CN102526794B - 钙络合型淀粉基微孔止血材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及钙络合型淀粉基微孔止血材料及其制备方法和应用。本发明首先制备出负载羧甲基的微孔淀粉，然后络合组装钙离子，从而最终制备出孔径为0.1～5μm、止血时间为20s～3分钟、且8小时～6天体内可完全降解的钙络合型淀粉基微孔止血材料。本发明原料成本低、制备方法简单，得到的止血材料结合了微孔淀粉的物理止血、羧基和钙离子的化学性止血功能，止血快速、强效，粘性大，生物相容性好，且体内降解，可用于人体表皮、体内组织等出血部位以及体内实质性脏器的大量出血或活动部位、难止血部位的出血控制。

Description

钙络合型淀粉基微孔止血材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于组织损伤修复医用材料领域，特别涉及一种钙络合型淀粉基微孔止血材料及其制备方法与应用。

背景技术

血液具有营养和滋润全身各组织器官的功能，是构成人体和维持人类生命活动的基本物质之一。外伤出血是人类生活中常有的事，而因战争、交通事故、自然灾害等引起的急性大出血以及实质性脏器的深部出血是人体受伤后导致死亡、致残和致畸的主要原因。当外伤失血量达到总血量的20％以上时，出现明显的休克症状；达到总血量的40％时就有生命危险。据报道，在抗美援朝战争中，我军有近1/3的负伤人员由于出血过多而死亡。美军的一项调查发现：阵亡将士中有90％死在被送到医院之前，其中1/2死于大出血，1/4在负伤5-10min内就送了命。可见，能否让流血的创面在短时间内快速有效止血是目前的研究热点。

有效的止血是患者生命安全的必要保障，也是减少术区积血、利于伤口愈合、减少感染等并发症的有效手段。对于体表小伤口，人体在自身的凝血因子作用下就可以止血；对于较大面积的出血需采用止血剂进行治疗。可见，研制快速高效的止血剂不仅对于提高战场上伤员存活率和突破战伤救治技术具有重大意义，而且具有重大的民用价值。

传统的止血材料主要包括急救包、四头带、止血带和绷带等。这些敷料一般面积小、厚度薄，对于创面虽能起到保护作用，但功能和治疗效果较单一，尤其对大面积伤口以及复合伤、多发伤伤口的覆盖和止血等效果欠佳。

随着科学技术的迅速发展，止血材料得到了长足的发展。目前国内市场上常见的止血材料主要有纤维蛋白胶、明胶海绵、胶原和壳聚糖等。然而，纤维蛋白胶虽有良好的粘合性，但由于其不能压迫止血，无法单独应用于大创面止血，此外因其源自动物和人体的血液，易致过敏和病毒感染[Nagamatsu M，Podratz J，Windebank AJ，Low PA.Neurol Sci.1997，146(2)：97-102]；明胶海绵的多孔结构使得对血液有很强的吸收作用，并激活血小板，促进血栓形成，但其对内脏创伤部位的粘附性较差，且在体内降解吸收性较差，大大地增加了伤口部位感染的风险；壳聚糖虽具有一定的抑菌性和止血作用，但因止血效果有限而对较大出血部位止血效果不很理想。壳聚糖是天然高分子化合物，对人体无排斥反应，具有良好的生物相容性和降解性能，而且具有一定的止血性能，但其自身的止血作用有限，对于广泛性出血创面的止血性能并不显著，常需要复合凝血因子、氯化钙等其他止血剂[Benesch J，Tengvall P.Biomaterials，2002，23：2561；Ishihara M，Nakanishi K，et al.Biomaterials.2001，22(4)：165-173]。此外，由于人体内缺乏将其迅速有效降解的酶，尚无法在外科手术中使用。可见，体表出血和一般性的软组织出血已有较为可靠的止血方法，但对实质性脏器创面的治疗仍是外科领域面临的难题。

实质性脏器(如脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官)脆性大、血流量十分丰富，缝扎止血对控制其中大血管出血是必要的，但易导致组织切割破损，造成裂口出血或针眼出血；另外，缝扎止血可影响实质性脏器的功能。国内外一直致力研发能对实质脏器迅速止血并且对其功能无影响的止血材料，已经在外科手术和动物实验中初步验证了止血效果，但在实际应用中仍有缺陷，如：奥地利林茨市HafsLund Nycomed医药公司研制开发的Taehocomd可吸收创面止血封固剂止血速度慢[Parthcni M，Kalogheropoulou C.Karageorgos N，et al.Spine J，2006，6(4)：455-458]、Surgical纤维素对神经组织具有毒性[Kheirabadi BS，Field.Ridley A，Pearson R，et al.CJ Surg Res，2002，106(1)：99-107]；主要成分为介孔沸石的QuickclotTM止血剂，于2002年获得美国FDA批准上市。已有的应用结果表明，QuickclotTM无论在止血效果，还是在提高存活率方面均优于其它止血材料，这主要归因于其特殊的介孔结构、超常的吸附能力以及对水分的选择性吸收。然而，QuickclotTM虽能在2分钟内快速止血，但价格昂贵。更致命的是，QuickclotTM不能降解，且吸水后放热明显，易引起组织热灼伤[Joseph W.Carraway，Darin Kent，Kelli Young，et al.Resuscitation.2008，78：230-235]，根本无法用于体内脏器的深部和大面积止血。

淀粉因为其丰富的资源和低廉的成本在工业上广为应用。近年来，淀粉因其高粘度、良好的生物相容性和生物降解性而在生物材料领域崭露头角。2002年，美国Medafor公司成功研制了一种称为Arista的淀粉微球，并已被FDA批准上市。Arista不含有任何动物源或人源性的成分，可避免过敏风险。此外，Arista吸水性好，并具有亲水性分子滤网的作用，通过聚集血液中的固体成分，提高创面附近凝血因子的浓度而促进止血。与此同时，作为主要成分为淀粉的Arista在体内可被淀粉酶降解，7-14天即可被完全吸收，术后不引起组织粘连，也不破坏新生上皮和血痂。加上应用简单，Arista已成为目前国内外临床使用最为广泛、也最为行之有效的新型止血材料之一。

尽管Arista克服了传统止血材料的缺陷并在临床上获得了应用，但其本身仍存在明显的不足：第一，Arista仅靠吸收血液中的水分来止血，无法引起材料对体内凝血系统的激活(属于物理性止血)，而且吸水速度慢，吸水性不强。第二，Arista止血过程伴随温度升高，易致组织灼伤。第三，粘性封堵差，易引起血痂的脱落并破坏新生组织，直接影响材料的止血效果。第四，Arista局限于体内小创伤和体表(如皮肤)止血，对于深部实质性脏器和活动部位的止血效果不理想。第五，原料表氯醇的高成本，再加上产品依赖进口，使得Arista价格一直高居不下。

专利CN 101121041A采用醚化、醚化和交联、酯化的方法制备了变性淀粉可吸收止血材料，材料安全性高、生物相容性好，而且吸水速度快，粘度大，与Arista相比，止血效果更为快速有效。该发明制备的材料虽能在体内使用，但其仅借助多孔结构和快速吸水两特性实现创面的物理性止血，致使止血不彻底或失败，这大大地限制了该变性淀粉止血材料在临床上的广泛应用。

综上所述，快速强效止血、良好的生物相容性、快速降解性、低成本和易于规模化生产是材料能成功用于体内深部脏器和活动部位止血的重要条件。目前，未见综合上述性能的材料的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服目前止血材料生物相容性差、难以体内降解、制备成本高等不足，提供一种钙络合型淀粉基微孔止血材料及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，提供一种淀粉基微孔止血材料，所述淀粉负载羧甲基，所述羧甲基络合钙离子。

在另一优选例中，所述微孔止血材料的微孔孔径大小为0.1-5μm。

在另一优选例中，所述止血材料具有可控的微孔结构。

在另一优选例中，所述微孔结构是由酶水解形成。

在另一优选例中，所述止血材料的吸水率为100％-400％，在8小时-6天内体内可完全降解，止血时间为20s-3分钟，粘性大且生物相容性好。

本发明的第二方面，提供一种淀粉基微孔止血材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)微孔淀粉的制备

将淀粉和酶加入到磷酸盐缓冲液中，在45-80℃温度和pH为5-7的条件下搅拌进行酶解反应，4-15小时后，离心分离，干燥得到微孔淀粉；其中，

所述的淀粉和酶的质量比为1∶(0.01-0.2)；

所述的淀粉和酶的总量与磷酸盐缓冲液的质量体积比为100g∶(250-1000)ml；

(2)微孔淀粉的羧甲基化

将一氯乙酸溶于乙醇，加入氢氧化钠溶液至pH 6.5～7后，混合到用乙醇溶解的步骤(1)所制得的微孔淀粉中，充分搅匀，在50-80℃条件下持续搅拌保温进行反应4-8小时，加入乙酸中和pH至6.5～7，过滤，用乙醇洗涤后干燥制得羧甲基微孔淀粉，其中

所述的微孔淀粉与乙醇(包括溶解一氯乙酸的乙醇和微孔淀粉的乙醇)的质量比为1∶(2-5)；

所述的一氯乙酸与微孔淀粉的质量比为1∶(5-30)；

(3)羧甲基微孔淀粉与钙的络合组装

将步骤(2)制得的羧甲基微孔淀粉，加入到饱和的钙盐溶液中，在温度为20～50℃和pH为6～10下进行络合组装反应，制得所述钙络合型淀粉基微孔止血材料。

在另一优选例中，步骤(1)中所述搅拌速度为40-80r/min。

在另一优选例中，步骤(1)中所述离心分离的转速为4000-6000r/min。

在另一优选例中，步骤(1)中所述干燥时间为24-48小时。

在另一优选例中，步骤(2)中所述搅拌速度为45-75r/min。

在另一优选例中，步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3-2mol/L。

在另一优选例中，步骤(2)中所述干燥时间为24-48小时。

在另一优选例中，络合组装反应1-5小时后，水洗抽滤，于-50～-30℃下冷冻干燥24-48小时，制得所述钙络合型淀粉基微孔止血材料。

在另一优选例中，其中所述的干燥方法包括常温干燥、冷冻干燥、真空干燥、梯度升温干燥等中的至少一种。干燥温度为20-160℃。

所述淀粉为马铃薯淀粉、绿豆淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉中的至少一种。

所述酶为β-淀粉酶，α-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶，异淀粉酶，糖化酶，脱支酶、普鲁蓝酶、磷酸化酶中的至少一种。

所述钙盐为氯化钙、硝酸钙、醋酸钙、磷酸氢钙、氟化钙、溴化钙中的至少一种。

所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的至少一种的水溶液，所述磷酸盐缓冲液的质量百分比浓度为5-30％。

本发明的第三方面，提供淀粉基微孔止血材料的应用，用于制备人体表皮、体内组织等出血部位的止血材料。

本发明的淀粉基微孔止血材料，还用于制备体内实质性脏器的大量出血或活动部位、或难止血部位的出血控制材料。

本发明的淀粉基微孔止血材料可单独使用或与载体材料复合使用。

本发明的钙络合型微孔淀粉止血材料，即在酶水解形成微孔淀粉的基础上，通过羧甲基化改性处理引入羧基，借助羧基与钙离子的强络合作用，形成钙络合型微孔淀粉，弥补体内血浆中钙离子含量的不足，启动凝血反应而加快止血；负载的羧基不仅可键合阳离子和激发第12号凝血因子-接触因子，而且易与血红蛋白中的Fe³⁺结合，形成胶块封闭毛细血管。此外，负载的羧基还具有抗菌作用。

本发明的钙络合型微孔淀粉止血材料，可促进材料快速强效止血，生物相容性好，体内可快速降解，制备简便且成本低，适用范围广。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为钙络合型微孔淀粉基止血材料样品图。

图2为纯微孔淀粉和钙络合型微孔淀粉基止血颗粒的显微形貌：(a)8000倍下酶解4h的纯微孔淀粉，(b)2000倍下酶解4h的纯微孔淀粉，(c)10000倍下酶解6h的钙络合型微孔淀粉和(d)6000倍下酶解15h的钙络合型微孔淀粉。

图3为钙络合型微孔淀粉基止血颗粒的Zeta电位图(pH＝6～7.4范围内)，横坐标表示pH，纵坐标表示Zeta电势。

图4为钙络合型微孔淀粉用于新西兰大白兔皮肤致敏实验图。

图5为钙络合型微孔淀粉和纯微孔淀粉的凝血时间：(a)纯微孔淀粉，(b)钙络合型微孔淀粉。

图6为钙络合型微孔淀粉用于新西兰大白兔的股动脉切除止血图。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，意外发现，通过羧甲基化改性处理微孔淀粉，在微孔淀粉上引入羧基，并通过自组装，借助羧基与钙离子的强络合作用，制备得到的钙络合型微孔淀粉，止血快速，强效，粘性大，且生物相容性好，体内快速降解。在此基础上，完成了本发明。

淀粉基微孔止血材料

本发明的淀粉基微孔止血材料，为钙络合型淀粉基微孔止血材料，所述淀粉负载羧甲基，所述羧甲基络合钙离子。

所述止血材料的微孔孔径大小为0.1-5μm。

所述止血材料的吸水率为100％-400％，在8小时-6天内体内可完全降解，止血时间为20s-3分钟，粘性大且生物相容性好。

本发明的止血材料具有可控的微孔结构。

所述微孔结构是由酶水解形成。

淀粉良好的体内降解性、生物相容性以及来源广泛、价格低廉的特性，为其用于不同场合的出血控制提供了巨大的潜力。多孔结构可有效增加材料的表面积，大大增加材料的吸水性，利于更好地止血。本发明选用天然淀粉作为原料，首先在复合酶的作用下进行水解反应制备一定孔隙率的微孔淀粉，以更好地吸附血液中的水分，提高创面附近相关凝血因子的浓度，实现物理性止血。

进一步地，本发明在酶法制备微孔淀粉的基础上，通过改性处理微孔淀粉制备负载羧基的羧甲基微孔淀粉，并采用自组装技术络合钙离子，从而制备出钙络合型淀粉基微孔止血材料。本发明制备的材料不仅具有物理性止血作用，而且具有化学性止血作用；不仅能激活血小板和启动凝血反应，而且促进血小板凝聚并作用于红细胞；不仅能应用于人体表皮、体内组织、器官等的缓慢出血，也能用于外科手术、喉镜、内窥镜、腔镜等引发的体内实质性脏器的大量出血或骨缺损等活动部位、难止血部位的出血控制。

在本发明的上下文中，“淀粉基微孔止血材料”、“钙络合型淀粉基微孔止血材料”、“钙络合型微孔淀粉止血材料”、“钙络合型微孔淀粉”具有相同的含义，均指

淀粉基微孔止血材料的制备方法

本发明的淀粉基微孔止血材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)微孔淀粉的制备

将淀粉和酶加入到磷酸盐缓冲液中，在45-80℃温度和pH为5-7的条件下搅拌进行酶解反应，4-15小时后，离心分离，干燥得到微孔淀粉；其中，

所述的淀粉和酶的质量比为1∶(0.01-0.2)；

所述的淀粉和酶的总量与磷酸盐缓冲液的质量体积比为100g∶(250-1000)ml；

(2)微孔淀粉的羧甲基化

将一氯乙酸溶于乙醇，加入氢氧化钠溶液至pH 6.5～7后，混合到用乙醇溶解的步骤(1)所制得的微孔淀粉中，充分搅匀，在50-80℃条件下持续搅拌保温进行反应4-8小时，加入乙酸中和pH至6.5～7，过滤，用乙醇洗涤后干燥制得羧甲基微孔淀粉，其中

所述的微孔淀粉与乙醇(包括溶解一氯乙酸的乙醇和微孔淀粉的乙醇)的质量比为1∶(2-5)；

所述的一氯乙酸与微孔淀粉的质量比为1∶(5-30)；

(3)羧甲基微孔淀粉与钙的络合组装

将步骤(2)制得的羧甲基微孔淀粉，加入到饱和的钙盐溶液中，在温度为20～50℃和pH为6～10下进行络合组装反应，制得所述钙络合型淀粉基微孔止血材料。

在另一优选例中，步骤(1)中所述搅拌速度为40-80r/min。

在另一优选例中，步骤(1)中所述离心分离的转速为4000-6000r/min。

在另一优选例中，步骤(1)中所述干燥时间为24-48小时。

在另一优选例中，步骤(2)中所述搅拌速度为45-75r/min。

在另一优选例中，步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3-2mol/L。

在另一优选例中，步骤(2)中所述干燥时间为24-48小时。

在另一优选例中，络合组装反应1-5小时后，水洗抽滤，于-50～-30℃下冷冻干燥24-48小时，制得所述钙络合型淀粉基微孔止血材料。

在另一优选例中，其中所述的干燥方法包括常温干燥、冷冻干燥、真空干燥、梯度升温干燥等中的至少一种。干燥温度为20-160℃。

所述淀粉为马铃薯淀粉、绿豆淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉中的至少一种或其组合。

所述酶为β-淀粉酶，α-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶，异淀粉酶，糖化酶，脱支酶、普鲁蓝酶、磷酸化酶中的至少一种或其组合。

所述钙盐为氯化钙、硝酸钙、醋酸钙、磷酸氢钙、氟化钙、溴化钙中的至少一种或其组合。

所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的至少一种或其组合的水溶液，所述磷酸盐缓冲液的质量百分比浓度为5-30％。

本发明的一优选实施方式中，淀粉基微孔止血材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)微孔淀粉的制备

将淀粉和酶加入到磷酸盐缓冲液中，在45-80℃温度和pH为5-7的条件下，以40-80r/min搅拌速度进行酶解反应，反应4-15小时后，以4000-6000r/min的转速离心分离，然后干燥24-48小时，得到微孔淀粉；其中，

所述的淀粉和酶的质量比为1∶(0.01-0.2)；

所述的淀粉和酶的总量与磷酸盐缓冲液的质量体积比为100g∶(250-1000)ml；

(2)微孔淀粉的羧甲基化

将一氯乙酸溶于乙醇，加入氢氧化钠溶液至pH 6.5～7后，混合到用乙醇溶解的步骤(1)所制得的微孔淀粉中，充分搅匀后移入恒温槽，在50-80℃条件下，以45-75r/min持续搅拌保温进行反应。4-8小时后反应完成，加入乙酸中和pH至6.5～7，过滤，用乙醇洗涤3-8次，干燥24-48小时，制得羧甲基微孔淀粉。

所述的微孔淀粉与乙醇的质量比为1∶(2-5)。

所述的一氯乙酸与微孔淀粉的质量比为1∶(5-30)。

所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3-2mol/L。

(3)羧甲基微孔淀粉与钙的络合组装

将步骤(2)制得的羧甲基微孔淀粉，加入到饱和的钙盐溶液中，在温度为20～50℃和pH为6～10下络合组装，反应1-5小时后，水洗抽滤，于-50～-30℃下冷冻干燥24-48小时，制得所述钙络合型淀粉基微孔止血材料。

淀粉基微孔止血材料的应用

本发明的淀粉基微孔止血材料不仅具有物理性止血作用，而且具有化学性止血作用；不仅能激活血小板和启动凝血反应，而且促进血小板凝聚并作用于红细胞；不仅能应用于人体表皮、体内组织、器官等的缓慢出血，也能用于外科手术、喉镜、内窥镜、腔镜等引发的体内实质性脏器的大量出血或骨缺损等活动部位、难止血部位的出血控制。因此，本发明的淀粉基微孔止血材料能用于制备人体表皮、体内组织等出血部位的止血材料。还用于制备体内实质性脏器的大量出血或活动部位、或难止血部位的出血控制材料。

本发明的淀粉基微孔止血材料可单独使用或与载体材料复合使用。

本发明的有益之处点在于：

1、本发明设计制备出的是钙络合型微孔淀粉止血材料，即在酶水解形成微孔淀粉的基础上，通过羧甲基化改性处理引入羧基，借助羧基与钙离子的强络合作用，形成钙络合型微孔淀粉，具有以下优点：①弥补体内血浆中钙离子含量的不足，钙离子的引入可激发其与体内凝血因子的反应，启动凝血反应而加快止血；②为引入钙离子而通过羧甲基化改性处理负载的羧基，不仅可键合阳离子和激发第12号凝血因子-接触因子，而且易与血红蛋白中的Fe³⁺结合，形成胶块封闭毛细血管。此外，负载的羧基还具有抗菌作用。

2、止血快速强效：本发明制备的钙络合型微孔淀粉止血材料，可凭借其多孔结构和高比表面积来吸水，提高创面附近凝血因子的浓度而实现物理性止血；此外，通过材料中引入的钙离子激发其与体内凝血因子的凝血级联反应，实现化学性止血。与此同时，负载的羧基还能促进血小板聚集并作用于红细胞，加速止血。可见，本发明制备的材料引发多种止血机制一并发挥作用，促进材料快速强效止血。

3、体内可快速降解：作为主要原料的淀粉在体内可被各消化酶作用而降解；此外，制备过程中形成微孔结构提高了材料的降解速度。

4、生物相容性好：制备过程中使用的原料(包括淀粉和酶等)安全无毒，且材料在体内发生酶促降解，形成的降解产物可作为人体的糖元而贮存，具有良好的生物相容性，在体内不会造成组织的不良反应。

5、制备简便且成本低：使用的主要原料淀粉是可再生资源，取之不尽，价格低廉；反应条件温和，无需昂贵的设备，便于材料的规模化生产。

6、适用范围广：本发明制备的钙络合型微孔淀粉止血材料，可用于人体表皮、体内组织、器官等的缓慢出血，也能用于外科手术、喉镜、内窥镜、腔镜等引发的体内实质性脏器的大量出血、创伤急救或骨缺损等活动部位、难止血部位的出血控制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

首先，称取100g木薯淀粉和1g糖化酶，加入到250ml、pH＝5的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀，在45℃下进行水解反应4小时，在4000r/min的转速下离心分离，并真空干燥24h，得到微孔淀粉。

将8g一氯乙酸溶于乙醇，并用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将其调至中性后，混合到用80g乙醇溶解的上述制备的微孔淀粉中，充分搅匀后移入恒温槽，在50℃条件下，以45r/min持续搅拌保温进行反应。4小时后反应完成，加入乙酸中和pH至6.5，过滤，用乙醇洗涤3次，干燥24小时，制得羧甲基微孔淀粉。

最后，将上述反应中得到的羧甲基化微孔淀粉，加入到饱和的氯化钙溶液中，在温度为20℃和pH为6下络合组装，反应1h后，水洗抽滤，于-50℃下冷冻干燥24h，获得钙络合型淀粉基微孔止血材料(见附图1)，流动性好。

实施例2～4

实施例2～4重复实施例1的实验步骤，不同之处在于部分实验条件，具体如表1-3所示。

采用扫描电镜(SEM)分别观察了实施例1制备的纯微孔淀粉(见附图2(a)和(b))和实施例2、实施例4制备的钙络合型微孔淀粉的显微形貌(见附图2(c)和2(d))。由图可见，制备的钙络合型微孔淀粉颗粒直径约为10-20μm，表面布满直径约1-5μm的小孔，孔道由表面向中心嵌入形成空腔。

实施例1～4制备的钙络合型微孔淀粉的平均孔径大小如表4所示。由表4可见，随着酶解反应时间的延长，得到的钙络合型微孔淀粉的平均孔径也随之增大，吸水性逐渐增强，降解时间却随之缩短。

表1  微孔淀粉的制备

表2  微孔淀粉的羧甲基化

表3  羧甲基微孔淀粉与钙的络合组装

实施例	饱和钙溶液成分	pH	温度(℃)	时间(h)
					2	硝酸钙	8	30	1.2
3	碳酸氢钙	9	40	1.5
					4	磷酸氢钙	10	50	2

表4  实施例1～4制备的钙络合型微孔淀粉的性能

实施例	平均孔径(μm)	吸水率(％)	降解时间
				1	0.5	100	6天
2	1	200	4天
				3	3	300	2天
4	5	400	8h

实施例5

优选实施例2中合成的钙络合型微孔淀粉，对其Zeta电位进行研究。称取放入25ml的0.025mol/L的CaCl₂溶液中，超声15min使其均匀分散，并用Zeta电位计测试pH＝6～7.4材料表面的电势，结果见附图3。

由图可见，在pH＝6～7.4范围内，本发明制备的钙络合型微孔淀粉的表面电势为-6～-4.5mv，这进一步表明表面带负电的钙络合型微孔淀粉会激发接触因子的激活，可促进凝血反应的发生，加快止血。

实施例6

优选实施例3中合成的钙络合型微孔淀粉，通过动物实验对其生物相容性和止血性能进行评价。实验动物：新西兰大白兔，平均3kg，清洁级(上海第二医科大学实验动物中心提供)。

(1)生物相容性评价

实验方法：取新西兰大白兔3只，将其固定于解剖台上，对耳缘静脉处注射0.3％戊巴比妥钠溶液，待动物充分麻醉后在其耳部边缘静脉处用安尔碘溶液消毒处理，然后用75％医用酒精脱碘。用手术刀在静脉处做一横断切口，完全切断耳缘静脉，待血液涌出时，用医用纱布拭去表面血液，施加适量的材料，并用纱布按压材料。一定时间后，撤去纱布并观察伤口及周围皮肤致敏反应情况，结果见附图4。由图可见，伤口处没有肿胀现象，无致敏反应，表明本发明制备的钙络合型微孔淀粉具有良好的生物相容性。

(2)止血性能评价

①兔股动脉切除止血模型

实验方法：取新西兰大白兔6只，随机分为2组，每组3只，对照组为微孔淀粉。对受试动物进行麻醉后，固定四肢使其仰卧在手术台上，剔去大腿处的兔毛，无菌环境下，分离软组织，直至找到股动脉，并将其剪断，将材料迅速洒于出血伤口处，并用无菌纱布施以一定的压力(见附图6)，记录下出血开始到停止所需要的时间。

结果见附图5，钙络合型微孔淀粉基止血材料完全控制出血所需的时间为(50±10)s，而纯微孔淀粉材料所需的时间为(100±12)s，两者所需的时间具有明显的差异。可见，本发明制备的钙络合型微孔淀粉对动脉部位的止血性能良好，止血迅速。

②兔肝脏止血模型

实验方法：取新西兰大白兔6只，随机分为2组，每组3只，对照组为微孔淀粉。采用腹部注射麻醉方式麻醉新西兰兔，固定四肢使其仰卧在手术台上，使用手术剪刀沿着腹白线剪开腹腔，分离腹腔其它内脏，暴露肝部，在肝脏部位沿着纵向划开一个长约1cm、宽约2mm、深约3mm的伤口，将材料迅速洒于出血伤口处，记录出血开始到停止所需要的时间。钙络合型微孔淀粉基止血材料完全控制出血所需的时间为(25±7)s，而纯微孔淀粉材料所需的时间为(60±10)s，两者所需的时间具有明显的差异。由此可见，本发明制备的钙络合型微孔淀粉对实质性脏器部位止血快速、高效，具有良好的止血性能。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种淀粉基微孔止血材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微孔淀粉的制备

将淀粉和酶加入到磷酸盐缓冲液中，在45-80℃温度和pH为5-7的条件下搅拌进行酶解反应，4-15小时后，离心分离，干燥得到微孔淀粉；其中，

所述的淀粉和酶的质量比为1：(0.01-0.2)；

所述的淀粉和酶的总量与磷酸盐缓冲液的质量体积比为100g：(250-1000)ml；

(2)微孔淀粉的羧甲基化

将一氯乙酸溶于乙醇，加入氢氧化钠溶液至pH6.5～7后，混合到用乙醇溶解的步骤(1)所制得的微孔淀粉中，充分搅匀，在50-80℃条件下持续搅拌保温进行反应4-8小时，加入乙酸中和pH至6.5～7，过滤，用乙醇洗涤后干燥制得羧甲基微孔淀粉，其中，

所述的微孔淀粉与包括溶解一氯乙酸的乙醇和溶解微孔淀粉的乙醇的乙醇的质量比为1：(2-5)；

所述的一氯乙酸与微孔淀粉的质量比为1:(5-30)；

(3)羧甲基微孔淀粉与钙的络合组装

将步骤(2)制得的羧甲基微孔淀粉，加入到饱和的钙盐溶液中，在温度为20～50℃和pH为6～10下进行络合组装反应，制得所述淀粉基微孔止血材料，所述淀粉负载羧甲基，所述羧甲基络合钙离子，

其中，所述酶为β-淀粉酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、脱支酶、普鲁蓝酶、磷酸化酶中的至少一种；

所述钙盐为氯化钙、硝酸钙、醋酸钙、磷酸氢钙、氟化钙、溴化钙中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉为马铃薯淀粉、绿豆淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉中的至少一种以上。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的质量百分比浓度为5-30％。