CN110721180A - 米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用 - Google Patents

米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用 Download PDF

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李晓倩
刘铁
岳昌武
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Zunyi First Peoples Hospital
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Abstract

本方案公开了米尔贝霉素化合物生物技术领域的米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用，尤其是米尔贝霉素化合物用于制备逆转肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或鼻咽癌细胞耐药性药物或组合物中的应用。经活性测试证明，米尔贝霉素化合物具有很好的逆转癌细胞耐药性的效果。

Description

米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中 的应用
技术领域
本发明属于米尔贝霉素化合物生物技术领域，特别涉及米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用。
背景技术
链霉菌(Streptomyces)的次级代谢产物种类丰富，骨架结构新颖多样，生物学活性显著，是发现药物先导化合物的重要来源。链霉菌FJS31-2是实验室前期鉴定的一株产新型卤化II型聚酮类抗生素zunyimycins A、B、C的菌株，并获得相应专利(ZL201610390757.5、ZL201610394737.5)。通过进一步深入挖掘，我们从该菌株的次生代谢产物中分离鉴定了一个α型米尔贝霉素类(Milbemycins)化合物VM48130，该化合物的结构式为：
Figure BDA0002271246030000011
发明人前期对该化合物进行研究，发现其对灭杀癌细胞具有一定的作用，申请人已将该研究成果以专利的形式申请保护，专利申请号为：CN201910641382.9。随着发明人对VM48130化合物进一步深入的研究，发明人发现米尔贝霉素化合物对于逆转癌细胞耐药性具有良好的活性，说明米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物上具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明意在提供米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用，以扩大米尔贝霉素化合物的应用范围。
本方案中的米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用，所述米尔贝霉素化合物从链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物中分离得到；链霉菌FJS 31-2的保藏号为：CGMCC 4.7321。
链霉菌FJS 31-2的保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2016年6月2日，分类命名:链霉菌Streptomyces sp，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述米尔贝霉素化合物的结构式为：
Figure BDA0002271246030000021
活性测试证明，米尔贝霉素化合物具有很好的逆转癌细胞耐药性的效果。因此，本发明提供了米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用。
进一步，米尔贝霉素化合物在制备逆转肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或鼻咽癌细胞耐药性药物或组合物中的应用。
经活性测试证明米尔贝霉素化合物具有良好的逆转癌细胞耐药性的效果，尤其是对逆转肺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞和鼻咽癌细胞耐药性的活性较高。
附图说明
图1为本发明中肺癌A549在显微镜下放大400倍的细胞图；
图2为本发明中肺癌A549/DDP在显微镜下放大400倍的细胞图；
图3为本发明中肺癌A549细胞和A549/DDP细胞的MDR1、MRP1、LRP和MAST1基因表达柱状图；
图4为加入不同浓度化合物VM48130后对相关耐药基因MDR1、MRP1、LRP和MAST1表达的影响柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
菌株及细胞系
菌株：链霉菌FJS 31-2的保藏号为：CGMCC 4.7321；保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2016年6月2日，分类命名:链霉菌Streptomyces sp，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。链霉菌FJS 31-2菌株分离自贵州省特殊生境梵净山海拔800m的土样中。米尔贝霉素化合物的分离：
步骤一、使用乙酸乙酯抽提保藏号为：CGMCC 4.7321的链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物，得到乙酸乙酯提取物浸膏；
步骤二、采用80～100目的硅胶对乙酸乙酯提取物浸膏进行拌样，然后用200～300目的硅胶以石油醚湿法装柱，用石油醚－丙酮(15:1～3:1)梯度洗脱，得到不同极性段的组分Fr.1～Fr.6；Fr.4经ODS-A柱层析(甲醇-水70:30～90:10)梯度洗脱，得到3个组分Fr.4-1、Fr.4-2和Fr.4-3；再将组分Fr.4-2通过葡聚糖凝胶Sephadex LH–20柱层析(氯仿-甲醇1:1)分离，再进一步通过半制备型HPLC，以甲醇–水(72:28,v/v)为流动相，收集保留时间为17.990min的组分，回收溶剂得白色无定形粉末化合物：米尔贝霉素化合物，米尔贝霉素化合物的结构式为：
Figure BDA0002271246030000031
以TLC检测254nm紫外下可见且10％硫酸乙醇显色剂显色后呈桃红色，以氯仿-丙酮10:1或石油醚-丙酮3:1为展开剂展开后，Rf值为0.5。
细胞株：肺癌A549细胞株为本实验室保存，多药耐药的顺铂耐药的人类肺癌细胞株(A549/DDP)获赠于遵义医科大学。
培养时，A549肺癌细胞株用含10％胎牛血清和1％青链霉素RPMI1640培养基，并在37℃、5％CO2培养箱中培养。A549/DDP细胞株用含10％胎牛血清和1％青链霉素和2000ng/L顺铂(DDP)的RPMI1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
肺癌A549细胞株和A549/DDP细胞株的细胞形态如附图1和附图2所示；图1和图2中的20μM为标尺，表示肺癌细胞在显微镜下放大400倍。
耐药谱及耐药倍数测定：
将培养的肺癌细胞A549和A549/DDP接种于96孔板中，培养过夜后，分别加入不同浓度的顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(TAX)、依托泊甙(VP-16)和长春新碱(VCR)，同时设空白对照组。cck8法检测各孔在490nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率和IC50，计算耐药倍数(Resistance index，RI)，RI＝耐药细胞的IC50/亲代细胞的IC50；具体参数如表1所示：
表1 A549/DDP耐药谱及耐药倍数
Figure BDA0002271246030000041
从表1可知：经过对耐药细胞株A549/DDP的耐药谱测定，其顺铂耐药指数大约为亲代细胞A549的17倍；另外A549/DDP对依托泊苷、长春新碱抗癌药物表现出较好的耐药，其IC50显著提高。
米尔贝霉素化合物VM48130增加A549/DDP细胞对顺铂敏感性的试验
将A549和A549/DDP细胞密度调整为1*104个/ml，接种于96孔培养板，每孔100μL，37℃、5％CO2培养24h后加药，顺铂的浓度为0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM、256μM，米尔贝霉素化合物VM48130选择三个测试浓度(0.5μmol/L、2μmol/L、5μmol/L)均低于自身的IC10，计算出在药物联合作用下，DDP对A549和A549/DDP细胞的半数抑制浓度及逆转倍数。
Figure BDA0002271246030000051
化合物VM48130对A549和A549/DDP细胞增殖抑制作用如表2所示：
表2化合物VM48130对A549和A549/DDP细胞增殖抑制作用
Figure BDA0002271246030000052
化合物VM48130对A549和A549/DDP细胞的逆转作用如表3所示：
表3化合物VM48130对A549/DDP和A549细胞的逆转作用
Figure BDA0002271246030000053
**P＜0.05，与对照组A549/DDP的DDP IC50比较。
从表3可以看出：米尔贝霉素与DDP联合使用后，DDP对于A549/DDP细胞的IC50显著下降(P＜0.05)，说明米尔贝霉素化合物明显增强了顺铂对耐药细胞的敏感性，但对于A549细胞则无明显影响(P＞0.05)。从逆转倍数上来看，当米尔贝霉素浓度仅为0.5μM时，逆转倍数达6.25倍，并且呈现剂量依赖效应，5μM时，逆转倍数达8.35倍，与相同浓度下传统药物维拉帕米的逆转倍数8.93效果相当。
RNA提取，荧光定量PCR测定化合物VM48130对多种耐药基因表达的影响
按照宝生物RNAiso Plus*试剂说明书进行总RNA的提取。利用宝生物PrimescriptTM RT reagent kit(DRR037A)，采用20μL PCR体系反转录条件如下：37℃15min，85℃5s(失活反转录酶)。取反转录后的cDNA品为模板，扩增LRP、MDR1、MRP1、MAST1和GAPDH基因，按SYBRR Premix Ex TaqTM RT-PCR KitⅡ试剂盒说明书配制PCR反应体系。在CFX96荧光定量PCR仪上设置Real Time PCR反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火30sec，共进行40个循环；从55℃开始，每0.5℃采集1次荧光，每次10sec，共采集81次。荧光定量PCR引物序列见表4：
表4荧光定量PCR引物及序列
Figure BDA0002271246030000054
运用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间差异用t检验，应用2-△△Ct法对实时荧光定量PCR数据进行处理，运用GraphPad Prism 6.0作图分析；P<0.05认为差异有统计意义。
肺癌A549细胞和耐药A549/DDP细胞的MDR1、MRP1、LRP和MAST1基因表达如附图3所示，附图3中可知：A549/DDP中的MDR1、MRP1、LRP和MAST1基因表达相对于亲代细胞A549显著升高。
不同浓度的化合物VM48130对A549/DDP中相关耐药基因表达的影响如附图4所示；从附图4可知：0.5μM的米尔贝霉素化合物可明显增强A549/DDP对DDP的敏感性，降低了MDR1、MRP1、LPR和MAST1基因的表达，且呈剂量依赖关系，米尔贝霉素浓度越高基因表达越低。

Claims (2)

1.米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用，其特征在于：所述米尔贝霉素化合物的结构式为：
Figure FDA0002271246020000011
2.根据权利要求1所述的米尔贝霉素化合物在制备逆转癌细胞耐药性药物或组合物中的应用，其特征在于：所述癌细胞为肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或鼻咽癌细胞。
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