CN111138557B

CN111138557B - 一种栀子多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111138557B
Application number: CN202010059048.5A
Authority: CN
Inventors: 马越鸣; 吴家胜; 王天明; 方溯
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-01-18
Filing date: 2020-01-18
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2040-01-18
Also published as: CN111138557A

Abstract

本发明公开了一种栀子多糖及其提取方法。所述栀子多糖包括下述质量百分比的原料：总糖含量为41‑56％，糖醛酸34‑45％，蛋白含量为7‑10％。所述栀子多糖的制备方法步骤包括：栀子药材粉碎、除脂后，加水浸提提取，乙醇沉淀，再反复冻融除蛋白，经透析后冷冻干燥。本发明制备的栀子多糖可改善α‑异硫氰酸萘酯(ANIT)和3,5‑二乙氧基羰基‑1,4‑二氢‑2,4,6‑三甲基吡啶(DDC)诱导的胆汁淤积性肝损伤，减轻四氯化碳(CCL₄)诱导的纤维化，而栀子多糖的肝保护作用未见文献报道，说明栀子多糖在制备肝保护药物，尤其在制备抗胆汁淤积性肝损伤和抗肝纤维化药物中的应用具有明显的前景。

Description

一种栀子多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种栀子多糖及其制备方法和应用，属于中药技术领域。

背景技术

多种慢性肝病如各种原因的肝硬化、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、酒精性肝炎、药物性肝病、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝肿瘤等，常伴发肝内胆汁淤积(intrahepatic cholestasis，IHC)，即胆汁流形成、分泌和排泄发生障碍，胆汁流不能正常流入十二指肠，而在肝脏中滞留、并进入血液循环，这些肝病又称为胆汁淤积性肝病/肝损伤。随着病情进展，肝内胆汁淤积可加重肝脏损害和肝纤维化/肝硬化，严重者可导致肝衰竭甚至死亡。针对肝内胆汁淤积性肝病/损伤和肝硬化，临床治疗药物尚显不足，迫切需要研发新的治疗药物。

胆汁淤积属中医“黄疸”范畴，中医在长期的临床实践中发现多种中药具有“退黄”保肝的疗效，可以改善胆汁淤积，在治疗胆汁淤积性肝脏疾病方面具有独特优势。中药栀子为茜草科植物栀子(Gardeniajasminoides Ellis)的干燥成熟果实。栀子具有清热利湿功效，在《本草纲目》记载中具有解五种黄疸的功效，现代临床上常用于治疗黄疸性肝炎，实验研究也表明栀子具有保肝利胆作用。栀子是常用的退黄保肝、改善胆汁淤积性肝病的中药。有研究确定栀子苷是主要的药效物质，但栀子苷具有肝毒性，限制了其进一步的研发，也与临床上栀子的广泛使用相矛盾，提示栀子苷并不能完全代表栀子的退黄保肝的效应物质，栀子中可能还含有其它退黄保肝的成分。但现有技术中并未有其他保肝成分的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种栀子多糖及其制备方法，所要解决的技术问题之二是提供所述的栀子多糖的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种栀子多糖，包括下述质量百分比的原料：总糖含量为41-56％，糖醛酸34-45％，蛋白含量为7-10％。

所述栀子多糖的重均相对分子量为M_W：10-20kDa，栀子多糖经完全酸水解后分析，单糖组成包括：鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

本发明还提供所述栀子多糖的制备方法，步骤包括：栀子药材粉碎、除脂后，加水浸提提取，乙醇沉淀，再反复冻融除蛋白，经透析后冷冻干燥，得栀子多糖。

优选地，所述栀子多糖的制备方法，步骤包括：

(1)栀子药材干燥，粉碎得栀子粉；

(2)栀子粉中加入乙醇浸泡除脂，过滤，药渣干燥；

(3)药渣加水浸提2-4次，过滤，合并滤液，滤液浓缩，得到浓缩液A，离心，取上清得水提液；

(4)水提液加入乙醇，使醇浓度达到65-85％，室温静置过夜；过滤收集沉淀，沉淀用乙醇浸洗1-3次，干燥，加水溶解，65-75℃水浴挥发除去多余醇，得到浓缩液B；

(5)浓缩液B在-78℃-82℃和水浴42-44℃反复冻融3-5次，离心除蛋白；

(6)透析，冷冻干燥，得栀子多糖。

步骤(1)中，所述粉碎过70-90目筛，优选为80目。

步骤(2)中，所述栀子粉和乙醇的固液比为1g：(3-8)mL，优选为1g：8mL，所述浸泡时间为20-30h。

步骤(3)中，所述浸提温度为80-100℃，优选为100℃；每次浸提时间为2-3.5h，优选为3h；所述浸提次数优选为3次；每次浸提水的质量是药渣质量的10-25倍，优选为20倍；离心条件为以3000-4000g的转速离心8-12min。

步骤(4)中，优选醇浓度达到70％，所述干燥为在35-45℃烘箱烘干，所述加水溶解时沉淀和水的固液比为1g：(2-3)mL。

步骤(2)和步骤(4)中，所用乙醇为95％乙醇。

步骤(5)中，反复冻融的条件优选为在-80℃和水浴43℃反复冻融4次，除蛋白的条件为以3000-4000rpm离心8-12min。

步骤(6)中，所述透析条件为采用3000-4000Da的透析袋透析24-48h，优选为采用3500Da的透析袋透析48h。

上述醇浓度均为体积百分比。

本发明还提供了栀子多糖在制备肝保护药物中的应用。

本发明还提供了栀子多糖在制备抗胆汁淤积性肝损伤和抗肝纤维化药物中的应用。

本发明采用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的小鼠急性胆汁淤积肝损伤模型，应用本发明的栀子多糖400mg/kg灌胃给药，结果表明，本发明的栀子多糖对ANIT诱导的急性胆汁淤积模型小鼠能改善胆汁淤积和减轻肝损伤，具有保肝作用。

本发明采用3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶即DDC(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)诱导的小鼠慢性胆汁淤积肝损伤模型，应用本发明的栀子多糖800mg/kg灌胃给药，结果表明，本发明的栀子多糖对DDC诱导的慢性胆汁淤积模型小鼠能减轻肝损伤，具有肝保护作用。

本发明采用CCL₄诱导的小鼠肝纤维化性模型，应用本发明的栀子多糖200mg/kg灌胃给药，结果表明，本发明的栀子多糖对CCL₄诱导的肝纤维化性模型小鼠能减轻肝损伤、减轻肝纤维化，具有肝保护作用。

本发明制备的栀子多糖可改善α-异硫氰酸萘酯(ANIT)和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)诱导的胆汁淤积性肝损伤和CCL₄诱导的肝纤维化，而栀子多糖的肝保护作用未见文献报道，说明栀子多糖在制备肝保护药物，尤其在制备抗胆汁淤积性肝损伤和抗肝纤维化药物中的应用具有明显的前景。

附图说明

图1是本发明的栀子多糖对ANIT诱导的模型中肝组织形态学的影响，其中图1a为正常组，图1b为模型组，图1c为熊去氧胆酸组，图1d为栀子多糖组。

图2是本发明的栀子多糖对DDC诱导的模型中肝组织学形态的影响，其中图2a为正常组，图2b为模型组；图2c为栀子多糖组。

图3是本发明的栀子多糖对CCl4诱导肝纤维化小鼠肝组织形态学及胶原水平的影响。其中图A为HE染色，图B为天狼星红染色。

图4是本发明的栀子多糖对肝纤维化小鼠肝组织胶原纤维沉积水平的影响，**p<0.01，与正常组相比；##p<0.01，与模型组相比

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。

实施例1

栀子多糖的制备方法，步骤包括：

栀子药材晒干，粉碎过80目筛，得栀子粉；栀子粉中加入乙醇浸泡24h除脂，过滤，药渣晾干，其中栀子粉和乙醇的固液比为1g：8mL；药渣加药渣质量20倍量的100℃热水浸提3次，每次3h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至原滤液的1/4，得到浓缩液A，浓缩液A以3500×g离心10min，取上清得水提液；水提液加入乙醇，使醇浓度达到70％，室温静置过夜，过滤收集沉淀，沉淀用95％无水乙醇进一步浸洗2次，再置40℃烘箱20min，然后加水溶解，其中沉淀和水的固液比为1g：3mL，65-75℃水浴挥发除去多余醇，得到浓缩液B；浓缩液B在-80℃和水浴43℃反复冻融4次，3500rpm离心10min除蛋白；使用3500Da透析袋透析48h，冷冻干燥，得栀子多糖。

得到的栀子多糖中总糖含量为41-56％，糖醛酸34-45％，蛋白含量为7-10％。多糖重均相对分子量为M_W:10-20kDa。栀子多糖经完全酸水解后分析，单糖组成主要为：鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

实施例2

健康雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2g，由上海灵畅动物有限责任公司提供。小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型对照组、熊去氧胆酸阳性对照组、栀子多糖组，每组10只。阳性对照组灌胃给予熊去氧胆酸115mg/kg，正常对照组和模型对照组灌胃给予等容量生理盐水，栀子多糖组灌胃给予栀子多糖(溶于生理盐水)400mg/kg，每日1次，连续给药14天。试验第12天给药4h后，除正常对照组外，其余各组单次灌胃给予α-萘异硫氰酸酯(ANIT)50mg/kg复制急性胆汁淤积性肝损伤模型。

试验第14天前一晚所有动物禁食不禁水12h，试验第14天给药4h后采集血清测定肝脏功能，摘取肝脏进行病理检测。结果如下：

表1本发明的栀子多糖对ANIT诱导胆汁淤积小鼠ALT、AST、ALP水平的影响(x±s，n＝10)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

表2本发明的栀子多糖胆对ANIT诱导汁淤积小鼠TBA、TBIL、DBIL水平的影响(x±s，n＝10)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

试验结果表明：与正常对照组相比(见表1和表2)，模型对照组动物血清ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL显著性升高，研究结果提示ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤模型建立。与模型对照组相比，栀子多糖组和阳性对照组动物血清各指标显著降低，提示栀子多糖能够减轻胆汁淤积性肝损伤。

光镜下显示(见图1)，与正常对照组相比，模型对照组出现明显的肝细胞坏死、少量炎性细胞浸润，与模型组比较，栀子多糖组肝脏损伤明显改善，提示栀子多糖能够减轻胆汁淤积肝损伤。

综上实验结果表明：本发明的栀子多糖具有肝保护作用，能改善急性胆汁淤积引起的肝损伤。

实施例3

健康雄性C57BL/6J小鼠，体重22±2g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。小鼠适应性喂养一周后，随机分为正常对照组、模型对照组及栀子多糖组。除正常对照组给予正常饲料外，其他各组给含0.025％3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydroxychollidine，DDC)的毒性饲料，复制慢性胆汁淤积肝损伤模型，模型诱导1周后，栀子多糖组灌胃给予800mg/kg栀子多糖(溶于生理盐水)，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每日1次。给药期间密切观察动物在试验期间的一般症状，于药物干预4周(DDC造模5周)后，将动物麻醉处死，采集血清测定肝脏功能，摘取肝脏进行病理检测。结果如下：

表3本发明的栀子多糖对DDC诱导胆汁淤积小鼠ALT、AST、ALP活性的影响(x±s，n＝6)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

表4本发明的栀子多糖对DDC诱导胆汁淤积小鼠TBA、TBIL、DBIL活性的影响(x±s，n＝10)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

试验结果表明：与正常对照组相比(见表3和表4)，模型对照组动物血清ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL显著性升高，研究结果提示DDC诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤模型建立。与模型对照组相比，栀子多糖组小鼠血清ALT、AST、TBIL和DBIL均明显降低，提示栀子多糖能够减轻胆汁淤积性肝损伤。

光镜下显示(见图2)，正常组小鼠肝细胞形态正常，排列规则，无变性坏死现象，见图2a；与正常组相比，DDC造模5周后，模型组小鼠肝脏汇管区可见明显的卟啉结晶沉积、炎性细胞浸润、肝细胞坏死、中小胆管管壁增厚且开始有不规则的新生胆管的出现，胆管周围出现炎症细胞浸润，见图2b；与模型组相比，栀子多糖干预4周后，小鼠肝脏汇管区炎症细胞浸润减少，肝细胞坏死及胆管反应减轻，胆汁淤积小鼠肝脏损伤得到明显改善，见图2c。

综上实验结果表明：本发明的栀子多糖具有肝保护作用，能改善慢性胆汁淤积引起的肝损伤。

实施例4

雄性C57BL/6小鼠，体重23-25g，由上海灵畅动物有限责任公司提供。小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型对照组、栀子多糖组。模型组、栀子多糖组按照2ml/kg体重腹腔注射10％CCL₄橄榄油，正常组腹腔注射相同体积的橄榄油，每周一、三、五各一次，连续4周。自造模之日起，栀子多糖组灌胃给予200mg/kg栀子多糖(溶于生理盐水)，正常组与模型组口服给予等量生理盐水，每天灌胃1次，持续灌胃4周。

最后一次注射10％CCL₄橄榄油48小时后，将动物麻醉处死，采集血清测定肝脏功能，摘取肝脏测定羟脯氨酸水平、HE染色和天狼星红染色，进行病理学检查。结果如下：

表5本发明的栀子多糖对CCL₄诱导肝纤维化小鼠ALT、AST、TBIL水平的影响(x±s，n＝8)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

表6本发明的栀子多糖对CCL₄诱导肝纤维化小鼠肝HYP水平的影响(

n＝8)

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

试验结果表明：与正常对照组相比(见表5)，模型对照组动物血清ALT、AST、TBIL显著性升高；与模型对照组相比，栀子多糖组动物血清ALT和TBIL降低，栀子多糖能够减轻肝损伤。

与正常组相比(见表6)，模型组小鼠肝脏羟脯胺酸(Hyp)含量显著升高(p<0.01)，与模型组相比，栀子多糖干预组小鼠肝脏羟脯胺酸(Hyp)含量明显降低(p<0.01)。

图3A为HE染色，图3B为天狼星红染色，HE染色结果显示，正常组肝细胞排列整齐，汇管区未见炎症，与正常组相比，模型组肝组织汇管区有炎性细胞浸润，成纤维细胞增生，肝细胞变性坏死(图3A)；与模型组相比，栀子多糖组小鼠肝脏炎性细胞浸润及肝细胞坏显著减轻(图3A)。天狼星红染色结果显示，正常组肝脏肝小叶结构清晰，未见明显胶原表达，与正常组相比，模型组小鼠肝脏汇管区有较多假小叶形成，肝小叶间隔明显增宽和大量胶原纤维沉积(图3B、图4)；与模型组相比，栀子多糖给药干预后，小鼠肝脏汇管区未见假小叶形成，肝小叶间隔及胶原纤维沉积显著减少(图3B、图4)。

综上实验结果表明：本发明的栀子多糖具有肝保护作用，能改善CCL₄诱导的肝纤维化病变。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.栀子多糖在制备抗a-异硫氰酸萘酯或3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶诱导的胆汁淤积性肝损伤药物，或抗CCl₄诱导的肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述栀子多糖总糖含量为41-56%，糖醛酸34-45%，蛋白含量为7-10%；所述栀子多糖的重均相对分子量为M_W：10-20 kDa，栀子多糖完全酸水解后的单糖组成包括：鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；

所述的栀子多糖的制备方法包括以下步骤：

（1）栀子药材干燥，粉碎得栀子粉；

（2）栀子粉中加入乙醇浸泡除脂，过滤，药渣干燥；

（3）药渣加水浸提2-4次，过滤，合并滤液，滤液浓缩，得到浓缩液A，离心，取上清得水提液；

（4）水提液加入乙醇，使醇浓度达到65-85%，室温静置过夜；过滤收集沉淀，沉淀用乙醇浸洗1-3次，干燥，加水溶解，65-75℃水浴挥发除去多余醇，得到浓缩液B；

（5）浓缩液B在-78℃或-80℃和水浴42-44℃反复冻融3-5次，3000-4000rpm离心8-12min除蛋白；

（6）采用3000-4000Da的透析袋透析24-48h，冷冻干燥，得栀子多糖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）中粉碎过70-90目筛，步骤（2）中，所述栀子粉和乙醇的固液比为1g：（3-8）mL，所述浸泡时间为20-30h。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述浸提温度为80-100℃，每次浸提时间为2-3.5h，每次浸提水的质量是药渣质量的10-25倍，离心条件为3000-4000g的转速离心8-12min。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（4）中所述干燥为在35-45℃烘箱烘干，加水溶解时沉淀和水的固液比为1g：（2-3）mL，步骤（2）和步骤（4）中所用乙醇为95%乙醇。