CN107556323A

CN107556323A - 一种氨基取代星孢菌素类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107556323A
Application number: CN201710765141.6A
Authority: CN
Inventors: 马忠俊; 周彪; 丁婉婧
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107556323B

Abstract

本发明公开了一种氨基取代星孢菌素类化合物及其制备方法和应用。所述氨基取代星孢菌素类化合物，其特征在于，命名为12‑N‑甲基‑k252c，结构式如式I：本发明化合物为从一种放线菌中分离纯化得到，经鉴定为一种氨基取代氨基取代星孢菌素类化合物，命名为12‑N‑甲基‑k252c，经实验检测发现该化合物对前列腺癌细胞具有较高的活性，同时还对Brd4蛋白具有较高的抑制作用，本发明化合物在制备治疗肿瘤、HIV、白血病等疾病的药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种氨基取代星孢菌素类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种氨基取代星孢菌素类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是危害人类生命健康的重大疾病之一，具有病程长死亡率高的特点。前列腺癌是一种常见于男性泌尿生殖系统的恶性肿瘤，其发病率在西方欧美国家居所有男性肿瘤之首，死亡率仅次于肺癌，居第二位。与西方国家相比，我国前列腺癌的发病率明显偏低，但近年来由于受各种因素的影响而呈显著增长态势。世界卫生组织报告，2012年全球癌症患者和死亡病例都在持续地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。因此，癌症的预防和治疗至关重要。

星孢菌素(STA)最早是从土壤放线菌中分离得到的吲哚咔唑类化合物，之后陆续从多种海洋放线菌和无脊椎动物中发现。研究表明蛋白激酶C(PKC)是介导肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成的信号通路中发挥至关重要的作用，PKC已经成为抗肿瘤治疗的一个靶点。STA为强PKC抑制剂(IC₅₀＝2.7nM)，主要作用于细胞信号转导通路中各种激酶、拓扑异构酶以及细胞周期调控因子，但随后证明为广谱的激酶抑制剂，选择性差，因而无法成药。而多个星孢菌素的衍生物目前正作为抗肿瘤药物处于临床研究。天然来源的星孢菌素衍生物UCN-01目前处于治疗乳腺癌和淋巴癌的II期临床研究。结构修饰得到的星孢菌素衍生物PKC-412处于急性髓性白血病的临床Ⅲ期，非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴白血病的临床Ⅱ期；口服lestaurtinib已经于2006年由FDA批准作为治疗急性髓细胞白血病的孤儿药；CEP-2563已经完成了治疗实体瘤的Ⅰ期临床研究；Enzastaurin正处于治疗淋巴瘤的Ⅲ期临床研究。上述实例表明，星孢菌素类化合物具有广阔的成药前景。

BRD4蛋白隶属于溴结构域蛋白家族中的BET亚家族，全长共1362个氨基酸残基，其氮端的第一个溴结构域，即BRD4(44-168)。它能识别结合乙酰化修饰的赖氨酸，并因此特异性地调控DNA甲基化、染色质重建和翻译相关的核小体的转录后修饰，从而进一步调控基因表达。BRD4是一个十分有潜力的药物靶标，大量文章报道显示BRD4是肿瘤、HIV和白血病等疾病治疗的很有前景的靶点。

发明内容

本发明通过对放线菌进行研究提供了一种氨基取代星孢菌素类化合物及其制备方法和应用。

一种氨基取代星孢菌素类化合物，命名为12-N-甲基-k252c，结构式如式I：

本发明又提供了所述的氨基取代星孢菌素类化合物在制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物中的应用。所述的癌症为黑色素瘤、急性髓系白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤等。优选的，所述癌症为前列腺癌。所述炎症为关节炎、皮肤炎等。

本发明又提供了所述的氨基取代星孢菌素类化合物在制备Brd4蛋白抑制剂中的应用。BRD4是肿瘤、HIV、炎症等疾病治疗的很有前景的靶点。

本发明还提供了所述的氨基取代星孢菌素类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)发酵培养放线菌获得发酵产物；

(2)发酵产物过滤去除菌丝体获得粗提物；

(3)粗提物分离纯化获得所述氨基取代星孢菌素类化合物，

其中，所述放线菌为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏号为CICC No.172617。

所述的制备方法，发酵使用培养基为大米培养基，所述大米培养基按以下组分制成：大米∶25％的海盐水＝1g∶1～2mL。

步骤(3)中分离纯化的方法包括以下步骤：

(a)粗提物用乙酸乙酯萃取；

(b)萃取液浓缩后，使用凝胶柱层析纯化，并用甲醇-水体系洗脱；

(c)将包含目的化合物的洗脱产物合并后，使用反相高效液相色谱分离获得所述氨基取代星孢菌素类化合物。

步骤(a)中萃取方法为：用与粗提物等体积的乙酸乙酯萃取3次。

步骤(b)中洗脱方法为使用甲醇体积比为20％～100％的甲醇-水体系梯度洗脱。

步骤(c)中反相高效液相色谱分离使用的填料为十八烷基键合硅胶，流动相为40％-60％乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，洗脱时间60min，收集包含目的化合物的洗脱产物。

本发明化合物为从一种放线菌中分离纯化得到，经鉴定为一种氨基取代氨基取代星孢菌素类化合物，命名为12-N-甲基-k252c，经实验检测发现该化合物对前列腺癌细胞具有较高的活性，同时还对Brd4蛋白具有较高的抑制作用，本发明化合物在制备治疗肿瘤、HIV、白血病等疾病的药物方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明化合物的¹H-NMR图谱。

图2为本发明化合物的¹³C-NMR图谱。

图3为本发明化合物的HSQC图谱。

图4为本发明化合物的HMBC图谱。

图5为本发明化合物的¹H-¹H COSY图谱。

图6为本发明化合物的关键二维谱信号分析图。

具体实施方式

菌种来源

放线菌为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏号为CICC No.172617，购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，订购网址：http://www.china-cicc.org/。

培养基

高氏一号液体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，加水至1L，调pH 7.2。

高氏一号固体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，12g琼脂，加水至1L，调pH 7.2。

大米培养基：大米和海盐水按以下质量体积比：大米40g，25％的海盐水60mL，即大米∶25％的海盐水＝40g∶60mL。

实施例1

1、种子液

将上述链霉菌接种于含有250mL液体培养基的500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养4天，获得种子液。

2、发酵

以每瓶接种8mL的量将上述种子液接种到大米发酵培养基(由以下重量组分制成：大米40g，25％的海盐水60mL)中，28℃静置培养60天后终止发酵。

3、粗提

每瓶固体发酵物用EA(乙酸乙酯)约200mL浸泡过夜，三层纱布过滤除去菌丝体，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)。

4、分离纯化

将上述粗提物用等体积乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液浓缩。将所得乙酸乙酯部分采用LH-20凝胶柱分离，洗脱方法为使用甲醇体积比为20％～100％的甲醇-水体系梯度洗脱，使用薄层色谱(TLC)分析含有新化合物的馏分，合并。

所得馏分用反相高效液相色谱分离(Agilent Pursuit C-18(10μm，21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积比为40％～60％的乙腈-水体系以10mL/min等度洗脱，时间为60min，分离获得含有新化合物的馏分，旋转蒸发仪上回收溶剂，即得本发明化合物，外观为白色无定型粉末。

实施例2

本发明所得新化合物为白色无定型粉末，高分辨质谱在HRESIMS m/z 341.1381给出[M+H]⁺峰，提示分子量为340，结合¹H-NMR、¹³C-NMR和HSQC谱数据(图1、2和3)推测分子式为C₂₁H₁₆N₄O，不饱和度为16。在¹H-NMR的低场区显示有8个芳香质子信号δ_H 9.26(1H，d，J＝8.0Hz)，8.05(1H，d，J＝7.8Hz)，7.82(1H，d，J＝7.8Hz)，7.80(1H，d，J＝7.8Hz)，7.55(1H，brt)，7.42(1H，br t)，7.34(1H，br t)，7.22(1H，br t)；三个活泼氢信号δ_H 11.54(1H，s)，8.47(1H，s)，7.10(1H，q，J＝5.5Hz)；高场中有一个亚甲基信号4.95(2H，s)和一个甲基信号δ_H 2.95(3H，d，J＝5.5Hz)，与报道的K252c对比发现，该化合物多了一个甲基和一个活泼氢信号。进一步分析¹H-¹H COSY和HMBC谱(图4和5)发现，活泼氢信号δ_H 7.10与甲基信号δ_H2.95相关，δ_H 7.10与C-11a和C-12a相关，说明12位上的氢被N-甲基取代。综上所述本发明所得新化合物为一种氨基取代星孢菌素类化合物，命名为12-N-甲基-k252c(图6)。

实施例3

人前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖抑制实验。

取对数生长期的细胞，配置成5×10⁴个/mL，以100μL/孔铺于96孔培养板，CO₂培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于CO₂培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μL4℃冰箱预冷的10％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μl SRB溶液，室温放置20分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的SRB用100μL/孔10mmol/L Tris碱液(pH＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(OD_515给药孔/OD_515对照孔)]×100％。

结果本发明化合物在10μg/mL时，对PC3的抑制率为53％。

实施例4

采用BRD4bromodomain 1TR-FRET assay kit(Cisbio)，以(+)-JQ1位阳性药测定所得化合物对BRD4蛋白的抑制活性。TR-FRET值通过测定BRD4蛋白在经340nm紫外光激发后620nm和665nm的荧光比值获得，即TR-FRET值T＝[F665nm/F620nm]×10⁴。BRD4蛋白％抑制率＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的TR-FRET值，Tmin为没有BRD4蛋白的空白反应液TR-FRET值。本发明化合物在浓度为10μg/mL对Brd4蛋白的抑制率为36％。

Claims

1.一种氨基取代星孢菌素类化合物，其特征在于，命名为12-N-甲基-k252c，结构式如式I：

2.如权利要求1所述的氨基取代星孢菌素类化合物在制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为前列腺癌。

4.如权利要求1所述的氨基取代星孢菌素类化合物在制备Brd4蛋白抑制剂中的应用。

5.如权利要求1所述的氨基取代星孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵培养放线菌获得发酵产物；

(2)发酵产物过滤去除菌丝体获得粗提物；

(3)粗提物分离纯化获得所述氨基取代星孢菌素类化合物，

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵使用培养基为大米培养基，所述大米培养基按以下组分制成：大米∶25％的海盐水＝1g∶1～2mL。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中分离纯化的方法包括以下步骤：

(a)粗提物用乙酸乙酯萃取；

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中萃取方法为：用与粗提物等体积的乙酸乙酯萃取3次。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中洗脱方法为使用甲醇体积比为20％～100％的甲醇-水体系梯度洗脱。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中反相高效液相色谱分离使用的填料为十八烷基键合硅胶，流动相为40％-60％乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，洗脱时间60min，收集包含目的化合物的洗脱产物。