CN111303165B - 一类星孢菌素类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类星孢菌素类衍生物，可用于开发抗肿瘤相关药物以及与蛋白激酶、酪氨酸激酶等激酶抑制相关疾病的药物。本发明还提供了上述星孢菌素类衍生物的制备方法，由放线菌大米固体培养基发酵产生，经乙酸乙酯萃取后所得的发酵粗提物物，采用凝胶柱色谱、硅胶柱色谱、中压制备色谱和高效液相色谱分离纯化得到，易于操作和实施。本发明的星孢菌素类衍生物结构类型比较新型，为天然产物中首次发现；本发明实验操作简单，易于扩大生产，具有较好的应用前景。

Description

一类星孢菌素类衍生物及其制备方法和应用
本申请是“一类星孢菌素类衍生物及其制备方法和应用”的分案申请，原申请的申请日为2019年9月19日，原申请的申请号为201910887005.3。
技术领域
本发明涉及放线菌发酵产物制备活性化合物领域，具体涉及一类星孢菌素类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，随着我国人口老龄化逐渐加剧、工业化和城镇化进程的加快、不健康生活方式及环境等危险因素的累积，恶性肿瘤的防控形势异常严峻。
2019年1月国家癌症中心发布的癌症统计数据显示恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势。肺癌、肝癌、上消化系统肿瘤及结直肠癌、男性前列腺癌、女性乳腺癌等依然是我国主要的恶性肿瘤。
目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％，与10年前相比提高了约10个百分点，但与发达国家还有很大差距。手术、放疗、化疗和分子靶向药物依然是治疗癌症的几大主要手段，因此，发现更高效的抗肿瘤药物是降低恶性肿瘤死亡率最有效的办法。
星孢菌素(Staurosporine，STA)最早发现于1977年，是一种广谱的激酶抑制剂，特别是对蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)有强效抑制作用(IC50＝1～20nM)，因此被广泛用于研究PKC在各类细胞信号传导过程中所起的作用。但STA为非选择性激酶抑制剂，限制了其作为临床药物使用。
多个STA衍生物包括天然来源的UCN-01、结构修饰得到的enzastaurin、edotecarin、CEP-2563、CEP-1347等进入临床研究或完成临床研究。衍生物lestaurtinib于2006年由FDA批准作为治疗急性髓细胞白血病的孤儿药；半合成衍生物midostaurin为一多靶点激酶抑制剂，于2017年由FDA批准用于治疗急性髓系白血病以及系统性细胞增生肥大症。这表明星孢菌素结构母核为一极具开发前景的化合物母核。
然而这些化合物通常选择性较差，对癌细胞及正常细胞均有抑制作用。因此寻找更多的结构新颖、选择性较高的星孢菌素类衍生物是发现具有抗肿瘤作用化合物的有效途径。
公开号为CN 107569491 A的专利说明书公开了一种星孢菌素类化合物的应用，通过对放线菌进行研究，分离纯化得到5种星孢菌素类化合物，所得星孢菌素类化合物对前列腺癌细胞具有较高的活性，同时还对Brd4蛋白具有较高的抑制作用，可用于制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物和Brd4蛋白抑制剂。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一类星孢菌素类衍生物，由放线菌通过固体发酵而得，具有明显的抗肿瘤活性及蛋白激酶抑制活性，可用于开发预防及治疗恶性肿瘤及激酶表达异常相关疾病的药物。
一类星孢菌素类衍生物，结构式如下任一结构所示：
Figure BDA0002443826850000031
所述的星孢菌素类衍生物可由放线菌经固体发酵产生，并通过分离纯化得到，易于操作和实施。
本发明还提供了所述的星孢菌素类衍生物的制备方法，包括步骤：
(1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；
(2)将所得种子液接种于大米培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物粗提物；
(3)将所得发酵产物粗提物进行分离纯化，获得所述的星孢菌素类衍生物。
步骤(1)中，所述的放线菌可采用市售产品，如中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomyces sp.CICC 11031，订购网址：http://www.china-cicc.org/。
作为优选，步骤(1)中，所述摇床培养的条件为：28℃，180rpm培养4～6天。
作为优选，步骤(2)中，所述大米培养基由大米和海盐水配制而成，大米质量和海盐水的体积之比为40g：60mL，即按照大米质量40g和海盐水体积60mL配比后经高压湿热灭菌所得；
所述种子液接种量为：每40g大米接种10mL种子液；
所述静置培养的条件为：28℃，静置培养70天。
作为优选，所述海盐水质量浓度为25‰。
作为优选，步骤(3)中，所述的分离纯化方法包括：萃取、凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱以及高效制备液相色谱。
作为优选，所述萃取条件：乙酸乙酯溶剂浸泡3天；
所述凝胶柱色谱条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的洗脱剂为甲醇-水溶液，按照甲醇体积百分数为20％、40％、60％、80％、100％的比例洗脱；
所述中压制备色谱条件：填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积百分数40％～100％的甲醇+0.05％TFA(三氟乙酸)-水溶液梯度洗脱；
所述硅胶柱色谱条件：采用300～400目的精制硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇溶液，洗脱体系为二氯甲烷:甲醇＝100:1，80:1，60:1，40:1，20:1，10:1，1:0；
所述高效制备液相色谱条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相是甲醇-水和乙腈-水溶液，进一步优选采用的流动相是40％～100％的甲醇-水溶液以及40％～60％的乙腈-水溶液。
采用人结肠癌细胞株HCT116和前列腺癌细胞株PC3对本发明的化合物进行肿瘤细胞毒活性评价；采用蛋白激酶PKCθ和ROCK2测试该类化合物对蛋白激酶的抑制活性，结果显示所述星孢菌素类化合物能有效抑制HCT116及PC3细胞的生长，同时具有较好的PKCθ、ROCK2激酶抑制活性，说明该类化合物具有相关蛋白激酶抑制作用以及肿瘤细胞毒作用，因此可用来进一步研发蛋白激酶抑制剂以及抗肿瘤药物。
本发明还提供了所述的星孢菌素类衍生物在制备治疗结肠癌、前列腺癌的药物中的应用。
本发明还提供了所述的星孢菌素类衍生物在制备蛋白激酶抑制剂中的应用，所述蛋白激酶为PKCθ和ROCK2。
本发明提供的化合物可用于治疗与蛋白激酶、酪氨酸激酶等抑制有关的多种恶性肿瘤、HIV、白血病、阿尔兹海默症等相关疾病的药物，因而具有很好的应用前景。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
本发明中的星孢菌素类化合物，可用于开发抗肿瘤相关药物以及与蛋白激酶、酪氨酸激酶等激酶抑制相关疾病的药物；所述的化合物其结构类型比较新型，为天然产物中首次发现；本发明实验操作简单，易于扩大生产，具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例通过下述方法得到上述结构式1～14的星孢菌素类化合物。
放线菌的发酵
放线菌采用中国普通微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC 11031；
1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，培养温度为28℃，180rpm摇床培养4～6天，获得种子液；
高氏一号培养基为：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，海盐25g，加水至1L，调pH 7.2。
2)将步骤1)所得的种子液接种至固体培养基(固体培养基，由以下组分制成：大米质量40g；海盐水60mL，置于500mL锥形瓶后经高压湿热灭菌所得)，每瓶接种量为10mL，28℃下静置培养70天，培养物经乙酸乙酯浸泡萃取、浓缩，得到含有本发明化合物的发酵产物粗提物。
化合物的制备
将所得粗体物进行凝胶柱色谱(填料为羟丙基葡聚糖凝胶LH-20)，洗脱剂为体积百分数20％、40％、60％、80％、100％的甲醇-水体系，每1/4柱体积为一个馏分，TLC分析合并各馏分，得到Fr.A～Fr.X组分，其中Fr.N～Fr.X含目标类型化合物。将Fr.N～Fr.X组分首先分别进行凝胶柱色谱分离(流动相为：二氯甲烷:甲醇＝1:1)，得到相应小组分，再进行中压或高压液相制备。使用高压色谱柱为Agilent Pursuit C-18(10μm,21.2×250mm)，检测波长292或316nm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶，分离得到本发明所述化合物。
Fr.Q-4采用中压液相制备(40％甲醇-水-0.05％TFA溶液)，得到Fr.Q-4-1～Fr.Q-4-5组分，Fr.Q-4-4采用硅胶柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1,1:0)分离得到组分Fr.Q-4-4-1～Fr.Q-4-4-14。Fr.Q-4-4-7采用高压液相制备(42％乙腈-水溶液，检测波长292nm)，收集28min和30min的峰得到化合物6和7；Fr.Q-4-4-8采用高压液相制备(40％乙腈-水溶液，检测波长292nm)，收集20min的峰得到化合物2；
Fr.Q-7采用硅胶柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝40:1,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,1:0)分离得到组分Fr.Q-7-1～Fr.Q-7-8，Fr.Q-7-1采用高压液相制备(40％乙腈-水溶液)收集50min、54min的峰得到化合物4和5；
Fr.Q-9采用高压液相制备(70％甲醇-水溶液)，收集7min和25min的峰得到化合物9和8。
Fr.T-4采用硅胶柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1,1:0)分离得到组分Fr.T-4-1～Fr.T-4-12，Fr.T-4-1采用高压液相制备(40％～100％甲醇-水溶液，60min,检测波长317nm)收集47min的峰得到化合物11；Fr.T-4-2采用高压液相制备(70％等度，0-40min；70％-100％梯度甲醇-水溶液，40-70min,检测波长292nm)收集59min和67min的峰得到化合物13和14；Fr.T-4-3采用高压液相制备(50-65％乙腈-水溶液)收集12min的峰得到化合物12；Fr.T-4-4采用高压液相制备(68％甲醇-水溶液，检测波长292nm)收集31min的峰得到化合物3；
Fr.U-3采用高压液相制备(50％～80％梯度甲醇-水溶液，55min，检测波长292nm)收集24min的峰得到化合物1；
Fr.V-3采用高压液相制备(60％～80％梯度甲醇-水溶液，40min，检测波长317nm)收集33min的峰得到化合物10。
化合物的鉴定
本发明化合物1为白色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z673.2325[2M+Na]+,calcd 673.2322，提示分子式为C21H15N3O，命名为7-methyl-K252c，具体核磁数据见表1、2。
化合物2为无色晶体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 559.1957[M+Na]+,calcd 559.1957，提示分子式为C31H28N4O5，命名为4'-N-demethyl-(3"-hydroxy-2"-pyrrolidinone)staurosprine，具体核磁数据见表1、2。
化合物3为无色晶体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 646.2065[M+Na]+(calculated 646.2066)，提示分子式为C37H29N5O5，命名为4'-N-demethyl-(4"-indolyl-2",3"-propanedione)staurosprine，具体核磁数据见表1、2。
化合物4为棕色结晶，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 522.1639[M+Na]+,calcd 522.1641，提示分子式为C28H25N3O6，命名为7(S)-methoxy-MLR-52，具体核磁数据见表1、2。
化合物5为淡黄色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 522.1636[M+Na]+,calcd 522.1641，提示分子式为C28H25N3O6，该结构与化合物4类似，差别在于OCH 3-7的化学位移，提示化合物5与4为7位甲氧基异构体。因此命名为7(R)-methoxy-MLR-52，具体核磁数据见表1、2。
化合物6为淡黄色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 508.1479[M+Na]+，calcd 508.1485，提示分子式为C27H23N3O6。该化合物与4的差别在于OCH 3-7被OH-7取代，因此命名为7(S)-hydroxyl-MLR-52，具体核磁数据见表1、2。
化合物7与化合物6类似，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 508.1479[M+Na]+，calcd 508.1485，提示分子式为C27H23N3O6。两者之间的差别在于7位氢的化学位移不同，提示化合物7与6为7位羟基异构体。因此命名为7(R)-hydroxyl-MLR-52，具体核磁数据见表1、2。
化合物8为白色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z510.1639[M+Na]+，calcd 510.1641，提示分子式为C27H25N3O6。因此命名为7(R)-methoxy-K252d，具体核磁数据见表1、2。
化合物9为棕色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z496.1481[M+Na]+，calcd 496.1485，提示分子式为C26H23N3O6。因此命名为7(S)-hydroxyl-K252d，具体核磁数据见表1、2。
化合物10为黄色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 519.1634[M+Na]+,calcd 519.1644，提示分子式为C28H24N4O5，命名为7-oxo-4'-N-Acetyl-holyrine A，具体核磁数据见表1、2。
化合物11为黄色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 488.1219[M+Na]+，calcd 488.1222，提示分子式为C27H19N3O5。该化合物与已知化合物3'-epi-4'-oxo-TAN-1030A类似，不同之处在于化合物4在5位和7位均有羰基存在，命名为3'-epi-7,4'-dioxo-TAN-1030A，具体核磁数据见表1、2。
化合物12为淡黄固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z[M+Na]+440.1611，calcd 440.1605，提示分子式为C26H21N3O4。该化合物与已知化合物streptocarbazoles C类似，因此命名为2',3'-epi-streptocarbazole C，具体核磁数据见表1、2。
化合物13为白色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 506.1687[M+Na]+，calcd 506.1692，提示分子式为C28H25N3O5。该化合物与已知化合物streptocarbazoles B类似，不同之处在于C-4'与C-5'之间的双键变为单键，5'位发生羟基取代，因此命名为5'-hydroxyl-streptocarbazoles B，具体核磁数据见表1、2。
化合物14为白色固体，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 607.1592[M+Na]+，calcd 607.1594，提示分子式为C34H24N4O6。具体核磁数据见表1、2。
表1化合物氢谱数据
Figure BDA0002443826850000081
Figure BDA0002443826850000091
Figure BDA0002443826850000101
注：a,b,c表示分别在600,500,400MHz下测定；d,e,f分别指示溶剂为CD3OD,DMSO-d6,CDCl3。
表2化合物碳谱数据
Figure BDA0002443826850000102
Figure BDA0002443826850000111
注：a,b,c分别表示在150,125,100MHz下测定；d,e,f分别表示溶剂为CD3OD,DMSO-d6,CDCl3。*数据通过BC谱获得。
化合物的抗肿瘤活性实验
采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法检测化合物对人结肠癌细胞株HCT116细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/mL，以100μL/孔铺于96孔培养板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于CO2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μL 4℃冰箱预冷的质量百分数10％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μL SRB溶液，室温25℃放置20分钟，去上清液，用质量百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的SRB用100μL/孔10mmoL/L Tris碱液(pH＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1-(OD515给药孔/OD515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50。其结果如表3所示。
化合物的激酶抑制活性实验
本实验采用384孔板，测定所得化合物对PKCθ、ROCK2激酶的抑制活性，基于实时分辨荧光技术测定抑制作用。将待测化合物配制所需浓度，由激酶缓冲液稀释，激酶、STK底物生物素、ATP、终止标记物等按照试剂盒说明书配制相应浓度。酶反应阶段，加入4μL待测化合物，2μL激酶，2μLSTL底物生物素，2μLATP在室温或37℃下孵育30min，检测阶段，加入5μLSa-XL665和5μL STK Antibody-Eu(K)，以乙二胺四乙酸(EDTA)为终止液，常温下孵育1h后采用HRTF测定在λ＝665和620nm下的荧光强度，根据相应信号强度比值计算得出各样品浓度下的抑制率，再根据各浓度抑制率计算对各激酶的半数抑制浓度IC50(μM)。其结果如表3所示。
表3化合物的抗肿瘤及激酶抑制活性(IC50)
Figure BDA0002443826850000121
注：STA(星孢菌素)为阳性对照。HCT116/PC3细胞株初筛浓度为10μg/mL；
PKθ初筛浓度为2.5μg/mL；ROCK2初筛浓度为0.5μg/mL。
采用人结肠癌细胞株HCT116和前列腺癌细胞株PC3对本发明的化合物进行活性评价，结果显示化合物2～7、10、11能显著抑制癌细胞株HCT116的生长，其中化合物2活性最好，IC50为0.146μM；化合物2～8、10～12能显著抑制前列腺癌细胞株PC3的生长，其中化合物5效果较好，IC50为0.76μM。这说明该类化合物具有较强的肿瘤细胞毒活性，可用来进一步研发抗肿瘤相关药物。
采用蛋白激酶PKCθ和ROCK2测试该类化合物对蛋白激酶的抑制活性，结果显示化合物2、3、5、6、11具有较强的PKCθ抑制活性，尤以化合物2效果最佳，IC50为0.17μM；化合物2、3、10、11具有较强的ROCK2抑制活性，其中化合物2效果最佳，IC50为0.26μM。
化合物4、5为互为异构体，化合物6、7为互为异构体，两两对比可发现区别仅在于R1基团的结构取向差异，但是化合物4、5，以及化合物6、7对于人结肠癌细胞株HCT116和前列腺癌细胞株PC3的活性却有明显差异，说明R1基团仅仅构型发生改变就能显著影响抗肿瘤活性。另外，比较化合物5、7可知R1基团为氧甲基时比羟基具有更加优异的抗肿瘤活性，且当R1基团为氧甲基时，化合物5表现出比化合物7明显更加优异的对PKCθ抑制活性，这些均为本发明的首次发现。
因此，本发明提供的化合物可用于治疗与蛋白激酶、酪氨酸激酶等抑制有关的多种恶性肿瘤、HIV、白血病、阿尔兹海默症等相关疾病的药物，因而具有很好的应用前景。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种星孢菌素类衍生物，其特征在于，结构式如下所示：
Figure FDA0002774603420000011
2.根据权利要求1所述的星孢菌素类衍生物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；所述的放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomyces sp.CICC 11031；所述摇床培养的条件为：28℃，180rpm培养4～6天；
(2)将所得种子液接种于大米培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物粗提物；所述大米培养基由大米和海盐水配制而成，大米质量和海盐水的体积之比为40g：60mL；
所述种子液接种量为：每40g大米接种10mL种子液；
所述静置培养的条件为：28℃，静置培养70天；
(3)将所得发酵产物粗提物进行分离纯化，获得所述的星孢菌素类衍生物；所述的分离纯化方法包括：萃取、凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱以及高效制备液相色谱；
所述萃取条件：乙酸乙酯溶剂浸泡3天；
所述凝胶柱色谱条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶，采用的洗脱剂为甲醇-水溶液，按照甲醇体积百分数为20％、40％、60％、80％、100％的比例洗脱；
所述中压制备色谱条件：填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积百分数40％～100％的甲醇+0.05％TFA-水溶液梯度洗脱；
所述硅胶柱色谱条件：采用300～400目的精制硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇溶液，洗脱体系为二氯甲烷:甲醇＝100:1，80:1，60:1，40:1，20:1，10:1，1:0；
所述高效制备液相色谱条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相是40％～100％的甲醇-水溶液以及40％～60％的乙腈-水溶液。
3.根据权利要求1所述的星孢菌素类衍生物在制备治疗结肠癌、前列腺癌的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的星孢菌素类衍生物在制备蛋白激酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述蛋白激酶为PKCθ和ROCK2。
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