CN111971277A - 作为sting激动剂的苯并噻吩及相关化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物及其药学上可接受的盐，其中所有变量如本文所定义，这些化合物及其药学上可接受的盐可用作I型干扰素产生的诱导剂，特别是作为STING活化剂。还提供了包含这些化合物的组合物，合成这些化合物的方法，以及这些化合物的用途，包括施用这些化合物以诱导免疫应答、诱导STING依赖性I型干扰素产生和/或治疗细胞增殖性疾病例如癌症。

Description

作为STING激动剂的苯并噻吩及相关化合物
技术领域
本公开涉及可用作激活STING途径的STING(干扰素基因的刺激物)激动剂的化合物及其衍生物。本公开还涉及包含此类化合物的组合物，此类化合物的合成方法以及此类化合物的用途，包括施用此类化合物以诱导免疫应答、诱导STING依赖性I型干扰素产生和/或治疗细胞增殖性疾病例如癌症。
对以电子方式提交的序列表的引用
本申请的序列表通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名为“24578_SEQLIST-FEB2019”，创建日期为2019年3月1日，大小为25KB。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，在此通过引用整体并入本文。
背景技术
免疫系统已发展为识别并消除不同类型的威胁，以维持宿主的体内平衡，通常分为两大类：适应性和先天性。适应性免疫系统专门用于识别宿主中未天然表达的那些外来抗原，并将其通过许多白细胞亚群的协同作用引发抗抗原反应。适应性免疫反应的特点是能够针对遇到的抗原提供“记忆”或持久的免疫力。尽管这种具体而持久的作用对于宿主的健康和生存至关重要，但适应性免疫反应需要时间才能产生全面的反应。
先天性免疫系统弥补了这一时间延迟，专门针对各种侮辱或危险信号迅速采取行动，为抵御细菌、病毒、寄生虫和其他传染性威胁提供了第一道防线，但对某些与细胞或组织损伤相关的危险信号也作出了强烈反应。先天性免疫系统没有抗原特异性，但确实对多种效应器机制有反应。调理作用、吞噬作用、补体系统激活和诸如细胞因子或趋化因子之类的可溶性生物活性物质的产生都是先天性免疫系统通过介导其反应的机制。通过响应上述的这些损伤相关分子模式(DAMP)或病原体相关分子模式(PAMP)，先天免疫系统能够针对对宿主的广泛威胁提供广泛的保护。
这些PAMP和DAMP中包括游离的胞质DNA和RNA。最近已经证明，胞质DNA的主要传感器是cGAS(环状GMP-AMP合酶)。识别胞质DNA后，cGAS催化环状二核苷酸2'3'-cGAMP的生成，这是一种非典型的第二信使，与ER跨膜衔接蛋白STING紧密结合。cGAMP结合的STING发生构象变化，该蛋白转位至核周区室并诱导关键转录因子IRF-3和NF-kB的激活。这导致强烈诱导I型干扰素并产生促炎性细胞因子，例如IL-6、NF-α和IFN-γ。
I型干扰素和促炎性细胞因子对免疫系统各种细胞的重要性已得到很好的确立。特别地，这些分子通过增强树突状细胞和巨噬细胞摄取、加工、呈递和交叉呈递至T细胞的抗原的能力来强烈增强T细胞的活化。这些抗原呈递细胞的T细胞刺激能力通过关键共刺激分子(例如CD80或CD86)的上调而增强。最后，I型干扰素可以迅速与它们的同源受体结合，并触发干扰素反应性基因的激活，从而大大有助于适应性免疫细胞的激活。
从治疗角度看，I型干扰素可通过直接抑制人类乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒复制，并刺激对病毒感染细胞的免疫反应而具有抗病毒活性。可以诱导I型干扰素产生的化合物可用在疫苗中，其中可用作佐剂，通过减少剂量和扩大免疫反应来增强对抗原的特异性免疫反应并且最大程度地减少副作用。
另外，干扰素和可诱导干扰素产生的化合物在治疗人类癌症中具有潜在用途。这样的分子潜在地可用作具有多种活性途径的抗癌剂。干扰素可以直接抑制人肿瘤细胞的增殖，并且可以与各种批准的化学治疗剂协同作用。I型干扰素可通过诱导激活适应性和先天性免疫细胞来显著增强抗肿瘤免疫反应。最后，干扰素可通过调节与组织重塑有关的酶表达来抑制肿瘤的侵袭。
考虑到I型干扰素和诱导I型干扰素的化合物作为抗病毒剂和抗癌剂的潜力，仍然需要可以诱导有效的I型干扰素产生的新试剂。越来越多的数据表明cGAS-STING胞质DNA传感途径具有诱导I型干扰素的显著能力，STING活化剂的开发在当今的抗肿瘤治疗领域迅速占据重要地位。
发明内容
本公开包括通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物及其药学上可接受的盐。这些化合物及其药学上可接受的盐可用作诱导免疫应答、诱导STING依赖性I型干扰素产生和/或治疗细胞增殖性疾病的药剂。
本公开涉及通式(I)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(I)的化合物：
Figure BDA0002716024870000031
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(I)的化合物的用途和制备通式(I)的化合物的方法。
本公开还涉及通式(II)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(II)的化合物：
Figure BDA0002716024870000032
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(II)的化合物的用途和制备通式(II)的化合物的方法。
本公开还涉及通式(III)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(III)的化合物：
Figure BDA0002716024870000041
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(III)的化合物的用途和制备通式(III)的化合物的方法。
本公开还涉及通式(IV)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(IV)的化合物
Figure BDA0002716024870000042
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(IV)的化合物的用途和制备通式(IV)的化合物的方法。
本公开还涉及通式(V)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(V)的化合物
Figure BDA0002716024870000043
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(V)的化合物的用途和制备通式(V)的化合物的方法。
本公开还涉及通式(VI)的新型化合物。特别地，如本文所述，本公开涉及具有通用结构式(VI)的化合物
Figure BDA0002716024870000044
或其药学上可接受的盐。还公开了通式(VI)的化合物的用途和制备通式(VI)的化合物的方法。
本发明的其他实施方案、方面和特征将在随后的描述、实施例和所附权利要求书中进一步描述或变得显而易见。
具体实施方案
本公开包括通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物及其药学上可接受的盐。这些化合物及其药学上可接受的盐可用作诱导免疫应答、诱导STING依赖性I型干扰素产生和/或治疗细胞增殖性疾病的药剂。
第一实施方案涉及通式(I)的化合物：
Figure BDA0002716024870000051
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；任选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环基任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；每个R6独立地选自：H，C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000061
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第一实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000062
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000063
Figure BDA0002716024870000064
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000065
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000066
Figure BDA0002716024870000067
Figure BDA0002716024870000068
在这个方面，所有其他基团如以上第一实施方案的通式(I)中所提供。
在第一实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第一实施方案的通式(I)或以上第一方面中所提供。
在第一实施方案的第三方面中，每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环。在此方面的实例中，每个R2独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OC1-C3烷基，C2-C3烯基和N(R6)2。在此方面的具体实例中，每个R2独立地选自：H,Br,Cl,CH3,CH2CH3,CH＝CH2,OCH3,OCFH2,OCF2H,OCF3和N(R6)2。在此方面的更具体实例中，每个R2独立地选自：H,CH3,OCH3和OCF2H。在此方面，所有其他基团均如第一实施方案的通式(I)或上述第一或第二方面中所提供。
在第一实施方案的第四方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；可选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在该第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此第四方面的具体实例中，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在这种实例中，通式(I)的结构为式(Ia)：
Figure BDA0002716024870000081
其中所有基团均如通式(I)中所提供。在此方面，所有其他基团如在第一实施方案的通式(I)或上述第一至第三方面中所提供的。
在第一实施方案的第五方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在第一实施方案的通式(I)或上述第一至第四方面中所提供的。
在第一实施方案的第六方面中，每个X1选自C＝O,-CH2-,-CHF-,和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在第一实施方案的通式(I)或上述第一至第五方面中所提供的。
在第一实施方案的第七方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一个实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第一实施方案的通式(I)或上述第一至第六方面中所提供的。
在第一实施方案的第八方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000091
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000092
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在第一实施方案的通式(I)中或在上述第一至第七方面中所提供的。
在第一实施方案的第九方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团都如上述第一实施方案的通式(I)或第一至第八方面所提供。
第一实施方案的第十方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第一实施方案的通式(I)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第一实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第一实施方案的通式(I)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第一实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第一实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第一实施方案的通式(I)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第一实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第一实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第一实施方案的通式(I)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第一实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第一实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在第一实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第一实施方案的第十八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十一方面的组合物。在第一实施方案的该第十八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第一实施方案的每个方面中，第一实施方案及其各个方面和实例的通式(I)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第二实施方案涉及通式(II)的化合物：
Figure BDA0002716024870000111
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；可选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；每个R6独立地选自：H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000121
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第二实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000122
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000123
Figure BDA0002716024870000124
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000125
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000126
Figure BDA0002716024870000127
Figure BDA0002716024870000131
在这个方面，所有其他基团如以上第二实施方案的通式(II)中所提供。
在第二实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第二实施方案的通式(II)或以上第一方面中所提供。
在第二实施方案的第三方面中，每个R2独立地选自：H，卤素，CN或OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环。在此方面的实例中，每个R2独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OC1-C3烷基，C2-C3烯基和N(R6)2。在此方面的具体实例中，每个R2独立地选自：H,Br,Cl,CH3,CH2CH3,CH＝CH2,OCH3,OCFH2,OCF2H,OCF3和N(R6)2。在此方面的更具体实例中，每个R2独立地选自：H,CH3,OCH3和OCF2H。在此方面，所有其他基团如第二实施方案的通式(II)或上述第一或第二方面中所提供。
在第二实施方案的第四方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；可选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在该第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此第四方面的具体实例中，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在这种实例中，通式(II)的结构为式(IIa):
Figure BDA0002716024870000141
其中所有基团均如通式(II)中所提供。在此方面，所有其他基团如在第二实施方案的通式(II)或上述第一至第三方面中所提供的。
在第二实施方案的第五方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在第二实施方案的通式(II)或上述第一至第四方面中所提供的。
在第二实施方案的第六方面中，每个X1独立地选自C＝O,-CH2-,-CHF-,和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在第二实施方案的通式(II)或上述第一至第五方面中所提供的。
在第二实施方案的第七方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8 CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第二实施方案的通式(II)或上述第一至第六方面中所提供的。
在第二实施方案的第八方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000151
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000152
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR 6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在第二实施方案的通式(II)中或在上述第一至第七方面中所提供的。
在第二实施方案的第九方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团如上述第二实施方案的通式(II)或第一至第八方面所提供的。
第二实施方案的第十方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第二实施方案的通式(II)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第二实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第二实施方案的通式(II)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第二实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第二实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第二实施方案的通式(II)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第二实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的上述第十方面的组合物。
第二实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的上述第二实施方案的通式(II)或上述第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第二实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第二实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的通式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第二实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第二实施方案的第十八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十一方面的组合物。在第二实施方案的该第十八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第二实施方案的每个方面中，第二实施方案及其各个方面和实例的通式(II)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第三实施方案涉及通式(III)的化合物：
Figure BDA0002716024870000171
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；可选地，R3可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环G，该稠环G选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环G至R3的键来自所述环G上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；可选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；每个R6独立地选自：H，C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000181
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第三实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000182
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000183
Figure BDA0002716024870000184
并且
Figure BDA0002716024870000185
选自：
Figure BDA0002716024870000191
Figure BDA0002716024870000192
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000193
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000194
Figure BDA0002716024870000195
Figure BDA0002716024870000196
每个
Figure BDA0002716024870000197
选自：
Figure BDA0002716024870000198
Figure BDA0002716024870000199
Figure BDA00027160248700001910
在这个方面，所有其他基团如以上第三实施方案的通式(III)中所提供的。
在第三实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第三实施方案的通式(III)或以上第一方面中所提供的。
在第三实施方案的第三方面中，每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环。在此方面的实例中，每个R2独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OC1-C3烷基，C2-C3烯基和N(R6)2。在此方面的具体实例中，每个R2独立地选自：H,Br,Cl,CH3,CH2CH3,CH＝CH2,OCH3,OCFH2,OCF2H,OCF3和N(R6)2。在此方面的更具体实例中，每个R2独立地选自：H,CH3,OCH3和OCF2H。在此方面，所有其他基团均如上述第三实施方案的通式(III)或第一或第二方面中所提供的。
在第三实施方案的第四方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；可选地，R3可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环G，该稠环G选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环G至R3的键来自所述环G上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；可选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在该第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此第四方面的具体实例中，R3可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环G，该稠环G选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环G至R4的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在这种实例中，通式(III)的结构为式(IIIa):
Figure BDA0002716024870000211
其中所有基团如通式(III)中所提供的。在第四方面的其他具体实例中，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代。在该实例中，通式(III)的结构为式(IIIb):
Figure BDA0002716024870000212
其中所有基团均如通式(III)中所提供的。在此方面，所有其他基团如上述第一实施方案的通式(III)或第一至第三方面中所提供的。
在第三实施方案的第五方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6独立地选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在上述第三实施方案的通式(III)或第一至第四方面中所提供的。
在第三实施方案的第六方面中，每个X1独立地选自C＝O、-CH2-、-CHF-和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在上述第三实施方案的通式(III)或第一至第五方面中所提供的。
在第三实施方案的第七方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一个实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第三实施方案的通式(III)或上述第一至第六方面中所提供的。
在第三实施方案的第八方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000231
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000232
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在上述第三实施方案的通式(III)中或在第一至第七方面中所提供的。
在第三实施方案的第九方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团如上述第三实施方案的通式(III)或第一至第六方面所提供的。
第三实施方案的第十方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第三实施方案的通式(III)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第三实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第三实施方案的通式(III)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第三实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第三实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的上述第三实施方案的通式(III)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第三实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第三实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第三实施方案的通式(III)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第三实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第三实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的通式(III)的化合物或其药学上可接受的盐。在第三实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第三实施方案的第十八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十一方面的组合物。在第三实施方案的该第十八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第三实施方案的每个方面中，第三实施方案及其各个方面和实例的通式(III)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第四实施方案涉及通式(IV)的化合物：
Figure BDA0002716024870000241
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；每个R6独立地选自：H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000251
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第四实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000252
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000253
Figure BDA0002716024870000254
Figure BDA0002716024870000255
选自：
Figure BDA0002716024870000256
Figure BDA0002716024870000261
Figure BDA0002716024870000262
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000263
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000264
Figure BDA0002716024870000265
并且
Figure BDA0002716024870000266
选自：
Figure BDA0002716024870000267
Figure BDA0002716024870000268
Figure BDA0002716024870000269
在这个方面，所有其他基团如以上第四实施方案的通式(IV)中所提供的。
在第四实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第四实施方案的通式(IV)或以上第一方面中所提供的。
在第四实施方案的第三方面中，每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环。在此方面的实例中，每个R2独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OC1-C3烷基，C2-C3烯基和N(R6)2。在此方面的具体实例中，每个R2独立地选自：H,Br,Cl,CH3,CH2CH3,CH＝CH2,OCH3,OCFH2,OCF2H,OCF3和N(R6)2。在此方面的更具体实例中，每个R2独立地选自：H,CH3,OCH3和OCF2H。在此方面，所有其他基团如第四实施方案的通式(IV)或上述第一或第二方面中所提供的。
在第四实施方案的第四方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)。在第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此方面，所有其他基团如在第四实施方案的通式(IV)或上述第一至第三方面中所提供的。
在第四实施方案的第五方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6独立地选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在上述第四实施方案的通式(IV)或第一至第四方面中所提供的。
在第四实施方案的第六方面中，每个X1独立地选自C＝O,-CH2-,-CHF-,和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在第四实施方案的通式(IV)或上述第一至第五方面中所提供的。
在第四实施方案的第七方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8 CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第四实施方案的通式(IV)或上述第一至第六方面中所提供的。
在第四实施方案的第八方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000281
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000291
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR 6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自下组：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在第四实施方案的通式(IV)中或在上述第一至第七方面中所提供的。
在第四实施方案的第九方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团如上述第四实施方案的通式(IV)或第一至第八方面所提供的。
第四实施方案的第十方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第四实施方案的通式(IV)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第四实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第四实施方案的通式(IV)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第四实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第四实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第四实施方案的通式(IV)或第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第四实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第四实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第四实施方案的通式(IV)或上述第一至第九方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第四实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十方面的组合物。
第四实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的通式(IV)的化合物或其药学上可接受的盐。在第四实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第四实施方案的第十八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据上述第十一方面的组合物。在第四实施方案的该第十八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第四实施方案的每个方面中，第四实施方案及其各个方面和实例的通式(IV)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第五实施方案涉及通式(V)的化合物：
Figure BDA0002716024870000301
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000311
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第五实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000312
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000313
Figure BDA0002716024870000314
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000315
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000316
Figure BDA0002716024870000317
Figure BDA0002716024870000318
在这个方面，所有其他基团如以上第五实施方案的通式(V)中所提供的。
在第五实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第五实施方案的通式(V)或以上第一方面中所提供的。
在第五实施方案的第三方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)。在该第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此方面，所有其他基团如上述第五实施方案的通式(V)或第一或第二方面中所提供的。
在第五实施方案的第四方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6独立地选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在上述第五实施方案的通式(V)或第一至第三方面中所提供的。
在第五实施方案的第五方面中，每个X1独立地选自C＝O,-CH2-,-CHF-,和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在上述第五实施方案的通式(V)或第一至第四方面中所提供的。
在第五实施方案的第六方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一个实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第五实施方案的通式(V)或上述第一至第五方面中所提供的。
在第五实施方案的第七方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000331
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000332
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在上述第五实施方案的通式(V)中或在第一至第六方面中所提供的。
在第五实施方案的第八方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团都如上述第五实施方案的通式(V)或第一至第七方面所提供的。
第五实施方案的第九方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第五实施方案的通式(V)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第五实施方案的第十方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第五实施方案的通式(V)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第五实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。
第五实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第五实施方案的通式(V)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第五实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。
第五实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第五实施方案的通式(V)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第五实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。
第五实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第五实施方案的通式(V)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。在第五实施方案的该第十六方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第五实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。在第五实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第五实施方案的每个方面中，第五实施方案及其各个方面和实例的通式(V)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第六实施方案涉及通式(VI)的化合物：
Figure BDA0002716024870000351
或其药学上可接受的盐，其中每个A-R1独立地选自C-R1和N；每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；每个R6独立地选自：H，C1-C6烷基，和C1-C6卤代烷基；每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000361
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
在第六实施方案的第一方面中，每个A-R1独立地选自C-R1和N。在此方面的具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000362
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000363
Figure BDA0002716024870000364
在此方面的更具体实例中，每个
Figure BDA0002716024870000365
独立地选自：
Figure BDA0002716024870000366
Figure BDA0002716024870000367
Figure BDA0002716024870000368
在这个方面，所有其他基团如以上第六实施方案的通式(VI)中所提供。
在第六实施方案的第二方面中，每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2。在此方面的实例中，每个R1独立地选自：H，卤素，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R1独立地选自H和卤素。在此方面的更具体实例中，每个R1独立地选自H和F。在此方面，所有其他基团如以上第六实施方案的通式(VI)或以上第一方面中所提供的。
在第六实施方案的第三方面中，R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)。在该第四方面的实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-8-,-O(CH2)1-7-,-O(CH2)1-6O-,-NH(CH2)1-7-和-NH(CH2)1-6O-。在该第四方面的具体实例中，R3-R4选自：-(CH2)2-,-(CH2)3-,-(CH2)4-,-O(CH2)2-,-O(CH2)3-,-O(CH2)4-,-O(CH2)2O-,-O(CH2)3O-,-OCH2CH(CH3)CH2O-,-O(CH2)4O-,-O(CH2)5O-,-NH(CH2)2-,-NH(CH2)3-,和-NH(CH2)3O-。在此方面，所有其他基团如上述第六实施方案的通式(VI)或第一或第二方面中所提供的。
在第六实施方案的第四方面中，每个R6独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基。在此方面的实例中，每个R6独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基。在此方面的具体实例中，每个R6独立地选自H、CH3和CHF2。在此方面，所有其他基团如在上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第三方面中所提供的。
在第六实施方案的第五方面中，每个X1独立地选自C＝O,-CH2-,-CHF-,和-CF2-。在此方面的实例中，X1选自C＝O和-CH2-。在此方面的具体实例中，X1是C＝O。在该实施方案中，所有其他基团如在上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第四方面中所提供的。
在第六实施方案的第六方面中，每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面的第一个实例中，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基。在第一个实例的具体情形下，每个X2是CH2CHR8，其中R8选自：H,CH3,CH2OH,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2OCH3和环丙基。在此方面的第二个实例中，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在第二个实例的具体情形下，每个X2是CHR8CHR8，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于不同碳原子上的2个R8连同它们所连接的原子一起形成3至6元稠环。在此方面的第三个实例中，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自：H，C1-C3烷基，被OH取代的C1-C3烷基，被OC1-C3烷基取代的C1-C3烷基，和C3-C6环烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在第三个实例的具体情形下，每个X2是CH2C(R8)2，其中每个R8独立地选自H和C1-C3烷基；可选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环。在此方面，所有其他基团如在第六实施方案的通式(VI)或上述第一至第五方面中所提供的。
在第六实施方案的第七方面中，每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure BDA0002716024870000381
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN。在此方面的实例中，每个X3独立地选自：COOR6,
Figure BDA0002716024870000382
SO2R6,C(O)N(R9)2,和CN。在此方面的具体实例中，每个X3独立地选自：COOR6，C(O)N(R9)2和CN。在此方面的更具体实例中，每个X3独立地选自：COOH，COOCH3，CONH2和CN。在此方面，所有其他基团如在上述第六实施方案的通式(VI)中或在第一至第六方面中所提供的。
在第六实施方案的第八方面中，每个R9独立地选自H、COOR6和SO2R6。在此方面的实例中，每个R9独立地为H。在这个方面，所有其他基团都如上述第五实施方案的通式(V)或第一至第七方面所提供的。
第六实施方案的第九方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。
第六实施方案的第十方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第六实施方案的第十一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。
第六实施方案的第十二方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第六实施方案的第十三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向所述患者施用根据治疗有效量的上述第九方面的组合物。
第六实施方案的第十四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。
第六实施方案的第十五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。
第六实施方案的第十六方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第六实施方案的通式(VI)或第一至第八方面的化合物或其药学上可接受的盐。在第六实施方案的该第十六方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第六实施方案的第十七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据上述第九方面的组合物。在第六实施方案的该第十七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
在本文描述的第六实施方案的每个方面中，第六实施方案及其各个方面和实例的通式(VI)的变量R1、R2、R3、R4、R6、R8、R9、A、X1、X2和X3彼此独立地选择，条件是R1、R2、R3、R4、R6、R8和R9中的至少一个不是H。
第七实施方案涉及选自下组的化合物：
Figure BDA0002716024870000401
Figure BDA0002716024870000411
Figure BDA0002716024870000421
Figure BDA0002716024870000431
Figure BDA0002716024870000441
Figure BDA0002716024870000451
Figure BDA0002716024870000461
Figure BDA0002716024870000471
Figure BDA0002716024870000481
Figure BDA0002716024870000491
Figure BDA0002716024870000501
Figure BDA0002716024870000511
Figure BDA0002716024870000521
Figure BDA0002716024870000531
Figure BDA0002716024870000541
Figure BDA0002716024870000551
及其药学上可接受的盐。该第七实施方案的具体方面涉及选自下组的化合物：
Figure BDA0002716024870000552
Figure BDA0002716024870000561
Figure BDA0002716024870000571
Figure BDA0002716024870000581
Figure BDA0002716024870000591
及其药学上可接受的盐。
第七实施方案的第一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第七实施方案的第二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
第七实施方案的第三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第七实施方案的第四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第七实施方案的化合物或药学上可接受的盐的组合物。
第七实施方案的第五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第七实施方案的第六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
第七实施方案的第七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第七实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。在第七实施方案的第七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第七实施方案的第八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据第七实施方案的化合物的组合物。在第七实施方案的第八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第八实施方案涉及选自以下所示的实施例1至190中描述的示例性物质的化合物。
第八实施方案的第一方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第八实施方案的第二方面涉及在需要治疗的患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
第八实施方案的第三方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第八实施方案的第四方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第八实施方案的化合物或药学上可接受的盐的组合物。
第八实施方案的第五方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。
第八实施方案的第六方面涉及在需要治疗的患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
第八实施方案的第七方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据上述第八实施方案的化合物或其药学上可接受的盐。在第八实施方案的第七方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
第八实施方案的第八方面涉及在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的包含根据上述第八实施方案的化合物的组合物。在第八实施方案的第八方面的实例中，细胞增殖性疾病是癌症。
本公开的其他实施方案包括以下内容:
(a)药物组合物，其包含有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
(b)(a)的药物组合物，其还包含选自下组的活性剂：STING激动剂化合物、抗病毒化合物、抗原、佐剂、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂以及其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化学治疗剂。
(c)药物组合，其为(i)通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐和(ii)选自下组的活性剂：STING激动剂化合物、抗病毒化合物、抗原、佐剂、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂以及其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化学治疗剂；其中通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐以及活性剂各自以使该组合在患者中有效诱导免疫应答的量使用。
(d)在患者中诱导免疫应答的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐。
(e)在患者中诱导免疫应答的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的(a)的组合物、(b)的组合物或(c)的组合。
(f)在患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐。
一种在患者中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，该方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的(a)的组合物、(b)的组合物或(c)的组合。
(h)在患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐。
(i)在患者中诱导STING依赖性细胞因子产生的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的(a)的组合物、(b)的组合物或(c)的组合。
(j)在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐。
(k)(j)的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
(l)在需要治疗的患者中治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的(a)的组合物、(b)的组合物或(c)的组合。
(m)(1)的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
本公开还包括本公开的化合物用于(i)以下、(ii)作为以下的药物或(iii)制备用于以下的药物：(a)在患者中诱导免疫应答，或(b)在患者中诱导STING依赖性细胞因子的产生。在这些用途中，本公开的化合物可任选地与选自STING激动剂化合物、抗病毒化合物、抗原、佐剂、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂以及其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化学治疗剂的一种或多种活性剂组合使用。
本公开的其他实施方案包括以上(a)至(m)中列出的药物组合物、组合和方法，以及前段中列出的用途，其中使用的本公开的化合物是上述实施方案、方面、实例、情形或化合物的特征之一的化合物。在所有这些实施方案中，化合物可以适当地以药学上可接受的盐的形式任选地使用。
在以上提供的化合物的实施方案中，应理解的是，每个实施方案可以与一个或多个其他实施方案组合，其程度是这种组合提供了稳定的化合物并且与实施方案的描述一致。还应理解，以上(a)至(m)提供的组合物和方法的实施方案应理解为包括化合物的所有实施方案，包括由实施方案的组合产生的此类实施方案。
如本文所用，术语“个体”(或者“患者”)是指已经成为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是选自下组的一种或多种：人、牛科(例如奶牛)、猪科(例如猪)、绵羊属(例如绵羊)、山羊属(例如山羊)、马科(例如马)、犬科(例如家犬)、猫科(例如家猫)、兔类(兔)、啮齿类(例如大鼠或小鼠)、浣熊属(例如浣熊)。在具体的实施方案中，个体是人。
如本文所用，术语“免疫应答”涉及以下任何一种或多种：特异性免疫应答、非特异性免疫应答、特异性和非特异性应答、先天性应答、原发性免疫应答、适应性免疫、继发性免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞活化、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。在某些实施方案中，通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐与一种或多种其他治疗剂联合给药，一种或多种其他治疗剂包括：抗病毒化合物、旨在刺激对一种或多种预定抗原的免疫应答的疫苗、佐剂、CTLA-4和PD-l途径拮抗剂以及其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化学治疗剂等。在某些实施方案中，通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐与一种或多种其他组合物联合给药，一种或多种其他组合物包括：抗病毒化合物、旨在刺激对一种或多种预定抗原的免疫应答的疫苗、佐剂、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂以及其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化学治疗剂等。
化合物
如本文所用，术语“烷基”是指具有在指定范围内的碳原子数的单价直链或支链的饱和脂族烃基。因此，例如，“C1-6烷基”(或“C1-C6烷基”)是指任何己基烷基和戊基烷基异构体以及正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正丙基、异丙基、乙基和甲基。作为另一个例子，“C1-4烷基”是指正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正丙基、异丙基、乙基和甲基。
如本文所用，术语“亚烷基”是指具有在指定范围内的碳原子数的二价直链饱和脂族烃基。
如本文所用，术语“烯基”是指具有在指定范围内的碳原子数并且包括一个或多个双键的单价直链或支链不饱和脂族烃基。
如本文所用，术语“亚烯基”是指具有在指定范围内的碳原子数并且包括一个或多个双键的二价直链不饱和脂族烃基。
如本文所用，术语“炔基”是指具有在指定范围内的碳原子数并且包括一个或多个三键的单价直链或支链不饱和脂族烃基。
如本文所用，术语“亚炔基”是指具有在指定范围内的碳原子数并且包括一个或多个三键的二价直链不饱和脂族烃基。
如本文所用，术语“卤素”(或“卤代”)是指氟、氯、溴和碘(或者氟代、氯代、溴代和碘代或F、Cl、Br和I)。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子已被卤素代替的如上定义的烷基。因此，例如，“C1-6卤代烷基”(或“C1-C6卤代烷基”)是指具有一个或多个卤素取代基的如上定义的C1至C6直链或支链的烷基。术语“氟代烷基”具有类似的含义，除了卤素取代基限于氟。合适的氟代烷基包括(CH2)0-4CF3系列(即三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟代正丙基等)。
如本文所用，术语“卤代亚烷基”是指如上文所定义的亚烷基，其中一个或多个氢原子已被卤素代替，如在上文所定义的卤代烷基中。
如本文所用，术语“卤代烯基”是指如上定义的烯基，其中一个或多个氢原子已被卤素代替。
如本文所用，术语“卤代亚烯基”是指如上定义的亚烯基，其中一个或多个氢原子已被卤素代替。
如本文所用，术语“卤代炔基”是指如上所定义的炔基，其中一个或多个氢原子已被卤素代替。
如本文所用，术语“卤代亚炔基”是指如上定义的亚炔基，其中一个或多个氢原子已被卤素代替。
如本文所用，本文所用的术语“烷氧基”，单独地或组合地，包括连接至氧连接原子的烷基。术语“烷氧基”还包括烷基醚基，其中术语“烷基”如上所定义，并且“醚”是指它们之间具有氧原子的两个烷基。合适的烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、甲氧基甲烷(也称为“二甲醚”)和甲氧基乙烷(也称为“乙基甲基醚”)。
如本文所用，术语“环烷基”是指含有一个具有指定碳原子数的环的饱和烃。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”或“杂环的”，如本文所用，表示稳定的3至6元单环，其为饱和或不饱和的，并且由碳原子和选自N、O和S的一至两个杂原子组成。杂环可以连接在任何导致形成稳定的结构的杂原子或碳原子上。该术语包括杂芳基部分。此类杂环元素的实例包括但不限于：吖庚因基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氢吡喃基、噌啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并硫代吡喃基、二氢苯并硫代吡喃基砜、1,3-二氧戊环基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、异苯并二氢吡喃基、异吲哚啉基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吗啉基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代吖庚因基、噁唑基、2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，吡啶基，吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基、三唑基和噻吩基。
如本文所用，术语“稠环”是指由直链或支链烷烃中的独立原子上的取代基形成的环基，或指由另一环中的独立原子上的取代基形成的环基。
如本文所用，术语“螺环”或“螺环”是指由单个原子上的取代基形成的侧环基。
除非有相反的明确说明，否则本文引用的所有范围包括端值；即，该范围包括该范围的上限和下限的值以及之间的所有值。作为示例，本文所述的温度范围、百分比、当量范围等包括范围的上限和下限以及介于两者之间的连续范围内的任何值。本文提供的数值和术语“约”的使用可以包括±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±10％、±15％和±20％的变化和它们的等效数值。
如本文所用，术语“一种或多种”项目包括从列表中选择的单个项目以及从列表中选择的两个或多个项目的混合。
在通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物以及上述化合物的药学上可接受的盐中，原子可以表现出天然的同位素丰度，或者一个或多个原子可以以具体的同位素人工富集，该同位素具有相同的原子序数但原子质量或质量数不同于主要在自然界中主要的原子质量或质量数。本公开意在包括通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物和上述化合物的药学上可接受的盐的所有合适的同位素变体。例如，氢(H)的不同同位素形式包括氕(1H)、氘(2H)和氚(3H)。氕是自然界中最主要的氢同位素。氘的富集可以提供某些治疗优势，例如增加体内半衰期或减少剂量要求，或者可以提供用作表征生物样品的标准物的化合物。同位素富集的通式(I)化合物、通式(II)化合物、通式(III)化合物、通式(IV)化合物、通式(V)化合物、通式(VI)化合物以及上述化合物的药学上可接受的盐可以通过使用合适的同位素富集的试剂和/或中间体，通过本领域技术人员众所周知的常规技术或通过类似于本文方案和实施例中描述的方法的方法制备，无需大量的实验。
在通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物以及上述化合物的药学上可接受的盐的具体实施方案中，该化合物在同位素上富含氘。在这些实施方案的各方面中，R1、R2、R3、R6、R8和R9中的一个或多个可以包括氘。
如本文提供的一般结构式和具体化合物的结构所示，在手性中心的直线包括(R)和(S)立体异构体及其混合物。另外，除非另有说明(例如100％纯化的化合物)，否则对在某一位置的具体立体化学的提及可提供具有指定的立体化学的化合物，但不排除在指定位置存在具有不同立化学的立体异构体的存在。
权利要求书中对具体化合物的描述或说明(即种类)没有指定具体的立体构型或没有指定所有手性中心，旨在涵盖化合物的该未指定的手性中心的外消旋体、外消旋混合物、每种单独的对映异构体、非对映异构体混合物和每种单独的非对映异构体，可能由于存在一个或多个不对称中心而存在这样的形式。立体异构体混合物的分离可以在合成通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐的中间步骤中进行，或者可以在最终外消旋产物上进行。绝对立体化学可以通过晶体产物或晶体中间体的X射线晶体学测定，如果需要，可以用含有已知构型的立体异构中心的试剂将其衍生化。或者，可以通过振动圆二色性(VCD)光谱分析来确定绝对立体化学。本发明包括所有这些异构体，以及这些外消旋体、对映异构体、非对映异构体、互变异构体及其混合物的盐、溶剂化物(包括水合物)和溶剂化的盐。
本发明包括所有可能的对映异构体和非对映异构体以及两种或更多种立体异构体的所有比例的混合物，例如对映异构体和/或非对映异构体的混合物。因此，对映异构体是对映体纯形式(左旋和右旋对映体)、外消旋体形式和两种对映体的所有比例的混合物形式的本发明的主题。在顺式/反式异构的情况下，本发明包括顺式和反式形式，以及这些形式的所有比例的混合物。如果需要，可以通过常规方法例如通过色谱法或结晶法分离混合物，通过使用用于合成的立体化学均匀的起始原料或通过立体选择性合成进行个别立体异构体的制备。任选地，可以在分离立体异构体之前进行衍生化。立体异构体混合物的分离可以在合成通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐的中间步骤中进行，或者可以在最终外消旋产物上进行。可以通过X射线晶体学测定结晶产物或结晶中间体的绝对立体化学，如果需要，可以用含有已知构型的立体异构中心的试剂对结晶产物或结晶中间体进行衍生化。除非指明了这样的外消旋体、对映异构体或非对映异构体的具体异构体、盐、溶剂化物(包括水合物)或溶剂化的盐，否则本发明包括所有此类异构体以及外消旋体、对映体、非对映体及其混合物的盐、溶剂化物(包括水合物)和溶剂化的盐。
术语“化合物”是指化合物，并且在某些实施方案中，在它们稳定的程度上是指其任何水合物或溶剂化物。水合物是与水络合的化合物，而溶剂合物是与溶剂络合的化合物，所述溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。
“稳定的”化合物是可以制备和分离并且其结构和性质在足以使该化合物用于本文所述目的(例如治疗性施用给患者)的时间内保持不变或可以使其基本保持不变的化合物。本发明的化合物限于由通式(I)、通式(II)、通式(III)、通式(IV)、通式(V)、通式(VI)或其药学上可接受的盐涵盖的稳定化合物。
盐
如上所述，本发明的化合物可以药学上可接受的盐的形式使用。本领域技术人员将认识到本发明化合物可形成盐的那些情况。此类化合物的实例在本文中参考可能的盐进行了描述。这样的参考仅用于说明。药学上可接受的盐可以与用于治疗患者的化合物一起使用。但是，非药用盐可用于制备中间体化合物。
术语“药学上可接受的盐”是指具有与母体化合物相似的功效并且在生物学上或其他方面都不是所不希望的(例如对其接受者既无毒也不有害)的盐(包括两性离子等内盐)。因此，本发明的一个实施方案提供了本发明化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，术语“盐”表示以下任一种：与无机酸和/或有机酸形成的酸性盐，以及与无机碱和/或有机碱形成的碱性盐。本发明化合物的盐可以通过本领域普通技术人员已知的方法形成，例如冻干后通过使本发明化合物与一定量(例如等量)的酸或碱在诸如其中盐沉淀的介质中或在水性介质中反应。
示例性的酸加成盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐(“甲磺酸盐”)、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、磷酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(“甲苯磺酸盐”)等。合适的盐包括酸加成盐，其可以例如通过将化合物的溶液与药学上可接受的酸例如盐酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸或苯甲酸的溶液混合而形成。另外，例如P.Stahl et al,Camille G.(eds.),Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge et al,Journal of Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.GouLd,International J.of Pharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson et al,ThePractice of Medicinal Chemistry(1996),Academic Press,New York；和The OrangeBook(Food&Drug Administration,Washington,D.C.on their website)讨论了通常被认为适合由碱性药物化合物形成药学上有用的盐的酸。这些公开内容通过引用并入本文。
示例性的碱性盐包括铵盐、碱金属盐(例如钠、锂和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)、与有机碱(例如有机胺)的盐例如二环己基胺、叔丁基胺、胆碱；和与氨基酸的盐，例如精氨酸、赖氨酸等。碱性含氮基团可以与诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如二甲基、二乙基和二丁基的硫酸酯)、长链卤化物(例如癸基、月桂基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴化物)等试剂进行季铵化。可以将带有酸性部分的化合物与合适的药学上可接受的盐混合以提供例如碱金属盐(例如钠或钾盐)、碱土金属盐(例如钙或镁盐)以及与合适的有机配体形成的盐例如季铵盐。同样，在存在酸(-COOH)或醇基的情况下，可以使用药学上可接受的酯来改变化合物的溶解度或水解特性。
在本发明的范围内，所有这些酸盐和碱盐均是药学上可接受的盐，并且出于本发明的目的，所有酸盐和碱盐均被认为等同于相应化合物的游离形式。
另外，当本发明的化合物同时包含碱性部分例如但不限于脂族伯、仲、叔或环胺、芳族或杂芳基胺、吡啶或咪唑和酸性部分例如但不限于四唑或羧酸，可以形成两性离子(“内盐”)，其包括在本文所用的术语“盐”中。应当理解，本发明的某些化合物可以两性离子的形式存在，即在同一化合物内具有阴离子和阳离子中心并且具有净中性电荷。这样的两性离子包括在本发明内。
化合物的制备方法
在以下方案和实施例中描述了制备通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物和前述化合物的药学上可接受的盐的几种方法。起始原料和中间体购自商业来源、通过已知方法制备或另有说明。在某些情况下，可以改变反应方案步骤的进行顺序以促进反应或避免不希望的反应产物。
在以下方法和方案中，LG表示离去基团，它可以是卤化物或三氟甲磺酸酯基团。方法和方案中包含的变量具有所提供的含义；示例性催化剂在缩写(下文)中定义。
方法1
苯并噻吩二聚体1D和1E及其药学上可接受的盐可以多种方法制备。方案1显示了一种方法。该顺序以烯丙基-苯并噻吩1A开始。与Grubbs催化剂2G的交叉复分解得到烯烃二聚体1B和1C。氢化然后水解得到具有不同链长的二聚体1D和1E。
方案1
Figure BDA0002716024870000711
方法2
方案2中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以适当取代的芳基卤化物2A开始。使用RockPhos Pd G3与包含苯并噻吩(2B)的伯醇交叉偶联，然后水解，得到二聚体2C。
方案2
Figure BDA0002716024870000712
方法3
方案3中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。烷基溴化物苯并噻吩3A和芳基溴化物3B的交叉偶联提供酯腈二聚体3C。用氢氧化钠水溶液水解得到二聚体3D。
方案3
Figure BDA0002716024870000721
方法4
方案4中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。在钯催化剂的存在下，芳基溴化物4a和烷基硼酸酯4B之间的烷基Suzuki反应，然后将酯水解，得到二聚体4C。
方案4
Figure BDA0002716024870000722
方法5
方案5中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。烷基溴化物苯并噻吩5A和芳基溴化物5B的交叉偶联得到二聚体5C。水解得到二聚体5D。类似地，芳基卤化物5E可以与烷基溴化物5F偶联以产生中间体5G。水解得到酸，得到5H。
方案5
Figure BDA0002716024870000723
Figure BDA0002716024870000731
方法6
方案6中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以烷基卤化物6A开始。在碱性条件下用适当取代的苯酚6B取代卤化物，然后水解，得到二聚体6C。类似地，在碱性条件下可以用苯酚6E取代烷基氯化物6D，从而在转化为二酸后得到6F。转化为二酸后，苯酚6G也可用于取代烷基氯化物6D，以提供所需的6H。最后，烷基溴化物6I可以被苯酚6J取代，在转化为二酸后得到6K。
方案6
Figure BDA0002716024870000732
方法7
方案7中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以伯醇7A和苯酚7B之间的Mitsunobu反应开始，在二酯水解后得到7C。或者，可使苯酚7D在Mitsunobu条件下与醇7E反应。随后的皂化得到二酸7F。在将二酯转化为二酸后，苯酚7G也可以用于与7H的Mitsunobu反应，得到7I。
类似地，可以使双酚苯并噻吩7J和适当取代的二醇(7K)经受Mitsnobu条件，得到7L和7M的混合物。水解得到二酸7N和7O的混合物。
方案7
Figure BDA0002716024870000741
方法8
方案8中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以适当取代的芳基溴化物8A开始。在钯催化剂的存在下与烷基胺8B反应，得到烷基氨基二聚体二酯8C。水解得到所需的二酸8D。
方案8
Figure BDA0002716024870000751
方法9
方案9中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以三乙酰氧基硼氢化钠存在下醛9A与氨基氮杂苯并噻吩9B之间的还原胺化开始。将TFA加到粗混合物中，得到所需的二酸9C。
方案9
Figure BDA0002716024870000752
方法10
方案10中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以烷基二卤化物与适当取代的酚苯并噻吩10A的双烷基化开始，从而得到二聚体二酯10B。水解得到所需的二酸10C。类似地，可以在二酯转化为二酸后，用10D将二卤化物二烷基化，得到二酸10E。
方案10
Figure BDA0002716024870000761
方法11
方案11中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以苯胺11B与烷基溴化物11A的烷基化开始，得到11C。二酯的水解得到11D。
方案11
Figure BDA0002716024870000762
方法12
方案12中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以苯酚12B与烷基溴化物12A的烷基化开始，提供12C。选择性碱介导的水解提供了单酸12D。将12D与磺酰胺或硫酰胺偶联，得到12E。酸介导的水解得到12F。
方案12
Figure BDA0002716024870000771
方法13
方案13中详述了另一种制备苯并噻吩二聚体及其药学上可接受的盐的方法。该顺序以苯酚13B与烷基溴化物13A的烷基化开始，提供13C。水解二酯，然后酸介导的甲氧基甲基乙缩醛(MOM)保护的苯酚脱保护，得到13D。
方案13
Figure BDA0002716024870000772
使用方法
本文所述具有治疗用途的化合物，例如通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物、实施例1至190的化合物以及上述化合物的药学上可接受的盐，可以施用于患者以诱导免疫应答、诱导STING依赖性细胞因子的产生和/或诱导抗肿瘤活性。术语“施用”及其变体(例如“给药”化合物)是指将化合物提供给需要治疗的个体。当化合物与一种或多种其他活性剂(例如可用于治疗HCV感染的抗病毒药或用于治疗癌症的抗肿瘤药)组合提供时，“施用”及其变体均应理解为包括同时提供和顺序提供该化合物或盐和其他药剂。
本文公开的化合物可以是STING激动剂。这些化合物可潜在地用于治疗疾病或病症，包括但不限于细胞增殖性疾病。细胞增殖性疾病包括但不限于癌症、良性乳头状瘤病、妊娠滋养细胞疾病和良性肿瘤疾病，例如皮肤乳头瘤(疣)和生殖器乳头瘤。
在具体的实施方案中，待治疗的疾病或病症是细胞增殖性疾病。在某些实施方案中，细胞增殖性疾病是癌症。在具体的实施方案中，癌症选自：脑和脊柱癌、头颈癌、白血病和血液癌、皮肤癌、生殖系统癌、胃肠系统癌、肝和胆管癌、肾和膀胱癌、骨癌、肺癌、恶性间皮瘤、肉瘤、淋巴瘤、腺癌、甲状腺癌、心脏肿瘤、生殖细胞肿瘤、恶性神经内分泌(类癌)肿瘤、中线道癌和未知原发性癌症(即，发现有转移癌但原始癌点未知的癌症)。在具体的实施方案中，癌症存在于成年患者中。在另外的实施方案中，癌症存在于小儿患者中。在具体的实施方案中，癌症与AIDS有关。
在具体的实施方案中，癌症选自脑和脊柱癌。在具体的实施方案中，癌症选自：间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和感觉神经母细胞瘤(也称为嗅觉母细胞瘤)。在具体的实施方案中，脑癌选自：星形细胞瘤(例如，细胞性星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、多形黄体星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、巨细胞胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤、原发性成年胶质母细胞瘤和原发性小儿胶质母细胞瘤)、上颌神经瘤(例如，少突胶质细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤)、少食性星形细胞肿瘤(如，少食性星形胶质细胞瘤和间变性卵泡星形细胞瘤)、室管膜瘤(例如黏膜乳头状室管膜瘤和间变性室管膜瘤)；髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、非典型脑膜瘤、间变性脑膜瘤、垂体腺瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑动脉瘤/恶性神经胶质瘤、视路径和下丘脑神经胶质瘤以及原发性中枢神经系统淋巴瘤。在这些实施方案的具体实例中，脑癌选自：神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、副神经节瘤和上尿道上皮原始神经外胚层肿瘤(sPNET)。
在具体的实施方案中，癌症选自：头颈癌、包括鼻咽癌、鼻腔和鼻旁窦癌、咽下癌、口腔癌(例如鳞状细胞癌、淋巴瘤和肉瘤)、唇癌、口咽癌、唾液腺肿瘤、喉癌(例如，喉鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤)以及眼部癌症或眼癌。在具体的实施方案中，眼癌选自眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。
在具体的实施方案中，所述癌症选自白血病和血液癌。在具体的实施方案中，所述癌症选自：骨髓增生性肿瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生性肿瘤(MPN)、MPN后AML、MDS后AML、del(5q)相关的高风险MDS或AML、母细胞期慢性粒细胞性白血病、血管免疫母细胞性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、朗格兰细胞组织细胞增生症、毛细胞白血病和浆细胞瘤(包括浆细胞瘤和多发性骨髓瘤)。本文提及的白血病可以是急性的或慢性的。
在具体的实施方案中，所述癌症选自皮肤癌。在具体的实施方案中，皮肤癌选自黑素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自生殖系统的癌症。在具体的实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌、宫颈癌、阴道癌、卵巢癌、前列腺癌、阴茎癌和睾丸癌。在这些实施方案的具体实例中，癌症是乳腺癌，其选自导管癌和叶状肿瘤。在这些实施方案的具体实例中，乳腺癌可以是男性乳腺癌或女性乳腺癌。在这些实施方案的具体实例中，所述癌症是子宫颈癌，其选自鳞状细胞癌和腺癌。在这些实施方案的具体实例中，所述癌症是卵巢癌，其选自上皮癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自胃肠系统的癌症。在具体的实施方案中，所述癌症选自：食道癌、胃癌(也称为胃部癌)、胃肠道类癌肿瘤、胰腺癌、胆囊癌、结肠直肠癌和肛门癌。在这些实施方案的实例中，所述癌症选自：食管鳞状细胞癌、食道腺癌、胃腺癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胃淋巴瘤、胃肠道淋巴瘤、实体乳头状胰腺肿瘤、胰母细胞瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺癌(包括腺泡细胞癌和导管腺癌)、胆囊腺癌、结直肠腺癌和肛门鳞状细胞癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自肝癌和胆管癌。在具体的实施方案中，癌症是肝癌(也称为肝细胞癌)。在具体的实施方案中，癌症是胆管癌(也称为胆管细胞癌)。在这些实施方案的实例中，胆管癌选自肝内胆管癌和肝外胆管癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自肾癌和膀胱癌。在具体的实施方案中，所述癌症是肾癌，其选自：肾细胞癌、Wilms肿瘤和移行细胞癌。在具体的实施方案中，所述癌症是膀胱癌，其选自：输尿管癌(移行细胞癌)、鳞状细胞癌和腺癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自骨癌。在具体的实施方案中，骨癌选自：骨肉瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、脊索瘤(沿脊柱的骨癌)。
在具体的实施方案中，所述癌症选自肺癌。在具体的实施方案中，肺癌选自：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、支气管肿瘤和胸膜肺母细胞瘤。
在具体的实施方案中，所述癌症选自恶性间皮瘤。在具体的实施方案中，所述癌症选自上皮间皮瘤和肉瘤样瘤。
在具体的实施方案中，所述癌症选自肉瘤。在具体的实施方案中，肉瘤选自：中央软骨肉瘤、中央和骨膜软骨瘤、纤维肉瘤、腱鞘的透明细胞肉瘤和卡波西氏肉瘤。
在具体的实施方案中，所述癌症选自淋巴瘤。在具体的实施方案中，所述癌症选自：霍奇金淋巴瘤(例如Reed-Stemberg细胞)、非霍奇金淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤。
在具体的实施方案中，所述癌症选自腺癌。在具体的实施方案中，所述癌症选自：肾上腺皮质癌(也称为肾上腺皮质癌或肾上腺皮质癌)、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、垂体瘤、胸腺瘤和胸腺癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自甲状腺癌。在具体的实施方案中，甲状腺癌选自：甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌和滤泡性甲状腺癌。
在具体的实施方案中，所述癌症选自生殖细胞肿瘤。在具体的实施方案中，所述癌症选自：恶性颅外生殖细胞肿瘤和恶性性腺外生殖细胞肿瘤。在这些实施方案的具体实例中，恶性性腺外生殖细胞肿瘤选自非精原细胞瘤和精原细胞瘤。
在具体的实施方案中，癌症选自心脏肿瘤。在具体的实施方案中，心脏肿瘤选自：恶性畸胎瘤、淋巴瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、软骨肉瘤、婴儿纤维肉瘤和滑膜肉瘤。
在具体的实施方案中，细胞增殖性疾病选自：良性乳头瘤病、良性肿瘤性疾病和妊娠滋养细胞性疾病。在具体的实施方案中，良性肿瘤性疾病选自：皮肤乳头状瘤(疣)和生殖器乳头状瘤。在具体的实施方案中，妊娠滋养细胞疾病选自：包虫囊状的痣和妊娠滋养细胞赘生物(例如浸润性痣、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤和上皮样滋养细胞肿瘤)。
如本文所用，术语“治疗”是指其中可能存在减缓、中断、阻止、控制或停止本文所述疾病或病症的进展的所有过程。该术语不一定表示完全消除所有疾病或病症的症状。
术语“化合物的施用”和/或“给予”应理解为包括向患者提供本文所述的化合物或其药学上可接受的盐以及前述化合物的组合物。
施用于患者的化合物的量是足以在患者中诱导免疫应答和/或诱导STING依赖性I型干扰素产生的量。在一个实施方案中，化合物的量可以是“有效量”或“治疗有效量”，使得以分别引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学(即意欲治疗)反应的量施用主题化合物。有效量不一定包括与化合物的施用有关的毒性和安全性的考虑。
化合物的有效量将随所选择的具体化合物(例如，考虑到该化合物的效力、功效和/或半衰期)、选择的施用途径、所治疗的疾病、所治疗疾病的严重程度、被治疗患者的年龄、大小、体重和身体状况、被治疗患者的病史、治疗的持续时间、同步疗法的性质、理想的治疗效果和类似因素而变化，并且可以由技术人员常规确定。
本文公开的化合物可以通过任何合适的途径施用，包括口服和肠胃外施用。肠胃外施用通常通过注射或输注进行，包括静脉内、肌内和皮下注射或输注。
本文公开的化合物可以施用一次或根据给药方案施用，其中在给定的时间段内以不同的时间间隔施用多个剂量。例如，可以每天一次、两次、三次或四次施用剂量。可以施用剂量直至达到所需的治疗效果或无限期地维持所需的治疗效果。本文公开的化合物的合适的给药方案取决于该化合物的药代动力学性质，例如吸收、分布和半衰期，其可以由技术人员确定。另外，对于本文公开的化合物，合适的给药方案(包括施用此类方案的持续时间)取决于所治疗的疾病或状况、该疾病或状况的严重程度、所治疗患者的年龄和身体状况、被治疗患者的病史、同步疗法的性质、所需的治疗效果以及在技术人员的知识和专长内的类似因素。这些技术人员将进一步理解，鉴于个体患者对给药方案的反应或随着个体患者的需求随时间变化，可能需要调整合适的给药方案。典型的每日剂量可以根据所选的具体给药途径而变化。
本公开的一个实施方案提供了一种治疗细胞增殖性疾病的方法，该方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物和上述化合物的药学上可接受的盐。在实施方案中，待治疗的疾病或病症是细胞增殖性疾病。在这些实施方案的方面，细胞增殖性疾病是癌症。在这些实施方案的其他方面，所述癌症选自：脑和脊柱癌、头颈癌、白血病和血液癌、皮肤癌、生殖系统癌、胃肠系统癌、肝和胆管癌、肾脏和膀胱癌、骨癌、肺癌、恶性间皮瘤、肉瘤、淋巴瘤、腺癌、甲状腺癌、心脏肿瘤、生殖细胞肿瘤、恶性神经内分泌(类癌)肿瘤、中线道癌和未知原发性癌症。
在一个实施方案中，本文公开了通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐在治疗中的用途。该化合物可用于在患者(例如需要这种抑制的哺乳动物)中诱导免疫应答和/或诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，所述方法包括向患者施用有效量的化合物。
在一个实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含至少一种通式(I)的化合物、至少一种通式(II)的化合物、至少一种通式(III)的化合物、至少一种通式(IV)的化合物、至少一种通式(V)的化合物、至少一种通式(VI)的化合物或前述化合物的至少一种药学上可接受的盐，其用于潜在的治疗以诱导免疫应答和/或诱导STING依赖性I型干扰素的产生。
本文公开的一个实施方案是通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐在制备用于诱导免疫应答和/或诱导STING依赖性I型干扰素产生的药物中的用途。在实施方案中，待治疗的疾病或病症是细胞增殖性疾病。在这些实施方案的方面，细胞增殖性疾病是癌症。在这些实施方案的其他方面，所述癌症选自：脑和脊柱癌、头颈癌、白血病和血液癌、皮肤癌、生殖系统癌、胃肠系统癌、肝和胆管癌、肾和膀胱癌、骨癌、肺癌、恶性间皮瘤、肉瘤、淋巴瘤、腺癌、甲状腺癌症、心脏肿瘤、生殖细胞肿瘤、恶性神经内分泌(类癌)肿瘤、中线道癌和未知原发癌。
组合物
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定化合物的剂型以及直接或间接地由指定量的指定化合物的组合产生的任何剂型。该术语旨在涵盖包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的剂型。因此，本发明的组合物包括通过将本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成的任何组合物。“药学上可接受的”是指载体或赋形剂与本文公开的化合物和组合物的其他成分相容。
为了诱导免疫应答和/或诱导STING依赖性I型干扰素产生，通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐可以通过使活性剂与活性剂的作用部位接触的方式施用。所述化合物可以通过可与药物结合使用的常规方式施用，可以作为单独的治疗剂或与治疗剂组合。化合物可以单独给药，但是通常与根据所选给药途径和标准药学实践选择的药物载体一起给药。
在一个实施方案中，本文公开了一种组合物，其包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述组合物可以以散装形式制备和包装，其中可以提取治疗有效量的本公开的所述化合物，然后例如与粉末或糖浆一起给予患者。或者，可以将组合物制备并包装成单位剂型，其中每个物理上离散的单位包含治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐。
本文公开的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂通常将被配制成适合通过所需给药途径对患者给药的剂型。例如，剂型包括适于(1)口服给药的剂型，例如片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、锭剂、散剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、小袋剂和扁囊剂；(2)肠胃外给药的剂型，例如无菌溶液、混悬液和用于重构的散剂。合适的药学上可接受的载体或赋形剂将根据所选的具体剂型而变化。另外，可以出于其在组合物中可以发挥的具体功能选择合适的药学上可接受的载体或赋形剂。例如，可以出于其有助于产生均匀剂型的能力选择某些药学上可接受的载体或赋形剂。可以出于其有助于产生稳定剂型的能力选择某些药学上可接受的载体或赋形剂。可以出于其一旦施用于患者就有助于将本文公开的化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或另一部分的能力选择某些药学上可接受的载体或赋形剂。可以出于其增强患者的依从性的能力选择某些药学上可接受的载体或赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂：稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、风味掩盖剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。
技术人员具有本领域的知识和技能，以选择合适量的合适的药学上可接受的载体和赋形剂用于本公开的组合物中。此外，还有许多资源可提供给技术人员，其描述了药学上可接受的载体和赋形剂并且可以用于选择合适的药学上可接受的载体和赋形剂。例子包括REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Company),THE HANDBOOK OF PHARMACEUTICALADDITIVES(Gower Publishing Limited)和THE HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(the AmericanPharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)。
使用本领域技术人员已知的技术和方法制备本公开的组合物。在本领域中常用的一些方法在《雷明顿药物科学》(Mack Publishing Company)中有所描述。
在一个实施方案中，本公开涉及固体口服剂型，例如片剂或胶囊剂，其包含治疗有效量的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐以及稀释剂或填充剂。合适的稀释剂和填充剂包括乳糖、蔗糖、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、淀粉(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和预凝胶化淀粉)、纤维素及其衍生物(例如微晶纤维素)、硫酸钙和磷酸氢钙。固体口服剂型可进一步包含粘合剂。合适的粘合剂包括淀粉(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和预凝胶化淀粉)明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、黄芪胶、瓜尔豆胶、聚维酮和纤维素及其衍生物(例如微晶纤维素)。固体口服剂型可以进一步包含崩解剂。合适的崩解剂包括交聚维酮、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基糖、海藻酸和羧甲基纤维素钠。固体口服剂型可以进一步包含润滑剂。合适的润滑剂包括硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石粉。
适当时，口服给药的剂量单位制剂可以是微囊化的。该组合物还可以制备成延长或维持释放，例如通过将颗粒材料涂覆或包埋在聚合物、蜡等中。
本文公开的化合物也可以与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，本公开的化合物可以与用于实现以下目的的一类可生物降解的聚合物偶联：药物的受控释放，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。
在一个实施方案中，本公开涉及液体口服剂型。口服液如溶液、糖浆和酏剂，可以以剂量单位形式制备，以使给定量包含预定量的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐。糖浆可通过将本发明的化合物溶解在适当调味的水溶液中来制备；酏剂是通过使用无毒的酒精媒介制备的。可以通过将本文公开的化合物分散在无毒媒介中来配制混悬剂。也可以加入增溶剂和乳化剂(例如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、风味添加剂(例如薄荷油)或其他天然甜味剂或糖精或其他人造甜味剂等。
在一个实施方案中，本公开涉及肠胃外给药用组合物。适于肠胃外给药的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，该溶质可使制剂与预期接受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要就在使用前添加无菌液体载体例如注射水。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
组合
通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物和/或前述的药学上可接受的盐可以与一种或多种另外的活性剂组合施用。在实施方案中，一种或多种通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的一种或多种药学上可接受的盐与一种或多种另外的活性剂可以共同施用。另外的活性剂可以与通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐以单一剂型施用，或者另外的活性剂可以与包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐以分开的剂型施用。
在适当的情况下，可以以药学上可接受的盐的形式提供另外的活性剂。
另外的活性剂可以是选自下组的一种或多种试剂：STING激动剂化合物、抗病毒化合物、抗原、佐剂、抗癌剂、CTLA-4、LAG-3和PD-1途径拮抗剂、脂质、脂质体、肽、细胞毒性剂、化学治疗剂、免疫调节细胞系、检查点抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、平滑抑制剂、烷基化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药物、类维生素A和免疫调节剂，免疫调节剂包括但不限于抗癌疫苗。将理解的是，此类另外的活性剂可以作为药学上可接受的盐提供。将理解，以上其他活性剂的描述可以是重叠的。还应理解，对治疗组合进行优化，并且应理解，使用通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述化合物的药学上可接受的盐以及一种或多种其他活性剂的最佳组合将根据患者的具体需求确定。
本文公开的化合物可以与一种或多种其他活性剂组合使用，所述活性剂包括但不限于用于预防、治疗、控制、改善或降低具体疾病或病症(例如细胞增殖性疾病)的风险的其他抗癌剂。在一个实施方案中，本文公开的化合物与一种或多种其他抗癌剂组合用于预防、治疗、控制、改善或降低本文公开的化合物可用于的具体疾病或病症的风险。此类其他活性剂可以通过通常与本发明化合物同时或相继使用的途径和一定量施用。
当本文公开的化合物与一种或多种其他活性剂同时使用时，预期除了本文公开的化合物之外还包含此类其他活性剂的组合物。因此，本公开的组合物包括除了本文公开的化合物之外还包含一种或多种其他活性成分的那些。本文公开的化合物可以与一种或多种其他活性剂同时或在其之前或之后施用。本文公开的化合物可以通过与其他药剂相同或不同的给药途径分开给药，或在相同的药物组合物中一起给药。
作为组合提供的产品可以包括组合物，其包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的其药学上可接受的盐和一种或多种其他活性剂一起在同一药物组合物中；或者可以包括包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的其药学上可接受的盐的组合物和包含一种或多种单独形式的其他活性剂的组合物，单独形式例如以试剂盒的形式或设计为能够同时进行或按单独的给药时间表进行单独给药的任何形式。
可以改变通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的其药学上可接受的盐与第二活性剂的重量比，并且将取决于每种活性剂的治疗有效剂量。通常，将使用每种的治疗有效剂量。本文公开的化合物和其他活性剂的组合通常也将在上述范围内，但是在每种情况下，应使用治疗有效剂量的每种活性剂。在这样的组合中，本文公开的化合物和其他活性剂可以分开或联合施用。另外，一种成分的施用可以在其他药剂的施用之前、同时或之后。
在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐以及至少一种其他活性剂作为组合制剂用于在治疗中同时、分别或依次使用。在一个实施方案中，所述治疗是细胞增殖性疾病如癌症的治疗。
在一个实施方案中，本公开提供了一种试剂盒，其包含两种或更多种单独的药物组合物，其中至少一种包含通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，试剂盒包括用于分开保存所述组合物的装置，例如容器、分开的瓶子或分开的箔包装。这种试剂盒的一个例子是泡罩包装，通常用于片剂、胶囊等的包装。
本公开的试剂盒可用于施用不同剂型，例如口服和肠胃外，用于以不同剂量间隔施用分开的组合物，或用于使分开的组合物彼此滴定。为了有助于依从性，本公开的试剂盒通常包含给药指导。
本文公开了通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐用于治疗细胞增殖性疾病的用途，其中所述药物被制备用于与另一种活性剂一起施用。本公开还提供了另一种活性剂在治疗细胞增殖性疾病中的用途，其中所述药物与通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐施用。
本公开还提供了通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐用于治疗细胞增殖性疾病的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用另一种活性剂治疗。本公开还提供了另一种活性剂在治疗细胞增殖性疾病中的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述的药学上可接受的盐治疗。可以在施用本文公开的化合物后一周、几周、一个月或几个月后施用第二种药物。
可以与本文公开的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐组合使用的STING激动剂化合物包括但不限于环状二核苷酸化合物，例如在国际专利申请公开号WO2014093936、WO2014189805、WO2014189806、WO2015185565、W02016120305、WO2016096174、WO2016096577、WO2017027645、WO2017027646、WO2017075477、WO2017093933和WO2018009466中公开的。
可以与本文公开的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐组合使用的抗病毒化合物包括乙型肝炎病毒(HBV)抑制剂、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂、HCV聚合酶抑制剂、HCV NS4A抑制剂、HCV NS5A抑制剂、HCV NS5b抑制剂和人类免疫缺陷病毒(HIV)抑制剂。适当时，此类抗病毒化合物可以药学上可接受的盐的形式提供。
可以与通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐组合使用的抗原和佐剂包括B7共刺激分子、白介素-2、干扰素-y、GM-CSF、CTLA-4拮抗剂、OX-40/0X-40配体、CD40/CD40配体、沙格司亭、左旋糖胺、牛痘病毒、Bacille Calmette-Guerin(BCG)、脂质体、明矾、弗氏完全或不完全佐剂、排毒的内毒素、矿物油、表面活性物质例如卵磷脂、普卢尼克多元醇、聚阴离子、肽和油或烃乳液。可以加入佐剂例如氢氧化铝或磷酸铝以增加疫苗触发、增强或延长免疫反应的能力。与上述组合物单独或组合使用的其他材料例如细胞因子、趋化因子和细菌核酸序列例如Cμg、toll样受体(TLR)9激动剂以及TLR 2、TLR 4、TLR5、TLR7、TLR 8、TLR9的其他激动剂(包括脂蛋白、LPS、单磷脂A、脂磷壁酸、咪喹莫特、雷西莫德)和另外的视黄酸诱导型基因I(RIG-I)激动剂如聚I:C也可以是潜在的佐剂。这些抗原和佐剂可以适当地以药学上可接受的盐的形式提供。
CLTA-4和PD-1途径是免疫应答的重要负调节剂。活化的T细胞上调CTLA-4，CTLA-4与抗原呈递细胞结合并抑制T细胞刺激、IL-2基因表达和T细胞增殖。在结肠癌、转移性前列腺癌和转移性黑色素瘤的小鼠模型中已观察到这些抗肿瘤作用。PD-1结合活性T细胞并抑制T细胞活化；PD-1拮抗剂也已显示出抗肿瘤作用。可以与本文公开通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐组合使用的CTLA-4和PD-1途径拮抗剂包括伊匹木单抗、曲美单抗、尼古鲁单抗、派姆单抗、CT-011、AMP-224和MDX-1106。
“PD-1拮抗剂”或“PD-1途径拮抗剂”是指任何阻断癌细胞表达的PD-L1与免疫细胞(T细胞、B-细胞或NKT细胞)表达的PD-L的结合、也优选阻断癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1的结合的化合物或生物分子。用于PD-1的替代名称或同义词及其配体包括：用于PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；用于PD-L1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；用于PD-L2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在其中正在治疗人类个体的本公开的任何治疗方法、药物和用途中，PD-1拮抗剂阻断人PD-1与人PD-1的结合，并且优选同时阻断人PD-L1和PD-L2与人PD-1的结合。人的PD-1氨基酸序列可以在NCBI位点：NP_005009中找到。人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分别在NCBI位点:NP_054862和NP_0795l5中找到。
可用于本公开的任何治疗方法、药物和用途的PD-1拮抗剂包括单克隆抗体(mAh)或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1或PD-L1，并且优选地特异性结合PD-1或PD-L1。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自下组：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，并且在优选的实施方案中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，抗原结合片段选自下组：Fab、Fab'-SH、F(ab')2、scFv和Fv片段。
在美国专利号US7488802、US7521051、US8008449、US8354509和US8168757、PCT国际专利申请公开号WO2004/004771、WO2004/072286和WO2004/056875以及美国专利申请公开号US2011/0271358中描述了与人PD-1结合并可用于本公开的治疗方法、药物和用途中的mAb的例子。
在PCT国际专利申请号WO2013/019906和WO2010/077634A1以及美国专利号US8383796中描述了与人PD-L1结合并且可用于本发明的治疗方法、药物和用途的mAb的实例。在本公开的治疗方法、药物和用途中用作PD-1拮抗剂的特异性抗人PD-L1 mAb包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C和WO2013/019906的分别包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:21的重链和轻链可变区的抗体。
可用于本公开的任何治疗方法、药物和用途中的其他PD-1拮抗剂包括特异性结合PD-1或PD-L1、并且优选特异性结合人PD-1或PD的免疫粘附剂，例如，包含与恒定区如免疫球蛋白分子的Fc区融合的PD-L 1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的融合蛋白。特异性结合PD-1的免疫粘附分子的实例在PCT国际专利申请公开号WO2010/027827和WO2011/066342中描述。在本公开的治疗方法、药物和用途中用作PD-1拮抗剂的特异性融合蛋白包括AMP-224(也称为B7-DCIg)，其是PD-L2-FC融合蛋白并与人结合PD-1。
本公开进一步涉及一种治疗人类患者中癌症的方法，该方法包括向患者施用本文公开的化合物(即通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或前述药学上可接受的盐)和PD-1拮抗剂。本公开的化合物和PD-1拮抗剂可以同时或顺序给药。
在具体的实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在替代实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是派姆单抗(KEYTRUDATM,Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)、纳武单抗(OPDIVOTM,Bristol-Myers Squibb Company,Princeton,NJ,USA)、西米普利单抗(LIBTAYOTM,Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY,USA)、阿特珠单抗(TECENTRIQTM,Genentech,San Francisco,CA,USA)、度伐单抗(IMFINZITM,AstraZeneca PharmaceuticalsLP,Wilmington,DE)或avelμMab(BAVENCIOTM,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是派姆单抗。在具体的实施方案中，该方法包括大约每三周向患者施用200mg的派姆单抗。在进一步的子实施方案中，该方法包括大约每六周向患者施用400mg派姆单抗。
在进一步的子实施方案中，该方法包括大约每三周向患者施用2mg/kg的派姆单抗。在具体的子实施方案中，患者是儿科患者。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是纳武单抗。在具体的子实施方案中，该方法包括大约每两周向患者施用240mg的纳武单抗。在其他子实施方案中，该方法包括大约每四周向患者施用480mg的纳武单抗。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是西米普利单抗。在具体的实施方案中，该方法包括大约每3周向患者施用350mg西米普利单抗。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是阿特珠单抗。在具体的子实施方案中，该方法包括大约每三周向患者施用1200mg阿特珠单抗。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是度伐单抗。在具体的子实施方案中，该方法包括大约每两周向患者施用10mg/kg的度伐单抗。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是avelμMab。在具体的子实施方案中，该方法包括大约每两周向患者施用800mg的avelμMab。
可与通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或上述化合物的药学上可接受的盐组合使用的细胞毒剂的实例包括但不限于三氧化二砷(以商品名
Figure BDA0002716024870000941
销售)、天冬酰胺酶(也称为L-天冬酰胺酶和欧文氏菌L-天冬酰胺酶，以商品名
Figure BDA0002716024870000942
和
Figure BDA0002716024870000943
销售)。
可与本文公开的通式(I)的化合物、通式(II)的化合物、通式(III)的化合物、通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐组合使用的化学治疗剂包括乙酸阿比特龙酯、六甲蜜胺、脱水长春碱、瑞奥西汀、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BMS184476、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、博来霉素、N,N-二甲基-L-戊基-L-戊基-N-甲基-L-戊基-L-脯氨酰基-1-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、恶病质素、西马多丁、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、3',4'-二脱氢-4'脱氧-8'-norvin-caleukoblastine、多西紫杉醇、多西他赛、环磷酰胺、卡铂、卡莫STING、顺铂、隐藻霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素、达诺罗宁、地西他滨尾海兔素、阿霉素(阿霉素)、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、非那雄胺、氟他胺、羟基脲和羟基脲紫杉烷、异环磷酰胺、利拉唑、氯尼达明、洛莫司汀(CCNU)、MDV3100、甲乙胺(氮芥)、美法仑、米沃斯布乙乙磺酸盐、根瘤菌素、sertenef、链脲菌素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、尼鲁米特、纳武单抗、奥纳司酮、紫杉酚、派姆单抗、泼尼莫司汀、甲基苄肼、RPR109881、磷酸Stramustine、他莫昔芬、他索纳明、紫杉醇、维甲酸、长春碱、长春新碱、硫酸长春地辛和长春氟宁。此类化学治疗剂可以适当地以药学上可接受的盐的形式提供。
血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂的实例包括但不限于：贝伐单抗(以商标AVASTIN出售)、阿昔替尼(在PCT国际专利公开号W001/002369中描述)、丙氨酸布立尼布((S)-((R)-1-((4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,l-f][l,2,4]三嗪-6-基氧基)丙烷-2-基)2-氨基丙酸酯，也称为BMS-582664)、莫替沙尼(N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[((4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺,并在PCT国际专利申请公开号W002/068470中进行了描述)、帕西肽(也称为SO 230，并在PCT国际专利公开号W002/010192中进行了描述)和索拉非尼(以商品名NEXAVAR出售)。在适当的情况下，此类抑制剂可以药学上可接受的盐的形式提供。
拓扑异构酶II抑制剂的例子包括但不限于：依托泊苷(也称为VP-16和依托泊苷磷酸酯，以商品名TOPOSAR、VEPESID和ETOPOPHOS出售)和替尼泊苷(也称为VM-26，以商品名VμMON出售)。在适当的情况下，此类抑制剂可以药学上可接受的盐的形式提供。
烷基化剂的实例包括但不限于：5-氮杂胞苷(以商品名VIDAZA出售)、地西他滨(以商品名DECOGEN出售)、替莫唑胺(以商品名TEMCAD、TEMODAR和TEMODAL出售)、放线菌素(也称为放线菌素D，以商品名COSMEGEN出售)、美法仑(也称为L-PAM、L-肌溶素和苯丙氨酸芥末，以商品名ALKERAN出售)、六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM)，以商品名HEXALEN出售)、卡莫司汀(以商品名BCNU出售)、苯达莫司汀(以商品名TREANDA出售)、白消安(以商品名
Figure BDA0002716024870000961
和
Figure BDA0002716024870000962
出售)、卡铂(以商品名
Figure BDA0002716024870000963
出售)、洛莫司汀(也称为CCNU，以商品名
Figure BDA0002716024870000964
出售)、顺铂(也称为CDDP，以商品名
Figure BDA0002716024870000965
和
Figure BDA0002716024870000966
-AQ出售)、苯丁酸氮芥(以商品名
Figure BDA0002716024870000967
出售)、环磷酰胺(以商品名
Figure BDA0002716024870000968
和
Figure BDA0002716024870000969
出售)、达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，以商品名
Figure BDA00027160248700009610
出售)、六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，以商品名
Figure BDA00027160248700009611
销售)、异环磷酰胺(以商品名
Figure BDA00027160248700009612
销售)、丙卡巴嗪(以商品名
Figure BDA00027160248700009613
出售)、甲乙胺(也称为氮芥末、芥末和盐酸甲基氯乙胺，以商品名
Figure BDA00027160248700009614
出售)、链脲菌素(以商品名
Figure BDA00027160248700009615
出售)、噻替帕(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，以商品名
Figure BDA00027160248700009616
出售)。在适当的情况下，此类烷基化剂可以药学上可接受的盐的形式提供。
抗肿瘤抗生素的实例包括但不限于：阿霉素(以商品名
Figure BDA00027160248700009617
和
Figure BDA00027160248700009618
出售)、博来霉素(以商品名
Figure BDA00027160248700009619
Figure BDA00027160248700009620
出售)、柔红霉素(也称为盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸鲁比霉素，以商品名
Figure BDA00027160248700009621
出售)、柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，以商品名
Figure BDA00027160248700009622
出售)、米托蒽醌(也称为DHAD，以商品名
Figure BDA00027160248700009623
出售)、表柔比星(以商品名ELLENCETM出售)、伊达比星(以商品名
Figure BDA00027160248700009624
IDAMYCIN
Figure BDA00027160248700009625
出售)和丝裂霉素C(以商品名
Figure BDA00027160248700009626
出售)。适当地，此类抗肿瘤抗生素可以以药学上可接受的盐的形式提供。
抗代谢物的实例包括但不限于：克拉比林(2-氯脱氧腺苷，以商品名
Figure BDA00027160248700009627
出售)、5-氟尿嘧啶(以商品名
Figure BDA00027160248700009628
出售)、6-硫鸟嘌呤(以商品名
Figure BDA00027160248700009629
出售)、培美曲塞(以商品名
Figure BDA00027160248700009630
出售)、阿糖胞苷(也称为阿拉伯糖基胞嘧啶(Ara-C)，以商品名
Figure BDA00027160248700009631
出售)、阿糖胞苷阿糖脂(也称为LiposomalAra-C，以商品名DEPOCYT TM出售))、地西他滨(以商品名
Figure BDA00027160248700009632
出售)、羟基脲和(以商品名
Figure BDA0002716024870000971
DROXIATM和MYLOCELTM出售)、氟达拉滨(以商品名
Figure BDA0002716024870000972
出售)、氟尿苷(以商品名
Figure BDA0002716024870000973
出售)、克拉屈滨(又称为2-氯脱氧腺苷(2-CdA)，以商品名LEUSTATINTM出售)、甲氨蝶呤(又称为氨蝶呤、甲氨蝶呤钠(MTX)，以商品名
Figure BDA0002716024870000974
和TREXALLTM出售)以及喷司他丁(以商品名
Figure BDA0002716024870000975
出售)。在适当的情况下，此类抗代谢物可以药学上可接受的盐的形式提供。
类维生素A的实例包括但不限于：阿利维甲酸(以商品名
Figure BDA0002716024870000976
出售)、维甲酸(全反式维甲酸，也称为ATRA，以商品名
Figure BDA0002716024870000977
出售)、异维甲酸(13-c/s-视黄酸，以商品名
Figure BDA0002716024870000978
Figure BDA0002716024870000979
Figure BDA00027160248700009710
和
Figure BDA00027160248700009711
出售)和贝沙罗汀(以商品名
Figure BDA00027160248700009712
出售)。适当时，此类化合物可以药学上可接受的盐的形式提供。
活性：STING生化[3H]cGAMP竞争测定
本文实施例中所述的单个化合物通过以下定义为STING激动剂，(i)与STING蛋白结合，通过在20μM(被测化合物的浓度)时在STING生化[3H]cGAMP竞争检测中氚标记的cGAMP配体与STING蛋白的结合降低至少20％即可证明；和/或(ii)证明在THP1细胞分析中30μM时干扰素产生且具有6％或更高的IFN-b分泌诱导(其中cGAMP在30μM处引起的诱导设为100％)。
化合物结合STING的能力通过使用放射性滤器结合测定法与氚标记的cGAMP配体竞争人类STING受体膜的能力来量化。结合测定法采用获自Hi-Five细胞膜的STING受体，该Hi-Five细胞膜过表达了内部制备的全长HAQ STING，氚标记的cGAMP配体也进行了内部纯化。
以下实验过程详细说明了本公开的具体实施例的制备。实施例的化合物以其中性形式在下面的步骤和表中绘制。在某些情况下，取决于用于最终纯化和/或固有分子特性的方法，将化合物分离为盐。实施例仅出于说明目的，无意以任何方式限制本公开的范围。
实施例
缩写词
2',3'cGAMP,cGAMP2',3'-环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷
18-冠醚-61,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷
Ac乙酰基
ACN、MeCN乙腈
AcOH、HOAc 乙酸
AMP一磷酸腺苷
Aq水性
ATP5'-三磷酸腺苷
BIIC杆状病毒感染的昆虫细胞
Br宽
Bu丁基，C4H9
Cat目录号
CBZ氯碳酸苄酯
CD3OD富氘甲醇，富氘甲醇
CDCl3氘代三氯甲烷，氘代氯仿
CDI羰基二咪唑
cGAMP环GMP-AMP合酶
Ci居里，一种非标准放射性单位；lCi＝3.7xl010Bq，其中Bq是贝可，SI的放射性单位，相当于每秒分解1次(dps)；
C-Phos Pd G3[(2-二环己基膦基-2',6'-双(N,N-二甲基氨基)-1,1'-联苯基)-2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)甲磺酸盐
C-Phos Pd G42-氨基联苯基钯甲磺酸钯CPhos预催化剂(第4代预催化剂)；[(2-二环己基膦基2',6'-双(N,N-二甲基氨基)-1,1'-联苯基)-2-(2'-甲基氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)甲磺酸盐
Cy环己基
d双峰
DBUl,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
DCE1,2-二氯乙烷
DCM,CH2Cl2二氯甲烷
ddd双重态的双重双峰
ddt三重态的双重双峰
DIAD偶氮二羧酸二异丙酯
DIPEAN,N-二异丙基乙胺
DMA二甲基乙酰胺
DMAP4-二甲氨基吡啶
DME二甲醚
DMEAN,N-二甲基乙胺
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DMPU1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-嘧啶酮
DMSO二甲基亚砜
DMTr4,4’-二甲氧基三苯甲基
DMTrCl4,4′-二甲氧基三苯甲基氯
dq四重双峰
EC50半数最大有效浓度，在指定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间产生一半反应的药物、抗体或毒物的浓度
EDC二氯乙烷
Eq当量
ES电子喷雾
Et乙基，C2H5
GMP 5’-单磷酸鸟苷
Grubbs 催化剂2G(1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑啉亚叉基)二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；亚苄基[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑啉亚叉基]二氯(三环己基膦)钌；二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑啉亚叉基](亚苄基)(三环己基膦)钌(II)
GTP 5’-三磷酸鸟苷
h小时
HAQ STING 包含三个突变R71H-G230A-R293Q的常见STING变体(本文使用的DNA构建体：STING(1-379)R71H、G230A、H232R、R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBAC1)
HEPES 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸，一种两性离子有机化学缓冲剂
Hept七重峰
Hex己烷
HPLC 高效液相色谱
IC50半数最大抑制浓度，50％抑制反应或结合所需的药物、抗体或毒物的浓度
Inh 抑制
IPA 异丙醇、CH3CHOHCH3
LAH 氢化铝锂
Lawesson 试剂2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫代二磷烷-2,4-二硫酮
LCMS 液相色谱-质谱
LDA 二异丙基氨基锂
m 多重峰
M 摩尔，摩尔/升
m/z 质荷比
M+H 质子化质量、通过质谱法进行质量测量
Me 甲基、CH3
min 分钟
MOI 感染多重性
MOM-C1 氯甲基甲醚
MP-TsOH 对-甲苯磺酸化大孔聚苯乙烯树脂
n-BuLi 正丁基锂
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
NCS N-氯代琥珀酰亚胺
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
Figure BDA0002716024870001011
过氧一硫酸钾，特别是2KHSO5·KHSO4·K2SO4
Pd/C 钯炭
PdCl2(dppf)-CH2Cl2[l,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)，与二氯甲烷络合
Pd(Ph3P)4 四(三苯基膦)钯(0)
Pd2(dba)3 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
PE 石油醚
pfu 空斑形成单元
Ph3P 三苯基膦
prep-HPLC 制备型高效液相色谱
prep-TLC 制备型薄层液相色谱
PS-TPP 聚合物支撑的三苯基膦
PSI 磅/平方英寸
pTsOH 对甲苯磺酸
py,py 吡啶
q 四重峰
Rac,rac 外消旋的
Rac BINAP Pd G3 2-(2-氨基苯基)苯-1-基甲烷磺酸{1-[2-(二苯基-1-膦基)萘-1-基]萘-2-基}二苯基膦钯
RockPhos Pd G3 [(2-二-叔丁基膦基-3-甲氧基-6-甲基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)-2-(2-氨基联苯基)]钯(II)甲磺酸盐
RP-HPLC 反相高效液相色谱
RPM,rpm 转数/分钟
RT,rt 室温、约25℃
s 单峰
sat 饱和
SFC 超临界流体色谱
t 三重峰
TBAF，nBu4NF 四正丁基氟化铵
TBS,TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
TMS 三甲基甲硅烷基
TR 保留时间
TrisCl 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
v/v 体积/体积
WTSTING 人类中STING的野生型(最丰富)变体(本文使用的DNA构建体：STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8/pBAC1)
X-Phos 2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯基
Xantphos 4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽
λem 发射波长
λex 激发波长
制备1：3-(叔丁氧基)-3-氧代丙酸镁
Figure BDA0002716024870001021
在20℃下将乙醇酸镁(3.57g,31.2mmol)加入到3-(叔丁氧基)-3-氧代丙酸(1.0g,62.4mmol)在THF(100mL)中的混合物中。将反应混合物在Ar下于20℃搅拌18h。然后将反应混合物在减压下浓缩。将残余物减压干燥，得到3-(叔丁氧基)-3-氧代丙酸镁。1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ2.96(s,4H),1.39(s,18H).
制备2：3-(2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-基)-3-氧代丙酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001031
步骤1:3-溴-5,6-二甲氧基吡嗪-2-甲醛
Figure BDA0002716024870001032
在-78℃下，向2,2,6,6-四甲基哌啶(5T2mL,30.mmol)的THF(40mL)溶液中逐滴加入正-BuLi溶液(2.5M在己烷中,1.15mL,28.8mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌10分钟，然后加热至0℃并搅拌20分钟。然后将反应混合物冷却回-78℃，并在5分钟内加入5-溴-2,3-二甲氧基吡嗪(3.00g,13.7mmol)的THF(10mL)溶液。将反应混合物在-78℃搅拌1h，然后用DMF(1.06mL,13.7mmol)淬灭。将反应混合物温热至0℃并再搅拌20分钟。在0℃下加入AcOH(3.0mL)，并将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将混合物用EtOAc(300mL)稀释,然后用H2O(2×150mL)和饱和NaCl水溶液洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的EtOAc洗脱)，得到3-溴-5,6-二甲氧基吡嗪-2-甲醛。LCMS(C7H8BrN2O3)(ES,m/z):247,249[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.19(s,1H),4.17(s,3H),4.14(s,3H).
步骤2：2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001033
在室温下，将2-巯基乙酸叔丁酯(424μL,2.92mmol)和DMF(2.9mL)加入至3-溴-5,6-二甲氧基吡嗪-2-甲醛(650mg,2.63mmol)。然后在室温下将K2CO3(1090mg,7.89mmol)分批加入反应混合物中。将反应混合物加热至80℃并搅拌过夜。然后将反应混合物冷却至室温，用Et2O稀释，并用H2O淬灭。用Et2O萃取反应混合物，并将合并的有机物用饱和NaCl水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的EtOAc洗脱)得到2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸叔丁酯。LCMS(C13H17N2O4S)(ES,m/z):297[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.89(s,1H),4.02(s,3H),3.99(s,3H),1.55(s,9H).
步骤3：2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸
Figure BDA0002716024870001041
在室温下,向2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸叔丁酯(400mg,1.35mmol)在DCM(6.0mL)的搅拌溶液中加入HCl(4.0M的二噁烷溶液，1.7mL,6.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后通过逐滴加入己烷(50mL)稀释并在室温搅拌1h。将反应混合物过滤，并将收集的物质用己烷(2×10mL)洗涤，并在减压下干燥，得到2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸。LCMS(C9H9N2O4S)(ES,m/z):241[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.71(br s,1H),7.90(s,1H),4.03(s,3H),3.99(s,3H).
步骤4：3-(2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-基)-3-氧代丙酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001042
将2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸(80mg,0.33mmol)和CDI(324mg,2.00mmol)在THF(5.5mL)中的混合物在室温下搅拌3h。将双(3-叔丁氧基-3-氧代丙酸)镁(628mg,1.83mmol)加入到混合物中，并将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的(25％EtOH/EtOAc)洗脱)，得到3-(2,3-二甲氧基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-基)-3-氧代丙酸叔丁酯。LCMS(C15H19N2O5S)(ES,m/z):339[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),4.13(s,2H),4.04(s,3H),4.00(s,3H),1.41(s,9H).
制备3：5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001051
步骤1：5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001052
在室温下将K2CO3(1180mg,8.56mmol)添加至3-氯-5,6-二甲氧基吡啶甲醛(575mg,2.86mmol)和2-巯基乙酸叔丁酯(0.456mL,3T4mmol)在DMF(8.3mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至60℃保持3天。将反应混合物冷却至室温，然后用Et2O和H2O稀释。分离有机层，用饱和NaCl水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的EtOAc洗脱)，得到5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸叔丁酯。1HNMR(499MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.84(s,1H),3.93(s,3H),3.87(s,3H),1.54(s,9H).
步骤2：5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001053
在室温下将HCl(4.0M在H2O中，2.lmL，8.4mmol)加入到5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸叔丁酯(493mg,1.67mmol)在DCM(7.4mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后通过滴加己烷(50mL)稀释。将混合物搅拌1小时，然后过滤。将收集的材料用己烷(2×10mL)洗涤，然后在减压下干燥，以提供5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸。LCMS(C10H10NO4S)(ES,m/z):240[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ7.97(s,1H),7.85(s,1H),3.95(s,3H),3.88(s,3H).
制备4：3-(5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-3-氧代丙酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001061
将CDI(508mg,3.13mmol)加入5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸(500mg,2.09mmol)在THF(5mL)的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物加入到包含3-(叔丁氧基)-3-氧代丙酸镁(120mg,3.55mmol)的单独的烧瓶中。将反应混合物用另外的THF(4mL)稀释，并在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物加热至50℃保持1小时。将反应混合物冷却至室温，并用H2O(20mL)稀释。加入柠檬酸三钠二水合物(2g)和EtOAc(50mL)。分离有机层，并用EtOAc萃取水层。合并有机层，用饱和NaCl水溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的EtOAc洗脱)，得到3-(5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-3-氧代丙酸叔丁酯。LCMS(C16H20NO5S)(ES,m/z):338[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.97(s,1H),7.44(s,1H),4.13(s,3H),3.99(s,3H),3.92(s,2H),1.48(s,9H).
制备5：C-Phos Pd G4
Figure BDA0002716024870001062
将(2′-甲基氨基-1,1′-联苯-2-基)甲磺酰氧基钯(II)二聚体(439mg,0.573mmol)和2′-(二环己基膦基)-N2,N2,N6,N6-四甲基-[1,1′-联苯]-2,6-二胺(500mg,1.15mmol)在DCM(6mL)中的混合物在室温下搅拌2h。然后将溶液用Et2O(30mL)稀释。将溶液过滤并在减压下浓缩。然后将残余物在戊烷中制浆，并再次在减压下浓缩，得到C-Phos Pd G4。参见Bruno,N.C.；NiljianskuL,N.；Buchwald,S.L.J.Org.Chem.2014,79,4161.
中间体1：(S)-4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001071
步骤1：5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001072
在N2下在0℃将POCl3(1.17mL,12.5mmol)逐滴加入到5,6-二甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸(1.0g,4.1mmol)在DMF(10.45mL)中的搅拌混合物中。10分钟后，使反应混合物升温至室温。然后将反应混合物加热至100℃并搅拌45分钟。将反应混合物加入冰水(100mL)并搅拌。将混合物过滤，并将收集的材料用水(2×30mL)和己烷(50mL)洗涤。用Et2O(50mL)稀释收集的材料并过滤。将收集的材料溶解在CH2Cl2(60mL)中，并将混合物经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),7.60(s,1H),4.06(s,3H).
步骤2：(S)-4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870001073
将CuI(0.073g,0.38mmol)置于真空下，并用加热枪加热1min。使烧瓶冷却至室温，然后打开至N2。将烧瓶再抽空两次，然后用N2回填。将烧瓶保持在正N2压下，烧瓶附设有有橡胶隔垫和N2入口。将THF(2mL)加入到烧瓶中，并将反应混合物在冰水浴中冷却。在5分钟内将(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)的THF(0.50M,1.68mL,0.84mmol)溶液滴加到反应混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌105分钟。然后在5分钟内滴加5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯(0.200g,0.763mmol)在NMP(3mL)中的混合物。然后将反应混合物在0℃下搅拌3小时。然后将反应混合物加入到乙酸异丙酯(50mL)和柠檬酸钠(20％w/v的水溶液，50mL)的搅拌混合物中。搅拌20分钟后，分离各层，并将水层用乙酸异丙酯(30mL)萃取。合并有机层，用饱和NaCl水溶液(2×50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用己烷中的EtOAc洗脱)，得到(S)-4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H15ClNO4S)(ES,m/z):328[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99(s,1H),7.60(s,1H),4.03(s,3H),3.72(s,3H),3.51(dd,J＝17.2,7.9Hz,1H),3.21-3.12(m,1H),3.06(dd,J＝17.2,5.2Hz,1H),1.32(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体2：4-(5-(3-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001081
步骤1：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩- 2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001082
将4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(1.75g,4.38mmol；纯度81％)和C-Phos Pd G3(0.177g，0.219mmol)加入装有隔垫的螺帽的40mL小瓶中。将小瓶抽真空并用N2回充三次。在搅拌下在N2下将THF(15.7mL)加入到小瓶中。在室温下搅拌所得悬浮液的同时，在搅拌下滴加(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，17.5mL，8.75mmol)。将混合物在室温搅拌18h。然后将反应在EtOAc(75mL)和10％柠檬酸钠水溶液(75mL)之间分配，并剧烈搅拌5min。分离各层，并将水层用EtOAc(20mL)萃取。合并有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至40％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C26H40NaO5SSi)(ES,m/z):515[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),7.62(s,1H),7.24(s,1H),3.92(s,3H),3.67(t,J＝6.3Hz,2H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),2.76(t,J＝7.2Hz,2H),2.72(t,J＝7.2Hz,2H),1.85(p,J＝6.5Hz,2H),1.46(s,9H),0.94(s,9H),0.08(s,6H).
步骤2：4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001091
向4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(1.45g,2.94mmol)在甲醇(5.0mL)的混合物中加入水(5.0mL)和HOAc(5.0mL)。将得到的悬浮液在室温下搅拌18h。将反应在EtOAc和NaCl水溶液之间分配。分离各层，并将水层用EtOAc萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤两次，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗残余物。所得残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C20H26NaO5S)(ES,m/z):401[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),7.64(s,1H),7.26(s,1H),3.94(s,3H),3.68(t,J＝5.5Hz,2H),3.28(t,J＝6.6Hz,2H),2.82(t,J＝7.3Hz,2H),2.72(t,J＝6.6Hz,2H),1.96-1.83(m,2H),1.46(s,9H).
中间体3：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001092
将三苯基膦(0.24g,0.91mmol)加入到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(0.22g,0.57mmol)在THF(2.8mL)的混合物中。将得到的混合物冷却至0℃,并一次性加入NBS(0.15g,0.85mmol)。在0℃下搅拌30分钟后，将反应用饱和AlCl3水溶液和EtOAc稀释。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。然后通过硅胶色谱法纯化得到的产物，得到4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H18BrO4S)(ES,m/z):385,387[M-C4H8]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),7.78(s,1H),7.62(s,1H),3.90(s,3H),3.60-3.49(m,2H),3.30-3.21(m,2H),2.88-2.75(m,2H),2.67-2.56(m,2H),2.18-2.06(m,2H),1.38(s,9H).
中间体4：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001101
步骤1：5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001102
将浓H2SO4(3.0mL,56mmol)加入到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸(5.0g,17mmol)在MeOH(60mL)中的悬浮液中。将反应混合物加热至70℃持续4.5天。然后将混合物冷却至室温并用水稀释。向混合物中加入30％IPA的CHCl3溶液。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),8.09(s,1H),7.83(s,1H),3.95(s,3H),3.88(s,3H).
步骤2：(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)甲醇
Figure BDA0002716024870001103
0℃下将LAH(1.0M的THF溶液，2.8mL，2.8mmol)缓慢加入至5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(0.78g，2.3mmol)的THF(9.0mL)混合物中。40分钟后，将反应混合物用饱和AlCl3水溶液稀释。加入EtOAc,并分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化得到的物质，得到(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)甲醇。LCMS(C10H8BrOS)(ES,m/z):255,257[M-OH]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.01(s,1H),7.69(s,1H),7.14(s,1H),5.69-5.59(m,1H),4.73-4.64(m,2H),3.89(s,3H).
步骤3：5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲醛
Figure BDA0002716024870001111
将二氧化锰(6.3g，73mmol)加入到(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)甲醇(4.0g，15mmol)在DCM(97mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌20h，然后通过CELITE塞过滤。减压浓缩滤液。将所得产物在MeOH中研磨，并将混合物通过玻璃料，以收集5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲醛。LCMS(C10H8BrO2S)(ES,m/z):271,273[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.07(s,1H),8.40(s,1H),8.29(s,1H),7.87(s,1H),3.97(s,3H).
步骤4：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001112
将ACN(0.15mL,2.2mmol)加入到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲醛(0.30g,1.1mmol)、2-异亚丙基丙酮基-2,5,6,7-四氢-吡咯并[2,l-c][1,2,4]三唑-4-鎓氯化物(0.029g,0.11mmol)和K3PO4(0.24g,1.1mmol)的甲苯(2.2mL)悬浮液中。将反应混合物置于氩气下并在室温下搅拌18小时。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈。LCMS(C13H11BrNO2S)(ES,m/z):324,326[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.33-8.22(m,2H),7.84(s,1H),3.96(s,3H),3.59-3.44(m,2H),2.88-2.73(m,2H).
中间体5：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001113
步骤1：5-溴-2-氟-4-甲氧基苯甲醛
Figure BDA0002716024870001121
在0℃下将2-氟-4-甲氧基苯甲醛(9.0g,58mmol)缓慢地(分批)加入到Br2(6.0mL,120mmol)的MeOH(40mL)溶液中。将反应混合物在0℃搅拌2h。在0℃下将NaHSO3(24.3g,234mmol)在H2O(300mL)中的溶液缓慢加入到反应混合物中。然后将得到的悬浮液在0℃下搅拌30分钟。将反应混合物过滤，并将滤液用另外的H2O(3×25mL)洗涤。然后将滤液减压干燥，得到5-溴-2-氟-4-甲氧基苯甲醛。该产物无需纯化即可使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.02(s,1H),7.98(d,J＝7.5Hz,1H),7.26(d,J＝13.0Hz,1H),3.97(s,3H).
步骤2：5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001122
于20℃下在Ar下将K2CO3(19.0g,137mmol)缓慢(分批)加入到5-溴-2-氟-4-甲氧基苯甲醛(10.7g,45.8mmol)和2-巯基乙酸叔丁酯(6.65mL,45.8mmol)在DMF(50mL)中的溶液中。将反应混合物搅拌并加热至100℃保持16小时。然后将反应混合物冷却至室温，并用Et2O(1000mL)稀释。然后将混合物用水(500mL,然后2×250mL)洗涤，合并的水层用Et2O(2×200mL)萃取。然后合并有机层，并用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，以提供5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸叔丁酯。该产物无需纯化即可使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.26(s,1H),7.96(s,1H),7.78(s,1H),3.92(s,3H),1.55(s,9H).
步骤3：5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001123
于20℃下将HCl(56mL，4.0M的1,4-二噁烷溶液，230mmol)加入到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸叔丁酯(15.5g,45.0mmol)在DCM(200mL)中的溶液中。将反应混合物在20℃下搅拌3天。然后通过滴加己烷(500mL)稀释反应混合物。将滴加后所得的悬浮液在室温下再搅拌2小时。过滤反应混合物，并将收集的物质用己烷(2×50mL)洗涤，并在减压下干燥，得到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸，无需纯化即可使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ13.42(s,1H),8.26(s,1H),7.98(s,1H),7.80(s,1H),3.93(s,3H).
步骤4：5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001131
于0℃下在Ar下将DMF(0.049mL,0.63mmol)缓慢(逐滴)加入至5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲酸(6.0g,21mmol)和(COCl)2(5.5mL,63mmol)在THF(100mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌2h，然后温热至室温。将反应混合物在室温下搅拌18h。然后将反应混合物减压浓缩，得到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯。该产物无需纯化即可使用。
步骤5：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001132
于0℃下在Ar下，将(3-乙氧基-3-氧代丙基)溴化锌(II)溶液(13.8mL,0.50M在THF中,6.9mmol)的溶液加入到含有((噻吩-2-羰基)氧基)铜(1.31g,6.87mmol)的烘干烧瓶中。将反应混合物在0℃下在Ar下搅拌20min。然后在0℃下通过插管将5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(1.52g,4.98mmol)在THF(25.0mL)中的氩气脱气溶液加入至反应混合物中；使所得悬浮液温热至室温，搅拌3h。将反应混合物冷却至0℃，并用饱和NH4Cl水溶液(50mL)淬灭。使混合物温热至室温并搅拌10分钟。将混合物过滤，并将滤液用EtOAc(500mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)稀释。分离有机层，用饱和NaCl水溶液(25mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc在DCM中)纯化，得到4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C15H16BrO4S)(ES,m/z):371,373[M+H]+.1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.27(s,1H),8.26(s,1H),7.81(s,1H),4.07-4.02(m,2H),3.94(s,3H),3.35-3.25(m,2H),2.68-2.64(m,2H),1.20-1.14(m,3H).
中间体6：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001141
中间体6可以按照与上述对中间体5概述的方法类似的方法，使用适当的起始原料(如制备所描述的或从市售来源获得)制备。
中间体7：4-(6-甲氧基-5-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丙 基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001142
步骤1：4-(5-烯丙基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001143
向含有4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(5.0g,13mmol)、Pd(Ph3P)4(1.6g,1.3mmol)、二噁烷(15mL)的小瓶中，加入烯丙基三正丁基锡(5.4mL,18mmol)。将反应加热至90℃持续18h。冷却至室温后，将混合物用DCM稀释，通过CELITE过滤，并加入至含有KF水溶液(0.5M,200mL)的烧瓶中。搅拌混合物，然后分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法(在己烷中的0至30％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(5-烯丙基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C18H21O4S)(ES,m/z):333[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.23(s,1H),7.69(s,1H),7.58(s,1H),5.96(dq,J＝15.9,6.6Hz,1H),5.04(d,J＝4.5Hz,1H),5.02(s,1H),4.01(q,J＝7.0Hz,2H),3.85(s,3H),3.37(d,J＝6.3Hz,2H),3.27(dd,J＝11.0,4.3Hz,2H),2.62(t,J＝6.1Hz,2H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：4-(6-甲氧基-5-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丙 基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001151
向1,4-双(二苯基膦基)丁烷(0.45g,1.1mmol)、氯(1,5-环辛二烯)铱(i)二聚物(0.35g,0.53mmol)、4-(5-烯丙基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(3.5g,11mmol)和THF(20mL)的混合物中加入频哪醇硼烷(1.0M在THF中，15.80mL,15.80mmol)。将反应在室温下搅拌4小时。然后在减压下除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法(在己烷中0至20％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(6-甲氧基-5-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(s,1H),7.66(s,1H),7.53(s,1H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.84(s,3H),3.27(t,J＝6.2Hz,2H),2.62(t,J＝6.1Hz,2H),2.58(t,J＝7.4Hz,2H),1.58(p,J＝7.4Hz,2H),1.16-1.11(m,15H),0.67(t,J＝7.6Hz,2H).
中间体8：4-(6-(3-(溴丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001152
步骤1：6-溴-5-甲氧基苯并[b]]噻吩-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001153
向4-溴-2-氟-5-甲氧基苯甲醛(5.00g，21.5mmol)在DMF(100mL)中的搅拌溶液中加入2-巯基乙酸甲酯(2.5lg,23.6mmol)和K2CO3(8.90g,64.4mmol))。将反应混合物用N2脱气3次。然后将得到的混合物在室温下搅拌15h。将EtOAc(500mL)和H2O(1200mL)加入到反应混合物中。分离有机层，并用饱和NaCl水溶液(2×200mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(在PE中的EtOAc)，得到6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯。LCMS(C11H10BrO3S)(ES,m/z):301,303[M+H]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.01(s,1H),7.93(s,1H),7.26(s,1H),3.96(s,3H),3.94(s,3H).
步骤2：6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001161
向6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(1.45g,4.81mmol)在MeOH(20mL)、THF(20mL)和H2O(20mL)中的悬浮液中加入NaOH(1.93g,48.1mmol)。将得到的悬浮液加热至50℃持续0.5h。将反应混合物减压浓缩以除去溶剂。将H2O(200mL)加入到残余物中，并加入柠檬酸以将溶液调节至pH＝6。剩余的水悬浮液用EtOAc(3×50mL)萃取。合并的有机层用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸，其无需进一步纯化即可使用。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.52(br s,1H),8.35(s,1H),8.01(s,1H),7.65(s,1H),3.90(s,3H).
步骤3：6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001162
在0℃下向搅拌的6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸(800mg,2.79mmol)的无水THF(6mL)溶液中滴加(COCl)2(1.06g,8.36mmol)。然后将混合物在75℃加热15h，然后冷却至室温。减压除去溶剂，得到粗制的6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯，其无需进一步纯化即可使用。
步骤4：4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001163
向圆底烧瓶中加入CuI(0.24g,2.4mmol)。将烧瓶抽真空，然后打开至N2。重复三次。加入THF(4.0mL)，并将混合物冷却至0℃。在0℃在10分钟内滴加(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，9.6mL，4.8mmol)的混合物。将所得混合物搅拌30分钟。加入6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(0.73g,2.4mmol)。从冰浴中移出混合物，使其温热至室温。将混合物搅拌2小时。然后将混合物冷却至0℃，并加入浓NH4OH(4.5mL)。向得到的悬浮液中加入水(240mL)和MeOH(60mL)。将混合物搅拌5min，并在浴超声仪中超声处理。然后将混合物用EtOAc稀释，并将有机层分离，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化，得到4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C17H19BrO4S)(ES,m/z):421,423[M+Na]+.
步骤5：4-(6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩- 2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001171
向含有4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(0.16g,0.40mmol)和THF(2.0mL)的烧瓶中加入[(2-二环己基膦基-2',6'-双(N,N-二甲基氨基)-1,1'-联苯基)-2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]甲磺酸钯(II)(C-Phos Pd G3,16mg,0.020mmol)。将烧瓶抽真空并用N2回填3次。加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，2.4mL,1.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌2.5h。然后将混合物用EtOAc和10％柠檬酸钠水溶液的混合物淬灭。分离有机层，用饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。粗残余物通过硅胶色谱法纯化，得到4-(6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C26H41O5SSi-C4H8)(ES,m/z):437[M-C4H8]+.
步骤6：4-(6-(3-(羟丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001181
向含有4-(6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(0.11g,0.23mmol)的烧瓶中加入甲醇(1.5mL)、水(1.5mL)和HOAc(1.5mL)。将混合物搅拌4小时。混合物用EtOAc稀释，然后用水(3×50mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。粗残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到4-(6-(3-(羟丙基)-5-甲氧基-苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C20H27O5S-C4H8)(ES,m/z):323[M-C4H8]+.
步骤7：4-(6-(3-(溴丙基))-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001182
在0℃下向4-(6-(3-(羟丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(74mg,0.20mmol)和三苯基膦(82mg,0.31mmol)在THF(1.0mL)中的混合物加入NBS(52mg,0.29mmol)。在0℃下15分钟后，将混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并用EtOAc稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。粗残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到4-(6-(3-(溴丙基))-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C20H26BrO4S-C4H8)(ES,m/z):385,387[M-C4H8].
中间体9：4-(4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001183
步骤1：2-溴-6-氟-4-甲氧基苯甲醛
Figure BDA0002716024870001184
在-78℃下，向1-溴-3-氟-5-甲氧基苯(7.5g,37mmol)的THF(120mL)混合物中加入LDA(2.0M在THF中，22mL，44mmol)，混合物在-78℃下搅拌30分钟。30分钟后，滴加DMF(3.4mL,44mmol)，然后将混合物搅拌30min。然后将混合物用水淬灭，温热至室温，然后加入EtOAc。分离各层，并将水层用EtOAc再萃取两次。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物残余物，得到2-溴-6-氟-4-甲氧基苯甲醛。LCMS(C8H7BrFO2)(ES,m/z):233,235[M+H]+.
步骤2：4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001191
向2-溴-6-氟-4-甲氧基苯甲醛(2.5g,11mmol)在DMSO(54mL)中的混合物中加入TEA(3.0mL,21mmol)。10分钟后，加入硫代乙醇酸甲酯(3.1mL,32mmol)，并将混合物在室温下搅拌30min。30分钟后，将混合物加热至60℃保持1小时。冷却至室温后，将混合物用饱和NaHCO3水溶液和EtOAc稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至15％EtOAc的梯度)，得到4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯。LCMS(C11H10BrO3S)(ES,m/z):301,303[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.93(s,1H),7.73(s,1H),7.44–7.37(m,1H),3.89(s,3H),3.87(s,3H).
步骤3：4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001192
向4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(1.7g,5.5mmol)在THF(14mL)、MeOH(7.0mL)和水(7.0mL)的混合物中加入LiOH(0.66g,28mmol)，并将混合物加热至40℃保持2小时。2小时后，将混合物冷却至室温。将混合物用HCl水溶液(2.0M在水中，14mL，28mmol)淬灭。将混合物过滤，并将残余物用EtOAc洗涤。然后将残余物真空干燥，无需进一步纯化即可使用。LCMS(C10H8BrO3S)(ES,m/z):287,289[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.57(s,1H),7.86(s,1H),7.71(s,1H),7.38(d,J＝1.7Hz,1H),3.86(s,3H).
中间体10：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001201
步骤1：4-(6-甲氧基-5-(3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2- 基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001202
向4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(13g,35mmol)和C-Phos Pd G4(1.4g,1.7mmol)的混合物中一次加入(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，100mL,50mmol)。将反应加热至40℃保持2小时。然后将混合物冷却至室温，并通过CELITE过滤。减压浓缩滤液。所得残余物通过硅胶柱色谱法纯化(在己烷中0至30％EtOAc的梯度)，得到4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C23H31O6S)(ES,m/z):435[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(s,1H),7.71(s,1H),7.55(s,1H),4.50(s,1H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.85(s,3H),3.70(t,J＝8.1Hz,1H),3.65-3.58(m,1H),3.40-3.34(m,1H),3.33-3.29(m,3H),2.73-2.59(m,4H),1.79(p,J＝6.7Hz,2H),1.69(d,J＝8.7Hz,1H),1.58(t,J＝7.9Hz,1H),1.48-1.34(m,4H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001203
在0℃下向4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸酯(6.2g,14mmol)和DCM(100mL)的混合物中分批加入三苯基膦二溴化物(9.03g,21.4mmmol)。使混合物升温至室温，然后搅拌1小时。然后将混合物用水淬灭并用DCM稀释。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法纯化(在己烷中的0至30％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C18H22BrO4S)(ES,m/z):413,415[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.23(s,1H),7.73(s,1H),7.58(s,1H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.86(s,3H),3.50(t,J＝6.5Hz,2H),3.27(d,J＝6.4Hz,2H),2.75(t,J＝7.3Hz,2H),2.63(t,J＝6.2Hz,2H),2.07(p,J＝6.7Hz,2H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).
中间体11：4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001211
步骤1：4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001212
在室温下将1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷双(四氟硼酸酯)(SELECTFLUORTM,77mg,0.22mmol)加入5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(50mg,0.20mmol)在ACN(1mL)中的混合物中。将所得混合物在45℃下搅拌15小时。将混合物冷却至室温，用饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释，并用EtOAc(3×10mL)萃取。合并的有机层用饱和NaCl水溶液(10mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过制备型TLC(SiO2，PE中的EtOAc)纯化，得到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯。LCMS(C12H12FO4S)(ES,m/z):293[M+H]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.05(s,1H),7.08(s,1H),3.99(s,3H),3.97(s,3H),3.94(s,3H).
步骤2：4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001221
室温下将LiOH·H2O(71.4mg,1.70mmol)分批加入到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(46mg，0.170mmol)在THF(3mL)、MeOH(1mL)和H2O(1mL)中的混合物中。然后，将混合物搅拌15小时。用1N HCl将混合物调节至pH＝5，并用EtOAc(3×10mL)萃取。合并的有机层用饱和NaCl水溶液(10mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)纯化，得到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸。LCMS(C11H9FO4S)(ES,m/z):257[M+H]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.12(s,1H),7.09(s,1H),3.99(s,3H),3.97(s,3H).
步骤3：4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001222
在0℃下向搅拌的4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸(153mg,0.60mmol)在无水THF(5mL)中的溶液中滴加(COCl)2(0.21mL,2.40mmol)。将混合物在0℃下搅拌1h，然后在室温下搅拌1h。在减压下除去溶剂，得到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯，无需进一步纯化即可使用。
步骤4：4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001223
用N2鼓泡噻吩-2-羧酸铜(I)(125mg,0.65mmol)的悬浮液5分钟，然后冷却至0℃。在0℃下在N2下加入(3-乙氧基-3-氧代丙基)溴化锌(II)溶液(17.7mL,0.5M在THF中，8.83mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌20分钟。然后在0℃下加入N2-鼓泡的4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(130mg,0.47mmol)的THF(3mL)溶液。使所得悬浮液温热至室温，并搅拌8h。在搅拌下将混合物倒入饱和NH4Cl水溶液(20mL)中。将混合物用EtOAc(2×20mL)萃取。合并的有机层用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝0.7Hz,1H),7.10(t,J＝1.0Hz,1H),4.19(q,J＝7.2Hz,2H),4.05-3.97(m,6H),3.36(t,J＝6.7Hz,2H),2.81(t,J＝6.7Hz,2H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H).
步骤5：4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基]-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001231
向4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(3.6g,11mmol)和DCM(50mL)的混合物中加入AlCl3(5.64g,42.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h。然后将加料漏斗连接至反应容器，并在剧烈搅拌下向该混合物中缓慢加入水(50mL)，然后加入HCl水溶液(1N,50mL)。然后将混合物用20％IPA/DCM稀释。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将所得的残余物通过硅胶柱色谱法(100％DCM)纯化，得到4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C15H16FO5S)(ES,m/z):327[M+H]+.1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.25(s,1H),7.47(s,1H),4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.92(s,3H),3.39-3.34(m,2H),2.68-2.63(m,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).
中间体12：(S)-4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001232
步骤1：(2S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001241
向(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(7.0g,19mmol)和C-Phos Pd G4(0.76g,0.94mmol)的混合物中加入(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，100mL,50mmol)。将该混合物加热至40℃持续2h。然后将混合物冷却至室温，并通过CELITE过滤。减压浓缩滤液。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(在己烷中0至30％EtOAc的梯度)，得到(2S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C23H31O6S)(ES,m/z):435[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(s,1H),7.70(s,1H),7.55(s,1H),4.50(s,1H),3.85(s,3H),3.70(dd,J＝13.2,5.3Hz,1H),3.64-3.58(m,1H),3.56(s,3H),3.42-3.35(m,2H),3.35-3.29(m,1H),3.15(dd,J＝17.4,4.9Hz,1H),2.94(dt,J＝12.9,7.1Hz,1H),2.67(hept,J＝7.6,7.1Hz,2H),1.79(p,J＝6.7Hz,2H),1.69(d,J＝8.7Hz,1H),1.58(t,J＝7.9Hz,1H),1.48-1.35(m,4H),1.18-1.11(m,3H).
步骤2：(S)-4-(5-(3-羟丙基))-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001242
向(2S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(2.62g,6.03mmol)和MeOH(50mL)的混合物中加入pTsOH(1.72g,9.04mmol)。将混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物用水淬灭并用DCM稀释。分离有机层，然后用饱和NaHCO3水溶液洗涤。然后将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到(S)-4-(5-(3-(羟丙基))-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H23O5S)(ES,m/z):351[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(s,1H),7.69(s,1H),7.54(s,1H),4.44(t,J＝5.0Hz,1H),3.85(s,3H),3.56(s,3H),3.42-3.35(m,3H),3.15(dd,J＝17.4,4.9Hz,1H),2.93(h,J＝7.0Hz,1H),2.64(t,J＝7.6Hz,2H),1.68(p,J＝6.6Hz,2H),1.15(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体13：4-(5-(3-(溴丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001251
步骤1：5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001252
向5-溴-2-氟-4-甲基苯甲醛(5.0g，23mmol)在DMSO(120mL)中的混合物中加入TEA(6.4mL，46mmol)。在10分钟后，加入硫代乙醇酸甲酯(6.7mL,69mmol)，然后将混合物加热至60℃持续18h。18小时后，将混合物冷却至室温，并将混合物用EtOAc和水稀释。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将混合物用DCM稀释。将混合物过滤，并将残余物在真空下干燥。向母液中加入硅胶(50g)，并将混合物浓缩。然后通过硅胶色谱法纯化混合物，得到5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,1H),8.13(s,1H),8.08(s,1H),3.89(s,3H),2.48(s,3H).
步骤2：5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001253
向5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸甲酯(2.76g,9.68mmol)在THF(24mL)、水(12mL)和MeOH(1.2mL)中的混合物中加入LiOH(1.16g,48.4mmol)，并将混合物在室温下搅拌30min。然后将混合物用HCl(1.0M在水中，48mL，48mmol)酸化至接近中性。然后将混合物用EtOAc和水稀释。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸。该产物无需纯化即可使用。LCMS(C10H8BrO2S)(ES,m/z):271,273[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ13.56(s,1H),8.29(s,1H),8.05(s,1H),8.04(s,1H),2.47(s,3H).
步骤3：5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩
Figure BDA0002716024870001261
向5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-羧酸(5.7g,21mmol)中加入DMA(100mL)。然后将混合物在5个小瓶中均匀分配。将DBU(1.6mL)加入到每个小瓶中，然后将每个小瓶在微波中于200℃下照射2h。完成后，合并五个小瓶，然后用EtOAc和饱和NaHCO3水溶液稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化,得到5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),8.00(s,1H),7.75(d,J＝5.4Hz,1H),7.39(d,J＝5.3Hz,1H),2.45(s,3H).
步骤4：4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870001262
在0℃下向5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩(2.0g,8.8mmol)在DCM(88mL)中的混合物中加入琥珀酸酐(1.1g,11mmol)，然后加入AlCl3(2.3g,18mmol)。将混合物温热至室温并搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc和HCl(在水中1.0N)稀释。分离有机层，经MgSO4干燥并过滤。向滤液中加入硅胶(10g)，并将混合物减压浓缩。将该混合物在真空下放置18小时，然后通过硅胶色谱法(在己烷中的0至50％EtOAc梯度)纯化，得到4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C13H12BrO3S)(ES,m/z):327,329[M+H]+.
步骤5：4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001263
向4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸在DMF(20mL)中的混合物(0.99g,3.0mmol)中加入K2CO3(1.0g,7.6mmol)。10分钟后，加入CH3I(0.95mL,15mmol)，并搅拌混合物直至通过LCMS确认完成。然后将混合物用EtOAc和水稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化得到的残余物，得到4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H14BrO3S)(ES,m/z):341,343[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),8.30(s,1H),8.07(s,1H),3.61(s,3H),3.37(t,J＝6.3Hz,2H),2.70(t,J＝6.3Hz,2H),2.48(s,3H).
步骤6：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2- 基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001271
向含有4-(5-溴-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(0.40g,1.2mmol)和THF(5.9mL)的烧瓶中加入C-Phos Pd G3(47mg,0.059mmol)，将混合物抽真空，并用N2回填三次。加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，7.0mL,3.5mmol)，并将混合物在室温下搅拌2.5h。然后将混合物用EtOAc和10％柠檬酸钠水溶液的混合物淬灭。分离有机层，用饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C23H35O4SSi)(ES,m/z):435[M+H]+.
步骤7：4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001272
向4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲基-苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(0.23g,0.54mmol)在THF(2.7mL)的混合物中加入TBAF(1.0M在THF中，1.0mL，1.0mmol)。1.5小时后，将混合物用EtOAc和饱和NH4Cl水溶液稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至70％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H21O4S)(ES,m/z):321[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),7.81(s,1H),7.78(s,1H),4.55(t,J＝5.1Hz,1H),3.61(s,3H),3.51-3.46(m,2H),3.38-3.34(m,2H),2.77-2.66(m,4H),2.41(s,3H),1.79-1.67(m,2H).
步骤8：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001281
在0℃下向4-(5-(3-羟丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(97mg,0.30mmol)和Ph3P(130mg,0.48mmol)在THF(1.5mL)中的搅拌混合物中一次性加入NBS(8mg,0.45mmol)。30分钟后，将反应用饱和NH4Cl水溶液和EtOAc淬灭。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中的0至25％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-溴丙基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H20BrO3S)(ES,m/z):383,385[M+H]+.
中间体14：4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔 丁酯
Figure BDA0002716024870001282
步骤1：4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001283
将CuCl(0.721g,7.29mmol)加入带有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中。将烧瓶抽空，然后用N2吹扫三次。向烧瓶中加入THF(14.6mL)，然后将其搅拌并在冰水浴中冷却至0℃。然后在10分钟内逐滴加入(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)锌(II)(0.50M THF,30mL,15mmol)同时在0℃下搅拌。将所得混合物在0℃下搅拌35分钟。加入5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯(1.9g,7.29mmol)，然后加入NMP(14.6mL)。将所得混合物在0℃下搅拌7h。在0℃快速搅拌下将浓NH4OH(4mL)加入反应中。向该悬浮液中加入水：MeOH(4:11,40mL)以及约20g柠檬酸三钠二水合物。将混合物搅拌20分钟。将得到的悬浮液过滤，并将滤饼用水洗涤。然后将滤饼在己烷中制浆并过滤两次。用N2吹扫滤饼抽真空72小时，得到4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H19ClNO4S)(ES,m/z):356[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.03(s,1H),7.61(s,1H),4.03(s,3H),3.30(t,J＝6.5Hz,2H),2.87-2.59(m,2H),1.46(s,9H).
步骤2：4-(5-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b] 吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001291
将4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(1.00g,2.81mmol)和CPhos Pd G3(0.113g,0.141mmol)加到带有隔膜的螺帽的40mL小瓶中。将小瓶抽真空并用N2回充三次。在搅拌下在N2下将THF(10.0mL)加入到小瓶中。在室温下搅拌所得悬浮液的同时，将(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中,11.2mL,5.60mmol)逐滴加入。将得到的混合物在室温下搅拌3h。将混合物在EtOAc(75mL)和10％柠檬酸钠水溶液(75mL)之间分配，并剧烈搅拌5min。分离各层，并将水层用EtOAc(20mL)萃取。合并有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，在减压下浓缩，得到粗残余物。所得残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至40％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C25H40NO5SSi)(ES,m/z):494[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),7.48(s,1H),3.94(s,3H),3.75(t,J＝6.5Hz,2H),3.30(t,J＝6.6Hz,2H),3.02-2.95(m,2H),2.73(t,J＝6.6Hz,2H),2.03-1.96(m,2H),1.46(s,9H),0.92(s,9H),0.07(s,6H).
步骤3：4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁 酯
Figure BDA0002716024870001301
向4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(0.735g,1.49mmol)在MeOH(3.0mL)中的混合物中加入水(3.0mL)和HOAc(3.0mL)。将得到的混合物在室温搅拌18h。然后将混合物在EtOAc(50mL)、水(25mL)和饱和NaCl水溶液(25mL)之间分配。分离各层，并将水层用EtOAc(50mL)萃取。合并有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度，然后100％EtOAc等度)，得到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C19H26NO5S)(ES,m/z):380[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.51(s,1H),3.95(s,3H),3.73(t,J＝5.8Hz,2H),3.28(t,J＝6.6Hz,2H),3.10(t,J＝6.9Hz,2H),2.72(t,J＝6.6Hz,2H),2.06(p,J＝6.5Hz,2H),1.45(s,9H).
中间体15：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001302
步骤1：2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙酸甲酯
Figure BDA0002716024870001303
将在DCM(3.0L)中的3-溴-4-甲氧基苯胺(232g,1.15mol)、DIPEA(171g,1.32mol)和2-氯-2-氧代乙酸甲酯(148g,1.21mol)的混合物置于5升4颈圆底烧瓶中，该烧瓶用N2惰性气氛吹扫并维持。将得到的混合物在室温下搅拌1h。然后通过加入水/冰(2L)将混合物淬灭。所得混合物用DCM(3×1L)萃取。合并有机层并减压浓缩，得到2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙酸甲酯，其无需纯化或表征即可使用。
步骤2：2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代硫代乙酸O-甲酯
Figure BDA0002716024870001311
将在甲苯(1.5L)中的2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙酸甲酯(111g，386mmol)和Lawesson试剂(86.4g,214mmol)的混合物放入3L的4颈圆底烧瓶中，该烧瓶用N2惰性气氛吹扫并保持。将所得混合物加热至85℃保持16小时。然后将反应混合物冷却至室温。过滤除去所得物质，并用DCM(3×500mL)洗涤。减压浓缩滤液，残余物通过硅胶色谱纯化(EtOAc/PE(1∶20))，得到2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代硫代乙酸O-甲酯，其未经表征即可使用。
步骤3：5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑- 2-羧酸钾盐(异构体的2:1混合物)
Figure BDA0002716024870001312
将2-((3-溴-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代硫代乙酸O-甲酯(84.5g,278mmol)放入2升4颈圆底烧瓶中，该烧瓶用N2惰性气氛吹扫并保持。在10分钟内将KOH(50g,90mmol)在H2O(500mL)中的混合物加入到反应混合物中。然后在10分钟内将铁氰化钾(III)水合物(242g,735mmol)在H2O(2L)中的混合物加入到反应混合物中。用HCl水溶液(2.0M)将所得混合物的pH调节至2。然后加入水(500mL)。将得到的混合物在室温下搅拌1h。然后通过过滤收集所得产物，并用DCM(1L)洗涤。将滤饼在KOH水溶液(2.0M,500mL,1mol)中制浆0.5小时。然后通过过滤收集所得产物，并用H2O(2×500mL)洗涤，得到5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐的2∶1混合物。5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐(主要异构体)的表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.13(s,1H),7.70(s,1H),3.80(s,3H)。7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐(次要异构体)的表征数据：1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)7.90(d,J＝8.9Hz,1H),7.26(d,J＝8.9Hz,1H),3.91(s,3H)。
步骤4：5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧 酸(异构体2:1的混合物)
Figure BDA0002716024870001321
向1L烧瓶中加入5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸钾盐(异构体2:1的混合物)(22.4g，49.4mmol)、水(300mL)、ACN(180mL)、MeOH(120mL)和TFA(11.4mmL,148mmol)。将混合物在室温下剧烈搅拌15分钟。通过过滤收集所得产物，并用水(2×20mL)、MeOH(2×5mL)和Et2O(2×10mL)洗涤，得到5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸的2：1的混合物。5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸(主要异构体)的表征数据：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.45(s,1H),7.97(s,1H),3.96(s,3H)。7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸(次要异构体)的表征数据：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.21(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(d,J＝9.0Hz,1H),4.00(s,3H)。
步骤5：5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001322
向250mL烧瓶中加入5-溴6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸和7-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸(异构体2:1混合物)(17.2g,41.8mmol)和MeOH(150mL)。将混合物剧烈搅拌并冷却至0℃。在10分钟内向搅拌的混合物中逐滴加入SOCl2(6.1mL,84mmol)。然后将混合物加热至回流持续18小时。冷却至室温后，通过过滤收集所得产物，并用MeOH(2×20mL)洗涤。通过硅胶色谱法(在DCM中的0至30％EtOAc梯度)纯化产物，得到5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸甲酯，为单一异构体。LCMS(C10H9BrNO3S)(ES,m/z):302,304(M+H)+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.40(s,1H),4.09(s,3H),4.02(s,3H).
步骤6：5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001331
向500mL圆底烧瓶中加入5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸甲酯(7.3g,24mmol)和MeOH(150mL)。向剧烈搅拌的混合物中加入NaOH水溶液(2.0M,37mL,74mmol)。将混合物加热至回流持续30分钟。冷却至室温后，逐滴加入HCl水溶液(2.0M,37mL,74mmol)。将混合物在室温下剧烈搅拌18小时。过滤收集得到的产物，用水(2×50mL)和MeOH(2×20mL)洗涤，得到5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸。LCMS(C9H7BrNO3S)(ES,m/z):288,290(M+H).1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.45(s,1H),7.97(s,1H),3.96(s,3H).
步骤7：5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001332
向100mL的圆底烧瓶中加入5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羧酸(1.46g,5.07mmol)、DCM(25mL)和DMF(0.080mL,1.0mmol)。在1分钟内向混合物中逐滴加入(COCl)2(5.32mL,10.6mmol)，并将混合物在室温下剧烈搅拌15分钟。然后将混合物通过CELITE过滤。减压浓缩滤液，得到5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-羰基氯，其无需进一步纯化或表征即可使用。
步骤8：4-(5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001333
向250mL圆底烧瓶中加入CuCl(0.45g,4.6mmol)。抽真空烧瓶，并回填N2三次。加入THF(10mL)，并将混合物搅拌并冷却至0℃。向混合物中加入(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，18mL，9.0mmol)。10分钟后，在5分钟内逐滴加入5-溴-6-甲氧基-苯并[d]噻唑-2-羰基氯(1.4g,4.6mmol)在NMP(30mL)中的混合物。5分钟后，将混合物温热至室温，然后搅拌1小时。向混合物中加入水(30mL)和浓NH4OH水溶液(15mL)。混合物用EtOAc(125mL)萃取，有机层用水(2×75mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至75％EtOAc的梯度)，得到4-(5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H18BrNO4S+Na)(ES,m/z):422,424[M+Na]+.1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.38(s,1H),7.40(s,1H),4.02(s,3H),3.51(t,J＝6.6Hz,2H),2.75(t,J＝6.6Hz,2H),1.46(s,9H).
中间体16：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001341
步骤1：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑- 2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001342
向4mL小瓶中加入4-(5-溴-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(233mg,0.581mmol)和C-Phos Pd G3(14mg,0.018mmol)。将该小瓶抽真空并回填N2三次。向该小瓶中加入THF(0.60mL)，然后加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，2.90mL，1.45mmol)。将混合物在室温下搅拌20min。向混合物中加入另外的(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，1.4mL，0.73mmol)。30分钟后，将混合物稀释于EtOAc(30mL)中，并用10％柠檬酸三钠水溶液(30mL)洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将得到的残余物通过硅胶色谱法(在己烷中的0至40％EtOAc梯度)纯化，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C25H40NO5SSi)(ES,m/z):494[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.31(s,1H),3.94(s,3H),3.70(t,J＝6.3Hz,2H),3.53(t,J＝6.6Hz,2H),2.86-2.78(m,2H),2.74(t,J＝6.6Hz,2H),1.94-1.84(m,2H),1.45(s,9H),0.93(s,9H).
步骤2：4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001351
向100mL烧瓶中加入4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(229mg,0.464mmol)、MeOH(5.0mL)、水(5.0mL)和AcOH(5.0mL)。将混合物在室温下搅拌4h。然后将混合物用EtOAc(50mL)稀释，并用水(3×50mL)洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到4-(5-(3-(羟丙基))-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C19H26NO5S)(ES,m/z):380[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.34(s,1H),3.96(s,3H),3.70(t,J＝6.3Hz,2H),3.52(t,J＝6.7Hz,2H),2.87(t,J＝7.5Hz,2H),2.75(t,J＝6.6Hz,2H),2.00-1.90(m,2H),1.46(s,9H).
步骤3：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001352
向4mL小瓶中加入CBr4(72mg,0.22mmol)、三苯基膦(62mg,0.24mmol)和4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(69mg,0.18mmol)。将小瓶冷却至0℃，并加入DCM(1.0mL)。使混合物温热至室温，持续90分钟。然后将混合物直接通过硅胶色谱法(在己烷中的0至30％EtOAc梯度)纯化，得到4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C19H25BrNO4S)(ES,m/z):442,444[M+H]+.1H NMR(499MHz,CDCl3)δ7.96(s,1H),7.33(s,1H),3.52(t,J＝6.6Hz,2H),3.95(s,3H),3.45(t,J＝6.6Hz,2H),2.93(t,J＝7.2Hz,2H),2.75(t,J＝6.6Hz,2H),2.30-2.19(m,2H),1.46(s,9H).
中间体17：4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001361
向RockPhos Pd G3(0.105g,0.125mmol)、苯甲醛肟(3.03g,25.0mmol)、4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(5.0g,13mmol)和Cs2CO3(12.2g,37.6mmol)的混合物中加入DMF(40mL)。将反应加热至80℃持续18h。然后将反应混合物冷却至室温，倒入含有HCl水溶液(0.5M,100mL)的烧瓶中。所得混合物用DCM萃取。然后将有机层用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将得到的残余物通过硅胶柱色谱法(在己烷中的0至50％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C17H20O5SNa)(ES,m/z):359[M+Na]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.35(s,1H),8.12(s,1H),7.49(s,1H),7.27(s,1H),3.83(s,3H),3.18(t,J＝6.2Hz,2H),2.52(t,J＝6.2Hz,2H),1.33(s,9H).
中间体18：4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001362
向4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(5.0g,12mmol)和EtOH(100mL)的混合物中加入pTsOH(4.4g,23mmol)。将反应在室温搅拌1小时。然后将反应用水淬灭并用DCM稀释。分离有机层，然后用饱和NaHCO3水溶液洗涤。然后将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C18H23O5S)(ES,m/z):351[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(s,1H),7.70(s,1H),7.55(s,1H),4.44(t,J＝5.0Hz,1H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.85(s,3H),3.40(q,J＝6.0Hz,2H),3.27(d,J＝6.4Hz,2H),2.63(q,J＝7.0,5.9Hz,4H),1.68(p,J＝6.6Hz,2H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).
中间体19：(2S)-4-[5-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001371
步骤1：(2S)-4-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2- 基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001372
在N2下向(2S)-4-(5-溴-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(124mg,0.334mmol)、三(三甲基甲硅烷基)硅烷(103μL,0.334mmol)和无水Na2CO3(71mg,0.67mmol)在脱气的DME(1.7mL)中的搅拌混合物中加入Ir(2-(2,4-二氟苯基)-5-(三氟甲基)吡啶)2(4,4’-二叔丁基-2,2’-联吡啶)PF6(3.8mg,3.3μmol)在脱气的DME(1.2mL)中的混合物。加入氯化镍(II)乙二醇二甲醚络合物(0.37mg,0.7μmol)和4,4’-二叔丁基-2,2’-联吡啶(0.45mg,1.7μmol)在脱气的DME(445μL)中的悬浮液，并将得到的混合物在N2下在室温下搅拌15min。在N2下一次性加入N-(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(150mg,0.67mmol)，搅拌反应混合物，并在室温下用两盏34W蓝色LED灯(每边7cm远)照射18h。然后将混合物直接通过硅胶快速柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(2S)-4-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C22H30NO6S)(ES,m/z):436[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.25(s,1H),7.70(s,1H),7.60(s,1H),6.86(br,1H),3.88(s,3H),3.59(s,3H),3.43(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.19(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.15(t,J＝7.0Hz,2H),3.01-2.93(m,1H),2.77(t,J＝7.0Hz,2H),1.34(s,9H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：(2S)-4-[5-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001381
在室温下一次性向(2S)-4-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(54mg,0.12mmol)在CH2Cl2(2.8mL)中的搅拌溶液中加入TFA(476μL,6.18mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2h。浓缩混合物，并将残余物溶于CH3CN和水中，冻干过夜，得到(2S)-4-[5-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H22NO4S)(ES,m/z):336[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.29(s,1H),7.80(br,2H),7.79(s,1H),7.68(s,1H),3.91(s,3H),3.60(s,3H),3.45-3.39(m,1H),3.20(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.10-3.01(m,2H),3.01-2.93(m,1H),2.95(t,J＝7.0Hz,2H),1.20(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体20：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯
Figure BDA0002716024870001382
向4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(0.065g,0.2mmol)、Cs2CO3(0.326g,1.00mmol)和ACN(2mL)的混合物中加入1,3-二溴丙烷(1.0mL,9.9mmol)。将该混合物加热至65℃保持2小时。冷却至室温后，将混合物过滤，并将滤出的物质用THF洗涤。滤液用己烷稀释，然后将混合物减压浓缩，得到4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯。LCMS(C18H21BrFO5S)(ES,m/z):447,449[M+H]+.
如下表1所示，中间体21至23和62至86是或可以根据类似于以上中间体20中概述的方法，使用合适的起始原料制备，起始原料如制备所描述的或从商业来源获得。
表1
Figure BDA0002716024870001391
Figure BDA0002716024870001401
Figure BDA0002716024870001411
Figure BDA0002716024870001421
Figure BDA0002716024870001431
Figure BDA0002716024870001441
中间体24：(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001442
步骤1：(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001443
向4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(4.3g,16mmol)、C-Phos Pd G4(0.26g,0.31mmol)和THF(25mL)的混合物中加入(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，25.0mL，12.5mmol)。将反应在室温搅拌2h。然后将反应用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并用DCM稀释。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将得到的残余物通过硅胶柱色谱法(在己烷中的0至50％EtOAc的梯度)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.33(s,1H),7.58(s,1H),3.92(s,3H),3.86(s,3H),3.60(s,3H),3.50(dd,J＝17.7,8.7Hz,1H),3.25(dd,J＝17.7,5.0Hz,1H),3.00-2.92(m,1H),1.20(d,J＝7.3Hz,3H).
步骤2：(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001451
向(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(4.0g,12mmol)和DCM(50mL)的混合物中加入AlCl3(6.27g,47.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h。然后将加料漏斗加入至反应中,并在剧烈搅拌下将水(50mL)缓慢加入至混合物，随后加入HCl水溶液(1N,50mL)。然后将混合物倒入分液漏斗中，并加入20％IPA/DCM。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法(100％DCM)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16FO5S)(ES,m/z):327[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.25(s,1H),7.47(s,1H),3.92(s,3H),3.60(s,3H),3.48(dd,J＝17.7,8.7Hz,1H),3.24(dd,J＝17.7,5.0Hz,1H),3.01-2.89(m,1H),1.19(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体25：(R)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870001461
步骤1：5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001462
在氩气下于0℃下向5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸(5.0g,21mmol)在THF(200mL)中的搅拌溶液中加入(COCl)2(5.5mL,63mmol)，接着加入DMF(0.1mL,1.3mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h，然后使其升温至室温，并搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并且得到的5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯无需纯化即可使用。1H NMR(600MHz,CH3CN-d3):δ8.25(s,1H),7.46(s,1H),7.45(s,1H),3.92(s,3H),3.88(s,3H).
步骤2：(S)-4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001463
在0℃下向含有噻吩-2-羧酸铜(I)(797mg,4.2mmol)的烘干的、氩气吹扫的圆底烧瓶中滴加(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(7.8mL，0.5M在THF中，3.9mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌20min。将5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(777mg,3.0mmol)在THF(15mL)中的悬浮液滴加到反应混合物中。使反应混合物温热至室温，并搅拌6h。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(15mL)稀释，然后用DCM(30mL)稀释。在萃取之前，通过过滤除去沉淀物。分离各层，并用DCM(3×30mL)萃取水层。合并的有机层在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(己烷中的(EtOAc中的25％EtOH))纯化，得到(S)-4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H19O5S)(ES,m/z):323[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.89(s,1H),7.26(s,2H),4.00(s,3H),3.97(s,3H),3.72(s,3H),3.48(dd,J＝16.9,7.6Hz,1H),3.22-3.16(m,1H),3.05(dd,J＝16.9,6.0Hz,1H),1.31(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤3：(R)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001471
在0℃下将AlCl3(1.0g,7.5mmol)加入到在CH2Cl2(40mL)中的(R)-4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.0g,3.0mmol)中。使反应混合物温热至室温持续18小时。然后将反应混合物冷却至0℃，并加入MeOH(85mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后将混合物温热至室温，并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc梯度)纯化，得到不纯的(R)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。然后将混合物通过手性SFC(AD-H柱(21×250mm)、30％MeOH和CO2中的0.25％DMEA)纯化，得到(R)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，保留时间为4.7分钟。LCMS(C15H17O5S)(ES,m/z):309[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6)δ:9.41(s,1H),8.17(s,1H),7.54(s,1H),7.31(s,1H),3.87(s,3H),3.60(s,3H),3.40(dd,J＝17.4,8.6Hz,1H),3.17(dd,J＝17.5,5.1Hz,1H),3.02-2.91(m,1H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
如下表2所示，中间体26至27是或可以根据类似于上面中间体25中概述的方法，使用适当的起始原料(如制备所描述的或从商业渠道获得)进行制备。
表2
Figure BDA0002716024870001472
Figure BDA0002716024870001481
中间体28：(S)-4-(5-(2-氯乙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基- 4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001482
步骤1：(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001483
向含有CuCl(2.5g,25mmol)的烧瓶中吹入氩气，然后冷却至0℃。逐滴加入3-甲氧基-(2R)-(+)-甲基-3-氧代丙基溴化锌(0.50M在THF中，50mL，25mmol)。将4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(5.0g,20mmol)在THF(25mL)和NMP(25mL)中的混合物滴加到搅拌的反应混合物中。然后将反应混合物加热至室温持续18小时。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(100mL)淬灭，并用EtOAc(3×100mL)萃取。合并的有机物经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。所得残余物通过正相硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.1H NMR(CDCl3)δ:7.99(s,1H),7.09(s,1H),4.00(s,3H),3.98(s,3H),3.73(s,3H),3.51(dd,J＝17.0,7.9Hz,1H),3.24-3.12(m,1H),3.06(dd,J＝17.0,5.6Hz,1H),1.32(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001491
向(S)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.0g,2.9mmol)和CH＝CCl2(40mL)的混合物中加入AlCl3(1.0g,7.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h。然后将反应混合物冷却至0℃，并用MeOH(40mL)稀释。然后将混合物温热至室温，然后减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16FO5S)(ES,m/z):327[M+H]+.1H NMR(methanol-d4)δ:8.11(s,1H),7.29(s,1H),3.98(s,3H),3.69(s,3H),3.50(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.23-3.16(m,1H),3.11-3.02(m,1H),1.28(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤3：(S)-4-(5-(2-氯乙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001492
将K2CO3(170mg,1 2mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(200mg,0.61mmol)和DMF(2.7mL)的搅拌混合物中。将1-溴-2-氯乙烷(50μL,0.6mmol)加入到搅拌的反应混合物中，然后将反应混合物加热至80℃持续18h。冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(S)-4-(5-(2-氯乙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H19ClFO5S)(ES,m/z):389[M+H]+.
如下表3所示，中间体29至31和87是或可以根据类似于上面中间体28中概述的方法，使用合适的起始原料进行制备，起始原料如制备中所描述的或从商业来源获得。
表3
Figure BDA0002716024870001501
中间体32：4-(5-(2-(羟乙基)-6-甲氧基噻吩并[3，2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸 叔丁酯，乙酸盐
Figure BDA0002716024870001502
步骤1：4-(6-甲氧基-5-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)噻吩并[3，2-b]吡 啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001511
向4mL小瓶中加入双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(II)(5.0mg,7.0μmol)、Cs2CO3(137mg,0.422mmol)、4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(50.0mg,0.141mmol)和三氟(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)硼酸钾(39.8mg,0.169mmol)。向小瓶中加入甲苯(0.50mL)和水(0.10mL)。将小瓶用N2脱气5分钟。将混合物加热至100℃保持18小时。冷却至室温后，将混合物通过CELITE过滤，并将CELITE用EtOAc洗涤。滤液在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法(在己烷中0至75％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(6-甲氧基-5-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C23H32NO6S)(ES,m/z):450[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.45(s,1H),7.80(s,1H),4.71(s,1H),4.26-4.15(m,1H),4.04(s,3H),3.78(t,J＝8.3Hz,1H),3.65-3.42(m,4H),3.33(t,J＝6.3Hz,2H),2.73(t,J＝6.3Hz,2H),1.64-1.48(m,6H),1.46(s,9H).
步骤2：4-(5-(2-羟乙基))-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁 酯，乙酸盐
Figure BDA0002716024870001512
向4mL小瓶中加入4-(6-甲氧基-5-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(28mg,0.062mmol)、HOAc(0.50mL)、MeOH(0.50mL)和水(0.5mL)。将混合物加热至50℃持续75分钟。冷却至室温后，将混合物用EtOAc(30mL)稀释，并用水(2×30mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到4-(5-(2-(羟乙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯，乙酸盐。LCMS(C18H24NO5S)(ES,m/z):366[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H),7.68(s,1H),4.13(t,J＝5.4Hz,2H),4.01(s,3H),3.39-3.22(m,4H),2.74(t,J＝6.5Hz,2H),1.46(s,9H).
中间体33：4-(5-(3-(羟丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001521
步骤1：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧 代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001522
将4-(5-溴苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(0.207g,0.561mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1’-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1’-联苯基)]钯(II)(0.022g,0.028mmol)放入带有磁力搅拌棒的20mL螺旋盖小瓶中。将小瓶抽真空并用N2回填3次。将小瓶盖上，盖上带有N2入口，然后加入THF(2.0mL)。在搅拌下逐滴加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，3.4mL，1.7mmol)。加入完成后，将反应在室温下在N2下搅拌1.5h。然后将反应在EtOAc(50mL)和10％柠檬酸钠水溶液(10mL)之间分配，并搅拌30min。然后分离各层，有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，用无水MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至55％EtOAc的梯度)，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C25H38NaO4SSi)(ES,m/z):485[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.96(s,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.70(s,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),3.66(t,J＝5.8Hz,2H),3.31(t,J＝6.5Hz,2H),2.82(t,J＝7.5Hz,2H),2.73(t,J＝6.5Hz,2H),1.93-1.86(m,2H),1.47(s,9H),0.94(s,9H),0.08(s,6H).
步骤2：4-(5-(3-(羟丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001531
于室温下在N2下将TBAF(1.0M在THF中，0.44mL，0.44mmol)加入至4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(102mg,0.220mmol)在THF(1.3mL)中的搅拌混合物中。将得到的混合物在室温下搅拌4.5h。然后将反应在Et2O和饱和NH4Cl水溶液之间分配，并在室温下搅拌1h。分离各层，并将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗残余物。所得残余物通过硅胶色谱法(在己烷中0至60％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(5-(3-(羟丙基))苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C19H24NaO4S)(ES,m/z):371[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.70(s,1H),7.33(d,J＝8.3Hz,1H),3.71(t,J＝6.3Hz,2H),3.30(t,J＝6.7Hz,2H),2.84(t,J＝7.7Hz,2H),2.72(t,J＝6.7Hz,2H),1.98-1.91(m,2H),1.46(s,9H).
中间体34：(S)-4-(4-氟-5-(3-羟丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基- 4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001532
向(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.065g,0.2mmol)和Cs2CO3(0.33g,1.0mmol)在ACN(2.0mL)的混合物中加入(3-溴丙氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(0.1mL,0.20mmol)。然后将反应加热至65℃持续2h。冷却至室温后，将混合物过滤并用THF(5mL)洗涤。将水(2mL)加入到所得滤液中，然后加入MP-TsOH(4.38mmol/g负载，1.00g，4.38mmol)。然后将混合物加热至60℃持续30分钟。冷却至室温后，将混合物过滤并用THF洗涤。减压浓缩滤液，得到(S)-4-(4-氟-5-(3-羟丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，其无需进一步纯化即可使用。LCMS(C18H22FO6S)(ES,m/z):385[M+H]+.
如下表4所示，中间体35至36是或可以根据类似于上文中间体34中概述的步骤，使用合适的起始原料进行制备的，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表4
Figure BDA0002716024870001541
中间体37：(2S)-4-[5-(3-溴丙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001542
在0℃下在N2下向(2S)-4-[5-(3-羟丙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(187mg,0.534mmol)和Ph3P(224mg,0.854mmol)在THF(2.7mL)中的搅拌混合物中一次性加入NBS(142mg,0.800mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌20分钟。将该混合物直接通过硅胶快速柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(2S)-4-[5-(3-溴丙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H22BrO4S)(ES,m/z):413,415[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.27(s,1H),7.76(s,1H),7.62(s,1H),3.89(s,3H),3.59(s,3H),3.54(t,J＝6.8Hz,2H),3.43(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.19(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.02-2.92(m,1H),2.79(t,J＝7.0Hz,2H),2.10(pentet,J＝6.9Hz,2H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体38：4-(5-(3-羟丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸 叔丁酯
Figure BDA0002716024870001551
步骤1：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2- b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001552
将4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(265mg,0.745mmol)、3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙-1-醇(156mg,0.8119mmol)、RockPhosPd G3(3mg,0.037mmol)和Cs2CO3(364mg,1.12mmol)加入到带有磁力搅拌棒的20mL螺帽小瓶中。盖上小瓶，并插入N2进样针。通过该针将小瓶抽真空并用N2回充三次。在氮气下，加入甲苯(2.5mL)，移除氮气入口，并将密封的小瓶加热至110℃持续18小时。使反应冷却至室温，并加入MeOH(3.0mL)、水(3.0mL)和HOAc(3.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌7h，然后在EtOAc和饱和NaCl水溶液之间分配。分离各层，并将水层用EtOAc萃取。合并有机层，用NaCl水溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗残余物。残余物通过硅胶色谱法纯化(己烷中0至100％3:1EtOAc:EtOH的梯度)，得到4-(5-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C25H40NO6SSi)(ES,m/z):510[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.39(s,1H),4.56(t,J＝6.5Hz,2H),3.94(s,3H),3.83(t,J＝6.0Hz,2H),3.26(t,J＝6.7Hz,2H),2.70(t,J＝6.7Hz,2H),2.12-2.05(m,2H),1.44(s,9H),0.89(s,9H),0.07(s,6H).
步骤2：4-(5-(3-羟丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔 丁酯
Figure BDA0002716024870001561
向含有4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(83mL,0.16mmol)的小瓶中加入MeOH(1.0mL)、水(1.0mL)，然后加入HOAc(1.0mL)。将得到的混合物在室温下搅拌30分钟。加入MeOH(1.0mL)，并继续搅拌。30分钟后，加入THF(1.0mL)，并将混合物在室温下搅拌18h。将混合物在EtOAc(25mL)和NaCl水溶液(25mL)之间分配。分离各层，并将水层用EtOAc萃取。合并有机层，用饱和NaCl水溶液洗涤两次，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗残余物。所得残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度，然后100％EtOAc等度)，得到4-(5-(3-羟丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C19H26NO6S)(ES,m/z):396[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.44(s,1H),4.69(t,J＝5.6Hz,2H),3.97(s,3H),3.80-3.76(m,2H),3.31-3.20(m,2H),2.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.14-2.07(m,2H),1.46(s,9H).
如下表5所示，中间体39是或可以按照类似于上文中间体38中概述的步骤，使用合适的起始原料制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表5
Figure BDA0002716024870001562
Figure BDA0002716024870001571
中间体40：4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001572
步骤：6-(苄氧基)苯并[b]噻吩
Figure BDA0002716024870001573
在20℃和Ar下将K2CO3(2.62g,19.0mmol)加入到苯并[b]噻吩-6-醇(1.9g,13mmol)和苄基溴(1.5mL,12.7mmol)在DMF(10.0mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至50℃持续18h。冷却至室温后,然后将反应混合物用EtOAc(500mL)和水(100mL)稀释。分离有机层，用水(50mL)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到6-(苄氧基)苯并[b]噻吩。LCMS(C15H13OS)(ES,m/z):241[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.77(d,J＝8.6Hz,1H),7.67(s,1H),7.54(d,J＝5.2Hz,1H),7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.44-7.38(m,2H),7.37-7.32(m,2H),7.08(d,J＝8.5Hz,1H),5.17(s,2H).
步骤2：6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-甲醛
Figure BDA0002716024870001574
在-78℃在氩气下将LDA(2.0M在THF中，7.3mL，15mmol)加入到6-(苄氧基)苯并[b]噻吩(2.92g,12.2mmol)在THF(1.0mL)中的混合物中。将反应混合物在-78℃下搅拌20min。在-78℃下将DMF(2.4mL,30mmol)加入到反应混合物中，然后将反应混合物缓慢升温至室温。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物在0℃下用柠檬酸(1.0M在水中，24mL，24mmol)淬灭，然后用EtOAc(200mL)稀释。将悬浮液搅拌15分钟。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗残余物。粗残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-甲醛。LCMS(C16H13O2S)(ES,m/z):269[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),8.34(s,1H),8.01(d,J＝8.8Hz,1H),7.78(s,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,2H),7.42(t,J＝7.3Hz,2H),7.40-7.33(m,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),5.23(s,2H).
步骤3：4-(6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001581
在20℃下将6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-甲醛(2.02g,7.53mmol)、2-异亚丙基丙酮-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,l-c][1,2,4]三唑-2-鎓氯化物(0.099g,0.38mmol)和磷酸三钾(1.6g,7.5mmol)的混合物用Ar冲洗5分钟。然后在20℃下加入甲苯(15mL)和丙烯酸叔丁酯(2.2mL,15mmol)。将反应混合物在20℃下搅拌18小时。然后将反应混合物用EtOAc(200mL)稀释并过滤以除去无机盐。减压浓缩滤液，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中的0至100％EtOAc梯度)，得到4-(6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C23H25O4S)(ES,m/z):397[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.35(s,1H),7.96(d,J＝7.0Hz,1H),7.75(s,1H),7.56-7.39(m,2H),7.47-7.33(m,3H),7.25-7.15(m,1H),5.24(s,2H),3.34-3.23(m,2H),2.65-2.55(m,2H),1.40(s,9H).
步骤4：4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870001591
将HCl(37％在水中，19.6mL，238mmol)加入到4-(6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(2.36g,5.96mmol)在二噁烷(100mL)中的混合物中。将反应混合物加热至90℃持续2天。将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(500mL)稀释。分离有机层，用水(3×100mL)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸，其无需进一步纯化即可使用。LCMS(C12H11O4S)(ES,m/z):251[M+H]+.
步骤5：4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001592
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在己烷中，3.0mL，6.0mmol)加入到4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸(1.5g,6.0mmol)在DCM(25mL)和MeOH(25mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟(直到不再放出气体)。加入HOAc(几滴)以淬灭任何剩余的TMS-重氮甲烷。然后将反应混合物在减压下浓缩以提供粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C13H13O4S)(ES,m/z):265[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),8.26(s,1H),7.84(d,J＝8.7Hz,1H),7.30(s,1H),6.97(d,J＝8.2Hz,1H),3.76-3.65(m,1H),3.60(s,3H),3.54-3.44(m,1H),2.72-2.67(m,2H).
如下表6所示，中间体41是或可以按照类似于上文中间体40中概述的步骤，使用合适的起始原料进行制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表6
Figure BDA0002716024870001601
中间体42：(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001602
步骤1：6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001603
在Ar下将4-(苄氧基)-2-溴-5-甲氧基苯甲醛(13g,41mmol)、K2CO3(11g,81mmol)、18-冠醚-6(2.lg,8.1mmol)和2-巯基乙酸甲酯(6.0mL,67mmol)在DMF(150mL)中的混合物加热至90℃持续14h。冷却至室温后，将反应混合物用水(400mL)淬灭，用1N HCl酸化至pH约5，并用EtOAc(3×250mL)萃取。合并的有机层用10％LiCl水溶液(3×50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物用EtOAc/MeOH(50mL/50mL)稀释，并在20℃下用LiOH水溶液(2.0M,80mL,160mmol)处理。将反应混合物加热至60℃持续2h。冷却至室温后,将混合物减压浓缩。将残余物用NaOH水溶液(1.0M,50mL,50mmol)、水(300mL)和EtOAc(300mL)稀释。分离各层，水层用EtOAc(3×200mL)洗涤。然后将水层用6N HCl酸化至pH约5,并用EtOAc(3×300mL)萃取。合并有机物，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物用1:1EtOAc/PE(3×30mL)和1:1DCM/PE(3×30mL)研磨，得到6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸。LCMS(C17H15O4S)(ES,m/z):315[M+H]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.16(br s,1H),7.95(s,1H),7.69(s,1H),7.51(s,1H),7.50-7.46(m,2H),7.44-7.32(m,3H),5.17(s,2H),3.83(s,3H).
步骤2：6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001611
于0℃下在Ar下将DMF(0.023mL,0.29mmol)加入到6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羧酸(3.05g,9.70mmol)和(COCl)2(2.55mL,29.1mmol)在THF(50mL)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌30min，然后温热至室温。然后将反应混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，得到6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯，其无需纯化即可使用。
步骤3：(S)-4-(6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870001612
于0℃下在Ar下将(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，25mL，13mmol)的混合物缓慢加入到含有((噻吩-2-羰基)氧基)铜(2.38g,l2.5mmol)的烧瓶中。将反应混合物在0℃下在Ar下搅拌20min。然后在0℃下通过套管将在氩气中脱气的6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(3.2g,9.6mmol)在THF(50mL)中的混合物缓慢地加入到混合物中。使混合物温热至室温，然后在室温下搅拌16h。将反应混合物冷却至0℃，并通过加入饱和NH4Cl水溶液(50mL)、水(100mL)和EtOAc(500mL)淬灭。将得到的两相混合物加热至室温，并在室温搅拌1h。然后将混合物通过CELITE玻璃料过滤，并将滤液在分液漏斗中分配。分离有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(在己烷中0至50％EtOAc的梯度)纯化，得到所需的产物，将其通过硅胶色谱法(用0-50％EtOAc的DCM溶液洗脱)再次纯化，得到(S)-4-(6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C22H23O5S)(ES,m/z):399[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.22(s,1H),7.72(s,1H),7.52-7.47(m,3H),7.42(t,J＝7.3Hz,2H),7.38-7.34(m,1H),5.19(s,2H),3.85(s,3H),3.60(s,3H),3.42(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.19(dd,J＝17.4,4.9Hz,1H),3.04-2.91(m,1H),1.20(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤4：(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001621
将(S)-4-(6-(苄氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.60g,4.02mmol)和Pd/C(1.17g,1.00mmol)用Ar脱气。在氩气流下将EtOAc(50mL)、MeOH(50mL)和HCl(37％在水中，0.66mL,8.0mmol)缓慢加入到混合物中。将反应混合物上方的顶部空间通过真空脱气并用H2回填。将反应混合物在H2下搅拌3h。通过CELITE过滤反应混合物，用EtOAc洗涤。减压浓缩滤液。残余物通过硅胶色谱法纯化(用0-100％EtOAc的己烷溶液洗脱)，得到(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H17O5S)(ES,m/z):309[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.93(s,1H),8.17(s,1H),7.44(s,1H),7.30(s,1H),3.85(s,3H),3.60(s,3H),3.44-3.38(m,1H),3.16(dd,J＝17.3,4.7Hz,1H),3.01-2.92(m,1H),1.19(d,J＝7.0Hz,3H).
步骤5：(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001622
将(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(141mg,0.457mmol)、1-溴-3-氯丙烷(360mg,2.3mmol)和K2CO3(379mg,2.74mmol)的混合物用Ar脱气。将ACN(4.0mL)加入到混合物中，并将反应混合物加热至50℃持续18h。冷却至室温后，将反应混合物用DCM(25mL)稀释并过滤。将滤液在减压下浓缩，然后通过硅胶色谱法(在DCM中的0至100％EtOAc的梯度)纯化，得到(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H22ClO5S)(ES,m/z):385[M+H]+.
如下表7所示，中间体43是或可以按照类似于上文中间体42中概述的步骤，使用合适的起始原料进行制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表7
Figure BDA0002716024870001631
中间体44：(2S)-4-[5-(2-羟乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001632
在N2下向(2S)-4-(5-溴-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.24g,3.34mmol)、三(三甲基甲硅烷基)硅烷(1.0mL,3.3mmol)和无水Na2CO3(708mg,6.68mmol)在脱气的DME(16.50mL)中的搅拌混合物中加入Ir(2-(2,4-二氟苯基)-5-(三氟甲基)吡啶)2(4,4'-二叔丁基-2,2'-联吡啶)PF6(38mg,33μmol)在脱气的DME(12mL)中的混合物。加入氯化镍(II)乙二醇二甲醚络合物(3.7mg,17μmol)和4,4’-二叔丁基-2,2’-联吡啶(4.5mg,17μmol)在脱气的DME(4.5mL)中的悬浮液，室温下将得到的混合物在N2下搅拌15分钟。在N2下以一份加入2-溴乙醇(835mg,6.68mmol)，然后将反应混合物搅拌并在光反应器中于20％的光强度下室温下照射24小时。然后将混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(EtOAc在己烷中)，得到(2S)-4-[5-(2-羟乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H21O5S)(ES,m/z):337[M+H]+.1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.26(s,1H),7.76(s,1H),7.58(s,1H),4.64(t,J＝5.2Hz,1H),3.88(s,3H),3.64-3.55(m,2H),3.59(s,3H),3.42(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.19(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.01-2.92(m,1H),2.81(t,J＝6.9Hz,2H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体45：4-(6-甲氧基-5-(3-氧代丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001641
向4mL小瓶中加入4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(30mg,0.079mmol)、Dess-Martin高碘烷(1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮；50mg,0.01mmol)和DCM(1.0mL)。将混合物在室温下搅拌1h。混合物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至55％EtOAc的梯度)，得到4-(6-甲氧基-5-(3-氧代丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C20H24O5SNa)(ES,m/z):399[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.89(s,1H),7.64(s,1H),3.27(t,J＝6.8Hz,2H),3.05(t,J＝7.4Hz,2H),2.80(t,J＝7.2Hz,2H),2.72(t,J＝6.7Hz,2H),1.46(s,9H).
中间体46：4-(5-氨基-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001642
步骤1：4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧 代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001643
向4mL小瓶中加入Cs2CO3(252mg,0.773mmol)、二苯基甲亚胺(129μL,0.773mmol)、4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(138mg,0.387mmol)、RacBINAP Pd G3(19mg,0.019mmol)和甲苯(2.0mL)。将混合物加热至120℃持续3.5h。冷却至室温后，将混合物直接通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至50％EtOAc的梯度)，得到4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C29H29N2O4S)(ES,m/z):501[M+H]+.
步骤2：4-(5-氨基-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001651
向20mL的小瓶中加入4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(146mg,0.291mmol)、AcOH(2.0mL)、MeOH(2.0mL)、水(2.0mL)和THF(6.0mL)。将混合物加热至50℃持续1h。冷却至室温后，将混合物于室温下搅拌24h。然后将混合物用EtOAc(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将得到的残余物通过硅胶色谱法(在己烷中的0至50％EtOAc的梯度)纯化，得到4-(5-氨基-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H21N2O4S)(ES,m/z):337[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.02(s,1H),7.53(s,1H),4.11(s,3H),3.24(t,J＝6.4Hz,2H),2.74-2.70(m,2H),1.46(s,9H).
中间体47：(S)-4-(6-(3-羟丙氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001652
将(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(25mg,0.081mmol)、3-氯丙烷-1-醇(10mg,0.1mmol)和K2CO3(22mg,0.6mmol)的混合物用Ar脱气。向混合物中加入DMF(0.50mL)，并将反应混合物在微波中照射至100℃持续1h。使反应混合物冷却至室温，然后用EtOAc(25mL)和水(5mL)稀释。分离有机层，用另外的水(5mL)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(5mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(0-100％[5％MeOH的EtOAc溶液]在DCM中洗脱)，得到(S)-4-(6-(3-羟丙氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H23O6S)(ES,m/z):367[M+H]+.
如下表8所示，中间体48是或可以按照类似于上文中间体47中概述的方法使用合适的起始原料来制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表8
Figure BDA0002716024870001661
中间体49：4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001662
步骤1：4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2- 基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001663
向4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(3.0g,8.9mmol)、K2CO3(7.4g,54mmol)和ACN(20mL)的混合物中加入2-(3-溴丙氧基)四氢-2H-吡喃(3.8mL,22mmol)。将反应加热至65℃持续4h。冷却至室温后，将混合物过滤，用ACN洗涤，然后在减压下除去溶剂。将得到的残余物溶解在DCM(10mL)中，并缓慢加入己烷(100mL)。过滤得到的沉淀物，用己烷洗涤，并风干，得到4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C25H34O7SNa)(ES,m/z):501[M+Na]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.16(s,1H),7.56(s,1H),7.46(s,1H),4.54(s,1H),4.06(t,J＝6.2Hz,2H),3.83(s,3H),3.78(dt,J＝9.6,6.4Hz,1H),3.69(dd,J＝13.5,5.5Hz,1H),3.52-3.45(m,1H),3.41-3.35(m,1H),3.20(t,J＝6.2Hz,2H),2.54(t,J＝6.2Hz,2H),2.02-1.95(m,2H),1.71-1.62(m,1H),1.58(t,J＝7.8Hz,1H),1.47-1.39(m,3H),1.36–1.33(m,10H).
步骤2：4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001671
向4-(6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(3.78g,7.90mmol)和EtOH(50mL)的混合物中加入pTsOH(2.2g,12mmol),并将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物用DCM稀释，并用饱和NaHCO3水溶液淬灭。然后分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C20H26O6SNa)(ES,m/z):417[M+Na]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.55(s,1H),7.44(s,1H),4.53(t,J＝4.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.2Hz,2H),3.83(s,3H),3.55(q,J＝5.4Hz,2H),3.20(t,J＝6.1Hz,2H),2.54(t,J＝6.1Hz,2H),1.88(p,J＝5.8Hz,2H),1.33(s,9H).
如下表9所示，中间体50是或可以按照类似于上文中间体49中概述方法使用合适的起始原料来制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表9
Figure BDA0002716024870001672
Figure BDA0002716024870001681
中间体51：4-(5-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001682
将4-(5-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(1.43g,3.60mmol)和Pd/C(10％w/w,1.5g,l.4mmol)的混合物用Ar脱气。将MeOH(25mL)、EtOAc(25mL)和HCl(37％在水中，0.59mL,7.2mmol)在Ar流下缓慢加入到混合物中。将反应混合物上方的顶部空间通过真空脱气并用H2回填。将得到的混合物在H2下搅拌24h。然后将反应混合物通过CELITE过滤，并将CELITE用EtOAc洗涤。滤液在减压下浓缩，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到4-(5-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C13H13O4S)(ES,m/z):265[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.28(s,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,1H),7.36(s,1H),7.07(d,J＝8.0Hz,1H),3.63(s,3H),2.75-2.67(m,2H)；2个脂族质子被包埋在溶剂峰下且不明显。
中间体52：(2S)-4-(5,6-二羟基--1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001683
步骤1：(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870001691
在0℃下向搅拌下的(2S)-4-(5,6-二甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸(2.0g,6.5mmol)的DCM(65mL)溶液中加入BBr3(1M在DCM中，19.5mL，19.5mmol)。使反应混合物升温至室温持续2.5小时。然后将混合物冷却至0℃，用水处理，并在减压下浓缩。过滤残余物，用水洗涤，并在高真空下干燥，得到(2S)-4-(5,6-二氢-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸，其无需进一步纯化即可使用。LCMS(C13H13O5S)ES,m/z):281[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),9.78(brs,1H),9.49(brs,1H),8.12(s,1H),7.28(s,1H),7.24(s,1H),3.39-3.33(m,1H),3.03(dd,J＝17.2,5.2Hz,1H),2.91-2.84(m,1H),1.16(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001692
向(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸(1.35g,4.82mmol)在DCM(24mL)和MeOH(24mL)的搅拌溶液中加入TMS-重氮甲烷(2M在己烷中,3.6mL,7.2mmol)。将混合物搅拌30分钟，用HOAc(0.28mL,4.8mmol)处理，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(在DCM中的0至10％MeOH梯度)纯化，得到(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H15O5S)(ES,m/z):295[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),9.45(s,1H),8.13(s,1H),7.28(s,1H),7.25(s,1H),3.59(s,3H),3.41-3.34(m,1H),3.17-3.11(m,1H),2.98-2.91(m,1H),1.17(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体53：(2S)-4-[5,6-双(3-羟基丙氧基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001701
将(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(230mg,0.78mmol)、3-氯-1-丙醇(196μL,2.34mmol)和K2CO3(432mg,3.13mmol)在DMF(7.8mL)中的混合物用微波照射至100℃持续1h。冷却至室温后，将混合物用EtOAc和饱和NaCl水溶液稀释。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，然后减压浓缩。将得到的残余物通过快速色谱法(在DCM中的0至10％MeOH梯度)纯化，得到(2S)-4-[5,6-双(3-羟丙氧基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C20H27O7S)(ES,m/z):411[M+H]+.
中间体54：(2S)-4-[6-(二氟甲氧基)-5-羟基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001702
在-78℃下向(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(177mg,0.601mmol)和KOH(1.0M在水中,120μL,l.2mmol)在ACN(5.5mL)和水(0.55mL)中的冷冻混合物中加入(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(170μL,0.96mmol)。移去冷却浴，并将反应混合物搅拌4小时。将混合物用EtOAc和水稀释。分离各层，然后将水层用EtOAc(×3)再次萃取。将合并的有机物用Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将得到的混合物通过快速色谱法(0-50％EtOAc的DCM溶液)纯化，得到粗(2S)-4-[6-(二氟甲氧基)-5-羟基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。通过SFC(15％MeOH(+0.25％DMEA)在CO2中)纯化所需的馏分，得到(2S)-4-[6-(二氟甲氧基)-5-羟基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，保留时间为4.4分钟。LCMS(C15H15F2O5S)(ES,m/z):345[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.25(s,1H),8.28(s,1H),7.83(s,1H),7.50(s,1H),7.18(t,J＝74.4Hz,1H),3.59(s,3H),3.44(dd,J＝17.6,8.7Hz,1H),3.20(dd,J＝17.6,4.9Hz,1H),3.01-2.94(m,1H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
中间体55：4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001711
步骤1：4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870001712
于0℃下在Ar下将3,3-二甲基二氢呋喃-2,5-二酮(4.6g,36mmol)加入到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩(3.8g,18mmol)和AlCl3(3.lg,23mmol)在DCM(100mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后温热至室温并搅拌16小时。然后通过在0℃下将反应混合物缓慢加入到水(200mL)和EtOAc(500mL)的混合物中来淬灭反应混合物。将得到的混合物在20℃下搅拌1h，然后用HCl(2.0M在水中，36mL,72mmol)稀释。分离有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。然后通过硅胶色谱法纯化混合物，得到4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.
步骤2：4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001713
向4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸(2.3g,6.8mmol)在DMF(45mL)中的混合物中加入K2CO3(2.3g,17mmol)。10分钟后，加入CH3I(2.1mL,34mmol)，并将混合物在室温下搅拌18h。然后将混合物用水和Et2O稀释，分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。然后通过硅胶色谱法纯化混合物，得到4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H20FO5S)(ES,m/z):355[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),7.59(s,1H),3.92(s,3H),3.85(s,3H),3.57(s,3H),3.44(s,2H),1.23(s,6H).
步骤3：4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001721
向4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.1g,3.1mmol)和DCM(20mL)的混合物中加入AlCl3(1.7g,12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物倒入含有冰和1N HCl的烧瓶中，并搅拌5分钟。然后加入EtOAc。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。然后通过硅胶色谱法纯化混合物，得到4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),8.24(s,1H),7.47(s,1H),3.91(s,3H),3.57(s,3H),3.43(s,2H),1.23(s,6H).
中间体56：(1S,2R和1R,2S)-2-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷- 1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001722
步骤1：(1S,2R和IR,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸
Figure BDA0002716024870001723
在0℃下在氩气下将3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮(3.78g,33.7mmol)加入到5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩(4.1g,17mmol)和AlCl3(2.92g,21.9mmol)在DCM(100mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌2h，然后温热至室温。将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后在0℃下通过将反应混合物缓慢加入水(200mL)和EtOAc(500mL)的混合物中来淬灭反应混合物。使所得混合物温热至室温并搅拌1h。然后将混合物用HCl(2.0M在水中，34mL，68mmol)稀释。分离有机层，用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(0-100％[5％MeOH的EtOAc溶液]在DCM中洗脱)，得到(1S,2R和IR,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸。LCMS(C14H12BrO4S)(ES,m/z):355,357[M+H]+.
步骤2：(1S,2R和1R,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸 叔丁酯
Figure BDA0002716024870001731
在室温下和在氩气下将叔丁醇(25.8mL,270mmol)加入到BOC-酸酐(6.3mL,27mmol)、DMAP(0.33g,2.7mmol)和(1S,2R和1R,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷甲酸(4.8g,14mmol)在DCE(30mL)的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至50℃持续2h。然后将反应混合物冷却至室温，并减压浓缩，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至100％EtOAc的梯度)，得到(1S,2R和1R,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸叔丁酯。LCMS(C18H20BrO4S-C4H8)(ES,m/z):355,357[M+H-tBu]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.33(s,1H),8.26(s,1H),7.81(s,1H),3.95(s,3H),3.10-3.03(m,1H),2.32-2.25(m,1H),1.57-1.52(m,1H),1.32-1.28(m,1H),1.14(s,9H).
步骤3：(1S,2R和1R,2S)-2-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧 酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001732
将(1S,2R和1R,2S)-2-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸叔丁酯(1.64g,3.99mmol)、RockPhos Pd G3(0.100g,0.120mmol)、Cs2CO3(3.90g,12.0mmol)和(E)-苯甲醛肟(0.725g,5.98mmol)的混合物用Ar脱气5分钟。在氩气下加入DMF(1.0mL)，然后将混合物用氩气脱气5分钟。将反应混合物搅拌并加热至80℃持续18h。将反应混合物冷却至室温，并用水(100mL)和EtOAc(250mL)稀释。分离有机层，用水(50mL)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法纯化(在己烷中0至75％EtOAc的梯度)，得到(1S,2R和1R,2S)-2-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸叔丁酯。LCMS(C18H20O5SNa)(ES,m/z):371[M+Na]+.
中间体57：(S)-4-(5-氨基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870001741
步骤1：(S)-4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基- 4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001742
将(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.50g,1.4mmol)、二苯甲酮亚胺(0.45mL,2.7mmol)、Rac BINAP Pd G3(0.067g,0.067mmol)和Cs2CO3(0.878g,2.69mmol)用Ar脱气5分钟。在20℃下在氩气下加入甲苯(10.0mL)，然后将混合物用氩气脱气5分钟。将反应混合物搅拌并在氩气下加热至110℃持续18小时。然后将反应混合物冷却至室温，并用DCM(25mL)稀释。将混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到(S)-4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，其无需纯化即可使用。LCMS(C28H26NO4S)(ES,m/z):472[M+H]+.
步骤2：(S)-4-(5-氨基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001751
在20℃下将TFA(2.1mL,27mmol)加入到(S)-4-(5-((二苯基亚甲基)氨基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(635mg,1.35mmol)在DCM(5.0mL)中的混合物中。将所得混合物在20℃下搅拌30分钟。然后将反应混合物在减压下浓缩，以提供粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法(在DCM中的0至100％EtOAc梯度)纯化，得到(S)-4-(5-氨基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H18NO4S)(ES,m/z):308[M+H]+.
中间体58：4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001752
将4-(6-(苄氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(256mg,0.646mmol)和Pd/C(172mg,0.161mmol)的混合物用Ar脱气。在氩气下向混合物中缓慢加入EtOAc(5.0mL)、MeOH(5.0mL)和HCl(37％在水中，0.053mL，0.65mmol)。将反应混合物上方的顶部空间通过真空脱气并用H2回填。将得到的混合物在H2下搅拌24h。然后将反应混合物通过CELITE过滤，用EtOAc洗涤。减压浓缩滤液，得到粗产物残余物。粗产物残余物通过硅胶色谱法(用0-100％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化，得到4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H19O4S-C4H8)(ES,m/z):251[M+H-tBu]+.
中间体59：4-(5-溴苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001753
步骤1：5-溴苯并[b]噻吩-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001754
在3分钟内，在0℃下将(COCl)2(0.30mL,3.4mmol)在搅拌下逐滴加入到5-溴苯并[b]噻吩-2-羧酸(0.750g,2.92mmol)在CH2Cl2(15mL)中的混合物中。向该反应中加入DMF(0.023mL,0.29mmol)。接着是另外的(COCl)2(0.20mL,2.3mmol)。然后将反应混合物在0℃下搅拌1h。从冰水浴中移出反应烧瓶，并在室温下继续搅拌1.5小时。浓缩反应得到5-溴苯并[b]噻吩-2-羰基氯，其无需进一步纯化或表征即可使用。
步骤2：4-(5-溴苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001761
将CuCl(0.269g,2.72mmol)加入到100mL带搅拌棒的圆底烧瓶中。将烧瓶抽空，然后用N2回充三次。向烧瓶中加入THF(6.0mL)，然后将其搅拌并在冰水浴中冷却至0℃。在搅拌下于0℃在3分钟内将(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，11mL，5.5mmol)逐滴加入到CuCl混合物中。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟。在搅拌下于0℃在7分钟内将5-溴苯并[b]噻吩-2-羰基氯(0.75g,2.7mmol)在NMP(24mL)中的混合物滴加到前述混合物中。将所得混合物在0℃下搅拌2h。然后将反应混合物在乙酸异丙酯(300mL)和10％柠檬酸钠(300mL)水溶液之间分配。将所得混合物搅拌20分钟。分离各层，并将水层用乙酸异丙酯(150mL)萃取。合并有机层，用NaCl水溶液洗涤，然后用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥并过滤，使滤液静置过夜。然后将滤液过滤，并将滤液浓缩，得到粗残余物。将粗残余物用丙酮加载到硅胶柱上。通过向其中吹入加压的氮气使柱干燥。然后将干燥的柱用己烷中030％EtOAc梯度洗脱。收集所有含有产物的级分，浓缩，并通过硅胶色谱法(在己烷中0 25％EtOAc梯度)纯化。将含有产物的级分浓缩并通过非手性SFC(Phenomenex联苯，21mm×250mm柱，90:10CO2:MeOH，w/0.25％DMEA，70mL/min，100巴出口压力，18.5mg/mLMeOH/MeCN上样浓度，1.6mL进样量，215nm检测)纯化，得到4-(5-溴苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H17BrNaO3S)(ES,m/z):391,393[M+Na]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.05(s,1H),7.94(s,1H),7.75(d,J＝8.6Hz,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.74(t,J＝6.6Hz,2H),1.46(s,9H).
中间体60：4-(5-氯-6-甲氧基噻吩[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870001771
抽真空含有CuCl(0.76g,7.6mmol)的烧瓶，然后用N2吹扫三次。加入THF(15mL)，并将混合物冷却至0℃。在10分钟内滴加(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，3lmL，16mmol)。30分钟后，加入5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯(2.0g,7.6mmol)，然后加入NMP(15mL)。然后将混合物温热至室温。1小时后，将混合物冷却至0℃，并加入浓NH4OH水溶液(4.5mL)。向该混合物中加入水(240mL)和MeOH(60mL)。将混合物搅拌5min，并在水浴超声仪中超声处理。将得到的混合物过滤，并将沉淀物用水洗涤，然后用己烷洗涤。分离沉淀物并真空干燥。然后将沉淀物在EtOAc和10％柠檬酸钠水溶液之间分配。分离各层，水层用EtOAc洗涤。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。在浓缩过程中发生沉淀，将沉淀通过过滤收集，用EtOAc洗涤，并在真空下干燥，得到4-(5-氯-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C16H19ClNO4S)(ES,m/z):356[M+H]+.1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.03(s,1H),7.62(s,1H),4.04(s,3H),3.30(t,J＝6.4Hz,2H),2.74(t,J＝6.4Hz,2H),1.46(s,9H).
中间体61：(S)-4-(2-(3-溴丙基)-4-甲氧基噻吩并[2’,3’:5,6]苯并[1,2-d]噁 唑-7-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001772
步骤1：(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基-4-硝基苯并[b]噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001781
向20mL小瓶中加入(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(100mg,0.21mmol)和EtOAc(3.0mL)。加入HNO3(0.017mL,0.27mmol)，并将混合物搅拌1h。1小时后，将混合物在减压下浓缩，然后用Et2O(3.0mL)研磨。过滤收集得到的物质，得到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基-4-硝基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ12.08(s,1H),8.75(s,1H),7.53(s,1H),4.07(s,3H),3.74(s,3H),3.59(dd,J＝17.1,7.9Hz,1H),3.23-3.16(m,1H),3.16-3.09(m,1H),1.35(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：(S)-4-(2-(3-溴丙基)-4-甲氧基噻吩并[2’,3’:5,6]苯并[1,2-d]噁唑-7- 基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001782
向4mL小瓶中加入(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基-4-硝基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(45mg,0.13mmol)、钯(0.040g,0.038mmol)和MeOH(0.60mL)。向混合物中加入4-溴-1,1,1-三甲氧基丁烷(0.6lmL,3.8mmol)。将混合物在H2下搅拌1h。然后将混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩。将得到的残余物通过硅胶色谱法(在己烷中的0至70％EtOAc梯度)纯化，得到(S)-4-(2-(3-溴丙基)-4-甲氧基噻吩并[2’,3’:5,6]苯并[1,2-d]噁唑-7-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C19H21BrNO5S)(ES,m/z):454,456[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.36(s,1H),7.25(s,1H),4.11(s,3H),3.73(s,3H),3.62(t,J＝6.4Hz,2H),3.55(dd,J＝16.7,7.5Hz,1H),3.24(t,J＝7.3Hz,2H),3.18(dd,J＝13.5,6.8Hz,1H),3.12(dd,J＝16.7,5.8Hz,1H),2.53(p,J＝6.8Hz,2H),1.32(d,J＝7.0Hz,3H).
中间体88：(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001791
向(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.637g,1.72mmol)在ACN(15mL)中的冷却溶液中加入TMS-Cl(1.32mL,10.30mmol)。加入氰基硼氢化钠(0.65g,10mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌2h。反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭并用DCM萃取。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基丁酸甲酯。1HNMR(600MHz,DMSO-δ6)δ7.96(s,1H),7.66(s,1H),7.04(s,1H),3.88(s,3H),3.61(s,3H),2.87-2.83(m,2H),2.57-2.52(m,1H),2.00-1.94(m,1H),1.82-1.73(m,1H),1.14(d,J＝7.0Hz,3H).
如下表10所示，中间体89至93是或可以根据类似于上文中间体88中概述的步骤使用合适的起始原料制备，起始原料如制备中所述或从商业来源获得。
表10
Figure BDA0002716024870001792
Figure BDA0002716024870001801
中间体94：(2S)-4-(5-(3-羟基-2-甲基丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2- 甲基-4-氧代丁酸甲酯
2-
Figure BDA0002716024870001802
将2-甲基丙烷-1,3-二醇(146mg,1.62mmol)、(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(50mg,0.16mmol)、(E)-双(4-氯苄基)二氮烯-1,2-二羧酸酯(60mg,0.16mmol)和三苯基膦(43mg,0.16mmol)在NMP(0.30mL)中的混合物用Ar脱气，然后搅拌并加热至100℃持续3h。将反应混合物冷却至室温，并通过反相HPLC(ACN/具有0.1％TFA的水)直接纯化，得到(2S)-4-(5-(3-羟基-2-甲基丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C19H25O6S)(ES,m/z):381[M+H]+.
中间体95：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001811
步骤1：4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩- 2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001812
将4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(161mg,0.496mmol)和CPhos Pd G3(20mg,0.025mmol)加入到THF(2.5mL)中。密封反应混合物，将反应混合物上方的顶部空间抽真空并用氮气回填(3×)。将3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基溴化溴(0.50M在THF中,3.0mL,1.5mmol)加入到反应混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌96h。将反应混合物用EtOAc稀释，然后用NaHCO3水溶液萃取。分离水层,并用EtOAc(3×)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基-苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈。LCMS(C22H32NO3SSi)(ES,m/z):418[M+H]+.
步骤2：4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001813
将4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(165mg,0.395mmol)悬浮于MeOH(2.0mL)、水(2.0mL)和HOAc(2.0mL)的混合物中。将得到的悬浮液在室温下搅拌19小时。将反应混合物用NaHCO3水溶液稀释，然后用EtOAc(3×)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈。LCMS(C16H18NO3S)(ES,m/z):304[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),7.75(s,1H),7.61(s,1H),4.50-4.47(m,1H),3.90(s,3H),3.53-3.40(m,4H),2.79(t,J＝6.5Hz,2H),2.68(t,J＝7.4Hz,2H),1.79-1.66(m,2H).
步骤3：4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈
Figure BDA0002716024870001821
将三苯基膦(39mg,0.15mmol)加入到4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(45mg,0.15mmol)在THF(1.0mL)中的溶液中。将混合物冷却至0℃，然后加入NBS(26mg,0.15mmol)。1小时后，将另外的三苯基膦(23mg,0.089mmol)和NBS(13mg,0.074mmol)加入到反应混合物中。将混合物在0℃下再搅拌10分钟。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，然后用EtOAc稀释。分离有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基-苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈。LCMS(C16H17BrNO2SNa)(ES,m/z):388,390[M+Na]+.
中间体96：(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲 基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001822
步骤1：6-溴代噻吩并[3,2-b]吡啶
Figure BDA0002716024870001823
在空气气氛下，在室温下将AcOH(50mL)加入到2-溴丙二醛(3.56g,23.6mmol)和噻吩-3-基氨基甲酸叔丁酯(4.70g,23.6mmol)的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至100℃持续24h。然后将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(300mL)稀释。加入饱和NaHCO3水溶液，直到气体逸出停止为止。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(用EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化，得到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶。LCMS(C7H5BrNS)(ES,m/z):214,216[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.86(s,1H),8.74(s,1H),8.18(d,J＝5.4Hz,1H),7.58(d,J＝5.4Hz,1H).
步骤2：6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶4-氧化物
Figure BDA0002716024870001831
在0℃和氩气下，将mCPBA(1.49g,6.63mmol)加入到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶(1.42g,6.63mmol)在DCM(50mL)中的混合物中。然后将反应混合物温热至室温，并再搅拌24小时。然后将反应混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(用DCM中的[5％MeOH的EtOAc溶液]洗脱)纯化，得到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶4-氧化物。LCMS(C7H5BrNOS)(ES,m/z):230,232[M+H]+.
步骤3：6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-基乙酸酯
Figure BDA0002716024870001832
在N2(g)下在室温下将乙酸酐(20mL,210mmol)加入到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶4-氧化物(l.38g,6.00mmol)中。然后将反应混合物加热至140℃并搅拌4h。然后将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(200mL)和H2O(200mL)稀释。将NaHCO3缓慢分批加入反应混合物中，直到所有气体逸出停止。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(用DCM中的[5％MeOH的EtOAc溶液]洗脱)，得到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-基乙酸酯。LCMS(C9H7BrNO2S-C2H2O)(ES,m/z):230,232[M+H-乙酸酯]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.04(s,1H),8.29(d,J＝5.2Hz,1H),7.54(d,J＝5.4Hz,1H),2.41(s,3H).
步骤4：6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-醇
Figure BDA0002716024870001841
在20℃和N2(g)下将NaOH(2.0M在H2O中，4.0mL,8.0mmol)加入到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-基乙酸酯(431mg,1.58mmol)在MeOH(5.0mL)的溶液中。然后将反应混合物在20℃下搅拌1h。将反应混合物用HCl(1.0M在H2O中,8.0mL,8.0mmol)淬灭，然后通过加入H2O(10mL)稀释。将反应混合物搅拌30分钟，然后过滤。将收集的物质用另外的H2O(10mL)洗涤，然后在减压下干燥，以提供6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-醇。LCMS(C7H5BrNOS)(ES,m/z):230,232[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ12.65(s,1H),8.59(s,1H),7.91(d,J＝5.3Hz,1H),6.99(d,J＝5.1Hz,1H).
步骤5：6-溴-5-氯噻吩并[3,2-b]吡啶
Figure BDA0002716024870001842
在20℃下在N2(g)下，将氯氧化磷(l5.2mL,163mmol)加入到6-溴噻吩并[3,2-b]吡啶-5-醇(375mg,1.63mmol)中。然后将反应混合物搅拌并加热至100℃持续2天。将反应混合物冷却至室温，并通过将反应混合物滴加至饱和NaHCO3水溶液中淬灭。将反应混合物进一步用EtOAc(250mL)稀释并搅拌。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到6-溴-5-氯噻吩并[3,2-b]吡啶，其无需纯化即可使用。LCMS(C7H4BrClNS)(ES,m/z):248,250[M+H]+.
步骤6：6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶
Figure BDA0002716024870001843
在20℃下在N2(g)下，将NaOMe(25％在MeOH中，3.24mL,14mmol)加入到6-溴-5-氯噻吩并[3,2-b]吡啶(352mg,1.42mmol)在MeOH(10mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并在微波反应器中加热至100℃持续1h。将反应混合物用柠檬酸(1.0M在H2O中，28mL，28mmol)淬灭，并用EtOAc(250mL)稀释。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化(在DCM中的[5％MeOH的EtOAc溶液]洗脱)，得到6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶。LCMS(C8H7BrNOS)(ES,m/z):244,246[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,1H),8.09(d,J＝5.3Hz,1H),7.44(d,J＝5.2Hz,1H),3.99(s,3H).
步骤7：6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸
Figure BDA0002716024870001851
在-78℃下将LDA(2.0M在THF中，12.3mL，24.6mmol)加入到6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶(5.0g,20mmol)在THF(100mL)的溶液中。将混合物老化15分钟，然后通过在-78℃下加入CO2(g)淬灭。然后在10分钟内将反应混合物温热至0℃。将反应混合物在0℃下用HCl(2.0M在水中,12.3mL,24.6mmol)淬灭，然后用EtOAc(500mL)稀释。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物悬浮在DCM(90mL)中，并搅拌1h。然后在室温下约4小时内，通过加料漏斗滴加己烷(250mL)。然后将得到的悬浮液在室温下再搅拌16小时。然后将悬浮液过滤，并将残余物用己烷/DCM的4:1混合物(50mL)洗涤。将残余物真空干燥，得到6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸。LCMS(C9H7BrNO3S)(ES,m/z):288,290[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ13.79(s,1H),8.87(s,1H),7.93(s,1H),4.01(s,3H).
步骤8：6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯
Figure BDA0002716024870001852
于0℃下在Ar下将DMF(8μL,0.1mmol)加入到6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羧酸(1.05g,3.64mmol)和草酰氯(0.64mL,7.3mmol)在THF(40mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌1h。将反应混合物减压浓缩，得到6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯，将其直接用于后续步骤。
步骤9：(S)-4-(6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870001861
在0℃下在Ar下将(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)溶液(0.5M在THF中，14.6mL，7.29mmol)缓慢加入到含有氯化亚铜(I)(0.361g,3.64mmol)的烘干烧瓶中。将反应混合物在0℃下在Ar下搅拌20min。在0℃下然后通过插管将6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-羰基氯(1.12g,3.64mmol)在THF(10mL)和NMP(5.0mL)中的氩气脱气溶液缓慢加入到反应混合物；将得到的溶液温热至室温，并在室温下再搅拌18小时。将反应混合物冷却至0℃，并通过加入饱和NH4Cl水溶液(50mL)和EtOAc(100mL)淬灭。将得到的两相混合物温热至室温，并再搅拌1小时。然后将混合物过滤，并将滤液用另外的EtOAc(250mL)和盐水(50mL)稀释。分离有机层，用另外的盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H15BrNO4S)(ES,m/z):372,374[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.87(s,1H),8.37(s,1H),4.02(s,3H),3.59(s,3H),3.52(dd,J＝17.9,8.7Hz,1H),3.27(dd,J＝18.0,4.5Hz,1H),3.03-2.91(m,1H),1.20(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤10：(S)-(5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)噻吩并[3,2-b]吡 啶-6-基)硼酸
Figure BDA0002716024870001862
将(S)-4-(6-溴-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(700mg,1.88mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(597mg,2.351mmol)、Pd2(dba)3(43mg,0.047mmol)、三环己基膦(53mg,0.19mmol)和乙酸钾(烘干)(295mg,3.01mmol)的混合物用Ar脱气5分钟。在室温下加入二噁烷(15mL)，并将所得混合物用Ar脱气5分钟。然后将反应混合物加热至80℃，并在氩气下搅拌18小时。将反应混合物冷却至室温，然后用EtOAc(20mL)稀释。将悬浮液在室温下搅拌10分钟，然后通过CELITE过滤，用EtOAc(20mL)洗涤。减压浓缩滤液，得到(S)-(5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)硼酸，其无需纯化即可用于后续步骤。LCMS(C14H17BNO6S)(ES,m/z):338[M+H]+.
步骤11：(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基噻吩并[[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870001871
室温下将
Figure BDA0002716024870001872
(KHSO5·1/2KHSO4·1/2K2SO4；0.2M在水中,14.10mL,2.82mmol)的溶液加入到(S)-(5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)硼酸(634mg,1.88mmol)在丙酮(20mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌30min。通过加入亚硫酸氢钠(587mg,5.64mmol)的水(5mL)溶液淬灭反应混合物，然后搅拌5分钟。将反应混合物用DCM(200mL)稀释。分离有机层，并用另外的DCM(2×50mL)洗涤水层。合并有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H16NO5S)(ES,m/z):310[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.46(s,1H),8.23(s,1H),7.66(s,1H),3.97(s,3H),3.60(s,3H),3.44(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.20(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.00-2.92(m,1H),1.19(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤12：(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基- 4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001873
在室温下将1-溴-3-氯丙烷(244mg,1.55mmol)加入到(S)-4-(6-羟基-5-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(96mg,0.31mmol)和碳酸钾(257mg,1.86mmol)在DMF(1.0mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至50℃持续4h。将反应混合物冷却至室温并过滤，然后将溶剂化物直接通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到(S)-4-(6-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基噻吩[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C17H21ClNO5S)(ES,m/z):386[M+H]+.
中间体97：(S)-4-(5-(3-溴丙基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001881
步骤1：(S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)苯并[b]噻吩-2- 基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001882
将(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(750mg,2.30mmol)、DCM(10mL)、Hunig碱(2.0mL,11mmol)和三氟甲磺酸酐(1.0M在DCM中，3.5mL，3.5mmol)合并。将反应混合物在室温下搅拌20min。然后将反应混合物用水淬灭并用DCM稀释。分离有机层，用饱和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H15F4O7S2)(ES,m/z):459[M+H]+.1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.52(s,1H),7.93(s,1H),4.03(s,3H),3.61(s,3H),3.53(dd,J＝17.8,8.7Hz,1H),3.27(dd,J＝17.8,5.0Hz,1H),3.05-2.92(m,1H),1.21(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤2：(2S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并 [b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001891
将(S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.00g,2.18mmol)、CPhos PdG4(0.088g,0.11mmol)和(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，8.7mL，4.4mmol)合并在小瓶中。将反应混合物在40℃加热2h。通过CELITE过滤反应混合物，然后在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(2S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C23H30FO6S)(ES,m/z):453[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,1H),7.52(s,1H),4.54(t,J＝3.4Hz,1H),3.92(s,3H),3.75-3.70(m,1H),3.69-3.62(m,1H),3.60(s,3H),3.49(dd,J＝17.7,8.7Hz,1H),3.44-3.39(m,1H),3.38-3.28(m,1H),3.25(dd,J＝17.6,5.0Hz,1H),3.02-2.92(m,1H),2.80-2.70(m,2H),1.84-1.76(m,2H),1.76-1.67(m,1H),1.63-1.57(m,1H),1.50-1.40(m,4H),1.20-1.17(m,3H).
步骤3：(S)-4-(5-(3-溴丙基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001892
将(2S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(350mg,0.773mmol)和DCM(5mL)合并在小瓶中。将三苯基膦二溴化物(653mg,1.55mmol)加入反应混合物中并搅拌30分钟。将反应混合物用水淬灭。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-(3-溴丙基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H21BrFO4S)(ES,m/z):431,433[M+H]+.
中间体98：(S)-4-(4-氟-5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001901
将(2S)-4-(4-氟-6-甲氧基-5-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(350mg,0.773mmol)、MeOH(5mL)和Mp-TsOH(1.00g,4.33mmol)合并在小瓶中。将反应混合物摇动2小时。然后将反应混合物过滤，用MeOH洗涤，并在减压下浓缩以提供(S)-4-(4-氟-5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H22FO5S)(ES,m/z):369[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,1H),7.51(s,1H),3.92(s,3H),3.60(s,3H),3.50(dd,J＝17.7,8.7Hz,1H),3.44(t,J＝6.5Hz,2H),3.25(dd,J＝17.4,4.7Hz,1H),3.02-2.93(m,1H),2.71(t,J＝7.4Hz,2H),1.69-1.63(m,2H),1.20(d,J＝7.0Hz,3H).
中间体99：2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001902
步骤1：2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸
Figure BDA0002716024870001903
在0℃下将氯化铝(0.923g,6.92mmol)加入到4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩(1.13g,5.32mmol)和3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮(1.19g,10.7mmol)在DCM(20.0mL)中的混合物中。将反应混合物加热至室温,然后搅拌18小时。将反应混合物冷却至0℃,并用水(50mL)淬灭。然后将混合物用EtOAc(500mL)稀释。分离有机层,用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸，其无需纯化即可用于后续步骤。LCMS(C15H14FO5S)(ES,m/z):325[M+H]+.
步骤2：2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001911
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在乙醚中，4.3mL，8.6mmol)逐滴加入至2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸(1.40g,4.32mmol)在DCM(20mL)和MeOH(20mL)的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物用HOAc淬灭。然后将反应混合物在减压下浓缩。残留物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸甲酯。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.1HNMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,1H),7.59(s,1H),3.93(s,3H),3.87(s,3H),3.48(s,3H),3.31-3.25(m,1H),2.47-2.41(m,1H),1.62-1.58(m,1H),1.44-1.40(m,1H).
步骤3：2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基]环丙烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001912
在室温下将氯化铝(2.66g,20.0mmol)分批加入至2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸甲酯(1.50g,4.43mmol)在DCM(40mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下在Ar下搅拌6h。将反应混合物冷却至0℃，然后用水(50mL)缓慢淬灭。将反应混合物用另外的DCM(250mL)稀释。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丙烷羧酸甲酯。LCMS(C15H14FO5S)(ES,m/z):325[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),8.29(s,1H),7.48(s,1H),3.92(s,3H),3.48(s,3H),3.30-3.23(m,1H),2.45-2.39(m,1H),1.61-1.57(m,1H),1.43-1.38(m,1H).
中间体100：(R)-4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001921
步骤1：(R)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001922
将5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(3.00g,9.82mmol)和THF(98mL)合并。然后将反应混合物用Ar脱气10分钟。向反应混合物中加入CPhos Pd G4(0.081g,0.098mmol)，并将混合物冷却至0℃。然后通过加料漏斗将(S)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，21mL，11mmol)加入到反应混合物中。将混合物在0℃下搅拌1h。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并用EtOAc稀释。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16BrO4S)(ES,m/z):371,373[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.28-8.26(m,2H),7.82(s,1H),3.95(s,3H),3.60(s,3H),3.44(dd,J＝17.6,8.6Hz,1H),3.21(dd,J＝17.6,5.1Hz,1H),3.03-2.93(m,1H),1.20(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤2：(R)-4-(5-(3-叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻 吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
将Phos Pd G3(74mg,0.215mmol)、然后(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，9.7mL,4.9mmol)加入到(R)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.00g,2.69mmol)在THF(13.5mL)中的混合物中。将反应混合物在40℃加热3h。将反应混合物冷却至室温，用水淬灭，并用EtOAc稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C24H37O5SSi)(ES,m/z):465[M+H]+.
步骤3：(R)-4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001932
将(R)-4-(5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.04g,2.24mmol)悬浮于MeOH(4mL)、水(4mL)和HOAc(4mL)的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌3.5h。将反应混合物用EtOAc和水稀释。分离水层，并用另外的EtOAc(3×)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-4-(5-(3-羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H23O5S)(ES,m/z):351[M+H]+.
步骤4：(R)-4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001933
于0℃下将NBS(518mg,2.91mmol)加入到(R)-4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(680mg,1.94mmol)和三苯基膦(814mg,3.10mmol)在THF(9.7mL)中的混合物中。1.5小时后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，然后用EtOAc稀释。分离有机层，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H22BrO4S)(ES,m/z):413,415[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),7.77(s,1H),7.62(s,1H),3.90(s,3H),3.60(s,3H),3.55(t,J＝6.6Hz,2H),3.43(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.20(dd,J＝17.5,5.1Hz,1H),3.04-2.94(m,1H),2.83-2.77(m,2H),2.14-2.08(m,2H),1.20(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体101、102、103和104：(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b] 噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或lS,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻 吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻 吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻 吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001941
步骤1：(顺式)-2-(4-氟-5 6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸
Figure BDA0002716024870001942
在0℃下将氯化铝(776mg,5.82mmol)加入4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩(950mg,4.48mmol)和3-氧杂双环[3.2.0]庚烷-2,4-二酮(1130mg,8.95mmol)在DCM(20.0mL)的混合物中。将反应混合物加热至室温，然后搅拌18小时。将反应混合物冷却至0℃，然后通过滴加水(50mL)淬灭。然后将混合物用另外的DCM(200mL)稀释。分离有机层，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(顺式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸，其无需纯化即可用于下一步。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.
步骤2：(顺式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001951
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在乙醚中，4.0mL，8.0mmol)滴加到(顺式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸(1.35g,3.99mmol)在DCM(20mL)和MeOH(20mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物用HOAc淬灭。然后将反应混合物在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到(顺式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸甲酯。LCMS(C17H18FO5S)(ES,m/z):353[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.58(s,1H),4.59-4.50(m,1H),3.93(s,3H),3.86(s,3H),3.68(q,J＝8.9,8.5Hz,1H),3.41(s,3H),2.34-2.10(m,4H).
步骤3：(反式)-2-(4-氟-5-6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸
Figure BDA0002716024870001952
在室温下将NaOH(5.0M,1.8mL,9.0mmol)加入到(顺式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸甲酯(650mg,1.85mmol)在MeOH(25mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌4h。将反应混合物用TFA(0.85mL,11mmol)淬灭，然后用DCM(250mL)稀释。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(MeOH/DCM)纯化，得到(反式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.
步骤4：(反式)-2-(4-氟-56-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001961
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在乙醚中，1.7mL，3.4mmol)滴加到(反式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸(570mg,1.69mmol)在DCM(20mL)和MeOH(20mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物用HOAc淬灭。然后将反应混合物在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到(反式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸甲酯。LCMS(C17H18FO5S)(ES,m/z):353[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.22(s,1H),7.60(s,1H),4.42(q,J＝9.0Hz,1H),3.93(s,3H),3.86(s,3H),3.63(s,3H),3.58-3.48(m,1H),2.38-2.30(m,1H),2.26-2.18(m,1H),2.17-2.10(m,2H).
步骤5：(1R,2R或lS,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁 烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁 烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁 烷-1-羧酸甲酯，(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁 烷-1-羧酸甲酯
Figure BDA0002716024870001962
在室温下将AlCl3(1.10g,8.27mmol)加入到(反式)-2-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷羧酸甲酯(530mg,1.50mmol)在DCM(40mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下在Ar下搅拌6h。将反应混合物冷却至0℃，然后用水(50mL)缓慢淬灭。然后将反应混合物用另外的DCM(250mL)稀释。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到(+/-反式)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯和(+/-反式)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯的混合物。外消旋区域异构体的混合物通过手性SFC(CCA柱，在CO2中的20％[含0.25％DMEA的MeOH])纯化，得到:
峰1(3.0min)：(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ10.58(br s,1H),8.15(s,1H),7.24(s,1H),4.45-4.34(m,1H),3.86(s,3H),3.62(s,3H),3.56-3.47(m,1H),2.36-2.24(m,1H),2.25-2.16(m,1H),2.16-2.07(m,2H).
峰2(3.5min)：(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.
峰3(3.9分钟)：(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),8.14(s,1H),7.48(s,1H),4.45-4.38(m,1H),3.92(s,3H),3.62(s,3H),3.58-3.49(m,1H),2.38-2.27(m,1H),2.25-2.19(m,1H),2.17-2.09(m,2H).
峰4(5.0分钟)：(1R,2R或1S,2S)-2-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基)环丁烷-1-羧酸甲酯。LCMS(C16H16FO5S)(ES,m/z):339[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.14(s,1H),7.48(s,1H),4.44-4.38(m,1H),3.92(s,3H),3.62(s,3H),3.55-3.49(m,1H),2.38-2.26(m,1H),2.26-2.17(m,1H),2.17-2.10(m,2H).
中间体105：(R)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001981
步骤1：(R)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001982
将4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(1.00g,3.64mmol)和THF(36.4mL)的混合物用Ar脱气10分钟。向混合物中加入CPhos Pd G4(0.030g,0.036mmol)，并将反应混合物冷却至0℃。然后通过加料漏斗将(S)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，8.0mL,4.0mmol)加入到反应混合物中。将混合物在0℃下搅拌1h。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，然后用EtOAc稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18FO5S)(ES,m/z):341[M+H]+.
步骤2：(R)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870001983
在室温下将AlCl3(1.6g,8.72mmol)加入到(R)-4-(4-氟-5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.742g,2.18mmol)在DCM(22mL)的混合物中。将反应混合物搅拌18小时。然后将反应混合物冷却至0℃，并通过加入水(50mL)和HCl(1.0M在水中，50mL,50mmol)淬灭。然后将反应混合物用EtOAc稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(R)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，其无需纯化即可使用。LCMS(C15H16FO5S)(ES,m/z):327[M+H]+.
中间体106：(S)-4-(4-氯-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001991
在室温下将NCS(1mg,0.081mmol)加入到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(25mg,0.081mmol)在DMF(0.25mL)中的混合物中。然后将反应混合物加热至40℃并搅拌2h。将反应混合物冷却至室温，并通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)直接纯化，得到(S)-4-(4-氯-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16ClO5S)(ES,m/z):343[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.16(s,1H),7.63(s,1H),3.94(s,3H),3.60(s,3H),3.50(dd,J＝17.8,8.7Hz,1H),3.31-3.23(m,1H),3.02-2.92(m,1H),1.20(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体107：(S)-4-(4-溴-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870001992
在室温下将NBS(14mg,0.081mmol)加入到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(25mg,0.081mmol)在DMF(0.25mL)中的混合物中。然后将反应混合物加热至40℃并搅拌2h。将反应混合物冷却至室温，并通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)直接纯化，得到(S)-4-(4-溴-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16BrO5S)(ES,m/z):387,389[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.82(s,1H),8.08(s,1H),7.66(s,1H),3.94(s,3H),3.60(s,3H),3.50(dd,J＝17.8,8.7Hz,1H),3.31-3.24(m,1H),3.03-2.92(m,1H),1.21(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体108：4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002001
步骤1：4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002002
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在乙醚中，5.5mL，11mmol)滴加到4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸(2.15g,7.30mmol)在DCM(50mL)和MeOH(50mL)的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌1h。将反应混合物用HOAc淬灭。将反应混合物减压浓缩，得到4-(5,6-二甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯，其无需纯化即可用于下一步。LCMS(C15H17O5S)(ES,m/z):309[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.22(s,1H),7.61(s,1H),7.49(s,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.61(s,3H),3.35-3.30(m,2H),2.71-2.66(m,2H).
步骤2：4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯和4-(5-羟基- 6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002003
室温下将AlCl3(5.7lg,42.8mmol)加入到4-(5,6-二甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(2.20g,7.13mmol)在DCM(250mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌24h。将反应混合物冷却至0℃，并用水(50mL，通过加料漏斗滴加)淬灭。然后将反应混合物温热至室温，并用另外的DCM(250mL)稀释。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(77％)和4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(23％)的不可分离的混合物。LCMS(C14H15O5S)(ES,m/z):295[M+H]+.
步骤3：4-(5-(((苄氧基)羰基)氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸 甲酯和4-(6-(((苄氧基)羰基)氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002011
在0℃下将CBZ-Cl(1.06mL,7.42mmol)加入到4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(77％)和4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(23％)(l.82g,6.l8mmol)和TEA(l.29mL,9.28mmol)在DCM(30mL)中的混合物中。然后将反应混合物温热至室温，并再搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩并将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到：
峰1：4-(5-(((苄氧基)羰基)氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C22H21O7S)(ES,m/z):429[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),7.89(s,1H),7.84(s,1H),7.48-7.38(m,5H),5.30(s,2H),3.87(s,3H),3.61(s,3H),3.40-3.33(m,2H),2.69(t,J＝6.4Hz,2H).
峰2：4-(6-(((苄氧基)羰基)氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C22H21O7S)(ES,m/z):429[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),8.01(s,1H),7.71(s,1H),7.47-7.37(m,5H),5.31(s,2H),3.85(s,3H),3.62(s,3H),3.41-3.36(m,2H),2.74-2.68(m,2H).
步骤4：4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002021
在室温下将1-甲基哌嗪(1.4mL,13mmol)加入到4-(6-(((苄氧基)羰基)氧基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(1.84g,4.29mmol)在DMF(5mL)和MeOH(5mL)中的混合物中。然后将反应混合物加热至50℃并再搅拌30分钟。将反应混合物冷却至室温，并在减压下部分浓缩。粗混合物通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)纯化，得到4-(6-羟基-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H15O5S)(ES,m/z):295[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.88(s,1H),8.18(s,1H),7.47(s,1H),7.32(s,1H),3.86(s,3H),3.61(s,3H),3.33-3.29(m,2H),2.71-2.66(m,2H).
中间体109：(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔 丁酯
Figure BDA0002716024870002022
步骤1：(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002023
向(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(3.00g,9.73mmol)在MeOH(97mL)和THF(97mL)的混合物中加入NaOH(5.0M在水中，39mL，200mmol)。将混合物加热到50℃持续1.5小时。将反应混合物冷却至室温，并用HCl(2.0M在水中，100mL，200mmol)酸化至pH为约3。将混合物用EtOAc和水稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C14H15O5S)(ES,m/z):295[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),9.39(s,1H),8.17(s,1H),7.54(s,1H),7.32(s,1H),3.88(s,3H),3.38(dd,J＝17.3,8.5Hz,1H),3.07(dd,J＝17.3,5.3Hz,1H),2.94-2.83(m,1H),1.18(d,J＝7.2Hz,3H).
步骤2：(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870002031
在室温下将2-叔丁基-1,3-二异丙基异脲(2.3mL,10mmol)加入到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸(1.00g,3.40mmol)在DMF(6.8mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。将混合物用EtOAc和水稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C18H23O5S+Na)(ES,m/z):373[M+Na]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),8.17(s,1H),7.54(s,1H),7.31(s,1H),3.88(s,3H),3.36-3.30(m,1H),3.05(dd,J＝17.1,5.0Hz,1H),2.90-2.79(m,1H),1.35(s,9H),1.16(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体110：(S)-4-(4,7-二氯-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002032
在20℃下将NCS(433mg,3.24mmol)加入到(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(500mg,1.62mmol)在DMF(4.0mL)中的混合物中。然后将反应混合物加热至40℃并搅拌2h。将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(100mL)稀释。用水(3×25mL)和盐水(1×25mL)洗涤混合物。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，然后通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)进一步纯化，得到(S)-4-(4,7-二氯-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H15Cl2O5S)(ES,m/z):377,379[M+H]+.
中间体111：(S)-4-(5-(3-溴-2,2-二甲基丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩- 2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002041
室温下将1,3-二溴-2,2-二甲基丙烷(176mg,0.766mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(25mg,0.077mmol)和碳酸钾(42mg,0.31mmol)在DMF(0.5mL)中的混合物中。然后将反应混合物搅拌并加热至100℃持续24h。将反应混合物冷却至室温，用DCM(2mL)稀释，并过滤。滤液通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)直接纯化，得到(S)-4-(5-(3-溴-2,2-二甲基丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C20H25BrFO5S)(ES,m/z):475,477[M+H]+.
中间体112(S)-4-(5-((1-(溴甲基)环丙基)甲氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻 吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002042
在室温下将1,1-双(溴甲基)环丙烷(175mg,0.766mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(25mg,0.077mmol)和碳酸钾(42mg,0.31mmol)在DMF(0.5mL)中的混合物中。然后将反应混合物搅拌并加热至40℃持续4h。将反应混合物冷却至室温,用DCM(2mL)稀释，并过滤。滤液通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)直接纯化，得到(S)-4-(5-((1-(溴甲基)环丙基)甲氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C20H23BrFO5S)(ES,m/z):473,475[M+H]+.
中间体113：(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002051
步骤1：(S)-4-(5-溴-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002052
在室温下将AlCl3(3.23g,24.2mmol)加入到(S)-4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.50g,4.04mmol)在DCM(35mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至35℃持续24小时。将反应混合物冷却至0℃，然后通过缓慢加入水(10mL)淬灭。然后将混合物温热至室温，再搅拌15分钟。用DCM(250mL)稀释反应混合物，并分离有机层。有机层用盐水(50mL)洗涤。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-溴-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H14BrO4S)(ES,m/z):357,359[M+H]+.
步骤2：(S)-4-(5-溴-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870002053
在0℃下将MOM-Cl(0.91mL,12mmol)加入到(S)-4-(5-溴-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.42g,3.98mmol)和Hunig碱(4.2mL,24mmol)在DCM(25mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌1h，然后温热至室温，再搅拌24h。通过加入饱和NaHCO3水溶液(10mL)淬灭反应混合物，然后用EtOAc(250mL)和水(50mL)稀释。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-溴-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18BrO5S)(ES,m/z):401,403[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),8.28(s,1H),7.87(s,1H),5.41(s,2H),3.60(s,3H),3.48-3.42(m,1H),3.45(s,3H),3.22(dd,J＝17.6,5.1Hz,1H),3.04-2.93(m,1H),1.20(d,J＝7.4Hz,3H).
步骤3：(S)-4-(6-(甲氧基甲氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷- 2-基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002061
将(S)-4-(5-溴-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.57g,3.91mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(1.19g,4.70mmol)、Pd2(dba)3(0.179g,0.196mmol)、三环己基膦(0.219g,0.783mmol)和乙酸钾(0.614g,6.26mmol)的混合物用Ar脱气5分钟。在室温下加入二噁烷(20mL)，并将所得混合物用Ar脱气5min。然后将反应混合物加热至90℃并在Ar下搅拌6h。将反应混合物冷却至室温，然后用EtOAc(50mL)稀释。将悬浮液在室温下搅拌10分钟，然后通过CELITE过滤，用EtOAc(50mL)洗涤。减压浓缩滤液，得到(S)-4-(6-(甲氧基甲氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯，其无需纯化即可用于后续步骤。LCMS(C22H30BO7S)(ES,m/z):449[M+H]+.
步骤4：(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870002062
室温下将
Figure BDA0002716024870002063
(0.20M在水中,21mL,4.3mmol)的溶液加入到(S)-4-(6-(甲氧基甲氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(1.75g,3.90mmol)在丙酮(50mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌60min。将反应混合物通过加入亚硫酸氢钠(0.81g,7.8mmol)的水(5mL)溶液淬灭，然后搅拌5分钟。将反应混合物用EtOAc(250mL)稀释。分离有机层，并将水层用另外的EtOAc e(2×100mL)洗涤。合并有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到频哪醇副产物污染的(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。分离的物质通过硅胶色谱法(EtOAc/DCM)再纯化，得到(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)-苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H19O6S)(ES,m/z):339[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),8.20(s,1H),7.61(s,1H),7.37(s,1H),5.29(s,2H),3.60(s,3H),3.44(s,3H),3.43-3.38(m,1H),3.18(dd,J＝17.5,5.1Hz,1H),3.03-2.91(m,1H),1.19(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体114：(S)-4-(4-氯-5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲 基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002071
室温下将NCS(99mg,0.74mmol)加入到(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(250mg,0.74mmol)在DMF(2.0mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至40℃持续2h。将反应混合物冷却至室温，然后直接通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(4-氯-5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18ClO6S)(ES,m/z):373[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ9.83(s,1H),8.17(s,1H),7.67(s,1H),5.35(s,2H),3.60(s,3H),3.51(dd,J＝17.8,8.7Hz,1H),3.46(s,3H),3.27(dd,J＝17.8,5.0Hz,1H),3.02-2.91(m,1H),1.20(d,J＝7.2Hz,3H).
中间体115(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2- 基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002081
步骤1：(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002082
在0℃下将三溴化硼(1.0M在DCM中，31mL，31mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(2.0g,6.1mmol)在DCM(100mL)的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至30℃持续2h。将反应混合物冷却至0℃，然后通过滴加MeOH(10mL)淬灭。将反应混合物再搅拌15分钟。然后将反应混合物用水(100mL)和另外的DCM(500mL)稀释。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸，其无需纯化即可用于后续步骤。LCMS(C13H12FO5S)(ES,m/z):299[M+H]+.
步骤2：(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002083
在0℃下将TMS-重氮甲烷(2.0M在乙醚中，3.1mL，6.2mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸(1.83g,6.14mmol)在DCM(10mL)和MeOH(10mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物用HOAc淬灭，然后在减压下浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到所需产物。分离的物质通过硅胶色谱法([25％EtOH的EtOAc溶液]/己烷)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H14FO5S)(ES,m/z):313[M+H]+.
步骤3：(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯和(S)-4-(4-氟-6-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002091
于0℃下将MOM-Cl(0.12mL,1.6mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5,6-二羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(460mg,1.47mmol)和Hunig碱(0.52mL,3.0mmol)在DCM(25mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌1h，然后温热至室温，再搅拌24h。通过加入饱和NaHCO3水溶液(10mL)淬灭反应混合物，然后用EtOAc(250mL)和水(50mL)稀释。分离有机层，用盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯和(S)-4-(4-氟-6-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯的不可分离的混合物，其无需进一步纯化即可用于随后的反应。LCMS(C18H18FO6S)(ES,m/z):357[M+H]+.
步骤4：(S)-4-(6-(3-溴丙氧基)-4-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2- 甲基-4-氧代丁酸甲酯和(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩- 2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002092
室温下将1,3-二溴丙烷(0.58mL,5.6mmol)加入到(S)-4-(4-氟-5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯和(S)-4-(4-氟-6-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(270mg,0.75mmol)和碳酸钾(260mg,1.9mmol)在DMF(2.0mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物用EtOAc(250mL)和水(50mL)稀释。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到区域异构体的混合物。区域异构体的混合物通过反相HPLC(ACN/水，含0.1％TFA)纯化，得到：
HPLC上的第一个洗脱峰：(S)-4-(6-(3-溴丙氧基)-4-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C19H23BrFO6S)(ES,m/z):477,479[M+H]+.
HPLC上的第二个洗脱峰：(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C19H23BrFO6S)(ES,m/z):477,479[M+H]+.
中间体116：(S)-4-(5-羟基-4-(甲基氨基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁 酸甲酯
Figure BDA0002716024870002101
步骤1：(S)-4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002102
将6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-羰基氯(5.96g,19.5mmol)和CPhos Pd G4(0.160g,0.195mmol)合并到烧瓶中，并用Ar脱气5分钟。在氩气流下加入THF(75mL)，并将混合物冷却至0℃。然后逐滴加入(R)-(3-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)溴化锌(II)(0.50M在THF中，40mL，20mmol)，并将所得混合物在0℃下搅拌2h，然后温热至室温。将混合物在室温下搅拌3天。
将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(25mL)淬灭，然后用EtOAc(500mL)稀释。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H16BrO4S)(ES,m/z):371,373[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.39(s,1H),8.30(s,1H),7.65(s,1H),3.94(s,3H),3.61(s,3H),3.52-3.43(m,1H),3.28-3.18(m,1H),3.05-2.95(m,1H),1.23-1.18(m,3H).
步骤2：(S)-4-(6-溴-5-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002111
在室温下将AlCl3(366mg,2.75mmol)加入到(S)-4-(6-溴-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(170mg,0.458mmol)在DCM(35mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至45℃持续3天。将反应混合物冷却至0℃，然后通过缓慢加入水(10mL)淬灭。然后将混合物温热至室温，再搅拌15分钟。将反应混合物用DCM(250mL)稀释，分离有机层。有机层用盐水(50mL)洗涤。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(6-溴-5-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C14H14BrO4S)(ES,m/z):357,359[M+H]+.
步骤3：(S)-4-(6-溴-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 甲酯
Figure BDA0002716024870002112
在0℃下将Hunig碱(0.44mL,2.5mmol)加入到(S)-4-(6-溴-5-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(150mg,0.42mmol)和MOM-Cl(0.096mL,1.3mmol)在DCM(5.0mL)中的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌1h。将反应混合物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)直接纯化，得到(S)-4-(6-溴-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C16H18BrO5S)(ES,m/z):401,403[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.42(s,1H),8.33(s,1H),7.77(s,1H),5.38(s,2H),3.61(s,3H),3.53-3.42(m,4H),3.23(dd,J＝17.7,3.0Hz,1H),3.07-2.95(m,1H),1.21(d,J＝5.0Hz,3H).
步骤4：(S)-4-(6-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻 吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002121
在用Ar脱气的同时，在室温下向Ar脱气的(S)-4-(6-溴-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(144mg,0.359mmol)、甲基氨基甲酸叔丁酯(71mg,0.54mmol)、Pd2(dba)3(16mg,0.018mmol)、Xantphos(31mg,0.054mmol)和碳酸铯(234mg，0.718mmol)的混合物中加入二噁烷(4.0mL)。将混合物搅拌5分钟，同时用Ar脱气，然后将混合物加热至90℃并在Ar下搅拌18h。将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(20mL)稀释。通过CELITE过滤得到的悬浮液。减压浓缩滤液。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到产物。LCMS(C22H30NO7S)(ES,m/z):452[M+H]+.
步骤5：(S)-4-(5-羟基-6-(甲基氨基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲 酯
Figure BDA0002716024870002122
室温下将TFA(1.0mL,13mmol)加入到(S)-4-(6-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)-5-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(18mg,0.040mmol)在DCM(2.0mL)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物用EtOAc(10mL)稀释，并通过加入饱和NaHCO3水溶液(10mL)缓慢淬灭。将所得混合物搅拌10分钟。分离有机层，用盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-羟基-6-(甲基氨基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C15H18NO4S)(ES,m/z):308[M+H]+.
实施例1：(2S,2’S)-4,4’-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)；和
实施例2：(2S,2’S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002131
步骤1：(2S)-4-[6-甲氧基-5-(丙-2-烯-1-基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧 代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002132
在N2下向(2S)-4-(5-溴-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(120mg,0.32mmol)、双(二苄叉丙酮)钯(7.1mg,12μmol)和烯丙基三丁基锡烷(120μL,0.39mmol)在甲苯(0.49mL)中的搅拌混合物中加入三叔丁基膦(1.0M在甲苯中，26μL，26μmol)。将反应混合物加热至65℃持续18h。冷却至室温后，将混合物用Et2O稀释，然后加入CsF。将粗混合物在室温下搅拌5分钟。然后将混合物过滤，并将滤液直接通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(2S)-4-[6-甲氧基-5-(丙-2-烯-1-基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C18H21O4S)(ES,m/z):333[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.27(s,1H),7.72(s,1H),7.62(s,1H),6.06-5.94(m,1H),5.07(d,J＝12.5Hz,2H),3.89(s,3H),3.59(s,3H),3.46-3.38(m,3H),3.19(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),3.02-2.92(m,1H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H).
步骤2：(2S,2'S)-4,4'-[丁-2-烯-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二 基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙-1-烯-1,3-二基双(6-甲氧基- 1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)
Figure BDA0002716024870002141
在N2下向(2S)-4-[6-甲氧基-5-(丙-2-烯-1-基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(44mg,0.13mmol)在CH2Cl2(1.3mL)的混合物中一次性加入Grubbs催化剂2G(11mg,0.013mmol)。将反应混合物加热至65℃持续18h。冷却至室温后，将混合物直接通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(2S,2'S)-4,4'-[丁-2-烯-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙-1-烯-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)的混合物。(2S,2'S)-4,4'-[丁-2-烯-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)的表征：LCMS(C34H37O8S2)(ES,m/z):637[M+H]+。(2S,2'S)-4,4'-[丙-1-烯-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)的表征：LCMS(C33H35O8S2)(ES,m/z):623[M+H]+。
步骤3：(2S,2'S)-4,4'-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)双 (2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻 吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)
Figure BDA0002716024870002142
在室温下在N2下向(2S,2'S)-4,4'-[丁-2-烯-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙-1-烯-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)(57.0mg，通过1H-NMR约3/2混合物)在EtOAc(0.5mL)的混合物中一次性加入10％Pd/C(6.0mg,5.4μmol)。将反应混合物脱气并用H2回填(三次)，并在室温下在H2(气球)下搅拌18小时。然后将混合物减压浓缩，得到(2S,2'S)-4,4'-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)的粗混合物。该混合物无需进一步纯化或表征即可使用。
步骤4：(2S,2'S)-4,4'-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩)-5,2-二基)] 双(2-甲基-4-氧代丁酸)和(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5, 2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002151
在室温下向(2S,2′S)-4,4′-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)(57mg)在THF(1.0mL)、MeOH(1.0mL)和水(0.20mL)中的混合物中一次性加入LiOH(26mg,1.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后用HCl水溶液(2N,0.52mL)淬灭。将混合物用DMSO稀释，并将得到的混合物过滤。滤液通过RP-HPLC[C18柱，水(0.1％TFA)-CH3CN]纯化，得到(2S,2'S)-4,4'-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩)-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸)和(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸)。
(2S,2'S)-4,4'-[丁烷-1,4-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩)-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸)的表征数据：LCMS(C32H34O8S2Na)(ES,m/z):633[M+Na]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.20(br,2H),8.21(s,2H),7.72(s,2H),7.57(s,2H),3.87(s,6H),3.39(dd,J＝17.5,8.6Hz,2H),3.07(dd,J＝17.5,5.0Hz,2H),2.94-2.84(m,2H),2.69(br,4H),1.62(br,4H),1.18(d,J＝7.1Hz,6H).
(2S,2'S)-4,4'-[丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基-1-苯并噻吩-5,2-二基)]双(2-甲基-4-氧代丁酸)的表征数据：LCMS(C31H32O8S2Na)(ES,m/z):619[M+Na]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.21(br,2H),8.23(s,2H),7.76(s,2H),7.59(s,2H),3.88(s,6H),3.40(dd,J＝17.5,8.6Hz,2H),3.08(dd,J＝17.5,5.0Hz,2H),2.94-2.85(m,2H),2.71(t,J＝7.1Hz,4H),1.91(pentet,J＝7.1Hz,2H),1.18(d,J＝7.1Hz,6H).
实施例3：(S)-4-(5-(3-(2-(3-羧基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基]丙氧 基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002161
在带有磁力搅拌棒的1德拉姆螺帽小瓶中装入(S)-4-(5-氯-6-甲氧基噻吩丙[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(60mg,0.18mmol)、4-(5-(3-(羟丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(76mg,0.20mmol)、RockPhos Pd G3(7.7mg,9.2μmol)和Cs2CO3(89mg,0.28mmol)，将该小瓶用装有隔膜的盖子密封。将小瓶抽真空并用N2回填3次。加入甲苯(0.6lmL)，并将悬浮液涡旋，超声处理，然后加热至110℃同时搅拌2.25h。然后将反应冷却至室温。加入TFA(0.60mL,7.8mmol)，并将混合物在室温下搅拌1.5h。然后将混合物在减压下浓缩。向所得残余物中加入THF(1.0mL)和MeOH(0.50mL)。加入NaOH水溶液(2.0M,0.50mL,1.0mmol),并将得到的混合物加热至40℃保持5h。冷却至室温后,加入另外的NaOH水溶液(2.0M,0.50mL,1.0mmol)，并将混合物加热至40℃持续另外2.5h。然后将反应冷却至室温，并减压浓缩。加入DMSO(1.0mL)，并将所得混合物通过注射过滤器过滤。然后将滤液通过RP-HPLC(C18，MeCN/水梯度，NH4OH改性剂)纯化。将含有产物的级分减压浓缩，然后通过RP-HPLC(C18，MeCN/水梯度，TFA改性剂)进一步纯化，得到(S)-4-(5-(3-(2-(3-羧基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基丙氧基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C29H30NO9S2)(ES,m/z):600[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,2H),8.22(s,1H),8.20(s,1H),7.97(s,1H),7.78(s,1H),7.60(s,1H),4.39(t,J＝6.3Hz,2H),3.90(s,3H),3.87(s,3H),3.43(dd,J＝17.5,8.6Hz,1H),3.29-3.22(m,2H),3.15-3.06(m,1H),2.91-2.80(m,3H),2.63-2.56(m,2H),2.18-2.06(m,2H),1.17(d,J＝7.2Hz,3H).
如下表11所示，实施例4至23和81-83是或可以根据类似于上述实施例3中概述的步骤，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表11
Figure BDA0002716024870002171
Figure BDA0002716024870002181
Figure BDA0002716024870002191
Figure BDA0002716024870002201
Figure BDA0002716024870002211
Figure BDA0002716024870002221
Figure BDA0002716024870002231
实施例24：4-(5-(3-(2-(3-(氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6- 甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002241
步骤1：4-(5-(3-(2-(3-氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6-甲氧 基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870002242
向小瓶中加入4-(5-(3-(溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(45mg,0.01mmol)、4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(33mg,0.1mmol)、NaI(7.6mg,0.051mmol)、溴化镍(II)乙二醇二甲醚络合物(9.4mg,0.031mmol)、Mn(22mg,0.41mmol)和4,4'-二甲氧基-2,2'-联吡啶(6.6mg,0.031mmol)。向小瓶中加入DMPU(1.0mL)，然后加入5％v/v的Py(82μL,0.051mmol)和TMS-Cl(78μL,0.031mmol)在DMPU中的溶液。将小瓶用Ar脱气5分钟。将该混合物加热至90℃持续2h。2小时后，将混合物冷却至室温，并通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)直接纯化，得到4-(5-(3-(2-(3-氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C33H35NO6S2Na)(ES,m/z):628[M+Na]+.
步骤2：4-(5-(3-(2-(3-氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6-甲氧 基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002243
向4-(5-(3-(2-(3-(氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(8.5mg,0.014mmol)、MeOH(500μL)和ACN(500μL)的混合物中加入NaOH(5.0M于水中，0.56μL，0.28mmol)。将该混合物加热至40℃持续4h。冷却至室温后，将混合物通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)纯化，得到4-(5-(3-(2-(3-氰基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C29H28NO6S2)(ES,m/z):550[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.20(s,1H),8.30-8.20(m,2H),7.82-7.75(m,2H),7.65-7.56(m,2H),3.89(s,6H),3.54-3.46(m,2H),2.82-2.76(m,2H),2.76-2.58(m,8H),1.99-1.86(m,2H).
实施例25：4,4’-(5,5’-(丙烷-1,3-二基)双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基)双 (4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002251
向4-(6-甲氧基-5-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(69mg,0.15mmol)、4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(84mg,0.23mmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2(25mg,0.030mmol)和Cs2CO3(195mg,0.600mmol)的混合物中加入二噁烷(0.80mL)和水(0.2mL)。将反应加热至100℃持续18h。冷却至室温后，将混合物过滤，并将残留的物质用二噁烷洗涤。减压浓缩滤液。然后将所得残余物通过制备型HPLC(含0.1％NH4OH的ACN/H2O)纯化，得到4,4'-(5,5'-(丙烷-1,3-二基)双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))双(4-氧代丁酸)。LCMS(C29H27O8S2)(ES,m/z):566[M-H]-.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,2H),7.68(s,2H),7.50(s,2H),3.82(s,6H),3.16-3.09(m,4H),2.66(t,J＝6.6Hz,4H),2.40(s,4H),1.93-1.83(m,2H).
实施例26：4-(4-(3-(2-(3-羧基丙酰基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-6-基)丙基)-6- 甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002252
步骤1：4-(5-甲氧基-6-(3-(6-甲氧基-2-(4-甲氧基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻 吩-4-基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0002716024870002261
向小瓶中加入4-(6-(3-溴丙基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(72mg,0.16mmol)、4-(4-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(58mg,0.16mmol)、NaI(12mg,0.082mmol)、溴化镍(II)乙二醇二甲醚络合物(15mg,0.049mmol)、Mn(36mg,0.65mmol)和4,4′-二甲氧基-2,2′-联吡啶(11mg,0.049mmol)。向小瓶中加入DMPU(1.6mL),然后加入Py(130μL,0.082mmol)和TMS-Cl(130μL,0.049mmol)在DMPU中的5％v/v的溶液。将小瓶用Ar脱气5分钟。将混合物加热至90℃持续1h。1小时后，将混合物冷却至室温，然后用EtOAc和水稀释。分离有机层，用MgSO4干燥。过滤并减压浓缩。所得混合物无需进一步纯化或表征即可使用。
步骤2：4-(4-(3-(2-(3-羧基丙酰基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-6-基)丙基)-6-甲氧 基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002262
向4-(5-甲氧基-6-(3-(6-甲氧基-2-(4-甲氧基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-4-基)丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(100mg,0.16mmol)和MeOH(1.6mL)的混合物中加入NaOH(5M在水中，0.65mL，3.3mmol)，并将混合物加热至50℃持续1h。冷却至室温后，将混合物通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)纯化，得到4-(4-(3-(2-(3-羧基丙酰基)-5-甲氧基苯并[b]噻吩-6-基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C29H29O8S2)(ES,m/z):569[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.23(s,2H),8.27(s,1H),8.25(s,1H),7.82(s,1H),7.50(s,1H),7.44(s,1H),6.93(s,1H),3.89-3.79(m,6H),3.34-3.19(m,4H),3.03(t,J＝7.3Hz,2H),2.82-2.74(m,2H),2.66-2.55(m,4H),2.06-1.96(m,2H).
如在下面的表12中所示，实施例27至31是或可以根据类似于以上实施例26中概述的那些步骤，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表12
Figure BDA0002716024870002271
Figure BDA0002716024870002281
实施例32：4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧 基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002282
向4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(83mg,0.20mmol)、4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(78mg,0.24mmol)和K2CO3(28mg,0.20mmol)的混合物中加入ACN(1mL)。将反应加热至65℃持续18h。冷却至室温后，将混合物用ACN(4mL)稀释并过滤。然后将滤液减压浓缩。然后加入THF(2.0mL)、MeOH(0.50mL)、水(1.0mL)和LiOH(48mg,2.0mmol)，将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物用AcOH(0.40mL)淬灭，并将混合物减压浓缩。然后将所得残余物通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)纯化，得到4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C29H28FO9S2)(ES,m/z):603[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.28(s,1H),8.20(s,1H),7.73(d,J＝13.7Hz,1H),7.55(d,J＝11.4Hz,2H),4.06-4.00(m,2H),3.90-3.81(m,6H),3.28(t,J＝6.1Hz,2H),3.23(t,J＝6.2Hz,2H),2.82(s,2H),2.58-2.56(m,4H),1.95-193(m,2H).
如下表13所示，实施例33至40和84至157是或可以根据类似于以上实施例32中概述的那些步骤，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表13
Figure BDA0002716024870002291
Figure BDA0002716024870002301
Figure BDA0002716024870002311
Figure BDA0002716024870002321
Figure BDA0002716024870002331
Figure BDA0002716024870002341
Figure BDA0002716024870002351
Figure BDA0002716024870002361
Figure BDA0002716024870002371
Figure BDA0002716024870002381
Figure BDA0002716024870002391
Figure BDA0002716024870002401
Figure BDA0002716024870002411
Figure BDA0002716024870002421
Figure BDA0002716024870002431
Figure BDA0002716024870002441
Figure BDA0002716024870002451
Figure BDA0002716024870002461
Figure BDA0002716024870002471
Figure BDA0002716024870002481
Figure BDA0002716024870002491
Figure BDA0002716024870002501
Figure BDA0002716024870002511
实施例41：(2S)-4-{5-[3-({2-[(3S)-3-羧基丁酰基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-5- 基}氧基)丙基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002521
在N2下向(2S)-4-(5-溴-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(107mg,0.287mmol)、RockPhos Pd G3(11mg,0.03mmol)和Cs2CO3(128mg,0.392mmol)的混合物中加入(2S)-4-[5-(3-羟基-丙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(92mg,0.26mmol)在甲苯(870μL)中的混合物。向反应混合物中通入氮气5分钟，然后加热至110℃持续2小时。冷却至室温，加入THF(1.0mL)、MeOH(1.0mL)和水(0.25mL)，然后在室温下一次性加入LiOH-H2O(157mg,3.75mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h，然后用HCl水溶液(2.0N,1.35mL)淬灭。加入DMSO，并将得到的混合物过滤。滤液通过RP-HPLC[C18柱，水(0.1％TFA)-CH3CN]纯化，得到(2S)-4-{5-[3-({2-[(3S)-3-羧基丁酰基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-5-基}氧基)丙基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C31H32O9S2Na)(ES,m/z):635[M+Na]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.19(br,2H),8.23(s,1H),8.16(s,1H),7.77(s,1H),7.61(s,1H),7.60(s,1H),7.44(s,1H),4.05(d,J＝6.2Hz,2H),3.88(s,3H),3.88(s,3H),3.06(dt,J＝17.5,4.3Hz,2H),2.94-2.80(m,4H),2.10(pentet,J＝6.9Hz,2H),1.17(d,J＝7.1Hz,6H).
如下表14所示，实施例42、158和159是或可以按照类似于以上实施例41中概述的那些方法，使用上述制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料制备。
表14
Figure BDA0002716024870002531
实施例43：(S)-4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)苯并[b]噻吩-6-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002532
步骤1：(S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((2-(4-甲氧基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-6- 基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002541
将(S)-4-(5-(3-羟基丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(16mg,0.044mmol)、4-(6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸甲酯(14mg,0.052mmol)、(E)-二氮烯-1,2-二基双(哌啶-1-基甲酮)(28mg,0.11mmol)和Ph3P(29mg,0.11mmol)在THF(1.0mL)中的混合物用Ar脱气，然后在20℃下搅拌18h。然后将反应混合物用DMSO(1.0mL)稀释并过滤。然后将混合物直接通过反相HPLC(ACN在水中，0.1％TFA改性剂，C-18固定相)纯化，得到(S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((2-(4-甲氧基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-6-基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C31H33O9S2)(ES,m/z):613[M+H]+.
步骤2：(S)-4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)苯并[b]噻吩-6-基)氧基)丙氧基)-6- 甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002542
在室温下将NaOH(5.0M在水中，21μL，0.11mmol)加入到(S)-4-(6-甲氧基-5-(3-((2-(4-甲氧基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-6-基)氧基)丙氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(6.3mg,10μmol)在MeOH(1.0mL)中的混合物中。将反应混合物搅拌并加热至50℃持续2h。将粗反应混合物冷却至室温，用TFA(16μL,0.21mmol)淬灭，用DMSO(1.0mL)稀释，然后过滤。然后将滤液直接通过反相HPLC(ACN在水中，0.1％TFA改性剂，C-18固定相)纯化，得到(S)-4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)苯并[b]噻吩-6-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C29H29O9S2)(ES,m/z):585[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.22(s,2H),8.33(s,1H),8.19(s,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),7.69(s,1H),7.63(s,1H),7.55(s,1H),7.15(d,J＝7.6Hz,1H),4.34-4.18(m,4H),3.89(s,3H),3.44-3.25(m,3H),3.13-3.05(m,1H),2.95-2.87(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.34-2.27(m,2H),1.25-1.14(m,3H).
如下表15所示，实施例44至59和160是或可以根据类似于以上实施例43中概述的那些步骤，使用上述制备或中间体中所述的或从商业获得的合适的起始原料制备。
表15
Figure BDA0002716024870002551
Figure BDA0002716024870002561
Figure BDA0002716024870002571
Figure BDA0002716024870002581
Figure BDA0002716024870002591
实施例60：(2S)-4-{5-2-({2-[(3S)-3-羧基丁酰基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-5- 基)氨基)乙基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002592
步骤1：(2S)-4-{6-甲氧基-5-[2-({6-甲氧基-2-[(3S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代 丁酰基]-1-苯并噻吩-5-基}氨基)乙基]-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002601
在N2下向(2S)-4-(5-溴-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(54mg,O.14mmol)、Rac BINAP Pd G3(12mg,0.012mmol)和Cs2CO3(117mg,0.360mmol)的混合物中加入(2S)-4-[5-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(54mg,0.120mmol)在甲苯(1.6mL)中的悬浮液。向反应混合物中通入氮气45分钟，然后加热至110℃持续12小时。冷却至室温后，将混合物通过硅胶柱色谱法(己烷中的EtOAc)纯化，得到(2S)-4-{6-甲氧基-5-[2-({6-甲氧基-2-[(3S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基]-1-苯并噻吩-5-基}氨基)乙基]-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯。LCMS(C32H35NO8S2Na)(ES,m/z):648[M+Na]+.
步骤2：(2S)-4-{5-[2-({2-[(3S)-3-羧基丁酰基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-5-基} 氨基)乙基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002602
在室温下向(2S)-4-{6-甲氧基-5-[2-({6-甲氧基-2-[(3S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基]-1-苯并噻吩-5-基}氨基)乙基]-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(20mg,0.03mmol)在THF(280μL)、MeOH(280μL)和水(70μL)中的混合物中一次性加入LiOH·H2O(13mg,0.32mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后用HCl水溶液(2N,170μL)淬灭。将混合物用DMSO稀释，并将得到的混合物过滤。滤液通过RP-HPLC[C18柱，水(0.1％TFA)-CH3CN]纯化，得到(2S)-4-{5-[2-({2-[(3S)-3-羧基丁酰基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-5-基} 氨基)乙基]-6-甲氧基-1-苯并噻吩-2-基}-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C30H32NO8S2)(ES,m/z):598[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.12(br,2H),8.27(s,1H),8.11(s,1H),7.82(s,1H),7.66(s,1H),7.44(s,1H),7.07(s,1H),3.98(s,3H),3.90(s,3H),3.41(dd,J＝17.5,8.6Hz,2H),3.36(t,J＝6.5Hz,2H),3.14-2.96(m,4H),2.94-2.84(m,2H),1.18(d,J＝7.1Hz,6H).
如下表16所示，实施例61是或可以按照类似于以上实施例60中概述的那些方法，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表16
Figure BDA0002716024870002611
实施例62：4,4′-((丙烷-1,3-二基双(氧基)双(4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2- 二基))双(4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002612
向4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(0.024g,0.073mmol)、4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(0.025g,0.056mmol)和Cs2CO3(0.09lg,0.28mmol)的混合物中加入ACN(1.0mL)。然后将反应混合物加热至65℃持续1h。冷却至室温后，将混合物用THF稀释，过滤，并将滤液减压浓缩。向得到的残余物中加入THF(1.0mL)，MeOH(0.20mL)，水(0.5mL)和LiOH(0.013g,0.56mmol)。将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物用AcOH淬灭，并将混合物减压浓缩。所得残余物通过制备型HPLC(含0.1％TFA的ACN/H2O)纯化，得到4,4'-((丙烷-1,3-二基双(氧基))双(4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))双(4-氧代丁酸)。LCMS(C29H27F2O10S2)(ES,m/z):637[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.26(s,2H),7.55(s,2H),4.31-4.24(m,4H),3.99-3.80(m,6H),3.34-3.32(m,4H),2.60(q,J＝6.4Hz,4H),2.09(dt,J＝11.5,5.8Hz,2H).
如下表17所示，实施例63至65和161至164是或可以根据类似于以上实施例62中概述的那些类似的步骤，使用如上文制备或中间体中所述,或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表17
Figure BDA0002716024870002621
Figure BDA0002716024870002631
实施例66：(R)-4-(5-(2-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩- 5-基)氧基)乙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002641
将(R)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.20M在DMF中，500μL，0.11mmol)加入到(S)-4-(5-(2-氯乙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(0.20M在DMF中，500μL，0.11mmol)和K2CO3(30mg,0.2mmol)的搅拌悬浮液中。将反应混合物加热至100℃持续18小时。冷却至室温后，加入DMSO(500μL),并将反应混合物过滤。加入水(500μL)，然后加入LiOH-H2O(30mg,0.7mmol),并将反应混合物在室温下搅拌18h。过滤混合物,并将产物通过质量导向的反相C-18柱色谱法(ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到(R)-4-(5-(2-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)乙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C30H29FO10S2Na)(ES,m/z):655[M+Na]+.1H NMR(DMSO-d6)δ:12.18(s,2H),8.31(s,1H),8.18(s,1H),7.58(s,2H),7.50(s,1H),4.50-4.41(m,2H),4.36-4.30(m,2H),3.88(s,3H),3.75(s,3H),3.46(dd,J＝18,9Hz,1H),3.40(dd,J＝17,9Hz,1H),3.10(ddd,J＝22,18,5Hz,2H),2.95-2.81(m,2H),1.24-1.14(m,6H).
如下表18所示，实施例67至74和165至171是或可以根据类似于以上实施例66中概述的那些方法，使用以上制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表18
Figure BDA0002716024870002642
Figure BDA0002716024870002651
Figure BDA0002716024870002661
Figure BDA0002716024870002671
Figure BDA0002716024870002681
实施例75：4-(5-((3-(2-(3-羧基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)氨 基)-6-甲氧基噻吩基[3，2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002682
向4mL小瓶中加入4-(6-甲氧基-5-(3-氧代丙基)苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(10mg,0.03mmol)、4-(5-氨基-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(8.9mg,0.027mmol)和THF(0.50mL)。向浆料中加入AcOH(0.015mL,0.27mmol)。将混合物加热至55℃保持10分钟。冷却至室温后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(17mg,0.080mmol)。然后将混合物加热至55℃保持3小时。冷却至室温后，加入TFA(1mL)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物减压浓缩，然后用DMSO(1mL)稀释。混合物通过制备型HPLC(ACN/H2O w/0.1％TFA)纯化，得到4-(5-((3-(2-(3-羧基丙酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)丙基)氨基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C28H29N2O8S2)(ES,m/z):585[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.18(br,2H),8.22(s,1H),8.03(s,1H),7.79(s,1H),7.63(s,1H),7.59(s,1H),6.55(br s,1H),3.90(s,3H),3.88(s,3H),3.48-3.43(m,2H),3.27-3.24(m,4H),2.73(t,J＝7.3Hz,2H),2.61-2.56(m,4H),1.98-1.91(m,2H).
实施例76：(2S,2'S)-4,4'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(6-甲氧基苯并[b]噻 吩-5,2-二基))双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002691
步骤1：二甲基4,4'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2- 二基))(2S,2'S)-双(2-甲基-4-氧代丁酸酯)
Figure BDA0002716024870002692
将(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(50mg,0.17mmol)和K2CO3(47mg,0.34mmol)的混合物用DMF(750μL)稀释。加入1-溴-2-氯乙烷(18μL,0.22mmol)，并将反应混合物加热至100℃保持18小时。将反应混合物在减压下浓缩，并且无需进一步纯化或表征即可使用。
步骤2：(2S,2’S)-4,4’-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5, 2-二基))双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002701
将LiOH(16mg,0.67mmol)加入到4,4'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))(2S,2'S)-双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)(50mg,0.08mmol)的THF(340μL)/水(80μL)的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌4h。将反应混合物过滤并在减压下浓缩。将残余物溶于DMSO(4mL)中并过滤。产物通过质量导向的反相C18柱色谱法(ACN/水含0.1％TFA)纯化，得到(2S,2'S)-4,4'-(5,5'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))双(2-甲基-4-氧代丁酸)。LCMS(C30H30O10S2Na)(ES,m/z):637[M+Na]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.21(br s,2H),8.20(s,2H),7.64(s,2H),7.59(s,2H),4.44(s,4H),3.87(s,6H),3.41(dd,J＝17,9Hz,2H),3.09(dd,J＝17,5Hz,2H),3.05-2.58(m,2H),1.19(d,J＝7Hz,6H).
实施例77：(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b: 6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)，和实施例78： (2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5',6'-i][1,4,8,11] 四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002702
步骤1：(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5', 6'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)- 4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十 四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)
Figure BDA0002716024870002711
将(2S)-4-(5,6-二羟基-1-苯并噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(60mg,0.20mmol)、(2S)-4-[5,6-双(3-羟基丙氧基)-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(120mg,0.20mmol)、Ph3P(193mg,0.737mmol)和1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶(186mg,0.737mmol)在THF(2.0mL)中的混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物过滤并通过反相HPLC(含0.1％TFA的MeCN/水梯度)，得到(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5',6'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)的1:1的混合物。LCMS(C34H36O10S2Na)(ES,m/z):691[M+Na]+.
步骤2：(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5', 6'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)和(2S,2'S)-4,4'- (7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环- 2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002712
向(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5',6'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)和(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸二甲酯)(67mg,0.10mmol)的1：1的混合物在MeOH(1.0mL)、THF(1.0mL)和水(0.2mL)中的搅拌溶液中加入LiOH(24mg,1.0mmol)。将反应混合物搅拌4h，然后通过反相HPLC纯化(MeCN/水含0.1％TFA的梯度)，得到(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:5',6'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)和(2S,2'S)-4,4'-(7,8,17,18-四氢-6H,16H-双[1]苯并噻吩并[5,6-b:6',5'-i][1,4,8,11]四氧杂十四环-2,12-二基)双(2-甲基-4-氧代丁酸)。LCMS(C32H33O10S2)(ES,m/z):641[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.20(brs,2H),8.18(s,2H),7.52(s,2H),7.40(s,2H),4.27-4.18(m,8H),3.42-3.34(m,2H),3.10-3.03(m,2H),2.92-2.85(m,2H),2.29(brs,4H),1.17(d,J＝6.8Hz,6H).
实施例79：(2S,2’S)-4,4’-(1,3-丙烷二基双{氧基[6-(二氟甲氧基)-1-苯并噻吩-5,2-二基]})双(2-甲基-4-氧代丁酸)
Figure BDA0002716024870002721
向(2S)-4-[6-(二氟甲氧基)-5-羟基-1-苯并噻吩-2-基]-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(54mg,0.16mmol)和K2CO3(109mg,0.788mmol)在DMF(0.8mL)中的搅拌溶液中加入1,3-二溴丙烷(8μL,0.08mmol)。将混合物加热至50℃持续4h。冷却至室温后，将混合物用LiOH(2M在水中，790μL，1.58mmol)处理，并在室温下搅拌4h。然后将混合物在减压下浓缩，并通过RP-HPLC(含0.1％TFA的MeCN/水梯度)纯化，得到(2S,2’S)-4,4’-(1,3-丙烷二基双{氧基[6-(二氟甲氧基)-1-苯并噻吩-5,2-二基]})双(2-甲基-4-氧代丁酸)。LCMS(C31H28F4O10S2Na)(ES,m/z):723[M+23]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.25(s,2H),8.27(s,2H),7.94(s,2H),7.73(s,2H),7.20(t,J＝74.0Hz,2H),4.33-4.29(m,4H),3.46-3.40(m,2H),3.12(dd,J＝17.5,4.9Hz,2H),2.94-2.87(m,2H),2.37-2.32(m,2H),1.19(d,J＝7.1Hz,6H).
如下表19中所示，实施例80和172是或可以根据类似于以上实施例79中概述的那些步骤，使用在上面的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表19
Figure BDA0002716024870002731
实施例173：(4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基) 氧基)丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002732
将4-(5-(3-(3-羟丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(76mg,0.20mmol)加入到含有4-(4-氟-5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(250mg,0.77mmol)、PS-TPP(319mg,0.600mmol)、DIAD(0.117mL,0.600mmol)和THF(3mL)的小瓶中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物过滤，用THF(5mL)洗涤。加入MeOH(2mL)、水(3mL)和LiOH(48mg,2.0mmol)，并将反应混合物再搅拌2h。然后将反应混合物用HOAc淬灭，并在减压下浓缩。将残余物悬浮在DCM(5mL)中，并加入TFA(1mL)。将反应混合物搅拌1h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物通过反相HPLC(含有0.1％TFA的乙腈/水梯度)纯化，得到(4-(5-(3-((2-(3-羧基丙酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙基)-6-甲氧基噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-4-氧代丁酸。LCMS(C28H27FNO9S2)(ES,m/z):604[M+H]+.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.34(s,1H),8.31(s,1H),8.07(s,1H),7.57(s,1H),4.17(t,J＝6.3Hz,2H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.35-3.29(m,4H),3.10-3.04(m,2H),2.63-2.58(m,4H),2.18-2.13(m,2H).
如下表20所示，实施例174是或可以根据类似于以上实施例173中概述的那些方法，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表20
Figure BDA0002716024870002741
实施例175：4,4’-(丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))双(4-氧 代丁腈)
Figure BDA0002716024870002751
将4-(5-溴-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(35mg,0.11mmol)、溴化镍(II)乙二醇二甲醚络合物(10mg,0.033mmol)、锰(24mg,0.44mmol)、NaI(8mg,0.06mmol)和4,4'-二甲氧基-2,2'-联吡啶(7mg,0.03mmol)合并在小瓶中。将4-(5-(3-溴丙基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-4-氧代丁腈(40mg,0.11mmol)在DMPU(1.1mL)中的溶液加入到小瓶中。将Py(88μL,0.055mmol)和TMS-Cl(84mL,0.033mmol)在DMPU中的5％v/v溶液加入到反应混合物中。将反应混合物用Ar脱气5min，然后搅拌并在90℃下加热2h。将反应混合物冷却至室温，用DMSO(2mL)稀释，并过滤。滤液通过反相HPLC(ACN/水，含有TFA改性剂)纯化，得到4,4’-(丙烷-1,3-二基双(6-甲氧基苯并[b]噻吩-5,2-二基))双(4-氧代丁腈)。LCMS(C29H27N2O4S2)(ES,m/z):531[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.26(s,2H),7.78(s,2H),7.61(s,2H),3.89(s,6H),3.55-3.45(m,4H),2.81-2.76(m,4H),2.74-2.69(m,4H),1.95-1.90(m,2H).
实施例176：(S)-4-(5-((3-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙基)氨基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002752
将(S)-4-(5-氨基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(37mg,0.12mmol)、(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(54mg,0.12mmol)和碳酸钾(67mg,0.48mmol)的混合物用Ar脱气。将DMF(1.0mL)加入到混合物中，并将反应混合物搅拌并在60℃下加热2天。将反应混合物冷却至室温，然后将NaOH(1.0M在水中，0.48mL，0.48mmol)加入到反应混合物中。将混合物进一步用DMSO(1.5mL)稀释，然后在室温下搅拌1h。将反应混合物用TFA(0.056mL,0.72mmol)淬灭并过滤。将滤液通过反相HPLC(ACN/水，含有0.1％TFA)纯化，得到(S)-4-(5-((3-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙基)氨基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C31H33FNO9S2)(ES,m/z):646[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),8.11(s,1H),7.60(s,1H),7.45(s,1H),7.04(s,1H),4.17(t,J＝5.9Hz,2H),3.92(s,3H),3.90(s,3H),3.47(dd,J＝17.6,8.6Hz,1H),3.43-3.34(m,3H),3.17-3.05(m,2H),2.94-2.95(m,2H),2.09-2.02(m,2H),1.20-1.15(m,6H).
如下表21中所示，实施例177是或可以按照类似于以上实施例176中概述的那些方法，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表21
Figure BDA0002716024870002761
实施例178：(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-((N,N-二甲基氨基磺酰基)氨基)-3-甲基- 4-氧代丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩- 2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002762
步骤1：(S)-4-(5-(3-((4-氟-6-甲氧基-2-((S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰 基)苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸 叔丁酯
Figure BDA0002716024870002771
将(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(11mg,0.248mmol)、(S)-4-(5-羟基-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔丁酯(87mg,0.25mmol)和碳酸钾(137mg,0.993mmol)的混合物用Ar脱气。将DMF(1.Ar)加入到混合物中，并将反应混合物搅拌并在40℃下加热18小时。将反应混合物冷却至室温，然后用EtOAc和水稀释。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到(S)-4-(5-(3-((4-氟-6-甲氧基-2-((S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔丁酯。LCMS(C36H42FO10S2)(ES,m/z):739[M+Na]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),8.21(s,1H),7.59(s,1H),7.57(s,1H),7.51(s,1H),4.26(q,J＝5.9Hz,4H),3.86(s,3H),3.85(s,3H),3.60(s,3H),3.48(dd,J＝17.7,8.7Hz,1H),3.39-3.33(m,1H),3.23(dd,J＝17.7,5.0Hz,1H),3.07(dd,J＝17.1,5.0Hz,1H),3.02-2.93(m,1H),2.91-2.81(m,1H),2.23-2.18(m,2H),1.35(s,9H),1.20-1.15(m,6H).
步骤2：(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-(叔丁氧基))-3-甲基-4-氧代丁酰基)-6-甲氧 基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代 丁酸
Figure BDA0002716024870002772
将NaOH(1.0M在水中，0.94mL，0.94mmol)加入到(S)-4-(5-(3-((4-氟-6-甲氧基-2-((S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)-苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸叔丁酯(135mg,0.188mmol)在THF(0.94mL)和MeOH(0.94mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用HCl(2.0M在水中，0.47mL，0.94mmol)淬灭，并用EtOAc和水稀释。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-(叔丁氧基))-3-甲基-4-氧代丁酰基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C35H40FO10S2)(ES,m/z):725[M+Na]+.
步骤3：(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-((N,N-二甲基氨基磺酰基)氨基)-3-甲基-4-氧代丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002781
将Hunig碱(0.062mL,0.36mmol)和TBTU(23mg,0.071mmol)加入到(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-(叔丁氧基)-3-甲基-4-氧代丁酰基)-6-甲氧基-苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸(50mg,0.071mmol)在DCM(0.7mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌30分钟。加入N,N-二甲基磺酰胺(11mg,0.085mmol)，并将混合物再搅拌4小时。然后加入TFA(0.055mL,0.71mmol)，将混合物搅拌并加热至45℃持续2h。将混合物冷却至室温，并在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(ACN/水，含有0.1％TFA)纯化，得到(S)-4-(5-(3-((2-((S)-4-((N,N-二甲基氨基磺酰基)氨基)-3-甲基-4-氧代丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C33H38FN2O11S3)(ES,m/z):775[M+Na]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ11.50(s,1H),8.30(s,1H),8.22(s,1H),7.59(s,1H),7.56(s,1H),7.52(s,1H),4.26(q,J＝5.9Hz,4H),3.87(s,3H),3.85(s,3H),3.48(dd,J＝17.8,9.8Hz,1H),3.40(dd,J＝17.3,8.4Hz,1H),3.16(dd,J＝17.8,4.4Hz,1H),3.09(dd,J＝17.3,5.3Hz,1H),3.00-2.94(m,1H),2.94-2.87(m,1H),2.79(s,6H),2.23-2.17(m,2H),1.21-1.15(m,6H).
如下表22中所示，实施例179是或可以根据类似于以上实施例178中概述的那些方法，使用在上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表22
Figure BDA0002716024870002791
实施例180：(S)-4-(5-(3-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻 吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002792
步骤1：(S)-4-(5-(3-((4-氟-6-甲氧基-2-((S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰 基)苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4- 氧代丁酸甲酯
Figure BDA0002716024870002793
将(S)-4-(5-(3-溴丙氧基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(30mg,0.068mmol)、(S)-4-(5-羟基-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(23mg,0.068mmol)和碳酸钾(38mg,0.27mmol)的混合物用Ar脱气。将DMF(0.5mL)加入到混合物中，并将反应混合物搅拌并在40℃下加热24h。将反应混合物冷却至室温，然后无需后处理或纯化即可用于随后的反应。LCMS(C34H38FO11S2)(ES,m/z):705[M+H]+.
步骤2：(S)-4-(5-(3-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸
Figure BDA0002716024870002801
在20℃下将NaOH(0.55mL，1.0M在水中，0.55mmol)加入到(S)-4-(5-(3-((4-氟-6-甲氧基-2-((S)-4-甲氧基-3-甲基-4-氧代丁酰基)苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-(甲氧基甲氧基)苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸甲酯(48mg,0.068mmol)在DMSO(2.5mL)中的溶液中。然后将反应混合物在20℃下搅拌15分钟。将反应混合物用HCl(0.280mL，37％在水中，3.41mmol)淬灭。将反应混合物在20℃下搅拌20h。将反应混合物过滤。将残余物通过反相HPLC(ACN/水，含有0.1％TFA)纯化，得到(S)-4-(5-(3-((2-((S)-3-羧基丁酰基)-4-氟-6-甲氧基苯并[b]噻吩-5-基)氧基)丙氧基)-6-羟基苯并[b]噻吩-2-基)-2-甲基-4-氧代丁酸。LCMS(C30H30FO10S2)(ES,m/z):633[M+H]+.1H NMR(499MHz,DMSO-d6)δ12.17(s,2H),9.70(s,1H),8.30(s,1H),8.17(s,1H),7.57(s,1H),7.48(s,1H),7.33(s,1H),4.31-4.26(m,4H),3.87(s,3H),3.46(dd,J＝17.6,8.6Hz,1H),3.38(dd,J＝17.2,8.4Hz,1H),3.13(dd,J＝17.6,5.1Hz,1H),3.06(dd,J＝17.2,5.3Hz,1H),2.91-2.85(m,2H),2.24-2.18(m,2H),1.19(d,J＝7.2Hz,6H).
如下表23中所示，实施例181至190是或可以根据类似于以上实施例180中概述的那些步骤，使用上文的制备或中间体中描述的或从商业来源获得的合适的起始原料来制备。
表23
Figure BDA0002716024870002811
Figure BDA0002716024870002821
Figure BDA0002716024870002831
生物评价
本文实施例中所述的各个化合物通过以下被定义为STING激动剂：(i)与STING蛋白结合，这通过在20μM(被测化合物的浓度)下在STING生化[3H]cGAMP竞争分析中氚化的cGAMP配体与STING蛋白的结合降低至少20％来证明；(ii)证明在THP1细胞分析中在30μM下6％或更高的IFN-β分泌诱导的干扰素产生(其中在30μM下cGAMP引起的诱导被设置为100％)。
[3H]-cGAMP合成
将包含80mM TrisCl、200mM MgCl2和20mM NaCl的2.3mL缓冲溶液，然后将0.32mL的10mM GTP水溶液加入到50mL塑料AMICON管中。然后加入[3H]ATP(21Ci/mmol,45mCi)在0.5mL H2O中的溶液，之后加入1mL的1mg/mLDNA溶液(Herring睾丸激活剂DNA，Sigma,#D6898)和53μL的47mM cGAS酶溶液。加入额外的H2O以使总体积达到10mL。
将反应在37℃下搅拌2h，然后直接加入至Amicon Ultra-15 10K离心管中，并在4,000g下旋转1h。然后使用以下流动相在半制备型Mono Q柱上纯化收集的溶液：
A：0.05M TrisCl pH 8.5(用1M NaOH调节)
B：0.05M TrisCl，0.5M NaCl pH 8.5(用1M NaOH调节)
梯度：100％A持续5min，然后在25min内线性梯度至50:50(A:B)，3mL/min，254nm。
合并收集的产物级分，并用缓冲液A调节至总体积为30mL。，在放射化学纯度为98.0％、比活度为2.1Ci/mmol下分离得总产量为15.5mCi的[3H]-cGAMP。
cGAS酶
化学合成重组DNA载体以表达截短的人cGAS酶(残基161-522)。为了帮助表达和纯化，氨基末端包含六组氨酸标签、SUMO标签和TEV切割位点。重组酶在ROSETTATM2(DE3)单感受态细胞(Novagen)中过表达。使用HIS-Select HF镍亲和凝胶(Sigma)进行亲和纯化，然后使用Hi-Load 26/60 SUPERDE×200制备级色谱柱(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱。将级分合并，浓缩，在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存直到被需要。
3H-cGAMP过滤结合试验(HAQ STING)
化合物结合STING的能力通过使用放射性滤器结合测定法与氚化的cGAMP配体竞争人STING受体膜的能力来量化。结合测定采用获自TrichouLusia ni细胞膜(T.ni；表达系统，目录号94-002F,www.expressionsystems.com)的STING受体，该细胞膜过表达全长HAQSTING和氚化的cGAMP配体。
基本的HAQ STING过滤分析协议如下：
通过Hamilton STARPLus CORE在96孔板(Greiner,#651201)中使用1:3十点剂量反应形式对化合物进行连续滴定。制备化合物后，通过将浓缩的膜稀释到测定缓冲液(1×PBS；Invitrogen#SH30028.02)中，然后使用手动组织均质器(Wheaton,#357546)均质7次，制备2.2μg/mL工作浓度的STING膜(SEQ.ID.No.1)。然后将148μL制备的膜手动加入到96孔深孔聚丙烯板(Fisher Scientific，#12-566-121)的每个孔中。加入膜后，使用BIOMEK FX将2μL滴定的测试化合物、DMSO对照(Sigma#276855)或冷cGAMP对照加入到适当的孔中。然后将化合物和膜在室温下预孵育放置60分钟以使化合物结合达到平衡。平衡后，通过稀释至测定缓冲液中来制备8nM的[3H]c-GAMP配体，然后将50μL的该工作储备液手动加入至测定板的每个孔中。然后将板在室温下孵育60分钟，然后使用配备20mM HEPES缓冲液的TomTec Mach III细胞收获器(Fisher Scientific，#BP299500)通过96孔GF/B滤板(PerkinElmer，#6005250)过滤每个测定板的内容物。然后使用加压烘箱将滤板在55℃下干燥30分钟，然后将30μL ULTIMA GOLD F闪烁液加入到每个孔中。然后使用PerkinElmerTopCount读板仪测量每个反应孔的氚水平。
归一化至对照后，通过测量剩余放射性量计算每种化合物浓度的活性百分比。将活性百分比相对化合物浓度的对数的图与4参数剂量响应方程拟合以计算EC50值。
最终反应条件为：
Figure BDA0002716024870002851
测试的化合物浓度为20.000、637.00、2.200、0.740、0.247、0.082、0.027、0.009、0.003和0.001μM，残留DMSO为1.0％。
全长STING(HAQ)病毒生成
使用昆虫细胞杆状病毒系统生成STING病毒。在没有抗生素的Sf-900II SFM培养基(LifeTechnologies#10902088)中将节食夜蛾Sf21(Spodoptera frugiperda Sf21)细胞(Kempbio,Inc.)稀释至5e5细胞/mL。将细胞悬浮液加入至处理过的6孔板的每个孔中(每孔2mL,总共le6个细胞)，并使细胞粘附至少30min。同时，通过将500ng HAQSTING[STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBACl]DNA(Genewiz定制合成)与包含10μL
Figure BDA0002716024870002861
II试剂(Invitrogen#10362100)和100ng病毒骨架BestBac2.0、v-cath/chiA缺失的线性杆状病毒DNA(表达系统#91-002)的1mLSf-900II SFM培养基合并，安装1mL共转染混合器。将转染混合物孵育30分钟。孵育后，将培养基从6孔板的粘附细胞中轻轻移出，加入1mL转染混合物(每孔1mL)，并将板置于27℃的加湿培养箱中。第二天，将1mL Sf-900II SFM培养基(无抗生素)加入到6孔板的每个孔中。加入培养基后，将细胞与DNA(SEQ.ID.No.2)在27℃下孵育5-7天以产生P0病毒原液。为了产生P1病毒原液，将0.5mL的P0病毒上清液加入到包含5μg/mL庆大霉素(Invitrogen#15710072)的Sf-900IISFM培养基中的50mL未感染的Sf21细胞中(感染前一天接种，密度为5×105细胞/mL，使其过夜加倍)。然后将感染的细胞在27℃温育3天，同时以10rpm的速度摇动(ATR Biotech MuLtitronInfors HT#AJ118)。在第3天，使用ViCell XR(Beckman CouLter Life Sciences#383556)对P1培养物进行计数，以确认已经发生感染(细胞大小比未感染的细胞大≥3μm，并且存活力约为85-95％)。将培养物收集在50mL锥形管中，并在4℃以2000×g离心10分钟。将P1病毒上清液倒入干净的50mL离心管中，并将剩余的P1细胞沉淀用于产生杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。制备含有10％热灭活的FBS、10％DMSO(Sigma#D2650)和5μg/mL庆大霉素的Sf-900II SFM培养基的冷冻保存培养基，并在通过0.22μM过滤器灭菌后立即使用。将P1细胞沉淀重悬至2e7细胞/mL的密度，并等分入冷冻小瓶(每小瓶1mL)。将冷冻小管在-80℃下置于MR.FROSTYTM细胞冰冻器O/N，然后转移到液氮中用于第二天的长期保存。为了产生P2病毒原液，将0.5mL的P1病毒上清液加入到含有5μg/mL庆大霉素的Sf-900II SFM培养基中的50mL未感染的Sf21细胞中(感染前一天接种，密度为5×105细胞/mL，使其过夜加倍)。将这些细胞在27℃下孵育3天，同时以110rpm的速度摇动，然后收获P2储备液，并在4℃下以2000×g的速度离心10分钟。倒出P2病毒上清液并丢弃，而P2细胞沉淀用于按照上述相同方案产生P2 BIIC。杆状病毒的产生方案已被验证可以持续产生效价为2e9 pfu/mL(2e7细胞/mL×100pfu/细胞)的P1/P2 BIIC。
全长STING(HAQ)表达
为了产生STING膜，通过将解冻的BIIC加入到以1.0×106细胞/mL密度接种的Sf21细胞中，将P1/P2 BIIC扩增过夜。使用假定的2e9 pfu/mL的BIIC滴度计算用于感染培养物的BIIC的量，以在过夜扩增中达到10的MOI。培养过夜后，将细胞在ViCell XR上计数以确认已发生感染(细胞大小比未感染的细胞大≥3μm，存活率约为80-90％)。用于感染MOI＝2.0时在细胞培养基(ESF921SFM含有5μg/mL庆大霉素)中以密度1.0×106接种的TrichouLusiani(T.ni；表达系统,目录号94-002F,www.expressionsystems.com)的大规模表达，来自过夜扩增的被感染的Sf21细胞的体积基于(100pfu/感染的Sf21细胞)计算。通过在4℃以3,400×g离心10分钟，使细胞在27℃下表达48小时，然后收集细胞沉淀。在ViCell XR上对T.ni细胞进行计数，以确认在收获前已发生感染(细胞大小比未感染的细胞≥3μm，存活率约为80-90％)。
全长STING(HAQ)膜产生
缓冲储备液试剂：
1)1M HEPES pH 7.5,Teknova，目录号Hl035
2)5M NaCl，Sigma Aldrich，目录号S5l50-lL
3)KCl，igma Aldrich，目录号3l9309-500ML
4)完成无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂，Roche Diagnostics，目录号1873580001
5)核酸酶，通用核酸酶，Pierce，目录号88702
将裂解缓冲液[25mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl2,20mM KCl,(核酸酶1:5000，完全蛋白酶抑制剂标签/50mL)]加入到表达全长STING(HAQ)的细胞沉淀中，每克细胞沉淀5mL裂解缓冲液。将沉淀重悬并使用Wheaton Dounce均质器均质20次以破坏细胞膜。然后将均质的裂解物在接近5000PSI的压力下通过EMuLSIFLEX-C5微流化器。在4℃下将重悬的沉淀物在45Ti转子超高速离心机中以36,000rpm(100,000×g)的速度离心45分钟。移除上清液。然后将沉淀重悬于洗涤缓冲液[(25mM HEPES pH7.5,1mM MgCl2,20mM KCl,1M NaCl(完全蛋白酶抑制剂标签/50mL))中，其体积为50mL沉淀/离心管。然后将沉淀/洗涤缓冲液混合物使用玻璃均质器在冰上均化(20冲程)，然后在4℃下以36,000rpm离心45分钟。移除上清液，再次重复洗涤步骤，将所得膜重悬于20mM HEPES pH 7.5、500mM NaCl、10％甘油、不含EDTA的蛋白酶抑制剂(l片/50mL)中。通过Bradford测定法(Bio-Rad蛋白质测定法，目录号500-0006)测量蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE测定蛋白质富集并通过Western印迹确认。将重悬的膜保存在-80℃。
全长HAQ STING[STING(l-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8]氨基酸序列：
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELHHIHSRYRGSYWRTVRACLGCULRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLULDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTADRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATULQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCQTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKULULRTDFSGGGLNDIFEAQKIEWHEGSLEVLFQGPHHHHHHHH(SEQ.ID.No.1)
全长HAQ[STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBACl]质粒DNA序列:
GGAACGGCTCCGCCCACTATTAATGAAATTAAAAATTCCAATTTTAAAAAACGCAGCAAGAGAAACATTTGTATGAAAGAATGCGTAGAAGGAAAGAAAAATGTCGTCGACATGCTGAACAACAAGATTAATATGCCTCCGTGTATAAAAAAAATATTGAACGATTTGAAAGAAAACAATGTACCGCGCGGCGGTATGTACAGGAAGAGGTTTATACTAAACTGTTACATTGCAAACGTGGTTTCGTGTGCCAAGTGTGAAAACCGATGTTTAATCAAGGCTCTGACGCATTTCTACAACCACGACTCCAAGTGTGTGGGTGAAGTCATGCATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAACAATTATAAATGCTAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATAAAAATTAACATAGTTATTATCGTATCCATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATATATATGTCTTTTTTAATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAACAGTGCTATTTTCTGGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATCAATGAATTTGGGATCGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACACCATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTACGAACCGTTAAACAAAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAATAACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAGTTGCTGATCAGATCTGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATAGGATCCATGCCCCACTCCAGCCTGCATCCATCCATCCCGTGTCCCAGGGGTCACGGGGCCCAGAAGGCAGCCTTGGTTCTGCTGAGTGCCTGCCTGGTGACCCTTTGGGGGCTAGGAGAGCCACCAGAGCACACTCTCCGGTACCTGGTGCTCCACCTAGCCTCCCTGCAGCTGGGACTGCTGTTAAACGGGGTCTGCAGCCTGGCTGAGGAGCTGCACCACATCCACTCCAGGTACCGGGGCAGCTACTGGAGGACTGTGCGGGCCTGCCTGGGCTGCCCCCTCCGCCGTGGGGCCCTGTTGCTGCTGTCCATCTATTTCTACTACTCCCTCCCAAATGCGGTCGGCCCGCCCTTCACTTGGATGCTTGCCCTCCTGGGCCTCTCGCAGGCACTGAACATCCTCCTGGGCCTCAAGGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTGCAGTGTGTGAAAAAGGGAATTTCAACGTGGCCCATGGGCTGGCATGGTCATATTACATCGGATATCTGCGGCTGATCCTGCCAGAGCTCCAGGCCCGGATTCGAACTTACAATCAGCATTACAACAACCTGCTACGGGGTGCAGTGAGCCAGCGGCTGTATATTCTCCTCCCATTGGACTGTGGGGTGCCTGATAACCTGAGTATGGCTGACCCCAACATTCGCTTCCTGGATAAACTGCCCCAGCAGACCGCTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTACAGCAACAGCATCTATGAGCTTCTGGAGAACGGGCAGCGGGCGGGCACCTGTGTCCTGGAGTACGCCACCCCCTTGCAGACTTTGTTTGCCATGTCACAATACAGTCAAGCTGGCTTTAGCCGGGAGGATAGGCTTGAGCAGGCCAAACTCTTCTGCCAGACACTTGAGGACATCCTGGCAGATGCCCCTGAGTCTCAGAACAACTGCCGCCTCATTGCCTACCAGGAACCTGCAGATGACAGCAGCTTCTCGCTGTCCCAGGAGGTTCTCCGGCACCTGCGGCAGGAGGAAAAGGAAGAGGTTACTGTGGGCAGCTTGAAGACCTCAGCGGTGCCCAGTACCTCCACGATGTCCCAAGAGCCTGAGCTCCTCATCAGTGGAATGGAAAAGCCCCTCCCTCTCCGCACGGATTTCTCTGGCGGTGGCCTGAACGACATCTTCGAAGCCCAGAAAATCGAATGGCATGAAGGCAGCCTGGAAGTGCTGTTCCAGGGCCCACACCACCATCATCACCATCACCATTAATGAGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTAACCTAGGTAGCTGAGCGCATGCAAGCTGATCCGGGTTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATTTAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTGTTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGTACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGATAAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTCGGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCGCCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGGTGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCGCAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTGGTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAATTTCGCTATCGTTTACCGTGCCGATATTTAACAACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTAAAGAGATTGTCTCAAGCTCGGATCGATCCCGCACGCCGATAACAAGCCTTTTCATTTTTACTACAGCATTGTAGTGGCGAGACACTTCGCTGTCGTCGAGGTTTAAACGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA(SEQ.ID.No.2)
如上所述，在HAQSTING体外结合测定中评估了本公开的某些化合物。下表将这些化合物的生物学数据列表为EC50值。
表24：3 HAQ STING的3H-cGAMP过滤结合测定
Figure BDA0002716024870002941
Figure BDA0002716024870002951
Figure BDA0002716024870002961
3H-CGAMP过滤结合试验(WT STING)
化合物结合STING的能力通过使用放射性滤器结合测定法与氚化的cGAMP配体竞争人STING受体膜的能力来量化。结合测定采用获自TrichouLusia ni细胞膜(T.ni；表达系统，目录号94-002F,www.expressionsystems.com)的STING受体，其过表达全长HAQSTING和氚化的cGAMP配体。
基本的WTSTING过滤分析方案如下：
通过稀释到测定缓冲液中来制备16hM的[3H]c-GAMP配体，并将50μL的这种工作储备液手动加入到测定板的每个孔中。加入配体后，使用BIOMEK FX将2μL滴定的测试化合物、DMSO对照(Sigma#276855)或冷cGAMP对照加入到适当的孔中。通过Hamilton STARPLusCORE在96孔板(Greiner,#651201)中使用1:3十点剂量反应形式对化合物进行连续滴定。加入化合物后，通过将浓缩的膜稀释到测定缓冲液(1×PBS；Invitrogen#SH30028.02)中，然后使用手动组织均质器(Wheaton,#357546)均质7次，制备2.2μg/mL工作浓度的STING膜(SEQ.ID.No.3)。然后将148μL制备的膜手动加入到96孔深孔聚丙烯板(FisherScientific，#12-566-121)的每个孔中。然后将化合物、配体和膜在室温下孵育放置60分钟，然后使用配备20mM HEPES缓冲液的TomTec Mach III细胞收获器(FisherScientific，#BP299500)通过96孔GF/B滤板(PerkinElmer，#6005250)过滤每个测定板的内容物。然后使用加压VWR烘箱将滤板在55℃下干燥30分钟，然后将30μL uLtima Gold F闪烁液加入到每个孔中。然后使用PerkinElmer TopCount读板仪测量每个反应孔的氚水平。
归一化至对照后，通过测量剩余放射性量计算每种化合物浓度的活性百分比。将活性百分比相对化合物浓度的对数的图与4参数剂量响应方程拟合以计算EC50值。
最终反应条件为：
Figure BDA0002716024870002971
Figure BDA0002716024870002981
测试的化合物浓度为20.000、637.00、2.200、0.740、0.247、0.082、0.027、0.009、0.003和0.001μM，残留DMSO为1.0％。
全长STING(HAQ)病毒生成
使用昆虫细胞杆状病毒系统生成STING病毒。在没有抗生素的Sf-900II SFM培养基(LifeTechnologies#10902088)中将节食夜蛾Sf21(Spodoptera frugiperda Sf21)细胞(Kempbio,Inc.)稀释至5e5细胞/mL中。将细胞悬浮液加入至处理过的6孔板的每个孔中(每孔2mL,总共le6个细胞)，并使细胞粘附至少30min。同时，通过将500ng HAQ STING[STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBACl]DNA(Genewiz定制合成)与包含10μL
Figure BDA0002716024870002982
II试剂(Invitrogen#10362100)和100ng病毒骨架BestBac2.0、v-cath/chiA缺失的线性杆状病毒DNA(表达系统#91-002)的Sf-900II SFM培养基合并，安装1mL共转染混合器。将转染混合物孵育30分钟。孵育后，将培养基从6孔板的粘附细胞中轻轻移出，加入1mL转染混合物(每孔1mL)，并将板置于27℃的加湿培养箱中。第二天，将1mL Sf-900II SFM培养基(无抗生素)加入到6孔板的每个孔中。加入培养基后，将细胞与DNA[(SEQ.ID.No.4)且线性化病毒骨架BestBac2.0]在27℃下孵育5-7天以产生P0病毒原液。为了产生P1病毒原液，将0.5mL的P0病毒上清液加入到包含5μg/mL庆大霉素(Invitrogen#15710072)的Sf-900II SFM培养基中的50mL未感染的Sf21细胞中(感染前一天接种，密度为5×105细胞/mL，使其过夜加倍)。然后将感染的细胞在27℃温育3天，同时以110rpm的速度摇动(ATR Biotech MuLti tronInfors HT#AJ118)。在第3天，使用ViCell XR(Beckman CouLter Life Sciences#383556)对P1培养物进行计数，以确认已经发生感染(细胞大小比未感染的细胞大≥3μm，并且存活率约为85-95％)。将培养物收集在50mL锥形管中，并在4℃以2000×g离心10分钟。将P1病毒上清液倒入干净的50mL离心管中，并将剩余的P1细胞沉淀用于产生杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。制备含有具有10％热灭活的FBS、10％DMSO(Sigma#D2650)和5μg/mL庆大霉素的Sf-900II SFM培养基的冷冻保存培养基，并在通过0.22μM过滤器灭菌后立即使用。将P1细胞沉淀重悬至2e7细胞/mL的密度，并等分入冷冻小瓶(每小瓶1mL)。将冷冻小管在-80℃下置于MR.FROSTYTM细胞冰冻器O/N，然后转移到液氮中用于第二天的长期保存。为了产生P2病毒原液，将0.5mL的P1病毒上清液加入到含有5μg/mL庆大霉素的Sf-900II SFM培养基中的50mL未感染的Sf21细胞中(感染前一天接种，密度为5×105细胞/mL，使其过夜加倍)。将这些细胞在27℃下孵育3天，同时以110rpm的速度摇动，然后收获P2储备液，并在4℃下以2000×g的速度离心10分钟。倒出P2病毒上清液并丢弃，而P2细胞沉淀用于按照上述相同方案产生P2 BIIC。杆状病毒的产生方案已被验证可以持续产生效价为2e9 pfu/mL(2e7细胞/mL×100pfu/细胞)的P1/P2 BIIC。
全长STING(HAQ)表达
为了产生STING膜，通过将解冻的BIIC加入到以1.0×106细胞/mL密度接种的Sf21细胞中，将P1/P2 BIIC扩增过夜。使用假定的2e9 pfu/mLBIIC滴度计算用于感染培养物的BIIC的量，以在过夜扩增中达到10的MOI。培养过夜后，将细胞在ViCell XR上计数以确认已发生感染(细胞大小比未感染的细胞大≥3μm，存活率约为80-90％)。用于感染MOI＝2.0时在细胞培养基(ESF921SFM含有5μg/mL庆大霉素)中以密度1.0×106接种的TrichouLusiani(T.ni；表达系统,目录号94-002F,www.expressionsystems.com)的大规模表达，来自过夜扩增的被感染的Sf21细胞的体积基于(100pfu/感染的Sf21细胞)计算。通过在4℃以3,400×g离心10分钟，使细胞在27℃下表达48小时，然后收集细胞沉淀。在ViCell XR上对T.ni细胞进行计数，以确认在收获前已发生感染(细胞大小比未感染的细胞≥3μm，存活率约为80-90％)。
全长STING(HAQ)膜产生
缓冲储备试剂：
1)1M HEPES pH 7.5,Teknova，目录号H1035
2)5M NaCl，Sigma Aldrich，目录号S5l50-lL
3)KCl，Sigma Aldrich，目录号3l9309-500ML
4)无EDTA的完全蛋白酶抑制剂片剂，Roche Diagnostics，目录号1873580001
5)核酸酶，通用核酸酶，Pierce，目录号88702
将裂解缓冲液[25mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl2,20mM KCl,(核酸酶1:5000，完全蛋白酶抑制剂标签/50mL)]加入到如上制备的表达全长STING(HAQ)的细胞沉淀中，每克细胞沉淀5mL裂解缓冲液。将沉淀重悬并使用Wheaton Dounce均质器均质20次以破坏细胞膜。然后将均质的裂解物在接近5000PSI的压力下通过EMuLSIFLEX-C5微流化器。在4℃将重悬的沉淀物在45Ti转子超高速离心机中以36,000rpm(100,000×g)的速度离心45分钟。移除上清液。然后将沉淀重悬于洗涤缓冲液[(25mM HEPES pH7.5,1mM MgCl2,20mM KCl，1MNaCl(完全蛋白酶抑制剂标签/50mL))中，其体积为50mL/沉淀/离心管。然后将沉淀/洗涤缓冲液混合物使用玻璃均质器在冰上均化(20冲程)，然后在4℃下以36,000rpm离心45分钟。移除上清液，再次重复洗涤步骤，将所得膜重悬于20mM HEPES pH 7.5、500mM NaCl、10％甘油、不含EDTA的蛋白酶抑制剂(l片/50mL)中。通过Bradford测定法(Bio-Rad蛋白质测定法，目录号500-0006)测量蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE测定蛋白质富集并通过Western印迹确认。将重悬的膜保存在-80℃。
全长STING WT[STING(l-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8]氨基酸序列：
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCULRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLULDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATULQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKULULRTDFSGGGLNDIFEAQKIEWHEGSLEVLFQGPHHHHHHHH(SEQ.ID.No.3)
全长WT STING[STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8/pBACl]质粒序列：
GGAACGGCTCCGCCCACTATTAATGAAATTAAAAATTCCAATTTTAAAAAACGCAGCAAGAGAAACATTTGTATGAAAGAATGCGTAGAAGGAAAGAAAAATGTCGTCGACATGCTGAACAACAAGATTAATATGCCTCCGTGTATAAAAAAAATATTGAACGATTTGAAAGAAAACAATGTACCGCGCGGCGGTATGTACAGGAAGAGGTTTATACTAAACTGTTACATTGCAAACGTGGTTTCGTGTGCCAAGTGTGAAAACCGATGTTTAATCAAGGCTCTGACGCATTTCTACAACCACGACTCCAAGTGTGTGGGTGAAGTCATGCATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAACAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATAAAAATTAACATAGTTATTATCGTATCCATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATATATATGTCTTTTTTAATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAACAGTGCTATTTTCTGGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATCAATGAATTTGGGATCGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACACCATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTACGAACCGTTAAACAAAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAATAACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAGTTGCTGATCAGATCTGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATAGGATCCATGCCCCACTCCAGCCTGCATCCATCCATCCCGTGTCCCAGGGGTCACGGGGCCCAGAAGGCAGCCTTGGTTCTGCTGAGTGCCTGCCTGGTGACCCTTTGGGGGCTAGGAGAGCCACCAGAGCACACTCTCCGGTACCTGGTGCTCCACCTAGCCTCCCTGCAGCTGGGACTGCTGTTAAACGGGGTCTGCAGCCTGGCTGAGGAGCTGCGCCACATCCACTCCAGGTACCGGGGCAGCTACTGGAGGACTGTGCGGGCCTGCCTGGGCTGCCCCCTCCGCCGTGGGGCCCTGTTGCTGCTGTCCATCTATTTCTACTACTCCCTCCCAAATGCGGTCGGCCCGCCCTTCACTTGGATGCTTGCCCTCCTGGGCCTCTCGCAGGCACTGAACATCCTCCTGGGCCTCAAGGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTGCAGTGTGTGAAAAAGGGAATTTCAACGTGGCCCATGGGCTGGCATGGTCATATTACATCGGATATCTGCGGCTGATCCTGCCAGAGCTCCAGGCCCGGATTCGAACTTACAATCAGCATTACAACAACCTGCTACGGGGTGCAGTGAGCCAGCGGCTGTATATTCTCCTCCCATTGGACTGTGGGGTGCCTGATAACCTGAGTATGGCTGACCCCAACATTCGCTTCCTGGATAAACTGCCCCAGCAGACCGGTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTACAGCAACAGCATCTATGAGCTTCTGGAGAACGGGCAGCGGGCGGGCACCTGTGTCCTGGAGTACGCCACCCCCTTGCAGACTTTGTTTGCCATGTCACAATACAGTCAAGCTGGCTTTAGCCGGGAGGATAGGCTTGAGCAGGCCAAACTCTTCTGCCGGACACTTGAGGACATCCTGGCAGATGCCCCTGAGTCTCAGAACAACTGCCGCCTCATTGCCTACCAGGAACCTGCAGATGACAGCAGCTTCTCGCTGTCCCAGGAGGTTCTCCGGCACCTGCGGCAGGAGGAAAAGGAAGAGGTTACTGTGGGCAGCTTGAAGACCTCAGCGGTGCCCAGTACCTCCACGATGTCCCAAGAGCCTGAGCTCCTCATCAGTGGAATGGAAAAGCCCCTCCCTCTCCGCACGGATTTCTCTGGCGGTGGCCTGAACGACATCTTCGAAGCCCAGAAAATCGAATGGCATGAAGGCAGCCTGGAAGTGCTGTTCCAGGGCCCACACCACCATCATCACCATCACCATTAATGAGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTAACCTAGGTAGCTGAGCGCATGCAAGCTGATCCGGGTTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATTTAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTGTTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGTACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGATAAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTCGGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCGCCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGGTGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCGCAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTGGTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAATTTCGCTATCGTTTACCGTGCCGATATTTAACAACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTAAAGAGATTGTCTCAAGCTCGGATCGATCCCGCACGCCGATAACAAGCCTTTTCATTTTTACTACAGCATTGTAGTGGCGAGACACTTCGCTGTCGTCGAGGTTTAAACGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA(SEQ.ID.No.4)
如上所述，在WT STING体外结合测定中评估了本公开的某些化合物。下表将这些化合物的生物学数据列表为EC50值。
表25：WT STING的3H-cGAMP过滤结合测定
Figure BDA0002716024870003061
Figure BDA0002716024870003071
Figure BDA0002716024870003081
Figure BDA0002716024870003091
Figure BDA0002716024870003101
THP1细胞培养物中的IFN-β分泌(5h)
使用人IFN-βAlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer,目录号AL265F)测量化合物刺激THP1细胞分泌β-干扰素的能力。基本方案如下:
使用Labcyte Echo 550声学分配器将溶解在DMSO中的120nL化合物转移到空的无菌384孔微孔板(Coming,目录号3712)的孔中。将先前在回收培养基(Life Technologies,目录号12648-010)中冷冻的THP1细胞(美国典型培养物保藏中心,目录号TIB202)解冻，并立即10倍稀释至37℃测定培养基(RPMI 1640+L-谷氨酰胺和酚红,Life Technologies,目录号11875-085；0.5％热灭活的胎牛血清,Sigma Aldrich,目录号F4135；1mM丙酮酸钠,Life Technologies,目录11360-070；1×非必需氨基酸；Life Technologies,目录11140-050)。使用Beckman CouLter V-Cell XR细胞计数器确定细胞活力和计数。将细胞悬浮液在室温下以200×g离心5分钟。将细胞在37℃测定培养基中重悬至0.8×106/mL的密度。随后使用MatriX电子多通道移液器或Agilent Bravo自动化液体处理平台进行液体转移。
通过将40μL先前制备的细胞悬浮液分配到含有化合物的平板的孔中开始分析。在湿润的气氛中于37℃、5％CO2孵育5小时后，将细胞和化合物的平板在室温以200×g离心5分钟。从每个孔中，将5μL上清液转移至白色的384孔板(Perkin Elmer,目录号6005620)的相应孔中。向这些含上清液的孔中加入10μL 5×抗分析物受体珠(50μg/mL AlphaLISAHiBlock Buffer)，并在室温下孵育30分钟，同时在轨道平板振荡器上振荡。向每个孔中加入10μL 5×生物素化抗体抗分析物(AlphaLISA HiBlock Buffer中为5nM)，并在定轨振荡器上于室温孵育60分钟，或于4℃过夜。向每个孔中加入25μL 2×SA-Donor珠(在AlphaLISAHiBlock Buffer中为80μg/mL)，并在黑暗中于室温孵育30-45分钟，同时在定轨振荡器上振荡。然后在Perkin Elmer Envision上读取板(λex＝680nm,λem＝570nm)。根据30μM cGAMP阳性对照和0.3％DMSO阴性对照，计算每种化合物浓度的AlphaLISA信号的百分效应。百分效应相对化合物浓度的对数的图与4参数浓度响应方程拟合以计算EC50值。测试化合物的浓度为30000、10000、3333、1111、370.4、123.4、41.2、13.7、4.6和1.5nM，残留DMSO为0.3％。测试对照化合物、cGAMP的浓度为100000、33333、11111、3704、1235、412、137、46和15hM，残留DMSO为0.3％。
如上所述，评估了本公开的化合物在THP1细胞培养物中的IFN-β分泌。下表列出了这些化合物的生物学数据，以浓度为30μM时相对于2'3'-cGAMP的活化百分比表示。
表26：THP1细胞培养物中的IFN-β分泌(5h)
Figure BDA0002716024870003111
Figure BDA0002716024870003121
Figure BDA0002716024870003131
Figure BDA0002716024870003141
应当理解，上述各种和其他特征和功能或其替代可以合乎需要地组合到许多其他不同的系统或应用中。还应当理解，本领域技术人员随后可以在其中进行各种目前无法预料或无法预期的替代、修改、变化或改进，并且也意在由所附权利要求书涵盖。
Figure IDA0002716024930000011
Figure IDA0002716024930000021
Figure IDA0002716024930000031
Figure IDA0002716024930000041
Figure IDA0002716024930000051
Figure IDA0002716024930000061
Figure IDA0002716024930000071
Figure IDA0002716024930000081
Figure IDA0002716024930000091
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Figure IDA0002716024930000111
Figure IDA0002716024930000121
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Figure IDA0002716024930000161
Figure IDA0002716024930000171

Claims (22)

1.通式(I)的化合物：
Figure FDA0002716024860000011
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基、COOR6和C(O)N(R6)2；
每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
任选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；
每个R6独立地选自：H，C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000021
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个
Figure FDA0002716024860000022
独立地选自：
Figure FDA0002716024860000023
Figure FDA0002716024860000024
3.通式(II)的化合物：
Figure FDA0002716024860000025
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基，COOR6和C(O)N(R6)2；
每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
任选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R3的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；
每个R6独立地选自：H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000031
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
4.根据权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个
Figure FDA0002716024860000032
独立地选自：
Figure FDA0002716024860000033
Figure FDA0002716024860000034
5.通式(III)的化合物：
Figure FDA0002716024860000041
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基，COOR6和C(O)N(R6)2；
每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基，和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
任选地，R3可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环G，该稠环G选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环G至R3的键来自所述环G上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；
任选地，R4可以与相邻的C-R1以及它们所连接的原子一起形成稠环E，该稠环E选自苯基或包括1至2个选自O、S、N和N(R6)的环成员的5或6元杂环，其中由所述环E至R4的键来自所述环E上具有开放取代价的原子，并且其中所述苯基或杂环任选地被卤素、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基中的一个或多个成员取代；
每个R6独立地选自：H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，
被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000051
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
6.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002716024860000052
独立地选自：
Figure FDA0002716024860000053
Figure FDA0002716024860000054
并且
Figure FDA0002716024860000055
选自：
Figure FDA0002716024860000056
Figure FDA0002716024860000057
7.通式(IV)的化合物：
Figure FDA0002716024860000058
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基，COOR6和C(O)N(R6)2；
每个R2独立地选自：H，卤素，CN，OR6，N(R6)2，COOR6，C(O)N(R6)2，SO2R6，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，被OR6取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，C2-C6卤代炔基，被OR6取代的C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和包括1至2个选自O、S和N(R6)的环成员的3至6元杂环；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
每个R6独立地选自：H、C1-C6烷基和C1-C6卤代烷基；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000061
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
8.根据权利要求7所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002716024860000071
独立地选自：
Figure FDA0002716024860000072
Figure FDA0002716024860000073
并且
Figure FDA0002716024860000074
选自：
Figure FDA0002716024860000075
Figure FDA0002716024860000076
9.通式(V)的化合物：
Figure FDA0002716024860000077
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基，COOR6和C(O)N(R6)2；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000081
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
10.根据权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个
Figure FDA0002716024860000082
独立地选自下组：
Figure FDA0002716024860000083
Figure FDA0002716024860000084
11.通式(VI)的化合物：
Figure FDA0002716024860000085
或其药学上可接受的盐，其中
每个A-R1独立地选自C-R1和N；
每个R1独立地选自：H，卤素，OR6，N(R6)2，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，被N(R6)2取代的C1-C6烷基，COOR6和C(O)N(R6)2；
R3和R4独立地选自：O-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)、C1-C5亚烷基或卤代亚烷基、和N(R6)-(C1-C4亚烷基或卤代亚烷基)；
每个R6独立地选自：H，C1-C6烷基，和C1-C6卤代烷基；
每个X1独立地选自：C＝O，-CH2-，-CHF-和-CF2-；
每个X2独立地选自(C(R8)2)(1-3)，其中每个R8独立地选自：H，卤素，C1-C6烷基，CN，OR6，N(R6)2，C1-C6卤代烷基，C3-C6环烷基，被OR6取代的C1-C6烷基，以及被N(R6)2取代的C1-C6烷基；
任选地，位于不同碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元的稠环；
任选地，位于一个碳原子上的2个R8可以与它们所连接的原子一起形成3至6元螺环；
每个X3独立地选自：COOR6,C(O)SR6,C(S)OR6,
Figure FDA0002716024860000091
SO2R6,C(O)N(R9)2和CN；
每个R9独立地选自：H、COOR6和SO2R6。
12.根据权利要求11所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个
Figure FDA0002716024860000092
独立地选自：
Figure FDA0002716024860000093
Figure FDA0002716024860000094
13.选下下组的化合物：
Figure FDA0002716024860000095
Figure FDA0002716024860000101
Figure FDA0002716024860000111
Figure FDA0002716024860000121
Figure FDA0002716024860000131
Figure FDA0002716024860000141
Figure FDA0002716024860000151
Figure FDA0002716024860000161
Figure FDA0002716024860000171
Figure FDA0002716024860000181
Figure FDA0002716024860000191
Figure FDA0002716024860000201
Figure FDA0002716024860000211
Figure FDA0002716024860000221
Figure FDA0002716024860000231
Figure FDA0002716024860000241
Figure FDA0002716024860000242
及其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
15.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
(a)向所述个体施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
16.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
(a)向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求14所述的药物组合物。
17.一种在个体中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
18.一种在个体中诱导STING依赖性I型干扰素产生的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求14所述的药物组合物。
19.一种治疗个体中细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
21.一种治疗个体中细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求19所述的药物组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
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