CN114555599A

CN114555599A - 制备(4s)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

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Publication number: CN114555599A
Application number: CN202080072389.4A
Authority: CN
Inventors: J·普拉策克; K·洛维斯; A·埃尔南德斯马丁; S·布雷迪
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CA3157823A1; KR20220084102A; BR112022005605A2; JOP20220148A1; IL292194A; US20240150344A1; CR20220161A; PE20221414A1; CL2022000941A1; EP4045500A1; JP2022553225A; MX2022004480A; WO2021074077A1; CN114555599B; AU2020365314A1; CO2022004464A2

Abstract

本发明涉及一种使用水解酶通过手性拆分式(II)的化合物制备式(IIa)的(4S)‑(4‑氰基‑2‑甲氧基苯基)‑5‑乙氧基‑2,8‑二甲基‑1,4‑二氢‑1,6‑萘啶‑3‑羧酸的酰氧基甲基酯的方法。本发明还涉及一种制备式(Ia)的(4S)‑4‑(4‑氰基‑2‑甲氧基苯基)‑5‑乙氧基‑2,8‑二甲基‑1,4‑二氢‑1,6‑萘啶‑3‑甲酰胺的方法，所述方法包括使用水解酶手性拆分式(II)的化合物。此外，本发明还涉及水解酶在制备式(IIa)的化合物的方法中的用途。本发明还涉及水解酶在制备式(Ia)的化合物的方法中的用途。

Description

制备(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基- 1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

本发明涉及一种使用水解酶通过光学拆分式(II)的化合物制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法：

本发明还涉及一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法，其中所述方法包括使用水解酶光学拆分式(II)的化合物。

本发明还涉及一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法，其中使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应以得到式(II)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的外消旋酰氧基甲基酯，并使用水解酶通过光学拆分将式(II)的化合物转化为式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的对映体酰氧基甲基酯，并将式(IIa)的化合物水解成式(IIIa)的化合物，然后将该式(IIIa)的化合物转化以获得式(Ia)的化合物：

更具体而言，本发明涉及一种制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分式(II)的化合物进行，

其中R为直链或支链C1-C25链。

本发明更具体而言涉及一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其中使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

以得到式(II)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的外消旋酰氧基甲基酯

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

并使用水解酶通过光学拆分将该式(II)的化合物转化为式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的对映体酰氧基甲基酯

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

并将该式(IIa)的化合物在THF/水混合物(2:1)中用氢氧化钠溶液水解，以得到式(IIIa)的化合物

然后使该式(IIIa)的化合物在作为溶剂的THF中首先与1,1-碳二咪唑(1,1-carbodiimidazole)和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶反应，加入六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane)，然后将混合物在回流下加热16-24小时，然后加入THF/水混合物。

此外，本发明还涉及水解酶在制备式(IIa)的化合物的方法中的用途。

本发明还涉及水解酶在制备式(Ia)的化合物的方法中的用途。术语“非奈利酮(finerenone)”涉及化合物(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺或式(Ia)的化合物

式(I)的化合物为非奈利酮的外消旋体

表述“非奈利酮的对映体”或“式(I)的化合物的对映体”涉及式(Ia)和(Ib)的化合物

非奈利酮(Ia)作为盐皮质激素受体的非甾体拮抗剂，并且可用作预防和/或治疗心血管和肾脏疾病例如心力衰竭和糖尿病肾病的药剂。

式(Ia)的化合物及其制备方法记载于WO 2008/104306 A1和ChemMedChem 2012,7,1385以及WO 2016/016287 A1中。为了获得式(Ia)的化合物，必须将酰胺的外消旋混合物(I)分离成对映体(Ia)和(Ib)

因为仅式(Ia)的对映体具有活性

在公开的研究级合成(WO 2008/104306 A1)中，为此目的使用了特别合成的手性相(内部制备)，其包含N-(二环丙基甲基)-N²-甲基丙烯酰基-D-亮氨酰胺作为手性选择剂。已发现，还可以在容易商购获得的相上进行分离。其为Chiralpak AS-V相，20μm。使用的洗脱液为甲醇/乙腈60:40的混合物。在这种情况下，层析可在常规色谱柱上进行，但优选使用本领域技术人员已知的技术，例如SMB(模拟移动床；G.Paredes,M.Mazotti,Journal ofChromatography A,1142(2007):56-68)或Varicol(Computers and ChemicalEngineering27(2003)1883-1901)。

尽管SMB分离能够提供相对良好的收率和光学纯度，但是在GMP条件下这种设备的购置成本和操作的挑战巨大，并伴随着高成本。甚至在每种情况下使用的手性相非常昂贵，并且仅具有有限的使用期限，在生产过程中必须经常更换。出于生产工艺的考虑，这不是最佳的，除非存在第二个设备来确保连续操作，这会带来额外的成本。此外，特别是在以吨级制备的产物的情况下，溶剂回收是时间限制性步骤，需要购买大型降膜蒸发器，并消耗大量的能量。

因此，解决的问题是提供对映体纯的非奈利酮(Ia)的替代合成路线，该替代合成路线成本显著降低并且可使用常规的中试工厂(pilot plant)设备(搅拌釜/分离装置)进行。这些设备为传统上制药生产厂的标准设备，并不需要额外的投资。此外，分批法的操作技能和验证比色谱法的要容易得多，这是一个额外的优点。

本发明涉及一种制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为直链或支链C1-C25链。

表述“C1-C25链”意指“C₁-C₂₅-烷基链”。表述“C₁-C₂₅-烷基”意指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子的直链或支链的饱和一价烃基。根据本发明可用的烷基的实例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基或1,3-二甲基丁基或其异构体。

C1-C25链可以是直链或支链的。

C1-C25链可以被芳族基团取代。

术语“取代的”意指所述原子或基团上的一个或多个氢原子已被选自指定的基团的选项所替代，条件是在特定情况下不超过所述原子的正常化合价。取代基和/或变量的组合是允许的。

术语“未取代的”意指没有一个氢原子被替代。

术语“芳族基团”包括“芳基”和“杂芳基”。

术语“芳基”优选应理解为意指具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的单价、芳族或部分芳族、单环或双环或三环烃环(“C6-C14-芳基”基团)，特别是具有6个碳原子的环(“C6-芳基”基团)，例如苯基；或具有9个碳原子的环(“C9-芳基”基团)，例如茚满基或茚基，或具有10个碳原子的环(“Clo-芳基”基团)，例如四氢化萘基(tetralinyl)、二氢萘基或萘基，或联苯基(“C12-芳基”基团)或具有13个碳原子的环(“C13-芳基”基团)，例如芴基，或具有14个碳原子的环(“C14-芳基”基团)，例如蒽基。芳基优选为苯基。

术语“杂芳基”优选应理解为意指具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子的单价、单环、双环或三环芳族环体系(5元至14元杂芳基基团)，特别是具有5或6或9或10个原子，并且其中至少一个杂原子可以相同或不同，其中所述杂原子为氧、氮或硫，并且在每种情况下可另外是苯并稠合的。更具体而言，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基(thia-4H-pyrazolyl)等及其苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等及其苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基(azocinyl)、中氮茚基(indolizinyl)、嘌呤基等及其苯并衍生物；或噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘吡啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、氧杂蒽基(xanthenyl)或氧杂卓基(oxepinyl)等。

“水解酶”是在可逆反应中水解裂解酯、醚、肽、糖苷、酸酐或C-C键的酶。该术语以本领域技术人员惯用的含义使用。水解酶的实例在下文中列出。术语“水解酶”包括“脂肪酶”、“酯酶”、“酰胺酶”和“蛋白酶”。

“脂肪酶”、“酯酶”、“酰胺酶”和“蛋白酶”是属于水解酶的亚组。该术语以本领域技术人员惯用的含义使用。脂肪酶的实例在下文中列出。

在本发明的新方法中，不是对酰胺的外消旋混合物(I)进行所述复杂的SMB分离以获得式(Ia)和(Ib)的对映体

而是对合成前体——外消旋单元(II)——进行有利的酶促光学拆分

用于光学拆分的外消旋二氢吡啶酯与水解酶(优选脂肪酶)的反应记载于文献中。实例包括：Torres等人,Org.Biomol.Chem.,2017,15,5171-5181；Xin等人,CN 2016-106279000；Verdecia等人,US 2014/0275042；Torres等人,Tetrahedron 71(2015)3976-3984；Sobolev等人,Biocatalysis and Biotransformations,2004,231-252(综述)；Schnell等人J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1-2000-4389。

此外，还记载了其他底物的拆分：Tetrahedron Letters,第29卷,第36期,1988,第4623-4624页；Biotechnology Letters,1994年9月,第16卷,第9期,第919-922页。

已经进行了许多尝试来借助酶促法合成可用于非奈利酮(Ia)的合成的合适手性衍生物。此处所述的衍生物在水中的溶解度(<<100mg/L)或在水混溶性有机溶剂中的溶解度极差，因此本领域技术人员非常惊讶地发现，可以找到允许以良好收率和高对映体纯度制备(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的手性酰氧基甲基酯(IIa)的条件。

对于酶促水解，必须区分两种情况。首先将具有4S构型的目标对映体(IIa)水解并转化为酸(IIIa)，然后将其分离出来，或者其次将具有4R构型的对映体(IIb)水解，并使4S构型的酯(IIa)保留在溶液中，然后在分离后将其转化为酸(IIIa)。

酯和酸这两种产物均可通过萃取非常容易地彼此分离。

可以使用以下商业化酶进行转化：

·来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的AK脂肪酶[CAS号9001-62-1；优选UniProtKB条目-Q7WZT7(Sigma-Aldrich,Amano Enzyme)]

·来自褶皱假丝酵母(Candida rugosa)的VII型脂肪酶(Sigma-Aldrich,L1754)

·来自褶皱假丝酵母的脂肪酶(Sigma-Aldrich 62316)

·来自爪哇毛霉(Mucor javanicus)的Amano脂肪酶M(Sigma-Aldrich 534803)

·来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的Amano脂肪酶PS(Sigma-Aldrich 534641)

·Amano脂肪酶PS-IM(Sigma-Aldrich 709603)

·来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶(Sigma-Aldrich 62301)

·来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(Sigma-AldrichL0777)

·来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶(Sigma-Aldrich L4277)

·来自南极假丝酵母(Candida antarctica)B的脂肪酶(Lipozyme,Novozymes)

·来自南极假丝酵母A的脂肪酶(Novocor AD L,Novozymes)

·来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶(Resinase HT,Novozymes)

·来自特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶(Novozym 51032,Novozymes)

·来自南极假丝酵母B的脂肪酶，固定化(Novozym 435,Novozymes)

·来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶，固定化(Lipozyme TL IM,Novozymes)

·来自米黑根毛霉的脂肪酶，固定化(Novozym 40086,Novozymes)

·丙烯酸树脂中来自南极假丝酵母的脂肪酶(Sigma-Aldrich L4777)

·来自猪肝的脂肪酶(Sigma-Aldrich E3019)

转化在具有水性缓冲液(例如磷酸钠、磷酸钾，优选磷酸钾)和水混溶性或水不混溶性有机溶剂(例如乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、THF、DMF、DMSO、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、1,4-二噁烷、2-甲基-THF、甲苯或其混合物)的单相或双相体系中进行。转化在pH为pH 7.0至pH 10、优选pH 7-8、更优选pH 7下进行。可以通过足够的缓冲能力，或通过逐渐滴加无机碱(例如KOH或NaOH)使pH保持恒定，两者均为水溶液。在一些情况下，已发现有利的是添加添加剂，例如糖、丙三醇、Mg盐、Ca盐。

转化在22-45℃、优选25-38℃的温度下进行；将混合物搅拌10小时至10天(取决于所使用的酶)。

已发现以下溶剂组合特别有用：

·2-甲基-THF/磷酸钾缓冲液pH 7

·10％DMSO/90％50mM磷酸钾缓冲液pH 7

·20％叔丁基甲基醚/80％50mM磷酸钾缓冲液pH 7

·水饱和的叔丁基甲基醚/各种缓冲液pH 7–pH 7.5

·50％环戊基甲基醚/50％50mM磷酸钾缓冲液pH 7

·1:1w/w Triton X-100、1.5％DMF/98.5％50mM磷酸钾缓冲液pH 7–pH 8

·水饱和的1,4-二噁烷/各种缓冲液pH 7–pH 7.5

对于反应溶液的后处理，可以通过加入饱和氯化钠溶液(或另一种盐溶液，例如CaCl₂)停止反应，然后可以通过用合适的溶剂萃取来萃取产物。产物可以通过色谱法进一步纯化。在许多情况下，粗产物也可以直接重结晶。通常已发现有利的是，将产物(通常显示>70％的ee％值)再次重结晶，以便由此获得>99％的ee％值。已发现用于最终重结晶的有用的溶剂为叔丁基甲基醚与醇例如乙醇、甲醇、异丙醇或乙酸乙酯或乙酸异丙酯的混合物。

本发明还涉及一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其中使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

然后使该式(IIIa)的化合物在作为溶剂的THF中首先与1,1-碳二咪唑和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶反应，加入六甲基二硅氮烷，然后将混合物在回流下加热16-24小时，然后加入THF/水混合物。

下文描述了手性酰氧基甲基酯(IIa)进一步转化为非奈利酮(Ia)。

从手性酰氧基甲基酯(IIa或IIb)开始，通过碱性水解和随后的酸处理获得酸(IIIa或IIIb)：

水解可以通过本领域技术人员已知的方法借助于无机碱在有机溶剂中或使用水混溶性溶剂以本身已知的方式进行。已发现，反应可以在THF/水的混合物中以相对浓缩的形式非常容易地进行。为此，优选在THF/水2:1(9倍量)的混合物中进行，在0-5℃下计量加入氢氧化钠水溶液中，然后将混合物在0-5℃下搅拌1-2小时。还可以使用氢氧化钾溶液，但优选使用氢氧化钠或氢氧化钾。后处理通过以下方式进行：用MTBE(甲基叔丁基醚)和乙酸乙酯或仅甲苯萃取，并通过用无机酸(例如盐酸、硫酸或磷酸，但优选盐酸)将pH调节至7进行分离。然后可以加入相应酸的饱和铵盐溶液，但优选氯化铵溶液，使产物定量结晶。分离后，产物用水和乙酸乙酯或乙腈或丙酮(但优选乙腈)洗涤，并在40-50℃下真空干燥。收率几乎是定量的(99％)。

酸(IIIa或IIIb)至酰胺(Ia或Ib)的后续转化描述如下：已发现，在THF中的酸(IIIa或IIIb)的转化中，酰胺(Ia或Ib)从溶液中直接结晶出来，并且可以高收率和纯度获得。为此，使羧酸(IIIa或IIIb)与1.1-1.6当量、优选1.3-1.4当量的1,1'-碳二咪唑在THF中在DMAP催化下(5-15摩尔％，优选10摩尔％/在一些情况下已发现该反应也可以在不添加DMAP的情况下进行)反应以得到鎓类咪唑(imidazolide)，其在温度20-50℃下进行，已证明优选的方法最初在20℃下开始，然后在该温度下搅拌1至2小时，然后在50℃下进一步搅拌2至3小时。在活化结束后，加入3-8当量、优选4.5当量的六甲基二硅氮烷，并将混合物在回流下沸腾16-24小时，但优选16小时。此处形成的二甲硅烷基酰胺化合物可任选地被分离，但已发现更有利的是在一锅法反应中继续进行。在反应结束后，因此将混合物冷却至0-3℃，并加入水/或与THF混合的混合物；已发现有利的是使用0.5至0.7倍量的水(基于反应物)，特别有利的是使用0.52倍量的水。水可以直接添加或作为与约1至2体积当量的THF的混合物添加。在骤冷结束后，将混合物加热至回流总共1-3小时，优选1小时。将混合物冷却至0℃并在该温度下搅拌1-5小时，优选3小时，然后将产物通过过滤或离心分离。产物用THF和水洗涤，并在高温(30至100℃，优选40℃至70℃)下真空干燥。收率非常高且通常为理论值的>93％。纯度通常为>99％(HPLC，100％方法)。化合物(Ia)还可以通过在高压釜(约25至30巴)中与氨气反应直接获得。为此，进行上述预活化，然后将反应混合物在气态氨中在压力下加热。反应完成后，将其冷却并滤出产物。由此获得的收率和纯度是可比较的。

最终结晶法(最终修正Mod A的建立)：为此，出于GMP相关考虑，首先将(Ia)溶解于乙醇中并进行颗粒过滤，然后将溶剂在减压下或在标准温度下蒸馏出，优选使用甲苯变性的乙醇。将混合物浓缩至体积的约1/3至1/5；使产物结晶出来。将其冷却至0℃，然后将晶体分离并在40-50℃下真空干燥。收率通常大于理论值的90％。获得的化学纯度为>99.8％且含量～100％符合ICH指南中商业产品的标准。在乙醇的情况下，残留溶剂为<0.02％。光学纯度>>99％e.e.。

本文描述的非创造性方法具有优于现有技术的几个优点。在非奈利酮合成(Ia)的前体处分离对映体不需要特定设备(例如SMB、手性色谱法)。酶促拆分可以在完全标准的搅拌反应器中进行。使用水作为反应介质可以节省昂贵溶剂的成本。结果还发现废物的处理比以前方法中废物的处理更环保。酶促光学拆分能够提供通常具有70-91％对映体过量(e.e.％)的中间体(IIa)。相对简单的结晶可以将对映体过量增加至>99％e.e.，已知用93％e.e.材料甚至可获得高纯度非奈利酮(Ia)，因为不正确的对映体由于结晶而在下游合成序列中丢失。因此，酯(IIa)可以在相对浓缩的操作模式下重结晶，以保持尽可能低的损失。

以下是对本发明的其他实施方案的说明：

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

在本发明的上下文中优选一种制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用脂肪酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链,

所述方法使用来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

在本发明的上下文中优选一种制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法，

其中R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基、正戊基或正己基，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基、正戊基或正己基。

所述方法使用脂肪酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

所述方法使用脂肪酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

在本发明的上下文中特别优选一种制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为甲基，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基。

其中R为甲基，

所述方法使用脂肪酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为甲基。

其中R为甲基，

其中R为甲基。

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

以得到式(II)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的外消旋酰氧基甲基酯，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

在本发明的上下文中优选一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

并使用脂肪酶通过光学拆分将该式(II)的化合物转化为式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的对映体酰氧基甲基酯

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

并使用来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶通过光学拆分将该式(II)的化合物转化为式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的对映体酰氧基甲基酯

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

在本发明的上下文中优选一种制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基、正戊基或正己基，

X为氯或溴，

其中

并将该式(IIa)的化合物在THF/水混合物(2:1)中用氢氧化钠溶液水解，以得到式(IIIa)的化合物，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

X为氯或溴，

其中

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

X为氯或溴，

其中

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯或溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯或溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯或溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为溴，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为氯或溴，

R为甲基，

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为溴，

R为甲基，

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为氯或溴，

R为甲基，

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为溴，

R为甲基，

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为氯或溴，

其中

R为甲基，

其中

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为溴，

其中

R为甲基，

其中

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

X为氯，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其中

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为氯，

R为甲基，

R为甲基，

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为甲基，

X为氯，

其中

R为甲基，

其中

R为甲基，

在有机碱或无机碱(例如三乙胺、三丁胺、吡啶、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化锂)的存在下，在有机溶剂(例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、NMP、乙腈、THF、DMSO、环丁砜、丙酮、2-丁酮)中进行转化。在0℃至80℃、优选20-60℃、更优选20-40℃下进行转化。在后处理后获得的粗产物通过结晶进行纯化。

酸(III)的制备记载于WO 2016/016287 A1(实施例6)中。

卤代酯(V)的制备类似于G.Sosnovsky,N.U.M.Rao,S.W.Li,H.M.Swartz,J.Org.Chem.1988,54,3667和N.P.Mustafaev,M.A.Kulieva,K.N.Mustafaev,T.N.Kulibekova,G.A.Kakhramanova,M.R.Safarova,N.N.Novotorzhina,Russ.J.Org.Chem.2012,49,198中所述的合成进行。

在一个实施方案中，本发明涉及水解酶在通过光学拆分化合物(II)制备式(IIa)的化合物的方法中的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及水解酶在通过光学拆分化合物(II)制备式(IIa)的化合物的方法中的用途，其中所述方法对应于如进一步阐明的制备式(IIa)的化合物的方法的实施方案之一。

本发明还涉及水解酶在制备式(Ia)的化合物的方法中的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及水解酶用于制备式(Ia)的化合物的用途，其中所述方法对应于如进一步阐明的制备式(Ia)的化合物的方法的实施方案之一。

以下段落1至10构成本发明的其他实施方案：

1.制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

2.根据第1段所述的方法，其特征在于

R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基、正戊基或正己基。

3.根据第1或2段所述的方法，其特征在于

R为甲基。

4.根据第1、2或3段所述的方法，其特征在于所使用的水解酶为脂肪酶。

5.根据第4段所述的方法，其特征在于使用来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶。

6.制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

7.根据第6段所述的方法，其特征在于

和

X为溴。

8.根据第6或7段所述的方法，其特征在于

R为甲基，

和

X为溴。

9.根据第6、7或8段所述的方法，其特征在于脂肪酶用于光学拆分。

10.根据第9段所述的方法，其特征在于来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶用于光学拆分。

段落1至10

以下段落1至10构成本发明的其他实施方案：

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

2.根据第1段所述的方法，其特征在于

3.根据第1或2段所述的方法，其特征在于

R为甲基。

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

7.根据第6段所述的方法，其特征在于

和

X为溴。

8.根据第6或7段所述的方法，其特征在于

R为甲基，

和

X为溴。

段落(1)至(27)

以下段落(1)至(27)构成本发明的其他实施方案：

(1)制备式(IIa)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的酰氧基甲基酯的方法

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

(2)根据第1段所述的方法，其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基、正戊基或正己基，并且

其中，在式(II)的化合物中，

(3)根据第1或2段所述的方法，其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，并且

其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

(4)根据第1、2或3段所述的方法，其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基，并且

其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基。

(5)根据第1至4段中任一项所述的方法，其中所使用的水解酶为脂肪酶。

(6)根据第1至5段中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶选自来自褶皱假丝酵母的VII型脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的脂肪酶、来自爪哇毛霉的Amano脂肪酶M、来自洋葱伯克霍尔德氏菌的Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶PS-IM、来自黑曲霉的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自南极假丝酵母A的脂肪酶、来自米曲霉的脂肪酶、来自特异腐质霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母的脂肪酶和来自猪肝的脂肪酶。

(7)根据第1至6段中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶为来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶。

(8)根据第1至7段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在单相体系中进行。

(9)根据第1至7段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在双相体系中进行。

(10)根据第1至9段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在水性缓冲液中进行。

(11)根据第1至10段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在选自磷酸钠、磷酸钾及其混合物的水性缓冲液中进行。

(12)根据第1至11段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在pH为pH 7.0至pH10、pH 7至8或pH 7下进行。

(13)根据第1至12段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在水混溶性或水不混溶性有机溶剂中进行。

(14)根据第1至13段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在水混溶性有机溶剂中进行，所述水混溶性有机溶剂选自乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、THF、DMF、DMSO、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、1,4-二噁烷、2-甲基-THF、甲苯及其混合物。

(15)根据第1至14段中任一项所述的方法，其中所述光学拆分在选自以下的溶剂组合中进行

·2-甲基-THF/磷酸钾缓冲液pH 7；

·10％DMSO/90％50mM磷酸钾缓冲液pH 7；

·20％叔丁基甲基醚/80％50mM磷酸钾缓冲液pH 7；

·水饱和的叔丁基甲基醚/各种缓冲液pH 7–pH 7.5；

·50％环戊基甲基醚/50％50mM磷酸钾缓冲液pH 7；

·1:1w/w Triton X-100、1.5％DMF/98.5％50mM磷酸钾缓冲液pH 7–pH 8；和

·水饱和的1,4-二噁烷/各种缓冲液pH 7–pH 7.5。

(16)制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

(17)根据第16段所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基或正戊基、正己基，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、苄基、正丁基或正戊基。

(18)根据第16或17段所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

(19)根据第16至18段中任一项所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，

R为甲基，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基。

(20)根据第8至11段中任一项所述的方法，其中，在式(V)中，X为氯且R如第16至19段中任一项所定义，并且其中，在式(II)的化合物中，R如第16至19段中任一项所定义，并且其中，在式(IIa)的化合物中，R如第16至19段中任一项所定义。

(21)根据第16至20段中任一项所述的方法，其中脂肪酶用于光学拆分。

(22)根据第16至21段中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶选自来自褶皱假丝酵母的VII型脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的脂肪酶、来自爪哇毛霉的Amano脂肪酶M、来自洋葱伯克霍尔德氏菌的Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶PS-IM、来自黑曲霉的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自南极假丝酵母A的脂肪酶、来自米曲霉的脂肪酶、来自特异腐质霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母的脂肪酶和来自猪肝的脂肪酶。

(23)根据第16至22段中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶为来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶。

(24)水解酶在通过光学拆分化合物(II)制备式(IIa)的化合物的方法中的用途。

(25)根据第24段所述的用途，其中所述制备式(IIa)的化合物的方法如第1至15段中任一项所定义。

(25)水解酶在制备式(Ia)的化合物的方法中的用途。

(26)根据第25段所述的用途，其中所述制备式(Ia)的化合物的方法如第16至22段中任一项所定义。

(27)根据第25或26段所述的用途，其中所述制备式(Ia)的化合物的方法如第16至22段中任一项所定义，并且还包括如第1至15段中任一项所定义的制备式(IIa)的化合物的方法。

实验

缩写和首字母缩略词：

<u>EtOH</u>	<u>乙醇</u>
		<u>DB酒石酸</u>	<u>二苯甲酰酒石酸</u>
<u>DMSO</u>	<u>二甲基亚砜</u>
		<u>th.的</u>	<u>(收率)理论值的</u>
HPLC	高压、高效液相色谱
		1H-NMR	1H核磁共振光谱
IT	内部温度
		MS	质谱
RT	室温
		RRT	相对保留时间
TFA	三氟乙酸
		TI	内部温度
TM	夹套温度
		XRPD	X-射线粉末衍射(粉末衍射仪)
酒精	用2％甲苯变性的乙醇

实施例

下表3示出了在HPLC中回收的化合物的结构。HPLC中保留时间的分配如下所示。

表3

在粗非奈利酮(Ia)阶段用于检查杂质的含量及对映体纯度的分析方法

仪器：超高效液相色谱仪(压力范围最高达1200巴，带有温控柱烘箱和UV检测器)

柱:YMC Triart C8长度：100mm；内径：3.0mm；粒径：1.9μm最大压力：1000巴

条件：20℃；0.50mL/min；1.7μL(10℃)；252nm/6nm和230nm/6nm用于DB酒石酸的评估

洗脱液：A：0.1％TFA于水中；B：乙腈

梯度：时间(min)A(％)B(％)

仪器：带有温控柱烘箱和UV检测器的高效液相色谱仪

柱：Chiralpak IA

长度：250mm，内径：4.6mm，粒径：5.0μm

最大压力：300巴

条件：40℃；0.8mL/min；5μL(20℃)；255nm/6nm

洗脱液：A：乙腈；B：甲基叔丁基醚(MTBE)

等梯度：A(％)90:B(％)10

对映体纯度

方法B

仪器/检测器：带有温控柱烘箱和UV检测器的高效液相色谱仪和数据评估系统

测量波长：252nm

烘箱温度：40℃

柱：Chiralpak IC

长度：150mm，内径：4.6mm，粒径：3μm

流动相：

A:50％缓冲液20mM NH₄OAc pH 9

B：50％乙腈

流速：1mL/min。

洗脱时间：8min。

平衡：不必要的，等梯度

样品溶剂：洗脱液

样品溶液：约0.5mg/mL的物质外消旋体，溶解于样品溶剂中

对比溶液：制备类似于样品溶液的对比溶液

进样体积：10μL

在以下实施例中用于对映体测定的所述测量值均由方法B测定。一些值，特别是在中试工厂中制备的批料的那些值，用方法A重新分析以进行比较，并给出了可比较的结果。

在以下实施例中给出的关于最终产物纯非奈利酮(Ia)的纯度和含量的HPLC分析数据仅与产物中以>0.05％的量存在的杂质有关。这基本上为杂质E。上文列表中示出的所有其他杂质通常为<0.05％。这些杂质的结构通过从富集母液中分离来测定。

HPLC条件/方法

方法(C)

YMC Hydrosphere C18

150*4.6mm，3.0μm

25℃，1mL/min，270nm，4nm

0’：70％TFA 0.1％*；30％乙腈

17’：20％TFA 0.1％；80％乙腈

18’：70％TFA 0.1％；30％乙腈

*：TFA于水中

方法(D)

YMC Hydrosphere C18

150*4.6mm，3.0μm

25℃，1mL/min，255nm，6nm

0’：90％TFA 0.1％；10％乙腈

20’：10％TFA 0.1％；90％乙腈

18’：10％TFA 0.1％；90％乙腈

方法(E)

Nucleodur Gravity C18

150*2mm，3.0μm

35℃，0.22mL/min，255nm，6nm

溶液A：0.58g磷酸氢铵和0.66g磷酸二氢铵于1L水中(磷酸铵缓冲液pH 7.2)

溶液B：乙腈

0‘：30％B；70％A

15‘：80％B；20％A

25‘：80％B；20％A

方法(F)

柱：Nucleodur C18 Gravity，50x3 mm，1.8μm，45℃，1.2mL/min，210nm，1.2nm；

溶剂A：0.1％甲酸水溶液

溶剂B：0.1％甲酸乙腈溶液

0’：80％A；20％B

1.3’：20％A；80％B

2’：20％A；80％B

2.5’：80％A；20％B

方法(G)

柱：Chiralpak AD-H，250x4.6mm，5μm，40℃，2mL/min，207nm，6nm；

溶剂A：正庚烷

溶剂B：乙醇+0.1％二乙胺溶液

0’：95％A；5％B

16’：95％A；5％B

16.1’：10％A；90％B

20’：10％A；90％B

平衡：10min

实施例1

在平行合成设备中，以下通式(II)的外消旋酰氧基酯以10-15mg合成*并通过质谱表征：

*将酸(III)与溴代酯(V A-F)在DMF和碳酸钾中于40℃一起搅拌。将固体滤出，并将滤液直接层析以进行纯化，然后通过冷冻干燥分离。

实施例2

筛选结果

对于外消旋酰氧基酯(II A-F)的动力学分离，测试了多种水解酶的潜力。将外消旋起始物料溶解于有机溶剂(例如DMSO、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、1,4-二噁烷、DMF或2-甲基-THF)中，然后加入上述酶的缓冲水溶液(pH 7)。使用以下脂肪酶：来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的VII型脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的脂肪酶、来自爪哇毛霉的Amano脂肪酶M、来自洋葱伯克霍尔德氏菌的Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶PS-IM、来自黑曲霉的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自南极假丝酵母A的脂肪酶、来自米曲霉的脂肪酶、来自特异腐质霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶(固定化)、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶(固定化)、来自米黑根毛霉的脂肪酶(固定化)、丙烯酸树脂中来自南极假丝酵母的脂肪酶或来自猪肝的脂肪酶。将所得双相体系在22至36℃下搅拌，直至达到接近50％的转化率。产物和对映体纯化的底物的分离通过碱-酸萃取进行。用5％磷酸钾水溶液处理有机层将所需的对映体纯化的残留酯从酸中分离出来，并进行对映体过量的色谱测定(方法G)。

达到的对映体过量(ee)通常为70％e.e.至91％e.e.；4R对映体优选被水解。

为了进一步放大反应，选择4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(±)-乙酰氧基甲基酯(IIA)，因为它在筛选中显示出最好的结果。原则上，其他酯(II B-F)也适用于适当的放大。

实施例3a

(4S,4R)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸乙酰氧基甲基酯(IIA)

将57.68g(152.024mmol)外消旋(4S,4R)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(III)、46.51g(304.049mmol)乙酸溴甲酯(VA)和42.02g(304.05mmol)碳酸钾于288mL二甲基乙酰胺中的初始装料在20℃下搅拌20小时(通过TLC完全转化，乙酸乙酯/庚烷1:1，R_f(酯＝0.18))。将反应混合物过滤(除去盐)，并将滤渣用400mL乙酸乙酯洗涤。将滤液用400mL水，然后用200mL饱和氯化钠水溶液洗涤两次。将有机相在减压下浓缩至干，并将残留物用200mL叔丁基甲基醚/50mL乙醇重结晶。

收率：27.04g(理论值的39％)，可以从母液中分离出另外20g材料。

MS(ES+):452[M+H]⁺，

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝1.10(t,J＝7.09Hz,3H),1.96(s,3H),2.16(s,3H),2.42(s,3H),3.75(s,3H),3.99-4.11(m,2H),5.32(s,1H),5.56-5.64(m,2H),7.21-7.27(m,2H),7.31(s,1H),7.61(s,1H),8.50(s,1H)ppm。

实施例3b

(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸乙酰氧基甲基酯(IIa：R＝Me)

向6L夹套玻璃反应器中初始装入来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶(22.5g，21000U/g)、磷酸钾缓冲液(2.1L，50mM，pH 7.0)和外消旋(4S,4R)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(±)-乙酰氧基甲基酯(IIA)(15g，33.224mmol)于2-甲基四氢呋喃(2-Me-THF，0.9L)中的溶液。将所得双相混合物在28.5℃和110rpm(乳液)下搅拌7天。在2、3和4天后添加额外量的酶，得到总共45g(1:3wt./wt.底物/酶)。在55％的转化率(对映体富集的酯(IIa：R＝Me；92％ee))后，通过加入氯化钠(150g)停止反应并用2-MeTHF(2×1L)萃取。将有机相与2L 5％磷酸钾水溶液在0℃下合并，并搅拌40分钟。将有机相除去，用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩至干。

获得橙色油状物(8.34g)。使用溶剂梯度(15％EtOAc/庚烷–100％EtOAc)在硅胶上通过急骤层析纯化粗反应产物。这得到4.78g(理论值的32％)白色固体。

对映体过量：91％e.e.(方法G)

t_R(HPLC方法F)：1.1min；

MS(ES+):452[M+H]⁺，

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝1.10(t,J＝7.09Hz,3H),1.96(s,3H),2.16(s,3H),2.42(s,3H),3.75(s,3H),3.99-4.10(m,2H),5.31(s,1H),5.56-5.64(m,2H),7.21-7.28(m,2H),7.31(s,1H),7.61(s,1H),8.49(s,1H)ppm。

将从15g外消旋(4S,4R)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(±)-乙酰氧基甲基酯(IIA)开始的10份批料进行酶促水解，并将粗产物合并。这得到46g具有91％e.e.的材料。将该粗产物从120mL叔丁基甲基醚/30mL乙醇中重结晶，获得41g光学纯酯(IIa：R＝Me；e.e.％>99％)。

类似于WO 2016/016287 A1中所述的方法，将该材料转化为非奈利酮(Ia)。这在随后的实施例中进行描述。

实施例3c

(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(IIIa)

将40.0g(88.69mmol)(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸乙酰氧基甲基酯(IIa：R＝Me))溶解于240mL THF和120mL水的混合物中，并冷却至0℃。在0℃下在15分钟内向该溶液中逐滴加入氢氧化钠溶液(由16.4g(184.96mmol)45％氢氧化钠水溶液和85mL水制备)，并将混合物在0℃下搅拌1.5小时。将混合物每次用100mL甲基叔丁基醚萃取两次，并用100mL乙酸乙酯萃取一次。用稀盐酸(由37.1g 37％HCl和151mL水制备)将0℃的水溶液调节至pH 7。使溶液升温至20℃，并加入41g氯化铵于110mL水中的水溶液。将溶液在20℃下搅拌1小时，并将产物滤出，每次用30mL水洗涤两次，并用80mL乙腈洗涤一次。将产物在夹带气体下在40℃下真空干燥。

收率：30.6g(理论值的91.0％)近乎无色粉末(非常轻微的黄色色泽)。

HPLC方法E：RT：约6.8min。

MS(EIpos):m/z＝380[M+H]⁺

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝1.14(t,3H),2.14(s,3H),2.37(s,3H),3.73(s,3H),4.04(m,2H),5.33(s,1H),7.26(m,2H),7.32(s,1H),7.57(s,1H),8.16(s,1H),11.43(br.s,1H)。

实施例3d

(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3- 甲酰胺(Ia)

将956mg(7.82mmol)DMAP在20℃下加入30g(79.13mmol)(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(IIIa)和17.96g(110.8mmol)1,1-碳二咪唑于150mL THF中的初始装料中。将混合物在20℃下搅拌1小时(放出气体！)，然后加热至50℃下保持2.5小时。将55.7g(0.345mol)六甲基二硅氮烷加入该溶液中，将其在回流下沸腾22小时。再加入34mL THF并将混合物冷却至5℃。在3小时内加入22mL THF和15.7g水的混合物，使得温度保持在5至20℃。随后将混合物在回流下沸腾一小时，然后通过梯度(3小时)冷却至0℃并在该温度下搅拌一小时。将产物滤出，并每次用38mL THF洗涤两次，并每次用60mL水洗涤两次。将产物在夹带气体下在70℃下真空干燥。

收率：27.67g(理论值的92.5％)近乎无色粉末(非常轻微的黄色色泽)。

HPLC方法D：RT约6.7min。

MS(EIpos):m/z＝379[M+H]⁺

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝1.05(t,3H),2.12(s,3H),2.18(s,3H),3.82(s,3H),3.99-4.07(m,2H),5.37(s,1H),6.60-6.84(m,2H),7.14(d,1H),7.28(dd,1H),7.37(d,1H),7.55(s,1H),7.69(s,1H)。

实施例3e

纯产物的制备(Ia＝非奈利酮)

将实施例3d中制备的27.0g粗产物(Ia)悬浮于540mL乙醇(用甲苯变性)中，然后加热至回流。加热时，产物进入溶液中。在该温度下继续搅拌一小时。将溶液通过加热的压力过滤器(T＝75℃)滤出，然后将压力过滤器用7mL乙醇(用甲苯变性)冲洗。然后将溶剂蒸馏出(蒸馏出约444mL)，直至最终体积达到所用物质的约4倍(27.0g x 4～110mL)。然后将混合物冷却至内部温度23℃(约1.5至2小时内)。然后将混合物在内部温度3℃下搅拌2小时。将产物滤出并用100mL乙醇(用甲苯变性)冲洗一次。湿收率：28g。将湿产物在减压(<100毫巴)下在50℃下干燥过周末(>48h)。收率：25.67g(理论值的95.1％)无色结晶粉末，细针状晶体。

分析结果：

MS(EIpos):m/z＝379[M+H]⁺

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝1.05(t,3H),2.12(s,3H),2.18(s,3H),3.82(s,3H),3.99-4.07(m,2H),5.37(s,1H),6.60-6.84(m(宽信号),2H),7.14(d,1H),7.28(dd,1H),7.37(d,1H),7.55(s,1H),7.69(s,1H)以及DMSO溶剂和水在δ＝2.5-2.6处的小信号和在δ＝3.38处的非常小的峰(不可指定)

修正：Mod A(如WO2016/016287A1中所定义)。

Claims

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

所述方法使用水解酶通过光学拆分(II)进行，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在式(IIa)的化合物中，

其中，在式(II)的化合物中，

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在式(IIa)的化合物中，R为甲基，并且

其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所使用的水解酶为脂肪酶、酯酶、酰胺酶或蛋白酶。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水解酶为脂肪酶。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶选自来自褶皱假丝酵母的VII型脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的脂肪酶、来自爪哇毛霉的Amano脂肪酶M、来自洋葱伯克霍尔德氏菌的Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶PS-IM、来自黑曲霉的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自南极假丝酵母A的脂肪酶、来自米曲霉的脂肪酶、来自特异腐质霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母的脂肪酶和来自猪肝的脂肪酶。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶为来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶。

8.制备式(Ia)的(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺的方法

其特征在于使式(III)的外消旋酸

与通式(V)的卤代酯反应

其中

R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

X为氯或溴，

以得到式(II)的(4S)-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸的外消旋酰氧基甲基酯

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

其中R为任选被芳族基团取代的直链或支链C1-C25链，

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基、乙基和异丙基、正丁基或正戊基。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，在式(V)的化合物中，

R为甲基，

和

X为溴，

并且其中，在式(II)的化合物中，

R为甲基，

并且其中，在式(IIa)的化合物中，

R为甲基。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，在式(V)中，X为氯且R如权利要求8至11中任一项所定义，并且其中，在式(II)的化合物中，R如权利要求8至11中任一项所定义，并且其中，在式(IIa)的化合物中，R如权利要求8至11中任一项所定义。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中，对于所述光学拆分，

-使用脂肪酶，或

-所述脂肪酶选自来自褶皱假丝酵母的VII型脂肪酶、来自褶皱假丝酵母的脂肪酶、来自爪哇毛霉的Amano脂肪酶M、来自洋葱伯克霍尔德氏菌的Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶PS-IM、来自黑曲霉的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自南极假丝酵母A的脂肪酶、来自米曲霉的脂肪酶、来自特异腐质霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母B的脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶、来自米黑根毛霉的脂肪酶、来自南极假丝酵母的脂肪酶和来自猪肝的脂肪酶，或

-所述脂肪酶为来自荧光假单胞菌的AK脂肪酶。

14.水解酶在通过光学拆分化合物(II)制备式(IIa)的化合物的方法中的用途。

15.水解酶在制备式(Ia)的化合物的方法中的用途。