CN114470309B - 一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球，包括空心花粉、组装在空心花粉表面的动力系统，所述止血微球表面为针刺状或刺突状。本发明还提供了一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，包括空心花粉微球的制备、动力系统在花粉微球上的生长、止血药物凝血酶的加载三步。本发明通过穿刺红细胞促进凝血物质的释放以及对血小板、红细胞和凝血因子吸附，促进纤维蛋白网络的形成，从而实现对伤口的快速止血。

Description

一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球及其制备方法。

背景技术

在自然灾害、意外事故、战争和外科手术过程中由创伤引起的无法控制的出血是一个重大的全球性问题，它可能导致军人或平民人口大量死亡。对于突发和意外大出血的患者，无法控制的大血管出血和外伤组织广泛出血是死亡率高的原因。及时有效的院前/急救止血技术和止血剂可以为后续治疗赢得宝贵的时间，从而降低残疾和死亡率。对于普通的伤口出血，例如表皮的组织损伤引起的出血，可以将治疗药物如纱布、海绵、水凝胶等快速覆盖在伤口表面进行止血。但对于深部或穿孔、出血部位隐蔽的伤口，普通的止血剂在止血过程中由于受到伤口血流的冲击，容易被血流冲出伤口，难以通过不规则而深的伤口通道对出血点/受损血管进行治疗。因此，如何针对不规则而深的伤口设计出一种能够在战场或医院手术过程中能够逆血流运动来控制不规则伤口出血的安全有效的止血剂至关重要。

目前，在止血材料领域，国内市场上的止血材料，如：止血纱布、止血带、弹性绷带等，虽然对于紧急情况的大出血有一定的止血效果，但是对于不规则而深的伤口以及大动脉出血等，由于它们作用在伤口表面，无法进入深部出血部位以促进止血，因此凝血作用只发生在伤口表面，难以对不规则而深的伤口进行及时、理想的治疗。对于动脉破裂的大出血，虽然商业止血材料，如：基于壳聚糖的Celox^TM敷料，沸石基的

纱布，和氧化再生纤维素基的

止血剂可用于伤口的大出血控制，但是在出血部位较深、隐蔽的穿孔创面，仍不能迅速截流，无法触及深层、隐蔽的出血部位，只能在浅表创面形成凝血。同时这些材料还存在价格昂贵、难以获取的缺点。

对于深部或穿孔、出血部位隐蔽的伤口，为了有效、快速止血，止血剂首先应充分、广泛接触出血部位，尤其是在出血部位不规则、空洞的出血腔内。其次，它应该具有持续的驱动力，使其能够对抗血流进入深层出血部位。最后，快速激活内源性止血通路。为了充分和广泛地接触出血部位，已有报道的形状适应性止血泡沫与血液接触时具有快速体积扩张能力和快速吸液能力，当其形状与创面腔相适应时，血腔内迅速发生有效止血。因此，近年来科研人员针对控制不规则而深的伤口出血进行了进一步研究，开发出许多新型止血材料，包括：填充出血创面的止血泡沫以及具有靶向伤口的止血微球等。

多孔材料由于其良好的特性，如高表面积和孔隙率、快速吸收液体的能力以及良好相容性，在阻止大出血方面显示出巨大的潜力。例如：自膨胀多孔材料支架或基质材料具有良好的血液吸收能力、密封和填塞伤口作用，能够快速填充、封闭伤口。其具有大量且丰富的孔道结构，具有极高的比表面积，在与血液接触时，能够快速吸收血液中的水分，逐渐在伤口内部膨胀以达到填充创面的目的；并且由于其极高的比表面积，能够富集血液中的凝血因子，进而达到快速止血的目的。随着自膨胀多孔材料逐渐作为支架或基质材料类止血材料或技术的发展，美国俄勒冈州威尔逊维尔的RevMedX公司生产的一种用于军事领域快速止血的膨胀多孔材料已获得FDA批准(XSTAT)，XSTAT是一种基于壳聚糖的纤维素海绵组成止血敷料，用于治疗四肢出血，在控制不可压缩的交界处出血方面也显示出前景。该装置由一个填充器组成，该填充器内部填充有高度压缩的海绵，吸收血液后，海绵可以在很短的时间内轴向膨胀数倍于其原始体积。XSTAT已被实验证明可有效地在多种严重出血动物模型(腹股沟、动脉和肝脏等中实现止血)。然而，由于XSTAT是由体积膨胀和机械强度有限的微型纤维素海绵组成，当应用于出血部位时，需要大量海绵(超过90个)来填充创腔，并且在康复后对海绵的去除可能会对患者造成二次伤害，其所需的止血时间为以及术后去除所有海绵的时间和难度必然会相应增加。

近年来，如何快速、精准地向深部或穿孔、出血部位隐蔽的伤口的出血点递送止血药物已成为当前止血领域的研究热点。能够逆血流运动靶向伤口的止血微球近年来已有所报导。如：Christian J.Kastrup等人提出了一种使用碳酸钙作为药物载体的止血材料。该止血材料由碳酸钙与凝血酶组成，在应用过程中通过将止血材料与质子化氨甲环酸混合，当混合物与血液接触时，会迅速释放CO₂推动颗粒的运动。然而，由于气体产生的方向的不确定性，因此对颗粒的推进并不全是向伤口内部运动，导致大部分颗粒只是停留在伤口表面，难以到达出血点。专利CN112891613A中采用微孔淀粉为载体，负载磁性纳米Fe₃O₄粒子，在磁场中产生靶向作用，但是由于纳米Fe₃O₄粒子的覆盖，微孔淀粉的吸水能力下降，且负载的凝血酶数量有限，对于大面积的快速出血止血速度难以达到理想的水平。

对于深部或穿孔、出血部位隐蔽的伤口，由于血液的阻力，大部分止血材料难以逆血流运动对出血点进行靶向止血，导致止血时间长、失血多、难度大。而现阶段对于靶向或填充伤口内部的止血材料存在动力方向不一致、易造成二次伤害等问题。因此，为了有效、快速止血，止血剂首先应充分、广泛接触出血部位，尤其是在出血部位不规则、空洞的出血腔内。其次，它应该具有持续的驱动力，使其能够对抗血流进入深层出血部位，精确靶向出血点，以及较好的药物递送功能和良好的生物相容性。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球及其制备方法，通过穿刺红细胞促进凝血物质的释放以及对血小板、红细胞和凝血因子吸附，促进纤维蛋白网络的形成，从而实现对伤口的快速止血。

本发明第一个目的在于提供一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球，其特征在于，包括空心花粉、组装在空心花粉表面的动力系统，所述空心花粉表面为针刺状或刺突状。

进一步的，所述空心花粉由向日葵花粉制得。

进一步的，所述止血微球的动力系统由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成。

进一步的，所述定向驱动止血微球还包括凝血酶，所述凝血酶加载在止血微球的内部。

进一步的，所述止血微球在应用前与质子化氨甲环酸或PH小于7.0的质子化氨甲环酸水溶液混合。

本发明第二个目的在于提供一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于，将表面针刺状或刺突状的天然花粉脱脂、采用碱解-酸解-碱解的方式去除内部细胞质后得到空心花粉微球；在所述空心花粉微球表面生长由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成的动力系统，然后将凝血酶加载到空心花粉微球的内部，得到具有穿刺功能的定向驱动止血微球。

进一步的，天然花粉脱脂的过程为：将天然花粉与丙酮溶液混合搅拌回流，分离出大颗粒或不溶性杂质；再用丙酮搅拌回流后，向过滤后的花粉中加入去离子水搅拌，转移到培养皿中冻干24～48h得到脱脂花粉。

进一步的，天然花粉脱脂时两次混合搅拌回流的时间为3～12h。

进一步的，所述去除内部细胞质的过程为：将脱脂后的花粉冷冻干燥后，与碱溶液混合搅拌，碱性裂解后离心完成第一次碱解；将碱解后的花粉在酸液中搅拌离心完成酸解；将酸解后的花粉与碱溶液混合搅拌，重复第一次碱解的过程完成第二次碱解，得到空心花粉微球。

进一步的，所述第一次碱解与第二次碱解时选用3～12％的KOH溶液，酸解时选用70～95％w/v的正磷酸。

去除内部细胞质时，加入碱溶液的浓度、碱解时间对去除效果影响较大。当碱溶液的浓度较低、处理时间较短时，花粉内部的细胞质不能很好的去除；当碱溶液的浓度较高、处理时间较长时，虽然能够去除花粉内部的细胞质，但是在高浓度碱溶液下，花粉的形态结构遭到破坏，丧失原有的空心结构，同时也对针刺状或刺突状结构有较大的破坏，不利于后期的药物加载释放以及对于红细胞的穿刺。进一步的，碱解时选用KOH碱溶液的浓度为6％～12％，搅拌温度85℃，搅拌时间6～10h。优选的，本发明中KOH碱溶液的浓度为6％，混合搅拌的时间为6h。

进一步的，去除内部细胞质时离心采用的溶液分别为热去离子水、热丙酮、热醇、1mol/L盐酸、6％NaOH。

进一步的，在所述空心花粉微球表面生长由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成的动力系统的过程为：通过原位生长的方式将纳米Fe₃O₄组装到空心花粉微球表面，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒；通过软模板法使空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒表面一侧团簇生长CaCO₃颗粒，再用磁铁分离未附着的CaCO₃颗粒，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒。

进一步的，空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒的制备过程为：经过去除内部细胞质后的空心花粉微球悬浮液，通入氮气以排出空气，加入FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O搅拌30min，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒。

加入FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O搅拌使微孔淀粉充分吸附Fe²⁺、Fe³⁺，再逐滴加入NaOH水溶液，直到溶液变黑，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒。通过原位生长的方式，调节加入Fe²⁺、Fe³⁺的含量及制备条件，增加止血微球的磁力，并利于后期药物的加载及释放。优选的，加入FeCl₂·6H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/5，加入FeCl₃·4H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/10。在空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒的组装过程中，Fe²⁺、Fe³⁺的投入量较低时，空心花粉微球对Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量较低，空心花粉微球表面的Fe₃O₄量少，在磁场中受到的磁力较小，不利于靶向伤口内部。Fe²⁺、Fe³⁺的投入量较高时，反应液中的游离Fe²⁺、Fe³⁺增加，游离的Fe₃O₄会增多，这增加了去除游离Fe₃O₄的难度，并且空心花粉微球表面的Fe₃O₄量多，覆盖了空心花粉微球表面的纳米级小孔，不利于后期药物的加载以及释放；表面吸附的Fe₃O₄量过多，空心花粉微球表面的针刺状或刺突状结构被填充，影响运动过程中的针刺效果。

优选的，加入FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O后搅拌时间为30min，温度为50℃。当空心花粉微球吸附Fe²⁺、Fe³⁺的温度较低时，会减少Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量，导致纳米Fe₃O₄在空心花粉微球上的负载量减少，空心花粉微球/Fe₃O₄对磁场的响应减弱；若温度过高，则会破坏空心花粉微球的物理结构，进而影响空心花粉微球对凝血药物的负载，进而以及止血中的速度。当吸附时间短，则Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量低，同样导致纳米Fe₃O₄在空心花粉微球上的负载量减少，空心花粉微球/Fe₃O₄对磁场的响应减弱；若吸附时间长，由于温度的影响，会破坏空心花粉微球的物理结构。

进一步的，所述FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O的质量比为2:1。

进一步的，所述空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒制成后分散到75％的酒精中充分搅拌洗涤，随后静置10min，去除过量的化学试剂以及游离的Fe₃O₄，共洗涤3次。

进一步的，空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒的制备过程为：在乙二醇和水的混合物中溶解CTAB和CaCl₂，然后加入制得的空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒，加入Na₂CO₃反应2h，将未附着的CaCO₃颗粒用磁铁分离，洗涤后转移到培养皿中冻干48小时，得到干燥的空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒。

进一步的，所述乙二醇与水的体积比为1:1，所述CTAB的浓度为2mg/ml，Na₂CO₃与CaCl₂的浓度为0.22M，所述CTAB与CaCl₂的体积比为1:1。

进一步的，加载凝血酶的过程为：将凝血酶与空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒按照0.1U:1g-20U:1g的比例在PBS中混合，在4℃下真空加载10min，重复三次，将沉淀物在-50℃条件下冷冻干燥48h，得到具有穿刺功能的定向驱动止血微球。

本发明的有益技术效果为：

本发明针对常规止血剂对于深部或穿孔、出血部位隐蔽的伤口治疗的缺陷，提供具有穿刺功能的定向驱动止血微球，以空心花粉作为递送止血药物的载体，将Fe₃O₄/CaCO₃共同组成动力体系，再将止血药物凝血酶加载到花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃微球的内部的新型止血材料。由于其独特的针刺结构以及较大的比表面积，在运动的过程中能够增强与红细胞的碰撞，加强对红细胞的穿刺效果，促进凝血物质的释放以及对血小板、红细胞和凝血因子吸附，促进纤维蛋白网络的形成，从而实现对伤口的快速止血。

本发明止血微球的使用向日葵花粉微球材料作为药物加载与递送的载体，同时也作为Fe₃O₄和CaCO₃生长的基体，其是一种具有纳米级孔以及针刺状或刺突状结构的多孔天然微球，具有高的比表面积以及良好的生物相容性。与现有技术中的微孔淀粉相比，空心花粉微球具有较大的空腔、较大的比表面积以及更为粗糙的表面，能够更好地进行药物的加载与释放，能够吸附富集更多血液中的凝血因子，再加上针刺结构对红细胞的穿刺效果，从而达到快速止血的目的，较微孔淀粉作为载体止血速度更快。

本发明止血微球在使用时与质子化氨甲环酸混合后使用，由于质子化氨甲环酸的刺激，使止血微球能够迅速在血液中分散，在磁场作用下向伤口深处运动，靶向出血点递送药物，并且由于其独特的针刺结构以及较大的比表面积，在运动的过程中能够增强与红细胞的碰撞，加强对红细胞的穿刺效果，促进凝血物质的释放以及对血小板、红细胞和凝血因子吸附，促进纤维蛋白网络的形成，从而实现对伤口的快速止血。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

图1为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备流程图；

图2为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备中空心花粉/纳米Fe₃O₄的物理结构图；

图3为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球不同Fe₃O₄负载量空心花粉/纳米Fe₃O₄的止血时间图；

图4为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的电镜图和元素分布图；

图5为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的在水中的微观运动图象图；

图6为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的在水中的宏观运动图象图；

图7为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的应用示意图。

图8为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球在碱溶液浓度15％时的扫描电镜图。

图9为本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球实施例3中各对比例的花粉微球蛋白质去除率对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。需要说明的是，本发明原料及试剂均为市售产品。

本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球，包括空心花粉、组装在空心花粉表面的动力系统，所述空心花粉表面为针刺状或刺突状。通过针刺状或刺突状的空心花粉实现对红细胞的穿刺效果，促进凝血物质的释放以及对血小板、红细胞和凝血因子吸附，促进纤维蛋白网络的形成；通过动力系统加速止血微球在伤口内的快速移动，可以根据需要运动到伤口的内部，实现快速止血。

在一优选实施例中，空心花粉由表面为针刺状或刺突状的向日葵花粉制得。

在一优选实施例中，止血微球的动力系统由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成。CaCO₃单侧生长，与磁性纳米Fe₃O₄粒子相互配合，实现在伤口内的定向快速移动。

为了促进凝血，加快止血，缩短止血时间，定向驱动止血微球还包括凝血酶，凝血酶加载在止血微球的内部。在止血微球运动过程中，凝血酶伴随着气体释放，激活血液中的纤维蛋白原，达到快速凝血的目的。

止血微球在应用前与质子化氨甲环酸或PH小于7.0的质子化氨甲环酸水溶液混合，质子化氨甲环酸在血液中释放出的游离H⁺离子与单侧生长的CaCO₃发生反应生成CO₂气体，实现单向驱动。

本发明还提供一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，将表面针刺状或刺突状的天然花粉脱脂、采用碱解-酸解-碱解的方式去除内部细胞质后得到空心花粉微球；在所述空心花粉微球表面生长由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成的动力系统，然后将凝血酶加载到空心花粉微球的内部，得到具有穿刺功能的定向驱动止血微球。

针刺状或刺突状的天然花粉脱脂、去除内部细胞质后形成空心花粉微球，空心花粉微球具有较大的空腔及较大的比表面积，更好地进行药物的加载与释放，吸附富集更多血液中的凝血因子。在空心花粉微球的表面依次生长磁性纳米Fe₃O₄粒子与定向生长CaCO₃颗粒，最后加载凝血酶，形成具有穿刺功能的定向驱动止血微球。制备得到的具有穿刺功能的定向驱动止血微球在空心花粉微球表面的针刺状或刺突状结构及纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成的动力系统的动力下实现定向驱动及快速止血。

实施例1

本发明一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：

1、空心花粉微球的制备：

采用脱脂和去除内部细胞质两步法制备空心花粉微球。

(1)脱脂:取天然葵花花粉40g在砂磨中研碎后，用100ml丙酮进行磁性搅拌回流4h(50℃，500rpm)。然后，静置倾倒上清液，用60目尼龙网分离大颗粒或不溶性杂质。再用100ml丙酮进行磁性搅拌回流4h(50℃，500rpm)。静置倾倒上清液后，向花粉中加入去离子水150ml，搅拌1h(50℃，400rpm)。将向日葵花粉转移到培养皿中冻干48小时，得到脱脂花粉。

(2)去除内部细胞质:将步骤(1)得到的脱脂花粉3g冷冻干燥后，转移到带冷凝器的圆底烧瓶中，将脱脂花粉与6％KOH(w/v)水溶液100ml混合，磁力搅拌(85℃，500rpm)6h，碱性裂解后得到悬浮液。然后将花粉悬浮液转入50ml的离心管中，分别用热去离子水、热丙酮、热醇、1mol/L盐酸、6％NaOH、热去离子水经高速离心机(2min,6500rpm)离心洗涤碎块完成第一次碱解。然后将第一次碱解悬浮液用100ml正磷酸(85％w/v)在85℃、500rpm的磁力搅拌下处理6h。再将花粉悬浮液转入50ml的离心管中，分别用热去离子水、热丙酮、热醇、1mol/L盐酸、6％NaOH、热去离子水经高速离心机(2min,6500rpm)离心洗涤。最后，重复第一次碱性裂解-洗涤步骤完成第二次碱解，得到空心花粉微球悬浮液。

2、纳米Fe₃O₄在空心花粉微球上的组装：

采用原位生长技术在空心花粉微球表面组装磁性纳米Fe₃O₄颗粒。在步骤1得到的100ml空心花粉微球悬液中，在40-70℃下通入氮气10-30min以排出空气，再加入0.4gFeCl₂·6H₂O和0.2g FeCl₃·4H₂O，磁力搅拌(50℃，500rpm)30分钟后，再通过微量注射器逐滴滴加1mol/L NaOH，直到溶液变黑停止滴加，连续搅拌30min，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒，然后将空心微球/纳米Fe₃O₄颗粒分散到75％的酒精中充分搅拌洗涤，随后静置10min，去除过量的化学试剂以及游离的Fe₃O₄，共洗涤3次，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄悬浮液。

3、空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒的制备：

在50ml体积比1:1的乙二醇和水的混合物中溶解CTAB(2mg/ml)和CaCl₂(0.22M)，然后将步骤2得到的空心花粉/纳米Fe₃O₄悬浮液与CTAB/CaCl₂溶液按照体积比1:1混合，然后加入50ml、0.22M的Na₂CO₃溶液，在35℃下反应2h，再将未附着的CaCO₃颗粒用磁铁分离，洗涤三次，将悬浮液转移到培养皿中冻干48小时，得到干燥的空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒。

4、凝血酶的加载：

将凝血酶与步骤3得到的空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒按照0.1U:1g-20U:1g的比例在PBS中混合，在4℃下真空加载10min，重复三次，将沉淀物在-50℃条件下冷冻干燥48h，即得具有穿刺功能的定向驱动止血微球。

参见附图4，对实施例1的止血微球表面的元素分布进行分析，可以看出，O元素在整个止血微球表面富集，Fe元素主要在空心花粉表面聚集，在一端生长的CaCO₃颗粒表面分布较少；Ca元素主要聚集在一端生长的CaCO₃颗粒表面，在空心花粉表面分布较少。

参见附图5、6，为了测试磁场对止血微球的作用，分别在宏观和微观上就止血微球对磁场的响应进行了表征。可见，在磁场的刺激下，能够控制止血微球的运动方向，图5中止血微球在3s内沿指定方向移动600μm，图6中分散的止血微球悬浊液在24s内运动聚集在磁铁处，外界磁场靶向作用好。

实施例2

与实施例1所不同的是，对步骤2中加入Fe²⁺、Fe³⁺的量、温度以及吸附时间进行调整，具体条件的调整见表1。

表1

参见附图2，对空心花粉/纳米Fe₃O₄-1，空心花粉/纳米Fe₃O₄-2，空心花粉/纳米Fe₃O₄-3的样品与天然花粉、实施例1步骤1得到的空心花粉进行扫描电镜观察，可见与天然花粉、空心花粉相比，三个样品表面都已成功自主组装纳米粒子在花粉微球的表面，空心花粉/纳米Fe₃O₄-1，空心花粉/纳米Fe₃O₄-2，空心花粉/纳米Fe₃O₄-3表面的Fe₃O₄颗粒依次增多。在空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒的组装过程中，空心花粉/纳米Fe₃O₄-1虽然很好的保留了空心花粉微球表面的纳米级小孔，但是Fe²⁺、Fe³⁺的投入量较低时，空心花粉微球对Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量较低，空心花粉微球表面的Fe₃O₄量少，在磁场中受到的磁力较小，不利于靶向伤口内部。相反空心花粉/纳米Fe₃O₄-3中Fe²⁺、Fe³⁺的投入量较高时，反应液中的游离Fe²⁺、Fe³⁺增加，游离的Fe₃O₄会增多，这增加了去除游离Fe₃O₄的难度，并且空心花粉微球表面的Fe₃O₄量多，覆盖了空心花粉微球表面的纳米级小孔，不利于后期药物的加载以及释放。

当空心花粉微球吸附Fe²⁺、Fe³⁺的温度较低时，会减少Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量，导致纳米Fe₃O₄在空心花粉微球上的负载量减少，空心花粉微球/Fe₃O₄对磁场的响应减弱；若温度过高，则会破坏空心花粉微球的物理结构，进而影响空心花粉微球对凝血药物的负载，进而以及止血中的速度。当吸附时间短，则Fe²⁺、Fe³⁺的吸附量低，同样导致纳米Fe₃O₄在空心花粉微球上的负载量减少，空心花粉微球/Fe₃O₄对磁场的响应减弱；若吸附时间长，由于温度的影响，会破坏空心花粉微球的物理结构。当加入FeCl₂·6H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/10～2/5，加入FeCl₃·4H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/20～1/5，FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O的质量比为2:1，搅拌时间为30min，温度为50℃时，均能获得较好的止血效果。加入FeCl₂·6H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/5，加入FeCl₃·4H₂O的质量为空心花粉微球质量的1/10时止血效果最佳。

参见附图3，分别取兔股动脉切出1.5cm长的“J”型弯曲伤口作为出血模型，分别选用空心花粉/纳米Fe₃O₄-1，空心花粉/纳米Fe₃O₄-2，空心花粉/纳米Fe₃O₄-3的样品与实施例1步骤1得到的空心花粉的止血时间进行检测，可以看出空心花粉由于表面纳米小孔的存在，对血液具有较好的吸附作用，大大降低了止血时间，但仍需要280s。空心花粉/纳米Fe₃O₄-2止血时间最短，仅需要185s，空心花粉/纳米Fe₃O₄-1与空心花粉/纳米Fe₃O₄-3分别需要230s与250s。

实施例3

与实施例1所不同的是，对步骤1中去除内部细胞质过程条件进行调整，具体条件的调整见表2。

表2

参见附图9，空心微球-2、空心微球-3、空心微球-6细胞质的去除效果都较好，去除效果达到90％以上。可见当碱溶液的浓度较低时(空心微球-1、空心微球-4)，花粉内部的细胞质不能很好的去除，去除率低于50％；当碱溶液处理时间较短时，对花粉内部细胞质的去除也有较大的影响，参见空心微球-5及空心微球-6，当处理时间减小到5h时去除率有较明显的下降，只有70％左右。在实验中，当碱溶液的浓度较高、处理时间较长时，虽然能够去除花粉内部的细胞质，但是在高浓度碱溶液下，花粉的形态结构遭到破坏，丧失原有的空心结构，同时也对针刺状或刺突状结构有较大的破坏，不利于后期的药物加载释放以及对于红细胞的穿刺。参见附图8，为KOH的浓度为15％时花粉微球的扫描电镜图，可见针刺状或刺突状结构开始出现了较明显的破坏，部分结构开始脱落。本发明碱解时选用KOH碱溶液的浓度为3％～12％，搅拌温度85℃，搅拌时间6～10h。优选的，KOH的浓度为6％～12％，搅拌温度85℃，搅拌时间6～10h。

本发明通过对碱溶液浓度及处理时间的调整对止血微球表面的针刺状或刺突状结构具有较大的影响；且纳米Fe₃O₄颗粒的负载量、负载条件对止血微球的吸附量具有较大的影响。

参见附图7，本发明具有穿刺功能的定向驱动止血微球的止血过程为：在应用时将止血微球与质子化氨甲环酸或PH小于7.0的质子化氨甲环酸水溶液混合，当混合物与血液接触时，会迅速释放CO₂气体推动颗粒的运动，使止血微球在血液中分散，然后在外界磁场与CaCO₃共同组成动力体系的作用下，止血微球产生动力向目标位置运动，在运动过程中止血微球表面的针刺状或刺突状结构对红细胞形成穿刺效果，促进凝血物质释放，促进纤维蛋白网络的形成，止血微球较大的比表面积在运动过程中增强与红细胞的碰撞，加速凝血。当改变磁场的方向时，能够改变微球的运动方向，从而适应不同类型的伤口。本发明止血微球表面针刺状或刺突状结构对红细胞的穿刺效果与Fe₃O₄/CaCO₃共同组成动力体系相配合，与现有技术相比具有更加的止血效果，大大缩短了止血时间，适应各种类型的出血伤口。

需要说明的是，本发明在通过原位生长的方式将纳米Fe₃O₄组装到空心花粉微球表面后，在空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒表面可以生长在血液中与H⁺离子反应生成气体的化合物颗粒。如可以一侧团簇生长的CaCO₃颗粒，可以在空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒表面生长的NaHCO₃颗粒、KHCO₃颗粒等，都是在本申请中生长的化合物颗粒与质子化氨甲环酸或其溶液在血液中释放出的游离H⁺离子发生反应生成CO₂气体，从而在气体的驱动下带动止血微球运动的原理下得出的，任何在此基础上做出的颗粒种类的变化都在本发明的保护范围之内。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球，其特征在于：包括空心花粉、组装在空心花粉表面的动力系统，所述动力系统由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成，所述空心花粉表面为针刺状或刺突状；所述定向驱动止血微球还包括凝血酶。

2.如权利要求1所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球，其特征在于：所述止血微球在应用前与质子化氨甲环酸或pH小于7.0的质子化氨甲环酸水溶液混合。

3.根据权利要求1-2中任一项所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于：将表面针刺状或刺突状的天然花粉脱脂、采用碱解-酸解-碱解的方式去除内部细胞质后得到空心花粉微球；在所述空心花粉微球表面生长由纳米Fe₃O₄粒子与CaCO₃共同组成的动力系统，然后将凝血酶加载到空心花粉微球的内部，得到具有穿刺功能的定向驱动止血微球。

4.如权利要求3所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于，天然花粉脱脂的过程为：将天然花粉与丙酮溶液混合搅拌回流，分离出大颗粒或不溶性杂质；再用丙酮搅拌回流后，向过滤后的花粉中加入去离子水搅拌，转移到培养皿中冻干24～48h得到脱脂花粉。

5.如权利要求3所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于，所述去除内部细胞质的过程为：将脱脂后的花粉冷冻干燥后，与碱溶液混合搅拌，碱性裂解后离心完成第一次碱解；将碱解后的花粉在酸液中搅拌离心完成酸解；将酸解后的花粉与碱溶液混合搅拌，重复第一次碱解的过程完成第二次碱解，得到空心花粉微球。

6.如权利要求5所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于：所述第一次碱解与第二次碱解时选用3～12％的KOH溶液，酸解时选用70～95％w/v的正磷酸。

7.如权利要求5所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于：去除内部细胞质时离心采用的溶液分别为热去离子水、热丙酮、热醇、1mol/L盐酸、6％NaOH。

8.如权利要求3所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于，通过原位生长的方式将纳米Fe₃O₄组装到空心花粉微球表面，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒；通过软模板法使空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒表面一侧团簇生长CaCO₃颗粒，再用磁铁分离未附着的CaCO₃颗粒，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄/CaCO₃颗粒。

9.如权利要求8所述一种具有穿刺功能的定向驱动止血微球的制备方法，其特征在于，空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒的制备过程为：经过去除内部细胞质后的空心花粉微球悬浮液，通入氮气以排出空气，加入FeCl₂·6H₂O和FeCl₃·4H₂O搅拌30min，得到空心花粉/纳米Fe₃O₄颗粒。

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