CN111713498B

CN111713498B - 抗微生物组合物

Info

Publication number: CN111713498B
Application number: CN202010515692.9A
Authority: CN
Inventors: T·巴顿; J·布伦南; J·R·巴雷特; I·斯塔普勒斯
Original assignee: Matoke Holdings Ltd
Current assignee: Matoke Holdings Ltd
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: NZ726323A; US20170049111A1; EP3136854A1; US11311017B2; JP2017519724A; JP6825913B2; GB2540054A; GB2535666A; US20180042240A1; AU2014393037A1; WO2015166197A1; GB2535666B; CN111713498A; BR112016025331A2; CA2947390A1; CN106470548B; AU2014393037B2; EP3245871A1; US20220248689A1; GB2540054B

Abstract

本发明涉及抗微生物活性领域，具体涉及一种抗微生物组合物。本发明描述了用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物。所述组合物包含能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包括所述酶的底物的未精制的天然物质，诸如蜂蜜。在某些实施方案中，所述酶是纯化的酶。在其它实施方案中，所述底物缺乏过氧化氢酶活性，并且所述酶是除了可能存在于未精制的天然物质中的能够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性以外的酶。储存稳定的组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。本发明的组合物对于抗微生物是有效的，可用于治疗微生物感染和伤口。

Description

抗微生物组合物

相关申请的交叉引用

本申请为申请日为2014年4月30日、申请号为201480080307.5、名称为″抗微生物组合物″的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及抗微生物活性技术领域，具体涉及用于生成抗微生物活性的组合物，特别是储存稳定的组合物、抗微生物组合物和溶液、所述组合物和溶液特别地用于伤口愈合的用途，以及它们的产生方法。

背景技术

自古以来，蜂蜜已被用于治疗微生物感染。近年来，人们对蜂蜜的治疗功效(特别是在伤口愈合领域)的兴趣再度兴起。临床试验已表明，蜂蜜是有效的广谱抗微生物剂，其对抗常见的伤口感染生物体诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)和大肠杆菌(Escherichiacoli)有效，并且在抗细菌的抗生素抗性菌株方面有效。作为一种天然产品，蜂蜜也提供了有吸引力的替代药物治疗。

许多不同类型的蜂蜜具有抗菌活性。该活性主要归因于摩尔渗透压浓度、pH、过氧化氢产生和植物化学组分的存在。与大多数其它蜂蜜相比，源自麦卢卡树(Leptospermumscoparium) 的麦卢卡蜂蜜已被认为具有优异的抗微生物活性，这是由于这种蜂蜜中存在高水平的抗菌植物化学活性。然而，麦卢卡蜂蜜的供应相对有限，不能满足全球市场的需求。

除了其抗微生物作用之外，蜂蜜的几种其它活性被认为有助于伤口愈合，特别是慢性伤口的愈合。具体地，蜂蜜具有对伤口自溶性清创和除臭的能力。清创是去除死的，损坏的或感染的组织以改善剩余健康组织的愈合潜力。蜂蜜也已被报道具有抗炎性质，能够刺激组织生长，并且控制疼痛和最小化瘢痕形成。

目前市场上有几种基于蜂蜜的伤口护理敷料。这些敷料中有许多使用麦卢卡蜂蜜或具有高水平的非过氧化物抗菌活性的其它蜂蜜，因为存在于伤口流体中的酸性、过氧化氢酶活性和蛋白质消化酶可降低过氧化氢的抗菌效力。

目前市售的基于蜂蜜的敷料包括由Comvita/Derma Sciences制造的Medihoney系列产品，其包含麦卢卡蜂蜜，以及由Advancis制造的Activon(一种无添加剂的纯麦卢卡蜂蜜)。其它基于蜂蜜的敷料含有蜂蜜和一种或多种另外的成分。这些成分包括MelladermPlus，其是由 SanoMed制造的抗菌伤口凝胶。该凝胶含有来自保加利亚的多花山区的蜂蜜，所述蜂蜜具有天然高的葡萄糖氧化酶和酚含量(蜂蜜中的主要植物化学成分是酚类化合物)。在加工期间，蜂蜜不被加热或辐照，因为这被认为破坏其愈合性质(特别是通过葡萄糖氧化酶产生过氧化氢)。替代地使用WO 2008/049578中描述的臭氧化方法灭菌，其中将臭氧气体鼓泡通过耐臭氧容器中的液化蜂蜜。然而，臭氧已经被美国食品和药物管理局(FDA)批准为仅用于可重复使用的医疗装置的灭菌剂，因此目前没有被美国FDA授权用于对用于伤口愈合的基于蜂蜜的产品进行灭菌。

Mesitran系列是另一系列富含蜂蜜的伤口护理产品。由Triticum制造的L-Mesitran软膏含有48％的医用级蜂蜜和几种其它组分，包括羊毛脂、向日葵油、鳕鱼肝油、万寿菊、芦荟、维生素C和E以及氧化锌。

蜂蜜间抗微生物能力的差异可以超过一百倍，这取决于蜂蜜的地理、季节和植物来源，以及收获、加工和储存条件。因此，基于蜂蜜的敷料根据所使用的蜂蜜的类型具有不同的抗微生物功效。由Jenkins，Burton和Cooper(“The determination of antimicrobialactivity of three honey impregnated wound dressings by challenge test withEMRSA-15”，Advancis)撰写的研究发现，含有Activon、Medihoney或Mesitran产品的基于蜂蜜的敷料均具有抗EMRSA-15的不同效力。Activon浸渍的敷料是最有效的，然后是Medihoney敷料，Mesitran产品具有大大减小的作用。

因此，需要降低蜂蜜的抗微生物能力的可变性，并提高具有低抗微生物能力的蜂蜜的抗微生物活性。还期望提供不依赖于使用具有高水平植物化学组分的蜂蜜的有效的基于蜂蜜的伤口护理产品。还期望提供没有通过臭氧化灭菌的有效的基于蜂蜜的伤口护理产品。

还有几种其它不包含蜂蜜的抗菌伤口护理敷料。这些敷料包括含银敷料，诸如ConvaTec’s

Ag敷料，随着伤口渗出物被吸收至敷料中，其以受控的方式释放离子银。然而，已经报道了耐银生物体，诸如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肠球菌属(enterococci)，并且所述生物体可促进伤口愈合中的无痛。

聚维酮碘(PVP-I)是聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮，PVP)和元素碘的稳定化学复合物。其是用于局部应用以治疗和预防伤口感染的广谱杀菌剂。已经证明细菌不产生对PVP-I的抗性。自 1994年以来，PVP-I已被美国FDA批准用于急性小伤口的急救治疗。然而，其安全性和有效性存在一些争议，并且未被美国卫生和人类服务部推荐用于压力性溃疡。

氯己定对广谱的非芽孢细菌具有快速的杀菌活性。已经记录了针对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和一系列临床分离株的抗菌活性。然而，已经观察到甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)对氯己定有抗性。在英国，药品和保健产品监管机构(MHRA)还发布了关于使用医疗器械和含有氯己定的药物产品引起的过敏反应风险的患者安全警示。

因此，还需要提供具有广谱活性的无毒的，可用于治疗慢性伤口的抗微生物伤口护理产品。

发明内容

本申请人已认识到，蜂蜜的抗微生物活性取决于天然抑制剂与活化剂之间的微妙相互关系，并且已经开发了组合物，其中蜂蜜的天然抗微生物活性可随不同类型的蜂蜜以及蜂蜜的不同收获物之间的可变性减小少而释放，并且其中可以改善具有差的抗微生物效力的蜂蜜的抗微生物性质。本申请人还发现，即使在通过暴露于γ辐照的灭菌之后，此类组合物还具有显著的伤口愈合性质。本申请人已经认识到，这些发现也适用于其它天然物质。

申请人已经发现，组合物的抗微生物效力可以在宽范围内得以精确地增强和控制。这使得可能提供具有最适于预期用途的抗微生物效力的组合物。

在其最广泛的意义上，本发明提供了用于生成抗微生物活性的组合物，其包含能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质。所述酶是除了可能存在于所述物质中的够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性(本文称为“底物转化活性”)以外的酶(即，作为人干预的结果添加的)。优选地，组合物是储存稳定的组合物，其不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

根据本发明，提供了用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶；和包括所述酶的底物的物质；其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

根据本发明，还提供了产生用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物的方法，其包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶与包括酶的底物的物质接触，其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

根据本发明，还提供了用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并且包括所述酶的底物的物质；其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

根据本发明，还提供了产生用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物的方法，其包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的酶与缺乏过氧化氢酶活性并且包括所述酶的底物的物质接触，其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

在足够的水存在下，储存稳定的组合物的酶能够转化底物并释放过氧化氢。已知过氧化氢在抗多种不同的微生物方面是有效的。因此，在稀释本发明的储存稳定的组合物后生成抗微生物活性。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物组合物或溶液的方法，其包括用足够的水稀释本发明的储存稳定的组合物以允许酶转化底物并释放过氧化氢。

根据本发明，还提供了抗微生物组合物或溶液，其包含用足够的水稀释的本发明的储存稳定的组合物，以允许通过酶转化底物而释放过氧化氢。

过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成水和氧的酶。使用缺乏过氧化氢酶活性的物质意味着在来自不同来源的相似物质之间或来自相同来源的不同收获物之间，这种活性的量没有可变性。这降低了可以从此类物质生成的抗微生物活性的可变性。或者，如果物质包括过氧化氢酶活性，并且不可能或不需要在物质与酶接触之前使物质中的过氧化氢酶活性失活，则可以使用足够的酶，以使得过氧化氢酶活性对可从所述物质生成的过氧化氢的影响减小。这也降低了可从所述物质生成的抗微生物活性的可变性。在一些实施方案中，优选所述物质缺乏过氧化氢酶活性。

过氧化氢酶存在于许多植物和动物中。可在物质的加工或提取期间除去过氧化氢酶活性，或者在物质用于本发明的组合物之前灭活过氧化氢酶活性。过氧化氢酶活性可被热灭活，例如通过巴氏灭菌。用于热灭活过氧化氢酶活性的合适温度为至少60℃、70℃或80℃，优选持续至少2分钟。

术语“储存稳定的”在本文中用于指组合物可在环境温度下储存至少数天，优选至少一周，更优选至少一或两个月，同时在稀释组合物后保留生成抗微生物活性的能力。优选的储存温度低于37℃，优选20-25℃。优选地，将组合物避光储存。

过氧化氢在环境温度下通常是不稳定的。本发明的储存稳定的组合物中缺乏足够的游离水防止酶转化底物以释放过氧化氢，从而有助于在环境温度下长时间保持组合物的稳定性。本发明的储存稳定的组合物可包括一些水，条件是没有足以允许酶转化底物的游离水。水的适当量将根据组合物的精确组分而变化。然而，通常，本发明的储存稳定的组合物优选包含少于20％的总水含量，例如10％-19％的水。

过氧化氢可在稀释本发明的组合物后持续释放一段时间，这取决于组合物中存在的底物的量和酶的活性。应当理解，可以选择组合物中底物的量和/或酶的活性，以在组合物稀释后提供相对高水平的过氧化氢在短时间内的释放，或较低水平的过氧化氢在较长时间内的释放。优选地，在稀释组合物后，组合物提供过氧化氢的持续释放至少24小时，更优选至少48小时的时间。优选地，在稀释组合物后，组合物以小于2mmol/升的水平提供持续至少24小时的时间的过氧化氢的持续释放。

存在于本发明的组合物中的酶是除了可存在于物质中的能够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性(本文称为“底物转化活性”)以外的酶，即本发明的组合物包含所述物质和添加的酶。在一些实施方案中，优选在所述物质中不存在底物转化活性。

应当理解，在本发明的储存稳定的组合物中应存在足够的酶以在稀释组合物后根据需要转化底物并形成过氧化氢。

鉴于在足够的水存在下通过本发明的储存稳定的组合物生成过氧化氢的重要性，应当理解本发明的组合物不应含有任何添加的过氧化物酶。

优选地，酶是纯化的酶。术语“纯化的酶”在本文中用于包括酶制剂，其中酶已经与当酶产生时最初存在的至少一些杂质分离。优选已被除去或减少的杂质包括否则会干扰酶转化底物释放过氧化氢的能力的杂质。

纯化的酶处于高水平的纯度可以不总是必要或需要的，条件是酶能够转化底物以释放过氧化氢。在一些情况下，可能需要使用相对粗制的酶制剂。合适的纯度水平的实例包括至少 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的纯度。

然而，优选的是，生产酶时可最初存在的任何过氧化氢酶的量已经减少。该酶可以通过重组或非重组方法产生，并且可以是重组或非重组酶。该酶可以从微生物来源，优选地从非遗传修饰的微生物纯化。

酶的纯度水平可以根据组合物的预期用途适当地选择。例如，如果组合物预期用于人消费，则食品级的纯度可能是适当的。对于医疗用途，应使用医疗级或医疗装置级的纯度。

优选地该酶是氧化还原酶。可转化底物以释放过氧化氢的氧化还原酶的实例包括葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇酸氧化酶和氨基酸氧化酶。这些氧化还原酶的相应底物分别是D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸盐、乙醇酸盐和氨基酸。

一种或多种氧化还原酶和一种或多种氧化还原酶的底物的混合物可以存在于本发明的组合物中。

根据本发明的优选实施方案，氧化还原酶是葡萄糖氧化酶，底物是D-葡萄糖。

所述物质可以是包括酶的底物的任何物质。优选地，所述物质缺乏过氧化氢酶活性。优选地，物质是未精制的物质。术语“未精制的”在本文中用于指未被加工成纯形式的物质。未精制的物质包括可能已经浓缩(例如通过干燥或煮沸)的物质。

优选地，所述物质包括来自天然来源(本文称为“天然物质”)的一种或多种底物。天然物质的实例包括来自植物来源的物质，包括来自树液、根、花蜜、花、种子、果实、叶或枝条的物质。更优选地，物质是未精制的天然物质。

优选地，该物质包括一种或多种下列底物：D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸盐、乙醇酸盐或氨基酸。

优选地，所述物质是糖物质。术语“糖物质”在本文中用于表示包括一种或多种糖的任何物质。术语“糖”在本文中用于指具有通式C_m(H₂O)_n的碳水化合物。优选的糖包括单糖，诸如 D-葡萄糖、己糖或D-半乳糖。优选地，糖物质包括来自天然来源的一种或多种糖(本文称为“天然糖物质”)。更优选地，天然糖物质是未精制的天然糖物质。未精制天然糖物质可以是(或衍生自)天然糖产品。在优选实施方案中，未精制天然糖产物是蜂蜜。在一些优选实施方案中，蜂蜜是已被处理以除去过氧化氢酶活性或使过氧化氢酶活性失活的蜂蜜。或者，未精制天然糖物质可以是加工的天然糖，诸如糖浆或转化糖浆。

如上所述，所述物质本身可优选缺乏能够转化底物以释放过氧化氢的酶活性(称为“底物转化活性”)。缺乏来自物质的底物转化活性具有的优点是，来自不同来源的相似物质之间或来自相同来源的不同收获物之间的活性的量没有变化。这进一步降低了可从这些物质生成的抗微生物活性的可变性。然后仅通过与物质接触的酶提供底物转化活性，因此可控制组合物中存在的底物转化活性的量。

可将底物转化活性在物质的加工或提取期间除去，或者在物质用于本发明的组合物中之前灭活。底物转化活性可以通过热灭活，诸如通过巴氏灭菌失活。用于使底物转化活性热失活的合适温度为至少80℃，优选持续至少2分钟。热失活的有利方面是过氧化氢酶活性和底物转化活性都可以在单一热灭活步骤中失活。

本发明的储存稳定的组合物可包括抗微生物剂。例如，如果通过将酶与水溶液中的物质在用于通过酶转化底物的条件下接触形成储存稳定的组合物，然后干燥组合物以将其水含量降低至一定水平(其中游离水不足以允许酶转化底物)，则可以存在过氧化氢。然而，优选地，储存稳定的抗微生物组合物不包括任何可检测的过氧化氢。此种组合物可以诸如通过在没有足够游离水以允许酶转化底的情况下将酶与底物接触物来形成。可存在于本发明的储存稳定的组合物中的其它抗微生物剂的实例包括：抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂。

特别优选的是，本发明的组合物是食品标准组合物。此类组合物可用于人消费。在其它特别优选实施方案中，组合物是医疗级或医疗装置级组合物。或者，本发明的组合物可具有用于动物食用的动物食物标准。

特别优选的是，组合物的每种组分是天然物质(即每种组分来源于天然来源)。仅含有天然成分的本发明的组合物提供了对基于药物的抗微生物制剂的有吸引力的替代品。

优选地，所述物质是蜂蜜。蜂蜜优选地可以是医疗级或医疗装置级蜂蜜。在一些实施方案中，优选的是，蜂蜜是已被处理以除去最初存在于蜂蜜中的过氧化氢酶活性或使该活性失活的蜂蜜。根据本发明的优选实施方案，所述物质是巴氏灭菌的蜂蜜，并且所述酶是葡萄糖氧化酶。根据优选实施方案，物质是医疗级或医疗装置级蜂蜜，并且酶是医疗级或医疗装置级酶，优选葡萄糖氧化酶。

蜂蜜是由蜜蜂使用花的花蜜制成的天然产品。其是饱和或过饱和的糖溶液。蜂蜜在食品法典国际食品标准中被定义为“由蜜蜂从植物花蜜或植物生活部分的分泌物或植物吮吸昆虫在植物生活部分上的排泄物(蜜蜂收集所述花蜜、分泌物或排泄物，通过将其与它们自已的特定物质结合进行转化、沉积、脱水、储存和留在蜂巢中以熟化和成熟)产生的天然甜味物质”(Revised Codex Standard for Honey，2001)。

花蜜通常包括约14％的单糖(w/w)、1％的酚化合物和85％的水。酚化合物赋予蜂蜜其味道、香气和颜色。在蜂巢的温暖条件(通常36℃)下，花蜜将很快发酵。为了防止这种情况，将花蜜与来自觅食蜂的唾液腺和下咽腺的含有酶的分泌物混合。在蜂巢中，花蜜从蜜蜂传递至蜜蜂，并且在其被存储在蜂巢的小室中之前被添加了更多的分泌物。存在的酶的量随着蜜蜂的年龄、饮食和生理阶段(当蜜蜂是觅食者时，其腺体会产生更多的消化酶)、集落的强度、蜂巢的温度以及花蜜流和其糖含量而变化。

由蜜蜂添加到花蜜的酶包括催化淀粉转化为糊精和糖的淀粉酶，催化蔗糖转化为果糖和葡萄糖的转化酶和催化葡萄糖转化成过氧化氢和葡萄糖酸的葡萄糖氧化酶。低剂量的过氧化氢阻止将快速发酵花蜜的酵母的生长。当蜜蜂逐渐干燥花蜜以形成蜂蜜时，葡萄糖酸使蜂蜜产生酸性(在pH 3.5与4.5之间)。水被有效地捕获至蜂蜜中的糖分子并且不可用于进一步的化学反应。蜂蜜中‘游离’水的量被测量为水活度(aw)。蜂蜜中发现的aw的范围已报道为0.47-0.70，平均值为0.562和0.589(RCIEGG，M；BLANC，B，1981，The wateractivity of honey and related sugar solutions.Lebensmittel-Wissenschaft undTechnologie 14：1-6)。熟化的蜂蜜的a_w太低，以至不支持任何菌种的生长，如果水含量低于17.1％，则没有发酵(Molan，P.C.(1992).The antibacterial activity of honey：1.The nature of the antibacterial activity.Bee World，73(1)，5-28)。蜂蜜的酸性和游离水的缺乏防止了发酵的进一步风险，并停止葡萄糖氧化酶的工作。蜂蜜还含有可变量的源自花蜜的过氧化氢酶。

开花蜂蜜的典型化学组成是：

表1

此外，存在痕量的花粉，其可以用于鉴定蜂蜜的植物来源，以及酶转化酶、淀粉酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。还有植物化学组分。这是变化的，但通常高达～1％，这取决于蜂蜜的来源。

一旦稀释，存在于天然蜂蜜中的葡萄糖氧化酶能够转化稀释的蜂蜜中的葡萄糖底物以释放过氧化氢。然而，蜂蜜含量(特别是葡萄糖氧化酶活性、葡萄糖和过氧化氢酶活性的含量) 的可变性意味着来自不同来源的蜂蜜或来自相同来源的蜂蜜的不同收获物在其抗微生物效力方面可具有非常大的可变性。

根据本发明的实施方案，可对蜂蜜进行巴氏灭菌。蜂蜜的巴氏灭菌使存在于蜂蜜中的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶活性失活。任选地，可过滤巴氏灭菌的蜂蜜以除去可在收获后存在于蜂蜜中的任何颗粒(诸如蜡颗粒和蜂翅)。为了形成本发明的储存稳定的组合物，一旦葡萄糖氧化酶已冷却至不会使添加的葡萄糖氧化酶失活并且蜂蜜保持足够的液体，以促进与葡萄糖氧化酶的混合的温度(适当地为35-40℃)，就可将葡萄糖氧化酶与巴氏灭菌的蜂蜜接触。

可在足以使过氧化氢酶活性热失活的温度下对蜂蜜进行巴氏灭菌。合适的最低温度为 60℃至80℃。该温度应优选保持至少2分钟。

热过程的控制可以是重要的，因为加热蜂蜜的双产物是HMF(羟基甲基糠醛)的形成，所述HMF用作蜂蜜中的热和储存变化的指示剂。HMF通过在酸的存在下果糖的分解形成。热增加了该反应的速度。速度的增加随着热量的增加而呈指数增长。对于蜂蜜升至高于40℃(接近正常蜂巢环境温度)的每一度数，HMF迅速增加。HMF不是有害产物。果酱、糖蜜、金糖浆等可具有为蜂蜜水平的10至100倍的HMF水平。然而，HMF水平用作蜂蜜降解的指示，并且根据食品法典标准，40mg/l是欧盟对餐桌蜂蜜的最大允许水平。

为了防止HMF的形成，优选将蜂蜜迅速升高至使过氧化氢酶失活的温度水平，然后使用热交换机制将蜂蜜迅速降温至最高40℃至45℃。

在该优选实施方案的过程中不添加水，因此所得组合物不包括足够的游离水，以允许葡萄糖氧化酶转化存在的葡萄糖以释放过氧化氢。储存稳定的组合物包括：巴氏灭菌的蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶。没有可检测的过氧化氢存在。组合物可在环境温度下储存至少数天。

在本发明的其它实施方案中，可不对蜂蜜进行灭菌。

根据一些优选实施方案，蜂蜜(巴氏灭毒的或未巴氏灭菌的)是乳酪型蜂蜜。乳酪型蜂蜜是已被处理以控制结晶的蜂蜜。乳酪型蜂蜜含有大量的小晶体，其防止可在未加工的蜂蜜中发生的较大晶体的形成。美国专利1,987,893中描述了用于产生乳酪型蜂蜜的方法。在该方法中，首先将生蜂蜜进行巴氏灭菌，然后将预先加工的乳酪型蜂蜜添加至巴氏灭菌的蜂蜜中，以产生10％乳酪型蜂蜜与90％巴氏灭菌蜂蜜的混合物。然后将混合物在14℃的控制温度下静置。该方法在约一周内产生一批乳酪型蜂蜜。种子批料可以通过使正常蜂蜜结晶并将晶体破碎成所需尺寸来制备。大规模生产者已通过使用桨搅拌蜂蜜混合物同时将混合物保持在14℃来改进了该方法。在替代性乳化法中，可以省略巴氏灭菌步骤，取而代之以将蜂蜜缓慢温热至37℃。

葡萄糖氧化酶优选是具有用于人类消费的食品标准的或具有用于医疗应用的医疗级或医疗装置级的纯化的天然葡萄糖氧化酶制剂。葡萄糖氧化酶的活性可根据在储存稳定的组合物稀释后所需的过氧化氢生成速率来选择。几种葡萄糖氧化酶制剂是可商购的(葡萄糖氧化酶根据参考文献CAS：9001-37-0来鉴定)。来自非遗传修饰的生物体的葡萄糖氧化酶的常见微生物来源包括黑曲霉(Aspergillus niger)、尼崎青霉(Penicilliumamagasakiense)、变幻青霉 (Penicillium variabile)、特异青霉(Penicillium notatum)的选定菌株。来自GMO黑曲霉的医疗装置级葡萄糖氧化酶可获自Biozyme UK，活性为240iu/mg。来自黑曲霉的食品标准葡萄糖氧化酶可获自BIO-CAT INC，活性为15,000个单位/g。非遗传修饰的葡萄糖氧化酶可获自 BIO-CAT INC，活性为12,000/g。来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GO3B2)可获自BBI Enzymes Limited，活性为360个单位/mg。污染物：α-淀粉酶不超过0.05％，糖精不超过0.05％，麦芽糖酶不超过0.05％，以及GO/Cat不超过2000。

酶活性(诸如，葡萄糖氧化酶活性)可在例如1-400IU/mg或1-300IU/mg，诸如250-280 IU/mg的范围内。所使用的酶的量可取决于几个因素，包括组合物的期望用途，物质中存在的任何过氧化氢酶活性的量，物质中存在的底物的量，期望的过氧化氢释放水平，以及过氧化氢释放所需的时间长度。本领域普通技术人员可以容易地确定合适量的酶，如果需要，使用如下文实施例2中所述的孔扩散测定来测定不同量的酶的过氧化氢释放的程度。酶(诸如葡萄糖氧化酶)的合适量可以为0.0001％w/w至0.5％w/w的组合物。可选择酶的用量，以便产生用于产生等效于选择的酚标准物(诸如10％、20％或30％的酚标准物)的抗微生物活性的组合物。

本发明的组合物，特别是其中物质是蜂蜜(诸如未经巴氏灭菌的蜂蜜)，并且酶是能够转化蜂蜜中的D-葡萄糖以释放过氧化氢的葡萄糖氧化酶的本发明的组合物，可包含每克组合物至少1个单位，优选高达1500个单位的葡萄糖氧化酶。所述葡萄糖氧化酶是除了可天然存在于物质中的任何葡萄糖氧化酶活性以外的葡萄糖氧化酶活性(即，作为人干预的结果添加的)。

“单位”在本文中定义为在pH 7.0、25摄氏度下每分钟引起1微摩尔葡萄糖的氧化的酶的量。

本申请人已经发现，本发明的组合物的抗微生物效力可仅通过增加组合物中存在的葡萄糖氧化酶活性的量来增加。

在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物包含每克组合物多于15个单位，例如至少 30个单位、至少50个单位或至少100个单位，并适当地少于685个单位，例如100-500个单位的葡萄糖氧化酶。已经发现此类组合物具有比每克组合物具有高达15个单位的葡萄糖氧化酶的组合物优异的抗微生物性质。具体地，此类组合物具有增强的抗广泛的微生物(包括 MSSA、MRSA、组A和B链球菌属(Streptococci)、肠球菌(Enterococcus)、大肠杆菌(E.coli)、大肠杆菌ESBL、液化沙雷菌Amp C(Serr.liquefaciens Amp C)、肺炎克雷伯菌(Kleb.pneumoniae)、铜绿假单孢菌(Pseud.aeruginosa)和白色念珠菌(Candidaalbicans))的效力。

在本发明的其它实施方案中，本发明的组合物包含每克组合物至少500个单位，例如 500-1000个单位或685-1000个单位的葡萄糖氧化酶。已发现此类组合物具有甚至更优异的抗微生物性能。具体地，此类组合物具有进一步增强的抗广泛的微生物(包括MSSA，MRSA，大肠杆菌ESBL和金黄色葡萄球菌)的效力。

巴氏消毒过程使存在于蜂蜜中的任何酶活性失活，因此来自不同来源的巴氏灭菌的蜂蜜之间或来自相同来源的蜂蜜的不同收获物之间的过氧化氢酶和底物转化活性没有可变性。底物转化活性的量可通过添加具有确定量和活性的酶的纯化葡萄糖氧化酶制剂来控制。因此，不同类型的蜂蜜以及蜂蜜的不同收获物之间的抗微生物性质的固有可变性显著降低，并且具有低抗微生物能力的蜂蜜的抗微生物性质得到改善。

根据本发明的另外的优选实施方案，所述物质可以是转化物质，优选转化糖浆，诸如转化枫糖浆。术语“转化的”在本文中用于表示最初存在于物质中的蔗糖已例如通过转化酶或蔗糖酶的活性转化为葡萄糖和果糖。此类转化物质然后可用于具有酶葡萄糖氧化酶的本发明的组合物。

枫糖浆由糖枫或黑槭树汁制成。在气候寒冷的地区，这些树在冬季到来之前将淀粉储存在其茎和根中，所述淀粉当在春季被转换为糖时，在树汁中升高。可叩击枫树，并且收集并浓缩渗出的汁液以形成枫糖浆。枫糖浆通常包含约66％的蔗糖，33％的水和1％的葡萄糖和果糖。由于存在低量的葡萄糖，当与葡萄糖氧化酶组合时枫糖没有强效的生成抗菌性的性质。然而，如果蔗糖首先被转化为葡萄糖和果糖(例如通过用转化酶或蔗糖酶处)，则所得的转化糖浆包括高得多的水平的葡萄糖氧化酶的底物。

根据本发明，还提供了抗微生物组合物或用于生成抗微生物活性的组合物，其包含缺乏过氧化氢酶活性的物质和能够转化所述物质中的底物以释放过氧化氢的酶。

根据本发明还提供了产生抗微生物组合物或用于生成抗微生物活性的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的酶与缺乏过氧化氢酶活性并且包括所述酶的底物的物质接触。

根据本发明还提供了抗微生物组合物或用于生成抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：物质；和能够转化所述物质中的底物以释放过氧化氢的纯化的酶。

根据本发明还提供了产生抗微生物组合物或用于生成抗微生物活性的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶与包括所述酶的底物的物质接触。

本发明的组合物或抗微生物组合物还可包含过氧化氢。根据本发明还提供了包含本发明的组合物或抗微生物组合物的抗微生物溶液。

本发明的组合物和溶液可用于治疗可用过氧化氢治疗的任何微生物感染。实例包括由革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、耐酸细菌、病毒、酵母、寄生或病原微生物或真菌引起的感染。具体地，可治疗由以下微生物引起的感染：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophytics)、A组或B组β溶血型链球菌(Beta haemolytic Streptococci)、结肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)、空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus)(MRSA)、甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(Methicillin Sensitive Staphylococcus Aureus)(MSSA)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、疟原虫属(Plasmodium)和弓形体属(Toxoplasma)。

根据本发明还提供了本发明的组合物或溶液用于预防或抑制微生物生长的用途。

根据本发明还提供了用作药剂的本发明的组合物或溶液。根据本发明还提供了用于预防、治疗或缓解微生物感染的本发明的组合物或溶液。

本发明还提供了本发明的组合物或溶液在制备用于预防、治疗或缓解微生物感染的药剂中的用途。

根据本发明，还提供了用于预防、治疗或缓解微生物感染的方法，其包括向需要此类预防、治疗或缓解的受试者施用本发明的组合物或溶液。受试者可以是人或动物受试者。可局部施用本发明的组合物。

本申请人已经发现，本发明的组合物，特别是其中未精制的天然物质是蜂蜜的本发明的组合物，具有显著的伤口愈合性质。具体地，已经持续一个月至一年以上的慢性伤口在用本发明的组合物治疗的几天内明显开始愈合。

具体地，据信这种组合物的伤口愈合活性是由当本发明的组合物例如通过伤口渗出物稀释时提供的过氧化氢的持续低水平释放导致的。这导致氧向伤口部位的递送。

氧在支持伤口愈合中具有多种重要作用。复杂的伤口愈合过程需要大量的能量。如果伤口感染，则存在甚至更大的能量需求，这又意味着对氧的需求更大。氧涉及自然愈合过程的许多机制。其在代谢支持、基质修复、抗菌/感染控制以及信号传导和细胞反应的控制中具有关键作用。与没有足够氧合的那些伤口相比，接受足够氧的伤口通常以增加的速率愈合。缺血/缺氧可以直接抑制伤口愈合过程，诸如血管生成、胶原合成和上皮形成，并且还阻碍白细胞杀死细菌的能力。随着细菌繁殖，更多的白细胞被募集到伤口部位，进一步增加氧消耗。

对于伤口愈合，必须具有足够的能量和营养物来驱动愈合过程。氧在这些代谢过程中是必需的。组织再生和愈合涉及肉芽组织的形成、上皮形成、收缩和重建模。愈合过程需要各种类型的细胞的增殖，随着基质建立，形成新的血管并且替换上皮。此类细胞活性取决于允许不受阻碍的呼吸的氧气可用性。构建所有生物聚合物(例如蛋白聚糖、结构蛋白)所需的生物合成途径取决于满足潜在的能量需求的氧气。需要多种酶，包括基质金属蛋白酶，并且这些酶在能量和从而氧的需求上也是昂贵的。

胶原合成是这些过程的基本部分。胶原的沉积对于重建结缔组织和作为血管生成过程的一部分是至关重要的。氧是在原胶原形成期间脯氨酸和赖氨酸的羟基化中所需的辅因子。成熟的胶原合成需要脯氨酰羟化酶和赖氨酰羟化酶，所述二者要行使它们的功能都依赖于氧。

新血管形成/血管发生是完全愈合所必需的。这必须由适当的信号触发。在高氧环境中，巨噬细胞白细胞可触发该信号，导致涉及组织降解，随后胶原形成和组织，内皮细胞迁移/定殖和血管形成的协调的、复杂的系列事件。

当产生伤口时，身体的自然防御被激活。中性粒细胞在创伤后不久聚集在创伤部位，释放杀菌活性氧(ROS)和过氧化氢(H₂O₂)以杀死细菌并预防感染。巨噬细胞响应于环境刺激到达伤口，吞噬外来颗粒，并释放血管内皮生长因子(VEGF)(一种对伤口愈合至关重要的血管生成因子)。氧在这些事件中发挥关键作用。巨噬细胞和嗜中性白细胞的主要微生物杀伤机制之一是“呼吸爆发”-这些细胞籍以杀死微生物的天然活性。在呼吸爆发过程中有缺陷的个体成为细菌感染的受害者。白细胞需要氧以递送呼吸爆发效应，并且升高的氧水平可提高其效力。这些白细胞还具有其它细菌杀伤机制，当它们吞噬微生物(吞噬作用)时被触发。这是一个氧依赖的过程，因为其涉及大量的能量消耗，所以其不能很好地在缺氧环境中工作。其在氧富集的情况下工作最好。氧对厌氧细菌也是致命的，并且在一些抗生素有效发挥作用中是重要的。

分子氧是与生长因子和其它信号(例如，氧化还原信号)相互作用以调节信号传导途径的重要细胞信号。由巨噬细胞释放的触发血管生成的分子信号是“血管内皮生长因子”(VEGF)。高氧水平可引起巨噬细胞白细胞释放VEGF。许多其它重要因子和酶的基因由高氧水平诱导。

一氧化氮(NO)的产生也被认为是伤口愈合中的关键信号传导和控制事件。NO由酶一氧化氮合酶(NOS)产生，并且存在于伤口愈合的早期阶段，酶(iNOS)的可诱导形式被上调。然而，其只能在精氨酸和氧气充足的情况下发挥作用，以使得能以适当的速率产生NO。

氧还在发出(刺激)进行上皮形成过程的信号中发挥直接作用，上皮形成是其中新的上皮细胞增殖，组织自身并分化成结构化上皮的关键后期愈合事件。

因此，通过本发明的组合物向伤口部位持续供应氧被认为在促进伤口愈合中是特别重要的。

据认为，除了它们的过氧化氢释放活性之外，本发明的优选组合物的伤口愈合活性也由组合物的许多活性促成。具体地，优选的组合物据认为具有对伤口清创和除臭，具有抗炎性质，能够刺激组织生长，以及控制疼痛和使瘢痕形成最小化的能力。

恶臭是慢性伤口的常见特征，并且归因于从分解的血清和组织蛋白产生恶臭化合物的厌氧细菌菌种的存在。除了抗微生物作用以外，包含葡萄糖(优选按重量计24-40％)的本发明组合物允许细菌优先于氨基酸代谢该恶臭化合物，导致无气味的代谢物乳酸的产生。

具有高摩尔渗透压浓度(适当地具有在与蜂蜜类似的范围(即0.47-0.7)内的a_w)的本发明的组合物据认为有助于通过组织蛋白酶的自溶作用清除伤口。本发明的组合物通过从伤口组织通过其强渗透作用抽出淋巴液而产生潮湿的伤口环境。这在伤口床与上覆的坏死组织的界面处提供了蛋白酶的恒定供应。该作用也从下面清洗伤口床的表面。通过本发明的组合物与水接触释放的过氧化氢对蛋白酶的活化也可以起辅助作用。清除作用还可通过去除死组织来有助于降低伤口的细菌负荷。众所周知死亡组织为细菌生长提供极好的培养基，并且如果留在伤口中则增加感染的风险。

身体的炎症反应标志着愈合过程的开始，但长时间的反应可抑制愈合，导致对组织的进一步损伤，并使得更难以处理伤口。长期的炎症反应通常与高水平的渗出物有关。抑制炎症以及减轻患者的疼痛，减少了血管的打开，从而减轻水肿和渗出。本发明的组合物清除感染和清创伤口的能力据认为有助于抗炎作用。包括抗氧化剂(优选存在于蜂蜜中的一种或多种抗氧化剂)的本发明组合物还可通过清除自由基来减少过度的炎症。

长期的炎症引起纤维化，其在伤口中表现为肥厚性瘢痕形成。本发明的优选组合物可通过减少炎症，促进血管生成和刺激肉芽组织的形成来减少瘢痕形成。本发明的优选组合物还可以刺激上皮的生长。

本发明的组合物也被认为具有由白细胞介素-1(IL-1)介导的免疫刺激作用。本发明的组合物被认为促进IL-1从皮肤细胞的释放。IL-1是也由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞分泌的细胞因子。其是身体对抗感染的炎症反应的重要部分。其增加粘附因子在内皮细胞上的表达，以使白细胞能够迁移到感染部位。其还作用于大脑的体温调节中心，导致体温升高。其被称为内源性热原。升高的体温有助于身体的免疫系统对抗感染。这是炎症性免疫应答的初始阶段，其增强了系统的抗微生物活性。炎症反应通过其抗可能的感染的防御以及通过参与细胞和组织修复和再生长而在伤口愈合中起中心作用。本发明组合物的抗微生物作用据认为通过免疫刺激作用得到辅助和补充，所述免疫刺激作用有助于受损组织和/或细胞的再生长和修复。

本发明的组合物，特别是基于蜂蜜的组合物为伤口组织提供潮湿的愈合环境，而无浸软周围的风险，并且防止敷料粘附到伤口床上，以使得当更换敷料时没有疼痛和组织损伤。此类组合物还刺激健康细胞发育并加速伤口中的肉芽形成和上皮形成过程。组合物还具有闭合作用以保护伤口和受损组织。还认为基于蜂蜜的组合物导致伤口pH的显著降低，这有利于愈合过程。

根据本发明的优选方面，本发明的组合物可用于伤口护理的方法，包括伤口的治疗，或伤口败血症的治疗或处理。

伤口可以是急性伤口、慢性伤口、手术伤口(例如，剖腹产伤)、慢性烧伤或急性烧伤。本发明的组合物可用于预防性预防伤口败血症。如果使用本发明的储存稳定的组合物，应当理解，这可通过存在于伤口部位的液体稀释，这由此导致由稀释的组合物释放过氧化氢。

当任何组织的完整性受损(例如皮肤破裂、肌肉撕裂、烧伤或骨折)时伤口产生。伤口可由动作(外伤)或外科手术，传染病或潜在病况引起。

急性伤口包括手术切口和创伤性损伤，诸如撕裂伤、擦伤、撕脱全国各地、穿透或咬伤和烧伤。急性创伤通常通过有序和及时的修复过程进行，所述修复过程导致解剖学和功能完整性的持续恢复。

慢性伤口是已存在超过三周或未能进行通过有序和及时的过程以产生解剖和功能完整性，或进行通过修复过程而未建立持续和功能结果的伤口(Lazarus等，ArchDermatol.1994； 130(4)：489-493)。

慢性伤口可分为四类：静脉溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡和压力性溃疡。少数不属于这些类别的伤口可由诸如辐射中毒或缺血的原因造成。

通常发生在腿部的静脉溃疡占慢性伤口的约70％至90％，并且主要影响老年人。它们被认为由静脉中存在的防止血液向后流动的瓣膜的不当功能引起的静脉高压造成。缺血是由功能障碍引起的，并且与再灌注损伤相结合，引起导致伤口的组织损伤。在静脉疾病中，溃疡通常位于踝和小腿之间的绑腿区域(通常在腿的内侧)。

动脉腿溃疡作为动脉血流量减少和随后组织灌注的结果而发生。动脉粥样硬化或外周血管疾病是动脉性腿溃疡的最常见原因。如果不进行治疗，血液供应的减少可导致通过受影响的动脉提供给养的区域中的组织死亡。溃疡发展通常是组织的迅速、深度破坏。动脉性腿部溃疡可发生在小腿上的任何地方，并且通常更深且为圆形，具有清楚限定的边界。

糖尿病性溃疡：糖尿病引起免疫妥协和对小血管的损害，阻止组织的充分氧合，这可引起慢性伤口。糖尿病引起神经病，其抑制伤害感受和疼痛感觉。因此，患者最初可能不会注意到腿和脚的小伤口，因此可能不能防止感染或反复受伤。压力也在糖尿病溃疡的形成中起作用。由于慢性溃疡，糖尿病患者截肢的风险比普通人群高15％。

压力性溃疡通常发生在具有抑制通常经受压力的身体部位(诸如脚跟、肩胛骨和骶骨)的运动的麻痹等病况的人中。压力性溃疡由当组织上的压力大于毛细血管中的压力，从而限制血液流入该区域时发生的缺血引起。，比皮肤需要更多的氧气和营养物的肌肉组织，显示来自长期压力的最糟糕的影响。如在其它慢性溃疡中一样，再灌注损伤损害组织。

当治疗溃疡时，希望：产生屏障以在伤口愈合时保护伤口；提供潮湿的伤口环境；脱落伤口；减少细菌负荷；以及理想地通过免疫调节和改善营养促进愈合。常规的伤口处理产品不能实现所有这些作用。一些常规治疗具这些作用中的一些作用，但具有相当的毒性，因此不是理想的治疗。然而，本发明的组合物，特别是其中物质是蜂蜜的本发明的组合物具有所有这些性质。另外，本发明组合物的抗微生物效力可被控制为远比其它基于蜂蜜的伤口护理产品有效，并且所述组合物在抗涉及慢性伤口的一系列病原体(包括抗生素抗性生物体，诸如 MRSA)方面是有效的。

本发明的组合物在尤其是其中伤口可能变得更糟的的患者(诸如糖尿病患者)的伤口的早期治疗中是特别有利的。利用本发明的组合物的早期治疗防止了在慢性伤口中出现的并发症，保持患者活跃，并且避免了治疗并发症的费用。

还已发现本发明的组合物在减少或预防手术伤口感染方面是有效的。外科伤口的感染是一个问题，特别是在具有大约10％的相当高的感染率的剖腹产中。本发明的组合物在手术后施用简单。例如，可将本发明的组合物施用于敷料，然后与伤口接触，并用第二敷料保持就位。以下实施例40表明，与历史数据相比，本发明的组合物对手术后的剖腹产伤口的的单次施用将手术部位的感染率降低了60％。

外周插入式中央导管(PICC管线)用于施用化疗治疗和/或其它药物。PICC管线是一根长而细的柔性管，其被插入手臂靠近肘的转弯处的大静脉之一。然后将其穿入静脉，直至尖端位于正好在心脏上方的大静脉中。然而，可能在管线内或在其进入静脉的区域中发展感染。如果感染发展，患者通常被给予抗生素。如果这些抗生素不能清除感染，或者如果感染是严重的，则可除去管线。为了减少感染发展的机会，可将含有抗微生物剂诸如氯己定或银的敷料施用到管线入口部位。

已发现通过将本发明的组合物局部施用于管线入口位点(参见下文实施例39)，本发明的组合物有效地防止和清除PICC管线的定殖。

本发明的组合物可被容易地施加，而无需任何专门医生培训或复杂的设备。该组合物非常适合用于第三世界，在第三世界患者通常具有增加的对感染的易感性的，并且用于手术和伤口护理的材料和器械通常比发达国家更容易受感染。

本发明的组合物是无毒的，并且不具有与含银敷料、PVP-I或氯己定相关的任何问题。

本发明的组合物也可用于治疗供体或受体移植部位。

根据本发明，提供了治疗伤口的方法，其包括向伤口施用本发明的组合物。

据本发明还提供了用于治疗伤口的本发明的组合物。

根据本发明还提供了本发明的组合物在制备用于治疗伤口的药剂中的用途。

根据本发明还提供了治疗炎症的方法，其包括向炎症部位施用本发明的组合物。

根据本发明还提供了用于治疗炎症的本发明的组合物。

根据本发明还提供了本发明的组合物在制备用于治疗炎症的药剂中的用途。

根据本发明还提供了刺激组织生长的方法，其包括向需要此类刺激的部位施用本发明的组合物。

根据本发明还提供了用于刺激组织生长的本发明的组合物。

根据本发明还提供了本发明的组合物在制备用于刺激组织生长的药剂中的用途。

根据本发明还提供了清创伤口的方法，其包括向需要清创的伤口施用本发明的组合物。

根据本发明还提供了用于清创伤口的本发明的组合物。

根据本发明还提供了本发明的组合物在制备用于清创伤口的药剂中的用途。

根据本发明还提供了对伤口除臭的方法，其包括向需要除臭的伤口施用本发明的组合物。

根据本发明还提供了用于对伤口除臭的本发明的组合物。

根据本发明，还提供本发明的组合物在制备用于对伤口除臭的药剂中的用途。

对于伤口愈合应用，本发明的组合物可以由保健提供者确定的适当频率施用。合适地，本发明的组合物可以至少每几天施用，诸如每周施用，但优选每天或隔天施用。

施用的本发明的组合物的量将取决于许多因素，诸如组合物的抗微生物性质的强度和组合物的其它伤口愈合性质，取决于伤口的大小以及待治疗的受试者的年龄和状况。然而，对于许多应用，预期施用2-100g，或5-100g本发明的组合物将是合适的，优选10-50g。

根据本发明的优选实施方案，本发明的组合物是无菌的。无菌组合物优选用于医疗应用，诸如伤口愈合。

本发明的组合物可通过任何合适的方法灭菌。本申请人已经发现，在通过暴露于γ辐照灭菌后，本发明的组合物保持葡萄糖氧化酶活性(并因此保持稀释时释放过氧化氢的能力)。

因此，根据本发明，提供了已通过暴露于γ辐照而被灭菌的本发明的组合物。

根据本发明还提供了对本发明的组合物灭菌的方法，其包括将组合物暴露于γ辐照。

合适的γ辐照水平为10-70kGy，优选25-70kGy，更优选35-70kGy。

由于臭氧没有被美国FDA批准用于对用于伤口愈合的基于蜂蜜的产品的灭菌，本发明的组合物优选一直未通过臭氧化灭菌，并且不包括臭氧或已通过臭氧化进行灭菌的任何组分。具体地，本发明的组合物不应包含臭氧化蜂蜜或臭氧化油。

用于医疗用途的本发明的优选组合物是无菌的单次使用的组合物。

在避光储存的本发明的经灭菌的组合物预期保持稳定至少6个月。例如，可将此类组合物包装在高密度聚乙烯/低密度聚乙烯(HDPE/LDPE)管或聚酯-铝-聚乙烯(PET/AI/PE)小袋中。

本发明的组合物优选是医疗级或医疗装置级组合物。优选地，未精制的天然物质是蜂蜜，合适地是医疗级或医疗装置级蜂蜜。

优选地，本发明的组合物包含乳酪型蜂蜜，更优选未巴氏灭菌的乳酪型蜂蜜。可容易地局部施用此类组合物，因为已通过乳化法使大晶体的存在或数量减少至最少。

对于包含蜂蜜的本发明的组合物，应当理解的是，如果组合物被灭菌，则可以不需要在组合物中使用巴氏灭菌的蜂蜜。可替代地优选使用未巴氏灭菌的蜂蜜(优选乳酪型蜂蜜)或其它未精制的天然物质。在特别优选的实施方案中，本发明的组合物包含未巴氏灭菌的蜂蜜和添加的纯化的葡萄糖氧化酶。

因此，根据本发明，提供了用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含未经巴氏灭菌的蜂蜜和添加的纯化的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶在足够的游离水存在下能够转化蜂蜜中的D-葡萄糖以释放过氧化氢，其中所述组合物不包括足以允许葡萄糖氧化酶转化 D-葡萄糖的游离水。

根据本发明，还提供了一种产生用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物的方法，其包括：将未经巴氏灭菌的蜂蜜与纯化的葡萄糖氧化酶接触，所述纯化的葡萄糖氧化酶在足够的游离水的存在下能够转化蜂蜜中的D-葡萄糖以释放过氧化氢，其中所述组合物不包括足以允许葡萄糖氧化酶转化D-葡萄糖的游离水。

此类组合物优选包含每克组合物至少1个单位，优选至多1500个单位的葡萄糖氧化酶。合适地，此类组合物包含每克组合物多于15个单位的葡萄糖氧化酶，例如每克组合物至少 100个单位，优选100-500个单位的葡萄糖氧化酶，或每克组合物至少500个单位，优选500-1000个单位的葡萄糖氧化酶。

此类组合物的蜂蜜可包含未经巴氏灭菌的乳酪型蜂蜜。

还根据本发明，提供了包含本发明的组合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

根据本发明的某些优选方面，提供了包含本发明的组合物的敷料。合适的敷料包括纱布、绷带、薄纱、薄膜、凝胶、泡沫、水胶体、藻酸盐、水凝胶或多糖糊剂、颗粒或珠。本发明的组合物可以与伤口敷料基质诸如胶原或胶原-糖胺聚糖基质一起存在。

本发明的组合物可呈固体或半固体制剂的形式。固体或半固体制剂的实例包括胶囊剂、丹剂、凝胶帽、粉剂、水凝胶、丸剂、小丸剂或小球剂。或者，本发明的组合物可呈液体制剂的形式。液体制剂的实例包括糖浆剂、糊剂、喷雾剂、滴剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、油剂、搽剂或凝胶剂。典型的凝胶包括醇凝胶，诸如异丙醇、乙醇或丙醇凝胶，或水凝胶。

本发明的组合物可呈适于向人或动物受试者施用的形式。合适的形式包括适于局部或口服施用的形式。适于局部施用的形式包括局部软膏、乳膏、洗剂、油剂、搽剂、液体、凝胶或可溶性条带。适于口服施用的形式包括胶囊剂、丹剂、凝胶帽、丸剂、小丸剂、小球剂、锭剂、牙线、牙膏、漱口剂、可溶性薄膜条。如果使用本发明的储存稳定的组合物，则该组合物可被存在于施用部位的液体(例如，通过用于口服给药的唾液，或通过来自伤口的渗出液)稀释，从而导致过氧化氢在所述施用部位的释放。

本发明的组合物可以与至少一种合适的抗微生物或免疫刺激性组分、赋形剂或佐剂，或其中期望提供生成抗微生物活性的能力的任何其它合适的组分一起存在。例如，本发明的组合物可以与抗菌剂、咳嗽药、祛斑护理制剂、保湿剂、瘙痒缓解制剂、清洁剂、擦洗剂、洗涤剂、阻挡制剂、剥脱制剂一起存在。然而，优选地，本发明的组合物不包括任何抗生素。

本发明的组合物可呈适于控释或缓释递送的形式。例如，口服施用形式可具有肠溶衣以提供控释或持续释放递送。

根据本发明的另一方面，本发明的组合物可呈用作化妆品组合物的形式。本发明的组合物可以与至少一种合适的化妆品赋形剂或佐剂一起存在。化妆品应用涵盖许多不同的个人护理应用，包括头发病况诸如头皮屑的治疗，或身体气味的治疗。

本发明的组合物可以以预防性手部防护溶液或手部消毒剂溶液的形式提供。此类手防护溶液可以以乳膏、洗剂或水凝胶的形式提供，并且用作具有预防性防止微生物感染的有利性质的洗手型产品。

有利地，本发明的组合物可用于治疗或预防MRSA或其它抗生素抗性微生物和细菌。本发明以非毒性方式克服了新出现的抗生素抗性微生物菌株的问题。对于本申请，本发明的组合物可以局部施用，例如作为局部软膏、乳膏、洗剂、油剂、搽剂、液体和/或凝胶。本发明的组合物可以作为组织或皮肤擦拭物的一部分施用。

微生物感染可以是口腔、眼睛、耳朵、皮肤、胸部或指甲感染。口腔感染可以是牙龈疾病、口腔溃烂和/或口腔卫生病症。口腔卫生病症可以是口臭和/或牙龈炎。或者，口腔感染可以是咽喉感染或鼻感染，包括鼻葡萄球菌感染。眼睛感染可包括结膜炎。皮肤感染可以是真菌皮肤感染。真菌皮肤感染包括人的足癣和/或皮癣。在兽医学中，真菌皮肤病况包括腐蹄病、皮癣和人畜共患皮肤感染的控制。指甲感染可以是真菌指甲感染，诸如甲真菌病。

本发明的组合物可用于治疗皮肤病症，诸如痤疮、湿疹或银屑病。痤疮和湿疹可具有可通过组合物治疗的微生物感染组分，并且由刮擦引起的银屑病损伤的继发性微生物感染可通过本发明的组合物治疗。

本发明的组合物可用于兽医学。重要的兽医应用包括微生物感染的治疗和伤口护理的治疗或管理或烧伤治疗。具体病症包括狗中的慢性皮肤感染(皮下葡萄球菌感染)、外耳炎(耳部感染)、动物口腔护理、鸡弯曲杆菌感染、猪、家禽和牛的脊椎侧凸、肠道微生物感染、隐孢子虫感染、人畜共患感染、伤口敷料的清除，例如去除角和脓肿治疗。本发明在兽医用途中具有特别的优点，因为其允许治疗微生物感染而不将抗生素引入食物链。

本发明的组合物可以以具对于其期望提供生成抗微生物活性的能力的任何其它组合物或产品提供。本发明的组合物可以作为与其它组合物或产品的混合物提供，或与其分开地提供，例如将其与另外的组合物或产品一起作为试剂盒包装。当本发明的组合物作为与另外的组合物或产品的混合物提供时，优选地该另外的组合物或产品不包括足以允许酶转化本发明组合物的底物的游离水。

可为本发明的组合物提供使用该组合物的说明书。例如，可将本发明的组合物与说明书一起作为试剂盒包装。

根据本发明，提供了用于预防、治疗或缓解微生物感染或用于治疗伤口的试剂盒，其包含本发明的组合物或溶液，以及用于施用所述组合物或溶液的说明书。

根据本发明，还提供了用于预防或抑制微生物生长的方法，其包括将本发明的组合物或溶液施加于需要预防或抑制微生物生长的表面或区域。

本发明的组合物或溶液可特别地用于预防或抑制植物或昆虫病原体的生长。例如，本发明的组合物或溶液可以特别适合于延长可食用产品(诸如水果或蔬菜)或其它产品(诸如高价值植物材料，包括鳞茎，尤其是百合鳞茎，或花)的保质期，通过防止或抑制否则会损害产品的微生物生长。利用本发明的组合物或溶液(特别是当所述组合物或溶液仅含有天然成分时)进行的可食用产品或其它产品的处理可优选使用农药或药物产品。

根据优选实施方案，本发明的组合物或溶液可用于预防或抑制欧文氏菌属(Erwinia)的生长。欧文氏菌属是主要包含植物病原性菌种的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的属。这些菌种产生水解植物细胞之间的果胶，导致细胞分离(称为“植物腐烂”的疾病)的酶。该属的熟知成员是梨火疫欧文氏菌(E.amylovora)，其在苹果、梨和其它红豆杉作物上引起火疫。胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(也称为胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))是另一菌种，其具有广泛的宿主范围，包括胡萝卜、马铃薯、番茄、绿叶蔬菜、南瓜和其它葫芦、洋葱、青椒。该种能够在其侵入的几乎任何植物组织中引起疾病。其是储存的水果和蔬菜的腐烂的常见原因，因此是非常重要的病原体。由胡萝卜软腐欧文氏菌引起的腐烂通常被称为细菌软腐病(BSR)。

欧文氏菌属感染是马铃薯储存的特殊问题。如果欧文氏菌属萌发，并且引起马铃薯中心的黑腐败，则可能发生显著的损失。该问题目前用药品控制。根据本发明的优选实施方案，本发明的组合物或溶液可用于预防或抑制由欧文氏菌属感染引起的马铃薯的腐烂。仅含有天然成分的本发明的组合物或溶液的使用是特别优选的。

根据本发明的另一方面，本发明的组合物或溶液可用于预防或抑制昆虫病原体的生长，特别是蜂中微粒子虫属(Nosema)的生长。

微粒子虫属是最普遍的成年蜜蜂疾病。其由存在于两个阶段-长寿孢子和复制营养阶段中的单细胞微孢子虫寄生虫引起。如果成年蜜蜂摄取孢子，那么它们会开始发育成营养阶段，其渗入内衬蜜蜂肠道的细胞。存在感染蜜蜂的两个描述的种：蜂小孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)。蜂小孢子虫缩短感染的蜜蜂的寿命。东方蜜蜂微孢子虫已从其亚洲宿主跨越物种屏障，并且已被发现比蜂小孢子虫更具毒力。感染的觅食蜂从蜂巢中消失，该持续的蜜蜂丢失减少了带入蜂巢的食物，直到菌落崩溃。

用抗生素烟曲霉素双环已胺盐(从烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)制备的，石仔病的致病因子)处理微粒子虫属抑制中肠中孢子的繁殖，但不杀死孢子。该抗生素也非常昂贵，并且必须在淡季使用，以使其将污染市售蜂蜜并进入人食物链的风险最小化。

我们已经发现本发明的组合物能够杀死微粒子虫属的孢子和营养阶段。根据本发明，提供了用于预防或治疗蜂中的微粒子病的方法，其包括向蜜蜂施用本发明的组合物或溶液。优选地，将呈粉末形式的本发明的储存稳定的组合物用水稀释并施加于蜂箱。可以例如通过在与呈粉末形式的葡萄糖氧化酶接触之前对蜂蜜进行干法巴氏灭菌来产生呈粉末形式的本发明的储存稳定的组合物。

附图说明

现通过举例的方式，参考附图描述本发明的优选实施方案，其中：

图1显示具有不同量的添加的葡萄糖氧化酶的巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图2显示与不同酚标准物的作用相比较具有不同量的酶的本发明组合物的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图3显示具有添加的葡萄糖氧化酶的巴氏灭菌的Tineo蜂蜜的抗微生物作用的孔扩散测定的结果的照片；

图4显示本发明的不同组合物的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图5显示了包括不同酶制剂的本发明的组合物的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图6显示在储存60天或90天后来自本发明的组合物的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图7显示来自本发明的组合物的粉末制剂的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图8显示在本发明的组合物存在和不存在的情况下不同产品的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图9显示在本发明的组合物存在和不存在的情况下不同产品的抗微生物作用的孔扩散测定的结果；

图10显示与麦卢卡UMF 25+蜂蜜相比，本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物的抗菌作用的孔扩散测定的结果；

图11显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物处理感染的脚趾的作用；

图12显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗脚趾溃疡的作用；

图13显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗脚趾溃疡的作用；

图14显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗足部溃疡的作用；

图15显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗足部溃疡的作用；

图16显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗足部溃疡的作用；

图17显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗足部溃疡的作用；

图18显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗创伤性腿部伤口的作用；

图19显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗感染的腿部伤口的作用；

图20显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗足部溃疡的作用；

图21显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图22显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图23显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图24显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图25显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图26显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图27显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图28显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图29显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗腿部溃疡的作用；

图30显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗并发有基础性骨髓炎的糖尿病性腿部溃疡的作用；

图31显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗压力性溃疡的作用；

图32显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗感染的腋窝切口的作用；

图33显示使用本发明的灭菌的基于蜂蜜的组合物治疗导管入口点周围的感染的作用；

图34显示Surgihoney 1(S1)、Surgihoney 3(S3)和Medihoney(MH)对于不同测试生物体的时间杀灭曲线：(a)金黄色葡萄球菌；(b)甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)；(c)大肠杆菌；(d)抗万古霉素肠球菌(VRE)；(e)铜绿假单胞菌；(f)克雷伯菌属(Klebsiella)；(g)大肠杆菌 ESBL；(h)粪肠球菌；

图35显示测试S1和S2 Surgihoney的抗病毒活性的噬斑测定的结果；

图36显示使用S1 Surgihoney治疗感染的腿部溃疡的结果的照片，其中：(a)显示治疗的第1天；(b)显示治疗的第4天；以及(c)显示治疗的第7天；

图37显示使用S1 Surgihoney治疗压疮的结果的照片，其中：(a)显示治疗的第1天；以及(b)显示治疗的第30天；

图38显示Surgihoney(SH)和两种修饰的原型PT1和PT2的不同过氧化氢产生速率；

图39显示了经修饰的蜂蜜、SH、PT1和PT2中的酚活性与最大过氧化氢活性之间的关系。

图40显示实施例3中不同样品引起的金黄色葡萄球菌的抑制区的琼脂平板的照片中不同样品的排列方式；

图41显示实施例9中图9a中所用样品的排列方式；

图42显示实施例9中图9b中所用样品的排列方式。

具体实施方式

实施方式1.一种用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物，所述组合物包含：

能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶；和

包括所述酶的底物的未精制的天然物质；

其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

实施方式2.一种用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：

能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和

未精制的天然物质，其缺乏过氧化氢酶活性并且包括所述酶的底物；

其中所述酶是除了可能存在于所述未精制的天然物质中的能够转化所述底物以释放过氧化氢的任何酶活性以外的酶，并且所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

实施方式3.根据实施方式1所述的组合物，其中所述未精制的天然物质缺乏过氧化氢酶活性。

实施方式4.根据实施方式2或3所述的组合物，其中所述物质已被处理以除去过氧化氢酶活性或使所述活性失活。

实施方式5.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述物质是未精制的天然糖物质。

实施方式6.根据实施方式5所述的组合物，其中所述糖物质是蜂蜜。

实施方式7.根据实施方式5所述的组合物，其中所述糖物质是已被处理以除去过氧化氢酶活性或使所述活性失活的蜂蜜。

实施方式8.根据实施方式5所述的组合物，其中所述糖物质是糖浆或转化糖浆。

实施方式9.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述物质缺乏能够转化所述底物以释放过氧化氢的酶活性。

实施方式10.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述物质是巴氏灭菌的物质。

实施方式11.根据实施方式6所述的组合物，其中所述蜂蜜是未巴氏灭菌的蜂蜜，优选未巴氏灭菌的乳酪型蜂蜜。

实施方式12.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述酶是氧化还原酶。

实施方式13.根据实施方式12所述的组合物，其中所述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇酸氧化酶或氨基酸氧化酶。

实施方式14.根据实施方式13所述的组合物，其中所述氧化还原酶的底物是D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸盐、乙醇酸盐或氨基酸。

实施方式15.根据实施方式13所述的组合物，其中所述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶，并且所述氧化还原酶的底物是D-葡萄糖。

实施方式16.根据实施方式15所述的组合物，其中所述组合物包括每克所述组合物至少一个单位的葡萄糖氧化酶。

实施方式17.根据实施方式16所述的组合物，其中所述组合物包含每克所述组合物高达 1500个单位的葡萄糖氧化酶。

实施方式18.根据实施方式16或17所述的组合物，其中所述组合物包含每克所述组合物多于15个单位的葡萄糖氧化酶。

实施方式19.根据实施方式16至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含每克所述组合物至少100个单位，和优选100-500个单位的葡萄糖氧化酶。

实施方式20.根据实施方式16至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含每克所述组合物至少500个单位，和优选500-1000个单位的葡萄糖氧化酶。

实施方式21.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物是食品标准组合物。

实施方式22.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物是医疗级或医疗装置级组合物。

实施方式23.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述组合物的每种组分是天然物质。

实施方式24.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物呈粉末形式。

实施方式25.一种抗微生物组合物，其包含根据实施方式1至24中任一项的组合物，用足够的水稀释以允许通过所述酶转化所述底物而释放过氧化氢。

实施方式26.一种用于生成抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：未精制的天然物质；和能够转化所述未精制的天然物质中的底物以释放过氧化氢的纯化的酶。

实施方式27.一种用于生成抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：缺乏过氧化氢酶活性的未精制的天然物质；和能够转化所述未精制的天然物质中的底物以释放过氧化氢的酶，其中所述酶是除了可能存在于所述未精制的天然物质中的能够转化所述底物以释放过氧化氢的任何酶活性以外的酶。

实施方式28.根据实施方式26所述的组合物，其中所述未精制的天然物质缺乏过氧化氢酶活性。

实施方式29.根据实施方式26至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包含过氧化氢。

实施方式30.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物是无菌组合物。

实施方式31.根据实施方式30所述的组合物，所述组合物已通过暴露于γ辐照来进行灭菌。

实施方式32.一种抗微生物溶液，所述溶液包含根据实施方式26至31中任一项的组合物。

实施方式33.一种对根据实施方式1至29中任一项的组合物进行灭菌的方法，所述方法包括将所述组合物暴露于优选10-70kGy，更优选25-70kGy，最优选35-70kGy的γ辐照。

实施方式34.一种产生用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶与包括所述酶的底物的未精制的天然物质接触，其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

实施方式35.一种产生用于生成抗微生物活性的储存稳定的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的酶与缺乏过氧化氢酶活性且包括所述酶的底物的未精制的天然物质接触，其中所述组合物不包括足以允许所述酶转化所述底物的游离水。

实施方式36.根据实施方式34所述的方法，其中所述未精制的天然物质缺乏过氧化氢酶活性。

实施方式37.根据实施方式34至36中任一项所述的方法，其中所述物质是未精制的天然糖物质。

实施方式38.根据实施方式34至37中任一项所述的方法，其中在将所述物质与所述酶接触之前，所述物质已被处理以除去存在于所述物质中的过氧化氢酶活性和/或存在于所述物质中的能够转化所述底物以释放过氧化氢的任何酶活性或使所述活性失活。

实施方式39.根据实施方式38所述的方法，所述方法还包括在将所述物质与所述酶接触之前处理所述物质以除去存在于所述物质中的过氧化氢酶活性和/或底物转化酶活性或使所述活性失活。

实施方式40.根据实施方式39所述的方法，其中通过加热所述物质以使过氧化氢酶和/ 或底物转化活性失活，然后在将所述物质与所述酶接触之前将所述物质冷却至允许保留所述酶的活性的温度来处理所述物质。

实施方式41.根据实施方式34至40中任一项所述的方法，其中所述物质是蜂蜜。

实施方式42.根据实施方式37所述的方法，其中所述未精制的天然糖物质是糖浆或转化糖浆。

实施方式43.根据实施方式42所述的方法，所述方法还包括转化包含蔗糖的物质以形成所述转化糖浆。

实施方式44.根据实施方式34至43中任一项所述的方法，其中所述酶是氧化还原酶。

实施方式45.根据实施方式44所述的方法，其中所述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇酸氧化酶或氨基酸氧化酶。

实施方式46.根据实施方式45所述的方法，其中所述氧化还原酶的底物是D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸盐、乙醇酸盐或氨基酸。

实施方式47.根据实施方式44所述的方法，其中所述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶，并且所述氧化还原酶的底物是D-葡萄糖。

实施方式48.根据实施方式34至47中任一项所述的方法，所述方法用于产生食品标准组合物，其中所述物质和所述酶具有食品标准。

实施方式49.根据实施方式34至48中任一项所述的方法，其中所述组合物的每种组分是天然物质。

实施方式50.一种产生用于生成抗微生物活性的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶与包括所述酶的底物的未精制的天然物质接触。

实施方式51.一种产生用于生成抗微生物活性的组合物的方法，所述方法包括：将能够转化底物以释放过氧化氢的酶与缺乏过氧化氢酶活性且包括所述酶的底物的未精制的天然物质接触。

实施方式52.根据实施方式50所述的方法，其中所述未精制的天然物质缺乏过氧化氢酶活性。

实施方式53.根据实施方式34至52中任一项所述的方法，其中所述酶和所述未精制的天然物质呈粉末形式。

实施方式54.一种产生抗微生物溶液的方法，所述方法包括用足够的水稀释根据实施方式1至24中任一项的储存稳定的抗微生物组合物，以允许所述酶转化所述糖物质中的底物并释放过氧化氢。

实施方式55.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物，或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或溶液用作药剂。

实施方式56.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或溶液用于预防、治疗或缓解微生物感染。

实施方式57.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于预防、治疗或缓解微生物感染的药剂中的用途。

实施方式58.一种预防、治疗或缓解微生物感染的方法，所述方法包括向需要此类预防、治疗或缓解的受试者施用根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式59.根据实施方式58所述的方法，所述方法包括局部施用所述组合物或溶液。

实施方式60.根据实施方式55至59中任一项所述的用于治疗人或动物受试者的用途或方法。

实施方式61.一种治疗伤口的方法，所述方法包括向伤口部位施用根据实施方式1至31 中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式62.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或抗微生物溶液用于治疗伤口。

实施方式63.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于治疗伤口的药剂中的用途。

实施方式64.一种治疗炎症的方法，所述方法包括向炎症部位施用根据实施方式1至31 中任一项的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液。

实施方式65.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或抗微生物溶液用于治疗炎症。

实施方式66.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于治疗炎症的药剂中的用途。

实施方式67.一种刺激组织生长的方法，所述方法包括向需要此类刺激的部位施用根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液。

实施方式68.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物，或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或抗微生物溶液用于刺激组织生长。

实施方式69.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于刺激组织生长的药剂中的用途。

实施方式70.一种清创伤口的方法，所述方法包括向需要清创的伤口施用根据实施方式 1至31中任一项的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液。

实施方式71.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或抗微生物溶液用于清创伤口。

实施方式72.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于清创伤口的药剂中的用途。

实施方式73.一种对伤口除臭的方法，所述方法包括向需要除臭的伤口施用根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式74.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液，所述组合物或抗微生物溶液用于对伤口除臭。

实施方式75.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液在制备用于对伤口除臭的药剂中的用途。

实施方式76.根据实施方式58所述的方法，其中所述受试者是昆虫。

实施方式77.根据实施方式76所述的方法，其中所述昆虫是蜂。

实施方式78.根据实施方式77所述的方法，所述方法用于预防、治疗或缓解微粒子虫属感染。

实施方式79.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

实施方式80.根据实施方式79所述的药物组合物，其中所述组合物是无菌的。

实施方式81.根据实施方式79或80所述的药物组合物，所述药物组合物是医疗级或医疗装置级药物组合物。

实施方式82.一种伤口敷料，所述伤口敷料包含用于敷裹伤口的敷料材料和根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式83.一种适于向受试者局部施用的抗微生物组合物，所述组合物包含根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式84.一种适于向受试者口服施用的抗微生物组合物，所述组合物包含根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式85.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方式1至31中任一项的组合物或根据实施方式32的溶液，以及用于施用所述组合物的说明书。

实施方式86.一种预防或抑制微生物生长的方法，所述方法包括向其中期望预防或抑制此类生长的表面或区域施加根据实施方式1至31中任一项的组合物，或根据实施方式32的抗微生物溶液。

实施方式87.根据实施方式86所述的方法，所述方法包括施加所述组合物或溶液以预防或抑制植物或昆虫病原体的生长。

实施方式88.根据实施方式86或87所述的方法，所述方法包括施加所述组合物或溶液以预防或抑制欧文氏菌属的生长。

实施方式89.根据实施方式86至88中任一项所述的方法，所述方法包括向植物、果实或蔬菜施加所述组合物或溶液。

实施方式90.根据实施方式89所述的方法，其中所述蔬菜是马铃薯。

实施方式91.根据实施方式1至31中任一项所述的组合物或根据实施方式32所述的抗微生物溶液用于预防或抑制微生物生长的用途。

实施例1

本实施例描述了用于产生本发明的储存稳定的组合物，以及稀释储存稳定的组合物以释放过氧化氢的优选方法。

“活化的”蜂蜜的制造方法

使用热交换器将蜂蜜加热2分钟至80℃(如果需要，可使用更低的温度，合适地至少 60℃，只要这足以灭活过氧化氢酶)。该加热过程的目的是对蜂蜜进行巴氏灭菌，降低其粘度，以使得其可被过滤以除去可能在收获后存在于蜂蜜中的任何蜡颗粒和蜂翼，并且使蜂蜜中的可影响过氧化氢的高效产生的任何过氧化氢酶失活。

然后将巴氏灭菌的蜂蜜过滤，并使其自然冷却至正常蜂箱温度(35-40℃)。然后以低水平 (相当于蜂蜜中通常发现的水平)添加葡萄糖氧化酶以替代在蜂蜜中天然发现的但已通过巴氏灭菌方法失活的葡萄糖氧化酶。过滤的巴氏灭菌的蜂蜜在35-40℃下具有相当大的流动性，因此可容易地将其与葡萄糖氧化酶混合。然而，不明白为什么不能在室温下进行混合。然后将所得的“活化的”蜂蜜在环境温度下储存。

除了失活的葡萄糖氧化酶的替代之外，没有对天然蜂蜜的组成进行修饰。在“活化的”蜂蜜中没有可检测的过氧化氢。

“活化的”蜂蜜的稀释

在“活化的”蜂蜜稀释后，过氧化氢在一段时间后释放，因为游离水变得可用并且葡萄糖氧化酶开始转化存在于蜂蜜中的葡萄糖。过氧化氢水平低于2mmol/升，但释放较长时间。

实施例2

该实施例描述了证明活化的Ulmo蜂蜜的抗微生物作用的测试结果。如果蜂蜜含有添加的葡萄糖氧化酶，则被描述为“活化的”。

孔扩散测定

将金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)在营养琼脂或营养肉汤中生长。

通过在琼脂平板的表面上擦拭过夜培养物，用培养物接种抗生素扩散琼脂平板。将板在室温下静置15分钟。在琼脂的表面上钻7mm直径的孔。将200微升样品(酚标准物或蜂蜜) 置于每个孔中。

将板孵育16小时，使用指盘式卡尺(+/-0.1mm)测量抑制区。记录区的直径，包括孔的直径。

通过以所需浓度在纯化水中稀释酚来制备酚标准物。例如，通过将1g酚稀释在9g纯化水中制备10％的酚标准物。将标准物在30℃下储存并在使用前摇动。

蜂蜜

蜂蜜：巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜。

使用未活化的蜂蜜(即未添加葡萄糖氧化酶的蜂蜜)作为对照。

酶的制备

葡萄糖氧化酶：由Biozyme UK提供的来自GMO黑曲霉菌的医疗装置级材料(非食品级)，活性240iu/mg。最初使用0.5％w/w的酶，但可将其降低至0.005％w/w的酶以达到20％的酚标准当量。

过氧化氢的检测

来自Merckoquant的过氧化物测试：目录号1.10011.0002，测量范围/颜色-标度刻度mg/l H2O2 0.5-2-5-10-25。

在水溶液中的方法测定：将蜂蜜以50/50w/w溶于水中。将测试条的反应区浸入测量样品(15-30℃)持续1秒。允许过量的液体通过条的长边径流至吸收性纸巾上，并在15秒(目录号110011)或5秒(目录号110081)后确定反应区的颜色与标签上的哪个颜色区域最完全一致。读取以mg/l H₂O₂表示的相应结果，或者如果需要，估计中间值。

为了确定蜂蜜中没有内源性过氧化氢可用，将蜂蜜以50/50w/w溶于甲醇。在有机溶剂(易挥发醚)中的测定：将测试条的反应区浸没在测量样品(15-30℃)中持续1秒。在溶剂蒸发(轻轻地来回扇动条带3-30秒)之后，将反应区域浸入蒸馏水中持续1秒，并允许过量的液体通过条带的长边缘径流至吸收性纸巾上或在反应区上轻轻地吹四次，每次3-5秒。在15秒(目录号110011)或5秒(目录号110081)后确定反应区的颜色与标签上的哪个颜色区域最完全一致。读取以mg/l H₂O₂表示的相应结果，或者如果需要，估计中间值。

结果

图1a显示来自孔扩散测定的结果，在所述测定中将含有巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜、已添加了不同量的葡萄糖氧化酶制剂(0.1％w/w、0.01％w/w、0.01％w/w、0.0015％w/w或0.0001％ w/w)的巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜或麦卢卡UMF 25+蜂蜜的样品添加至接种有金黄色葡萄球菌的琼脂平板的孔中。结果显示对于每个样品记录的抑制区的直径。

含有至少0.001％w/w葡萄糖氧化酶(240iu/mg)的活化的蜂蜜对金黄色葡萄球菌的抗微生物作用等同于麦卢卡25+蜂蜜的抗微生物作用。

活化的蜂蜜的作用是杀菌的。

图1b显示了来自孔扩散测定的结果，在所述孔扩散测定中将含有添加了0.5％w/w的葡萄糖氧化酶制剂的巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜的样品与MGO麦卢卡蜂蜜、麦卢卡25+蜂蜜的样品以及一系列不同的酚标准物(10％-40％)相比较。结果显示每个样品的抑制区的面积。

结果表明，活化的Ulmo蜂蜜的作用相当于30％的酚标准物，并且作用为MGO麦卢卡蜂蜜的两倍以上，以及几乎为麦卢卡UMF 25+蜂蜜的两倍。

图2表明活化的蜂蜜的效力可通过添加适量的酶来适应要求。

实施例3

该实施例描述了证实活化的Tineo蜂蜜的抗微生物作用的测试结果。如果蜂蜜含有添加的葡萄糖氧化酶，则被描述为“活化的”。

使用TINEO蜂蜜和不同酚标准物的样品进行如实施例2中所述的孔扩散测定。图3a是显示由不同样品引起的金黄色葡萄球菌抑制区域的一式两份琼脂平板的照片。该图包括显示琼脂板的孔中的样品的布局的图示：

1.10％的酚标准物

2.20％的酚标准物

3.30％的酚标准物

4.TINEO蜂蜜(未添加葡萄糖氧化酶的巴氏灭菌TINEO蜂蜜)

5.TINEO Deact(巴氏灭菌的TINEO蜂蜜，进一步热灭活)

6.麦卢卡UMF 25+

7.TINEO 20+(添加有葡萄糖氧化酶的巴氏灭菌的TINEO蜂蜜，0.005％Biozyme酶)

图3a显示TINEO蜂蜜单独或TINEO失活的蜂蜜都不会引起金黄色葡萄球菌生长的抑制。添加葡萄糖氧化酶的TINEO蜂蜜(TINEO 20+)的作用大于麦卢卡UMF 25+的作用，并相当于30％的酚标准物。

图3b是显示由不同样品引起的金黄色葡萄球菌的抑制区的琼脂平板的照片，其排列如图 40所示：

1.10％的酚标准物

2.20％的酚标准物

3.30％的酚标准物

4.TINEO活性蜂蜜25+(0.005％酶w/w)

5.TINEO活性蜂蜜25+(0.005％酶w/w)

6.TINEO活性蜂蜜40+(0.05％酶w/w)

7.麦卢卡蜂蜜UMF 25+

图3b显示TINEO活性蜂蜜25+和40+样品在抑制金黄色葡萄球菌的生长上比麦卢卡蜂蜜25+样品更有效。

实施例4

本实施例描述了证实活化的Ulmo和Tineo蜂蜜的抗微生物作用的测试结果。

图4a显示来自如实施例2所述进行的测量24小时孵育后金黄色葡萄球菌生长的抑制区的孔扩散测定的三个重复的结果。去离子水中酚的浓度范围为40-10％的样品和2种类型的麦卢卡(麦卢卡UMF 25+，麦卢卡550MGO)的样品和具有0.01％w/w Biozyme葡萄糖氧化酶的活化的Ulmo蜂蜜(如实施例2)的样品。

图4b显示了来自另一孔扩散测定的结果。将葡萄糖氧化酶(如实施例2中所述的Biozyme 制剂)添加至巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜(0.005％酶w/w)中，并在40℃下储存24或72小时。然后如实施例2所述，在孔扩散测定中测试来自储存的活化的蜂蜜的样品的抗金黄色葡萄球菌的活性，并与4％至25％的一系列酚标准物进行比较。图4b显示活化的蜂蜜在40℃下储存72 小时时是稳定的，并且活化的蜂蜜在其抗金黄色葡萄球菌的有效性方面相当于20％的酚标准物。

图4c显示了来自另一孔扩散测定的结果，在所述测定中新批和旧批(旧批在新批之前约四个月被接收)的巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜(如实施例2中所述的Biozyme制剂，0.5％w/w)和具有递增量的葡萄糖氧化酶的Tineo蜂蜜(如实施例2中所述的Biozyme制剂，0.0005-0.5％w/w) 与麦卢卡18+和25+UMF蜂蜜以及10-40％的一系列酚标准物进行比较。在图4c中，“正常”是指如所接受的巴氏灭菌的蜂蜜，“Deact”是指已被进一步热失活的巴氏灭菌的蜂蜜，“React”是指在添加葡萄糖氧化酶之前已被进一步热失活的巴氏灭菌的蜂蜜。因此，在无(“Ulmo旧4 正常”、“Ulmo新X”和“Ulmo新Y”)和具有添加的葡萄糖氧化酶的情况下测试Ulmo蜂蜜。图 4c显示金黄色葡萄球菌的抑制区的面积。可以看出，旧批的巴氏灭菌的Ulmo蜂蜜(“Ulmo旧 4 React”)保持与新的巴氏灭菌的批次(“Ulmo新X React”和“Ulmo新YReact”)相等的活性。所有这些批次显示约为麦卢卡蜂蜜18+两倍的活性，以及比麦卢卡蜂蜜25+更高的活性。向巴氏灭菌的Tineo蜂蜜中添加递增量的葡萄糖氧化酶增加了蜂蜜的活性。

在该测试中，0.005％w/w的酶大约相当于10％的酚标准物，0.05％w/w的酶大约相当于 15％的酚标准物，0.5％w/w的酶大约相当于25％酚标准。麦卢卡18+蜂蜜相当于10％酚标准，麦卢卡25+蜂蜜显示介于10％与15％酚标准之间的活性。

实施例5

在本实施例中，用巴氏灭菌的Tineo蜂蜜测试不同葡萄糖氧化酶制剂的作用。所用的酶制剂是如实施例2中所述的Biozyme制剂和来自ANHUI MINMETALS DEVELOPMENT I/ECO.，LTD的食品级非GMO来源的葡萄糖氧化酶(下文中称为“Anhui”酶制剂)。

图5a显示如实施例2中所述进行的孔扩散测定的结果，在所述测定中将不含酶或含 0.005-0.05％w/w的Anhui酶的巴氏灭菌的Tineo蜂蜜的样品与不同的酚标准物(10％、20％、30％)和麦卢卡蜂蜜UMF 25+的样品相比较。结果表明，增加酶的量增加了活化的蜂蜜抗金黄色葡萄球菌的有效性。0.0125％w/w的酶大约相当于20％的酚标准物和麦卢卡蜂蜜样品， 0.05％w/w的酶大约相当于30％的酚标准物。

图5b显示如实施例2中所述进行的孔扩散测定的结果，在所述测定中将不同量的酶添加至商业批次的巴氏灭菌的Tineo蜂蜜的样品中。“Tineo”样品是没有添加葡萄糖氧化酶的巴氏灭菌的蜂蜜。“Tineo Deact”样品是已被进一步热处理的巴氏灭菌并且不含添加的葡萄糖氧化酶的蜂蜜。“Tineo 20+”样品含有0.005％w/w的Biozyme葡萄糖氧化酶。结果表明，Tineo样品没有抗金黄色葡萄球菌的活性。Tineo 20+样品比麦卢卡25+更有效地抗金黄色葡萄球菌，并且介于20％的酚标准物与30％的酚标准物之间。

实施例6

本实施例描述了储存60天或90天的活化的蜂蜜的稳定性的测试结果。

将如实施例2所述的来自Biozyme的葡萄糖氧化酶以0.005％w/w添加至巴氏灭菌的 Ulmo或Tineo蜂蜜中，将所得混合物在37℃下储存两个月(Ulmo蜂蜜样品)或在室温下储存 90天(Tineo蜂蜜样品)。所使用的酶的量对应于将用于商业食品的量。

储存后，在如实施例2所述进行的针对金黄色葡萄球菌的孔扩散测定中测试样品。将储存的样品与10％、20％和30％的酚标准物进行比较。图6a显示Ulmo蜂蜜样品的结果，图6b 显示了Tineo蜂蜜样品的结果。对于任一类型的蜂蜜，在储存期间没有明显的活性损失。

实施例7

本实施例描述了粉状活化的蜂蜜的抗微生物活性的测试结果，在所述测试中将呈粉末形式的葡萄糖氧化酶添加至粉状蜂蜜中。

粉状蜂蜜获自ADM Specialty Ingredients的Honi Bake。将0.1％w/w的Biozyme葡萄糖氧化酶(如实施例2中所述的)添加至粉状蜂蜜中。如实施例2所述，在针对金黄色葡萄球菌的孔扩散测定中测试混合物的抗微生物活性。将混合物添加至琼脂平板的两个不同孔中。对照仅与蜂蜜粉末一起使用。结果示于图7a中。对照孔显示无活性，但活化的蜂蜜显示出清楚的抑制区。

图7b显示另一个孔扩散测定的结果，在所述测定中将不同的粉状蜂蜜与来自ANHUI MINMETALS DEVELOPMENT I/E CO.，LTD的粉状酶混合(实施例5)。样品孔24a仅为蜂蜜粉末，而样品孔24b为与1％w/w的酶混合的蜂蜜粉末。再次地，可以看到清楚的抑制区。

实施例8

本实施例显示各种不同产品本身以及当与活化的蜂蜜(即添加了葡萄糖氧化酶的蜂蜜)混合时的抗微生物活性的测试结果。在如实施例2所述进行的孔扩散测定中测试抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。测试的不同样品列于下表2中，结果的照片示于图8中。

表2

结果清楚地显示当与活化的蜂蜜混合时产品的增强的抗微生物效力。

实施例9

本实施例显示各种不同产品本身以及当与活化的蜂蜜(即，添加了葡萄糖氧化酶的蜂蜜) 混合时的抗微生物活性的进一步测试的结果。在如实施例2所述进行的孔扩散测定中测试抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。测试的不同样品列于下面，图9a中所用样品的排列方式如图41所示，图9b中所用样品的排列方式如图42所示，结果的照片示于图9中。

图9a：

1.品牌抗菌霜#1

2.品牌抗菌霜#1+10％Ulmo 40+

3.品牌抗菌霜#2

4.品牌抗菌霜#2+10％Ulmo 40+

5.TINEO活性蜂蜜20+

6.麦卢卡蜂蜜25+

7.Ulmo活性蜂蜜20+。

图9b：

1.止咳糖浆

2.止咳糖浆+10％Ulmo 40+

3.品牌手霜

4.品牌手霜+10％Ulmo 40+

5.TINEO活性蜂蜜20+

6.麦卢卡蜂蜜25+

7.Ulmo活性蜂蜜20+

实施例10

本实施例描述了包含未巴氏灭菌的蜂蜜和添加的纯化的葡萄糖氧化酶的本发明的组合物的灭菌。

以11.6-14.2kGy的目标剂量(剂量为13.1-13.6kGy，如通过剂量计测定的)对10个各自含有50g组合物的密封小袋进行γ辐照，随后单独测试无菌度。

对于无菌度测试，所有的工作在层流下于洁净室中进行。将10g的所述组合物添加至 100ml无菌胰蛋白胨大豆肉汤(TSB：酪蛋白的胰酶消化物，17g/L，大豆豆粕的木瓜酶消化物， 3g/L，氯化钠，5g/L，磷酸氢二钾，2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH 7.3±0.2)并摇动混合，然后转移至无菌容器中。再添加100ml的TSB以除去任何样品残余物，并将其添加至同一容器中。将TSB添加至样品中并在30℃±2℃下孵育最少14天，并检查微生物生长的迹象。在测试开始前对所有培养基进行阳性对照。

在完全孵育期后注意到一个阳性结果。35kGy作为灭菌剂量的证实被接受。

使用类似于实施例2中所述的测定的孔扩散测定对通过γ辐照灭菌之前和之后的小袋的测试证实：辐照对组合物的抗微生物活性的影响可忽略。灭菌后活性水平没有可观察到的降低。

实施例11

本实施例描述了与麦卢卡UMF 25+蜂蜜和热灭活的蜂蜜(非活性蜂蜜)相比，已经使用γ辐照灭菌的本发明的组合物的抗微生物作用的测试结果，所述组合物包含未巴氏灭菌的蜂蜜和添加的纯化的葡萄糖氧化酶(称为“Surgihoney”)。

使用麦卢卡蜂蜜UMF 25+、非活性蜂蜜和Surgihoney的样品进行如实施例2中所述的孔扩散测定。图10(a)是显示由不同样品引起的金黄色葡萄球菌(ATCC 9518)的抑制区的琼脂平板的照片。麦卢卡蜂蜜UMF 25+在图中的顶行，非活性蜂蜜在中间行，而Surgihoney在底行。图10(b)显示用麦卢卡UMF 25+蜂蜜(顶行)处理的平板和用Surgihoney(底行)处理的平板。

结果清楚地表明，Surgihoney在灭菌后保留抗金黄色葡萄球菌的显著的抗微生物活性，并且Surgihoney在抗金黄色葡萄球菌方面比麦卢卡蜂蜜UMF 25+更有效。

实施例12

已经使用γ辐照(以最小剂量35kGy)灭菌的包含未巴氏灭菌的蜂蜜和添加的纯化的葡萄糖氧化酶的本发明组合物的稳定性测试。

加速老化技术基于以下假设：涉及材料劣化的化学反应遵循Arrhenius反应速率函数。该函数阐明均匀过程的温度的10℃增加或降低导致化学反应速率的约两倍或1/2时间的变化。例如，在55℃下，5.3周相当于货架上的1年，在55℃下，两年相当于10.6周，五年将相当于 26.5周。

将来自两个不同生产批次的产品用于本研究。产品是包含10g组合物的小袋。已以最小剂量35kGy进行γ辐照对小袋灭菌。将样品在加速老化条件下于55℃(±2℃)储存。

实时与加速老化之间的关系如下：

表3

测试、测试间隔和所需样品

以相同的时间间隔测试来自每批的样品。下表总结了所进行的测试，以及每个批次每个时间点所需的样品总数。

*对于充满的小袋重量测试使用相同的样品

**使用五个样品进行压力试验

表4

测试方法

充满的小袋重量：空小袋的平均皮重为1.7g。将10个小袋在校准的实验室天平上单独称重，扣除皮重，记录结果。

压力测试：根据标准操作程序在压力测试试验台上测试每个小袋。记录通过次数和失败次数。

蜂蜜的pH：将五个小袋的内容物合并至玻璃烧杯中。使用三种标准溶液校准HannapH 计，然后在去离子水中漂洗电极。将pH电极和温度探针浸入蜂蜜样品中，从数字显示器读取pH值和温度，并记录。

水分含量：从每个时间点取5袋蜂蜜。从每个小袋取出约1ml的样品并放置在折射计的样品板上(一次一个样品)。盖上样品盖，用户通过透镜观察，同时将仪器指向诸如窗户的光源。读取刻度的值，如阴影线所示的，并记录结果。

颜色：打开一袋蜂蜜，将一些蜂蜜组合物放在白色瓷砖上。将蜂蜜组合物的颜色与Honey Color Chart Pfund标度相比较，记录分数(30-800)。

结果

充满的小袋重量-加速老化

批次A：

表5

批次B：

表6

压力测试结果-加速老化

测试间隔(周)	批次A	批次B
			2.6	10/10	10/10

表7

pH测试结果-加速老化

表8

水分含量测试结果-加速老化

批次A：

表9

批次B：

表10

颜色测试结果-加速老化

表11

下面的实施例13-35描述了使用本发明的组合物治疗伤口的结果，所述组合物包含添加了葡萄糖氧化酶的未巴氏灭菌的蜂蜜(在实施例中组合物被称为“Surgihoney”)。该Surgihoney 以密封的小袋提供，每个小袋含有10g的组合物。小袋已经使用γ辐照灭菌。从治疗的第0 天使用小袋。每次敷料更换涉及Surgihoney的新应用。在实施例中记录的每一天，或者有时更频繁地更换敷料。将Surgihoney施加于敷料，或直接施加至伤口，然后用敷料覆盖。在这两种情况下，将Surgihoney与伤口直接接触，并用敷料覆盖。

实施例13

本实施例描述了使用Surgihoney治疗感染的脚趾的结果。结果示于图11中。

患者为78岁的糖尿病男性。左脚上的伤口已在治疗开始前一个月发展，并引起轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：3×2×1cm；99％健康肉芽形成但1％绿色菌落；周围皮肤脱落；少量黄脓液渗出物产生臭味；

b)第5天-伤口特征：伤口改善；每次施加1小袋蜂蜜进行第二次敷料更换；甲硝唑和阿莫西林；还使用茶树油；

c)第10天-伤口特征：伤口改善；绿色菌落消失；伤口被清洁，干燥皮肤被除去，以及再施加一小袋蜂蜜。

实施例14

本实施例描述了使用Surgihoney治疗脚趾溃疡的结果。结果示于图12中。

患者为在右脚上具有在治疗前的一个月长的时期内发展的感染性足趾溃疡并引起轻度疼痛的61岁糖尿病女性。

a)第0天-伤口特征：伤口：2×2×0.2cm；1％黄褐色脱落物，其余为肉芽形成的组织；少量黄色渗出物；

b)第7天-伤口特征：伤口改善；对于敷料更换每日施加0.5袋Surgihoney；Flucox；

c)第10天-伤口特征：伤口进一步改善；停用Flucox。

实施例15

本实施例描述使用Surgihoney治疗脚趾溃疡的结果。结果示于图13中。

患者为在左脚第一和第二脚趾上具有脚趾溃疡的61岁糖尿病女性。轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：0.8×0.8×0.2cm；100％肉芽形成的组织；少量浆液性渗出物；

b)第7天-伤口特征：伤口愈合至不再张开的程度；每天半袋蜂蜜；Flucox；

c)第10天-伤口特征：伤口改善；现在干燥，无脱落物或渗出；停用Flucox。

实施例16

本实施例描述使用Surgihoney治疗足部溃疡的结果。结果示于图14中。

患者为具有已在治疗前一个月发展的足部溃疡的50岁女性糖尿病患者。报告了脆性皮肤但没有疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：1×0.5×0.5cm；1％黄褐色脱落物，其余为肉芽形成的组织；极低量的黄色渗出物；

b)第7天-伤口特征：伤口改善；干燥；脱落物由健康肉芽形成的组织代替；尺寸和深度减小；伤口用盐水清洗，然后施加蜂蜜敷料(0.5小袋)；无抗生素；

c)第9天-伤口特征：伤口大大改善；几乎封闭，无渗出物；继续施加敷料，每次0.5小袋。

实施例17

本实施例描述了使用Surgihoney治疗足部溃疡的结果。结果示于图15中。

该患者为具有已发展一年以上的糖尿病性足部溃疡的87岁糖尿病男性。周围皮肤脆弱，但疼痛不明显。

a)第0天-伤口特征：伤口：1×1.8cm；1％黄褐色脱落物，其余为肉芽形成的组织；少量黄色浆液性渗出物；

b)第3天-伤口特征：伤口改善；敷料更换施加1个蜂蜜小袋；没有疼痛的报告；无抗生素；

c)第6天-伤口特征：伤口改善；伤口床现在为100％肉芽形成的组织；进一步施加蜂蜜小袋；在周围溃疡的干性皮肤上使用Diprosalic。

实施例18

本实施例描述使用Surgihoney治疗糖尿病性足部溃疡的结果。结果示于图16中。

患者是患有由质量差的鞋的刺激引起的糖尿病性足部溃疡的男性。患者在治疗前不到1 个月患有溃疡。

a)第0天-伤口特征：具有轻微疼痛的周围红色的皮肤；1％脱落物，99％肉芽形成的组织；感染和糖尿病；小体积的黄色浆液性渗出物；伤口尺寸：2cm×2cm×0.2cm；

b)第7天-伤口特征：在医院进行评估，但从第1天至现在每天更换敷料。由为训练有素的护士的儿媳妇按照方案更换敷料。伤口改善；100％健康肉芽形成；健康的周围皮肤，轻微的疼痛；所用抗生素，氟卡西林500mg，每6小时一次，持续7天；伤口尺寸：1.5cm×1.3cm×0.1。

实施例19

本实施例描述了使用Surgihoney治疗足部溃疡的结果。结果示于图17中。

患者为患有严重且控制不良的糖尿病的55岁男性。患者在截肢后的第三个脚趾部位有一个深部溃疡。

a)第0天-伤口特征：伤口：3×3×3cm；1％黄褐色脱落物；1％绿色菌落；其余为肉芽组织；中等体积的黄脓渗出物；

b)第1天-伤口特征：伤口改善；在施加蜂蜜(1小袋)之前，除去所有脱落物；甲硝唑；

c)第3天-伤口特征：伤口改善；进一步施加小袋；患者出院；拭子：+++皮肤菌群；无抗生素。

实施例20

本实施例描述了使用Surgihoney治疗创伤性腿部伤口的结果。结果示于图18中。

患者是在下腿部具有引起中度疼痛的创伤性创伤的95岁女性。

a)第0天-伤口特征：伤口：15×12×1cm；主要是肉芽组织但具有1％的伤口床坏死和黑色；中量的血红蛋白渗出物(haemoserous exudate)；

b)第3天-伤口特征：伤口是静态的；无进一步坏死，但伤口几乎相同；施加1小袋蜂蜜；拭子：肠球菌属；无抗生素；

c)第8天-伤口特征：伤口改善；渗出物体积减少和坏死组织减少。

实施例21

本实施例描述了使用Surgihoney治疗感染的腿部伤口的结果。结果示于图19中。

患者为具有小腿感染伤口的91岁女性。周围皮肤脆弱，存在轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口尺寸：4.5×2.5cm；大部分红色肉芽组织，具有1％黄/褐色脱落物；中等体积黄色浆液性渗出物。

b)第15天-伤口特征：伤口改善；尺寸：4×2cm；存在较少的脱落物和浆液性渗出物；

c)第19天-伤口特征：伤口改善；每个敷料施加Surgihoney。

实施例22

本实施例描述了使用Surgihoney治疗足部溃疡的结果。结果示于图20中。

患者为在第一、第二、第三和第四脚趾截肢后维持慢性糖尿病性足部溃疡的53岁女性糖尿病患者。

a)第0天-伤口特征：伤口：6.5×3×0.2cm；肉芽组织，具有少量黄色浆液性渗出物；

b)第5天-伤口特征：伤口尺寸略微改善，但床状况几乎保护不变；去除松散的肉芽组织；可吸收的敷料施加小袋的蜂蜜；无抗生素；

c)第7天-伤口特征：伤口被健康肉芽组织清洁；每2天更换一次敷料，每次施加蜂蜜的小袋；

d)第9天-伤口特征：伤口改善；尺寸减小，渗出物减少；患者出院。

实施例23

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图21中。

患者为患有已在治疗开始之前一年内发展的并引起轻度疼痛的腿部溃疡的女性。

a)第0天-伤口特征：健康的周围皮肤；1％脱落物，99％肉芽形成；中等体积的黄色浆液性渗出物；伤口尺寸：7cm×3cm；

b)第7天-伤口特征：伤口改善和处于社区护理中的患者；施加1小袋Surgihoney；存在减小的尺寸和较少的渗出物；疼痛更可忍受。

实施例24

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图22中。

患者为具有不良营养状况和脱水的77岁男性。近平卧式贫血(Anaemia.caprostrate)。患者有已在治疗前6-12个月内发展的腿部溃疡。轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：20×10×0.5cm；1％黄褐色脱落物，其余为肉芽组织但有中度渗出物，脓绿色；拭子：+++混合的大肠菌群及假单胞菌属；抗生素：Ben Pen，Clinda；

b)第4天-伤口特征：伤口是静态的；单独的蜂蜜敷料；Ben Pen&Clinda；

c)第8天-伤口特征：伤口改善；所有绿色脱落物消失；无抗生素；扑热息痛。

实施例25

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图23中。

患者为患有已在6至12个月的时期内发展的腿部溃疡的91岁女性，她住院了并且具有很多痛苦。

a)第0天-伤口特征：疼痛严重，有伤口臭味；感染；10％脱落物，50％定殖绿色，20％蜂窝织炎，20％健康肉芽形成；伤口：15cm×5cm×0.3cm；渗出物：小体积，浆液性和黄色的；

b)第11天-伤口特征：轻度疼痛和伤口大大改善；100％健康肉芽形成；无感染；伤口： 10cm×5cm×0.2cm；渗出物：低，血红蛋白性的，红色cm；50％伤口尺寸减小。

实施例26

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图24中。

患者为78岁男性，UTI患者。患者有感染性腿部溃疡。周围皮肤被浸软。伤口引起轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口尺寸：5cm×6cm×0.5cm；98％红色肉芽，1％黄/褐色脱落物， 1％坏死组织；小体积的血红蛋白渗出物；

b)第8天-伤口特征：伤口改善；每次敷料更换施加1小袋蜂蜜；拭子显示少量皮肤菌群；无抗生素。

实施例27

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图25中。

患者为具有不良营养状况和脱水的82岁女性。患者具有已在治疗前3个月内发展的腿部溃疡。

a)第0天-伤口特征：伤口：3×3×0.5cm；伤口床由健康肉芽组织组成；少量黄色血红蛋白渗出物；

b)第3天-伤口特征：伤口改善；拭子显示+++皮肤菌群；敷料施加1小袋蜂蜜；无抗生素；

c)第8天-伤口特征：伤口改善；伤口尺寸减小和渗出物体积减少。

实施例28

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图26中。

患者为具有低血清白蛋白的83岁的不能行动的男性。患者具有在治疗前3个月的时期内发展的，导致中度水平的疼痛的腿部溃疡。

a)第0天-伤口特征：伤口：20×18×0.5cm；1％黄/褐色脱落物，1％绿色菌落，其余为肉芽形成的组织；中等体积的绿色浆液性渗出物；轻微的伤口臭味；

b)第4天-伤口特征：伤口改善；已施加2小袋Surgihoney；++拭子上的假单胞菌属；没有给予抗生素；

c)第8天-伤口特征：2次单独的蜂蜜敷料更换后伤口改善；+++假单胞菌属；大大改善，停用蜂蜜。

实施例29

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图27中。

患者为具有2型呼吸衰竭和行动性差的74岁男性吸烟者。患者具有已在治疗前一周内发展的，引起中度疼痛的脓毒性皮肤撕裂。

a)第0天-伤口特征：伤口：15×20×0.3cm；99％健康肉芽形成，但1％严重感染；中等体积的黄色着色的渗出物；拭子显露出稀少的大肠菌群；抗生素：克林霉素；

b)第6天-伤口特征：2次敷料更换后伤口改善；单独的蜂蜜敷料；溃疡现是干燥的；无来自拭子的生长；克林霉素；

c)第9天-伤口特征：伤口改善；仍然残留的蜂窝织炎，但溃疡愈合；在拭子上再一次无生长；Clinda。

实施例30

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图28中。

患者为在腿和手臂上有严重的广泛溃疡的81岁男性。患者具有外周血管疾病和不良营养状况。伤口已在治疗前一个月发展。周围皮肤脱落并引起严重疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：30×28×1cm；1％黄/褐色脱落物，其余为肉芽形成的组织；大量红色的血红蛋白渗出物；拭子显示+++混合的大肠菌群及假单胞菌属；

b)第6天-伤口特征：伤口改善；极少的假单胞菌属；无抗生素，但无痛性疼痛；

c)第10天-伤口特征：伤口改善；+假单胞菌属仍存在；疼痛不太严重。

实施例31

本实施例描述使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图29中。

患者为具有外周血管疾病的67岁男性。腿部溃疡发展于治疗前一周。周围皮肤脆弱，疼痛适度。

a)第0天-伤口特征：伤口：1×1×0.2cm；1％黄/褐色脱落物，其余为肉芽形成的组织；伤口中存在少量黄色浆液性渗出物；

b)第11天-伤口特征：在一系列敷料更换后，其中伤口是静态的，现在显示改善的迹象；体积较小的渗出物，伤口较小；每次更换施加1×蜂蜜小袋；拭子显示金黄色葡萄球菌++；

c)第18天-伤口特征：伤口是静态的；伤口尺寸：3×3×0.2cm；金黄色葡萄球菌++存在。

实施例32

本实施例描述了使用Surgihoney治疗腿部溃疡的结果。结果示于图30中。

患者为患有一个月的重度糖尿病性溃疡的43岁女性。溃疡并发有基础性骨髓炎，骨去除 (bone debriefed)和来自跟骨的金属加工。患者摔破了她的脚，随后的治疗导致骨感染。主治临床医生的意见是，很可能对患者的脚进行截肢。

a)第0天-伤口特征：具有40％脱落物，10％定殖的绿色，50％健康肉芽形成的伤口；周围皮肤健康；中度疼痛；黄色脓液性渗出物介质；伤口9cm×8cm×2com；无抗生素；

b)第1天-伤口特征：伤口是静态的；拭子：大肠菌群及假单胞菌属；无抗生素；无镇痛药；

c)第14天-伤口特征：伤口改善；使用1小袋Surgihoney；创伤缓慢肉芽形成，大大改善；拭子：少量皮肤菌群。

实施例33

本实施例描述使用Surgihoney治疗压力性溃疡的结果。结果示于图31中。

患者为具有不良营养状况的88岁女性糖尿病患者。患者具有已在治疗之前6个月内发展的，引起中度水平的疼痛的具有脆弱周围皮肤的压力性溃疡(3级)。

a)第0天-伤口特征：伤口尺寸：0.7×0.7×0.2cm；1％黄/褐色脱落物，1％；其余部分为肉芽的脂肪组织；小体积的黄色脓存在；

b)第3天-伤口特征：伤口愈合(闭合)；施加1小袋Surgihoney。

实施例34

本实施例描述使用Surgihoney治疗感染的腋窝切口的结果。结果示于图32中。

患者为在臂下有感染的伤口的21岁女性。周围皮肤红色，轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：1％蜂窝织炎，99％肉芽形成；小体积的具有黄色脓的渗出物；伤口尺寸：5cm×5cm；

b)第24天-伤口特征：伤口改善；在度假期间使用蜂蜜超过2周；无抗生素。

实施例35

本实施例描述了使用Surgihoney治疗导管的入口点周围的感染的结果。结果示于图33 中。

患者是41岁女性癌症患者。患者在导管进入点周围的乳房区域具有感染。在治疗前不到 1周出现伤口，其引起轻度疼痛。

a)第0天-伤口特征：伤口：2cm×2cm；1％蜂窝织炎，其余为肉芽形成的组织；小体积的红色浆液性渗出物；

b)第6天-伤口特征：伤口大大改善；无渗出物；施加1小袋surgihoney；获取拭子，但无生长；无抗生素；

c)第14天-伤口特征：伤口改善至不再是问题的程度。

实施例36

Surgihoney

Surgihoney是添加了纯化的葡萄糖氧化酶的未巴氏灭菌的蜂蜜。制备具有不同的抗微生物能力的3种不同的Surgihoney制剂：

S1 Surgihoney：具有0.1％(w/w)添加的葡萄糖氧化酶的未巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BIO-CAT，INC的活性为15,000个单位/g的来自黑曲霉菌的食品级葡萄糖氧化酶。以 11/6-14.2kGy的目标剂量对含有50g的S1 Surgihoney的密封小袋进行γ辐照。

S2 Surgihoney：具有0.1％(w/w)添加的葡萄糖氧化酶的未巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BBI Enzymes Limited的活性为274个单位/mg的来自黑曲霉菌的葡萄糖氧化酶(GO3B2)。单位定义：在25℃，pH 7.0下每分钟引起1微摩尔葡萄糖氧化的酶量。污染物：α-淀粉酶不超过0.05％，蔗糖酶不超过0.05％，麦芽糖酶不超过0.05％，以及GO/Cat不超过2000。

S3 Surgihoney：具有0.25％(w/w)添加的葡萄糖氧化酶的未巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BBI Enzymes Limited的活性为274个单位/mg的葡萄糖氧化酶(GO3B2)。

因此，S1 Surgihoney含有每克组合物15个单位的葡萄糖氧化酶，S2 Surgihoney含有每克组合物274个单位的葡萄糖氧化酶，S3 Surgihoney含有每克组合物685个单位的葡萄糖氧化酶。

实施例37

Surgihoney的体外抗微生物活性

本实施例描述了通过盘扩散法、最小抑制浓度(MIC)以及最小杀灭浓度(MBC)测定和时间杀菌测量进行的一系列伤口和溃疡细菌分离株对Surgihoney的敏感性测试。

概述

结果：Surgihoney显示高效的抗广泛的革兰阳性和革兰阴性细菌和真菌的抑制性和杀菌活性。MIC/MBC显著低于局部临床使用中可能达到的浓度。伤口中的Surgihoney的局部浓度估计为约500gms/L。用于金黄色葡萄球菌的Surgihoney 1的MIC/MBC为31和125gms/L， Surgihoney 3的MIC/MBC为0.12和0.24gms/L。杀灭速度取决于效力。在Surgihoney 1中，对于在48小时内测试的所有生物体发生最有效的完全杀灭活性。对于Surgihoney 3，最有效的杀灭活性在30分钟内发生。维持Surgihoney接种物制剂长达一周表现出完全的杀灭活性并且没有细菌持久性。

结论：Surgihoney具有作为具有高度活性的局部治疗的广泛潜力，所述局部治疗将蜂蜜的愈合性质的作用与用于皮肤损伤、伤口，溃疡和腔的生物工程化产品的强效抗微生物活性组合。其具有抗多药耐药菌的高度活性。其比其它测试的蜂蜜更具活性，并且在抗菌活性方面可与化学抗菌剂相当。

表面伤口和皮肤溃疡在许多国家随着人口年龄的不断增加以及肥胖和2型糖尿病的全球流行而变得越来越普遍。在英国，社区护士花费大量时间敷裹腿部溃疡，并且如果要在社区腿部溃疡服务中保持标准，由腿部溃疡护士进行的监护是必需的。皮肤中的大多数慢性中断逐渐被细菌定殖。很难知道这些细菌何时是致病性的以及是否是致病性的，但很可能即使不存在明显的感染，细菌定殖在减缓组织愈合，建立生物膜和导致伤口蜕裂和令人讨厌的臭味中起作用。

组织存活力是具有挑战性的，特别是当并发并存病时。慢性伤口总是逐渐被细菌定殖，这可能破坏愈合过程的稳定性。当样品被报告为正在生长的细菌时，存在发送微生物样品并提供全身性抗生素的诱惑。所有这些服务将选择更耐药的微生物，这是为什么慢性下肢溃疡常常被多药耐药性生物诸如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌定殖的原因。

Surgihoney已被开发作为用于伤口的预防敷料。本研究检查了Surgihoney的体外性质。 Surgihoney保留天然蜂蜜的所有建立的愈合性质，但其抗微生物活性可被设定在任何需要的效力。本研究确定了Surgihoney 1、2和3的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)以及时间杀灭曲线。

方法

提供了效力等级1、2和3的Surgihoney。将其作为无菌药物级产品呈现在呈半固体形式的小袋中。

从软组织微生物学样品收集临床分离物。针对Surgihoney测试金黄色葡萄球菌的18个分离株(12个甲氧西林敏感(MSSA)和6个抗甲氧西林(MRSA))、β溶血性链球菌的6个分离株 (Lancefield组A(2)、B(2)、C(1)、G(1))、肠球菌属的某些种的5个分离株(包括抗万古霉素屎肠球菌)、大肠杆菌的6个分离株(包括扩展谱β内酰胺酶生产菌)、克雷伯菌属的2个分离株，粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescens) Amp C生产菌的1个分离株、铜绿假单胞菌的4个分离株、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)的1个分离株、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的1个分离株、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的1个分离株以及白色念珠菌的2个分离株、光滑念珠菌的1个分离株、Aspergillusfumigates的1个分离株。

琼脂扩散法

在已用测试生物体以一定浓度接种以获得半融合生长的isosenitest琼脂中切割6mm的孔。将试验性研究中的测试Surgihoney和其它蜂蜜添加至孔中。

最初进行了试验性研究，以将Surgihoney效力S1、S2、S3与来自世界各地：欧洲、南美洲、新西兰，Yemani、苏丹的各种蜂蜜以及与医用蜂蜜、Medihoney和含有银(SilverAquacell) 和碘(Iodoflex)的抗微生物敷料相比较。在接种有金黄色葡萄球菌并用测试蜂蜜填充的板中切割孔，或在敷料的情况下，将这些敷料切成2×2cm并放置在接种板的表面上。

在试验性研究之后，针对一系列来自皮肤损伤的细菌分离株单独测试了Surgihoney效力 S1、S2、S3。将孔用约2gms纯的所述3种效力的Surgihoney制剂填充至表面，稀释并在等体积的无菌水中乳化。在18-24小时需氧培养(对于念珠菌属和曲霉菌属的某些种更长，对于丙酸杆菌属的一个种和类杆菌属的一个种进行厌氧培养)之后测量区域大小。

最小抑制浓度和最小杀菌浓度

将Surgihoney产品温热至37℃以液化其，并将5gms与10mL无菌去离子水混合。该稀释液被认为是用于连续稀释的“纯净”物质。使用用于进行最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度 (MBC)的英国抗微生物化学治疗学会(BSAC)方法(Andrews JM.Determination ofminimum inhibitory concentrations.J Antimicrob 372 Chemother 2001；48(增刊1)：5-16)。将Surgihoney产品在微量滴定板孔中从纯净至1/1024连续稀释。将75μL的每种蜂蜜稀释液添加至微量滴定板的条中的每个孔中。净浓度表示250gm/L的浓度，1/2048的稀释度表示约0.12gm/L。

通过对来自纯培养物的每种生物体取四个形态相同的菌落以产生0.5McFarland密度来制备测试生物体。将其以1∶10进一步稀释。

用75μL的测试分离株制剂接种包括对照的所有孔。将孔板在37℃下孵育18小时。MIC 被认为是显示无可检测的浊度的最稀的孔。

将MIC孔和MIC孔周围的孔在血琼脂上继代培养，并在37℃下孵育18小时以测定MBC。 MBC是在培养后没有生长的最稀的浓度。

时间杀灭曲线

通过取0.1mL的0.5MacFarlane密度的测试生物体并将其接种在3mL营养肉汤中来制备测试生物体接种物。将测试接种物分成3个单独的小块对照和向其中添加了0.5gSurgihoney 1 (S1)、Surgihoney 3(S3)或Medihoney(MH)的3个测试制剂。接种物的菌落计数通过1∶10的系列稀释并在血琼脂平板上涂铺0.1mL(重复3次)来测定。

将测试和对照接种物保持在30℃以模拟表面皮肤损伤的温度。如上在0.5小时、2小时、 4小时、24小时、48小时、72小时和168小时的时间以一式三份进行菌落计数。

通过将0.1ml原始接种物接种到营养肉汤中以中和Surgihoney的任何残留效应并在37℃孵育72小时，然后铺板在血液琼脂上以测定测试生物体存活，来进行终末培养。

结果

抑制区尺寸。

试验性比较研究表明，所有Surgihoney效力具有比任何其它测试的蜂蜜(包括医疗级蜂蜜 Medihoney)更大的抗微生物活性。S1的抑制区大于由任何其它蜂蜜产生的那些抑制区。银敷料在敷料下面产生一定抑制作用，但没有如对于Surgihoney存在的抑制区。碘敷料对金黄色葡萄球菌产生大的抑制区域(约70mm)，大于S1(36mm)并相当于S3(67mm)。

在定量区域尺寸测试中，所有效力上的Surgihoney在针对所有测试的细菌(革兰阳性和革兰阴性细菌，包括多重抗生素抗性细菌)和真菌菌种的琼脂扩散中产生抑制区。每种菌种的区域尺寸随着Surgihoney效力制剂的增加而增加。表12.Surgihoney的抑制作用不仅仅取决于与活性剂的直接接触(如与银敷料一样)，而是远远扩散至孔之外，产生表12中列出的广泛区域。

MIC及MBC

Surgihoney显示了显著的抗所有测试的分离株的抗微生物活性。MIC和MBC在相同菌种的分离株中非常一致，无论该分离株是多药耐药性的还是高度敏感的。表13列出了通过稀释比测试的分离株种的MIC和MBC值，表14显示了以克/升计的MIC和MBC。效力程度随着Surgihoney的等级升高而上升。在大多数情况下，每个分离株的MBC在单一稀释度内接近MIC。

伤口中的Surgihoney的局部浓度估计为约500gms/L。Surgihoney 1对于金黄色葡萄球菌的MIC/MBC分别为31和125gms/L，Surgihoney 3的MI/MBC分别为0.12和0.24gms/L。

时间杀灭曲线。

Surgihoney快速杀死细菌。从每毫升(cfu/mL)约105的集落形成单位开始，对照中的cfu/mL 数稳定上升，而在Surgihoney接种物中，cfu/mL在与两种Surgihoney效力接触后快速下降。在大多数情况下，对于S1和S3，30分钟的cfu数量下降了1000倍(图34)。对于S1，在大多数情况下到2小时时和对于S3到30分钟时检测不到细菌生长。肠球菌属似乎更有弹性，持续48小时。对于所有生物体，杀灭活性是完全的，因为随后在血琼脂上铺板的营养肉汤中的终末培养物未能检测S1或S3接种体中的任何生物体。

讨论

Surgihoney是天然蜂蜜，在目前的词义上也是有机的，因为其与供人类消费的许多商业蜂蜜不同，不具有农业添加剂或抗微生物残留物。其不依赖于特定的花蜜来源，与其增强的活性取决于特定植物花蜜来源的蜂蜜诸如麦卢卡不同。可通过制备方法在Surgihoney中控制抗微生物活性，从而允许生产具有一致的测量效力的不同等级。

该研究已清楚地证明了Surgihoney作为抗所测试的细菌和真菌的所有种类的高效抗微生物活性剂的功效。在比较Surgihoney与各种来源于世界各地的多种蜂蜜和医疗级蜂蜜Medihoney的初步试验和性究中，Surgihoney显示显著更大的抗微生物功效。通过与常用的局部防抗菌剂银和碘比较，Surgihoney 3产生了与碘敷料一样大的抗菌作用，并且大于银敷料 (Aquacel Ag)，所述银敷料仅有效地抑制与敷料直接接触的细菌。

MIC和MBC测试显示，Surgihoney在低至可能在局部治疗中获得的那些浓度的1/1000 至1/10的浓度(估计为500gms/L)上不仅抑制而且杀死微生物。Surgihoney的杀灭活性在接近其抑制活性的浓度上发生。因此，当在任何定殖或表面感染的伤口或软组织腔中局部施加时， Surgihoney在多微生物抑制和根除中具有高度活性的潜力。由于许多慢性伤口定殖有抗性细菌，并且生物膜产生中的细菌持久性延迟伤口愈合，所以Surgihoney的使用可有助于适当减少抗生素的使用以及促进伤口愈合。在临床使用中，伤口部位的局部Surgihoney浓度将显著高于血清或深部组织中全身性抗生素的浓度。这反映在用于Surgihoney的MIC和MBC的值中，所述MIC和MBC的值相应地高于对于全身性抗生素一般表达的值。

时间杀灭曲线显示了杀灭活性的速度极快，对于Surgihoney 3，在30分钟内以及对于 Surgihoney 1，在2小时内。尽管肠球菌属显示略微更具弹性，但对于革兰阳性和革兰阴性生物情况均如此。真菌、念珠菌属的某些种、曲霉菌属的一个种也需要较高的浓度和更长时间的暴露以抑制生长并杀死生物体。

Surgihoney被配制为无菌产品，以作为局部伤口敷料施加于皮肤损伤和腔，目的是提供潮湿的伤口愈合环境，同时还减少微生物定殖，帮助除去脱落并促进肉芽和上皮形成。

其它抗微生物制剂可用作旨在治疗或预防伤口感染的局部制剂。银浸渍的敷料似乎具有良好的抗微生物活性，但是它们与蜂蜜制剂相比也显示出细胞毒性。碘类似物也具有良好的抗微生物活性，但它们也被报道在某些情况下是有毒的。由于抗微生物抗性和毒性的发展，对氯己定制剂在伤口敷料中的使用也越来越关注。

Surgihoney的临床应用可能是在局部应用中、皮肤上、伤口和腔中。伤口可能逐渐被细菌定殖，其可形成生物膜并延迟愈合。随着对抗微生物抗性日益关注和缺乏新型抗微生物剂，具有广泛的抗微生物活性的局部试剂可在于软组织损伤中减少全身性抗生素的使用方面发挥作用。这些体外研究已证明了Surgihoney作为具有高抗微生物活性的伤口敷料的潜力，其效力可被控制，并且还在伤口愈合中提供其它重要功能：潮湿屏障、脱落、局部营养供应、局部免疫调节并且无细胞毒性。

结论

这些体外结果支持Surgihoney作为伤口敷料的临床用途，并且这可以是能够在伤口愈合过程中递送所有所需作用以及作为强效和无毒的抗微生物剂的第一种产品。

表12具有不同效力的Surgihoney(S1、S2、S3)的抑制区尺寸

表13.显示最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的稀释的来自纯净 Surgihoney(S1、S2、S3)的系列二倍稀释

表14.以克/升表示的Surgihoney的MIC和MBC值

实施例38

Surgihoney的抗病毒活性

将S1或S2 Surgihoney与单纯疱疹病毒在细胞培养基(细胞培养基中的蜂蜜和病毒的50％混合物)中混合，然后在37℃孵育1小时。然后将混合物铺在细胞上，记录针对每种混合物形成的病毒噬斑的数量。也进行了没有蜂蜜或利用对照蜂蜜的对照。

在孵育1小时后记录的病毒(单纯疱疹病毒)噬菌斑的数量显示在图35中。与没有蜂蜜的混合物的160个噬菌斑相比，对于S1或S2 Surgihoney混合物没有形成噬菌斑，对于具有对照蜂蜜的混合物形成150个噬菌斑。

结果表明，S1和S2 Surgihoney制剂都具有强效的抗病毒活性。

实施例39

利用管线部位敷料的Surgihoney的使用

为了评估Surgihoney在防止外周插入式中央导管(PICC管线)的感染中的有效性，将S1 Surgihoney局部施加于30名患者的手臂中的管线进入部位。将约3g-8g S1Surgihoney施加于敷料，然后将所述敷料与伤口接触，并通过第二敷料保持就位。评估了管线部位定殖和管线相关菌血症，并与30名未接受Surgihoney敷料的患者进行比较。结果示于下表15中。

表15.S1 Surgihoney在预防和清除管线部位定殖中的作用

	Surgihoney(30)	非Surgihoney(30)
			初始时定殖的	2	4
评价过程中的定殖	0	6
			评价过程中清除的定殖	2	0

得出Surgihoney是与管线部位敷料一起使用的有效的抗微生物剂。

实施例40

使用Surgihoney预防剖腹产伤口的感染

手术伤口的感染是剖腹产的特殊问题，其具有约10％的相当高的感染率。在英国，每年有与147,726例CS相关的剖腹产伤口感染的国家增加(8-24.6％)和NHS医院间的广泛变化(13.6-31.9％)(Bragg等，2010.Variation in rates of caesarean section amongEnglish NHS trusts after accounting for maternal and clinical risk：crosssectional study.BMJ2010；341)。剖腹产伤口感染是延长住院时间、资源消耗以及其它发病率和死亡率的主要原因。从剖腹产术恢复对于发展术后伤口感染的妇女更加困难。

为了评估Surgihoney在预防剖腹产伤口感染中的有效性，将S1 Surgihoney在手术后局部施加于伤口一次。将约25g-35g S1 Surgihoney施加于敷料，然后将所述敷料与伤口接触，并通过第二敷料保持就位。在3个月内评估了近200名患者。

临床评价

当在手术结束时对伤口敷料时，将Surgihoney作为伤口敷料提供给在2012年10月与2013 年1月期间进行剖腹产术(CS)的妇女。将每小袋10g的Surgihoney用于单个患者使用。通过使用无菌技术，‘非无菌’手术助手打开Surgihoney小袋，并小心地将无菌内容物施加于无菌敷料。然后由产科医生或助产士将敷料施加于外科伤口。在手术后，主治助产士完成评价记录。收集的数据是MRSA状态，糖尿病史，药物和体重指数。手术后14天，主治助产士也记录任何伤口愈合问题，特别是渗出、疼痛、炎症的存在。如果有任何炎症，要求伤口培养拭子，并记录微生物学结果。基于由感染控制团队收集的数据，将在评价的三个月期间使用Surgihoney敷料的手术部位感染(SSI)率与评估前9个月的感染率进行比较。伤口感染在临床上被定义为需要抗生素治疗的发炎伤口(红斑、肿胀、排出)。SSI的比率计算为占所有进行的CS术的百分比。

结果

结果示于下表16中。在3个月期间(2012年10月-2013年1月)，有186例CS，其中102例(55％)是紧急的。没有妇女被MRSA定殖。4例(2.23％)具有糖尿病。42例(27.3％)具有＞25 的体重指数。在评价期间186例中有4例被确认为CS SSI。这代表了2.15％的感染率。单个患者报告了以伤口刺激的形式存在的与Surgihoney治疗相关的不良事件，所述不利事件在3 天内消退而无需进一步干预。在前9个月中有590例CS手术(234例是选择的和356例是紧急的)，感染控制监督记录了32例CS SSI，感染率为5.42％。感染率的降低是显著的：p＝0.042 (χ²检验)。

表16.S1 Surgihoney在预防剖腹产伤口感染中的作用

*来自在信托上可能少报了历史感染率的微生物学样品数据。英国全国平均水平接近10％结果显示，与历史数据相比，用S1 Surgihoney治疗的组中手术部位感染的发生率较低(减少60％)。Surgihoney敷料被良好地耐受，几乎没有报道的不良反应。

当使用Surgihoney时，伤口感染率下降了60.33％。通过使用来自研究的两个臂的SSI数据，CS SSI率(预期的)在Surgihoney之前为5.42％，之后为(观察到的)2.15％。在这些水平(其低于以前报道的9.6％的感染率)上，UK的外推CS SSI感染率将是(预期的)每年8007例和每年(观察到的)3176例。差为4831例，这可能因使用Surgihoney而减少。

得出S1 Surgihoney有效地降低手术后的剖腹产伤口的感染率。使用对愈合组织无毒并且还促进愈合过程的药剂Surgihoney预防伤口的定殖是新型的潜在重要的发现，所述发现可改变治疗手术伤口的方式。Surgihoney提供临床上有效的和具有成本效益的干预，以显著降低经历剖腹产的妇女的SSI。

讨论

该评价表明，Surgihoney(一种高效的抗微生物伤口敷料)可以用作初期CS伤口的伤口敷料，以防止感染。作为具有建立的伤口愈合性质的“天然”产品，Surgihoney除了提供有效的抗微生物活性以防止伤口定殖和感染之外，还可能促进伤口愈合。一些基于卤素的化学防抗菌剂可提供相同程度的抗微生物活性，但可延迟伤口愈合(Jan WA.Comparisonof conventional pyodine dressing with honey dressing for the treatment ofdiabetic foot ulcers.JPMI-Journal of Postgraduate Medical Institute 2012；26(4)：402-7)。碘伤口敷料在CS中是禁忌的(Joint Formulary Committee.The BritishNational Formulary.London：The Pharmaceutical Press；2013)，并且一系列毒性与其使用相关(Pietsch和Meakins：Complications of povidone-iodine absorption intopically treated burn patients.The Lancet 1976；307(7954)：280-2；Scoggin等：

and acidosis in association with topical treatment of burns.TheLancet 1977；309(8018)：959； Donovan等：Seizures in a Patient Treated withContinuous Povidone-Iodine Mediastinal Irrigation. New England Journal ofMedicine 1992；326(26)：1784；Colpaert：Iodine toxicity as a cause of totalatrioventricular block in burn patients.Burns 2009；35：S45-S6；Ramaswamykanive：Cardiovascular collapse following povidone-iodine wash.Anaesthesia andIntensive Care 2011； 39(1)：127-30；Lakhal：Povidone iodine：Features of criticalsystemic absorption.Annales Francaises d′Anesthesie et de Reanimation 2011；30(7-8)：e1-8)：e1-e3.)。

类似地，Cochrane系统评价显示没有足够的证据来确定含银敷料或局部闭幕式剂是否促进伤口愈合，防止伤口感染(Storm-Versloot等：Topical silver for preventingwound infection.Cochrane Database of Systematic Reviews 2010)或是对感染或污染的慢性伤口的有效治疗(Vermeulen等：Topical silver for treating infected wounds(综述).Cochrane review 2010；(10)： 42)。

尽管先前关于蜂蜜作为伤口敷料的临床有效性的系统评价已显示有益的不明确的证据，但该新制剂似乎在CS患者中提供显著的临床益处(Jull等：Honey as a topicaltreatment for wounds：The Cochrane Collaboration，2009；Jull等：Honey as atopical treatment for wounds. Cochrane database of systematic reviews (在线)2013；2)。在伤口感染率的时间比较中，评价已显示感染率从干预前的5.42％至使用Surgihoney的2.15％的60.33％的降低。

医疗相关感染是显著且昂贵的医疗保健并发症，约8％的住院和SSI患者占这些感染的14％，并且发现近5％的已经历了外科手术的患者已发展了SSI。SSI与相当大的发病率相关，超过三分之一的术后死亡与SSI至少部分相关。抗微生物预防常规地用于许多外科手术中以减少手术伤口感染。虽然外科医生通常也使用皮肤消毒来在皮肤切口之前减少皮肤细菌负荷，但是使用抗微生物敷料并不是常规的做法。其原因可能是大多数局部抗菌剂对组织愈合具有有害作用。

Surgihoney是具有有效的抗微生物活性的产品，其是无毒的并且促进组织愈合。将该产品局部应用于‘清洁’手术伤口实际上可以替代某些类型的手术中的全身性抗生素预防。此类进展将有助于减少抗生素体积使用和对定殖细菌的选择压力。

在本评价中选择剖腹产伤口，因为患者大体上健康，没有或很少有并发症，并且CS感染率据报告不断增加。这种增加的可能原因是年龄较大的母亲，具有合并症特别是糖尿病的母亲，以及身体质量指数较高的母亲的普遍增加。尽管以前没有常规地在初期伤口敷料中使用抗微生物剂，但该评价显示了Surgihoney在预防CS伤口感染中的有趣和有效的作用。

实施例41

使用S1 Surgihoney治疗感染的腿部溃疡

患者为患有糖尿病和慢性肾脏疾病的52岁男性。溃疡是广泛的，疼痛的，有臭味，并生成大量浆液性渗出物。

将S1 Surgihoney与抗生素一起用作局部敷料。到第7天，伤口臭味减少，疼痛消除，并且大量的严重渗出物和假单胞菌属感染被消除。患者在第7天出院。

结果的照片示于图36中，其中：(a)显示治疗的第1天；(b)显示治疗的第4天；和(c)显示治疗的第7天。

实施例42

使用S1 Surgihoney治疗压疮

患者是50岁的女性脊柱裂患者，她是残疾的和不能动的。患者在下背部至骶骨有持续了1年以上的褥疮。该腔被化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)感染。

S1 Surgihoney用作局部敷料。从第2天报告了伤口改善。到第30天，软组织腔几乎完全愈合。在这一点上没有检测到链球菌属。

结果的照片示于图37中，其中：(a)显示治疗的第1天；和(b)显示治疗的第30天。

实施例43

Surgihoney的抗微生物活性

测试了通过西方蜜蜂(蜜蜂)制备的Surgihoney(SH)和两种原型修饰的蜂蜜抗金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)的抗微生物活性。我们还检查了许多经修饰的类型的Surgihoney的改变样品的过氧化氢的产生水平的能力。

方法：使用针对金黄色葡萄球菌的标准菌株的生物测定方法将Surgihoney(SH)与两种经修饰的蜂蜜原型1(PT1)和原型2(PT2)进行比较。进一步的工作研究了从这些制剂生成过氧化氢的速率。

结果：Surgihoney抗微生物活性经显示主要归因于过氧化氢产生。通过修饰Surgihoney，显示两种更强效的蜂蜜原型生成大至2至3倍的抗菌活性和高达十倍的过氧化物活性。

结论：Surgihoney是临床可用的伤口抗菌敷料，其显示良好的抗菌活性。已显示两种另外的蜂蜜原型具有抗微生物活性，所述抗微生物活性可能因所证实的过氧化物活性的增加而增强。

方法

1.通过生物测定法测定蜂蜜活性

使用金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)测量Surgihoney(SH)和两种经修饰的蜂蜜原型1(PT1) 和原型2(PT2)的抗菌活性，并将其表示为当量％酚。计算来自测试的三个样品重复(在3天重复的)的平均值的值。

测定方法。所使用的琼脂孔扩散法改造自Microbiology Standard MethodsManual for the New Zealand Dairy Industry(1982)[蜂产品标准委员会：提出的用于测量蜂蜜的非过氧化物活性的标准。于新西兰：蜂产品标准委员会；1982.]中描述的用于抑制性物质的穿孔板测定。

接种物制备。使用无菌营养肉汤(作为空白)、稀释剂和具有1cm路径的比色杯，将过夜培养物调整至在540nm测量的0.5的吸光度。

测定板制备。将100μl体积的调节至0.5的吸光度的培养物用于接种150ml营养琼脂以制备测定板。将琼脂涡旋以充分混合并倒入已放置在水平表面上的大皮氏培养皿中。一旦琼脂凝固，将板倒置过夜，然后第二天使用。为了测定，将这些接种的板从4℃取出，并在室温下静置15分钟，然后将7.0mm直径的孔切入琼脂表面。将250μl测试材料(样品或标准物) 置于每个孔中。

过氧化氢酶溶液。每天新鲜制备200mg/ml的来自牛肝脏的过氧化氢酶(SigmaC9322，2900个单位/mg)在蒸馏水中的溶液。

样品制备。通过将4g样品添加至4ml普通蒸馏水中并在37℃下放置30分钟以帮助混合来制备初级样品溶液。为了制备二次溶液，将2ml初级样品溶液添加至2ml蒸馏水中并混合用于总活性测试，并将2ml初级样品溶液添加至2ml过氧化氢酶溶液中，并混合用于非过氧化物活性。

酚标准物的制备。通过将酚溶解在水中制备标准物(w/v)10％、30％、50％的酚。在使用前将酚标准物在黑暗中达到室温，并在添加至测试孔之前充分混合。将每种标准物以一式三份放置在3个孔中进行测试。将标准物保持在4℃，有效期为一个月。

样品和标准物应用。通过向3个孔中的每一个孔添加250μl，以一式三份地测试所有样品和标准物。

平板孵育。在施加样品后，将板在37℃下孵育约18小时。记录抑制区的直径，包括孔的直径(7.0mm)。

样品抗菌活性的计算。计算每个酚标准物周围的透明区的平均直径并取平方。将％酚相对于透明区的平均直径的平方绘制标准图。使用线性回归获得最佳拟合直线，并且将该线的方程用于从透明区的直径的平均测量值的平方计算每个稀释的蜂蜜样品的活性。为了允许进行稀释(假设Surgihoney的密度为1.35g/ml)，将该数值乘以为4.69的系数，然后将样品的活性表示为当量酚浓度(％w/v)。

总活性：所有活性，包括归因于过氧化氢(H₂O₂)的活性。

非过氧化物活性：通过用过氧化氢酶处理样品除去H₂O₂。

2.通过H₂O₂方法测定蜂蜜活性

使用

1.10011及1.10081测量活性。

过氧化物测试试剂盒。浓度表示为当量mg/L H₂O₂。

样品用纯化水以1∶10稀释。在5分钟孵育后，测量所有样品在12小时内每小时的H₂O₂产生，随后在24和48小时时间点进行该测量。

测定方法。过氧化物酶将氧从过氧化物转移至有机氧化还原指示剂，然后将其转化为蓝色氧化产物。通过目测比较测试条的反应区与颜色标度的区域来半定量地测量过氧化物浓度。将测试条的反应区浸入Surgihoney样品，持续1秒，允许过量的液体从条上径流至吸收性纸巾上，并在15秒(目录号110011)、5秒(目录号110081)后，之后确定与颜色区域标度更精确一致的在反应区中形成的颜色。

结果

1.活性评级

通过修饰蜂蜜样品产生的抗微生物活性导致与单独的Surgihoney相比，对于PT1和PT2 的酚活性的分别两倍和几乎三倍的增加。Surgihoney(SH)和两个经修饰的原型PT1和PT2的 3个样品的结果显示在表17中。

2.通过H₂O₂方法测定蜂蜜活性

观察到原型修饰生成高达7倍和10倍的Surgihoney的过氧化氢活性。3个样品的结果示于图38中。通过取三种蜂蜜原型中的每一种的过氧化氢输出的最高水平，并将其相对于总酚活性作图，观察到线性关系(图39)。

讨论

该工作的结果表明，Surgihoney(SH)以及两个经修饰的原型PT1和PT2的主要抗微生物活性归因于过氧化氢。这对于来自各种花卉来源的某些其它蜜蜂是类似的发现。然而，与先前的工作不同，来自样品的过氧化氢的可用性能够被增强，并且在12小时时分别是单独的 Surgihoney(SH)的值的7倍和10倍。在3种蜂蜜原型的抗微生物活性与过氧化氢的最大输出之间存在显著的线性关系。

该过氧化物活性提供了有效的抗微生物活性，其理想地适用于施用于急性或慢性伤口以治疗或预防伤口感染的伤口敷料。尽管少量的过氧化氢酶存在于伤口中，并且男性的过氧化氢酶的血清水平已报道为50kU/1，但已显示在创伤后的第一周期间，在愈合伤口中过氧化氢酶活性实际上降低，并且过氧化氢酶的活性水平在创伤后两周恢复至原始水平。因此，过氧化氢酶的此类浓度极不可能影响利用外源施用的Surgihoney或两种经修饰的原型PT1和PT2 观察到的抗微生物活性。

抗微生物伤口敷料的理想特征是：有效性、无毒性、使用的容易性、患者和临床医生的可接受性和性价比。过氧化氢是有效的抗微生物剂，并且因为其抗营养细菌、酵母和孢子的强有力的活性面已用作杀生物剂。其通过细胞组分的化学氧化产生其抗微生物作用。

过氧化氢的人毒性是浓度依赖性的，一项研究声称，对于抗微生物和人毒性的差异浓度可能重叠。相比之下，某些蜂蜜制剂经显示是有效的抗微生物剂，通过随时间连续地向伤口提供低浓度的过氧化氢，而不是在敷料时大量地提供过氧化氢，从而不存此类毒性。实际上，有令人信服的证据表明，当将生理水平的过氧化氢施用于哺乳动物细胞时，这些细胞中存在生物反应的刺激和特定生化途径的活化。

很明确地，Surgihoney和两个经修饰的原型PT1和PT2是抗微生物敷料，其提供有效的过氧化氢释放超过至少24小时。

结论

已显示Surgihoney和两个经修饰的原型PT1和PT2对于金黄色葡萄球菌的标准菌株具有强效的抗微生物活性。已显示这些抗微生物活性由过氧化氢产生。活性是可缩放的，并且可用过氧化氢活性来描述。这些经修饰的蜂蜜提供有效的，无毒的且易于施用的敷料。

表17显示Surgihoney(SH)和两种经修饰的原型PT1和PT2抗金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)的过氧化物和非过氧化物抗菌活性

实施例44

本实施例列出了本发明的优选的基于蜂蜜的组合物(称为“活性蜂蜜”)，其包含蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶。

醇凝胶

用途：用于治疗痤疮。不要在破损的皮肤上使用。

“活性蜂蜜(5+)”用于表示应当使用比在不具有(5+)名称的其它制剂中更多的葡萄糖氧化酶。

实施例45

该实施例列出了本发明的优选的基于蜂蜜的组合物(称为“活性蜂蜜”)，其包含蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶。

水性喷雾

25ml塑料瓶，其包含：

活性蜂蜜 10g

Triton CF 0.1g

麦芽糖糊精或玉米淀粉 1g

用途：一般伤口，和应用于烧伤

Triton CF在该组合物中充当表面活性剂。麦芽糖糊精和玉米淀粉用作成膜剂。

实施例46

非水性喷雾

活性蜂蜜 70％

丙二醇 30％

用法：一般伤口

实施例47

敷料-塑料袋

海藻酸钙敷料的范围

10cm×10cm，20cm×20cm

活性蜂蜜 10％w/w

用途：伤口清创，用于相对较大的渗出性伤口。该组合物提供相对潮湿的环境。

实施例48

蜂蜜和镇痛药

活性蜂蜜 99％

布洛芬 1％

用途：用于伤口处理的所有阶段，以提供伤口愈合中的疼痛治疗。

实施例49

粉末

活性蜂蜜

麦芽糖糊精

布洛芬

微晶纤维素(CMC)

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)

优选地，将布洛芬以1-2％w/w包括在组合物中。其它组分可以变化，例如以实现不同水平的吸湿。

用途：包装在箔中，以防止吸水。PVP-提供粒化。CMC-提供水分干燥剂。

实施例50

伤口清创

重建水溶液，包含活性蜂蜜(诸如，5-50％活性蜂蜜)，任选还包括止痛剂，优选布洛芬，合适地为1-2％w/w。

用途：例如在分配器(诸如泵分配器)中，作为清创后的伤口漂洗，以提供早期开始伤口愈合和疼痛缓解。

实施例51

泡沫敷料

用以吸收渗出物的聚氨酯背衬

浸泡在活性蜂蜜中的藻酸钙的岛状物

用以终止粘附伤口的硅胶

用途：泡沫基敷料，以帮助擦拭伤口渗出物。

实施例52

真菌指甲治疗

泡沫井中的石膏与活性蜂蜜(5+)

羟基丙基纤维素

甘油

异丙醇

柠檬酸

一水合物

用途：用于治疗真菌性指甲感染

实施例53

喉喷雾

蜂蜜和甘油，优选包含5-20％的蜂蜜

用途：喉咙痛。制剂可在用于喷雾的双重分配器中，或在使用前用水重构，然后喷雾。

实施例54

软膏剂(Pommade)

活性蜂蜜 25％

白凡士林

轻液体石蜡

滑石

高岭土

氧化锌

用途：用于治疗感染性湿疹

实施例55

唇膏

用途：用于破裂的嘴唇

实施例56

面霜

用途：用于治疗痤疮。已知蜂蜜具有抗痤疮丙酸杆菌的活性。

Claims

1.一种用于生成抗微生物活性的无菌组合物，所述组合物包含：

葡萄糖氧化酶；和

蜂蜜，所述蜂蜜缺乏过氧化氢酶活性，并且缺乏葡萄糖氧化酶活性；其包含D-葡萄糖；

其中所述组合物是储存稳定的组合物，其不包括足以允许所述葡萄糖氧化酶转化D-葡萄糖的游离水；且所述组合物不包含臭氧化蜂蜜或臭氧化油。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括每克所述组合物多于15个单位的葡萄糖氧化酶。

3.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物不含有任何添加的过氧化物酶。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物不含有任何能被检测的过氧化氢。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物不含有任何能被检测的过氧化氢。

6.根据权利要求1、2和5中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物的形式为液体或凝胶。

7.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物的形式为液体或凝胶。

8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物的形式为液体或凝胶。

9.根据权利要求1、2、5和7-8中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物的总水含量小于20％。

10.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物的总水含量小于20％。

11.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物的总水含量小于20％。

12.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物的总水含量小于20％。

13.一种生产前述权利要求中任意一项所述的组合物的方法，该方法包括：将葡萄糖氧化酶与含有D-葡萄糖的蜂蜜接触，所述蜂蜜缺乏过氧化氢酶活性，并且缺乏葡萄糖氧化酶活性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述葡萄糖氧化酶为纯化的酶，且其具有至少90％的纯度。

15.一种生产抗微生物溶液的方法，所述方法包括：用足够的水稀释根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，以允许所述葡萄糖氧化酶转化D-葡萄糖并释放过氧化氢。

16.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物作为抗微生物的活性成分在制备药剂中的用途。

17.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物在制备以下药剂中的用途：

(1)用于预防、治疗或缓解人或动物微生物感染的药剂；

(2)用于治疗伤口的药剂；

(3)用于刺激组织生长的药剂；或

(4)用于清创伤口的药剂。

18.一种伤口敷料，所述伤口敷料包含权利要求1至12中任一项所述的组合物。

19.根据权利要求18所述的伤口敷料，其中，所述敷料包括纱布、绷带、薄膜、凝胶、泡沫、水胶体、藻酸盐、多糖糊剂或颗粒。

20.根据权利要求19所述的伤口敷料，其中，所述敷料包括薄纱、水凝胶或珠。

21.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至12中任一项所述的组合物，以及药学上可接受的赋形剂。