CN113876952B - 氮源用于抑制细菌三型分泌系统的应用 - Google Patents

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Abstract

氮源用于抑制细菌三型分泌系统的应用。本发明涉及生物医药领域，具体涉及氮源在制备用于预防和/或治疗病原菌侵染的药物中的应用。

Description

氮源用于抑制细菌三型分泌系统的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及氮源在制备用于预防和/或治疗病原菌侵染的药物中的应用。
背景技术
细菌感染一直是人类健康的重大威胁，虽然上世纪抗生素的发现为该问题提供了一个解决方案。但是由于耐药细菌等原因，我们需要寻找新的有效抗菌/抗感染方法。
抗生素能够杀死或抑制细菌的生长，近几十年来，被广泛应用于临床抗感染第一线。然而近年来，抗生素滥用、超级抗药细菌等原因，使得抗生素的杀菌/抑菌效率一降再降，因此，新型抗菌药物的研发是当前医学微生物研究领域的一个热点。微生物(特别是细菌)在长期进化中形成了不同于多细胞生物的独特繁殖优势，易对抗生素等生存压力产生耐药性(Drug resistance，在面临生存压力时仍能生长)或耐受性(Tolerance，在面临生存压力时不能生长但也不死亡)，并使这种耐药或耐受能力在种群内(甚至不同物种间)进行传播。抗生素的不合理使用乃至滥用，加剧了致病菌耐药性的形成、并在世界范围内迅速蔓延，导致许多传染性疾病濒临无药可治的困境，给人类健康造成严重威胁。因此，如何抑制病原菌产生耐药，有效减少细菌感染，是生命医学领域面临的一个巨大挑战。抗生素在临床、农业及养殖业的大量使用乃至滥用，对药物敏感菌施加了生存选择压力，引起耐药菌群不断富集、倍增，最终导致耐药能力的产生和传播。
抗生素耐药的经典应对策略是不断研发新型抗生素或已有抗生素的新衍生物，以此治疗已对旧抗生素耐药的病原菌感染。该策略在过去半个世纪硕果累累，但目前已面临下述严峻挑战：(1)绝大多数抗生素靶点已经被研究和开发，发现有效的新型靶点已经非常困难，使得开拓全新抗生素举步维艰；(2)几乎所有已知抗生素母体化合物都已被变构优化，找到更高活性新衍生物的机会越来越小；(3)抗生素用药周期短，利润相对不高，而临床毒副作用审批要求严格，使得大多数国际知名制药厂商因商业利益解散了其抗生素研发团队，导致过去20多年罕有新抗生素投放市场；(4)过去十几年里，基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等“OMICS”技术曾带来很大希望，认为对细菌“OMICS”的深入理解会提供无数的抗生素新靶点，从而开发出多种新抗生素；不幸的是，该平台技术耗费了巨大的人力物力，目前却连一个新抗生素都没能开发上市。
此外，临床上使用抑菌类抗生素时，只能抑制细菌繁殖，而无法有效清除细菌；使用杀菌类抗生素时，病人体内革兰氏阴性菌被杀死裂解后，往往会导致内毒素及其他致病物质在短时间内大量释放，从而可能加重患者病情。因此，抗生素耐药问题很难通过不断研发新抗生素的方法解决，急需科学家探索和开发不依赖抗生素的新策略。
三型分泌系统(Type 3secretion system，T3SS)广泛存在于革兰氏阴性细菌，主要由包含5个操纵子(LEE1/2/3/4/5)的LEE毒力岛编码。其在细菌膜上形成的一种蛋白复合体跨膜结构，负责分泌蛋白因子，或将其直接注入高等宿主细胞，从而改变细胞的正常行为，导致宿主致病。T3SS与其他黏附因子类似，是细菌攻击宿主细胞的一种入侵武器，但其分子结构非常精密复杂，在细菌对宿主的附着和侵入过程中起着关键作用。T3SS在常见的革兰氏阴性致病菌中均有发现，如肠致病/出血性大肠杆菌(EnteropathogenicEscherichia coli—EPEC/Enterohemorrhagic Escherichia coli—EHEC)、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium—CR)、志贺氏菌、沙门氏菌、耶尔氏杆菌、假单胞菌、衣原体、霍乱弧菌、克雷伯氏菌和伯克氏菌等。已有研究表明，T3SS的功能缺失或其表达发生下降，会极大削弱病原菌对宿主的侵染致病能力。因此，探索病原微生物T3SS的作用机理，对于发现有效控制和治疗病原菌的新思路具有重要意义。
鉴于细菌T3SS在宿主侵染中起到的关键作用。近年来，世界各地的科学家尝试通过抑制T3SS表达，从而降低病原菌的侵染力。其先期结果显示了一定的应用前景。
发明内容
本发明第一方面提供一种抑制包含三型分泌系统的病原菌对宿主侵染的方法，所述方法包括：使所述病原菌接触有效量的氮源。
在本发明的一个实施方案中，所述方法通过抑制病原菌对宿主的定殖能力以达到抑制病原菌对宿主的侵染。
在本发明的一个实施方案中，所述方法通过抑制三型分泌系统相关蛋白的表达及其转运以达到抑制病原菌对宿主的定殖。
本发明第二方面提供氮源在制备用于预防和/或治疗包含三型分泌系统的病原菌侵染的药物中的应用。
本发明第三方面提供氮源作为病原菌三型分泌系统抑制剂的应用。
本发明第四方面在于提供一种病原菌三型分泌系统抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，所述病原菌是包含三型分泌系统的细菌，例如，所述病原菌可以是包含三型分泌系统的人畜共患病原菌、动物病原菌和植物病原菌。
在本发明的一个具体实施方案中，所述细菌属于选自下述的细菌属：肠致病/出血性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli—EPEC/EnterohemorrhagicEscherichia coli—EHEC)、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium—CR)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)。
在本发明的一个实施方案中，所述宿主可以是人、动物和植物以及所有依赖于细菌三型分泌系统可以粘附定殖的表面。
在本发明的一个实施方案中，所述氮源选自无机氮源和有机氮源。
在本发明的一个实施方案中，所述氮源是氨基酸氮源。
在本发明的一个实施方案中，所述氮源选自谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述氮源是谷氨酰胺。
在本发明的一个实施方案中，所述无机氮源选自铵盐和硝酸盐。
发明的有益效果
本发明通过添加氮源(特定氨基酸氮源/无机含氮化合物)作为环境信号，抑制病原菌中三型分泌系统相关蛋白的表达及其转运，减少其在宿主体内的定殖，促进病原菌排出，从而降低甚至消除病原菌感染风险。并且，促进病原菌排出过程中不伤害其本身，因此能够避免因生存压力而产生的耐药性，能够针对性的对抗目前因抗生素滥用而产生的大量耐药细菌，也对一般的细菌病害具有广谱作用。
本发明在细菌体外培养中实现了氮源(特定氨基酸氮源/无机含氮化合物)对于细菌毒力相关蛋白表达及其转运的抑制(约10-20倍)，减少在细胞上黏附作用(约10倍)，促进病原菌从小鼠体内的排出(100-1000倍)，降低病原菌在小鼠肠道的定殖量。
附图说明
图1经过谷氨酰胺处理与未经谷氨酰胺处理的出血性大肠杆菌(EHEC)的生长情况。
图2谷氨酰胺对EHEC三型分泌系统蛋白分泌的抑制，其中图A为在培养基中添加水(对照)和谷氨酰胺后蛋白EspA/B/D的SDS-PAGE分析；图B为在培养基中添加水(对照)和谷氨酰胺后蛋白EspD/B的分泌量。
图3EHEC中操纵子LEE4和LEE5的表达量。
图4EHEC对宿主细胞的黏附，其中图A为荧光标记的EHEC和DAPI染色的细胞核的荧光显微镜下图；图B为EHEC对宿主细胞黏附情况的计数分析。
图5CR分泌蛋白的SDS-PAGE分析。
图6在饮水中添加谷氨酰胺的实验组与未添加谷氨酰胺的对照组小鼠粪便中CR数量的统计。
图7在饮水中添加谷氨酰胺的实验组与未添加谷氨酰胺的对照组小鼠肠道中CR数量统计，其中图A为小鼠肠道中荧光素标记的CR检测分析；图B为小鼠肠道中荧光素标记的CR数量统计分析，P值<0.05。
图8在饮水中添加谷氨酰胺的实验组与未添加谷氨酰胺的对照组tlr4突变小鼠感染CR后存活率数量统计。
图9在饮水中添加谷氨酰胺的实验组与未添加谷氨酰胺的对照组小鼠粪便中EHEC数量的统计。
图10丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)毒力基因avrE,avrptoB和hrpL的mRNA表达量。
图11丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)感染拟南芥叶片致病实验结果。
图12经过不同氮源处理与未经处理的出血性大肠杆菌(EHEC)的生长情况(图B)及其对EHEC三型分泌系统蛋白分泌的抑制(图A)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
MEM-Hepes培养基购自Sigma-Aldrich公司，货号M7278。所用的仪器IVIS luminaII购自Caliper Life Sciences公司。
实施例1谷氨酰胺抑制三型分泌系统转运蛋白分泌而不影响细菌生长
1.挑取出血性大肠杆菌(EHEC)单菌落，接种至LB肉汤培养基中，37℃，200rpm培养过夜；
2.将菌液通过4℃，4500xg离心30mins收集得到菌体和培养上清液；
3.将离心得到的菌体用MEM-Hepes培养基重悬后，按初始OD600＝0.05重新接种到新鲜MEM-Hepes培养基中(分别添加终浓度为2mM的谷氨酰胺/谷氨酸/无机氮源，或相应体积无菌水)，培养至OD600＝0.6后，通过4℃，4500 x g离心30mins收集得到菌体和培养上清液；
4.培养上清液通过0.45μm滤器过滤后加入TCA(终浓度10％)，4℃过夜沉淀后，通过4℃,4500 x g离心30mins后，弃去上清，用0.5M Tris-Cl(pH8.6)缓冲液重悬沉淀得到分泌蛋白样品；
5.将菌体重悬于PBS缓冲液中，超声破碎菌体后，通过4℃,4500 x g离心30mins收集上清得到菌体蛋白裂解样品；
我们对于EHEC的分泌蛋白进行SDS-PAGE分析，实验结果表明应用氮源(谷氨酰胺/谷氨酸/无机氮源)处理后不抑制EHEC生长(图1，图12B)，但其三型分泌系统转运蛋白输出减少了约20倍(图2，图12A)。
报告基因实验结果(图3)表明应用氮源(谷氨酰胺)处理后EHEC的LEE4和LEE5操纵子的基因表达量也下降了10-20倍。
细菌的生长曲线测定：
将细菌按以上培养方法(步骤1、2、3)分别在添加不同氮源的培养基中培养，在设定时间点分别取出1ml菌液加入比色皿，通过分光光度计测量OD600值。
LEE4/5表达水平的测定：(参考文献：Analysis of the expression,regulationand export of NleA-E in Escherichia coli O157:H7.Microbiology.2007)
参考文献方法，将LEE4-gfp/LEE5-gfp质粒分别通过电穿孔方法转入待测菌中，在相应抗性平板上挑取转化菌落，转化菌落按以上培养方法在添加不同氮源及抗生素的培养基中培养，当菌液OD600值到达0.8时，取150μl菌液在多功能酶标仪中读取绿色荧光值，即为LEE4/5的相对表达值。
实施例2细胞黏附实验
1.将Hela细胞接种到腔室培养玻片中，37℃，5％ CO2培养至细胞密度>80％；
2.挑取EHEC单菌落，接种至LB肉汤培养基中，37℃，200rpm培养过夜；
3.将过夜培养的菌液1:100稀释到新鲜MEM-Hepes培养基中(添加终浓度为2mM的谷氨酰胺或相应体积无菌水)，37℃，200rpm培养至OD600＝0.6；
4.按M.O.I.1:100将EHEC加入Hela细胞培养基(添加终浓度为2mM的谷氨酰胺或相应体积无菌水)中，37℃，5％ CO2孵育1hr，弃去培养基，加入4％ PFA室温固定30mins；
5.弃去4％ PFA，加入6％ BSA孵育1小时后弃去，加入FITC标记的O157抗体孵育1小时用于标记EHEC，弃去O157抗体后加入PBS清洗3遍，弃去PBS；
6.去除玻片上的腔室，加入适量含有DAPI染液的封片液，盖上盖玻片，置于暗盒内，4℃，24hrs固化；
7.荧光显微镜下对荧光标记的EHEC及DAPI染色的细胞核进行观察计数。
从图4中可以看出，在不添加谷氨酰胺的对照组中，EHEC能在Hela细胞上形成有效黏附，从而为进一步感染细胞奠定基础。而在添加谷氨酰胺的实验组中，EHEC在Hela细胞上形成有效黏附的能力大大下降，很难造成有效侵染。通过计数分析证实，添加谷氨酰胺大大降低了EHEC对于Hela细胞的黏附能力，黏附数量仅为不添加谷氨酰胺组的10％左右甚至更低。
实施例3动物感染实验
1.选取20只6周龄BALB/C小鼠(CR感染致死实验使用B10ScNJ小鼠)，分为对照组(n＝10)和实验组(n＝10),对照组小鼠的饮食中不含谷氨酰胺/谷氨酸，实验组小鼠额外在饮水中添加谷氨酰胺；
2.挑取转入荧光质粒(pGEN-luxCDABE)的病原菌单菌落，接种至LB肉汤培养基中，37℃，200rpm培养过夜；
3.离心获得过夜菌，加入PBS清洗3遍后以1x109菌量对小鼠进行灌胃(灌胃前对小鼠进行24小时断水断食)；
4.收集小鼠粪便，加入生理盐水匀浆后，进行10倍梯度稀释点板计数分析；
5.第9天和第15天，每组分别随机处死5只小鼠，进行解剖，取出肠道，使用IVISLumina II进行生物发光检测计数分析。
CR动物感染实验：从图中可以看出，添加谷氨酰胺会使得体外培养CR上清中的分泌蛋白减少(图5)，且在CR感染小鼠饮食中添加谷氨酰胺后，会导致该病原菌的大量排出(图6、9)，从而导致在小鼠肠道中的CR大大减少(图7)。在tlr4突变的B10ScNJ小鼠(CR小鼠感染致死模型)中使用CR进行感染时，CR感染对照组小鼠在感染23天后50％(5只)死亡，而饮食添加谷氨酰胺的小鼠在感染23天后仅有10％(1只)死亡(图8)。饮食添加谷氨酰胺对于CR感染致死小鼠表现出良好的保护效果。
EHEC动物感染实验：在EHEC感染小鼠模型中，也可观察到类似于CR感染小鼠模型中的结果，在感染小鼠饮食中添加谷氨酰胺后，会导致EHEC的大量排出(图9)，由于EHEC在小鼠体内感染定殖量不如CR高，无法用生物发光实时检测EHEC在肠道内定殖情况。
实施例4植物病原菌毒力基因的mRNA表达水平检测
1.从平板上挑取丁香假单胞菌番茄致病株(DC3000)单菌落，将细菌接种于液体KB培养基，置24℃250rpm摇床培养至对数中期，再转移至MM培养基，其中实验组按照1:100的比例添加200mM L-谷氨酰胺溶液(终浓度2mM L-谷氨酰胺)，对照组添加相同体积的无菌水，于250rpm,24℃条件下培养12h后通过4℃，4600xg离心得到菌体。
2.细菌RNA提取:参照Roche Tripure试剂盒说明书提供的方法对步骤1离心得到的菌体进行操作。
3.反转录反应:参照abcam的5×All In One RT MasterMix试剂盒说明书提供的方法对步骤2得到的细菌RNA进行反转录操作。
4.RT-PCR(或qPCR)反应体系和反应程序参照Takara的SYBR
Figure GDA0003934053900000091
Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂说明书，引物见下表。反应结束后，先观察Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线是否正确，并根据得到的CT值进行分析作图。
RT-PCR引物信息
引物名称 序列 SEQ ID
avrPtoB-FP TGCACACGCCAACAGTATCG SEQ ID NO:1
avrPtoB-RP CGCAGGTGCTCTAAATTGAC SEQ ID NO:2
avrE-FP ACTTGTCGAGCCCGTTCATG SEQ ID NO:3
avrE-RP GTCAGGCCGCGATTGTTGTTC SEQ ID NO:4
hrpL-FP CATCTTCGTCCGCCGGTATTC SEQ ID NO:5
hrpL-RP GTCCATCTCCAGCGACACTTC SEQ ID NO:6
psy-16s-FP CGGTAATACAGAGGGTGCAAGC SEQ ID NO:7
psy-16s-RP ATTCCACCACCCTCTACCATAC SEQ ID NO:8
从实验结果来看，丁香假单胞菌在添加谷氨酰胺后，与对照组相比，其三型分泌系统相关的毒力基因的mRNA表达水平明显减少(降低量>60％)(图10)，该病原菌的毒力水平明显下调。
实施例5植物病原菌致病实验
用108CFU/mL(OD600≈0.2)的丁香假单胞菌番茄致病株(Pseudomonas syringae)DC3000细菌悬浮液通过注射的方式感染野生型拟南芥，会引起植物宿主的缓慢的萎黄症状。因此，在该实验中我们选择这一剂量对植株进行感染。
1.从平板上挑取丁香假单胞菌番茄致病株(DC3000)单菌落，将细菌接种于液体KB培养基，置24℃250rpm摇床培养至对数中期，再转移至MM培养基，其中实验组按照1:100的比例添加200mM L-谷氨酰胺溶液(终浓度2mM L-谷氨酰胺)，对照组添加相同体积的无菌水，于250rpm,24℃条件下培养12h后通过4℃，4600xg离心得到菌体。
2.离心后菌体最终用10mM氯化镁溶液重悬，使菌液浓度为OD600＝0.2，同时加入Silwet L-77(终体积分数为0.02％)。选取4周龄的野生型拟南芥(Col-0)，将菌悬液通过注射方式感染叶片上。感染后观察叶片颜色、形态的变化。
从图11中可以观察到，感染后第4天，对照组(无菌水)的叶片出现了明显的黄色斑点，且在第7天，对照组(无菌水)叶片的黄色区域已明显扩散开来，并出现枯萎现象，而实验组(2mM L-谷氨酰胺)的叶片在感染后第4天或第7天所出现的黄色斑点较对照组明显更少，外在表征更为健康。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 氮源用于抑制细菌三型分泌系统的应用
<130> IDC190218
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcacacgcc aacagtatcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcaggtgct ctaaattgac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acttgtcgag cccgttcatg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcaggccgc gattgttgtt c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catcttcgtc cgccggtatt c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtccatctcc agcgacactt c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggtaataca gagggtgcaa gc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attccaccac cctctaccat ac 22

Claims (8)

1.氮源在制备用于抑制包含三型分泌系统的病原菌对宿主侵染的试剂中的用途，其中所述氮源选自：2mM的谷氨酰胺、谷氨酸或天冬酰胺；或者4mM的天冬氨酸、氯化铵或硝酸钠。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述氮源通过抑制病原菌对宿主的定殖能力以减少病原菌对宿主的侵染和促进病原菌从宿主体内的排出。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述氮源抑制三型分泌系统毒力相关蛋白的表达及其转运。
4.氮源在制备用于预防和/或治疗包含三型分泌系统的病原菌侵染的药物中的用途，其中所述氮源选自：2mM的谷氨酰胺、谷氨酸或天冬酰胺；或者4mM的天冬氨酸、氯化铵或硝酸钠。
5.氮源用于制备病原菌三型分泌系统的抑制剂的用途，其中所述氮源选自：2mM的谷氨酰胺、谷氨酸或天冬酰胺；或者4mM的天冬氨酸、氯化铵或硝酸钠。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其中所述病原菌是革兰氏阴性细菌。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述病原菌选自：肠致病/出血性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli—EPEC/Enterohemorrhagic Escherichia coli—EHEC)、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium—CR)和丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)。
8.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述宿主是人、动物或植物。
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