CN114113355B - Hplc法分离检测加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种利用高效液相色谱法分析加替羧酸乙酯及相关杂质的方法。所述方法采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，采用缓冲盐溶液和有机溶剂进行梯度洗脱，流速为0.9～1.1ml/min，柱温为18～22℃；检测波长为220nm或250nm；可在42分钟内将盐酸莫西沙星起始原料加替羧酸乙酯中可能存在的7个已知杂质有效分离并进行准确定量，且起始原料中可能存在的其他2个已知杂质与这7个已知杂质分离效果好，对于杂质的鉴别及定量检测无干扰，提供了现有技术未能解决的加替羧酸乙酯中已知杂质的分离测定问题；分析方法灵敏度高；专属性强；重现性好；操作简单可行。

Description

HPLC法分离检测加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种利用高效液相色谱法分析加替羧酸乙酯及相关杂质的方法。
背景技术
莫西沙星是一种近乎白色晶体粉末的化学品，分子式为C21H24FN3O4，氟喹诺酮类抗菌药。DNA拓扑异构酶抑制剂，可用于治疗金葡菌、流感杆菌、肺炎球菌等引起的社会获得性肺炎，慢性支气管炎急性发作，急性窦炎等。属第四代喹诺酮类抗菌药物，是新一代抗菌谱广的抗生素。该品对常见的呼吸道病菌，如肺炎链球菌、嗜血流感杆菌、卡他莫拉汉菌以及部分金黄色葡萄球菌都具有很强的抗菌活性.特别是对肺炎链球菌，抗菌作用强大。临床用于治疗急性窦腺炎、慢性支气管炎的急性发作、社区获得性肺炎，以及无并发症的皮肤感染和皮肤软组织感染。本品特点是几乎没有光敏反应，具有良好的组织穿透力，在肺组织中也可达到很高浓度，是治疗呼吸道感染较好的药物。
加替羧酸乙酯为莫西沙星关键起始原料，对加替羧酸乙酯的质量把控有利于保障莫西沙星药物的质量。根据其合成工艺路线，加替羧酸乙酯中可能存在以下共计9个杂质。：
Figure BDA0002659089450000011
/>
Figure BDA0002659089450000021
而目前暂无相关文献或资料有公开对上述加替羧酸乙酯以及9杂质进行分离并测定其中7种杂质含量的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种利用HPLC法分离加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，通过该方法可以有效分离相关物质。
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
HPLC法分离加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述加替羧酸乙酯和/或相关杂质进行分离；所述相关杂质为杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j、杂质MOXH-SM1f、杂质MOXH-SM1i中的一种或多种；所述加替羧酸乙酯、相关杂质的结构式具体如下：
Figure BDA0002659089450000031
所述流动相A为缓冲盐溶液，流动相B为有机溶剂；
进一步，所述缓冲盐溶液为六氟磷酸钾溶液和三乙胺的混合溶液，所述缓冲盐溶液pH为2.8～3.2；
具体的，所述缓冲盐溶液pH为3.0；
进一步，所述缓冲盐溶液中六氟磷酸钾质量浓度为0.005～0.05mol/L，所述缓冲盐溶液中三乙胺体积百分比为0.05～5.0％。
具体的，所述缓冲盐溶液中六氟磷酸钾质量浓度为2.0g/L，所述缓冲盐溶液中三乙胺体积百分比为0.3％；
进一步，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇中的一种或多种；
具体的，所述有机溶剂为乙腈；
进一步，所述梯度洗脱具体为：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％
0 53-57 43-47
15 55 45
35 20 80
35.1 55 45
42 55 45
；
具体的所述梯度洗脱具体为：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％
0 55 45
15 55 45
35 20 80
35.1 55 45
42 55 45
；
进一步，所述方法中流动相流速为0.9～1.1ml/min；所述方法中色谱柱柱温为18～22℃；
具体的，所述方法中流动相流速为1.0ml/min；所述方法中色谱柱柱温为20℃。
本发明目的之二是提供一种鉴定加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，该方法有效鉴定相关物质；
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
HPLC法鉴定加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，利用目的一中所述方法将所述加替羧酸乙酯和/或相关杂质进行分离，通入检测器中进行检测；所述相关杂质为目的一中所述相关杂质；将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，鉴定检测物中是否含有所述加替羧酸乙酯和/或相关杂质；所述检测器检测波长为205～340nm；
具体的，当鉴定杂质MOXH-SM1e时，所述检测器检测波长为220nm；当鉴定所述相关杂质不含杂质MOXH-SM1e时，所述检测器检测波长为250nm。
本发明目的之三是提供一种利用HPLC法测定加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种含量的方法；该方法可有效测定相关物质的含量，并控制测定时间；
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
HPLC法测定加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种的方法，利用目的一中所述方法将所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种进行分离，在检测波长为220nm或250nm的检测器中进行检测得到色谱图，根据得到的峰面积，计算所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种的含量；
具体的，所述杂质MOXH-SM1e的检测波长为220nm，所述相关杂质中其余杂质检测波长为250nm；
进一步所述方法具体步骤如下：
S1：试剂配制
取供试样品溶于稀释剂，得供试品溶液；取对照品溶于稀释剂，得对照品溶液；将配制好的试剂放入控温2～8℃的进样盘中；
S2：分离
利用目的一中所述方法，将所述替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种进行分离；
S3：鉴定
利用目的2中所述方法，鉴定检测物中是否含有所述替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种；
S4：含量计算
根据得到的色谱图，测量峰面积，计算所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种的含量；
具体的，所述稀释剂为水和乙腈。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的分析方法可在42分钟内将盐酸莫西沙星起始原料加替羧酸乙酯中可能存在的9个已知杂质有效分离，并对其中7个已知杂质进行准确定量，提供了现有技术未能解决的加替羧酸乙酯中已知杂质的分离测定问题；
2.本发明提供的分析方法灵敏度高；专属性强；重现性好；操作简单可行；
3.本发明提供的分析方法准确分离测定盐酸莫西沙星起始原料加替羧酸乙酯中可能存在的杂质，为保证和提高盐酸莫西沙星药物质量提供保障。
附图说明
图1：专属性(耐用性正常条件)250nm的HPLC色谱图；
图2：专属性(耐用性正常条件)220nm的HPLC色谱图；
图3：检测限250nm的HPLC色谱图；
图4：检测限220nm的HPLC色谱图；
图5：耐用性1 250nm的1HPLC色谱图；
图6：耐用性1 220nm的1HPLC色谱图；
图7：耐用性2 250nm的1HPLC色谱图；
图8：耐用性2 220nm的1HPLC色谱图；
图9：耐用性3 250nm的1HPLC色谱图；
图10：耐用性3 220nm的1HPLC色谱图；
图11：耐用性4 250nm的1HPLC色谱图；
图12：耐用性4 220nm的1HPLC色谱图；
图13：耐用性5 250nm的1HPLC色谱图；
图14：耐用性5 220nm的1HPLC色谱图；
图15：耐用性6 250nm的1HPLC色谱图；
图16：耐用性6 220nm的1HPLC色谱图；
图17：耐用性7 250nm的1HPLC色谱图；
图18：耐用性7 220nm的1HPLC色谱图；
图19：耐用性8 250nm的1HPLC色谱图；
图20：耐用性8 220nm的1HPLC色谱图；
图21：耐用性9 250nm的1HPLC色谱图；
图22：耐用性9 220nm的1HPLC色谱图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
取本品适量，精密称定，加稀释剂[水-乙腈(1:1)]溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液(配制好后立即放入控温5℃的进样盘中)；精密量取5.0ml置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取2.0ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。用十八烷基键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；以缓冲盐(称取六氟磷酸钾2.0g，加水1000ml溶解，加入三乙胺3.0ml，用磷酸调节pH 3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱，检测波长分别为250nm和220nm(杂质MOXH-SM1e的测定波长为220nm，其余杂质检测波长为250nm)；流速为每分钟1.0ml；柱温为20℃。精密称取杂质MOXH-SM1b及SM1系统适用性对照品(含MOXH-SM1、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1i、杂质MOXH-SM1f、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j、杂质MOXH-SM1a)各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含杂质MOXH-SM1b 4μg和SM1系统适用性对照品1mg的混合溶液，摇匀，作为系统适用性溶液(配制好后立即放入控温5℃的进样器中)。取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1i、SM1、杂质MOXH-SM1f、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j、杂质MOXH-SM1a顺序出峰，杂质MOXH-SM1b与杂质MOXH-SM1m间分离度应满足要求。精密量取供试品溶液、对照溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按加校正因子的主成分对照法计算各已知杂质及其他单个杂质含量。
表1梯度洗脱表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 55 45
15 55 45
35 20 80
35.1 55 45
42 55 45
实施例2
专属性
SM1中可能存在的杂质：杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j、杂质MOXH-SM1f、杂质MOXH-SM1i共计9个杂质，本方法中将对杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j共7个杂质进行研究。分别取空白溶液、各杂质定位溶液、供试品溶液、混合溶液各10μl，依次进样，记录色谱图，测定结果见表2-4，附图1-2。
表2专属性250nm HPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000091
表3专属性220nm HPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000092
Figure BDA0002659089450000101
表4专属性试验测定结果
Figure BDA0002659089450000102
结论：空白溶液不干扰各已知杂质及其他单个杂质的检测，各已知杂质间分离度均大于1.5，杂质MOXH-SM1i和杂质MOXH-SM1f与主峰间分离度均大于1.5，方法专属性符合要求。
实施例3
检测限
取检测限溶液连续进样3次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。试验结果见表5-7，附图3-4。
表5检测限250nm HPLC色谱图
Figure BDA0002659089450000111
表6检测限220nm HPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000112
/>
表7检测限测定结果
Figure BDA0002659089450000113
Figure BDA0002659089450000123
结论：杂质MOXH-SM1e检测限浓度为0.069μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为3.8；杂质MOXH-SM1g检测限浓度为0.067μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为11.2；杂质MOXH-SM1b检测限浓度为0.073μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为12.5；杂质MOXH-SM1m检测限浓度为0.065μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为19.6；杂质MOXH-SM1h检测限浓度为0.066μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为15.1；杂质MOXH-SM1j检测限检测浓度为0.066μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为6.8；杂质MOXH-SM1a检测限检测浓度为0.067μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为9.8；SM1检测限检测浓度为0.067μg/ml，以样品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为19.0，均符合检测限检测要求。
实施例4
色谱条件耐用性
取杂质供试品混合溶液，分别使用正常流动相，预定测试的不同流动相比例、柱温、柱流速以及同型号不同批次色谱柱进行测试，待仪器系统稳定后分别测试，记录各峰间的分离度，试验结果见表2-3、8-26，附图1、5-22。
表8耐用性1 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000131
表9耐用性1 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000132
表10耐用性2 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000133
/>
Figure BDA0002659089450000141
表11耐用性2 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000142
表12耐用性3 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000143
/>
Figure BDA0002659089450000151
表13耐用性3 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000152
表14耐用性4 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000153
Figure BDA0002659089450000161
表15耐用性4 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000162
表16耐用性5 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000163
表17耐用性5 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000171
表18耐用性6 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000172
表19耐用性6 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000173
/>
Figure BDA0002659089450000181
表20耐用性7 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000182
表21耐用性7 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000183
/>
Figure BDA0002659089450000191
表22耐用性8 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000192
表23耐用性8 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000193
Figure BDA0002659089450000201
表24耐用性9 250nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000202
表25耐用性9 220nmHPLC色谱图积分结果
Figure BDA0002659089450000203
Figure BDA0002659089450000211
表26色谱条件变化耐用性试验测定结果
Figure BDA0002659089450000212
结论：色谱条件有微小波动时，各杂质间分离度均大于1.5，杂质MOXH-SM1i及杂质MOXH-SM1f与主峰间分离度均大于1.3，方法耐用性符合要求。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.HPLC法分离加替羧酸乙酯和相关杂质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述加替羧酸乙酯和相关杂质进行分离；所述相关杂质为杂质MOXH-SM1f和杂质MOXH-SM1i组成的杂质组合物和/或其它杂质，所述其它杂质包括杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h、杂质MOXH-SM1j中的一种或多种；所述加替羧酸乙酯、相关杂质的结构式具体如下：
Figure FDA0004186425180000011
所述流动相A为缓冲盐溶液，流动相B为有机溶剂；所述缓冲盐溶液为六氟磷酸钾溶液和三乙胺的混合溶液，所述缓冲盐溶液pH为2.8～3.2；所述缓冲盐溶液中六氟磷酸钾质量浓度为0.005～0.05mol/L，所述缓冲盐溶液中三乙胺体积百分比为0.05～5.0％；所述有机溶剂为乙腈，所述梯度洗脱具体为：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％ 0 53-57 43-47 15 55 45 35 20 80 35.1 55 45 42 55 45
。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述方法中流动相流速为0.9～1.1ml/min；所述方法中色谱柱柱温为18～22℃。
3.HPLC法鉴定加替羧酸乙酯和相关杂质的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述方法将所述加替羧酸乙酯和相关杂质进行分离，通入检测器中进行检测；所述相关杂质为权利要求1中所述相关杂质；将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，鉴定检测物中是否含有所述加替羧酸乙酯和相关杂质；所述检测器检测波长为205～340nm。
4.HPLC法测定加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述方法将所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j进行分离，在检测波长为220nm下检测杂质MOXH-SM1e，在250nm下检测剩余杂质得到色谱图，根据得到的峰面积计算所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j的含量，所述杂质MOXH-SM1e的检测波长为220nm，所述相关杂质中其余杂质检测波长为250nm。
5.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
S1：试剂配制
取供试样品溶于稀释剂，得供试品溶液；取对照品溶于稀释剂，得对照品溶液；将配制好的试剂放入控温2～8℃的进样盘中；
S2：分离
利用权利要求1中所述方法，将所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j进行分离；
S3：鉴定
利用权利要求3中所述方法，鉴定检测物中是否含有所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j；
S4：含量计算
根据得到的色谱图，根据峰面积，测量所述加替羧酸乙酯、杂质MOXH-SM1a、杂质MOXH-SM1b、杂质MOXH-SM1e、杂质MOXH-SM1m、杂质MOXH-SM1g、杂质MOXH-SM1h和杂质MOXH-SM1j的含量。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为水和乙腈。
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