CN110988167B - 一种加替环合酯中基因毒杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测加替环合酯中潜在基因毒性杂质3‑二甲氨基‑2‑（2,4,5‑三氟‑3‑甲氧基‑苯甲酰基）‑丙烯酸乙酯（式III）含量的方法，所述的方法采用液相色谱‑质谱法，优选液相‑串联质谱法行检测，所采用的流动相为有机溶剂‑水溶液，不含有缓冲盐，避免了缓冲盐易析出，堵塞色谱柱，进而造成柱压升高问题的出现；同时，该检测方法灵敏度高，定量限为0.98ppm，并经方法学验证，符合相关要求，所述的方法可用于加替环合酯中杂质3‑二甲氨基‑2‑（2,4,5‑三氟‑3‑甲氧基‑苯甲酰基）‑丙烯酸乙酯（式III）含量的检测。

Description

一种加替环合酯中基因毒杂质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种采用液相-质谱方法检测样品中基因毒性杂质含量，更具体的是采用液相-串联质谱方法检测加替环合酯中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯。
背景技术
加替环合酯是合成加替沙星、莫西沙星等第四代喹诺酮类抗菌药重要的中间体，其化学命名为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代喹啉-3-羧酸乙酯（CAS号:112811-71-9），结构式如式I所示：
Figure 711381DEST_PATH_IMAGE001
。
目前，文献已报道了多种加替沙星环合酯合成路线，其中的一种合成路线涉及N,N-二甲基丙烯酸乙酯，如文献US4699992、CN1030911A、US6229017，顾海宁等.盐酸加替沙星的合成研究[J].浙江大学学报(理学版),2005(01):66-68，74.等均报道了采用N,N-二甲基丙烯酸乙酯制备喹诺酮母核的方法，其合成路线如下所示。
Figure 374444DEST_PATH_IMAGE002
该路线为采用2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯（式V）与N,N-二甲基丙烯酸乙酯（式IV）反应制备得到3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III），再经取代反应、环合反应制备得到加替环合酯。
式III化合物与加替环合酯结构类似，易残留在加替环合酯中，而N,N-二甲基结构为基因毒性杂质警示结构，应严格控制其在原料药中的含量，并根据从源头开始全程控制药品质量的要求，非常有必要对加替环合酯这一关键中间体中的式III化合物含量进行检测，确保含量符合要求，以降低原料药中基因毒杂质含量超标的风险。参考ICH M7，结合盐酸莫西沙星最大日剂量为400mg，按照最严格的单个杂质日总摄入量为1.5μg进行计算，其限度为3.75ppm，以此作为加替环合酯中基因毒性杂质式III化合物的限度。
专利CN108088930A公开了一种HPLC法检测加替环合酯中有关物质的方法，用于控制加替环合酯的质量，该方法的流动相为有机相和水相的混合物，其中水相为磷酸盐缓冲溶液，而磷酸盐容易析出，造成色谱柱的堵塞，压力升高，试验前后通常需要用高比例水相进行冲洗，无形中增加了试验时间。根据该专利公开的内容，图7为加标杂质供试品溶液的液相谱图，其中杂质浓度为1ug/ml，供试品浓度为1mg/ml，相当于式III化合物在样品中的含量为1000ppm，杂质的峰高小于0.01，当式III化合物在样品中的含量为3.75ppm时，供试品浓度为1mg/ml时，进样量为20μl，杂质的在液相谱图中峰高约为0.000038，显然液相无法满足检测的需要。
因此，有必要开发新的检测方法，提高检测灵敏度，满足检测的需要，同时避免现有技术中的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术中的问题，提供了一种改进的检测加替环合酯中潜在基因毒性杂质3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III）含量的方法，所述的检测方法为液相色谱-质谱法（LC-MS），该方法灵敏度高，所采用的流动相为有机溶剂-水溶液，不含有缓冲盐，避免了现有技术中因磷酸盐析出造成色谱柱堵塞，压力升高的问题。
本发明提供的一种加替环合酯中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于采用LC-MS进行检测，包括如下步骤：
（1）溶液配制：分别配制对照品储备液、参比溶液和测试溶液；所述的对照品储备液为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III）溶液；所述的参比溶液为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III）溶液；所述的测试溶液为加替环合酯样品溶液。
（2）进样：待LC-MS仪器系统稳定后，分别将空白溶液、参比溶液和测试溶液进样检测，记录谱图，检测条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲酸-水-甲醇体系，进行梯度洗脱。
所述的基因毒性杂质为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯；
所述的对照品储备液的配制方法为：精密称取3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯对照品适量置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液适量置于另一容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；
所述的参比溶液的配制方法为：精密量取对照品储备液适量置于容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述的测试溶液的配制方法为：精密称取加替环合酯样品适量置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述的的空白溶液和稀释液均为乙腈。
所述的甲酸为AR级及以上，所述的乙腈为HPLC级，所述的水为HPLC级，所述的甲醇为HPLC级，所述的3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯对照品为AR级及以上。
所述对照品储备液中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯的浓度为50 ng/ml~300ng/ml；所述参比溶液中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯的浓度为1ng/ml~5ng/ml；所述测试溶液加替环合酯浓度为0.5ng/ml~3ng/ml。
所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18RRHD 3.0×150mm,1.8µm,或效能相当的色谱柱。
所述的流动相包括流动相A和流动相B，所述的流动相A为甲醇-水溶液，所述的流动相B为甲醇；所述的甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:800~1500，优选1:800~1200，更优选为1:1000。
其中所述的梯度洗脱如表1所示：
Figure 103365DEST_PATH_IMAGE003
质谱条件如表2所示：
Figure 182180DEST_PATH_IMAGE004
更优选的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
（1）溶液配制：分别配制对照品储备液、参比溶液和测试溶液；所述的对照品储备液为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III）溶液；所述的参比溶液为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯（式III）溶液；所述的测试溶液为加替环合酯溶液。
（2）进样：待超高效液相色谱-串联质谱（UHPLCMS/MS）仪器系统稳定后，分别将空白溶液、参比溶液和测试溶液进样检测，记录谱图，检测条件如下：色谱柱：AgilentEclipse Plus C18 RRHD 3.0×150mm,1.8µm，进样量0.1μl，柱温35℃，流速0.5ml/min，流动相A为甲酸：水=1:1000（V/V），流动相B为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱。
其中流动相梯度过程如表1所示，质谱的条件如表2所示。
其中空白溶液进样1次，参比溶液进样5次，测试溶液进样1次，其中5次参比溶液以3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯峰面积计标准偏差（RSD）应不大于10.0%。
所述的对照品储备液的配制方法为：精密称取3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯对照品约20mg置于200ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液100µl适量置于100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；
所述的参比溶液的配制方法为：精密量取对照品储备液300μl置于10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述的测试溶液的配制方法为：精密称取加替环合酯样品约80mg置于100ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述的的空白溶液和稀释液均为乙腈。
所述的甲酸为AR级及以上，所述的乙腈为HPLC级，所述的甲醇为HPLC级，所述的3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯对照品为AR级及以上。
所采用的仪器为超高效液相色谱仪、Agilent QQQ配备ESI（+）MS检测器、电子分析天平。
根据以下公式计算3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯在测试样品加替环合酯中的含量，
结果（ppm）=(RU/Rs) ×(Cs/CU)
其中：RU：测试溶液图谱中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯峰面积；Rs：5针参比溶液图谱中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯的平均峰面积；Cs：参比溶液中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯的浓度(ng/ml)； CU：测试溶液中的加替环合酯浓度(mg/ml)。
所述方法中，3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯的保留时间约为7.8min。
所述的检测方法经方法学验证，符合相关要求，其测试结果如下：
Figure 680157DEST_PATH_IMAGE005
本发明所述的LC-MS为液相色谱-质谱，LCMS/MS为液相色谱-串联质谱，所述的UHPLCMS/MS为超高效液相色谱-串联质谱。
本发明所提供的用于检测加替环合酯中3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯含量的方法，具有高灵敏度，其定量限为0.98ppm，根据相关指导原则，按照从严控制杂质含量，3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯在加替环合酯中的限度为3.75ppm，并且所述的方法经系统适用性、专属性、精密度、定量限、LOQ精密度、检出限等项目验证，均符合相关要求，本发明所提供的方法可用于该杂质在加替环合酯中含量的检测。本发明的另一个有益效果是，流动相革除了缓冲盐，解决了缓冲盐析出造成色谱柱堵塞，柱压升高的问题。
附图说明
图1 实施例2中参比溶液典型谱图
图2 实施例3中莫西沙星S1测试溶液谱图
图3实施例4中Precision-1谱图
图4实施例5中LOQ-1谱图
图5实施例5中LOD谱图
图6实施例6中线性溶液-100%典型谱图
图7实施例8中测试溶液-2 days谱图
图8实施例8中参比溶液-2 days谱图
图9实施例8中选择溶液-2 days谱图
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。本发明中所述的中间体A1为3-二甲氨基-2-（2,4,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯，也即式III化合物，本发明所述的莫西沙星S1为加替环合酯，也即式I化合物。本发明实施例所采用的仪器、色谱柱、试剂、对照品、供试品等信息如表4、表5所示。
Figure 763389DEST_PATH_IMAGE006
Figure 714027DEST_PATH_IMAGE007
实施例1 检测方法
(1)仪器条件及试剂
仪器及条件：超高效液相色谱-串联质谱仪：型号：Agilent1290&Agilent QQQ，Agilent QQQ配备ESI（+）MS检测器；色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD 3.0×150mm,1.8µm；Agilent Eclipse Plus C18 RRHD 3.0×150mm,1.8µm，电子分析天平，梯度洗脱条件如表1所示，质谱仪条件如表2所示。
试剂及对照品：甲醇：HPLC；超纯水：HPLC；甲酸：HPLC；乙腈：HPLC；中间体A1：含量99.5%；莫西沙星S1：NA。
（2）试验操作
①溶液配制：
稀释液：乙腈；
空白溶液：稀释液；
中间体A1储备液：精密称取中间体A1对照品约20mg置于200ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液100µl置100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；
参比溶液：精密量取中间体A1储备液300ul置于10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
测试溶液：精密称取莫西沙星S1样品约80mg置于100ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
②进样与数据处理
待系统稳定后，进空白溶液1针，参比溶液5针，测试溶液1针，记录谱图。其中5针参比溶液以中间体A1峰面积计 RSD应不大于10.0%。
中间体A1在莫西沙星S1中的含量按照下式计算，
结果（ppm）=(RU/Rs) ×(Cs/CU)
其中：RU：测试溶液图谱中中间体A1峰面积；
Rs：5针参比溶液图谱中中间体A1的平均峰面积；
Cs：参比溶液中中间体A1的浓度(ng/ml)；
CU：测试溶液中的莫西沙星S1浓度(mg/ml)。
实施例2 系统适用性
系统适用性是通过5针参比溶液中中间体A1峰面积的RSD而实现的，要求5针参比溶液以中间体A1峰面积计RSD应不得大于10.0%。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）空白溶液：稀释液；
3）中间体A1储备液配制：参考实施例1中中间体A1储备液的配制，所得浓度为98.1568ng/ml；
4）参比溶液配制：参考实施例1中参比溶液的配制，所得浓度为2.9447ng/ml；
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测方法，进参比溶液5针，记录谱图。
测定结果：
Figure 596532DEST_PATH_IMAGE008
实施例3 专属性
专属性是通过测定空白溶液对中间体A1检测有无干扰；加样前后，选择性溶液中中间体A1的分离度和回收率而实现的。要求空白溶液对中间体A1检测应无干扰；选择性溶液中中间体A1与相邻峰的分离度应不小于1.5；加样前后，选择性溶液中中间体A1的回收率应在70.0%~130.0%之间。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）空白溶液：稀释液；
3）中间体A1储备液：见实施例2系统适用性项下的中间体A1储备液；
4）中间体A1定位溶液（参比溶液）：见实施例2系统适用性项下的参比溶液；
5）莫西沙星S1测试溶液（定位溶液）：精密称取79.58mg莫西沙星S1置于100ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为0.7958mg/ml；
6）选择性溶液-1：精密称取79.58mg莫西沙星S1置于100ml容量瓶中，精密量取中间体A1储备液3.0ml加入到容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，所得莫西沙星S1浓度为0.7958mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；依照该法，依次配制选择性溶液-2，所得莫西沙星S1浓度为0.8025mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；选择性溶液-3，所得莫西沙星S1浓度为0.8015 mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；其中，选择性溶液引用实施例4精密度项下前三针精密度溶液。
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测方法，进空白溶液1针，中间体A1定位溶液（参比溶液）1针，莫西沙星S1测试溶液（定位溶液）1针，选择性溶液-1 1针，记录谱图。
（2）测定结果
Figure 745754DEST_PATH_IMAGE009
其中，参比溶液引用实施例2系统适用性项下前3针参比溶液，选择性溶液引用实施例4项下前3针精密度溶液，样品中带入峰面积=选择性溶液中莫西沙星S1浓度/测试溶液中莫西沙星S1浓度×测试溶液中中间体A1峰面积，回收率=（选择性溶液峰面积-样品中带入峰面积）/参比溶液平均峰面积×100
实施例4精密度
精密度是通过6份测试溶液（加标）中中间体A1测定结果的RSD而实现的，要求6份莫西沙星S1测试溶液（加标）中中间体A1测定结果的RSD应不大于10.0%。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）中间体A1储备液：见实施例2系统适用性项下的中间体A1储备液；
3）精密度溶液的配制：参考实施例3中选择性溶液配制，依次配制Precision-1，所得莫西沙星S1浓度为0.7958 mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；Precision-2，所得莫西沙星S1浓度为0.8025 mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；Precision-3，所得莫西沙星S1浓度为0.8015 mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；Precision-4，所得莫西沙星S1浓度为0.8013mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；Precision-5，所得莫西沙星S1浓度为0.8025mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；Precision-6，所得莫西沙星S1浓度为0.8055mg/ml，中间体A1浓度为2.9447 ng/ml；
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测方法，进Precision-1， Precision-2，Precision-3， Precision-4， Precision-5， Precision-6各1针，记录谱图。
测定结果：
Figure 688302DEST_PATH_IMAGE010
其中参比溶液引用实施例2系统适用性项下参比溶液。
实施例5 检测限和定量限
检测限是通过检测其响应信号与噪声之比不小于3：1而得到的，定量限由信噪比不小于10：1而得到的。在该浓度水平，重复考察6份定量限测试溶液，要求6次所得的谱图中，LOQ应不大于1.125ppm，S/N值应不小于10，6份LOQ溶液中间体A1单位浓度峰面积的RSD不大于10.0%，LOD应小于LOQ，S/N值应不小于3。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）中间体A1储备液：见实施例2系统适用性项下的中间体A1储备液；
3）定量限溶液（LOQ-1）：精密量取中间体A1储备液160.0ul 置于20ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，所得浓度为0.7853ng/ml；
4）检测限溶液：精密量取LOQ-1溶液3.0ml置于10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，所得浓度为0.2356ng/ml；
5）定量限精密度溶液配制：按照定量限溶液（LOQ-1）依次配制LOQ-2，LOQ-3，LOQ-4，LOQ-5，LOQ-6，浓度均为0.7853ng/ml；
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测方法，进LOQ-1，LOQ-2，LOQ-3，LOQ-4，LOQ-5，LOQ-6，LOD各1针，记录谱图。
测定结果
Figure 126237DEST_PATH_IMAGE011
实施例6 线性和范围
在LOQ浓度~150%限度浓度范围内均匀的取6个点，以浓度为横坐标，中间体A1峰面积为纵坐标画曲线。要求中间体A1峰面积在LOQ浓度~150%限度浓度范围内应呈线性，线性相关系数的平方（R2）应不小于0.99。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）中间体A1储备液：见实施例2系统适用性项下的中间体A1储备液；
3）线性溶液-LOQ-1：见实施例5定量限和检测限项下的LOQ-1溶液配制；
4）线性溶液-LOQ-2：见实施例5定量限和检测限项下的LOQ-2溶液配制；
5）线性溶液-LOQ-3：见实施例4定量限和检测限项下的LOQ-3溶液配制；
6）线性溶液-50%：精密量取中间体A1储备液150.0μl置于10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，浓度为1.4724 ng/ml；参照此法，依次配制线性溶液-80%，线性溶液-100%，线性溶液-120%，线性溶液-150%，浓度依次为2.3558 ng/ml，2.9447 ng/ml，3.5336ng/ml，4.4171 ng/ml。
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测方法，进线性溶液-LOQ-1，线性溶液-LOQ-2，线性溶液-LOQ-3各1针，线性溶液-50%，线性溶液-80%，线性溶液-100%，线性溶液-120%，线性溶液-150%各3针，记录谱图。
测定结果：
Figure 625482DEST_PATH_IMAGE012
实施例7 准确度
准确度系指采用该方法测定浓度与真实浓度接近的程度，是通过测定测试溶液中加入不同浓度的标准液的回收率而实现的，要求LOQ浓度、100%限度浓度、150%限度浓度下的准确度溶液中中间体A1的回收率应在70.0%~130.0%之间。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）中间体A1储备液：见实施例2系统适用性项下的中间体A1储备液；
3）准确度溶液100%-1：见实施例4精密度项下Precision-1；
4）准确度溶液100%-2：见实施例4精密度项下Precision-2；
5）准确度溶液100%-3：见实施例4精密度项下Precision-3；
6）准确度溶液配制：参考实施例3中选择性溶液-1配制方法配制，依次配制准确度溶液LOQ-1，所得莫西沙星S1浓度为0.8034 mg/ml，中间体A1浓度为0.7853ng/ml；准确度溶液LOQ-2，所得莫西沙星S1浓度为0.8019 mg/ml，中间体A1浓度为0.7853ng/ml；准确度溶液LOQ-3，所得莫西沙星S1浓度为0.8085 mg/ml，中间体A1浓度为0.7853ng/ml；准确度溶液150%-1，所得莫西沙星S1浓度为0.8015 mg/ml，中间体A1浓度为4.4171ng/ml；准确度溶液150%-2，所得莫西沙星S1浓度为0.8038 mg/ml，中间体A1浓度为4.4171ng/ml；准确度溶液150%-3，所得莫西沙星S1浓度为0.8041 mg/ml，中间体A1浓度为4.4171ng/ml；
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测条件，进准确度溶液100%-1，准确度溶液100%-2，准确度溶液100%-3，准确度溶液LOQ-1，准确度溶液LOQ-2，准确度溶液LOQ-3，准确度溶液150%-1，准确度溶液150%-2，准确度溶液150%-3各1针，记录谱图。
（2）测试结果
Figure 98052DEST_PATH_IMAGE013
其中，准确度100%溶液引用实施例4精密度项下前三针精密度溶液；参比溶液引用实施例2系统适用性项下五针参比溶液；测试溶液引用实施例3专属性项下测试溶液。
实施例8 耐用性
考察参比溶液、测试溶液和选择性溶液在室温放置一段时间后，检测结果随时间变化的规律，为检测时参比溶液和测试溶液的放置时间提供参考。
要求与0时参比溶液相比较，参比溶液在室温考察期间，中间体A1的回收率在70.0%~130.0%之间，且中间体A1无明显变化趋势，则参比溶液在室温考察期间稳定。
若测试溶液0h有检出中间体A1，测试溶液在室温放置一段时间内，测定结果变化值在中间体A1限度的20%以内，则测试溶液在室温考察期间稳定；若测试溶液0h未检出中间体A1，测试溶液在室温放置一段时间内，仍无中间体A1检出，则测试溶液在室温考察期间稳定。
选择性溶液在室温考察期间，中间体A1的回收率在70.0%~130.0%之间，且选择性溶液中间体A1无明显变化趋势，则选择性溶液在室温考察期间稳定。
（1）溶液配制
1）稀释液：乙腈；
2）中间体A1储备液-0h：见实施例2系统适用性项下中间体A1储备液；
3）参比溶液-0h：见实施例2系统适用性项下参比溶液-1；
4）测试溶液-0h：见实施例3专属性项下测试溶液；
5）选择性溶液-0h：见实施例4精密度性项下Precision-1。
6）溶液稳定性储备液配制：参考实施例1中间体A1储备液配制方法依次配制中间体A1储备液-0h，浓度为98.1568ng/ml；中间体A1储备液-1day，浓度为98.4055ng/ml；中间体A1储备液-2day，浓度为99.4503ng/m；
7）溶液稳定性参比溶液配制：参考实施例1中参比溶液配制方法依次配制参比溶液-0h，浓度为2.9447ng/ml；参比溶液-1day，浓度为2.9522ng/ml；参比溶液-2day，浓度为2.9835ng/m；
8）溶液稳定性测试溶液配制：参考实施例1中测试溶液配制方法依次配制测试溶液-0h，浓度为0.7958ng/ml；测试溶液-1day，浓度为0.8065ng/ml；测试溶液-2day，浓度为0.8031ng/m；
9）溶液稳定性选择性溶液配制：参考实施3中选择性溶液-1的配制方法依次配制选择性溶液-0h，所得莫西沙星S1浓度为0.7958mg/ml，中间体A1浓度为2.9447ng/ml；选择性溶液-1day，所得莫西沙星S1浓度为0.8052mg/ml，中间体A1浓度为2.9522ng/ml；选择性溶液-2day，所得莫西沙星S1浓度为0.8086mg/ml，中间体A1浓度为2.9835ng/ml
（2）进样
待系统稳定后，按照实施例1的检测条件，进参比溶液-0h，参比溶液-15h，参比溶液-1 day，参比溶液-2 days，测试溶液-0h，测试溶液-15h，测试溶液-1 day，测试溶液-2days，选择性溶液-0h，选择性溶液-15h，选择性溶液-1 day，选择性溶液-2 days各1针，记录谱图。其中参比溶液-15h是参比溶液-0h在室温下放置15h，测试溶液-15h是测试溶液-0h在室温下放置15h，选择性溶液-15h是选择性溶液-0h在室温下放置15h
测定结果：
Figure 211501DEST_PATH_IMAGE014
其中参比溶液-0h引用实施例2系统适用性项下的参比溶液-1；回收率（%）=稳定性参比溶液峰面积/参比溶液0h峰面积×参比溶液0h浓度/稳定性参比溶液浓度×100。
Figure 933470DEST_PATH_IMAGE015
Figure 737871DEST_PATH_IMAGE016
其中，选择性溶液-0h引用实施例4精密度项下Precision-1，回收率(％) ＝(选择性溶液峰面积-选择性溶液中带入中间体A1的峰面积)/参比溶液0h峰。

Claims (8)

1.一种加替环合酯中基因毒性杂质含量的检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱法对样品进行检测，所采用的流动相为有机溶剂-水溶液，所述的基因毒性杂质为 3-二甲氨基-2-（2 ,4 ,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯，所述的有机溶剂-水溶液为甲醇-水-甲酸三元溶剂体系，其中甲酸-水为流动相 A，所述的流动相 A 中甲酸与水的体积比为 1:800 ~ 1500，甲醇为流动相 B，使用的色谱柱为 Agilent Eclipse PlusC18 RRHD，规格为 3.0×150mm ,1.8µm，色谱洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱过程如下表所示：
Figure 115898DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱为超高效液相色谱，所述的质谱为串联质谱。
3.根据权利要求 1 ~ 2 任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：（1）溶液配制：分别配制参比溶液和测试溶液，所述的参比溶液为 3-二甲氨基-2-（2,4 , 5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯溶液；所述的测试溶液为加替环合酯样品溶液；（2）进样：待超高效液相色谱-串联质谱仪器系统稳定后，分别将空白溶液、参比溶液和测试溶液进样检测，记录谱图；所述的空白溶液为乙腈。
4.根据权利要求 3 所述的方法，其特征在于，所述参比溶液的浓度为 1ng/ml ~ 5ng/ml，所述测试溶液的浓度为 0 .5 ng/ml ~ 3ng/ml。
5.根据权利要求 4 所述的方法，其特征在于，所述的流动相 A 中甲酸与水的体积比为 1:800 ~ 1200。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的流动相 A 中甲酸与水的体积比为1:1000。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，检测方法中进样量为 0 .1μl，柱温 35℃，流速 0 .5ml/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的参比溶液的配制方法为，精密称取3-二甲氨基-2-（2 ,4 ,5-三氟-3-甲氧基-苯甲酰基）-丙烯酸乙酯对照品适量置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液适量置于另一容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液；精密量取对照品储备液适量置于容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。
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