CN108088930B - 一种喹啉羧酸乙酯或/和其有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种1‑环丙基‑6,7‑二氟‑1,4‑二氢‑8‑甲氧基‑4‑氧代‑3‑喹啉羧酸乙酯或/和有关物质的检测方法，它是采用高效液相色谱法进行检测的。本发明方法对1‑环丙基‑6,7‑二氟‑1,4‑二氢‑8‑甲氧基‑4‑氧代‑3‑喹啉羧酸乙酯含量或/和有关物质提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了终产品的安全性。

Description

一种喹啉羧酸乙酯或/和其有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及检测方法领域，特别是涉及一种喹啉羧酸乙酯或/和其有关物质的检测方法。
背景技术
喹诺酮类药物以其抗菌活性强、抗菌谱广、口服吸收好、组织分布广、生物利用度高、半衰期长、使用方便、与其他抗菌药物之间交叉耐药现象较少等特点，在临床被广泛用于治疗各种感染性疾病，年用药金额达50亿元，目前，该药物在国内医院里的用药金额仅次于β内酰胺类。被医院选用的喹诺酮类药物的主要品种有：左氧氟沙星、加替沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、莫西沙星、司帕沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、托氟沙星、芦氟沙星、诺氟沙星等，医院用药以注射剂为主。喹诺酮类药物中，左氧氟沙星是主力品种，近年受价格政策影响较大，但由于其具有较高的临床有效性和安全性，市场需求量仍然较大。第四代喹诺酮虽然上市较晚，但以其优良的产品特性，在临床使用中颇受欢迎，用药量增长迅速。
莫西沙星是第四代喹诺酮类药物的首推代表。该品由拜耳公司研制，于1999年在德国首次上市，同年12月在美国上市；2002年9月在我国上市，包括片剂和输液剂两类。莫西沙星的化学结构是母环上8位改为甲氧基，7位由二氮杂环取代的新结构。莫西沙星抗菌谱广，对革兰阴性菌和阳性菌都有效，用于呼吸道感染，对与呼吸道感染有关的细菌和草绿色链球菌可起抑制作用，比头孢呋辛和红霉素更有效，且不受β内酰胺酶的影响。
1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯是喹诺酮类药物的合成原料之一，经过硝化、还原、水解并结合侧链后可得到莫西沙星。现有技术中，未见有检测1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯或其杂质的质量检测相关研究。因此，为了更好地监控沙星类药物的产品质量，需要建立一种检测1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯或/和其有关物质行之有效的检测方法。
发明内容
1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯主要通过以下路线合成：
Figure GDA0001615107010000011
其中，式Ⅰ所示的化合物为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯，即为合成莫西沙星的起始原料。式Ⅱ所示的化合物为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯，式Ⅲ所示的化合物为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯。
在合成的过程中，发明人发现合成莫西沙星的起始原料，即1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中存在杂质α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯或3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯,同时，1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯也可能水解产生杂质1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸,且上述杂质很有可能会带入莫西沙星成品中，根据国家食品药品监督局对抗生素药物杂质的严格要求，急需一种杂质检测方法，而本发明的检测方法既能检测1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯又能检测有关物质，不用更换色谱柱和流动相，降低了检测成本，为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的质量控制带来了方便。
具体的，本发明的目的在于提供一种1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯有关物的质检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液、对照品溶液；
(2)分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测，根据高效液相色谱结果进行定性或/
和定量即可，检测条件如下：
色谱柱：十八烷基键和硅胶柱；
检测波长：210～360nm，进一步为254nm；
流动相为有机相和水相的混合物，所述水相中含有磷酸缓冲液、三乙胺，水相pH为6.0～7.0，有机相包括甲醇、乙腈中的一种，有机相：水相体积比为55：45～70：30。
进一步地，所述有关物质至少包括：α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环酸中的一种；更进一步，本发明可以同时实现对如下至少三种杂质的检测：α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸。
“磷酸缓冲液”是指含有磷酸氢根、磷酸二氢根、磷酸根中的至少两种离子的缓冲液。在本发明中，所述磷酸缓冲液进一步是指含有磷酸二氢根和磷酸根离子；更进一步地，所述磷酸缓冲液选自磷酸二氢钾或磷酸二氢钠和磷酸组合而成的缓冲液。
本发明一个具体实施方式中，水相为含5～50mmol/L磷酸二氢钾和体积百分比为0.05％～1％的三乙胺的水溶液；进一步地是，含5～0mmol/L磷酸二氢钾和体积百分比为0.1％～0.5％的三乙胺的水溶液；更进一步地，含10mmol/L磷酸二氢钾和体积百分比为0.1％的三乙胺的水溶液。
进一步地，所述有机相为甲醇。
进一步地，所述流动相中有机相：水相体积比为60～65:35～40，进一步为65:35。
进一步地，所述水相pH为6.5～6.9；进一步选自6.5～6.8。
进一步地，制备供试品溶液、对照品溶液的溶剂选自甲醇、乙腈、水的一种或多种混合物。本发明研究发现，采用甲醇作为溶剂时，对检测效果有干扰，因此，本发明中更进一步选自乙腈或乙腈和水的混合物作为溶剂。
本发明一个具体实施方式中，乙腈和水的混合物中乙腈体积含量在40％以上，例如50:50。
本发明检测波长，可以在前述公开的范围内通过常规手段进行调节选择。在寻找最佳检测波长时，可以使用紫外分光光度法、HPLC配套使用的全波段扫描等方式进行，再配合HPLC检测器的检测效果(如避免溶剂干扰等)，采用常规技术找到适宜的检测波长。本发明一个具体实施方式中，检测波长选自210～360nm，例如在254nm。
在确定了本发明色谱柱填料的基础上，色谱柱尺寸可以使用常规尺寸，即所述色谱柱长度为50～250mm，内径为2.1～4.6mm，填料的粒径为3～5μm。
本发明中，柱温、流速、进样量等参数可以在常见范围内选择。
在确保正常的保留时间、系统压力等情况下，根据色谱柱尺寸，可以适当调整流速范围，例如所述流动相的流速为0.2ml/min～1.2ml/min，进一步选自0.8～1.0ml/min，更进一步为0.8ml/min。
例如，所述色谱柱的柱温为20℃～40℃，进一步地，柱温为25℃～30℃，更进一步为30℃。
本发明还提供了一种1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液、对照品溶液；
(2)分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测，根据高效液相色谱结果对1-环丙基
-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯进行定性或/和定量即可，检
测条件如下：
色谱柱：十八烷基键和硅胶柱；
检测波长：210～360nm，进一步为254nm；
流动相为有机相和水相的混合物，所述水相中含有磷酸缓冲液、三乙胺，水相pH为6.0～7.0，有机相包括甲醇、乙腈中的一种，有机相：水相体积比为55：45～70：30。
前述有关物质各检测条件，同样适合1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的检测方法。
本发明中，对照品可以根据不同需求来进行选择，例如对有关物质的含量测定时，对照品可以是有关物质化合物；若对1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯进行含量检测，则可以使用该化合物作为对照品。前述对照品的选取是基于外标法，若采用内标法，则对照品则可以选自其他化合物，只要这个化合物能够与待检成分有效分离，且稳定，即可选用。另外，若使用指纹图谱或类似手法进行检测，则此时的对照品可以选取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯或杂质中的任一种作为参照峰，其余色谱峰均计算相对值(如相对峰面积或相对保留时间等)，建立标准图谱后，即可用于后续的检测。
本发明中定性检测，可以使用常规方法进行，例如选用对照品通过外标法进行对应分析，又或者通过HPLC将各成分分开以后，通过常规鉴定手段进行定性分析，如质谱、薄层、紫外等等。
本发明中定量检测，可以使用外标法、面积归一化法等常规方法进行含量计算。
在定量分析时，若使用外标法，采用常规手段制作标准曲线进行计算即可；但在定性分析时，则无需制作标准曲线，可以通过保留时间来判定。
当然，定性或定量同样可以选用指纹图谱法进行。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯含量或/和其有关物质如α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的高效液相色谱方法，采用本发明检测方法1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯与杂质之间的分离度高，其他有关物质不干扰杂质或含量的检测；同时，本发明方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和重复性，回收率高，检测结果准确、可靠，为监控1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中的多个杂质和其含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了终产品的安全性。
附图说明
图1为本发明检测条件下溶剂的HPLC图。
图2为本发明检测条件下限度浓度的α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图3为本发明检测条件下3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图4为本发明检测条件下1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图。
图5为本发明检测条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图。
图6为本发明检测条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图，对杂质谱进行积分。
图7为本发明检测条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质的混合溶液的HPLC图。
图8为对比试验1色谱条件下α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图9为对比试验1色谱条件下3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图10为对比试验1色谱条件下1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图。
图11为对比试验1色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图。
图12为本对比试验1色谱条件下三个杂质的混合溶液的HPLC图。
图13为对比试验2色谱条件下α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图14为对比试验2色谱条件下3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图15为对比试验2色谱条件下1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图。
图16为对比试验2色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图。
图17为本对比试验2色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和三个杂质的混合溶液的HPLC图。
图18为本对比试验3色谱条件下α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图19为本对比试验3色谱条件下3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图。
图20为本对比试验3色谱条件下1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图。
图21为本对比试验3色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图。
图22为本对比试验3色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质的混合溶液的HPLC图。
图23为本对比试验4色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品甲醇溶液的HPLC图。(甲醇做溶剂)
图24为本对比试验4色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品甲醇溶液放置4小时后进样的HPLC图。(甲醇做溶剂4H)
图25为实施例2色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液在220nm检测波长下的HPLC图。
图26为实施例2色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液在254nm检测波长下的HPLC图。
图27为实施例2色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液在318nm检测波长下的HPLC图。
图28为实施例3色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液的HPLC图。(比例40:60,1.0流速)
图29为实施例4色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液的HPLC图。(温度25℃,0.7流速)
图30为实施例5色谱条件下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质混合溶液的HPLC图。
图31为方法验证第1项下α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯的紫外光谱图。
图32为方法验证第1项下3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯的紫外光谱图。
图33为方法验证第1项下1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的紫外光谱图。
图34为方法验证第1项下1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的紫外光谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的批号为20170108；杂质α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯的批号为20170501，含量：98.3％，杂质3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯批号为20170503，含量：98.3％；杂质1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸批号为20170601，含量：99.1％；均来源于成都百裕科技制药有限公司。
式Ⅰ为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯。
式Ⅱ为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中杂质，其名称为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯。
式Ⅲ为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中杂质，其名称为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯。
式Ⅳ为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中杂质，其名称为1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸。
MS205DU型精密电子天平可购自梅特勒公司；LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，SPD-M20A DAD检测器可购自岛津公司，SIL-20A自动进样器可购自岛津公司，Empower3网络工作站可购自沃特世公司；Waters2695型高效液相色谱可购自沃特世公司；Waters Symmetry C18(250mm×4.6mm,5μm)可购自沃特世科技(上海)有限公司。
实施例1、本发明检测1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中多个杂质的高效液相色谱方法
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm5μm；
流动相：甲醇-水(10mmol/L磷酸二氢钾，含0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5)；(65:35)
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；DAD检测器。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含1mg的供试品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：取溶剂及上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1～图6。
图1为溶剂图谱，溶剂在该色谱条件下未检出干扰峰。
图2为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为9.477min。
图3为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为19.659min。
图4为1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图，其保留时间为4.807min。
图5和图6为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图，其保留时间为11.564min。
图7为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品和杂质对照品的混合溶液HPLC图，α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯的保留时间为9.502min，3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯的保留时间为19.681min，1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的保留时间为4.852min，1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯的保留时间为11.575min，杂质峰之间及杂质与主峰之间分离度均大于2，溶剂不干扰杂质的检测。方法可以用于的1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯中杂质的定性或/和定量检测。
结果表明，本发明的色谱条件下，1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯与杂质之间的分离度高，溶剂不干扰杂质检测。
对比试验1：
色谱柱：Waters Symmetry C18 4.6mm×250mm，5μm；
流动相：水-甲醇(32:68)；
溶剂：甲醇
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；DAD检测器。
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含1mg的样品溶液。
取上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含杂质1μg的混合杂质溶液。
测定法：取溶剂及上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图8～图6。
图8为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为7.875min。
图9为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为14.941min。
图10为1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图，其保留时间为8.094min。
图11为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图，其保留时间为9.383min。
图12为混合杂质溶液HPLC图，α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯的保留时间为7.881min，1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的保留时间为8.429min，这两个杂质峰之间分离度仅为0.94，且杂质峰拖尾，不利于杂质检测。
对比试验2：
色谱柱：Waters Symmetry C18 4.6mm×250mm，5μm；
流动相：水-甲醇(32:68)，水中含0.1％的三乙胺，磷酸调节pH为3.0；
溶剂：甲醇
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；DAD检测器。
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含1mg的样品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图13～图17。
图13为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为7.875min。
图14为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为14.941min。
图15为1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图，其保留时间为8.094min。
图16为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图，其保留时间为9.383min。
图17为混合溶液HPLC图，1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的保留时间为9.428min，样品的保留时间为9.393min，杂质被包裹在样品峰里面不能分离，基线有倒峰存在，不利于杂质检测。
对比试验3：
色谱柱：Waters Symmetry C18 4.6mm×250mm，5μm；
流动相：水-乙腈(60:40)，水中含10mmol/L的磷酸二氢钾和0.1％的三乙胺，磷酸调节pH为6.5；
溶剂：甲醇
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；DAD检测器。
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含1mg的样品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图18～图22。
图18为α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为16.311min。
图19为3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯对照品溶液的HPLC图，其保留时间为55.977min。
图20为1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品溶液的HPLC图，其保留时间为8.143min。
图21为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品溶液的HPLC图，其保留时间为13.970min。
图22为混合杂质溶液HPLC图，杂质之间分离度良好。
上述结果表明，本方法杂质之间以及杂质和样品峰之间分离度良好，但杂质3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯的出峰时间较晚。并且，基线不平滑，检出杂质较少。
对比试验4：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm5μm；
流动相：甲醇-水(65:35)，水中含10mmol/L磷酸二氢钾和0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5；
溶剂：甲醇
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；DAD检测器。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用甲醇溶解，配制成每1mL约含1mg的样品溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图23～图24。
图23为样品甲醇溶液的HPLC图，相对保留时间0.77处的杂质含量0.17％，杂质总量0.31％。
图24为样品甲醇溶液放置4小时进样的HPLC图，相对保留时间0.77处的杂质含量1.27％，杂质总量1.41％。
上述结果表明，在采用甲醇做溶剂时，相对保留时间0.77处杂质明显增加，在实际研究数据表明，甲醇做溶剂，样品极其不稳定，样品即使临用新配，杂质量仍有明显差异，因此，甲醇不适于为本方法检测用溶剂。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供以下实施例。
实施例2：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲醇-水(65:35)，水中含10mmol/L磷酸二氢钾和0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；DAD检测器
进样体积：20μL。
检测步骤：
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：混合溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图25～图27。
图25为混合溶液220nm波长下的HPLC图。
图26为混合溶液254nm波长下的HPLC图。
图27为混合溶液318nm波长下的HPLC图。
结果表明，采用210nm～360nm以内的检测波长进行样品的检测，均能检出这三个已知杂质和较大的未知杂质。结合杂质个数和面积归一法计算杂质总量结果比较，优选254nm进行本品检测。
实施例3：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲醇-水(60:40)，水中含10mmol/L磷酸二氢钾和0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：40℃；流速：1.0ml/min；DAD检测器。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：混合溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图28。
图28为混合溶液的HPLC图。结果表明，该条件下，杂质之间及杂质与样品峰之间分离度良好，杂质均能被准确检出。
实施例4：
色谱柱：
Figure GDA0001615107010000091
C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲醇-水(65:35)，水中含10mmol/L磷酸二氢钾和0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：25℃；流速：0.7ml/min；DAD检测器。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质1μg的对照品溶液。
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，上述杂质溶液各适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg，各杂质1μg的混合溶液。
测定法：混合溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图29。
图29为混合溶液的HPLC图。结果表明，该条件下，杂质之间及杂质与样品峰之间分离度良好，杂质均能被准确检出。
实施例5：
色谱柱：
Figure GDA0001615107010000101
C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲醇-水(65:35)，水中含20mmol/L磷酸二氢钾和0.3％三乙胺，用磷酸调pH值至6.8)；
溶剂：乙腈-水(90:10)
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；DAD检测器。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯样品适量，用溶剂稀释制成每1ml含样品1mg的样品溶液。
测定法：取样品20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图30。
图30为混合溶液的HPLC图。结果表明，该条件下，杂质之间及杂质与样品峰之间分离度良好，杂质均能被准确检出。
本发明检测方法的方法学研究
本实施例中各种试验均采用如下条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm5μm；
流动相：甲醇-水(10mmol/L磷酸二氢钾，含0.1％三乙胺，用磷酸调pH值至6.5)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；DAD检测器,检测波长254nm。
1、检测波长
取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯和杂质α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯，杂质3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯，杂质1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸对照品各适量，用溶剂溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版通则0401)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图31～34所示。
结果显示，1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯和三个杂质在200～360nm均有吸收，但样品和杂质的最大吸收波长均不一致，因此选择在200～360nm范围内选择测定波长，优选检测波长254nm作为杂质1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯有关物质测定的检测波长。
2、专属性试验
取杂质α(E)-[(二甲氨基)亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯(以下简称杂质1)，杂质3-(环丙氨基)--2-(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸乙酯(以下简称杂质2)，杂质1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸(以下简称杂质3)适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中各约含1μg的溶液，作为对照品溶液。另取1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯(以下简称喹啉羧酸乙酯)适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。分别精密取上述杂质对照品溶液、供试品溶液、混合对照品各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图1～7所示。
同时，通过破坏试验对方法专属性进行验证。
取喹啉羧酸乙酯样品10.46mg，置10ml量瓶中，加乙腈:水(50:50)稀释至刻度，摇匀，作为未降解样品溶液。
酸破坏取喹啉羧酸乙酯样品10.90mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸1ml，80℃水浴加热1h后，取出，放冷，加入0.1mol/L氢氧化钠1ml中和，加乙腈:水(50:50)稀释至刻度，摇匀即得。
碱破坏取喹啉羧酸乙酯样品11.90mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，80℃水浴加热1h后，取出，放冷，加入0.1mol/L盐酸1ml中和，加乙腈:水(50:50)稀释至刻度，即得。
氧化破坏取喹啉羧酸乙酯样品10.26mg，置10ml量瓶中，加30％过氧化氢溶液1ml，室温放置15.0小时，加乙腈:水(50:50)稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏取喹啉羧酸乙酯样品置120℃电热鼓风干燥箱加热6h，取出，精密称取10.16mg，置10ml量瓶中，加乙腈:水(50:50)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
强光破坏取喹啉羧酸乙酯样品11.17，置10ml量瓶中，加乙腈:水(50:50)溶解并稀释至刻度，置紫外灯365nm、254nm灯光照射5天，即得。
取上述溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1。
表1破坏试验结果表
破坏条件 未降解 酸破坏 碱破坏 氧化破坏 高温破坏 光破坏
杂质1 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质3 0.003％ 8.90％ 45.65％ 0.005％ 0.004％ 0.007％
其余最大单杂 0.124％ 0.110％ 0.066％ 0.124％ 0.128％ 0.125％
杂质总量 0.22％ 9.10％ 45.82％ 0.23％ 0.23％ 0.23％
主峰前分离度 5.3 5.4 2.1 5.3 5.2 5.2
主峰后分离度 3.4 3.5 1.6 3.3 3.3 3.2
降解率 0.1％ 8.8％ 45.6％ 0.0％ 0.0％ 0.0％
物料平衡 - 98％ 100％ 102％ 96％ 103％
结果表明，酸和碱破坏试验在本色谱条件中产生的杂质峰较多，但峰与峰之间均达到了基线分离，说明该色谱条件是可行的。其它破坏试验产生的杂质相对较少，所有杂质与样品峰分离度均符合要求，物料平衡在95％～105％之间，说明降解产生的杂质均能被准确检测出来，检测方法专属性好。
3、标准曲线和线性范围
精密量取喹啉羧酸乙酯及杂质1、杂志、杂质3对照品各适量，用溶剂溶解并稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果见表2。
表2、线性关系
Figure GDA0001615107010000111
Figure GDA0001615107010000121
以喹啉羧酸乙酯溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算喹啉羧酸乙酯的线性回归方程及相关系数r。结果表明，本发明检测方法中喹啉羧酸乙酯的浓度在0.054μg/mL～5.440μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝77203.5726X+622.3759，r＝1；杂质1的浓度在0.050μg/mL～5.034μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝31384.0880X+848.3545，r＝0.9999；杂质2的浓度在0.051μg/mL～5.072μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝51458.7577X-309.9378，r＝1；杂质3的浓度在0.048μg/mL～4.841μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝86071.9068X-305.1705，r＝1，证明本发明方法线性范围广，准确度高。
此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。
4、精密度试验
取实施例1第3项下浓度4﹟的对照品溶液，精密取20μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表3。
表3、精密度试验结果
Figure GDA0001615107010000122
计算得到各成分峰面积的RSD均小于2％，证明本发明的检测方法精密度优异。
5、定量限
精密量取实施例第3项下对照品溶液适量，用溶剂稀释至一定浓度的对照品溶液，精密取20μl，注入液相色谱仪，注入高效液相色谱仪，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表4。
表4、定量限试验结果
对照品名称 浓度(μg/ml) 定量限(ng)
喹啉羧酸乙酯 0.0054 0.108
杂质1 0.0252 0.504
杂质2 0.0254 0.508
杂质3 0.0049 0.098
喹啉羧酸乙酯、杂质1、杂质2、杂质3的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得喹啉羧酸乙酯的定量限为0.108ng，杂质1定量限为0.504ng，杂质2定量限为0.508ng，杂质3定量限为0.098ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足含量测定的要求。6、重复性试验
精密称取喹啉羧酸乙酯6份，各约100mg，分别置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各20μL，按照本发明的检测方法进行检测，按面积归一法和外标法加自身对照法以峰面积分别计算杂质的含量，结果见表5～7。
表5、重复性试验结果(面积归一法)
样品编号 1 2 3 4 5 6
杂质1 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质3 0.003％ 0.003％ 0.003％ 0.004％ 0.003％ 0.003％
其他单个杂质 0.11％ 0.11％ 0.11％ 0.11％ 0.11％ 0.11％
杂质总量 0.19％ 0.18％ 0.18％ 0.18％ 0.18％ 0.17％
杂质个数 7 7 7 7 7 7
表6、重复性试验结果(外标法)
样品编号 1 2 3 4 5 6
杂质1 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质3 0.002％ 0.002％ 0.002％ 0.003％ 0.002％ 0.002％
表7、重复性试验结果(自身对照法)
Figure GDA0001615107010000131
Figure GDA0001615107010000141
由上述结果可知，无论采用外标法、面积归一法和自身对照法，6份样品结果均无明显差异，本发明检测方法的重复性良好，杂质计算可采用外标法、面积归一法和自身对照法任一形式计算。
7、溶液稳定性试验
精密称取喹啉羧酸乙酯100.26mg，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h进样20μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中杂质的稳定性情况，结果见表8。
表8、供试品溶液稳定性试验结果表
放置时间 0h 2h 4h 6h 8h
杂质1 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
杂质3 0.003％ 0.003％ 0.004％ 0.007％ 0.008％
其他单个杂质 0.10％ 0.10％ 0.10％ 0.10％ 0.10％
杂质总量 0.19％ 0.19％ 0.19％ 0.20％ 0.20％
杂质个数 7 7 7 7 7
由上述结果可知，在配制后4小时内供试品溶液较稳定，4小时后杂质3略有增加，证明本发明检查方法供试品溶液4小时内稳定。
8、回收率试验
精密称取喹啉羧酸乙酯9份，各约100mg，分别置10mL量瓶中，加入实施例第3项下浓度1﹟对照品溶液1mL、2mL、3mL各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及实施例第4项下的对照品溶液各20μL进样测定，记录色谱图，计算各杂质的测得量、对照品加入量及回收率，结果见表9～11。
计算公式：
Figure GDA0001615107010000142
式中：a为供试品中所含杂质的量(μg)；
b为杂质对照品加入量(μg)；
c为杂质的测得量(μg)。
表9、杂质1回收率试验结果
Figure GDA0001615107010000143
Figure GDA0001615107010000151
表10、杂质2回收率试验结果
Figure GDA0001615107010000152
表11、杂质3回收率试验结果
Figure GDA0001615107010000153
结果表明，本发明检测方法测定喹啉羧酸乙酯中的杂质，杂质1回收率在95.32％～100.46％之间，相对标准偏差为1.78％；杂质2回收率在96.59％～100.72％之间，相对标准偏差为1.50％；杂质3回收率在95.85％～100.55％之间，相对标准偏差为1.84％；证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
综上所述，本发明提供了一种喹啉羧酸乙酯中杂质检测及含量测定的高效液相色谱方法，喹啉羧酸乙酯与杂质之间的分离度高，溶剂不干扰杂质的检测；同时，本发明方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控沙星类药物起始原料中的杂质含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了终产品如莫西沙星类药物的安全性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (14)

1.一种1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，包括如下步骤：
（1）制备供试品溶液、对照品溶液；
（2）分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测，根据高效液相色谱结果对有关物质 进行定性或/和定量即可，检测条件如下：
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；
检测波长：210~360nm；
流动相为有机相和水相的混合物，所述水相中含有磷酸缓冲液和体积百分比为 0.1%~0.5%的三乙胺，水相 pH 为 6.5~6.8，有机相为甲醇，有机相：水相体积比为 60~65:35~40，等度洗脱；
所述有关物质包括α（E）-[（二甲氨基）亚甲基]-2,4,5-三氟-3-甲氧基-β-氧-苯丙酸乙酯、3-（环丙氨基）-2（2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酰基）丙烯酸乙酯、1-环丙基-6,7二氟-1,4-二氢-8-甲氧基 -4-氧代-3-喹啉羧酸三种；
所述磷酸缓冲液中含有磷酸二氢根和磷酸根离子，水相中磷酸二氢根和磷酸根离子的总浓度为5~30mmol/L；
制备供试品溶液、对照品溶液的溶剂选自乙腈或乙腈和水的混合物，乙腈和水的混合物中乙腈体积含量在40%以上。
2.根据权利要求 1 所述的检测方法，其特征在于，检测波长为254nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液选自磷酸二氢钾或磷酸二氢钠和磷酸组合而成的缓冲液。
4.根据权利要求 1 所述的检测方法，其特征在于，水相为含 5~30mmol/L 磷酸二氢钾和体积百分比为 0.1%~0.5%的三乙胺的水溶液。
5.根据权利要求 4所述的检测方法，其特征在于，水相为含 10mmol/L 磷酸二氢钾和体积百分比为 0.1%的三乙胺的水溶液。
6.根据权利要求 1 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相中有机相：水相体积比为65:35。
7.根据权利要求 1 所述的检测方法，其特征在于，乙腈和水的混合物中乙腈体积含量为 50%。
8.根据权利要求 1 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱长度为50~250mm，内径为 2.1~4.6mm，填料的粒径为 3~5μm。
9.根据权利要求 8 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱长度为250mm，内径4.6mm，填料的粒径为 5µm。
10.根据权利要求 1 所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为 0.2ml/min～1.2ml/min；所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20℃~40℃。
11.根据权利要求 10 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8~1.0ml/min。
12.根据权利要求 11所述的有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8 ml/min。
13.根据权利要求 12 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱的柱温为25℃~30℃。
14.根据权利要求 13 所述的有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱的柱温为30℃。
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