CN113880226A - 一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种消减水体中耐药基因mcr‑1的方法及其应用，该方法包括以下步骤：将高铁酸钾加入至水体中，在40‑60℃的条件下反应5‑30min即可；水体中耐药基因mcr‑1的绝对丰度与高铁酸钾的比例为(5×10⁶‑7×10⁶)copies/mL：2.126mg；水体的pH控制为5‑9。本发明提供的方法能够有效的对养殖废水等水体中的mcr‑1基因进行消减，有利于减少mcr‑1基因在环境中的污染和扩散，保障多粘菌素类药物治疗革兰氏阴性耐药菌感染的“最后一道防线”地位，从而保护人类的健康与安全。

Description

一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法及其应用

技术领域

本发明属于水体治理领域，具体涉及一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法及其应用。

背景技术

多粘菌素类药物已成为人类医学临床的救命药，其耐药性问题也在国际上受到了非常广泛的关注。2015年首次在动物源大肠埃希菌中发现了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1(Mobile colistin resistance)；质粒能够自我复制和在细菌间转移，引起mcr-1基因的快速传播，这将使多粘菌素类药物耐药性迅速发展，威胁该类药物作为“最后一道防线”的有效性。

研究表明，mcr-1基因已经存在于我们生存的环境中。当mcr-1基因通过环境传播转移到人类其他病原菌中，如肺炎克雷伯菌等，将导致新一轮多重耐药病原菌的爆发性流行，给临床治疗带来沉重的打击。因此，相比其他抗生素耐药基因，mcr-1在环境中的出现和传播将给人类造成更为严重的威胁。因此，开发一种安全、有效的方法消减mcr-1基因对于保障人类安全具有非常重要的意义。但目前关于环境中mcr-1基因的消减尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法，该方法能够用于猪场废水处理中，具体采用以下的技术方案：

一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法，包括以下步骤：将高铁酸钾加入至所述水体中，在40-60℃的条件下反应5-30min即可；所述水体中耐药基因mcr-1的绝对丰度与所述高铁酸钾的比例为(5×10⁶-7×10⁶)copies/mL：2.126mg；所述水体的pH控制为5-9。其中，所述水体包括养殖废水。

在一些优选的实施情况中，温度条件为60℃；反应的时间为5min；所述水体的pH控制为9。

在反应时间到达后，加入硫代硫酸钠终止反应。

本发明的有益效果为：本发明提供的方法能够有效的对养殖废水等水体中的mcr-1基因进行消减，有利于减少mcr-1基因在环境中的污染和扩散，保障多粘菌素类药物治疗革兰氏阴性耐药菌感染的“最后一道防线”地位，从而保护人类的健康与安全。

附图说明

图1所示为DNA提取后的PCR扩增产物的琼脂凝胶电泳图；

图2所示为LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基上的菌落图；

图3所示为阳性质粒PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图4所示为阳性克隆菌测序对比结果图；

图5所示为mcr-1标准质粒10倍稀释的扩增曲线和溶解曲线；

图6所示为mcr-1绝对定量标准曲线；

图7所示为高铁酸钾处理后各样品中DNA浓度图；

图8所示为高铁酸钾处理后各样品中mcr-1基因的绝对丰度图；

图9所示为正交试验中各因素和水平下高铁酸钾处理对mcr-1影响的效应曲线。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。

实施例1：

一、DNA提取

采用土壤DNA提取试剂盒对样品DNA进行提取，具体操作如下：

(1)称取适量细菌(从mcr-1基因阳性猪场废水样品中分离得到)沉淀到一个PowerBead Tubes中，准确记录质量，轻轻涡旋混匀；

(2)检测Solution C1，若出现沉淀，60℃水浴至全溶解；

(3)加入60μL Solution C1，上下颠倒数次混匀；

(4)把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5～10min)涡旋连续振荡10min；

(5)室温10000g离心30s，转移上清至一个干净的2mL Collection Tube(试剂盒提供)中；

(6)加入250μL SolutionC2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min；

(7)室温10000g离心1min，避开沉淀小珠，转移上清≤600μL到一个新的收集管(2mL Collection Tube)中；

(8)加入200μL SolutionC3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min；

(9)室温10000g离心1min，避开沉淀小珠，转移上清≤600μL到一个新的收集管(2ml Collection Tube)中；

(10)soiution C4使用前先摇匀，加入1200μL solution C4到上清中，涡旋混匀5s；

(11)加载约675μL上清到spin filter中，室温10000g离心1min；弃去滤液，继续加载675μL上清，室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清(每个样品共需要加载3次)；

(12)加500μL solution C5到spin filter中，室温10000g离心30s，弃上清；

(13)室温10000g离心1min，小心转移spin filter到2mL collection tube中，尽量避免solutiong C5污染；

(14)加入100μL solution C6到白色滤膜中心，室温10000g离心30s，弃去spinfilter，此时收集管中的DNA可以直接用于下游实验，无需进一步纯化；DNA冷冻保存(-20℃-80℃)。

二、mcr-1基因的聚合酶链式反应(PCR)体系及条件

根据文献中报道的mcr-1基因序列，设计引物，将提取的DNA进行PCR反应，验证样品中是否有mcr-1基因。引物为mcr-1-F(5’-CGG TCA GTC CGT TTG TTC-3’)和mcr-1-R(5’-CTT GGT CGG TCT GTA GGG-3’)，PCR扩增体系为25μL：DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×PCR mix 12.5μL，灭菌双蒸水加10.5μL，使反应总体积为25μL，PCR产物片段大小为309bp，引物由擎科生物科技有限公司合成。PCR循环条件如表1所示。

表1

三、琼脂糖凝胶电泳

(1)根据所需要的孔数选择合适的梳子，并配制好5×TBE用以保存，实验时将5×TBE用蒸馏水稀释成0.5×用以充当电泳缓冲液和制备琼脂糖凝胶；

(2)配制1.5％的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖凝胶置于锥形瓶中，加入相应0.5×TBE溶解后，将锥形瓶放入微波炉中加热，每次加热至沸腾几秒后拿出摇匀几秒，反复三次沸腾后即可。摇匀后匀速倒入制胶板内，待冷却后垂直拔出梳子；

(3)将制好的胶跟琼脂板一起轻轻勾在电泳槽的边缘，电泳液要保证完全淹没胶，并且每次电泳之前要加电泳液，电泳液使用几次以后要完全更换；

(4)点样：将样品和marker各6μL打入点样孔内；

(5)接通电源，开始电泳。待样品条带电泳至琼脂板的倒数第二条红线时，停止电泳，在紫外仪下用透射光源观察样品条带情况；

(6)阳性样品采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)(DP219)(天根生化科技(北京)有限公司)进行胶回收。

四、标准质粒及标准曲线的制备

使用pMD19-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)进行mcr-1阳性样品的DNA片段的克隆。将克隆产物进行PCR反应，并且通过测序确证质粒是否含有mcr-1基因。最后使用质粒DNA小提试剂盒(PM0201-200，擎科生物科技有限公司)抽提纯化阳性质粒，并进行精确定量，以此作为qPCR反应的标准质粒，用于构建标准曲线。具体步骤参考试剂盒说明书。

(1)目的基因的连接、转化与克隆

使用的感受态细胞是大肠杆菌DH5а(北京全式金生物技术有限公司)。目的基因的连接、转化与克隆请参照pMD 19-T(宝生物工程(大连)有限公司)载体试剂盒说明书。

1)在PCR管中加入1μL T-Vector Pmd19(simple)，1μL PCR产物，3μL灭菌双蒸水；

2)向以上反应落液加入5μL等体积的DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(CodeNo.6023)充分混匀；

3)4℃过夜；

4)从-80℃冰箱中取出E.coli感受态细胞，迅速插入冰盒内，使其溶解；

5)全量(10μL)加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰中放置30分钟，同时设定水浴锅温度为42℃；

6)42℃水浴锅热激45秒，迅速放回冰中放置2分钟左右，注意不要晃动；添加700μLSOC液体培养基，混合均匀；

7)37℃振荡培养1小时(160rpm)，吸取适量体积均匀涂布到LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基平板中；

8)37℃正置至液体被完全吸收，然后倒置过夜培养。

所有步骤均在无菌条件下操作。

(2)PCR鉴定

用无菌枪头挑取白色单菌落于20μL无菌水中，混匀后取1μL作为PCR反应的模板按已定方法跑PCR，引物为mcr-1上下游引物；

(3)测序验证

PCR鉴定结果阳性的菌落，将含菌的水转接到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养10～16h；采用质粒DNA小提试剂盒(PM0201-200，擎科生物科技有限公司)抽提纯化阳性质粒，具体步骤参考试剂盒说明书。

(4)标准质粒定量

1)提取的质粒用微量核算蛋白质分析仪检测含量和纯度；将OD₂₆₀与质粒大小代入以下公式计算每升标准品中基因的拷贝数，拷贝数(copies/μL)＝DNA质量(ng/μL)/DNA分子量(g/mol)×6.02×10²³(/mol)×10^-9。

2)建立标准曲线：将已知浓度的标准质粒按10倍稀释梯度稀释成合适的浓度，确保荧光定量时样品DNA的阈值落在梯度稀释的标准质粒的阈值范围内。将梯度浓度样品上机进行qPCR检测，每个样品做3个复孔。

五、实时荧光定量PCR条件

对提取的DNA样品进行适量稀释后作为qPCR的DNA模板，以2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)(擎科生物科技有限公司)进行扩增，扩增体系各组分如表2所示：

表2

以上扩增体系按表3中扩增程序扩增并之后熔解解链：

表3

反应结果使用qPCR带的软件和Excel进行收集、分析，所有的样品做3个复孔，数值以

表示。

结果：

(1)PCR扩增mcr-1基因目的片段

将前期研究中发现的mcr-1基因阳性猪场废水样品进行DNA提取后，作为DNA模板进行PCR扩增，以获得目的片段。产物的琼脂凝胶电泳图如图1所示，可见，在309bp处有阳性条带，可用于后续的TA克隆。由于电泳时使用的是DL500 DNA Marker，片段较小，加上使用的默认电压稍大，使得Marker的各个条带未完全分开，但不影响本实验的鉴定结果和下一步实验。

(2)蓝白斑筛选结果

经Amp/X-Gal/IPTG进行蓝白斑筛选，有重组质粒的细菌形成白色菌落，无重组质粒的细菌形成蓝色菌落，结果如图2所示。可见，LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基上有白色菌落形成，说明有重组质粒的细菌；可挑取白色菌落鉴定后用于标准质粒的制备。

(3)阳性质粒PCR鉴定结果

取8个白色菌落作DNA模板，进行PCR扩增反应后，凝胶电泳结果如图3所示，结果表明除1个菌落(样品4)外，挑取的7个菌落均携带目的基因片段(309bp)，说明克隆成功，这些菌落可进行进一步增殖培养，以供提取阳性质粒。

(4)阳性克隆菌质粒的测序验证结果

PCR鉴定结果阳性的菌落，将含菌的水转接到含氨苄青霉素的LB液体培养基中进行增殖培养，按已定方法提取质粒后进行测序，并与NCBI数据库进行比对，结果如图4所示。可见，mcr-1基因已成功克隆至阳性菌的质粒中，标准品构建成功。

(5)标准质粒的定量

超微量核酸蛋白分析仪对提取的阳性质粒DNA含量和纯度检测结果如表4所示。根据其浓度计算拷贝数为6.45×10⁹copies/μL。

表4

(6)标准曲线

按建立的qPCR条件和引物对mcr-1标准质粒进行扩增，所得扩增曲线(图5A)和溶解曲线(图5B)如图5所示。可见，扩增曲线为S型，有明显的四个时期，且复孔的CT值较为一致；所有样品在85℃附近均只有一个单峰，无非特异性条带出现，表明引物的特异性强，所用qPCR方法可靠。

梯度浓度的标准质粒经qPCR扩增后，绘制所得的标准曲线(图6)相关系数良好，引物的扩增效率为97.37％，可以保证定量结果的可靠性。

实施例2：

称量实施例1制得的mcr-1阳性质粒样品离心富集所得的细菌沉淀适量，加入不同pH水中，旋涡1min混匀，制得200mg/mL细菌悬液，于菌悬液中分别加入100μL不同浓度的高铁酸钾溶液(不加作为对照)，计时，转速500rpm，不同温度下进行降解反应，不同时间加入1mL 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液，旋涡混匀，终止反应。反应完后立即离心(12000rpm，10min，4℃)，弃去上清，按实施例1中的方法对样品DNA进行提取，作适量稀释后，按实施例1记载的条件进行qPCR检测。按照表5中记载的条件分别进行，其具体方案如表6所示。

表5

表6

(1)DNA浓度

样品及对照经DNA提取后，测得单位质量样品中DNA浓度如图7所示。可见，与对照相比，按A3、A5～A9方案对mcr-1阳性样品进行处理后，DNA浓度明显下降。A4与对照相当，A1略有上升。说明在适当条件下，高铁酸钾可有效降解细菌DNA，但在某些组合条件下，则会促进细菌DNA的复制。

(2)mcr-1基因绝对丰度

根据每个样品称取的质量，稀释的倍数等，计算出每个样品中单位质量的绝对拷贝数如图8所示。可见，相比未处理样品，A7～A9的处理条件可有效消减mcr-1基因，消减率在50％左右。但值得注意的是，一些处理组的样品中mcr-1基因不但没有消减反而升高，如A2～A6，其中以A4为甚。高铁酸钾作为一种消减抗生素的新兴试剂，在降解多种抗生素如氟喹诺酮类、硫酸黏菌素等方面展现出了优越的性能，不仅降解效率高(降解率>90％)，且绿色环保，降解产物一般均无抗菌活性残留，对水体生物也安全无毒。但我们的研究结果表明，这些常用的有效方法在某些组合下会促进mcr-1基因的增殖。因为在不利条件下，细菌为了保护自己，会加速突变，从而使耐药基因表达量显著增加。因此，在使用这些方法降解抗生素和抗生素耐药基因时应考虑到这点，否则不仅无法达到消减的目的，反而会适得其反。

(3)DNA浓度与mcr-1基因绝对丰度的相关性

采用Excel计算各样品中DNA浓度与mcr-1基因绝对丰度之间的相关系数r，以评价二者的线性相关程度。当相关系数r的绝对值越接近于1，相关性越强，反之，越接近于0，相关性越弱。当|r|≥0.8时，认为二者高度相关；0.5≤|r|<0.8时，认为中度相关；0.3≤|r|<0.5时，视为低度相关；|r|<0.3时，说明二者相关程度极弱，可视为不相关。结果表明，对于高铁酸钾处理的阳性样品，二者的相关系数r为0.40，说明mcr-1基因绝对丰度与DNA浓度具有一定正相关性，说明高铁酸钾可通过改变DNA浓度来影响mcr-1基因含量。

(4)正交试验结果表明(表7和图9)，高铁酸钾处理mcr-1阳性样品时，采用21.26mg/mL高铁酸钾铁(以Fe计为6mg/mL)，在pH为5，温度为60℃的条件下反应15min，对阳性水样中的mcr-1基因消减率可达55％。极差分析表明，4个试验因素的最佳水平组合为A₃B₃C₁D₃。即在pH为9时，采用6mg/mL高铁酸钾铁(以Fe计)，在60℃条件下反应5min对mcr-1的消减效果最佳。

表7

总的来说，高铁酸钾可对猪场废水样品中DNA浓度和mcr-1基因的丰度产生明显的影响。在某些组合的处理条件下，会促进mcr-1基因的生成，在实际中应避免同时满足这些条件，以免造成mcr-1基因的进一步污染和扩散。而特定的处理条件能够显著地降低mcr-1基因的形成，可能是通过影响DNA浓度，进而影响到耐药菌中mcr-1基因的丰度。研究结果为消减猪场废水样品中mcr-1基因，从而减少其在环境中的扩散传播提供了有效方法和数据支撑。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (7)

1.一种消减水体中耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，包括以下步骤：将高铁酸钾加入至所述水体中，在40-60℃的条件下反应5-30min即可；所述水体中耐药基因mcr-1的绝对丰度与所述高铁酸钾的比例为(5×10⁶-7×10⁶)copies/mL：2.126mg；所述水体的pH控制为5-9。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水体包括养殖废水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，温度条件为60℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应的时间为5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水体的pH控制为9。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间到达后，加入硫代硫酸钠终止反应。

7.权利要求1所述的方法在猪场废水处理中的应用。

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