CN112409347B - 吴茱萸乙二胺a及其制备方法和抗肿瘤用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，提供了一种具有治疗肿瘤疾病的生物碱类新化合物——吴茱萸乙二胺A（3‑(2‑(4‑methoxy‑2‑oxo‑1,4‑dihydro‑2H‑benzo[d][1,3]oxazin‑4‑yl)ethyl)‑1‑methylquinazoline‑2,4(1H,3H)‑dione）的制备方法和在医药领域中的治疗癌症的用途，可用于医药领域。

Description

吴茱萸乙二胺A及其制备方法和抗肿瘤用途

一、技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从吴茱萸中提取分离得到的一种具有治疗肿瘤疾病的酰胺生物碱类新化合物吴茱萸乙二胺A(3-(2-(4-methoxy-2-oxo-1,4-dihydro-2H-benzo[d][1,3]oxazin-4-yl)ethyl)-1-methylquinazoline-2,4(1H,3H)-dione)的制备方法和在医药领域中的治疗癌症的用途。

二、技术背景：

天然酰胺类生物碱非常稀少，主要存在于芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Evodia)植物中。吴茱萸属全世界约有150种，分布在亚洲、非洲东部和大洋洲。我国有20种5变种，除东北北部及西北部少数省区外，各地都有分布。吴茱萸是古老的传统中药，嫩果用盐水漂洗或以醋炒，干后人药，或用蜜炙甘草炮制。晋、唐以下各家本草如《神农本草》、《新修本草》、《大观本草》、《证类本草》、《政和本草》以至《齐民要术》等均有载录。其药效与用治经李时珍保留并发扬了陶弘景《名医别录》中的叙述，在他的《本草纲目》中有详叙。常用中药吴茱萸历版《中国药典》都收录，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻、疏肝解郁、行气止痛之功效，颇受人们的关注。

近代药理研究发现吴茱萸对心血管系统、中枢神经系统、消化系统等有作用，可治疗心绞痛、头痛、腹痛、产后出血等症状，此外还具有抗菌和抗肿瘤活性的作用。

三、发明内容：

本发明提供一种具有显著抑制肿瘤作用的酰胺生物碱类新化合物——吴茱萸乙二胺A(3-(2-(4-methoxy-2-oxo-1,4-dihydro-2H-benzo[d][1,3]oxazin-4-yl)ethyl)-1-methylquinazoline-2,4(1H,3H)-dione)的制备方法和在医药领域中的治疗癌症的用途

本发明公开了该化合物的结构式如下：

分子式为：C₂₀H₁₉N₃O₅，不饱和度为13，分子量：381。

命名为：吴茱萸乙二胺A。

本发明中上述化合物的制备方法如下：

其特征在于以芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Evodia)植物吴茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth)、石虎(Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth var.officinalis(Dode)Huang)及疏毛吴茱萸(Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth var.bodinieri(Dode)Huang)为原料，首先应用HPLC技术分别进行了主要成分的含量测定及组分的确定，其次经反复通过硅胶或球形硅胶、Sephadex LH-20(Sep.)凝胶柱层析、反相材料ODS中的一种或几种柱层析和重结晶等手段分离纯化得到该化合物。通过MTT法活性试验，显示一定的抗癌作用。

本发明的新化合物及其衍生物与医学上可接受的药用辅料组成药物制剂用于治疗肿瘤。

四、附图说明：

图1、化合物的化学结构

图2、化合物的¹H-NMR谱 图3、化合物的¹³C-NMR谱

图4、化合物的¹H-¹H COSY的谱 图5、化合物的HSQC谱

图6、化合物的HMBC谱 图7、化合物的ESI-MS谱

五、具体实施方式：

结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1.从吴茱萸中分离和鉴定该新化合物

以吴茱萸(Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth)中的喹唑啉类生物碱为研究对象，并运用制备液相色谱技术及液质联用技术喹唑啉生物碱进行纯化制备和结构表征。吴茱萸4Kg，先取出200g用挥发油提取器提取吴茱萸挥发油约2ml，备用做GC-MS。药渣与剩下生吴茱萸合并用80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压浓缩得稠浸膏约800g，加水溶解至混悬液，依次用石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别浓缩成浸膏得石油醚部位14g、氯仿部位209g、乙酸乙酯部位26g、正丁醇部位210g、水部位316g。氯仿部位反复通过硅胶常压(LC)、低压(LPLC)和中压柱层析(MPLC)、Sephadex LH-20(Sep.)凝胶柱层析、反相材料ODS柱层析和重结晶等手段分离纯化化合物Ⅰ(9.0mg)。

该化合物结构经核磁共振谱鉴定如下：

吴茱萸乙二胺A为无色针晶，UV254 nm紫外灯下有暗斑，UV365 nm紫外灯下无荧光。改良碘化铋钾试剂不显色，喷5％香草醛浓硫酸溶液加热后显黄色。

ESI-MS显示该化合物的准分子离子峰为m/z 380.1246[M-H]^-(calcd forC₂₀H₁₈N₃O₅,380.1252)，推断化合物的分子式为C₂₀H₁₉N₃O₅，不饱和度为13。

吴茱萸乙二胺A的¹H NMR谱显示了19个氢信号，分别为8个芳氢信号、1个氮氢质子信号、1个氮甲基质子信号、1个甲氧基质子信号和-CH₂-CH₂-片段。结合¹H-¹H COSY发现这8个芳氢分别为2个邻位二取代苯环上的氢。¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)和¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)数据见表1。H-5(δ_H 7.98)与C-4(160.8)和C-9(140.2),H-8(δ_H 7.38)与C-4(160.8)和C-10(114.6)及H-23(δ_H 3.44)与C-2(150.0)和C-9(140.2)有HMBC远程相关，证明吴茱萸乙二胺A具有甲基喹唑啉二酮结构，与其二级质谱数据相互佐证。根据已推测的分子式、甲基喹唑啉二酮片段、-CH₂-CH₂-片段及甲氧基片段，可以推测吴茱萸乙二胺A还具有一个苯并噁嗪酮片段。通过H-16(δ_H 10.42)与C-15(149.0)、C-17(114.0)、C-21(117.1)和C-22(136.3),H-19(δ_H 6.97)与C-21(117.1),H-18(δ_H 7.24)与C-22(136.3),H-24(δ_H3.07)与C-13(105.9)的HMBC远程相关证明了吴茱萸乙二胺A的甲氧基苯并噁嗪片段。接下来H-11(δ_H 4.02)与C-2(150.0)、C-4(160.8)和C-13(105.9)、H-12(δ_H 2.33)与C-13(105.9)和C-21(117.1)的BC远程相关揭示了甲氧基苯并噁嗪片段、甲基喹唑啉二酮片段和-CH₂-CH₂-片段这三者的连接关系。至此，该化合物的结构已确定，是新化合物，命名为吴茱萸乙二胺A。

表1吴茱萸乙二胺A的¹H NMR、¹³C NMR数据

为了进一步确证吴茱萸乙二胺A的结构，对其进行单晶X-射线衍射，其晶体结构如下所示，与核磁波谱解析的结构一致。

吴茱萸乙二胺A的晶体结构：C₂₀H₁₉N₃O₅,M_r＝381.38,orthorhombic,space groupPbca,

Z＝8,D_calcd＝1.378g·cm^-3,and crystal dimensions of 0.20×0.10×0.10mm were used formeasurements.Final indices:R₁＝0.1187andωR₂＝0.2038for observed reflectionsand R₁＝0.2361andωR₂＝0.2445for all reflections.CCDC 1537876

实施例2.从石虎中鉴定该新化合物

取石虎100g用索氏法80％乙醇回流提取6h，减压浓缩滤液得总浸膏，总浸膏硅胶柱层析先以石油醚(60～90℃)洗脱大部分油脂，再依次用乙酸乙酯、甲醇洗脱得到乙酸乙酯部位浸膏、甲醇部位浸膏。浸膏分别经SPE柱100％甲醇洗脱得到不同部位的供试液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样，经UPLC-Q-TOF-MSⁿ检测到该新化合物。

实施例3.从波氏吴萸中鉴定该新化合物

同实施例2的方法，称取波氏吴萸100g用索氏法80％乙醇回流提取6h，减压浓缩滤液得总浸膏，总浸膏硅胶柱层析先以石油醚(60～90℃)洗脱大部分油脂，再依次用乙酸乙酯、甲醇洗脱得到乙酸乙酯部位浸膏、甲醇部位浸膏。浸膏分别经SPE柱100％甲醇洗脱得到不同部位的供试液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样，经UPLC-Q-TOF-MSⁿ检测到该新化合物。

实施例4.吴茱萸乙二胺A的体外抗癌活性筛选

药物筛选是整个抗肿瘤药物研究过程中一个非常重要的环节。利用实验动物移植瘤寻找具有抗肿瘤作用的化合物曾是抗肿瘤药物研究的主要方法。随着组织培养方法的发展和普及，利用体外培养的癌细胞寻找新抗肿瘤药物的研究已逐渐成为最重要的初筛手段。

美国国立肿瘤研究所(NCI)自80年代起致力于寻找一种针对某种肿瘤病(disease-oriented)而不是以肿瘤总体为对象(tumororiented)的筛选方法。该法以60种人体癌细胞系作为筛选模型，组成一个“板块”(panel)。此板块按肿瘤病种类再分成白血病，黑色素瘤，肺癌，结肠癌，肾癌，卵巢癌及中枢神经系统癌7个亚板块(subpanel)，每个亚板块由6～13种肿瘤细胞系组成。筛选时采用96孔平板作微培养，用MTT，SRB等方法观察细胞的杀伤或生长抑制。如果某种受试药物的细胞毒作用具有亚板块特异性，则有可能发现具有选择性的抗肿瘤药物。

为了实施规模性筛选，美国NCI采用了半自动的快速比色测定方法。并将最初的利用MTT还原反应测定活细胞数目的方法，换以更易操作的磺酰罗丹明B(SRB)蛋白质染色法。本试验所用的显色剂为四唑盐，是一种能接受氢原子的染料，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称为MTT，是一种淡黄色物质。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(NADP)能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞、红细胞、培养液无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶标仪在570nm波长处测定其OD值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数呈直线相关。此法与集落形成法、生长曲线法等测定结果有良好相关性。通过MTT法初步筛选可获知具有影响肿瘤细胞增殖的活性化合物。

1实验方法

1.1操作步骤

接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度稀释至4×10⁴个/ml。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔。

培养：将培养板转入恒温CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

加药：将受试药物作6个稀释度，浓度依次为50、60、70、80、90、100μl/ml。96孔板换液，对于悬浮生长的细胞，需离心(4℃，500～1000rpm，5min)。加入受试药物，20μl/孔，每个浓度加三个孔，再培养48小时。

染色：将MTT加入96孔板中，20μl/孔，置于培养箱中反应4小时。小心吸弃孔内上清液，晾干，加入DMSO，150μl/孔，悬浮细胞必须经离心(4℃，2500～3000rpm，20min)吸出上清再加DMSO。置平板摇床上振摇10分钟。

比色：用酶标仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。

1.2注意事项

细胞悬液需充分混匀，以避免各孔之间细胞分布不均；加细胞的过程应控制在4小时以内，避免细胞活性受损。

各板需单独设定空白对照及阴性对照。

MTT配制及保存过程中均需避光，且在两周内使用有效。

悬浮细胞用MTT法时必须经离心后才能吸出上清再加DMSO。

1.3数据处理

细胞抑制率的计算：

2实验结果见表2

表2药物对体外培养肿瘤细胞的影响

3阳性药的肿瘤抑制率：

实验所选阳性药为长春新碱和5-FU，抑瘤率分别为87.9％和67.9％，IC₅₀(μg/ml)分别为：11.35，35.44。

Claims (4)

1.一种酰胺生物碱类化合物，其特征在于该化合物化学名为吴茱萸乙二胺A，化学结构式为：

2.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于以中药吴茱萸4Kg为原料，先取出一小部分用挥发油提取器提取吴茱萸挥发油2ml，备用做GC-MS，药渣与剩下生吴茱萸合并用80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压浓缩得稠浸膏800g，加水溶解至混悬液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别浓缩成浸膏得石油醚部位14g、氯仿部位209g、乙酸乙酯部位26g、正丁醇部位210g、水部位316g，氯仿部位反复通过硅胶常压、低压和中压柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相柱层析和重结晶手段分离纯化得到权利要求1所述的化合物9.0mg。

3.权利要求1所述的化合物与医学上可接受的药用辅料组成药物制剂。

4.权利要求1所述的化合物在制备治疗肿瘤疾病药物方面的用途。

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