CN111432844B - 靶向psma的鹅膏蕈碱缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PSMA靶向缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)小分子PSMA靶向部分；(c)任选存在的连接所述鹅膏毒素和所述小分子PSMA靶向部分的接头。本发明还涉及包含这种缀合物的药物组合物。

Description

靶向PSMA的鹅膏蕈碱缀合物
技术领域
本发明涉及一种PSMA靶向缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)小分子PSMA靶向部分；(c)任选存在的连接所述鹅膏毒素和所述小分子PSMA靶向部分的接头。本发明还涉及进一步包含半衰期延长部分的所述缀合物。本发明还涉及包含这种缀合物的药物组合物。
背景技术
鹅膏毒素是包含8个氨基酸的环状肽，其可在鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蘑菇中找到(见图1)。鹅膏毒素特异性地抑制哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II，从而还抑制受影响细胞的转录和蛋白质生物合成。细胞中转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管没有共价键合，但鹅膏蕈碱和RNA聚合酶II之间的配位非常紧密(KD＝3nM)。鹅膏蕈碱从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因此使受影响细胞不太可能恢复。当转录的抑制持续太长时间时，所述细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
在1981年已经通过使用连接到Trp(氨基酸4；见图1)的吲哚环的接头经由重氮化将抗Thy 1.2抗体与α-鹅膏蕈碱偶联来研究使用鹅膏毒素作为肿瘤治疗的细胞毒素部分(Davis&Preston,Science213(1981)1385-1388)。Davis和Preston将连接位点认定为位置7'。Morris和Venton也证明了位置7'处的取代产生了保持细胞毒素活性的衍生物(Morris&Venton,Int.J.Peptide Protein Res.21(1983)419-430)。
专利申请EP 1859811 A1(公布于2007年11月28日)描述了缀合物，其中β-鹅膏蕈碱的鹅膏毒素氨基酸1的γC原子直接(即没有接头结构)与白蛋白或与单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，还显示了这些缀合物对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴瘤细胞(Jurkat)增殖的抑制作用。建议使用接头，包括含有诸如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫(disulfide)、脲、硫脲、烃部分等元件的接头，但实际上未显示此类构建体，并且未提供更多细节，诸如鹅膏毒素上的连接位点。
专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(均公布于2010年10月14日)描述了缀合物，其中抗体(诸如抗EpCAM抗体，如人源化抗体huHEA125)经由(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子、(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6'C原子或(iii)经由鹅膏毒素氨基酸3的δC原子偶联到鹅膏毒素，在每种情况下直接偶联至鹅膏毒素或通过抗体和鹅膏毒素之间的接头，偶联到鹅膏毒素。建议的接头包含诸如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫、脲、硫脲、烃部分等的元件。此外，显示了这些缀合物对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌(Capan-1细胞系)、结肠癌(Colo205细胞系)和胆管上皮癌(OZ细胞系)增殖的抑制作用。
专利申请WO 2012/119787描述了靶向结合部分可以经由接头在色氨酸氨基酸4上的另外的连接位点(即位置1'-N)连接到鹅膏毒素，而不会干扰这种鹅膏毒素与其靶标(哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II)的相互作用。
到目前为止，鹅膏毒素已经与大生物分子(如抗体分子)缀合作为靶向部分。然而，此类大生物分子在生产过程和商品成本方面提出了巨大的挑战。因此，高度希望改为使用基于小分子的靶向部分。但是，存在某些严重的安全问题。
首先，尽管已知当与此类大生物分子偶联时鹅膏毒素是相对无毒的，并且它们仅在内化到靶细胞中后生物分子载体被裂解后才发挥其细胞毒素活性，但到目前为止，携带基于小分子的靶向结构域的鹅膏毒素缀合物是否能够维持这种毒性特性还是未知的。考虑到鹅膏毒素的毒性，特别是对肝细胞的毒性，最重要的是用于靶向肿瘤治疗的鹅膏毒素缀合物对它们的靶细胞保持特异性。在这种情况下，缀合物结构的微小变化可能对用于治疗方法的鹅膏毒素缀合物的治疗窗口和安全性产生重大影响。
其次，迄今为止已经开发和测试了大量的小分子药物缀合物(SMDC)。尽管它们中的许多都表现出良好的选择性(选择性(S)＝受体阴性细胞的IC50/受体阳性细胞的IC50)，但靶向指数却相当差(靶向指数(TI)＝游离毒素的IC50/缀合物的IC50，二者均是对于受体阳性细胞系)。关于已知SMDC的详细信息显示在以下实施例A和表1至5中。
因此，在用于治疗用途的基于抗体的鹅膏毒素缀合物的开发中已经取得了重大进展。但是，还存在与这类缀合物相关的到目前为止尚不能令人满意地解决的某些问题。
发明目的
因此，对于可以替代鹅膏毒素缀合物中的基于抗体的结构的备选靶向部分的开发，还存在重大而未满足的需要。现有技术既没有提供也没有建议该问题的解决方法，即将NAAG(N-乙酰基天冬氨酰谷氨酸)的某些衍生物认定为靶向部分。
发明内容
本发明是基于以下预料不到的观察：鹅膏毒素可以与基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA靶向部分缀合，其中此类缀合物显示出优异的选择性和靶向指数值。
该发现特别令人惊讶，因为其他基于小分子的鹅膏毒素缀合物(诸如具有整合素αvβ3的缀合物)并未产生具有适合开发为药物化合物的性质的化合物(见实施例A.2)。
因此，在一个方面，本发明涉及缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分；和(c)连接所述鹅膏毒素和所述PSMA结合部分的接头。
在第二方面，本发明涉及缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分；(c)半衰期延长部分；和(d)连接所述鹅膏毒素、所述PSMA结合部分和所述半衰期延长部分的至少一个接头。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的缀合物的药物组合物。
在第四方面，本发明涉及用于治疗患者的癌症的本发明的缀合物，特别是其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管上皮癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌，胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
附图说明
图1显示了不同鹅膏毒素的结构式。粗体数字(1至8)表示形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还显示了氨基酸1、3和4中原子的标准名称(分别为希腊字母α至γ，希腊字母α至δ和数字1'至7')。
图2显示了DUPA-α-鹅膏蕈碱缀合物在LNCaP(PSMA++)细胞系中的细胞毒性-图形表示。注意：在一个实验中，未对所有DUPA缀合物与鹅膏蕈碱进行直接比较。图中所示的鹅膏蕈碱曲线来自HDP 30.2284与鹅膏蕈碱的直接比较。
图3显示了DUPA-α-鹅膏蕈碱缀合物在22RV1(PSMA+-)细胞系中的细胞毒性-图形表示。注意：在一个实验中，未对所有DUPA缀合物与鹅膏蕈碱进行直接比较。图中所示的鹅膏蕈碱曲线来自HDP 30.2284与鹅膏蕈碱的直接比较。
图4显示了DUPA-α-鹅膏蕈碱缀合物在PC-3(PSMA-)细胞系中的细胞毒性-图形表示。注意：在一个实验中，未对所有DUPA缀合物与鹅膏蕈碱进行直接比较。图中所示的鹅膏蕈碱曲线来自HDP30.2284与鹅膏蕈碱的直接比较。
图5显示了与未缀合的α-鹅膏蕈碱相比，两种最有效的DUPAα-鹅膏蕈碱缀合物HDP30.2284和HDP 30.2301在三种前列腺癌细胞系中的细胞毒性-图形表示。注意：在一个实验中，未对所有HDP 30.2284和HDP 30.2301与鹅膏蕈碱进行直接比较。图中所示的鹅膏蕈碱曲线来自HDP 30.2284和鹅膏蕈碱的直接比较。
图6显示了用于制备DUPA-Fc-鹅膏蕈碱缀合物的两步“程序化和武装”策略。
图7A显示了用于程序化和武装Fc的三官能含DUPA的接头。图7B显示了带有用于武装DUPA-Fc的组织蛋白酶B可裂解的自杀式接头的鹅膏蕈碱-DBCO接头。
图8显示了Fc-LPETG多肽的结构和氨基酸序列。
图9显示了三官能含DUPA的接头的分析型RP-HPLC(λ＝210nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟40％B；14-19分钟45％B；19-20分钟100％B；20-21分钟100％B；21-22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈；流速＝1.4ml/min)。
图10显示了DBCO-鹅膏蕈碱接头的分析型RP-HPLC(λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；0-15分钟100％B；15-18分钟100％B；18-18.50min＝100％B；18.50-22min 5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈；流速＝1.4ml/min)。
图11显示了纯化的Fc-LPETG在天然非还原条件下的SEC-HPLC(λ＝280nm；缓冲液：0.1mol/l NaPO4 pH 6.7中的0.05％NaN3+0.1mol/l Na2SO4；流速：0.35ml/min)。
图12显示了纯化DUPA-Fc在天然非还原条件下的SEC-HPLC(λ＝280nm；缓冲液：0.1mol/l NaPO4 pH 6.7中的0.05％NaN3+0.1mol/l Na2SO4；流速：0.35ml/min)。
图13显示了(A)在天然非还原条件下在λ＝280nm和(B)λ＝310nm下，纯化的DUPA-Fc鹅膏蕈碱的SEC-HPLC(缓冲液：0.1mol/l NaPO4 pH 6.7中的0.05％NaN3+0.1mol/lNa2SO4；流速：0.35ml/min)。
图14显示了DUPA-Fc鹅膏蕈碱的表征。图14A显示了在Fc-LPETGG(面板a)、DUPA-Fc(面板b)和DUPA-Fc鹅膏蕈碱(面板c)去卷积后的HRESI-MS分析。图14B显示了在还原(+βME)和非还原(-βME)条件下的SDS-PAGE分析。图14C显示了在非还原条件(-βME)下的抗α-鹅膏蕈碱蛋白质印迹。在非还原条件下对Fc-LPETG(泳道1)、DUPA-Fc(泳道2)和DUPA-Fc鹅膏蕈碱(泳道3)进行SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝进行染色或者用鹅膏蕈碱免疫检测进行蛋白质印迹分析。
图15显示了与单独的Fc-DUPA接头和在200倍摩尔过量的PSMA抑制剂2-PMPA存在下的缀合物相比，DUPA-Fc-α鹅膏蕈碱缀合物在四种前列腺癌细胞系中的细胞毒性。
图16显示了Cb17 Scid雄性小鼠(n＝3)中DUPA-Fc-α鹅膏蕈碱缀合物的血液药代动力学。观察到与双室模型和FcRn循环相关的双相消除曲线。
图17显示了DUPA-Fc-α鹅膏蕈碱缀合物在Cb 17Scid小鼠LNCaP异种移植模型(n＝8-9)中的抗肿瘤作用。
如相对体重图方案所示，建议的给药方案是完全容许的。所观察到的恶病质与LNCaP模型相关，并且在媒介物注射组中也观察到。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
特别地，本文所用的术语如在"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)"(Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所描述的来定义。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包括(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所述的整体、组合物或步骤或者整体或步骤的组，然而也可以任选地存在任何另外的整体、组合物或步骤或者整体、组合物或步骤的组，包括其中不存在另外的整体、组合物或步骤或者整体、组合物或步骤的组的实施方案。在此类后者的实施方案中，术语“包含”的使用与“由...组成”一致。
在本申请的文本中引用了几篇文献。本文引用的文献中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的规范、说明书、GenBank登记号序列提交等)，无论是在上文还是下文中，均在可行的程度上在相应的专利法下，在此通过引用将其全部内容并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这种公开内容。
现在将进一步描述本发明。在以下章节中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非相反地明确指出。特别地，任何指示为优选或有利的特征均可以与任何其他指示为优选或有利的一个或多个特征组合。
本发明是基于以下预料不到的观察：鹅膏毒素可以与基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA靶向部分缀合，其中此类缀合物显示出优异的选择性和靶向指数值。
因此，在一个方面，本发明涉及缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分；和(c)连接所述鹅膏毒素和所述PSMA结合部分的接头。
在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括包含8个氨基酸的所有环状肽，如从鹅膏属中分离并描述于Wieland,T.和Faulstich H.(Wieland T,Faulstich H.,CRC CritRev Biochem.5(1978)185-260)中的，其包含根据(i)(即，其中氨基酸残基色氨酸的吲哚部分在位置6'处没有含氧取代基，特别是其中位置6'携带氢原子)和(ii)(即，其中天然存在的鹅膏毒素的硫醚亚砜部分被硫化物(sulphide)或砜代替)的特定位置，并且还包括其所有化学衍生物；还包括其所有半合成类似物；还包括所有合成或半合成类似物，其中硫醚亚砜部分被硫化物、砜代替，或被与硫不同的原子代替；还包括由根据天然化合物的主结构(环状，8个氨基酸)的构建块构造的其所有合成类似物，还包括包含非羟基化氨基酸而不是羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物，还包括所有合成或半合成的类似物，在每种情况下，其中任何这样的衍生物或类似物至少携带上述位置(i)和(ii)，并且通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II而是功能上有活性的。特别地，术语“鹅膏毒素”包括图1所示的所有结构。
在功能上，鹅膏毒素定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或缩肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与如上定义的接头分子或靶向结合部分反应的官能团(例如，羧基或羧酸衍生物，诸如羧酰胺或异羟肟酸、氨基、羟基、硫醇或硫醇捕获基团)的那些鹅膏毒素。特别适于本发明的缀合物的鹅膏毒素为图1所示的α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏无毒环肽(amanullin)或一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinic acid)的双脱氧变体，或鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、γ-鹅膏素、或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺的单脱氧变体，以及它们的盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。
在特定实施方案中，本发明的缀合物具有大于90％，特别是大于95％的纯度。
在本发明的上下文中，术语“纯度”是指存在的缀合物的总量。例如，大于90％的纯度是指在1mg的包含本发明的缀合物的组合物中，存在大于90％(即大于900μg)这种缀合物。其余部分(即，杂质)可以包括未反应的起始材料和其他反应物、溶剂、裂解产物和/或副产物。
在特定实施方案中，包含本发明的缀合物的组合物包含大于100mg，特别是大于500mg，并且更特别地大于1g的此类缀合物。因此，明确地排除痕量的本发明缀合物，该痕量的缀合物可能存在于现有技术的缀合物的复杂制备中，例如来自天然存在的亚砜的部分还原。
在本发明的上下文中，术语“PSMA”是前列腺特异性膜抗原的缩写，其也称为谷氨酸羧肽酶II”(GCPII)、N-乙酰基-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALADase I)或NAAG肽酶。PSMA)是由人类中的FOLH1(叶酸水解酶1)基因编码的一种酶。
在本发明的上下文中，术语“基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)的PSMA结合部分”是指基本上由结构I构成的部分，其中接头连接至戊二酸的位置5的羧基。
在本发明的上下文中，术语“基于……6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分”是指基本上由结构II构成的部分，其中接头连接到己酸部分的6-氨基。
在本发明的上下文中，“接头”是指连接两个组分的结构，每个组分均连接到所述接头的一端。在接头为键的情况下，鹅膏毒素与PSMA靶向部分的直接键可能降低鹅膏毒素与RNA聚合酶II相互作用的能力。在特定的实施方案中，接头增加了两个组分之间的距离并减轻了这些组分之间(，诸如在当前情况下在PSMA靶向部分和鹅膏毒素之间)的空间干扰。在特定实施方案中，接头在其主链中具有1至70个原子的连续链(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70个原子)，即，接头的长度定义为最短的连接，如通过鹅膏毒素部分与PSMA靶向部分之间的原子或键的数量来测量的，其中接头主链的一侧已与鹅膏毒素反应，并且另一侧可用于与PSMA靶向部分的羧基或氨基反应或者已经与其反应。在特定的实施方案中，接头具有20至70个原子，更特别地25至60个，更特别地30至55个，更特别地35至50个原子的连续链。在本发明的上下文中，接头特别地是任选被取代的C1-20-亚烷基、C1-20-亚杂烷基、C2-20-亚烯基、C2-20-亚杂烯基、C2-20-亚炔基、C2-20-亚杂炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基或亚杂芳烷基。接头可包含一种或多种结构元件，诸如羧酰胺、酯、醚、硫醚、二硫、脲、硫脲、烃部分等。接头还可包含这些结构元件中两个或更多个的组合。这些结构元件中的每一个可以在接头中存在超过一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，接头可以包含二硫键。应当理解，接头必须在单个步骤中或者在两个或更多个后续步骤中连接至鹅膏毒素和PSMA靶向部分。为此，接头会携带两个基团，特别是在近端和远端，它们可以(i)与待连接的组分之一中存在的基团，尤其是鹅膏毒素或PSMA靶向部分上的活化基团形成共价键，或(ii)其被激活或可以被激活以与鹅膏毒素上的基团形成共价键。因此，优选的是，化学基团位于接头的远端和近端，其是这种偶联反应的结果，例如，酯、醚、氨基甲酸酯(urethane)、肽键等。
在特定的实施方案中，接头L是独立地选自C、O、N和S的1至20个原子，特别是2至18个原子，更特别是5至16个原子，甚至更特别是6至15个原子的线性链。在特定的实施方案中，所述线性链中至少60％的原子是C原子。在特定的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键连接。
在特定的实施方案中，接头L是亚烷基、亚杂烷基、亚烯基、亚杂烯基、亚炔基、亚杂炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基或亚杂芳烷基，其包含1-4个选自N、O和S的杂原子，其中所述接头是任选取代的。
术语“亚烷基”是指具有1至20个碳原子的二价直链饱和烃基，包括具有1至10个碳原子的基团。在某些实施方案中，亚烷基可以是低级亚烷基。术语“低级亚烷基”是指具有1至6个碳原子，并且在某些实施方案中具有1至5或1至4个碳原子的亚烷基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2-CH2-)、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基和亚正己基。
术语“亚烯基”是指具有2至20个碳原子的二价直链基团，其中碳-碳键中的至少一个是双键，而其他键可以是单键或另外的双键。术语“亚炔基”是指具有2至20个碳原子的基团，其中碳-碳键中的至少一个是三键，而其他键可以是单键、双键或另外的三键。亚烯基的实例包括亚乙烯基(-CH＝CH-)、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、3-亚丁烯基等。亚炔基的实例包括亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基等。
如本文所用，“亚环烷基”旨在指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这种环具有3至12个碳原子，但没有杂原子，并且其中这种环是完全饱和的，并且术语“亚环烯基”旨在指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这种环具有3至12个碳原子，但没有杂原子，并且这种环至少部分不饱和(但不包括任何亚芳基环)。亚环烷基的实例包括但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环庚基。亚环烯基的实例包括但不限于亚环戊烯基和亚环己烯基。
如本文所用，术语“亚杂环烷基”和“亚杂环烯基”旨在指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这种环具有3至约12个原子，并且其中这种环由碳和至少一个杂原子，特别是至少一个独立地选自N、O和S的杂原子组成，其中亚杂环烷基是指完全饱和的这种环，并且亚杂环烯基是指至少部分不饱和的环(但不包括任何亚芳基或亚杂芳基环)。
术语“亚芳基”旨在表示作为任何稳定的单环或多环系统的一部分的二价环或环体系，其中这种环或环体系具有3至20个碳原子，但没有杂原子，该环或环体系由“4n+2”π电子法则所定义的芳香部分组成，包括亚苯基。
如本文所用，术语“亚杂芳基”是指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环体系，其中这种环或环体系具有3至20个原子，该环或环体系由“4n+2”π电子法则所定义的芳香部分构成，并包含碳原子和一个或多个氮、硫和/或氧杂原子。
在本发明的上下文中，术语“取代的”旨在表示存在于接头的主链中的一个或多个氢被所指定基团中的选择所取代，条件是不超过所指定原子的正常价或被取代的基团的适当原子的正常价，并且该取代产生稳定的化合物。术语“任选取代”旨在表示该接头未被取代或被一个或多个如本文定义的取代基取代。当取代基为酮基(或氧代，即＝O)、硫代或亚氨基等时，则接头主链原子上的两个氢被取代。示例性取代基包括，例如，烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、羧基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、芳酰氧基、杂芳酰氧基、烷氧基羰基、卤素、(硫代)酯、氰基、磷酰基、氨基、亚氨基、(硫代)酰胺基、巯基、烷硫基、酰硫基、磺酰基、硫酸基、磺酸基、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、叠氮基、卤代烷基，包括全氟烷基(诸如三氟甲基)，卤代烷氧基、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺氨基、磷酰基、磷酸基、膦酸基、次膦酸基、烷基羧基、烷基羧基酰胺、氧代、羟基、巯基、氨基(任选地被单取代或二取代，例如被烷基、芳基、或杂芳基取代)、亚氨基、羧酰胺、氨基甲酰基(任选地被单取代或二取代，例如被烷基、芳基、或杂芳基取代)、脒基、氨基磺酰基、酰氨基、芳酰氨基、(硫代)脲基、(芳硫基)脲基、烷基(硫代)脲基、环烷基(硫代)脲基、芳氧基、芳烷氧基或-O(CH2)n-OH、-O(CH2)n-NH2,、-O(CH2)nCOOH、-(CH2)nCOOH、-C(O)O(CH2)nR、-(CH2)nN(H)C(O)OR或-N(R)S(O)2R，其中n为1-4，R独立地选自氢、-烷基、-烯基、-炔基、-环烷基、-环烯基、-(C连接的杂环烷基)、-(C连接的杂环烯基)、-芳基和-杂芳基，其中多个取代程度是允许的。本领域技术人员会理解，如果合适，取代基(诸如杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基等)或官能团(诸如-OH、-NHR等)本身可被取代。本领域技术人员也会理解，适当时，取代部分本身也可被取代。
在特定的实施方案中，接头L包含选自以下部分之一的部分：二硫(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或–C(＝O)-O-)、羧酰胺(-NH-C(＝O)-或–C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-NH-)和脲部分(-NH-C(＝O)-NH-)。
在本发明的特定实施方案中，接头L包含选自以下名单的多个m个基团：亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基和亚杂芳烷基，其中每个基团可以任选地被独立地取代，所述接头进一步包含独立地选自以下部分之一的多个n个部分：二硫(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或–C(＝O)-O-)、羧酰胺(-NH-C(＝O)-或–C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-NH-)和脲部分(-NH-C(＝O)-NH-)，其中m＝n+1。在特定实施方案中，m为2且n为1，或m为3且n为2。在特定的实施方案中，接头包含2或3个未取代的亚烷基，以及分别连接所述未取代的亚烷基的1或2个二硫、醚、硫醚、胺、酯、羧酰胺、氨基甲酸酯或脲部分。[0061]
在特定的实施方案中，所述线性链中的C原子独立地是任选取代的亚甲基(-CH2-)的一部分。在特定的此类实施方案中，任选存在的取代基独立地选自卤素和C1-6-烷基，特别是甲基。[0062]
在特定的实施方案中，接头L是稳定的接头。[0063]
在本发明的上下文中，术语“稳定的接头”是指在(i)酶存在下和(ii)在细胞内还原环境中稳定的接头。
在特定的实施方案中，稳定的接头不包含(i)酶可裂解的子结构和/或(ii)二硫基团。在特定的此类实施方案中，接头具有至多12个原子，特别是2至10个原子，更特别是4至9个原子，最特别是6至8个原子的长度。
在特定的其他实施方案中，接头是可裂解的接头。
在本发明的上下文中，术语“可裂解的接头”是指(i)通过化学裂解可裂解的接头，或(ii)可还原的接头。
在某些此类实施方案中，所述接头是通过还原可裂解的。在本发明的上下文中，术语“通过还原可裂解”是指可以在细胞内还原环境中裂解的接头，特别是含有二硫基团的接头，从而导致在被细胞内还原环境内化之后，与靶结合部分缀合的毒素货物的细胞内释放(参见Shen et al.,(1985)J.Biol.Chem.260:10905–10908)。
在某些此类实施方案中，所述接头包含二硫键，特别是以下部分：
其中R1至R4独立地选自H和甲基。
在某些其他此类实施方案中，所述接头可通过化学裂解，特别是通过水解或蛋白水解来裂解，特别是其中这种化学裂解由酶催化。
在本发明的上下文中，术语“化学裂解由酶催化”是指这样的接头，其可以通过酶裂解，特别是通过溶酶体肽酶(诸如组织蛋白酶B)裂解，从而导致与靶向抗体缀合的毒素货物在内化之后的细胞内释放(参见Dubowchik et al.,(2002)Bioconjug Chem.13:855-69)。在特定的实施方案中，可裂解接头包含选自以下的二肽：Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-Cit和Val-Cit，特别是其中所述可裂解接头进一步包含在二肽和毒性负荷之间的对氨基苄基(PAB)间隔基。
在某些此类实施方案中，所述接头包含腙基。在特定的此类实施方案中，裂解通过在溶酶体中的水解而发生。
在某些实施方案中，接头是自杀式接头。
在本发明的上下文中，术语“自杀式接头”是指包含可裂解键的接头，其中在裂解之后发生片段化，该片段化除去了在所述裂解后仍与毒素连接的接头的那部分。[0074]
在特定的此类实施方案中，可裂解键是多肽(特别是二肽)的C端与任选地N-取代的对氨基苄基(PAB)间隔基的氨基之间的酰胺键。[0075]
在特定的此类实施方案中，可裂解接头包含结构L1-L*-L2
其中R'选自H和甲基，L1是将L*连接至鹅膏毒素的接头的一部分，特别地其中L1通过-NH-或-O-基团，特别是–C(＝O)-NH-、–C(＝O)-NH-O-或–C(＝O)-O-基团连接至L*，并且其中L2是将L*连接至PSMA靶向部分的接头的一部分，特别地其中L1通过–(CH2)m-部分(其中m是选自1至8，特别地1至5的整数)，或通过–(CH2CH2O)n-部分(其中n是选自1至3，特别地1至2的整数)连接至L*。
在特定的其他此类实施方案中，L*具有以下结构
在某些实施方案中，接头部分L1-L*-包含基团-(可裂解键)-NR'-苯基-CH2-O-C(＝O)-，其中R'选自H和甲基，并且其中羰基是在鹅膏毒素的位置1处的天冬氨酸残基的侧链的末端羧酸部分的一部分。
在特定的其他实施方案中，接头部分L1-L*-包含基团-(可裂解键)-NR'-苯基-CH2-O-，其中氧原子与在鹅膏毒素的位置4处的色氨酸残基的吲哚环的位置6'形成醚键。[0079]
在特定的实施方案中，接头L1为独立地选自C、O、N和S的1至4个原子，特别是1至3个原子，更特别是1至2个原子，甚至仅1个原子的线性链。在特定的实施方案中，所述线性链中至少50％的原子是C原子。在特定的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键而连接。
在特定的此类实施方案中，这种可裂解接头中所含的结构L1-L*-L2具有至多20个原子，特别是6至18个，更特别是8至16个，最特别是10至15个原子的长度。在特定的此类实施方案中，连接根据本发明的鹅膏毒素和可裂解二硫基团的接头的一部分是3或4个碳原子，特别是3个碳原子的线性链。在特定的实施方案中，所述线性链中的3或4个C原子通过单键而连接。在特定的实施方案中，所述接头是正亚丙基。
接头与靶结合部分的偶联可以通过本领域，特别是抗体-药物缀合物(ADC)领域中的普通技术人员熟知的各种方法来实现。
在特定的实施方案中，本发明涉及具有结构III、IV、V或VI的缀合物
其中每个L是接头，Ama是鹅膏毒素，B是分叉接头元件，并且R选自H、C1-6-烷基和对溴苄基。
在本发明的上下文中，术语“分叉接头元件”涉及包含至少三个连接位点的元件，使得这种元件的加入产生包含与鹅膏毒素缀合的两个PSMA结合部分的分支构建体。
在特定实施方案中，每个L独立地包含n个独立地选自以下名单的接头元件：-CH2-、-CHR1-、-C(R2)2-、-O-、-S-、-NH-、-NR3-、-C(＝O)-、-亚苯基-、2,5-二氧代-1,3-亚吡咯烷基，其中R1选自以下名单：C1-6-烷基、-COOH、氨基酸的侧链；R2选自以下名单：C1-6-烷基；R3选自以下名单：C1-6-烷基，B选自1,3,4-三取代的马来酰亚胺和1,3,4-三取代的琥珀酰亚胺，并且n是独立地选自5至60的整数。在特定的实施方案中，所述接头元件的名单还包括1,2,3-亚三唑基。在特定的其他实施方案中，B可以另外选自鸟氨酸和赖氨酸。
在特定的实施方案中，接头L为独立地选自C、O、N和S的至少5个，特别是至少10个，更特别是10至20个原子的线性链，特别是10至18个原子，更特别是10至16个原子，甚至更特别是10至15个原子的线性链。在特定的实施方案中，所述线性链中至少60％的原子是C原子。在特定的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键而连接。
在特定的实施方案中，每个L独立地包含一个或多个独立地选自以下的接头元件：-(CH2)x-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、-(O-CH2-CH2-)y、-(CH2-CH2-O-)y、N,O-二取代的对氨基苄氧基和2,5-二氧代-1,3-亚吡咯烷基，其中x和y是独立选自2至14的整数。在特定的实施方案中，所述接头元件的名单还包括1,2,3-亚三唑基。
在特定的实施方案中，接头L包含基于8-氨基辛酸的元件–NH-(CH2)7-C(＝O)-(Aoc元件)。在特定的此类实施方案中，–NH-(CH2)7-C(＝O)-元件的氨基末端与根据结构III或V的PSMA结合部分的末端羧酸形成酰胺键，或者是与根据结构IV或VI的PSMA结合部分的末端氨基的脲键的一部分。
在特定的实施方案中，接头L包含选自Phe-Phe-、-Phe-Phe-Cys-和-Phe-Phe-His-Glu-His-Glu-Cys-(N-至C-端)的多肽。在特定的此类实施方案中，所述多肽的N端与基于8-氨基辛酸的元件–NH-(CH2)7-C(＝O)-形成肽键。
在特定的实施方案中，所述接头包含硫醚部分。[0090]
在特定的此类实施方案中，这样的缀合物是由含硫醇的接头部分…L-SH与包含硫醇反应基团–X的第二接头部分…L-X的偶联产生的。在特定的此类实施方案中，所述含硫醇的接头部分是作为所述接头的一部分的多肽的半胱氨酸残基的游离-SH基团。
因此，在这样的实施方案中，本发明涉及通式PSMA结合部分-L-X*-S-L-Ama或PSMA结合部分-L-S-X*-L-Ama的缀合物，其中–X*-是由硫醇基团与硫醇反应基团的偶联产生的部分。
在本发明的上下文中，术语“硫醇反应基团X”是指与硫醇基团选择性地反应，特别是在6.0至8.0的pH值下，更特别地在6.5至7.5的pH值下反应的基团。特别地，术语“选择性地”是指包含硫醇反应基团的分子与包含至少一个游离半胱氨酸残基的第二部分的偶联反应的小于10％，特别是小于5％，更特别地是小于2％是与所述第二部分的非半胱氨酸残基(如赖氨酸残基)的偶联反应。在特定的实施方案中，硫醇反应基团选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、马来酰亚胺、在位置3具有离去基团(特别是选自-Br和取代的硫醇的离去基团)的马来酰亚胺(参见例如US 9,295,729)、在位置4具有离去基团(特别是选自-Br和取代的硫醇的离去基团)的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮(参见例如US9,295,729)、甲基磺酰基苯并噻唑、甲基磺酰基苯基四唑、甲基磺酰基苯基噁二唑(参见Toda et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,52(2013)12592-6)、3-芳基丙腈(参见Kolodych et al,Bioconjugate Chem.2015,26,197-200)和5-硝基吡啶-2-基-二硫(…-L-S-S-(5-硝基吡啶-2-基)。
在特定的实施方案中，在偶联中使用分叉试剂，该分叉试剂包含两个官能团，每个官能团可与PSMA结合部分-接头构建体中存在的硫醇基团反应。结果，两个含PSMA结合部分的链连接至分叉接头元件。在特定的实施方案中，分叉试剂是具有在位置3和4处的两个离去基团的马来酰亚胺，特别地选自3,4-二溴马来酰亚胺、3,4-双(芳硫基)马来酰亚胺，特别是3,4-二苯硫基马来酰亚胺和3,4-双(杂芳基硫基)马来酰亚胺，特别是3,4-双(2-吡啶基硫烷基)马来酰亚胺。在特定的其他实施方案中，所述分叉试剂是具有在位置4和5处的两个离去基团的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别选自4,5-溴-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮、4,5-双(芳硫基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别是4,5-二苯硫基-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮和4,5-双(杂芳基硫基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别是4,5-双(2-吡啶基硫烷基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮。
在特定的实施方案中，在根据本发明的缀合物中存在分叉接头元件B的情况下，PSMA结合部分与所述分叉接头元件B之间的接头各自至少包含-(O-CH2-CH2-)y*或-(CH2-CH2-O-)y*部分，其中y是独立地选自6至14，特别是8至12的整数。
在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应基团的偶联产生的部分选自：硫醇取代的乙酰胺；硫醇取代的琥珀酰亚胺；硫醇取代的琥珀酰胺酸；硫醇取代的杂芳基，特别是硫醇取代的苯并噻唑、硫醇取代的苯基四唑和硫醇取代的苯基噁二唑；和二硫。在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应基团的偶联产生的部分是硫醇取代的琥珀酰亚胺。
在特定的实施方案中，存在于[0069]段中的通式中的部分L-X*-S中的接头L选自以下部分：
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-CHMe-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2CHMe-S-S-CHMe-(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2CHMe-S-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S-(PSMA结合侧)
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S-(PSMA结合侧)；
并且
其中侧接(flank)二肽序列的-NH-和-CO-分别代表接头的氨基和羰基部分，其分别与所述二肽的羧基和氨基末端形成酰胺键。
在本发明的上下文中，术语“由硫醇基团与硫醇反应基团的偶联产生的部分”是指由以下而产生的结构：(i)存在于硫醇反应基团中的离去基团Y被半胱氨酸残基的硫原子亲核取代，例如溴乙酰胺基、碘乙酰胺、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基、烷基砜或杂芳基砜；(ii)半胱氨酸残基的HS-基团加成到硫醇反应基团(例如马来酰亚胺)的活化双键，或(iii)活化的二硫或甲基硫代磺酸酯(methanethiosulfonate)与半胱氨酸的硫原子的二硫交换，例如吡啶-2-硫醇、5-硝基吡啶-2-硫醇或甲磺酸根作为离去基团；或(iv)产生半胱氨酸残基的硫原子与作为硫醇反应基团的一部分的反应性部分之间的稳定键的任何其他化学反应。
由硫醇基团的偶联产生的主要部分可以任选地进一步衍生化，例如，由马来酰亚胺得到的琥珀酰亚胺基硫醚可以水解成琥珀酰胺酸硫醚。
在备选实施方案中，接头包含至少一个由1,3-偶极子与1,3-偶极环加成中的双键或三键的反应(点击化学)产生的五元环。
在特定的实施方案中，在结构III、V或VII的情况下通过羧酰胺基团–C(＝O)-NH-，或在结构IV、VI或VIII的情况下通过羧酰胺基团-NR–C(＝O)-或脲基-NR–C(＝O)-NH-将所述PSMA结合部分缀合到所述接头L。
在特定的实施方案中，在所述接头通过脲部分连接至所述PSMA靶向部分的情况下，所述脲部分由最初存在于根据结构II的PSMA靶向部分中的伯氨基与氨基甲酸衍生物…-接头-NH-C(＝O)-Z的反应产生，其中Z是可被伯胺替代的离去基团。
在具有结构III、V或VII的本发明的缀合物的特定实施方案中，接头L具有以下一般结构
(Aoc元件)a-(多肽)b-(亚烷基)c-(PEG)d-(硫醇元件)e-(亚烷基)f-(自杀式元件)g
其中因子a至g中的每一个独立地选自0和1，条件是所述因子中的至少一个是1。
在此类实施方案中，术语“Aoc元件”是指如[0074]段中所定义的基团，术语“多肽”是指二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽，特别是指[0075]段中所定义的多肽。术语“亚烷基”独立地是指任选地被至多n个C1-6-烷基取代的基团(CH2)n，其中n是选自2至8的整数。术语“PEG”是指基团-(O-CH2-CH2-)y或-(CH2-CH2-O-)y，其中y是选自6至14的整数。术语“硫醇元件”是指硫醚、二硫或元件–S-X-，其中X是指如[0079]段中所定义的基团，术语“自杀式元件”是指如[0061]至[0063]段中所定义的酶可裂解的结构。对于本领域的普通技术人员而言将立即显而易见的是，在本章节中描述的一般概念隐含地包括某些键元件，这些键元件是在根据本发明的所述一般概念的各个组分之间形成适当的键所需要的。例如，在根据结构II的PSMA结合部分和Aoc元件之间的脲键的情况下，会存在另外的羰基部分，并且在多肽-亚烷基键的情况下，所述键包括在所述亚烷基和所述多肽的C-端之间形成酰胺键的氨基。
在具有结构IV、VI或VIII的本发明的缀合物的特定实施方案中，接头(L-)2-B-L具有以下结构
[(Aoc元件)a-(多肽)b-(PEG)]2-B-亚烷基)c-(自杀式元件)d
其中因子a至d中的每一个独立地选自0和1，条件是所述因子中的至少一个是1。
在这样的实施方案中，如[0090]段中所定义的那样来使用术语。
在特定的实施方案中，所述鹅膏毒素通过天冬氨酸残基的侧链在位置1处缀合至所述接头L。
在特定的此类实施方案中，所述鹅膏毒素通过酯键Ama–C(＝O)-O-L-…或通过异羟肟酸键Ama-C(＝O)-NH-O-L-…而缀合。
在特定的其他实施方案中，所述鹅膏毒素通过羧酰胺键缀合。
在特定的此类实施方案中，所述缀合物是化合物HDP 30.2597。
在特定的实施方案中，所述鹅膏毒素通过二羟异亮氨酸残基的侧链在位置3处缀合至所述接头L。
在特定的实施方案中，所述鹅膏毒素通过色氨酸残基的吲哚氮原子在位置4处缀合至所述接头L。
在特定实施方案中，所述鹅膏毒素通过色氨酸残基的吲哚环的亚苯基部分在位置4处缀合至所述接头L。
在特定的此类实施方案中，所述鹅膏毒素通过醚键缀合至所述吲哚环的位置6′。
在特定的此类实施方案中，所述缀合物是选自以下列表的化合物：
/>
/>
/>
/>
以及
在第二方面，本发明涉及一种或多种形式的缀合物，所述缀合物包含连接至基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分的鹅膏毒素，所述缀合物具有延长的药代动力学半衰期。
对于小于约70kDa的蛋白质和多肽，从血清中清除的主要途径通过肾脏的肾小球滤过。已经开发出各种策略来延长小分子治疗剂以及基于蛋白质的治疗剂的药代动力学半衰期。对于基于蛋白质的治疗剂，这样的策略包括但不限于使用基于合成聚合物的融合，例如聚乙二醇(PEG)，以及蛋白质融合构建体。融合蛋白已经在制药行业中使用了数十年，以改善另外的短半衰期治疗剂的药代动力学性质(综述参见Strohl W.R.,2015,Fusionproteins for half-life extension of biologics as a strategy to makebiobetters；BioDrugs 29,215–239)。这些包括，例如，使用免疫球蛋白(抗体)的恒定片段(Fc)部分、血清白蛋白、羧基端肽(CTP)等用于融合构建体的设计。
与抗体Fc(可结晶片段)片段的缀合是一种常见的策略，该策略用以通过增加大小和利用经由上皮细胞的新生Fc受体(FcRn)循环过程来降低肽清除率，这是G型免疫球蛋白((IgG)在血清中的长半衰期的原因(Strohl W.R.,2015,BioDrugs 29,215-239)。
在根据本发明的特定实施方案中，如上文所公开的缀合物进一步通过三官能接头连接至半衰期延长部分。
在本发明的特别优选的实施方案中，如上文所公开的缀合物通过三官能接头连接至抗体(优选人抗体，最优选人IgG型抗体)的恒定片段(Fc)部分。
本发明的发明人已经发现，通过连接至抗体的恒定片段(Fc)部分，可以显著延长如上文所公开的所述鹅膏毒素-DUPA缀合物的药代动力学半衰期。令人惊讶地，包含鹅膏毒素、基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分、和抗体的恒定片段(Fc)部分的所述缀合物保留了它们的PSMA结合活性以及它们对鹅膏毒素靶RNA聚合酶II的功能活性。
在本发明的上下文中，术语“半衰期延长部分”，也简称为“延长部分”(EM)，是指缀合物的任何部分或组分，其在包含到所述缀合物中之前、期间或之后成为的，其用于增加所述缀合物的血浆半衰期和/或减少随着时间从血浆的清除，包括但不限于肽、多肽、蛋白质、融合肽或融合蛋白、小分子、天然或合成化学化合物。所述半衰期延长部分可以是例如免疫球蛋白Fc结构域或者其片段或衍生物、白蛋白或人血清白蛋白或者其片段或衍生物、转铁蛋白或人转铁蛋白或者其片段或衍生物、来自人绒毛膜促性腺激素β亚基的CTP肽、弹性蛋白样肽(ELP)重复序列、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS)聚合物、氨基酸同型聚合物(HAP)(诸如甘氨酸残基的均聚物)、人造明胶样蛋白(GLP)、非精确重复肽序列(XTEN)、各种长度的聚乙二醇(PEG)或者其片段或衍生物，或它们的组合。
在特定的实施方案中，本发明涉及具有结构VII或VIII的缀合物
其中每个L为接头，Ama为鹅膏毒素，B为三官能接头元件，EM为半衰期延长部分，且R选自H、C1-6-烷基和对溴苄基。
在另外的特定实施方案中，本发明涉及具有结构VII或VIII的缀合物，其中所述半衰期延长部分包含抗体的Fc部分，优选人抗体的Fc部分。
在另外的特定实施方案中，本发明涉及具有结构VII或VIII的缀合物，其中所述缀合物包含由三官能接头B的叠氮基部分与将所述鹅膏毒素连接至所述三官能接头B的所述接头L的炔部分的反应产生的1,2,3-三唑，并且其中所述炔部分选自丙炔酸、3-丁炔酸、4-戊炔酸、5-己炔酸、二苄基环辛炔(DiBO)、二苄基氮杂环辛炔酮(DBCO)和双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)。
在另外的特定实施方案中，本发明涉及具有结构IX的缀合物
其中PSMA结合部分是基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸。
在其他优选的实施方案中，所述L-Ama选自以下列表：
/>
/>
在另外的优选实施方案中，本发明涉及选自以下列表的缀合物：
/>
/>
在本发明的其他优选实施方案中，所述Fc部分包含SEQ ID No.1。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的缀合物的药物组合物。
在第四方面，本发明涉及本发明的缀合物，其用于治疗患者的癌症，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管上皮癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
如本文所使用的，疾病或病症的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指完成以下中的一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症的特征性症状的形成；(c)抑制所治疗病症的特征性症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的患者的该疾病的复发；(e)限制或预防先前对该病症有症状的患者的症状复发。
如本文所使用的，治疗可以包括向患者施用根据本发明的缀合物或药物组合物，其中“施用”包括体内施用，以及直接向离体组织例如静脉移植物施用。
在特定的实施方案中，使用治疗有效量的本发明的缀合物。
“治疗有效量”是足以实现预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量会随诸如药剂的性质、施用途径、接受该治疗剂的动物的大小和种类以及施用目的等因素而变化。每个情况中的有效量可以由本领域技术人员按照本领域已建立的方法凭经验确定。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的鹅膏毒素或本发明的鹅膏毒素与靶结合部分的缀合物，并且进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
“药学上可接受的”是指联邦管理机构、州政府所核准的或者美国药典或其他公认的用于动物(更具体地是人)的药典所列的。
在特定的实施方案中，药物组合物以全身施用药物的形式使用。这包括肠胃外药剂，其尤其包括注射剂和输注剂。注射剂配制成安瓿或所谓的即用型注射剂形式，例如即用型注射器或一次性注射器，除此之外还有用于多次拔出的可刺入小瓶形式。注射剂的施用可以是皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)或皮内(i.c.)应用的形式。特别地，可以制备分别合适的注射制剂，如晶体混悬剂、溶液、纳米颗粒或胶体分散体系，例如水溶胶。
注射制剂还可制备成可用含水等渗稀释剂溶解或分散的浓缩剂。输注剂还可以制备成等渗溶液、脂肪乳液、脂质体制剂和微乳液形式。类似于注射剂，输注制剂也可以制备成供稀释的浓缩剂形式。注射剂还可以以持久输注剂的形式应用于住院患者和门诊治疗，例如通过微型泵。
可以向肠胃外药物制剂中加入例如白蛋白、血浆、增容剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH的物质、复合物质或聚合物物质，特别是作为影响本发明的靶结合部分毒素缀合物吸附到蛋白质或聚合物的物质，或者可以添加它们以便减少本发明的靶结合部分毒素缀合物吸附到诸如注射装置或包装材料(例如塑料或玻璃)的材料。
包含靶结合部分的本发明的鹅膏毒素可以结合至肠胃外药剂等中的微载体或纳米颗粒，例如结合至基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸酯、聚乙二醇酯、聚氨基酸或聚醚聚氨酯的微细分散颗粒。如果本发明的靶结合部分毒素缀合物分别以微细分散的、分散的和悬浮的形式引入，则肠胃外制剂还可以将被改成储存(depot)制剂，例如基于“多单位原则”，或者，如果本发明的靶向结合部分毒素缀合物被封装在随后植入的剂型(例如片或棒)中，则肠胃外制剂还可以被改成在药物中的晶体悬液或基于“单一单位原则”进行改造。以单一单位或多单位制剂形式的这些植入或储存药物常常由诸如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖的所谓的生物可降解聚合物构成。
在配制为肠胃外药剂的本发明的药物组合物的制备过程中添加的辅剂和载体特别地是无菌水(已灭菌的水)；影响pH值的物质，例如有机或无机酸或碱及其盐；用于调节pH值的缓冲物质，用于等张化(isotonization)的物质，例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖；分别地，表面活性物和表面活性剂；和乳化剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如，)或例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如，/>)；脂肪油，例如花生油、大豆油或蓖麻油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(例如/>)，以及聚合物辅剂，例如明胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮；增加有机溶剂的溶解度的添加剂，例如丙二醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺、丙二醇；或形成复合物的物质，例如柠檬酸盐和脲；防腐剂，例如苯甲酸羟丙酯和甲酯、苯甲醇；抗氧化剂，例如亚硫酸钠；和稳定剂，例如EDTA。
当在优选实施方案中将本发明的药物组合物配制为悬浮液时，加入增稠剂以防止本发明的靶结合部分毒素缀合物或表面活性物和聚合电解质的沉淀，以便确保沉淀物和/或复合物形成剂(例如EDTA)的再悬浮。还可以得到活性成分与各种聚合物的络合物。这样的聚合物的实例为聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本发明的靶结合部分毒素缀合物还可以包合物(例如具有环糊精)形式掺入到液体制剂中。在特定的实施方案中，可以添加分散剂作为另外的辅剂。为了制备冻干物，可以使用支架剂如甘露醇、葡聚糖、蔗糖、人白蛋白、乳糖、PVP或各种明胶。
实施例
在下文中，通过非限制性实施例更详细地解释本发明：
A.小分子药物缀合物(SMDC)的背景
1.与SMDC有关的已公布信息的综述
为了研究与SMDC相关的现有技术，研究了用于解决以下小分子靶标的已知方法：
·叶酸受体α(FRα)
·胆囊收缩素2型受体(CCKBR)
·碳酸酐酶IX(CAIX)
·整合素
·促性腺激素释放受体(GnRH)
·前列腺特异性膜抗原(PSMA)
·生长抑素受体2(SSTR2)
·人表皮生长因子受体2(HER2)
·铃蟾肽受体
·促性腺激素释放受体(GnRH)
在每种情况下，识别了与选择性S(S＝IC50(受体阴性细胞)/IC50(受体阳性细胞))和靶向指数TI(对受体阳性细胞系，TI＝IC50(游离毒素)/IC50(缀合物))有关的数据。在可以找到针对给定靶标的不同现有技术文献的情况下，选择具有最高靶向指数的参考文献。这些分析的结果总结在表1至表5中。另外的SMDC总结在表6中。
总而言之，具有最有效的选择性因子的最佳描述的结合物是叶酸和DUPA。然而，在许多情况下，没有报道受体阴性细胞系的IC50值，并且主要使用的毒素(DM1、MMAE、长春碱、微管溶素(tubulysin)、紫杉醇、多西他赛)的靶向指数值相当低。
2.另外的小分子-鹅膏毒素缀合物的产生
为了补充在以上实施例A.1中示出的与SMDC有关的现有技术的研究获得的数据，产生了许多基于鹅膏蕈碱的SMDC。表7显示了这些构建体的结果。
表1：所评论叶酸受体靶向缀合物的总结
表2：所综述的CCK2R靶向缀合物的总结
表3：所综述的CAIX靶向缀合物的总结
表4：所综述的整合素靶向缀合物的总结
表5：所综述的DUPA缀合物的总结
/>
表6：另外的SMDC的总结
表7：用基于鹅膏蕈碱的SMDC获得的结果的总结
B.DUPA-鹅膏毒素缀合物的合成
实施例1
(S)-二叔丁基2-(3-((S)-6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)脲基)戊二酸酯(HDP 30.1570)
步骤1：3,11-二氧代-1-苯基-2-氧杂-4,10,12-三氮杂十五烷9,13,15-三羧酸(9S,13S)-三叔丁基酯(HDP 30.1567)
在0℃下向二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)(1g，3.90mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF；20ml)中的溶液中分批加入α,γ-二叔丁基L-谷氨酸酯(1.16g，3.90mmol)。50分钟后，加入三乙胺(TEA；541μl，3.90mmol)。完全转化后，在0℃下加入α-叔丁基-γ-羧基苄基L-赖氨酸(1.46g，3.90mmol)和TEA(1.08ml，7.8mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。除去DMF，并用甲基叔丁基醚(MTBE；50ml)溶解残余物。将有机层依次用15％柠檬酸溶液(2×50ml)、水(2×50ml)、饱和碳酸氢钠(NaHCO3)溶液(2×50ml)和水(30ml)洗涤。将有机层用硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱法(MTBE在己烷中的0-60％梯度)纯化所得淡黄色油，以提供浆形式的脲HDP 30.1567(2.34g，97％)。
步骤2：2-(3-((S)-6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-基)脲基)戊二酸(S)-二叔丁基酯(HDP 30.1570)
将HDP 30.1567(2.32g，3.73mmol)在室温下于MeOH(50ml)中并在Pd-C存在下氢化2h。然后将混合物过滤并用MeOH洗涤。将该溶液在减压下浓缩。将无色油溶解于叔丁醇(tBuOH)(50ml，pH＝8)中，并逐滴加入1M HCl(3.44ml，3.44mmol)。将产物冻干过夜，得到无色固体形式的HDP 30.1570(1.84g，94％)。
MS(ESI+):m/z实测值:488.40计算值:488.33[M+H]+；实测值:975.36计算值:975.66[2M+H]+；实测值:432.29计算值:432.27[MH-CH2＝C(CH3)2]+；实测值:376.26计算值:376.21[MH-2x CH2＝C(CH3)2]+.1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.17(t,J＝5.9Hz,3H),6.30(d,J＝7.9Hz,1H),6.11(d,J＝8.3Hz,1H),4.36(td,J＝8.1,4.7Hz,1H),4.28(td,J＝7.2,4.3Hz,1H),3.11(dt,J＝11.4,5.9Hz,2H),2.35(ddd,J＝15.8,11.8,6.3Hz,2H),1.95-1.68(m,4H),1.62–1.51(m,2H),1.45(s,18H),1.43(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝173.42,172.64,172.37,157.54,82.13,81.52,80.47,53.34,52.80,39.42,31.72,31.18,28.30,28.06,28.02(2x),26.72,21.81。
步骤3：2-(3-((S)-1-(叔丁氧基)-6-(((((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)脲基)戊二酸(S)-二叔丁基酯(HDP 30.1579)
在0℃下在10分钟内向DSC(256mg，1mmol)在DMF(10ml)中的溶液中，滴加HDP30.1570(524mg，1mmol)在DMF(10ml)和TEA(139μl，1mmol)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物在高真空下蒸发。通过快速色谱法(丙酮在己烷中的0-50％梯度)纯化粗产物。将纯级分合并，蒸发并从1,4-二氧六环中冻干过夜，得到无色粉末形式的产物(544mg，86％)。
MS(ESI+):m/z实测值：629.26，计算值：629.34[M+H]+。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝6.54(dd,J＝6.8,4.8Hz,1H),5.53(d,J＝8.0Hz,1H),5.43(d,J＝8.3Hz,1H),4:39-4.31(m,1H),4.29(dt,J＝8.3,4.2Hz,1H),3.27-3.36(m,1H),3.18 3.25(m,1H),2.85(s,4H),2.30(qdd,J＝16.2,9.5,6.1Hz,2H),2.04(ddd,J＝14.2,9.5,6.3,4.7Hz,1H),1.86-1.76(m,3H),1.71-1.50(m,2H),1.49-1.32(m,29H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝172.87,172.44,172.36,170.45,157.27,151.84,81.98,81.45,80.45,53.21,52.90,41.35,31.74,28.38,28.05,27.99,27.93 2x,25.50,21.57。
实施例2
(S)-5-(叔丁氧基)-4-(3-((S)-1,5-二叔丁氧基-1,5-二氧代戊烷-2-基)脲基)-5-氧代戊酸(HDP 30.2178)
步骤1：1-叔丁基2-(3-((S)-1,5-二叔丁氧基-1,5-二氧代戊烷-2-基)脲基)戊二酸(S)-5-苄基酯(HDP30.2175)
在0℃下向DSC(1.73g，6.76mmol)在DMF(31.6ml)中的溶液中分批加入α,γ-二叔丁基L-谷氨酸酯(2g，6.76mmol)。50分钟后，加入TEA(937μl，6.76mmol)。完全转化后，在0℃下加入α-叔丁基-γ-苄基L-谷氨酸酯(2.23g，6.76mmol)和TEA(1.87ml，13.52mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。在真空中除去DMF，并将残余物溶解于MTBE(100ml)。将有机层依次用15％柠檬酸溶液(2×100ml)、水(2×100ml)，饱和NaHCO3溶液(2×100ml)和水(80ml)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯在己烷中的0-33％梯度)来纯化所得淡黄色油，以提供无色浆形式的脲HDP 30.2175(3.02g，77％)。
MS(ESI+):m/z实测值:579.17计算值:579.72[M+H]+；实测值:601.35计算值:601.70[M+Na]+；实测值:1180.35计算值:1180.41[2M+Na]+。
步骤2：(S)-5-(叔丁氧基)-4-(3-((S)-1,5-二叔丁氧基-1,5-二氧代戊烷-2-基)脲基)-5-氧代戊酸(HDP30.2178)
将HDP 30.2175(3.02g，5.21mmol)在室温下于乙酸乙酯(EtOAc；27.3ml)中并在Pd-C存在下氢化过夜。然后将混合物过滤并用EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以提供透明无色浆形式的DUPA前体HDP 30.2178(2.45g，96％)。
MS(ESI+):m/z实测值:489.20计算值:489.59[M+H]+；实测值:978.22，计算值:978.16[2M+Na]+。
实施例3
DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys试剂(HDP 30.2225)
步骤1：(tBuO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-CysTrt试剂(HDP 30.2185)
试剂和条件.i)a-Fmoc-Phe-OH、1-羟基苯并三唑(HOBt)、(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、DMF，60℃，40W，10分钟；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；ii)a-Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；iii)a-Fmoc-Aoc-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；b-20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；iv)HDP 30.2178、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；v)TFE/AcOH/DCM(1∶1∶8)，23℃，1小时30分钟。
在上述条件下由H-Cys(Trt)-(2-ClTrt)树脂(391mg，0.25mmol)开始，通过微波辅助的Fmoc-固相肽合成来制备DUPA-肽前体HDP 30.2185。通过用三氟乙醇(TFE)/乙酸(AcOH)/二氯甲烷(DCM)(1：1：8)混合物(10ml，2小时30分钟)洗涤，将结合树脂的肽从树脂上裂解。然后依次用新鲜的TFE/AcOH/DCM(1∶1∶8)混合物(10ml，2分钟)、DCM(10ml，2分钟)和MeOH(10ml，2分钟)洗涤树脂。收集滤液并在真空中浓缩，得到214mg产物(68％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1292.5计算值:1292.60[M+Na]+。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys试剂(HDP 30.2225)
将HDP 30.2185(109mg，85.6μmol)用三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/H2O(95∶5∶5)混合物(8ml)和1,4-二硫苏糖醇(DTT)处理(362mg)并在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟。将混合物与甲苯(2×8ml)共蒸发。加入冷的MTBE(40ml)导致固体的沉淀。通过在0℃下离心来分离沉淀物，收集并用另外的冷MTBE(40ml)洗涤，在0℃下离心并收集。将沉淀溶于乙腈(ACN)/水(1∶1，v∶v，2ml)中，并通过制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)在C18柱上分批纯化[λ＝210nm；梯度:0分钟5％B；15-18分钟100％B；18.50-22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水,B＝乙腈]。合并含有目标化合物的管，蒸发并在tBuOH/H2O(4∶1，v∶v，5ml)中冻干过夜，得到白色粉末形式的试剂HDP 30.2225(122.9mg，85％)。
MS(ESI+):m/z实测值:859.33计算值:859.98[M+H]+；实测值:881.33计算值:881.96[M+Na]+。
实施例4
DUPA-Aoc-Phe-Phe-OSu(HDP 30.2401)
步骤1：(ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-OH试剂(HDP 30.2393)
试剂和条件.i)a-Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；ii)a-Fmoc-Aoc-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b-20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；iii)HDP 30.2178、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；iv)TFE/AcOH/DCM(1∶1∶8)，23℃，1小时30分钟。
在上述条件下由H-Phe-(2-ClTrt)树脂(417mg，0.25mmol)开始，通过微波辅助的Fmoc-固相肽合成来制备DUPA-肽前体HDP 30.2393。通过用TFE/AcOH/DCM(1:1:8)混合物(10ml，2小时30分钟)洗涤，将结合树脂的肽从树脂上裂解。然后依次用新鲜的TFE/AcOH/DCM(1∶1∶8)混合物(10ml，2分钟)、DCM(10ml，2分钟)和MeOH(10ml，2分钟)洗涤树脂。收集滤液并在真空中浓缩，得到131.15mg产物(57％)。
MS(ESI+):m/z实测值:924.50计算值:924.18[M+H]+；实测值:946.58计算值:946.16[M+Na]+。
步骤2：(ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-OSu试剂(HDP 30.2401)
在室温下于氩气下，将HDP 30.2393(131.01mg，0.15mmol)溶解于四氢呋喃(THF；2.5ml)中。依次添加溶解在THF(各200μl)中的二环己基碳二亚胺(DCC；52.61mg，0.26mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu；29.34mg，0.26mmol)。
将反应混合物在室温下于氩气下搅拌18小时。滤出DCC，并用少量THF洗涤。蒸发溶剂，并将残余物重新溶解于含有0.05％TFA的ACN/MeOH(5∶1，6ml)中，并转移至15ml离心管中，冷却至0℃并离心(4500rpm，3分钟)。丢弃固体残余物并收集上清液，在减压下蒸发并在含0.05％TFA的tBuOH(5ml)中冻干过夜，得到白色粉末形式的147.77mg(97％)的HDP30.2401。
MS(ESI+):m/z实测值:1021.80,计算值:1022.24[M+H]+。
实施例5
DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys试剂(HDP 30.2579)
步骤1：(tBuO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-(HisTrt-GluOtBu)2-CysTrt试剂(HDP 30.2557)
试剂和条件.a-Fmoc-Glu(OtBu)-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；ii)a-Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；iii)a-Fmoc-Glu(OtBu)-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；iv)a-Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3min；v)a-Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；vi)a-Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；b)20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；vii)a-Fmoc-Aoc-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10min；b-20％哌啶/DMF，60℃，40W，3分钟；viii)HDP 30.2178、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF，60℃，40W，10分钟；ix)TFE/AcOH/DCM(1:1:8)，23℃，1小时30分钟。
在上述条件下由H-Cys-(2-ClTrt)树脂(391mg，0.25mmol)开始，通过微波辅助的Fmoc-固相肽合成来制备DUPA-肽前体HDP 30.2557。通过用三氟乙醇(TFE)/乙酸(AcOH)/二氯甲烷(DCM)(1：1：8)混合物(10ml，2小时30分钟)洗涤，将结合树脂的肽从树脂上裂解。然后依次用新鲜的TFE/AcOH/DCM(1∶1∶8)混合物(10ml，2分钟)、DCM(10ml，2分钟)和MeOH(10ml，2分钟)洗涤树脂。收集滤液并在真空中浓缩，得到284mg产物(47％)。
MS(ESI-):m/z实测值:2397.50计算值:2397.99[M-H]-。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys试剂(HDP 30.2579)
用TFA/TIS/H2O(95∶2.5∶2.5)混合物(6ml)和DTT(150mg)处理HDP 30.2557(284mg，0.118mmol)，并在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟。将混合物与甲苯(2×6ml)共蒸发。加入冷的MTBE(40ml)导致固体的沉淀。通过在0℃下离心来分离沉淀物，收集并用另外的冷MTBE(40ml)洗涤，在0℃下离心并收集。将沉淀溶于ACN/H2O(9∶1，v∶v，1.5ml)中，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上分批纯化[λ＝246nm；梯度：0分钟5％B；15-18分钟100％B；18.50-22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈]。合并含有产物的级分，蒸发并在tBuOH/H2O(4∶1，v∶v，5ml)中冻干过夜，得到白色固体形式的DUPA-肽试剂HDP 30.2579(115.38mg，70％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1391.50计算值:1391.50[M+H]+；实测值:696.42计算值:696.76[M+Na]2+。
实施例6
1,1,1-三苯基-5,8,11-三氧杂-2-硫杂十三烷基-13-胺(HDP 30.2383)
步骤1：1-溴-2-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙烷(HDP 30.0381)
将三苯膦(Ph3P；0.5g，230.8mmol)溶解在干燥的DCM(190ml)中，并将混合物冷却至0℃。逐滴添加溴(11.8ml，230.8mmol)。5分钟后，滴加溶解在DCM(11.8ml)中的四甘醇(20.0ml，115.4mmol)，并将反应混合物解冻至室温并搅拌74小时。将反应混合物冷却至0℃，并用饱和的NaHCO3溶液(400ml)稀释至pH 7。加入10％的硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液(20ml)并分离各相。将有机相用饱和氯化钠(NaCl)溶液(100ml)洗涤，用MgSO4干燥并在减压下蒸发。将残余物用正己烷(400ml)溶解，并摇动30分钟。滤出晶体，用正己烷(2×50ml)溶解，超声处理并过滤。
收集滤液，蒸发并蒸馏(140℃，0.0062mbar)，得到无色油形式的34.70g(94％)的HDP 30.0381。
步骤2：1-叠氮基-2-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙烷(HDP 30.0388)
将HDP 30.0381(4.8g，15.0mmol)溶解于无水DMF(30ml)中。添加NaN3(975mg，15.0mmol)，并将反应混合物在室温下于氩气下搅拌21小时，并直接用于步骤3。
步骤3：13-叠氮基1,1,1-三苯基-5,8,11-三氧杂-2-硫杂十三烷(HDP 30.2382)
将三苯基甲硫醇(4.17g，15.0mmol)溶解在DMF(30ml)中并冷却至0℃。加入甲醇钠(NaOMe；2.78ml，15.0mmol，在MeOH中的30％溶液)。2分钟后，加入反应混合物HDP 30.0388，将反应解冻至室温，搅拌1小时30分钟。蒸发DMF，用EtOAc(100ml)溶解残余物，并依次用饱和氯化铵(NH4Cl)溶液(100ml)、饱和NaHCO3溶液(100ml)、H2O(100ml)和饱和NaCl溶液(100毫升)洗涤。用MgSO4干燥有机相并蒸发。将粗产物在硅胶柱(330g，梯度：0-20％的MTBE的甲苯溶液，λ＝285nm)上纯化。收集含有产物的级分，并蒸发成3.12g的HDP 30.2382。
步骤4：1,1,1-三苯基-5,8,11-三氧杂-2-硫杂十三烷-13-胺(HDP 30.2383)
将HDP 30.2382(478mg，1mmol)溶解于THF(20ml)。依次添加三苯膦(525mg，2mmol)和H2O(2ml)。将反应混合物在室温下搅拌42小时。蒸发后，将粗产物在硅胶柱(40g，梯度：在含1％TEA的DCM中的含1％TEA的0-100％的DCM/MTBE/MeOH(6:3:1,v:v:v)，λ＝235nm)上纯化。收集含有产物的级分，并蒸发成淡黄色油形式的354mg(77％)的HDP 30.2383。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.46-7.37(m,6H),7.32-7.16(m,9H),3.65-3.53(m,6H),3.51-3.40(m,4H),3.31(t,J＝6.9Hz,2H),2.84(t,J＝5.2Hz,2H),2.43(t,J＝6.9Hz,2H),1.47(bs,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝144.78,129.57,127.81,126.58,73.38,70.55,70.43,70.24,69.57,66.55,41.75,31.6。
实施例7
1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2-硫杂二十五烷-25-胺(HDP30.2407)
步骤1：1,23-二溴-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂二十三烷(HDP 30.2397)
在氩气下将甲磺酸酐(4.7g，27.0mmol)溶解于无水DCM(80ml)中，并冷却至0℃。添加溶解在DCM(20ml)中的八乙二醇(5.0g，13.5mmol)。在0℃下未稀释地添加DIPEA(9.18ml，54mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌5分钟，然后解冻至室温。在起始材料完全转化(4小时)后，添加溴化锂(LiBr；11.72g，135.0mmol)的THF(100ml)溶液，并将反应混合物在回流(60℃)下加热30分钟。6小时后，将混合物冷却并在真空中蒸发。将残余物溶解在H2O(100ml)中，并用DCM(2×100ml)萃取。用饱和NaCl溶液(100ml)洗涤合并的有机相，用MgSO4干燥，蒸发成橙色油形式的5.78g(86％)的HDP 30.2397，其无需纯化即用于随后的步骤。
步骤2：1-叠氮基-23-溴-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂二十三烷(HDP 30.2402)
如本文实施例6步骤2中所述来制备HDP 30.2402。
步骤3：25-叠氮基-1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2-硫杂二十五烷(HDP 30.2403)
如本文实施例6步骤3中所述来制备HDP 30.2403，得到1.93g(51％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:676.42计算值:676.30[M+H]+。
步骤4：1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23-七氧杂-2-硫杂二十五烷-25-胺(HDP30.2407)
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将HDP 30.2403(654mg，1mmol)溶解在THF(20ml)中，并加入三苯膦(525mg，2mmol)。在三苯膦完全溶解后，加入H2O(2ml)，并将反应混合物在室温下在塞子打开(opentap)条件下搅拌过夜。
蒸发后，将产物在硅胶柱(40g，洗脱液：在含1％TEA的DCM中的含1％TEA的0-100％的DCM/MeOH(4∶1，v∶v)，λ＝235nm)上纯化。
将对应于产物的级分合并并蒸发。将残余物再溶解于环己烷(10ml)和DCM(2ml)中，并滤出沉淀物。将滤液蒸发并冻干，得到淡黄色油形式的622.7mg(99％)的HDP30.2407。
MS(ESI+):m/z实测值:628.42计算值:628.33[M+H]+。
实施例8
1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-硫杂三十七烷-37-胺(HDP 30.2585)
步骤1：1,35-二溴-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷(HDP30.2564)
如本文实施例6步骤1中所述来制备HDP 30.2564，得到浅黄色油形式的1.74g(57％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:673.17计算值:673.46[M+H]+；实测值:690.25calc:690.47[M+NH4]+。
步骤2：1-叠氮基35-溴-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷(HDP 30.2575)
如实施例6步骤2中所述来制备HDP 30.2575。
步骤3：37-叠氮基-1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-硫杂三十七烷(HDP30.2576)
如本文实施例5步骤3中所述来制备HDP 30.2576，得到1.94g材料(90％)。
步骤4：1,1,1-三苯基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-硫杂三十七烷-37-胺(HDP30.2581)
如本文实施例5步骤4中所述来制备HDP 30.2581，得到浅黄色油形式的627mg(22％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:804.50计算值:804.08[M+H]+；实测值:826.42计算值:826.06[M+Na]+。
实施例9
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG4-SH试剂(HDP 30.2439)
步骤1：(ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG4-S(Trt)试剂(HDP 30.2409)
将HDP 30.2401(20mg，0.020mmol)溶解于THF(237μl)，将HDP 30.2383(9.29mg，0.021mmol)和NaHCO3(1.81mg，0.022mmol)溶解于H2O(158μl)，并添加至HDP 30.2401溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应用0.2M柠檬酸溶液(237μl)酸化。加入EtOAc(237μl)，并萃取有机化合物(x2)。将合并的水相用柠檬酸酸化至pH＝3，并用EtOAc(3×237μl)萃取。将有机相用H2O、NaCl饱和溶液洗涤，用MgSO4干燥并在减压下蒸发，并冻干成白色固体形式的15.8mg(59％)的HDP 30.2409。
MS(ESI+):m/z实测值:1379.75计算值:1380.76[M+Na]+。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG4-SH试剂(HDP 30.2439)
将HDP 30.2409(15.8mg，11.6μmol)用TFA/TIS/H2O(95∶2.5∶2.5)混合物(2ml)处理，并在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟。将混合物与甲苯(2×2ml)共蒸发。加入冷的MTBE(10ml)导致固体的沉淀。将混合物在0℃下离心并收集沉淀物。将沉淀物用另外的冷MTBE(10ml)洗涤，在0℃下离心，收集并冻干过夜，得到白色粉末形式的试剂HDP 30.2439(6.7mg，61％)。
MS(ESI+):m/z实测值:947.50计算值:948.21[M+H]+；实测值:969.50计算值:970.11[M+Na]+。
实施例10
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG8-SH试剂(HDP 30.2466)
步骤1：(ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG8-S(Trt)试剂(HDP 30.2461)
将HDP 30.2401(78.0mg，0.077mmol)溶解于THF(0.93ml)中，将HDP 30.2407(50.8mg，0.081mmol)和NaHCO3(7.12mg，0.085mmol)溶解于H2O(0.62ml)中并添加至HDP30.2401溶液。将反应混合物在室温下搅拌8小时。在减压下蒸发反应物，并将残余物再溶解于ACN/H2O(9∶1，v∶v，500μl)中，并在制备型HPLC上在C18柱上分两部分纯化[λ＝210nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-26分钟100％B；26-30分钟100％B；30-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。合并包含产物的级分，蒸发并冻干成白色固体形式的46.38mg(40％)的HDP30.2461。
MS(ESI+):m/z实测值:1555.75计算值:1556.98[M+Na]+；实测值:786.92计算值:787.05[M+H+K]2+。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG8-SH试剂(HDP 30.2466)
将HDP 30.2461(46mg，30.0μmol)用TFA/TIS/H2O(95∶5∶5，5ml)/DTT(260mg)混合物处理，并在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟。将混合物与甲苯(2×5ml)共蒸发。将溶解在MeOH(200μl)中的残余物滴入冷MTBE(13ml)中，这导致固体的沉淀。将混合物在0℃下离心，收集沉淀物，并用另外的冷MTBE(13ml)洗涤，在0℃下离心并收集。将沉淀物溶解于ACN/H2O(5∶5，v∶v，200μl)中，并在制备型HPLC上在C18柱上纯化[λ＝210nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-26分钟100％B；26-30分钟100％B；30-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。合并含有产物的级分，蒸发并冻干成白色固体形式的18.1mg(54％)的HDP30.2466。
MS(ESI+):m/z实测值:1145.50计算值:1146.33[M+Na]+；实测值:573.33计算值:573.67[M+H+Na]2+。
实施例11
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG12-SH试剂(HDP 30.2585)(HDP 30.2585)
步骤1：(ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG12-S(Trt)试剂(HDP 30.2584)
将HDP 30.2401(50.0mg，0.045mmol)溶解在THF(545μl)中，将HDP 30.2581(41.3mg，0.051mmol)和NaHCO3溶液(4.16mg，0.050mmol)溶解在H2O(362μl)中并添加至HDP30.2401溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时。在减压下蒸发反应物，并将残余物再溶解于ACN/H2O(1∶1，v∶v，400μl)中，并在制备型HPLC上在C18柱上纯化[λ＝210nm；梯度：0 5％B；15分钟100％B；18分钟100％B；18.5分钟5％B；22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。蒸发含有产物的级分，冻干成白色冻干粉末形式的43.75mg(57％)的HDP 30.2584。
MS(ESI+):m/z实测值:1707.67计算值:1707.93[M-H]-；实测值:1754.50计算值:1753.94[M+HCOOH-H]-。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG12-SH试剂(HDP 30.2585)
将HDP 30.2584(43.18mg，43.0μmol)用TFA/TIS/H2O(95∶5∶5，6ml)/DTT(120mg)混合物处理，并在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟。将混合物与甲苯(2×6ml)共蒸发。将溶解在ACN(200μl)中的残余物滴入冷MTBE(40ml)中，这导致固体的沉淀。将混合物在0℃下离心并收集沉淀物。用另外的冷MTBE(40ml)洗涤沉淀物，在0℃下离心并收集。将沉淀溶解于ACN/H2O(8∶2，v∶v，200μl)中，并通过制备型HPLC在C18柱上纯化[λ＝210nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-26分钟100％B；26-30分钟100％B；30-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。合并含有产物的级分，蒸发并冻干成白色固体形式的18.2mg(55％)的HDP 30.2585。
MS(ESI+):m/z实测值:1299.58计算值:1300.30[M+H]+；实测值:1316.42计算值:1316.58[M+NH4]+；实测值:1321.58计算值:1322.54[M+Na]+；实测值1337.50计算值:1338.65[M+K]+；实测值:658.92计算值:658.90[M+H+NH4]2+。
实施例12
DUPA-Aoc-Phe-Phe-N-(1-酰胺基-2-巯基)丁烷试剂(HDP 30.2614)
步骤1：(tBuO)2DUPAtBu-Aoc-Phe-Phe-N-(1-酰胺基-2-(S-三苯甲基硫基)丁烷试剂(HDP 30.2612)
如本文实施例9步骤1中所述，用3-三苯甲基硫烷基丁胺作为胺化合物来制备HDP30.2612，得到30.29mg(56％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:1253.50计算值:1254.68[M+H]+。
步骤2：DUPA-Aoc-Phe-Phe-N-(1-酰胺基-2-巯基)丁烷试剂(HDP 30.2614)
如本文实施例9步骤2中所述来制备HDP 30.2614，得到白色粉末形式的6.10mg(30％)产物。
MS(ESI-):m/z实测值:841.33计算值:842.01[M-H]-；实测值:863.33计算值:864.17[(M-2H)+Na]-。
实施例13
6’(6-N-马来酰亚胺基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0880)
步骤1：1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮外型异构体(HDP 30.0891)
将4.00g(41.2mmol)的2,5-二甲基呋喃和5.93g(61.7mmol，1.5当量)马来酰亚胺溶解在30ml的二乙醚(Et2O)中，并在Parr反应器中加热至90℃持续12小时。滤出所得沉淀物，并用MeOH再结晶，得到6.62g(83％)晶体(熔点：137℃)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)＝8.68(宽单峰,1H),6.31(单峰,J,2H),2.88(单峰,2H),1.73(单峰,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)＝175.04,140.82,87.68,53.77,15.76。
步骤2：4-(6-溴己基)-1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮外型异构体(HDP30.0916)
将386mg(2mmol)HDP 30.0891和1.952g(8mmol)1,6-二溴己烷溶解在20ml DMF中，添加276mg(2mmol)碳酸钾，并将悬浮液加热至50℃持续3小时。随后将DMF蒸发，将残余物用100ml DCM溶解。通过过滤除去无机盐，将硅藻土(3g)加入滤液中，并在真空下除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法用梯度正己烷-乙酸乙酯洗脱来纯化，产生蜡状晶体形式的HDP30.0916(483mg)，产率69％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)＝6.31(s,2H),3.48(t,J＝7.2Hz,2H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(s,1H),1.90–1.77(m,2H),1.70(s,5H),1.64–1.52(m,2H),1.44(dddd,J＝9.2,7.4,6.5,5.4Hz,2H),1.35–1.23(m,2H)。
13C NMR(126MHz,CDCl3):δ(ppm)＝174.81,140.81,87.52,52.33,38.42,33.65,32.50,27.54,27.33,25.64,15.87。
步骤3：6′-(6-(1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮-4-基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0903)
在室温下于氩气下，将34.5mg(37.5μmol)真空干燥的α-鹅膏蕈碱溶解于1000μl无水二甲基亚砜(DMSO)中。添加HDP 30.0916(106.8mg，8当量)和1M氢氧化钠(41.2μl，1.1当量)。在室温下3小时后，将反应混合物用41.2μl的1M AcOH的DMSO溶液酸化至pH＝5。在真空中除去溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC在C18柱上以5-100％MeOH的梯度纯化。将包含产物的级分蒸发成无色固体形式的27.2mg(59％)的HDP 30.0903。
MS(ESI+):m/z实测值:1194.17计算值:1195.35[M+H]+；实测值:1216.10计算值:1217.33[M+Na]+。
步骤4：6′-(6-N-马来酰亚胺基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0880)
将HDP 30.0903(27.2mg，22.7μmol)溶于3000μl无水DMSO中。将反应混合物加热至100℃并搅拌1.5小时。冷却至40℃后，在真空中除去DMSO，并用上述方法通过制备型HPLC纯化残余物。收集保留时间为17.3-18.1分钟的级分，并蒸发溶剂。将残余物从3ml tBuOH中冻干，得到灰白色粉末形式的23.6mg(94％)的HDP 30.0880。
MS(ESI+):m/z实测值:1098.29计算值:1099.22[M+H]+；实测值:1120.36计算值:1121.20[M+Na]+。
实施例14
6′-O-[3-(5-硝基吡啶-2-基二硫基)丙基)]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0951)
步骤1：6′-O-(3-S-三苯甲基硫基丙基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0517)
在氩气下将46mg(50μmol)真空干燥的α-鹅膏蕈碱溶解在2500μl无水DMSO中。添加3-(S-三苯甲基)巯基丙基-1-溴化物(159mg，8当量)，随后添加60μl的1M氢氧化钠(NaOH)溶液。在室温下1.5小时后，将反应混合物用50μl的1M AcOH的DMSO溶液酸化至pH＝5，并蒸发溶剂。将残余物溶解于200μl的MeOH中，并滴加到装有10ml MTBE的离心管中。将所得沉淀物冷却至0℃10分钟，并通过离心(4000xg)分离，随后用10ml MTBE洗涤。丢弃上清液，将沉淀溶解在750μl的MeOH中，并在制备型HPLC上在C18柱(250x21.2 mm，Luna RP-18，10μm，)上分三部分纯化[梯度：0分钟5％B；5分钟5％B 20分钟100％B；25分钟100％B；27分钟5％B，35分钟5％B；流速30ml/min]。收集保留时间为21.1-21.8分钟的级分，并将溶剂蒸发成无色固体形式的36.5mg(59％)的HDP 30.0517。
MS(ESI+):m/z实测值:1234.8计算值:1236.45[M+H]+；实测值:1257.3计算值:1258.45[M+Na]+。
步骤2：6′-O-[3-(5-硝基吡啶-2-基二硫基)-丙基)]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0951)
向步骤1产物(5.00mg，4.05μmol)中添加溶解于200μl TFA的2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(DTNP)(6.28mg，5当量)。4分钟后，蒸馏掉挥发物并将残余物与1000μl MeOH共蒸发。如步骤1中一样，通过RP-HPLC来纯化粗产物。收集保留时间为18.46-19.28分钟的级分，并蒸发溶剂。将残余物从2mltBuOH中冻干成轻微的淡黄色固体形式的2.99mg(64％)的HDP30.0951。
MS(ESI+):m/z实测值:1146.97计算值:1148.29[M+H]+；实测值:1169.17计算值:1170.27[M+Na]+。
实施例15
6′-O-[3-(5-硝基吡啶-2-基二硫烷基)丁基)]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2587)
步骤1：6′-O-(3-S-三苯甲基硫基丁基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1168)
在氩气下将38mg(41.3μmol)真空干燥的α-鹅膏蕈碱溶解在无水DMSO(1150μl)中。添加1-溴-3-三苯甲基硫基丁烷(68.1mg，4当量)，随后添加2M氢氧化锂(LiOH)溶液(25μl，1.2当量)。在室温下26小时后，将反应混合物用1M AcOH的DMSO溶液(50μl，1.2当量)酸化，并蒸发溶剂。将残余物溶于400μl的MeOH中，并滴加到装有10ml MTBE的离心管中。将所得沉淀物冷却至0℃保持10分钟，并通过离心(4000xg)分离，随后用10ml MTBE洗涤。丢弃上清液，将沉淀溶解于800μl MeOH中，并在制备型HPLC上在C18柱(250×21.2mm，Luna RP-18，10μm，)上分2部分纯化[λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；15分钟100％B 18分钟100％B；18,5分钟5％B；22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝含0.05％TFA的甲醇；流速30ml/min]。收集对应于产物的级分，并将溶剂蒸发成无色固体形式的31.3mg(61％)的HDP 30.1168。
MS(ESI+):m/z实测值:1271.42计算值:1272.49[M+Na]+。
步骤2：6′-O-[3-(5-硝基吡啶-2-基二硫基)丁基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2587)
向HDP 30.1168(31.17mg，2.6μmol)中加入2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(DTNP)的0.5M的TFA溶液(260μl，5.0当量)，并将混合物在室温下涡旋。4分钟后，将反应混合物滴入10ml冷MTBE/正己烷(1∶1)混合物中。将沉淀物冷却至0℃保持10分钟，并在0℃下通过离心来分离。丢弃上清液，将沉淀溶解于400μl的MeOH中，并按照步骤1中所述的条件分两步进行纯化。收集保留时间为18.46-19.28分钟的级分，并蒸发溶剂。将残余物从tBuOH/H2O(4∶1，10ml)中冻干成浅黄色粉末形式的17.92mg(59％)的HDP 30.2587。
MS(ESI+):m/z实测值:1183.33计算值:1183.36[M+Na]+。
实施例16
6′-O-[3-(3-氨基-1,1-二甲基丙基二硫基)丙氧基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1172)
将HDP 30.0951(10.0mg，8.09μmol)称重到15ml离心管中，并溶解在0.5M DTNP的TFA溶液(80.94μl，5当量)中。将反应混合物在室温下搅拌4分钟。然后将反应混合物用MTBE/正己烷(1∶1，10ml)稀释。将沉淀物冷却至0℃保持10分钟，通过离心(4000xg)分离，随后用MTBE(10ml)洗涤。丢弃上清液，并将沉淀溶解在500μl的MeOH中。加入4-氨基-2-甲基丁烷-2-硫醇HDP 30.1157(17mg，9当量)。1小时后，将混合物用含0.05％TFA(10ml)的MTBE研磨，倒出乙醚，并用含0.05％TFA(10ml)的新鲜MTBE代替。将获得的沉淀物溶解在MeOH(200μl)中，并通过制备型HPLC在C18柱(250x21.2 mm，Luna RP-18，10μm，)上纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。收集对应于产物的级分，并将溶剂蒸发成白色粉末形式的8.05mg(81％)的HDP 30.1172。
MS(ESI+):m/z实测值:1110.39计算值:1110.44[M+H]+。
实施例17
6′-O-(6-氨基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0134)
步骤1：6′-O-(6-Boc-氨基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0132)
在氩气气氛下用2M LiOH溶液(68.6μl，137.1μmol)处理α-鹅膏蕈碱(105mg，114μmol)和6-(Boc-氨基)己基溴化物(128mg，457μmol)在DMSO(3.5mL)中的溶液。在环境温度下搅拌40分钟后，通过添加AcOH(7.84μl)来酸化反应混合物，然后将混合物滴加到含有MTBE(40mL)的烧瓶中，以沉淀所需的醚中间体。倒出并丢弃上清液。将沉淀物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝水；B＝甲醇]，得到白色粉末形式的HDP 30.0132(84.37mg，66％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1118.5计算值:1119.29[M+H]+。
步骤2：6’-O-(6-氨基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0134)
向HDP 30.0132(152mg，136μmol)中加入TFA(5mL)，并将反应混合物在环境温度下搅拌2分钟。在减压下浓缩反应混合物，并将粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；0-1分钟30％B；1-10分钟39％B；10-13分钟100％B；13-18分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。合并含有产物的级分，浓缩并冻干，得到衍生物HDP 30.0134(118.67mg，86％)
MS(ESI+):m/z实测值:1018.5计算值:1019.17[M+H]+。
实施例18
6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1702)
通过采用Jeffrey等人在J.Med.Chem.2005,48,1344-1358中公开的方法，由相应的苄醇合成二肽对氨基溴苄。通过以下路线例示了一般过程：
步骤1：Boc-Val-Ala-PAB-OTBDMS(HDP 30.1683)
将Boc-Val-Ala-PAB-OH(HDP 30.1680，8.28g，21.04mmol)溶解在DMF(50ml)，并添加DIPEA(8.61ml，52.61mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)(10.99ml，31.56mmol)。30分钟后，蒸发DMF，并将残余物溶于200ml EtOAc中，并用100ml 0.2M柠檬酸溶液、水、饱和NaHCO3、饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，并在减压下浓缩。将粗产物通过快速色谱法用0至100％MTBE的己烷溶液的梯度来纯化。合并纯级分，并蒸发成固体形式的9.12g(85％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:508.09计算值:508.32[M+H]+；实测值:530.29计算值:530.30[M+Na]+；实测值:376.22计算值:376.22[MH+tBDMSO]+；实测值:320.22计算值:320.16[MH+tBDMSO-C4H4]+；实测值:约1015计算值:1015.63[2M+H]+；实测值:1037.21计算值:1037.62[2M+Na]+
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)＝8.74-8.70(m,1H),7.51(d,J＝8.5Hz,2H),7.24(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝7.5Hz,1H),5.12(d,J＝7.8Hz,1H),4.73-4.64(m,3H),4.00(s,1H),2.15(dq,J＝13.4,6.7Hz,1H),1:45(d,J＝7.0Hz,3H),1.43(s,9H),0.96(d,J＝6.9Hz,3H),0.94-0.90(m,12H),0:07(s,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ(ppm)＝172.24,170.17,156.28,137.53,136.77,126.81,119.98,80.60,64.80,60.31,49.77,30.84,28.43,26.08,19:44,18:55,17.89,17.78,-5.07。
步骤2：Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-OTBDMS(HDP 30.1687)
在0℃下向步骤1产物(9.12g，17.96mmol)在THF(100mL)中的溶液中，添加双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(LiHMDS)(26.94ml，1M的THF溶液)。10分钟后，在0℃下加入纯净的2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(SEMCl)(6.36ml，35.92mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。转化后，加入200ml柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.40)，将产物用EtOAc(2×50ml)萃取。合并有机层，并用200ml柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.76)、100ml饱和NaHCO3溶液和100mlNaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。将粗产物通过快速色谱法用0至50％MTBE的己烷溶液的梯度来纯化，得到白色泡沫形式的纯产物(7.51g，66％)。
MS(ESI+):m/z实测值:638.03计算值:638.40[M+H]+；实测值:660.47计算值:660.3[M+Na]+。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.40(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6:53(d,J＝7.4Hz,1H),5.14(d,J＝10.0Hz,1H),5.05(d,J＝9.0Hz,1H),4.97(d,J＝10.0Hz,1H),4.76(s,2H),4.54(p,J＝6.9Hz,1H),3.93(t,J＝7.6Hz,1H),3.63(dd,J＝9.6,7.3Hz,2H),2.10(h,J＝6.7Hz,1H),1.43(s,9H),1.16(d,J＝6.9Hz,3H),0.98-0.92(m,14H),0.90(d,J＝6.8Hz,3H),0:12(d,J＝1.4Hz,6H),0.00(s,9H)。
步骤3：Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-OH(HDP 30.1688)
向步骤2产物(7.51g，11.96mmol)在THF(200mL)中的溶液中加入正四丁基氟化铵(TBAF)(14.35ml，1M的THF溶液，14.35mmol)。20分钟后，将硅藻土(20g)加入反应混合物中，并在减压下除去挥发物。将剩余的固体施加在硅胶柱的顶部上，并用0至50％丙酮的己烷溶液的梯度洗脱。合并纯级分并蒸发，得到白色泡沫形式的产物(6.16g，100％)。
MS(ESI+):m/z实测值:524.09计算值:524.32[M+H]+；实测值:546.46计算值:546.30[M+Na]+；实测值:562.41计算值:562.2[M+K]+；实测值:271.07计算值:271.17[M-C13H22NO2Si]+。
步骤4：Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-Br(HDP 30.1690)
向步骤3产物(4.73g，9.03mmol)在DCM(100mL)中的溶液中加入甲磺酸酐(1.89g，1M的DCM溶液，10.84mmol)，随后在氩气下在0℃下加入DIPEA(3.69ml，21.47mmol)。35分钟后，在0℃下加入溴化锂(LiBr)(3.92g，THF的溶液，45.16mmol)。10分钟后，将反应混合物在室温搅拌3小时。加入200ml柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.40)，并将混合物用200ml MTBE稀释。将有机层依次用200ml柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.76)、200ml饱和NaHCO3溶液和200ml NaCl溶液洗涤。合并有机层，用MgSO4干燥，浓缩并在硅胶柱上用0至100％MTBE的己烷溶液的梯度来纯化。合并含有产物的级分，并在减压下蒸发并冻干，得到纯产物(5.96g，93％)。
MS(ESI+):m/z实测值:约586/大约588计算值:586.23/588.23[M+H]+；实测值:约608/610.28计算值:608.21/610.21[M+Na]+。
步骤5：6’-[Boc-Val-Ala(SEM)-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1698)
在室温下于氩气下，将57mg(62.02μmol)的真空干燥的α-鹅膏蕈碱溶解在3000μl的无水二甲基乙酰胺(DMA)中。加入步骤4产物(145.5mg，248.1μmol)和0.2M碳酸铯(Cs2CO3)(372.2μl，74.43μmol)。在室温下4小时后，将反应混合物用10μl的AcOH酸化至pH＝5。在真空中除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC在C18柱上纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝水；B＝甲醇]。将含有产物的级分蒸发成54.46mg(62％)的HDP 30.1698。
MS(ESI+)：MS(ESI+):m/z实测值:1425,23计算值:1424,6
步骤6：6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1702)
将Boc和SEM保护的步骤5产物(134.29mg，94.25μmol)溶解在5ml的TFA中。2分钟后，将混合物在室温下蒸发至干，再溶解于5ml水中，并用滴加的3.2％氨水调节至pH 10。将得到的悬浮液冷冻干燥，应用于RP18-HPLC[λ＝305nm；梯度：0-2分钟5％B；2-10分钟20％B；10-10.5分钟25％B；10.5-13分钟100％B；13-14分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]，将纯级分蒸发并冻干成68.59mg(55％)的无色粉末。
MS(ESI+):m/z实测值:1194.8计算值:1194.53[M+H]+；实测值:1217.8计算值:1216.51[M+Na]+。
实施例19
6’-[(6-马来酰亚胺基己酰胺基)-Val-Cit-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1919)
通过以Boc-Val-Cit-PAB-OH为起始原料重复实施例18步骤1-6的方法，并通过应用实施例25中报道的程序，得到无色粉末形式的标题物质：
MS(ESI+):m/z实测值:1473.60；计算值：1473.65[MH]+
实施例20
6’-[H-Val-Ala-(N-甲基)-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1584)
通过以Boc-Val-Ala-(N-甲基)-PAB-OH为起始原料重复实施例17步骤1-6的方法，得到无色粉末形式的标题物质：
MS(ESI+):m/z实测值:1208.59计算值:1208.54[M+H]+；实测值:1230.61计算值:1230.52[M+Na]+。
实施例21
6’-[(2-溴乙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1704)
/>
将HDP 30.1702(15mg，11.5μmol)溶解在无水DMF(457.26μl)中。添加0.1M的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液(229.2μl，22.9μmol，2.0当量)和0.1M的DIPEA溶液(458.4μl，45.84μmol，4.0当量)，并在室温下搅拌反应混合物。1小时后，将反应混合物用MTBE(40ml)稀释。将沉淀物冷却至0℃保持10分钟，通过离心来分离(4000×g)，随后用MTBE(40ml)洗涤。丢弃上清液。将沉淀干燥，再溶解于MeOH(200μl)中，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]，以在冻干后得到白色粉末形式的6.26mg(42％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:1338.33,计算值:1338.27[M+Na]+。
实施例22
6’-O-[6-(2-溴乙酰胺基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1619)
通过使用本文实施例21中所述的方法，从作为鹅膏蕈碱前体的HDP 30.0134开始，制备HDP30.1619。产物分离为白色粉末(12.34mg，83％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1162.42,计算值:1162.09[M+Na]+。
实施例23
6’-[((3,4-二(苯硫基)-3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1751)
步骤1：3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-羧酸甲酯(HDP 30.1621)
通过采用等人在Tetrahedron Lett.2013,54,3493-3495中公开的方法，由相应的3,4-二溴马来酰亚胺合成3,4-二溴-N-甲基酯马来酰亚胺。
将3,4-二溴马来酰亚胺(5g，19.92mmol)溶解在THF(175ml)中。在室温下于氩气下加入N-甲基吗啉(2.16ml，19.92mmol)和氯甲酸甲酯(1.51ml，19.92mmol)。将反应混合物在室温下于氩气下搅拌20分钟，然后用DCM(200ml)稀释。将有机层用水(200ml)洗涤，用MgSO4干燥，浓缩并冻干，得到6.15g(100％)产物。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝4.01(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝159.23,146.91,131.41,54.79。
步骤2：3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)乙酸叔丁酯(HDP 30.1732)
将HDP 30.1621(2.23g，7.13mmol)溶解在DCM中，并添加甘氨酸单乙酸叔丁酯(1.36g，7.13mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时30分钟。此后，将混合物蒸发并将残余物再溶解在DCM中。添加硅藻土(25g)，并在减压下除去挥发物。将残余物在硅胶柱上用0至50％的MTBE的己烷溶液的梯度纯化。合并含有产物的级分并浓缩，得到白色晶体形式的2.31g(88％)的HDP30.1732。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝4.25(s,2H),1.46(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ165.45,163.32,129.73,83.44,40.85,27.93。
步骤3：[2,5-二氧代-3-苯硫基-4-(1-乙烯基戊-1,3-二烯基硫基)-2,5-二氢吡咯-1-基]乙酸叔丁酯(HDP 30.1660)
将2.31g(6.26mmol)的HDP 30.1732溶解在MeOH(50ml)中。在室温下加入乙酸钠(NaOAc)(1.18g，14.40mmol)和苯硫酚(PhSH)(1.47ml，14.40mmol)。2小时后，将硅藻土(12g)加入反应混合物中，并在减压下除去挥发物。将残余物在硅胶柱上用0至20％的MTBE的己烷溶液的梯度纯化。合并对应于产物的级分并浓缩，得到黄色油形式的2.55g(95％)目标材料。
MS(ESI+):m/z实测值:450.07计算值:450,08[M+Na]+；实测值:372.09计算值:372.04[MH-C4H8]+。
步骤4：(2,5-二氧代-3,4-二苯硫基-2,5-二氢吡咯-1-基)乙酸(HDP 30.1730)
/>
将HDP 30.1660(2.55g，5.96mmol)溶解于TFA(30ml)中，并在室温下搅拌5分钟。此后，将TFA与甲苯(2x30 ml)在真空中共蒸发，得到橙色油形式的HDP 30.1730(2.78g)，其无需进一步纯化即用于下一步反应。
MS(ESI+):m/z实测值:372.16计算值:372.04[M+H]+；实测值:326.24计算值:326,03[MH-HCO2]+。
步骤4：2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-3,4-二(苯硫基)-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(HDP30.1746)
将HDP 30.1730(2.78g，最大值，6.26mmol)溶解在THF(60ml)中。添加HOSu(793mg，6.56mmol)。添加溶解在28ml THF中的DCC(1.42g，6.89mmol)。在室温下搅拌22小时后，滤出二环己基脲(DCU)并将滤液蒸发。将残余物再溶解于DCM(60ml)中，并抽滤掉另外的DCU。将残余物在硅胶柱上用0至20％的MTBE的DCM溶液的梯度纯化。将包含产物的级分蒸发，得到橙色固体形式的化合物(2.12g，72％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.33-7.20(m,10H),4.58(s,2H),2.81(s,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝167.89,164.83,162.89,136.03,131.87,128.83,128.40,128.35,36.91,25.27。
步骤5：6'-[(3,4-二(苯硫基)-3-马来酰亚胺基乙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1751)
随后向溶解于2ml无水DMF的HDP 30.1702(15.00mg，11.46μmol)中添加1.72ml(34.39μmol)的HDP 30.1746溶液(在DMF中为20mM)和DIPEA(5.85μl，34.39μmol)。在室温下于氩气下2小时后，将混合物在真空中蒸发，并将残余物溶解于MeOH(200μl)中并滴入10ml冷MTBE中，并且在0℃下离心。收集沉淀物，用另外的10ml MTBE洗涤并再次离心。干燥粗产物，然后通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；0-1分钟30％B；1-10分钟39％B；10-13分钟100％B；13-18分钟5％B；A＝水；B＝甲醇]。将含有产物的级分浓缩并冻干成白色粉末形式的9.27mg(52％)产物。
MS(ESI+):m/z实测值:796,63计算值:796,26[M+2Na]2+
实施例24
6’-[(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1699)
将HDP 30.1702(17.09mg，14.3μmol)溶解在无水DMF(350μl)中。添加溶解于DMF(350μl)的3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)(7.62mg，28.6μmol，2.0当量)和未稀释的DIPEA(9.79μl，57.2μmol，4.0当量)。在室温下于氩气下搅拌1小时30分钟后，将混合物滴入40ml冷MTBE中，并在0℃下离心。收集沉淀物并用40ml MTBE洗涤并再次离心。干燥粗产物，并通过RP18-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。将纯级分冻干，得到白色粉末形式的12.51mg(65％)的标题产物6’-[(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱。
MS(ESI+):m/z实测值:1367.50计算值:1368.45[M+Na]+。
实施例25
6’-[(6-马来酰亚胺基己酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2254)
将HDP 30.1702(23.49mg，17.9μmol)溶解在无水DMF(400μl)中。添加溶解于DMF(562μl)中的6-(马来酰亚胺基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(ECMS)(11.07mg，35.9μmol)和DIPEA(12.21μl，7.16μmol)。在室温下于氩气下2小时后，将混合物滴入40ml冷MTBE中，并在0℃下离心。收集沉淀物并用40ml MTBE洗涤并再次离心。干燥粗产物，并通过RP18-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。将纯级分冻干，得到白色粉末形式的21.03mg(86％)的标题产物6’-[(6-马来酰亚胺基己酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱。
MS(ESI+):m/z实测值:1145.7计算值:1144.99[M+Na]+。
实施例26
6’-O-[6-((Glu-脲基-Lys)脲基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1585)
步骤1：6’-O-[6-((Glu(tBuO)3-脲基-Lys)脲基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1581)
向6’-O-(-6-氨基己基)-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0134，按照EP 2621536中公开的而合成)(11.32mg，10mmol)在DMF(1ml)中的溶液中，添加HDP 30.1579(12.57mg，20mmol)在DMF(1ml)中的溶液，而以纯净形式加入DIPEA(5.10μl，30mmol)。17小时后，添加水(100μl)，并将混合物在高真空下浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝水；B＝甲醇]。合并纯级分，浓缩并冻干24小时，得到无色残余物形式的缀合物HDP 30.1581(13.38mg，87％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1531.61计算值:1531.77[M+H]+；实测值:1553.79计算值:1553.75[M+Na]+；实测值:1475.56计算值:1475.71[MH-tBu]+；实测值:1419.53计算值:1419.65[MH-2 tBu]+；实测值:1363.54计算值:1363.58[MH-3 tBu]+。
步骤2：6’-O-[6-((Glu-脲基-Lys)脲基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1585)
将HDP 30.1581(13.38mg，8.73μmol)溶解在TFA(1ml)中，并将混合物在室温下搅拌2分钟，然后在减压下浓缩。将残余物再次溶解于TFA(1ml)中，并将混合物在室温下搅拌5分钟，然后在减压下浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。合并纯级分，浓缩并冻干24小时，得到无色固体形式的产物HDP 30.1585(6.82mg，57％)。
MS(ESI+)实测值:1363.56计算值:1363.58[M+H]+；实测值:1385.59计算值:1385.57[M+Na]+。
实施例27
6’-O-[-((Glu-脲基-Lys)脲基-Val-Ala-(N-甲基)PAB)-α-鹅膏蕈碱(HDP30.1592)
步骤1：6’-O-[(Glu(tBuO)3-脲基-Lys)脲基-Val-Ala-(N-甲基)PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.1588)
向HDP 30.1584(7.68mg，5.81mmol)在DMF(1ml)中的溶液中，添加HDP 30.1579(7.30mg，11.61mmol)在DMF(1ml)中的溶液，而以纯净形式添加DIPEA(3.95μl，23.23mmol)。22小时后，加入H2O(100μl)，并将混合物在高真空下浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝水；B＝甲醇]。合并纯级分，浓缩并冻干24小时，得到无色残余物形式的缀合物HDP 30.1588(8.42mg，84％)。
MS(ESI+):m/z实测值:约1721计算值:1721.85[M+H]+；实测值:1743.72计算值:1743.83[M+Na]+；实测值:1665.52计算值:1665.78[MH-tBu]+。
步骤2：6’-O-[-((Glu-脲基-Lys)脲基-Val-Ala-(N-甲基)PAB)-α-鹅膏蕈碱(HDP30.1592)
将HDP 30.1588(8.42mg，4.89μl)溶解于TFA(1ml)中，并将混合物在室温下搅拌2分钟，然后在减压下蒸发。将残余物再次溶解于TFA(1ml)中，并将混合物在室温下搅拌5分钟，然后在真空下浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。合并纯级分，浓缩并冻干24小时，得到无色固体形式的产物HDP 30.1592(4.37mg，58％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1553.49计算值:1553.66[M+H]+；实测值:1575.56计算值:1575.64[M+Na]+；实测值:1535.85计算值:1535.65[MH-H2O]+。
实施例28
6’-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-二硫杂丙基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2246)
在室温下于氩气下，向HDP 30.2225(13.4mg，15.6μmol)在DMSO(1.5ml)中的溶液中添加HDP 30.0951(17.9mg，15.6μmol)在DMSO(1.6ml)中的溶液。未稀释地添加DIPEA(5.15μl，3.0μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时20分钟。将橙色粗产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-16分钟60.6％B；16-23分钟100％B；23-26分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。合并含有产物的级分，浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP 30.2246(11.36mg，40％)。
MS(ESI+):m/z实测值:947.5计算值:948.0[M+2Na]2+实测值:1872.4计算值:1873.1[M+Na]+。
实施例29
6′-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys-二硫基)丁基)]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2589)
在室温下于氩气下，向HDP 30.2225(2.27mg，2.6μmol)在MeOH(135μl)中的溶液中添加HDP 30.2587(3.07mg，2.6μmol)在MeOH(280μl)中的溶液。未稀释地添加DIPEA(0.9μl，5.2μmol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时，然后蒸发溶剂。将残余物溶解于MeOH(200μl)中，并通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；15分钟100％B；18分钟100％B；18.50分钟100％B；22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。将含有产物的级分浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP 30.2589(2.79mg，58％)。
MS(ESI-):m/z实测值:1862.58计算值:1861.71[M-H]-。
实施例30
6′-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-酰氨基-2-甲基丁烷-2-基)二硫基)丙基]-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2609)
步骤1：6′-O-[3-((ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-(4-酰氨基-2-甲基丁烷-2-基)二硫基)丙基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2606)
将HDP 30.1172(5.07mg，4.6μmol)和NaHCO3(0.92mg，10.9μmol)溶解在H2O/THF混合物(20∶80，248μl)中，并添加HDP 30.2401(5.13mg，5.03μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后蒸发溶剂。将残余物溶解于MeOH(200μl)中，并通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。将含有产物的级分浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP30.2606(6.38mg，75％)。
MS(ESI-):m/z实测值:1031.00计算值:1031.23[M+2Na]2+。
步骤2：6′-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-酰胺基-2-甲基丁烷-2-基)二硫基)丙基]-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2609)
将HDP 30.2606(6.10mg，3.0μmol)溶解于TFA(1ml)中，并在室温下摇动2分钟。然后蒸发TFA，并将残余物溶解于TFA(1ml)中，并在室温下摇动另外5分钟(×2)。最后将TFA与甲苯(2x1 ml)共蒸发。
将样品溶解在ACN/H2O(8∶2，200μl)中，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化[λ＝305nm；梯度：0分钟5％B；15分钟100％B；18分钟100％B；18.50分钟100％B；22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。将含有产物的级分蒸发并冻干成白色粉末形式的1.1mg(20％)的HDP30.2609。
MS(ESI-):m/z实测值:1846.67计算值:1847.15[M-H]-；实测值:922.44计算值:923.07[M-2H]2-。
实施例31
6′-O-[3-DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-酰胺基丁烷-2-基)二硫基]丙基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2618)
在室温下于氩气下向HDP 30.2614(4.64mg，5.5μmol)在MeOH(423μl)中的溶液中添加HDP30.0951(6.31mg，5.5μmol)。未稀释地添加DIPEA(1.88μl，11μmol)，反应混合物变为强烈的黄色。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后蒸发溶剂。将残余物溶解于MeOH(200μl)中，并通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-16分钟61％B；16-19分钟100％B；19-22分钟100％B；22-25分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]。将含有产物的级分浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP 30.2618(4.69mg，47％)。
MS(ESI-):m/z实测值:1832.58计算值:1833.12[M-H]-；实测值:915.83计算值:916.05[M-2H]2-。
实施例32
6′-O-[3-DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-酰胺基丁烷-2-基)二硫基]丁基]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2619)
如本文在实施例29中所述，通过使用HDP 30.2587和HDP 30.2614作为前体来制备HDP30.2619，得到白色粉末形式的2.9mg(60％)的最终缀合物。
MS(ESI-):m/z实测值:1846.67计算值:1847.15[M-H]-；实测值:922.92计算值:923.07[M-2H]2。
实施例33
6’-O-[6-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2284)
/>
在室温下于氩气下，向HDP 30.2225(12.97mg，15.1μmol)在DMSO(1ml)中的溶液中添加HDP 30.2254(21.03mg，15.1μmol)在DMSO(2ml)中的溶液。未稀释地添加DIPEA(5.15μl，3.0μmol)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。将反应混合物注入制备型RP-HPLC中[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。合并含有产物的级分，浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP 30.2284(14.53mg，43％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1146.5计算值:1146.2[M+2Na]2+。
实施例34
6’-O-[3-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEGn)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱
将HDP 30.1699(5.24mg，3.9μmol)溶解在DMSO(520μl)中。依次添加溶解于DMSO(260μl)的HDP 30.2439(5.7mg，3.9μmol，1.0当量)以及DIPEA(1.33μl，7.8μmol，2.0当量)。将反应混合物在室温下于氩气下搅拌24小时，然后将产物通过制备型RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-1分钟5％B；14分钟54％B；18分钟69％B；19-20分钟100％；21-22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈]以提供白色粉末形式的3.54mg(43％)产物HDP 30.2471。
MS(ESI-)m/z＝[M-H]-实测值:2290.92,计算值:2291.58；[M-2H]2-实测值:1144.92,计算值:1145.29。
分别由作为前体的HDP 30.2466和HDP 30.2585开始，按如上所述来制备HDP30.2474和HDP30.2680。该合成产生2.95mg(41％)的HDP 30.2474和1.08mg(20％)的HDP30.2680。
HDP 30.2474-MS(ESI+):m/z实测值:1254.80计算值:1254.39[M+H+K]2+；实测值:843.75计算值:845.92[M+3Na]3+。
HDP 30.2680-MS(ESI-):m/z实测值:2643.33计算值:2644.01[M-H]-；实测值:2703.42计算值:2704.06[M+AcOH-H]-；实测值:1321.25计算值:1321.5[M-2H]2-；实测值:1377.85计算值:1378.51[M+TFA-2H]2-；实测值:1434.42计算值:1435.52[M+2TFA-2H]2。
实施例35
6’-O-[(3,4-双(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)乙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2300)
/>
在室温下于氩气下，向HDP 30.1751(21mg，14μmol)在DMSO(5.6ml)中的溶液中加入HDP 30.2225(23.2mg，27μmol)的溶液。未稀释地添加DIPEA(13.82μl，81μmol)。将反应混合物在室温下搅拌49小时。将反应混合物注入制备型RP-HPLC中[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇。合并包含产物的级分，浓缩并冻干24小时，得到白色固体形式的化合物HDP 30.2300(4.0mg，10％)。
MS(ESI+):m/z实测值:1522.60计算值:1522,61[M+2H]2+；实测值:1015.40计算值:1015,40[M+3H]3+。
实施例36
6’-O-[(3,4-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEGn)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱
将HDP 30.1751(2.41mg，1.62μmol，1.0当量)溶解在MeOH(347μl)中。依次添加HDP30.2585在MeOH(230μl，7.29μmol，4.5当量)中的0.03M溶液和NaOAc在MeOH(140μl，12.64μmol，7.8当量)中的0.1M溶液，在室温下于氩气下搅拌混合物20小时。
在减压下蒸发混合物，并将残余物溶解于ACN/H2O(1∶1，200μl)中，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化[λ＝210nm；梯度：0-1分钟5％-30％B；1-18分钟50％B；18-20分钟100％B；20-22分钟100％B；22-23分钟5％B；23-25分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈]。收集对应于产物的级分，蒸发并冻干(tBuOH/H2O，4∶1，3ml)，得到淡黄色粉末形式的3.12mg(49％)的HDP30.2595。
MS(ESI-):m/z实测值:1961.83,计算值:1962,25[M-2H]2-；实测值:1307.58,计算值:1307.83[M-3H]3-；实测值:980.42,计算值:980.62[M-4H]4-。
分别由作为前体的HDP 30.2466和HDP 30.2585开始，按如上所述来制备HDP30.2490和HDP30.2595。该合成产生1.86mg(37％)的HDP 30.2490和3.12mg(49％)的淡黄色粉末形式的HDP30.2595。
HDP 30.2490-MS(ESI-):m/z实测值:1785.75计算值:1786.03[M-2H]2-；实测值:1190.17计算值:1190.35[M-3H]3-；实测值:892.42计算值:892.51[M-4H]4。
HDP 30.2595-MS(ESI-):m/z实测值:1961.83计算值:1962.25[M-2H]2-；实测值:1307.58计算值:1307.83[M-3H]3-；实测值:980.42计算值:980.62[M-4H]4-。
实施例37
6’-O-[6-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2301)
在室温下于氩气下，向HDP 30.0880(20.48mg，18.6μmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中添加HDP 30.2225(16.0mg，18.6μmol)在DMF(0.5ml)中的溶液。未稀释地添加TEA(5.18μl，37.2μmol)。将反应混合物在室温下搅拌4天。将反应混合物注入制备型RP-HPLC中[λ＝268nm；梯度：0-1分钟5％B；1-14分钟54％B；14-26分钟100％B；26-30分钟100％B；30-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝乙腈]；合并含有产物的级分，浓缩并冻干24小时，得到白色固体的化合物HDP30.2301(6.03mg，17％)。
MS(ESI+):m/z实测值:979.42计算值:979.60[M+2Na]2+。
实施例38
6’-O-[3-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2535)
通过使用本文中实施例33报道的相同方法，获得白色粉末形式的期望化合物(2.84mg，43％)。
MS(ESI-):m/z实测值:2203.08计算值:2203.43[M-H]-；实测值:1101.00计算值:1101.21[M-2H]2-。
实施例39
6’-O-[6-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基)-Val-Cit-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2537)
通过使用本文中实施例33报道的相同方法，获得白色粉末形式的期望化合物(6.42mg，83％)。
MS(ESI-):m/z实测值:2331.00计算值:2331.60[M-H]-；实测值:1164.92计算值:1165.30[M-2H]2-。
实施例40
6’-O-[2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)乙酰胺基-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.2515)
将HDP 30.1704在ACN/H2O中的溶液(1∶1，v∶v)(2.60mg，2μmol，4mM)和HDP30.2225在ACN/H2O中的溶液(1∶1，v∶v)(1.71mg，2μmol，4mM)混合并用Na2CO3/NaHCO3缓冲液(100mM，pH＝9.3，750μl)稀释至pH＝9.0，得到HDP 30.2225的最终浓度等于1.14mM。将反应混合物在室温下搅拌1小时半，并将产物通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化[λ＝305nm；梯度：0-5分钟5％B；20-25分钟100％B；27-35分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水；B＝含0.05％TFA的甲醇]。分离出产物，为2.61mg的白色粉末(62％)。
MS(ESI-):m/z实测值:1045.42,计算值:1045.66[M-2H]2-；实测值:696.67,计算值:696.77[M-3H]3-。
实施例41
6’-O-[6-(2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)硫基)乙酰胺基)己基]-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2523)
由作为鹅膏蕈碱前体的HDP 30.1619开始，如本文中实施例40所述来制备HDP30.2523。分离出产物，为白色粉末形式(5.68mg，67％)。
MS(ESI-):m/z实测值:1915.75,计算值:1916.15[M-H]-；实测值:957.42,计算值:957.57[M-2H]2-。
实施例42
6’-O-[2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys)硫基)乙酰胺基-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2594)
由作为鹅膏蕈碱前体的HDP 30.1704开始，如本文中实施例40所述来制备HDP30.2594。分离出产物，为白色粉末形式(1.24mg)。
MS(ESI-):m/z实测值:2623.83计算值:2624.84[M-H]-；实测值:1311.50计算值:1311.92[M-2H]2-；实测值:874.00计算值:874.72[M-3H]3-。
C.有关DUPA-鹅膏毒素缀合物的数据
图2至图5显示了细胞毒性研究的结果，表8显示了有效的DUPA-α-鹅膏蕈碱缀合物的选择性(S)和靶向指数(TI)值。
表8显示了有效的DUPA-α-鹅膏蕈碱缀合物的选择性(S)和靶向指数(TI)值
D.半衰期延长的DUPA-毒素结合物的合成和表征
实施例43
发明人开发了一种用于将DUPA-鹅膏蕈碱缀合物移植到人IgG1 Fc上的两步“程序化和武装”策略，如图6所示。首先通过分选酶A(SrtA)介导的包含PSMA靶向部分的三官能接头、SrtA底物和叠氮化物柄的连接，将Fc蛋白程序化以靶向PSMA表达细胞(图7)。SrtA是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的转肽酶，广泛用于抗体和抗体片段的位点特异性修饰(Swee L.K.,Guimares C.P.,Sehrawat S.,Spooner E.,Barrasa M.I.,PloeghH.L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2013,110,1428-1433；Kornberger P.,Skerra A.mAbs2014,6,354-366；Wagner K.,Kwakkenbos M.J.,Claassen Y.B.,Maijoor K.,Bohne M.,van der Sluijs K.F.,Witte M.D.,van Zoelen D.,J.,Cornelissen L.A.,Beaumont T.,Bakker A.Q.,Ploegh H.L.,Spits H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014,111,16820-16825；Dickgiesser S.,Rasche N.,Nasu D.,Middel S.,S.,Avrutina O.,DiederichsenU.,Kolmar H.ACS Chem.Biol.2015,10(9),2158-2165)。SrtA催化的反应导致在C端分选基序LPXTG(X等于任何氨基酸)和N端低聚甘氨酸之间形成新的酰胺键(Chen L.etal.Sci.Rep.2016,6,article number:31899)。
克隆了编码具有C端SrtA识别序列LPETG的人IgG1 Fc片段的表达质粒，并用于Expi293FTM细胞中的瞬时表达。为防止N端截短的形成，引入了另一种N端TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒核——包涵体—肽链内切酶)裂解位点。此外，遗传去除CH2域中N297处独特的糖基化位点，以避免异质性问题，该问题在使用哺乳动物细胞作为生产系统并简化制造和分析过程时会发生(Dmitrij Hristodorov,Rainer Fischer,Lars LindenMol.Biotechnol.2013,54,1056-1068)。在其化学修饰之前，将构建体通过蛋白质A纯化，并导致产生约122.5mg/L的含C-端SrtA标签的IgG1 Fc片段，称为Fc-LPETG(图6)，其中单体纯度>99％。
通过向PSMA靶向部分添加PEG3-PEG3-Orn(N3)-Lys(Gly-Gly-Gly)接头来设计三官能含DUPA接头，其将N端GGG用于Fc-LPETG转肽作用和将叠氮官能团用于毒素缀合(图7)，并通过SPPS来组装。
为此，在活性优化的SrtA(eSrtA)的催化下，将Fc-LPETG构建体(图6)与大大过量的三官能含DUPA接头(图7A)反应(Chen I.,Dorr B.,Liu D.R.Proc.Natl.Acd.Sci.USA2011,108,1139-11404)。优化连接条件以确保最大的缀合产率并最小化逆反应。根据SDS-PAGE分析，反应以几乎定量的转化顺利进行(图14B)。在天然的非还原条件下，通过尺寸排阻色谱除去过量的试剂。通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下证实DUPA-Fc缀合物(程序化的Fc；图6)是二硫连接的Fc二聚体(图14)。在非还原条件下的ESI-MS分析(图14A，面板b)进一步证实了Fc二聚体的预期分子量。然而，去卷积结果揭示了两个不同的峰，这两个峰归属于用一至两个接头分子修饰的Fc形式，导致接头与抗体之比(LAR)的平均值为1.62(图14A，面板b)。
在SrtA介导的缀合之后，发明人随后研究了应变促进的叠氮炔烃环加成(SPAAC)，这是一种温和的化学选择性反应，保留了DUPA-Fc缀合物的化学计量和残基特异性(ThomasJ.D.,Cui H.,North J.P.,Hofer T.,Rader C.,Burke Jr T.R.Bioconjugate Chem.2012,23(10),2007-2013)，用于以二苯并环辛炔(DBCO)-鹅膏蕈碱衍生物“武装”DUPA-Fc构建体(图7B)。对于此概念验证研究，我们选择了组织蛋白酶B可裂解接头策略，这是因为其向靶细胞释放和递送未修饰的α-鹅膏蕈碱的潜力。
以20倍过量的DBCO-鹅膏蕈碱进行缀合反应，随后通过尺寸排阻-快速蛋白质液相色谱(SEC-FPLC)进行纯化，以去除过量的游离毒素衍生物，得到约19mg/L的总DUPA-Fc-鹅膏蕈碱缀合物(程序化和武装化的Fc；图6)。
通过在非还原条件下的SDS-PAGE(与DUPA-Fc相比，显示出迁移至更高的分子量)以及通过利用α-鹅膏蕈碱的免疫检测的蛋白质印迹分析证实了最终缀合物中α-鹅膏蕈碱的掺入(图14B和14C)。如SDS-PAGE所示并通过去卷积质谱图所证实，相对于所连接的接头分子的数目，DUPA-Fc的异质性导致异种物质的形成，其中药物与抗体之比(DAR)为1-2。计算出平均DAR等于1.72，这与针对DUPA-Fc所报道的LAR值一致(图14A，面板c)。
步骤1：三官能含DUPA接头的合成
将40RAM树脂(703mg，0.267mmol)在DCM中溶胀1小时，用DCM洗涤并重悬于DMF中30分钟。用20％哌啶的DMF溶液对树脂进行脱保护(30s，室温2分钟，30W，50℃)，然后在DMF(8ml)中与Fmoc-Lys(Mtt)-OH(4.0当量)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸铵(TBTU；3.99当量)、DIPEA(8.0当量)一起在室温下摇动1小时，然后在MW辐射下摇动(30W，50℃，3分钟)。重复两次偶联，其间进行几次DMF洗涤。通过在上述条件下将树脂悬浮在20％哌啶的DMF(3ml)溶液中来除去Fmoc。然后通过在MW辐射(30W，50℃，3分钟，x3)下，将树脂与Fmoc保护的氨基酸(4.0当量)、TBTU(3.99当量)、DIPEA(8.0当量)在DMF(8ml)中一起摇动进行每次偶联，随后在本文提及的条件下进行Fmoc去除。在MW辐照(30W，50℃，3分钟，x 3)下，通过使用TBTU(2.99当量)、DIPEA(6.0当量)来偶联受保护的DUPA试剂(3.0当量)。在裂解之前，通过将结合树脂的肽悬浮在DCM/TIS/TFA(97:2:1，4ml)中并在室温摇动10分钟来去除Mtt。重复该过程，直到通过HPLC在滤液中检测不到Mtt-OH为止(约20个循环)。然后使赖氨酸侧链与预组装的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH反应。然后将树脂用DCM充分洗涤并在真空中干燥。从树脂上裂解肽，并在室温下用TFA/茴香醚/TIS/H2O(94:2:2:2，20ml)混合物完全脱保护2小时。将混合物分四部分沉淀在预冷的MTBE(40ml)中，并通过在0℃下离心10分钟收集沉淀。收集沉淀，在真空中干燥并溶解于ACN/H2O(1∶1，v∶v)中用于通过RP-HPLC纯化[λ＝210nm；梯度：0分钟5％B；14分钟40％B；19分钟45％B；20-21分钟100％B；22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；流速：30ml/min]。将所需化合物直接冻干，得到白色粉末形式的119.46mg(28％)所需接头。
RP-HPLC tR＝14.51分钟。
ESI-MS m/z:[M-H]-计算值:1598.81实测值1598.83；[M-2H]2-计算值:798.90；实测值799.00。
以下方案显示了三官能含DUPA接头的MW辅助的SPPS。
i)a-20％哌啶的DMF溶液，室温，30s(x1)，W＝30，T＝50℃,3分钟(x2),b-Fmoc-Lys(Mtt)-OH(4当量)，TBTU(3.99当量)，DIPEA(8当量)，室温，1小时，W＝30，T＝50℃，3分钟(x1)；ii-v)a-20％哌啶的DMF溶液，室温，30s(x1)，W＝30，T＝50℃，3分钟(x2),b-c-AA-OH(4当量)，TBTU(3.99当量)，DIPEA(8当量)，W＝30，T＝50℃，3分钟(x 3)；vi)a-20％哌啶的DMF溶液，室温，30s(x1)，W＝30，T＝50℃，3分钟(x2)，b-4，(3.0当量)，TBTU(2.99当量)，DIPEA(6.0当量)，W＝30，T＝50℃，3分钟(x 3)；vii)a-TFA/TIS/DCM(1/2/97,4ml)，室温，10分钟(x 20)，viii)a-Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(4当量)，TBTU(3.99当量)，DIPEA(8当量)，1小时，室温，W＝30，T＝50℃，3分钟(x 3)，b-20％哌啶的DMF溶液，室温，30s(x1),W＝30，T＝50℃，3分钟(x 2)[x 3]；ix)TFA/茴香醚/TIS/H2O(94/2/2/2,20ml)，室温，2小时。
步骤2：鹅膏蕈碱-DBCO接头的合成
如以上方案所示，由鹅膏蕈碱前体HDP 30.1702(其合成是根据上文所述的方法完成的(实施例18))合成鹅膏蕈碱-DBCO衍生物。将前体HDP 30.1702(80.32mg，0.067mmol)溶解于无水DMF(1.6ml)中。将二苯并环辛炔-N-琥珀酰亚胺酯(DBCO-SE)(29.8mg，0.074mmol)溶解在DMF(1.6ml)中，并将DIPEA(22,9μl，0.13mmol)添加到溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2.5小时。
通过加入H2O(100μl)终止反应，并将DMF在真空中蒸发。将残余物溶解于甲醇(MeOH)(2ml)中，滴入预冷的MTBE(40ml)中，并在0℃下离心。用MTBE(40ml)洗涤沉淀，收集并在真空中干燥。将化合物通过RP-HPLC纯化[λ＝305nm；梯度：0-15分钟5％B；18分钟100％B；1,5-22分钟5％B；A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；流速：30ml/min]。将对应于产物的级分直接冻干，得到白色粉末形式的77.88mg(78％)的鹅膏蕈碱-DBCO衍生物。
ESI-MS m/z:[M+H]+计算值:1481.62,实测值1481.42；[M+2H]2+计算值:741.32,实测值741.42。
步骤3：用于蛋白质表达的质粒的克隆
质粒载体pEXPR-TEV-G5-H20C-Fc-LPETGG(由德国达姆施塔特工业大学的H.Kolmar教授提供)编码SEQ ID No.1的氨基酸序列。该质粒用于表达Fc-LPETG多肽，其包含TEV裂解位点、H20区域、代表免疫球蛋白的CH2和CH3区域的Fc结构域以及SrtA标签(见图8)。
SEQ ID No.1：
AENLYFQGGGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGS
SEQ ID No.2：
LPETGG
SEQ ID No.3：
AENLYFQGGGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSLPETGG
步骤4：蛋白质Fc-LPETGG的表达和纯化
根据制造商的说明书，使用PEI试剂(聚乙烯亚胺)以Fc-LPETGG构建体瞬时转染Expi 293FTM细胞。将Expi293FTM细胞培养在2升烧瓶中，每瓶Expi293培养基的最终体积为500毫升。
通过在50ml的Opti-MEM培养基中将1.5ml的PEI试剂(在H2O中为1mg/ml)与500μg的DNA混合来制备转染复合物。在室温下孵育15分钟后，将转染混合物添加到425ml体积的Expi293FTM细胞悬浮液中。在转染后16小时，将细胞在室温下以460x g离心20分钟，丢弃上清液，并加入500ml新鲜的Expi293F表达培养基。在转染后第6天，将细胞在3488x g和4℃下离心40分钟。将细胞上清液在4℃下以10947x g再次离心20分钟。用500ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液稀释培养基，并通过1.2、0.65、0.45、0.22μm无菌过滤器离心。将最终溶液施加在蛋白质A柱上。用结合缓冲液(PBS pH 7.4)洗涤柱，并用洗脱缓冲液(甘氨酸0.1M pH 3.0)洗脱结合的级分，并且用中和缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)1M pH 9.0)中和。将收集的蛋白质样品在4℃下用SrtA缓冲液(Tris-HCl 50mM pH 7.4，NaCl 150mM)透析过夜。通过Abs280nm测得蛋白质浓度为4.8mg/ml(122.5mg/l培养物)。
步骤5：分选酶A(SrtA)介导的肽三官能含DUPA接头与Fc-LPETG片段的连接
如Chen et al.PNAS 2011 108(28)11399-11404所述来制备eSrtA。在分选酶A五突变(eSrtA)酶(0.125当量，2.6μM)存在下将蛋白质A纯化的Fc-LPETG(40mg，20.65μM)与三官能含DUPA接头(50当量，1mM)在SrtA反应缓冲液(Tris-HCl 50mM pH 7.5，NaCl 150mM，CaCl25mM)中混合。使反应在25℃下进行18小时，然后使用SEC-FPLC在HiLoadTM26/600SuperdexTM200pg柱上纯化，以去除eSrtA和过量的肽。首先用PBS缓冲液(pH 7.4)使柱平衡，然后使用与柱平衡所用的相同的缓冲液来洗脱含DUPA的Fc 15。使用Ultra-15离心过滤器(MWCO 50000)浓缩来自柱的流出液，并通过0.22μm无菌过滤器(无菌/>过滤器)过滤。通过Abs280nm(MW＝58461.89Da，ε280＝74675.1cm-1M-11)测得DUPA-Fc缀合物的浓度为3.6mg/ml(27.87mg)。
步骤6：通过SPAAC将DBCO-鹅膏蕈碱接头与DUPA-Fc构建体缀合
将DBCO-鹅膏蕈碱接头(20当量，12.18mg)溶解在ACN/H2O(3:1，1.28ml)中，并添加到在PBS缓冲液(pH 7.4，8.46ml)中的DUPA-Fc(24mg，48.6μM)中。加入DMSO(2.24ml)。将混合物在37℃下孵育24小时。通过SEC-FPLC在HiLoadTM16/600SuperdexTM200pg柱上进行纯化。将缀合物浓缩至最终体积7.5ml，在其用于生物测定之前将其通过0.22μm无菌过滤器过滤。通过Abs280nm(MW＝61425.21Da，ε280＝85500cm-1M-11)测得DUPA-Fc-鹅膏蕈碱缀合物的浓度为3.16mg/ml(23.7mg)。
实施例44
与单独的Fc-DUPA-接头和在200倍摩尔过量的PSMA抑制剂2-PMPA存在下的缀合物相比，在四种前列腺癌细胞系中测试了DUPA-Fc-α-鹅膏蕈碱缀合物的细胞毒性。
仅在表达PSMA的细胞系LNCaP和C4_2PSMA(+++)；22RV1 PSMA)(+)中观察到DUPA-Fc-α-鹅膏蕈碱缀合物的细胞毒性作用。观察到PSMA阳性细胞系中的EC50为5.04–15.17nM。缀合物的活性被2-PMPA完全抑制。如预期的那样，在PSMA阴性PC3细胞系中未观察到缀合物的活性。该缀合物表现出优异的体外选择性(图15)。
在Cb17 Scid雄性小鼠(n＝3)中测试了DUPA-Fc-α-鹅膏蕈碱缀合物的血液药代动力学。观察到与双室模型和FcRn循环相关的双相消除曲线。测得快速消除相半衰期为82分钟，并在施用5分钟-4小时后的早期时间点观察到。从施用后4小时往前明显观察到缓慢消除相。测得该相的半衰期为5.5天(图16)。
在Cb 17 Scid小鼠LNCaP异种移植模型(n＝8-9)中测试了DUPA-Fc-α-鹅膏蕈碱缀合物的抗肿瘤作用。
如相对体重图所示，提出的给药方案是完全耐受的。所观察到的恶病质与LNCaP模型相关，并且在媒介物注射组中也观察到。
DUPA-Fc-α-鹅膏蕈碱缀合物的抗肿瘤作用明显地是剂量和施用频率依赖性的。在治疗开始后第25天，在所有治疗动物中，每周一次施用1mg/kg和每周两次施用0.5mg/kg产生完全应答。每周3次施用0.25mg/kg和每周一次服用0.5mg/kg产生相似的肿瘤应答：直至第25天导致轻微的肿瘤消退并抑制肿瘤生长。每周两次施用0.25mg/kg在施用期间抑制肿瘤生长，但显示出有限的体内功效。每周一次施用0.25mg/kg仅稍微延迟了肿瘤的生长，但在治疗期结束时，在统计学上与媒介物治疗组无差异(图17)。

Claims (21)

1.缀合物，其包含(a)鹅膏毒素；(b)基于2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(I)或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸(II)的PSMA结合部分；和(c)连接所述鹅膏毒素和所述PSMA结合部分的接头，所述缀合物具有结构VII或VIII：
其中每个L为接头，Ama为鹅膏毒素，B为三官能接头元件，EM为半衰期延长部分，且R选自H、C1-6-烷基和对溴苄基，并且其中所述缀合物包含由所述三官能接头B的叠氮基部分与将所述鹅膏毒素连接至所述三官能接头B的所述接头L的炔部分的反应产生的1,2,3-三唑，并且其中所述炔部分选自丙炔酸、3-丁炔酸、4-戊炔酸、5-己炔酸、二苄基环辛炔(DiBO)、二苄基氮杂环辛炔酮(DBCO)和双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)。
2.权利要求1的缀合物，其中所述半衰期延长部分包含抗体的Fc部分。
3.权利要求2的缀合物，其中所述半衰期延长部分包含人抗体的Fc部分。
4.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中每个L独立地包含n个独立地选自-CH2-、-CHR1-、-C(R2)2-、-O-、-S-、-NH-、-NR3-、-C(＝O)-、-亚苯基-、2,5-二氧代-1,3-亚吡咯烷基、1,2,3-亚三唑基的接头元件，其中R1选自C1-6-烷基、-COOH、氨基酸的侧链；R2选自C1-6-烷基；R3选自C1-6-烷基，B选自鸟氨酸、赖氨酸、1,3,4-三取代的马来酰亚胺和1,3,4-三取代的琥珀酰亚胺，并且n是独立地选自6至60的整数。
5.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中每个L独立地包含一个或多个独立地选自-(CH2)x-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、二肽、三肽、四肽、-(O-CH2-CH2-)y、-(CH2-CH2-O-)y、N,O-二取代的对氨基苄氧基和2,5-二氧代-1,3-亚吡咯烷基、1,2,3-亚三唑基的接头元件，其中x和y是独立选自2至12的整数。
6.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中在结构VII的情况下通过羧酰胺基团–C(＝O)-NH-，或在结构VIII的情况下通过羧酰胺基团-NR–C(＝O)-或脲基-NR–C(＝O)-NH-将所述PSMA结合部分缀合到所述接头L。
7.权利要求1至3中任一项的缀合物，其具有结构VII，其中所述接头L具有以下结构
(Aoc元件)a-(多肽)b-(亚烷基)c-(PEG)d-(硫醇元件)e-(亚烷基)f-(自杀式元件)g
其中因子a至g中的每一个独立地选自0和1，条件是所述因子中的至少一个是1。
8.权利要求1至3中任一项的缀合物，其具有结构VIII，其中所述接头(L-)2-B-L具有以下结构
[(Aoc元件)a-(多肽)b-(PEG)]2-B-亚烷基)c-(自杀式元件)d
其中因子a至d中的每一个独立地选自0和1，条件是所述因子中的至少一个是1。
9.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述鹅膏毒素通过位置1处的天冬氨酸残基的侧链缀合至所述接头L。
10.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述鹅膏毒素通过位置3处的二羟异亮氨酸残基的侧链缀合至所述接头L，或者所述鹅膏毒素通过位置4处的色氨酸残基的吲哚氮原子缀合至所述接头L。
11.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述鹅膏毒素通过位置4处的色氨酸残基的吲哚环的亚苯基部分缀合至所述接头L。
12.权利要求11的缀合物，其中所述鹅膏毒素通过醚键缀合至所述吲哚环的位置6′。
13.权利要求1、2或3中任一项的缀合物，其具有结构IX
其中所述PSMA结合部分包含2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸或6-氨基-2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]己酸。
14.权利要求1、2或3中任一项的缀合物，其中所述L-Ama选自：
15.权利要求14的缀合物，其为选自下列的化合物：
16.权利要求1、2、3或15中任一项的缀合物，其中所述Fc部分由SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3组成。
17.药物组合物，其包含权利要求1至16中任一项的缀合物。
18.权利要求1至16中任一项的缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
19.权利要求17的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.权利要求18的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管上皮癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
21.权利要求19的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管上皮癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
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