CN114315870B

CN114315870B - 一种二聚型生物碱及其制备与应用

Info

Publication number: CN114315870B
Application number: CN202111580552.0A
Authority: CN
Inventors: 尹小英; 孟陈婷
Original assignee: Shanghai University of Engineering Science
Current assignee: Shanghai University of Engineering Science
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-02-10
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114315870A

Abstract

本发明涉及一种二聚型生物碱及其制备与应用，该二聚型生物碱的化学结构式如下所示：

本发明所述的生物碱为苦豆子中新发现的金雀花碱型二聚型生物碱，可明显抑制Topo I的活性，有潜力成为具有高选择性的天然拓朴异构酶抑制剂，可设计开发成为新型抗肿瘤药物，在新药研发领域具有广泛应用前景。

Description

一种二聚型生物碱及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物碱技术领域，涉及一种二聚型生物碱及其制备与应用。

背景技术

一直以来，肿瘤都是困扰全球的疾病，正如国际癌症研究机构(GLOBOCAN)的统计报告所确定的那样，其发病率和死亡率居高不下。目前常见的治疗手段有化疗、放射线治疗、免疫疗法等，然而在临床中存在副作用及耐药性等问题，因此，在开发新型抗肿瘤药物时，更倾向于使用靶向不同生物靶标的小分子药物来帮助研究关于细胞增殖的内容。此外，大多数抗肿瘤药物的来源直接或间接与天然药用植物有关。

苦豆子是一种药用价值很高的植物，近十年来都有学者对其进行不断的研究。苦豆子中含有多种化合物，常见的有生物碱、类固醇化合物、类黄酮、多糖以及挥发油，在这些化学成分中，其主要生物活性成分是喹喏里西啶类生物碱。喹喏里西啶类生物碱具有多种生物活性，常见的有抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、镇痛等。

拓扑异构酶在多种肿瘤细胞中有高水平表达，因此，抑制拓扑异构酶活性可有效抑制肿瘤细胞生长。此外，研究表明，大多数抗肿瘤药物在生物体内靶向DNA，并且直接作用于DNA，干扰其发挥正常生理作用，从而影响基因表达与调控，达到抑制或杀死肿瘤细胞的作用。因此，提供合适的拓扑异构酶抑制剂具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种二聚型生物碱及其制备与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一提供了一种二聚型生物碱，其化学结构式如下所示：

本发明的技术方案之二提供了一种二聚型生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)取苦豆子种子打磨成粉体，以乙醇为溶剂加热回流提取，此处可加热回流多次，且多次所得提取的浓缩滤液可以合并，得到浓缩滤液作为药液备用；

(2)取药液加水溶解调节pH呈碱性，采用氯仿萃取，静置至分层清洗，再取氯仿相反复萃取至无颜色，旋干氯仿，得到总生物碱粗品；

(3)将总生物碱粗品经硅胶柱层析分离，依次用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱检测，得到中间馏分；

(4)将中间馏分经ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，显色，即得到目标产物。

进一步的，步骤(1)中，加热回流的温度为80～90℃，时间为1～4h。

进一步的，步骤(1)中，加热回流过程中的料液比为1:8～12。

进一步的，步骤(1)中，所用乙醇溶剂为质量分数70～80％的乙醇溶液。

进一步的，步骤(1)中，加热回流的次数为一次或若干次。

进一步的，步骤(2)中，调节pH所用试剂为氢氧化钠溶液。

进一步的，步骤(2)中，pH被调节至10～11。

进一步的，步骤(2)中，氯仿与所加水的体积比为1:1；水的添加量满足药液溶解即可，即水尽量少加。

进一步的，步骤(3)中，二氯甲烷-甲醇的梯度变化范围为50:1～1:9。

进一步的，步骤(3)中，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱后，得到六个组分，分别为组分1、组分2、组分3、组分4、组分5和组分6，各组分所对应的二氯甲烷/甲醇的浓度比分别为50：1、90：10、70：30、1：1、30：70和10：90，同时，以组分2作为中间馏分进行后续处理。

进一步的，步骤(4)中，中间馏分分别以石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇为流动相梯度洗脱，经薄层色谱合样后得到3个组分，即组分Fr2.1、Fr2.2和Fr2.3，其中，各组分所对应的洗脱条件分别为石油醚:乙酸乙酯为1:1、石油醚:乙酸乙酯为0:1、二氯甲烷：甲醇为4:1；

再以组分Fr2.3继续经ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到8个组分，分别为组分Fr 2.3.1～2.3.8，各组分所对应的洗脱条件甲醇/水(10、20、40、60和80％，v/v)，其中，对组分Fr 2.3.3和组分Fr 2.3.4继续进行分离纯化，即得到目标产物。

更进一步的，步骤(3)中，石油醚-乙酸乙酯的洗脱梯度为1：1与0：1，二氯甲烷-甲醇的洗脱梯度为4：1，得到三个组分Fr 2.1-2.3。

更进一步的，步骤(4)中，Fr 2.3的流动相甲醇-水洗脱梯度为1：9～8：2，得到八个组分Fr 2.3.1-2.3.8。更优选的，步骤(4)中，其中Fr 2.3.3经ODS柱色谱甲醇-水(10％，v/v)、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离纯化得到化合物1；Fr 2.3.4经ODS柱色谱甲醇-水(20％，v/v)得化合物2。

本发明的技术方案之三提供了二聚型生物碱的应用，该二聚型生物碱作为Topo I抑制剂。

本发明的研究结果显示：本发明从苦豆子种子中所提取的金雀花碱-喹喏里西啶类二聚型生物碱化合物可明显抑制拓扑异构酶I活性，说明此种金雀花碱-喹喏里西啶类二聚型生物碱化合物为拓扑异构酶I抑制剂，可望作为活性成分用于开发设计为新型抗肿瘤先导化合物，具有广泛应用前景。

附图说明

图1为新型生物碱对Topo I的抑制活性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：新型生物碱的提取分离

1.1实验药材：

苦豆子果实由郑州中冠健业生物科技有限公司提供。

1.2从苦豆子种提取分离新型生物碱：

取苦豆子种子50Kg打粉备用。用75％乙醇为溶剂85℃加热回流提取三次，每次回流2.5h，料液比为1：10，合并浓缩滤液得药液备用。

将提取得的药液用尽量少的水溶解，用氢氧化钠溶液调pH 10.5，氯仿与药液溶解的水溶液体积比为1:1，置于分液漏斗中，摇晃，静置至分层清晰，氯仿部位在下层，取氯仿部位，反复萃取至氯仿层无颜色，用旋转蒸发器旋干氯仿得总生物碱。

将氯仿萃取得到的总生物碱经硅胶柱层析分离，依次用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱检测，合并馏分，最终得到6个组分，各组分所对应的二氯甲烷/甲醇的浓度比分别为50：1、90：10、70：30、1：1、30：70和10：90，v/v。将各组分减压浓缩回收至干，备用。

其中，组分2经硅胶柱色谱分离，分别以石油醚∶乙酸乙酯(1:1,0:1,v/v)和二氯甲烷：甲醇(4:1,v/v)为流动相梯度洗脱，经薄层色谱合样后得到3个组分Fr 2.1 -2.3，分别对应洗脱条件为：石油醚∶乙酸乙酯(1:1,v/v，Fr 2.1)、石油醚∶乙酸乙酯(0:1,v/v，Fr2.2)、二氯甲烷：甲醇(4:1,v/v，Fr 2.3)。将得到的Fr 2.3经ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，甲醇-水洗脱梯度为1：9～8：2，得到8个组分Fr 2.3.1-2.3.8。其中，甲醇：水(1：9，v/v，Fr 2.3.1-2.3.3)、甲醇：水(2：8，v/v，Fr 2.3.4)、甲醇：水(4：6，v/v，Fr 2.3.5)、甲醇：水(6：4，v/v，Fr 2.3.6)和甲醇：水(8：2，v/v，Fr 2.3.7-2.3.8)。其中，组分Fr 2.3.3经ODS柱色谱甲醇-水(10％，v/v)、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离纯化得到化合物1；组分Fr 2.3.4经ODS柱色谱甲醇-水(20％，v/v)得化合物2。

以上得到的化合物均用改良碘化铋钾显色剂在薄层色谱上进行显色，结果显示为橘红色，即化合物为生物碱。

实施例2：考察新型生物碱化合物的结构鉴定与解析

对上述实施例1得到的新型生物碱化合物进行结构测试解析，得到以下试验数据：

式I化合物:C₂₆H₃₈N₄O₃为淡黄色无定形粉末，微溶于DMSO。HR-ESI-MS(m/z439.3058[M+H]⁺,计算值439.3073)。通过HSQC及HMBC谱，结合¹H NMR和¹³C NMR谱所给出的信息，对上述新化合物的碳氢信息进行了归属，如表1所示。在HMBC谱图中，δ_H 7.39(H-4’)和δ_C 151.6(C-6’)、δ_C 162.1(C-2’)相关，δ_H 6.22(H-3’)和δ_C 104.0(C-5’)有关，δ_H 5.76(H-5’)和δ_C34.1(C-7’)、δ_C 115.1(C-3’)、δ_C 151.6(C-6’)相关，δ_H 3.76(H-10’)和δ_C 25.6(C-8’)、δ_C27.3(C-9’)、δ_C 57.6(C-11’)相关，δ_H 2.68(H-2)和δ_C 57.6(C-11’)相关，δ_H1.92(H-13’)和δ_C 151.6(C-6’)相关，确定了各结构片段的连接方式。综上信息，确定上述的新化合物(式I)的化学结构为：

表1 ¹H(400MHz)and ¹³C(150MHz)NMR Spectroscopic Data in DMSO-d6(δinppm,J in Hz)

式II化合物:C₂₆H₃₈N₄O₂为黄色无定形粉末，微溶于DMSO。HR-ESI-MS(m/z439.3063[M+H]⁺,计算值439.3073)。通过HSQC及HMBC谱，结合¹H NMR和¹³C NMR谱所给出的信息，对上述新化合物的碳氢信息进行了归属，如表2所示。在HMBC谱图中，δ_H 3.74(H-10’)和δ_C 25.6(C-8’)、δ_C 27.3(C-9’)相关，δ_H 7.39(H-4’)和δ_C 151.6(C-6’)、δ_C 162.1(C-2’)相关，δ_H2.09(H-11’)和δ_C 49.6(C-10’)相关，δ_H6.22(H-3’)和δ_C 104.0(C-5’)有关，δ_H 3.76(H-10’)和δ_C 25.6(C-8’)、δ_C 27.3(C-9’)、δ_C57.6(C-11’)相关，δ_H 2.68(H-2)和δ_C 57.6(C-11’)相关，δ_H 1.92(H-13’)和δ_C 151.6(C-6’)相关，δ_H 5.76(H-5’)和δ_C 34.1(C-7’)、δ_C115.1(C-3’)、δ_C 151.6(C-6’)相关，由此确定了各结构片段的连接方式。综上信息，确定上述的新化合物的化学结构为：

表2 ¹H(400MHz)and ¹³C(150MHz)NMR Spectroscopic Data in DMSO-d6(δinppm,J in Hz)

实施例3：新型生物碱化合物的抑制Topo I活性实验

3.1实验材料：

实验所用新型生物碱由上述实施例1的方法制备，精密称取，用DMSO溶解稀释至浓度为1mM。EDTA(上海阿达马斯试剂有限公司)；EB(西格玛奥德里奇贸易有限公司)；琼脂糖(上海阿达马斯试剂有限公司)；pBR322DNA(宝日医生物技术有限公司)；DNA拓扑异构酶I(宝日医生物技术有限公司)；DNA Loading Buffer(6×)(上海碧云天生物技术有限公司)。

3.2实验方法：

(1)1％琼脂糖凝胶的配制：

准确称取0.5g琼脂糖粉末，用50mL的1×TAE缓冲液高温溶解后冷却至60℃倒入凝胶电泳水平槽内。

(2)1×Topo I Buffer的配制：

移液枪移取10μL 10×Topo I Buffer，用90μL超纯水稀释得1×Topo I Buffer备用。

(3)1U·μL^-1Topo I的配制：

移液枪移取1μL浓度为20U·μL^-1的Topo I，用19μL上述(2)中的1×Topo I Buffer进行稀释，得1U·μL^-1Topo I。

(4)反应体系：

依次向1.5mL样品管中加入超纯水10μL，10×Topo I Buffer 2μL，0.1％ BSA2μL，1U·μL-1Topo I 1.0μL，1mM新型生物碱1μL，pBR322DNA 0.5μg，加超纯水定容至20μL，混匀，37℃恒温水浴孵育30min。

(5)电泳：

孵育结束后用1μL DNA Loading Buffer(6×)混合4μL样品反应液上样，99V电泳1h。电泳结束后用EB溶液染色30min，使用凝胶成像系统拍照分析电泳结果。

3.3实验结果：

本实验用Topo I介导的DNA松散实验来研究新型生物碱对Topo I的抑制活性作用，结果如图1所示，泳道T为不加样品时，1U的Topo I能将超螺旋DNA解旋为松散DNA，泳道S排除了溶剂DMSO对实验的影响，泳道1和2说明新型生物碱对Topo I表现出了不同程度的抑制作用。

图1中，泳道D：pBR322DNA；泳道T：pBR322DNA+Topo I；泳道S：pBR322DNA+Topo I+DMSO；泳道1：pBR322DNA+Topo I+式I生物碱；泳道2：pBR322DNA+Topo I+式II生物碱

综合图1可见，本发明的金雀花碱-喹喏里西啶类二聚型生物碱化合物是从苦豆子中提取分离得到的一种新型骨架的生物碱，且具有抑制拓扑异构酶I活性的作用。根据研究报道，DNA拓扑异构酶在多种肿瘤细胞中由高水平的表达，因此，抑制拓扑异构酶I可以有效的抑制或杀死肿瘤细胞。所述生物碱作为Topo I抑制剂，可望用于制备治疗糖尿病胃肠功能紊乱而致腹泻的药物，可望作为活性成分用于开发设计为新型抗肿瘤先导化合物。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种二聚型生物碱，其特征在于，其化学结构式如下所示：

2.如权利要求1所述的一种二聚型生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取苦豆子种子打磨成粉体，以乙醇为溶剂加热回流提取，得到浓缩滤液作为药液备用；

(4)将中间馏分经硅胶柱色谱分离，分别以石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇为流动相梯度洗脱，经薄层色谱合样后得到中间组分，再经ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，所得洗脱部分继续纯化，即得到目标产物；

步骤(1)中，加热回流的温度为80～90℃，时间为1～4h；

步骤(1)中，加热回流过程中的料液比为1:8～12；

步骤(1)中，所用乙醇溶剂为质量分数70～80％的乙醇溶液；

步骤(2)中，调节pH所用试剂为氢氧化钠溶液，其pH被调节至10～11；

步骤(2)中，氯仿与所加水的体积比为1:1；水的添加量满足药液溶解即可；

步骤(3)中，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱后，得到六个组分，分别为组分1、组分2、组分3、组分4、组分5和组分6，各组分所对应的二氯甲烷/甲醇的浓度比分别为50：1、90：10、70：30、1：1、30：70和10：90，同时，以组分2作为中间馏分进行后续处理；

步骤(4)中，中间馏分分别以石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇为流动相梯度洗脱，经薄层色谱合样后得到3个组分，即组分Fr2.1、Fr2.2和Fr2.3，其中，各组分所对应的洗脱条件分别为石油醚:乙酸乙酯为1:1、石油醚:乙酸乙酯为0:1、二氯甲烷：甲醇为4:1；

再以组分Fr2.3继续经ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到8个组分，分别为组分Fr 2.3.1～Fr2.3.8，各组分所对应的甲醇/水的体积比具体为：组分Fr 2.3.1至组分2.3.3均为1：9，组分Fr 2.3.4为2：8，组分Fr 2.3.5为4：6，组分Fr 2.3.6为6：4，组分Fr 2.3.7-2.3.8为8：2，其中，对组分Fr 2.3.3和组分Fr 2.3.4继续进行分离纯化，即得到目标产物。

3.如权利要求1所述的二聚型生物碱在制备Topo I抑制剂中的应用。