CN110785417B - 膜铁转运蛋白抑制剂盐 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式(I)化合物的新盐，包含它们的药物组合物及其作为药物的用途，特别是用作膜铁转运蛋白抑制剂，更特别地用于预防和/或治疗疾病由缺乏铁调素或铁代谢紊乱引起的，例如特别是铁过载状态，例如特别是地中海贫血症，镰状细胞病和血色素沉着症。
Description
技术领域
本发明涉及通式(I)化合物的新盐、包含其的药物组合物及其作为药物的用途，特别是用作膜铁转运蛋白抑制剂，更特别地是用于预防和/或治疗疾病由缺乏铁调素或铁代谢紊乱引起的疾病，例如特别是铁过载状态，例如特别是地中海贫血症、镰状细胞病和血色素沉着症。
背景技术
铁几乎是所有生物体的必需微量元素，并且特别是与生长和血液形成相关。在这种情况下，铁代谢的平衡主要受到衰老红细胞中的血红蛋白和膳食铁的十二指肠吸收的铁回收水平来调节。所释放的铁通过肠道吸收，特别是通过特定的转运系统(DMT-1，膜铁转运蛋白)，转移到血液循环中，从而输送到适当的组织和器官(转铁蛋白，转铁蛋白受体)。
在人体中，元素铁非常重要，尤其是用于氧运输，氧摄取，细胞功能如线粒体电子传递，认知功能等，并最终用于整个能量代谢。
平均而言，人体含有4至5克的铁，其存在于酶，血红蛋白和肌红蛋白中，以及以铁蛋白和含铁血黄素形式存在的贮存铁或储备铁。大约一半的这种铁(约2g)是以血红素铁的形式存在的，其结合在红细胞的血红蛋白中。由于这些红细胞仅具有有限的寿命(75-150天)，因此必须连续形成新的红细胞以及降解老的红细胞(每秒形成超过两百万个红细胞)。这种高的再生能力是通过巨噬细胞吞噬并裂解老化的红细胞，并因此将由此获得的铁再循环以用于铁代谢来实现的。以这种方式提供红细胞生成所需的大部分铁，每天约25mg。
成人每天的铁需求介于每天0.5至1.5mg之间，婴儿和怀孕期间的妇女则每日需要2至5mg的铁。例如通过皮肤和上皮细胞的脱落所造成的每日的铁损耗是很低的。铁损耗的增加例如发生在女性月经出血期间。一般而言，失血会显著地减少铁水平，因为每2ml血液会流失约1mg铁。在健康成人中，约1mg铁的正常每日损耗通常可以通过每日的食物摄取来替代，从而使每日铁需求再次平衡至适当的水平。
铁水平由吸收存在于食物中的铁来调节，吸收率在介于6和12％之间，在缺铁的情况下高达25％。吸收率由生物根据铁需求和铁储存的规模来调节。在该过程中，人的机体既利用二价铁离子也利用三价铁离子。通常，铁(III)化合物在足够酸的pH值下溶解于胃中，从而可供吸收。铁的吸收在小肠上部中通过黏膜细胞来进行。在该过程中，三价非血红素铁首先在肠细胞膜中例如通过铁还原酶(膜结合的十二指肠细胞色素b)被还原为Fe(II)以供吸收，从而使其随后能够通过转运蛋白DMT1(二价金属转运体1)被转运至肠细胞中。相对地，血红素铁穿过细胞膜进入肠上皮细胞而无任何改变。在肠上皮细胞中，铁或者作为贮存铁储存在于铁蛋白中，或者通过转运蛋白膜铁转运蛋白释放到血液中。铁调素在此过程中扮演核心角色，因为它是铁吸收的关键调节因子。通过膜铁转运蛋白转运到血液中的二价铁通过氧化酶(血浆铜蓝蛋白、膜铁转运辅助蛋白)转换成三价铁，该三价铁随后通过转铁蛋白被转运到机体中的相关位置(见，举例来说，"Balancingacts:molecular control ofmammalian iron metabolism".M.W.Hentze,Cell 117,2004,285-297.)。
哺乳动物的机体无法主动排出铁。铁代谢基本上由铁调素通过来自巨噬细胞，肝细胞和肠上皮细胞的铁的细胞释放来控制。
铁调素是肝中产生的肽类激素。尽管已发现两种氨基端截短的形式，即铁调素-22和铁调素-20，但是主要的活性形式具有25个氨基酸(见，举例来说：“Hepcidin,a keyregulator of iron metabolism and mediator of anaemia of inflammation”.T.Ganz,Blood,102,2003,783-8)。铁调素作用于通过肠和胎盘的铁吸收以及源自网状内皮系统的铁释放。在体内，铁调素在肝中由所谓的前铁调素所合成，前铁调素由所谓的HAMP基因所编码。铁调素形成的调节与机体中铁的水平直接相关，即，假使机体有足够的铁和氧供应，则形成较多的铁调素，而假使铁和氧的水平低，或者在红细胞生成增加的情况下，则形成较少的铁调素。在小肠黏膜细胞和巨噬细胞中，铁调素和转运蛋白膜铁转运蛋白结合，其通常将吞噬回收的铁从细胞内部运输至血液中。
转运蛋白膜铁转运蛋白是由571个氨基酸组成的跨膜蛋白，其形成于肝、脾、肾、心脏、肠和胎盘中。特别是，膜铁转运蛋白定位于肠上皮细胞的基底外侧膜中。以这种方式结合的膜铁转运蛋白于是用于将铁输出至血液中。在此情况下，膜铁转运蛋白最有可能以Fe2+的形式来转运铁。假使铁调素与膜铁转运蛋白结合，则膜铁转运蛋白被转运至细胞内部，在该处其发生分解，使得从细胞中吞噬回收的铁的释放随后几乎完全被阻断。假使该膜铁转运蛋白例如被铁调素失活，使得其不能输出储存在黏膜细胞中的铁，则所储存的铁便随着细胞的自然脱落经由粪便而损失。因此，当膜铁转运蛋白例如被铁调素失活或抑制时，可以减少肠中的铁吸收。此外，膜铁转运蛋白显著地定位在网状内皮系统(RES)中，巨噬细胞也属于该系统。当铁代谢受到慢性炎症损害时，铁调素就在这里发挥重要作用。在发炎的情况下，尤其是白细胞介素-6会增加，引发铁调素水平的增加。结果，更多的铁调素与巨噬细胞的膜铁转运蛋白结合，于是阻断储存铁的释放，最终导致炎症性贫血(ACD或AI)。
另一方面，假使血清铁水平降低，则肝脏的肝细胞中的铁调素生成减少，使得释放更少的铁调素，据此更少的膜铁转运蛋白被失活，从而容许更大量的储存铁运输到血清中。
由此显而易见的是，铁调素-膜铁转运蛋白系统直接调节铁代谢，因此铁调素调节机制的紊乱对机体的铁代谢具有直接效应。原则上，铁调素-膜铁转运蛋白调节机制通过以下两个相反的原理起作用：
一方面，铁调素的增加导致膜铁转运蛋白的失活，于是阻断了储存铁从细胞释放到血清中，于是降低了血清中的铁水平。在病理情况下，血清铁水平的降低导致血红蛋白水平降低，红细胞生成降低，于是导致缺铁性贫血。
另一方面，铁调素的减少导致活性膜铁转运蛋白的增加，于是容许储存铁加强释放并加强例如从食物中的铁的摄取，于是增加了血清的铁水平。在病理情况下，铁水平的增加导致铁过载。
铁的过载状态和疾病的特征在于铁水平过量。其中，问题出在导致非转铁蛋白结合铁(NTBI)的血清铁水平过量。NTBI被器官迅速地非特异性摄取，导致铁在组织和器官中积累。铁过载导致许多疾病和不需要的医疗状况，包括心脏、肝脏和内分泌的损害。再者，在罹患神经退化性疾病中，例如在阿兹海默症和帕金森氏症的患者中已经观察到了铁在脑中的积累。作为过量游离铁的尤其有害的方面，必须提到不需要的自由基形成。特别是，铁(II)离子催化形成活性氧族(ROS)(特别是通过芬顿反应)。这些ROS导致对DNA、脂质、蛋白质和碳水化合物的损害，其在细胞、组织和器官中具有深远的效应。ROS的形成是众所周知的，并在文献中描述为是导致所谓的氧化应激的原因。
用于治疗铁过载的迄今建立良好的现有方法是基于通过增加的铁从体内的移除来减少血清中铁的量的概念。对在其他方面健康的人体进行的最早已知且仍然常规的治疗方法包括定期的静脉切开术(放血)。当首次诊断时，静脉切开术通常安排得相当频繁，例如每周一次，直到铁水平达到正常范围为止，接着取决于患者的铁负载的速率，随后安排每月或每三个月一次进行静脉切开术。
对于无法耐受常规抽血的患者来说，有螯合剂可供使用。举例来说，去铁胺(deferoxamine)(也称为去铁敏B，N'-{5-[乙酰基(羟基)氨基]戊基}-N-[5-({4-[(5-氨基戊基)(羟基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)戊基]-N-羟基琥珀酰胺或
)是一种细菌载铁体，其是已建立的用于螯合疗法的药物。作为螯合剂的去铁胺在血流中结合铁，并通过尿和粪便增加了铁的排除。慢性铁过载的典型治疗需要每天8-12小时的皮下注射。去铁敏B盐的肠胃外可注射组合物例如描述于WO1998/25887中。
两种较新的药物为地拉罗司和去铁酮，其被许可用于接受常规输血的患者中以治疗地中海贫血症，但这会导致发展为铁过载。
例如描述于WO1997/49395中的地拉罗司(
4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)苄酸)以及去铁酮(/>
3-羟基-1,2-二甲基吡啶-4(1H)-酮)同样起到铁螯合剂的作用，于是适宜作为铁螯合疗法的药物。
已有描述起到用于治疗铁过载的铁螯合物作用的另外的化合物。举例来说，WO2013/142258涉及二亚乙基三胺五乙酸酯(DTPA)和锌盐的囊封颗粒。WO2003/041709涉及作为铁螯合物的4-羟基-2-烷基喹啉，例如4-羟基-2-壬基喹啉。WO1998/09626涉及以含有二硫代氨基甲酸酯的组合物为基础的用于治疗铁过载状态的螯合剂。
WO2015/077655涉及用于治疗铁过载疾病的式(A)或(J)的去铁硫素衍生物
根据WO2015/077655，已发现该去铁硫素衍生物起到铁螯合剂的作用。
WO2005/051411涉及基于根据下式的欧沙切林(oxachelin)及其衍生物的新的抗生素或抗真菌剂
其被描述为可起到铁螯合物的作用并用于治疗铁过载疾病。
由螯合疗法治疗铁过载的缺点是在已发生铁过载时从身体移除螯合的铁，而非预防该病症的发生。再者，已经知道，已建立的用于铁螯合疗法的药物显示出潜在毒性。
可以预期，尤其是随着基础机制知识的增多和基于此类知识所发展起来的适当的治疗方法，现代疗法会日益取代此方法。对铁代谢中的生化调节途径具有抑制或支持效果的铁调素激动剂或化合物基本上可以从现有技术中获知。
举例来说，假使铁调素表达被阻断，那么例如由于遗传缺陷可发生铁过载，例如已知的铁过载疾病血色素沉着症。血色素沉着症是由控制铁调素合成的基因或铁调素基因本身的突变所导致的铁过载疾病。在这类患者中铁调素的水平低或没有会导致活性膜铁转运蛋白的量增强，使得膳食铁的吸收增加，导致严重的铁过载，其会导致心脏、肝脏和内分泌的损害。在铁调素敲除小鼠(一种2型(幼年)血色素沉着症模型)中，已显示出铁调素模拟肽(即同样地结合并失活膜铁转运蛋白的肽)有效地逆转了组织铁的累积(Ramos et al.,Blood 2012)。
在已知的铁过载疾病β-地中海贫血症中，β珠蛋白基因的突变导致血红素生成减少以及无效红细胞生成，由于骨髓中发育的红细胞的损伤和死亡而不能产生足够数量的红细胞。这导致红细胞生成速率上调和铁调素水平的降低，使得更多的铁可用于增加红细胞生成活性。由于铁调素水平降低，这种不良反应导致铁过载，这导致活性膜铁转运蛋白的量提高，使得膳食铁的吸收增加，如上文所述。由于α-和β-血红蛋白亚基的比例不平衡的毒性，地中海贫血症的红细胞具有缩短的半衰期。再者，在β-地中海贫血症的治疗中，已经描述了铁调素模拟肽的使用，基于铁调素活性增加使铁受限和铁降低的治疗原理介导了红细胞的损害。将铁调素模拟肽向th3/+小鼠(一种非输血依赖性β-地中海贫血症模型)给药，致使无效红细胞生成得以缓解，增加了红细胞的存活时间并改善了贫血。在此模型中，由于膳食铁吸收的减少而预防了铁过载成为铁调素模模拟疗法中的额外益处(Gardenghi et al,2010；Casu et al,2013)。
所述的治疗方式基于通过提供铁调素模拟物或铁调素激动剂的铁调素初级调节的直接作用以直接参与干扰铁代谢途径，即起到一种铁调素替代物或供应物的意义上的作用。该方式是基于通过铁调素-失活机制抑制膜铁运输蛋白，从而阻断过量铁吸收来治疗铁过载(即过量血清铁水平)的治疗原理。
另外的已知铁过载相关疾病为与无效性红细胞生成有关联的疾病，例如骨髓发育不良综合征(还称为MDS或骨髓增生异常)、真性红细胞增多症等等。
再者，涉及感知全身性铁储存的基因(例如铁调素(Hamp1)、血色素沉着症蛋白(HFE)、铁调素调节蛋白(HJV)和转铁蛋白受体2(TFR2))的突变可导致小鼠和人类的铁过载。据此，可述及与HFE和基因突变相关的疾病、慢性溶血相关疾病、镰状细胞疾病、红细胞膜病症，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD缺乏症)、红细胞生成性卟啉病(erythrpoietic porphyria)和瑞克氏运动失调症(Friedrich’s Ataxia)。再者，铁过载亚群包含输血铁过载、铁中毒、肺含铁血黄素沉着症(pulmonary hemosiderosis)、骨质缺乏、胰岛素抵抗症、非洲型铁过载、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervordan Spatz disease)、高铁蛋白血症、血浆铜蓝蛋白缺乏症、新生儿血色素沉着症，以及包含地中海贫血、α地中海贫血、中间型地中海贫血、镰状细胞疾病和骨髓增生异常综合征的红细胞病症也包括在内。
与升高的铁水平有关的另外的疾病和/或病症和/或罹病状况包括但不限于，带有升高铁水平的疾病，包含运动失调、瑞克氏运动失调症、年龄相关性黄斑变性、年龄相关性白内障、年龄相关性视网膜疾病和神经退行性疾病，其中此类神经退行性疾病包含阿兹海默症、帕金森氏症、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病、不宁腿综合征和亨廷顿舞蹈病。
铁调素是宿主防御肽，代表了响应侵入机体的先天免疫统的组分。
已描述过许多细菌高度依赖于来自宿主的铁供应(所谓的嗜铁性生物)，并具有从局部组织捕获铁的演化机制。由膜铁转运蛋白-抑制剂限制此类生物可获取铁量的能力可代表有效的辅助疗法。一种此类的嗜铁性生物是创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，其导致沿海社区罕见但极严重的传染病，通常发生在具有未确诊的铁过载的主体中。对已接种致死剂量的创伤弧菌的动物的研究已经证实，用铁调素模拟肽治疗使膜铁转运蛋白失活的响应接近100％存活，无论治疗是在感染启动之前或之后开始都是如此(Arezes et al 2015)。
作为已知的铁调素模拟物，可提到所谓的微型铁调素(minihepcidins)，其例如描述于WO2013/086143中。微型铁调素是铁调素N-端的小型合成肽类似物，其对与膜铁转运蛋白相互作用的铁调素至关重要。微型铁调素基于发现到铁调素的前9个氨基酸(DTHFPICIF)有足够的体外活性(以膜铁转运蛋白-GFP的降解进行测量)而开发。微型铁调素具有经修饰的铁调素-9氨基酸序列，以展现出改良的蛋白水解抗性及加强的与膜铁转运蛋白的生物物理相互作用。微型铁调素被描述为可用于治疗铁调素缺乏所导致的人类铁过载病况。
WO2015/069660描述了增加铁调素表达以治疗铁过载障碍的方法，其通过施用经修饰的铁结合/释放转铁蛋白来减少非转铁蛋白结合铁(NTBI)。
作用为铁调素激动剂、铁调素模拟物或膜铁转运蛋白抑制剂等等的所有已述的化合物皆为相对高分子量的化合物，尤其是那些主要由基因工程获得的化合物。已描述了以生物分子相互作用和生物分子为基础的各种另外的方式。缺点是，此类生物分子化合物的制备复杂以及敏感性高。尤其是，以膜铁转运蛋白抗体为基础的方法不够有效，因为被抗体抑制的膜铁转运蛋白可由机体永久再生，于是这种抑制不足以持续达到所希望的治疗效果。
还已知在铁代谢中发挥作用并可具有抑制或促进效果的低分子量化合物。
举例来说，WO 2008/151288、WO 2008/118790、WO 2008/115999、及WO 2008/109840描述了作用为二价金属转运体-1(DMT1)抑制剂的化合物及其用于治疗铁病症，例如地中海贫血症或血色素沉着症的用途。
WO 2008/123093涉及预防或治疗铁过载病症的药剂，其包含22β-甲氧基齐墩果-12-烯-3β,24(4β)-二醇。
EP 1074254和EP1072265涉及儿茶酚和类黄酮结构的植物多酚用于治疗铁过载的用途。
WO 2011/029832涉及作用为铁调素拮抗剂的噻唑和恶唑化合物，于是被描述为适用于治疗缺铁性疾病。其中，铁调素拮抗的活性被描述为抑制由铁调素引起的膜铁转运蛋白的抑制，其具有与本发明的发明人发现的在此描述的所述新的噻唑和恶唑化合物相反的效果。
未公开的国际申请PCT/EP2016/075305和PCT/EP2016/075306描述了具有作为膜铁转运蛋白抑制剂活性的化合物，其与本发明的式(I)化合物的具体选择重叠，并且一般而言，呈现为游离碱和/或其药学上可接受的盐。这两项国际申请提到了药学上可接受的盐的可能酸的一般列表。此外，这两项国际申请提到了一些形式为2HCl盐、3HCl盐或4HCl盐的具体的实施例化合物，其中仅一些所述HCl盐的具体实例包括在根据本发明式(I)的化合物的具体选择中。因此，本发明构成了由式(I)定义的一组非常特定的新型选择的化合物，其为盐的形式(而不是游离碱或盐和游离碱的混合物)，并进一步定义为新型选择的特定比例的抗衡离子(游离碱/化合物(I)：酸)。
迄今为止，尚未公开基于本发明通式(I)结构的化学化合物及其盐与其作为膜铁转运蛋白抑制剂的活性或在用于预防和治疗铁代谢紊乱(均与增加铁水平例如铁过载有关)中的用途有关。
US2004/0138268A1、US2011/0224136A1、CN103508957、WO2006/062224A1、WO2015/051362A1、EP1953145A1、WO2009/154739A2、GB937878A、WO2011/023722A1、WO2010/020556A1、WO2005/011685A1、WO00/56724A1、WO2010/036632A1、WO2005/014576A1、WO2013/067578A1、WO2005/113535A1、EP1889852A1、US2013/303508A1、WO98/27108A2、WO2006/040646A1、WO2010/078408A1，或Ashish K.Pathak等人的“Solution-Phase ParallelSynthesis of Acyclic Nucleoside Libraries of Purine,Pyrimidine,and TriazoleAcetamides”，ACS Combinatorial Science.Vol.16,No.9,pages 485-493,2014，ZouYiquan等人的“Discovery of pyrazole as C-terminus of selective BACE1inhibitors”.Eur.J.Of Medicinal Chemistry 68(2013)270-283，Tussing-Humphreys等人的"Rethinking Iron Regulation and Assessment in Iron Deficiency,Anemia ofChronic Disease,and Obesity:Introducing Hepcidin"J.Academy of Nutrition andDietetics(2012),Vol.122,No.3,391-400，Riordan等人的"Bleomycinanalogs.Synthesis and proton NMR spectral assignments of thiazole amidesrelated to bleomycin A2(1)"；J.Heterocyclic Chem.18,1213(1981)，Hideaki Sasaki的"Synthesis of a novel bis(2,4'-bithiazole)derivative as a Co(I InactivatedDNA cleaving agent"；Chem.Pharm.Bull.42(8)1685-1687(1994)，和Ballell等人的"Fueling open-source drug discovery.177small-molecule leads againsttuberculosis"；ChemMedChem 2013,8,313-321均描述了用于不同医学用途和作用机制的化合物。
发明内容
本发明的目的尤其是提供新的治疗上有效的化合物，该化合物可用于预防和治疗与铁水平增加相关的铁代谢紊乱(例如尤其是铁过载)的有效治疗。在另一目的中，该新的化合物应显示出副作用少，且具有极低的毒性以及良好的生物利用度和兼容性。再者，这些新的化合物与已知的铁螯合化合物相反，其应适用于预防铁水平增加以及因此与之相关的病症的发生，而非在已发生铁过载时从体内移除过量铁。在再一目的中，该新的化合物应具有所定义的结构(化学计量)并应可通过简单合成方法制备，与已知的生物分子化合物，例如抗体相比，其显示出较低的敏感性及提高的长效效率。
在本发明的另一方面，新化合物应在其物理，化学和理化特性方面表现出最佳稳定性。特别地，对于药物应用而言，良好或改善的长期稳定性(货架期稳定性)是提供新的药学上的活性化合物的重要方面，从而长期保持其物理，化学和理化特性及其药理学和生理学上的活性。溶解度稳定性(即稳定的溶解度曲线)在药物应用中也很重要。在这方面，本发明的另一个目的涉及提供本文所述的具有良好或改善的长期稳定性的新化合物，包括例如减少溶剂的释放或不释放溶剂，和/或在升高的温度下质量损失少或不吸湿，即使在不同温度和/或湿度条件下长期储存也能保持固态结构，对真空干燥具有抵抗力的结晶形式，制备方法中高纯度下的高再现性和低副产物或降解产物，甚至在不同温度和湿度条件下长期储存时保持溶解度曲线，以及它们的组合。
该目的通过开发本文定义的式(I)化合物的新盐来实现，已发现其可以作为膜铁转运蛋白抑制剂，因此适用于抑制铁转运，因此可以有效地用于预防和治疗与铁水平增加相关的铁代谢紊乱(例如特别是铁过载)，以及预防和治疗由铁调素缺乏引起的疾病，由于铁水平增加或铁过载相关或引起的疾病以及与无效性红细胞生成相关的疾病。
本发明人出乎意料地发现，具有如本文所定义的通用结构式(I)的所选化合物的特定盐可以作为膜铁转运蛋白抑制剂，从而有效地抑制铁转运，因此特别适合用作药物，特别是用于治疗和/或预防由于缺乏铁调素引起的疾病，与无效性红细胞生成相关的疾病或导致铁水平增加的铁代谢紊乱，例如特别是铁过载状态，例如特别是地中海贫血症，镰状细胞病和血色素沉着症。特别是，该新的盐化合物被证明适用于治疗地中海贫血症，镰状细胞病和血色素沉着症。该新的盐化合物也适用于治疗由病理性铁调素水平低引起的疾病和抑制铁转运的用途。
因此，本发明涉及通式(I)化合物的新盐
其中
X1为N或O，以及
X2为N、S或O；
前提是X1和X2不同；
R1选自以下组成的群组
-氢和
-任选的取代烷基；
n为1至3的整数；
A1和A2独立地选自烷二基的群组；
R2为
-氢，或
-任选的取代烷基；
或
A1和R2与其所键合的氮原子共同形成任选的取代4至6元环；
R3表示1、2或3个任选的取代基，其可以独立地选自以下组成的群组
-卤素，
-氰基，
-任选的取代烷基，
-任选的取代烷氧基，和
-羧基；
R4选自以下组成的群组
氢，
卤素，
C1-C3-烷基，和
卤代烷基；
其中所述盐选自式(I)的化合物与酸形成的盐，所述酸选自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；并排除以下3HCl盐(Exp.指实施例)：
在其中以及整个发明中，上述取代基定义如下：
任选的取代烷基优选包括：
优选含有1至8个，更优选1至6个，特别优选1至4个，甚至更优选1、2或3个碳原子的直链或支链烷基，也表示为C1-C4烷基或C1-C3烷基。
任选的取代烷基还包括含有优选3至8个，更优选5或6个碳原子的环烷基。
含有1-8个碳原子的烷基残基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、2-甲基丁基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基-1-甲基丙基、正庚基、1-甲基己基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、1-乙基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、4-乙基戊基、1,1-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1-丙基丁基、正辛基、1-甲基庚基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、1-乙基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、5-乙基己基、1,1-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、5,5-二甲基己基、1-丙基戊基、2-丙基戊基等。含有1-4个碳原子(C1-C4-烷基)的那些基团，例如特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基是优选的。更优选的是C1-C3烷基，特别是甲基、乙基、丙基和异丙基。最优选的是C1和C2烷基，例如甲基和乙基。
含有3-8个碳原子的环烷基残基优选包括：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。优选的是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。特别优选的是环丙基。
上述任选取代烷基的取代基优选包括1、2或3个相同或不同的取代基，选自例如下列组成的群组：如下定义的卤素，例如优选地为F，如上定义的环烷基，例如优选地为环丙基，如下定义的任选的取代杂芳基，例如优选地为苯并咪唑基，如下定义的任选的取代氨基，例如优选地为氨基或苄氧基羰基氨基，羧基，如下定义的氨基羰基，以及亚烷基，例如特别是亚甲基，以形成例如亚甲基取代的乙基(CH3-(C＝CH2)-或
其中*表示结合位点。
在本发明的含义之内，卤素包括氟、氯、溴和碘，优选氟或氯，最优选氟。
被卤素取代并含有1-8个碳原子的直链或支链烷基残基的实例包括：
氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、溴甲基、二溴甲基、三溴甲基、1-氟乙基、1-氯乙基、-1-溴乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、二氟乙基如1,2-二氟乙基、1,2-二氯乙基、1,2-二溴乙基2,2-二氟乙基、2,2-二氯乙基、2,2-二溴乙基、2,2,2-三氟乙基、七氟乙基、1-氟丙基、1-氯丙基、1-溴丙基、2-氟丙基、2-氯丙基、2-溴丙基、3-氟丙基、3-氯丙基、3-溴丙基、1,2-二氟丙基、1,2-二氯丙基、1,2-二溴丙基、2,3-二氟丙基、2,3-二氯丙基、2,3-二溴丙基、3,3,3-三氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、2-氟丁基、2-氯丁基、2-溴丁基、4-氟丁基、4-氯丁基、4-溴丁基、4,4,4-三氟丁基、2,2,3,3,4,4,4-七氟丁基、全氟丁基、2-氟戊基、2-氯戊基、2-溴戊基、5-氟戊基、5-氯戊基、5-溴戊基、全氟戊基、2-氟己基、2-氯己基、2-溴己基、6-氟己基、6-氯己基、6-溴己基、全氟己基、2-氟庚基、2-氯庚基、2-溴庚基、7-氟庚基、7-氯庚基、7-溴庚基、全氟庚基等。特别提及的是氟代烷基，二氟代烷基和三氟代烷基，优选三氟甲基以及单-和二-氟乙基。特别优选的是三氟甲基。
环烷基取代烷基的实例包括上述含有1-3个，优选1个环烷基的烷基，例如：环丙基甲基，环丁基甲基，环戊基甲基，环己基甲基，2-环丙基乙基，2-环丁基乙基，2-环戊基乙基，2-环己基乙基，2-或3-环丙基丙基，2-或3-环丁基丙基，2-或3-环戊基丙基，2-或3-环己基丙基等。优选的是环丙基甲基。
杂芳基取代烷基的实例包括上述含有1至3个，优选1个(任选取代的)杂芳基的烷基残基，例如吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，吡唑基，咪唑基，苯并咪唑基，苯硫基或恶唑基，如吡啶-2-基-甲基，吡啶-3-基-乙基，吡啶-4-基-乙基，2-吡啶-2-基-乙基，2-吡啶-1-基-乙基，2-吡啶-3-基-乙基，哒嗪-3-基-乙基，嘧啶-2-基-甲基，嘧啶-4-基-甲基，吡嗪-2-基-甲基，吡唑-3-基-甲基，吡唑-4-基-甲基，吡唑-5-基-甲基，咪唑-2-基-甲基，咪唑-5-基-甲基，苯并咪唑-2-基-甲基，苯硫基-2-基-乙基，苯硫基-3-基-甲基，1,3-恶唑-2-基-甲基。
优选的是被苯并咪唑基取代的烷基，例如苯并咪唑-2-基-甲基和苯并咪唑-2-基-乙基。
氨基取代烷基残基的实例包括上述含有1至3个，优选1个(任选取代的)氨基的烷基残基，如下所定义，例如氨基烷基(NH2-烷基)或单-或二烷基氨基-烷基，如氨基甲基，2-氨基乙基，2-或3-氨基丙基，甲基氨基甲基，甲基氨基乙基，甲基氨基丙基，2-乙基氨基甲基，3-乙基氨基甲基，2-乙基氨基乙基，3-乙基氨基乙基等，优选3-氨基丙基，或烷基，其可以被任选取代的烷氧基羰基氨基取代，例如根据式
根据本发明的任选的取代氨基优选包括：氨基(-NH2)，任选的取代单-或二烷基氨基(烷基-NH-，(烷基)2N-)，其中关于“烷基”可以参考上述任选的取代烷基的定义。优选的是单-或二甲基氨基，单-或二乙基氨基和单丙基氨基。最优选的是氨基(-NH2)和单丙氨基。
此外，在本发明的意义上，羧基表示为[-(C＝O)-OH]基团，氨基羰基表示为[NH2-(C＝O)-]基团。
任选的取代烷氧基包括任选的取代烷基-O-基团，其中可以参考前述烷基的定义。优选的烷氧基是含有最多6个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，异戊氧基，仲戊氧基，叔戊氧基，2-甲基丁氧基，正己氧基，异己氧基，叔己氧基，仲己氧基，2-甲基戊氧基，3-甲基戊氧基，1-乙基丁氧基，2-乙基丁氧基，1,1-二甲基丁氧基，2，2-二甲基丁氧基，3,3-二甲基丁氧基，1-乙基-1-甲基丙氧基，以及环烷氧基(如环戊氧基或环己氧基)。优选的是甲氧基，乙氧基，正丙氧基和异丙氧基。更优选的是甲氧基和乙氧基。特别优选的是甲氧基。
在整个发明中，任选的取代烷二基优选为具有1至6个，优选1至4个，更优选1、2或3个碳原子的二价直链或支链烷二基，其可任选地带有1至3个，优选1或2个选自卤素，羟基(-OH)，氧代基团((＝O；以形成羰基或酰基[-(C＝O)-])和如上定义的烷基(优选甲基)组成的群组的取代基。作为优选的例子述及如下：亚甲基，乙烷-1,2-二基，乙烷-1,1-二基，丙烷-1,3-二基，丙烷-1,1-二基，丙烷-1,2-二烷基，丙烷-2,2-二基，丁烷-1,4-二基，丁烷-1,2-二基，丁烷-1,3-二基，丁烷-2,3-二基，丁烷-1,1-二基，丁烷-2,2-二基，丁烷-3,3-二基，戊烷-1,5-二基等。特别优选的是亚甲基，乙烷-1,2-二基，乙烷-1,1-二基，丙烷-1,3-二基，丙烷-2,2-二基和丁烷-2,2-二基。最优选的是亚甲基，乙烷-1,2-二基和丙烷-1,3-二基。
优选的取代烷二基残基为羟基取代烷二基(例如羟基取代的乙二基)，氧代烷二基(例如氧代亚甲基或乙二基，以形成羰基或酰基(乙酰基))，卤代烷二基(如被一个或两个选自F和Cl的卤素原子取代的烷二基，优选为2,2-二-氟-乙二基)，或被甲基取代的烷二基。
根据本发明，还可以是A1和R2及与之键合的氮共同形成任选的取代4至6元环，其可以被如上定义的1-3个取代基取代，其中，A1具有定义如上的直链或支链烷二基含义，R2具有定义如上的任选的取代烷基含义。因此，A1和R2可以共同来自根据下式之一的基团
其中优选的是(取代或未取代的)4元环，例如特别是/>
基团。其中，左旋结合位点表示为直接与本发明中式(I)中位置在X1和X2之间的杂环5元环结合的位点。右旋结合位点表示为与具有如本文定义的烷烃二基含义的A2基团结合的位点。
在如本文所定义的式(I)中，n具有1至3的整数的含义，包括1、2或3，因此表示为亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基。更优选的是，n为1或2，甚至更优选的是n为1，表示为亚甲基。
在本发明中，上述式(I)的各个取代基可具有以下含义：
A)X1为N或O；和
X2为N，S或O；
前提是X1和X2不同；
从而形成根据下式的5元杂环
其中*表示与氨基羰基结合的位点，**表示与A1-基团结合的位点。
B)n为1、2或3的整数；优选n为1或2，更优选n为1。
C)R1选自如下组成的群组
-氢，和
-任选的取代烷基(定义如上)；
优选的R1为氢或甲基，更优选的R1为氢。
D)R2选自如下组成的群组
-氢，和
-任选的取代烷基(定义如上)；
优选的R2为氢或C1-C4烷基，更优选的R2为氢或甲基，甚至更优选的R2为氢。
E)R3表示1、2或3个任选的取代基，其可以独立地选自如下组成的群组
-卤素(定义如上)，
-氰基，
-任选的取代烷基(定义如上)，
-任选的取代烷氧基(定义如上)，和
-羧基(定义如上)；
优选R3表示1或2个任选的取代基，其可以独立地选自如下组成的群组
-卤素，
-氰基，
-烷基(定义如上)，其可以被1、2或3个卤素原子(定义如上)取代，
任选取代的烷氧基(如上所定义)，以及
羧基(定义如上)；
更优选R3表示1或2个任选的取代基，其可以独立地选自如下组成的群组：
-F和Cl，
-氰基，
-三氟甲基，
-甲氧基，和
-羧基；
甚至更优选的R3为氢，表示式(I)中未取代的末端为苯并咪唑基环
F)R4选自如下组成的群组
-氢，
-卤素(定义如上)，
-C1-C3-烷基，和
-卤素取代的烷基(定义如上)；
优选地，R4选自如下组成的群组：
-氢
-Cl，
-甲基，乙基，异丙基和
-三氟甲基；
更优选地，R4选自如下组成的群组：
-氢，
-Cl，
-甲基，和
-三氟甲基；
更优选地，R4选自如下组成的群组：
-氢，
-Cl，和
-甲基，
甚至更优选R4为氢。
G)A1为烷二基，
优选地，A1为亚甲基或乙烷-1,2-二基，更优选地，A1为乙烷-1,2-二基。
H)A2为烷二基，
优选地，A2为亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基，
更优选地，A2为亚甲基或乙烷-1,2-二基，甚至更优选地，A2为乙烷-1,2-二基。
I)或者，A1和R2及与之键合的氮共同形成如上定义的任选的取代4至6元环；
其中A1和R2及与之键合的氮优选地共同形成如上定义的任选的取代4元环，
其中A1和R2及与之键合的氮更优选地共同形成未取代的4元环(氮杂环丁烷基环)。
其中，以下(I)的化合物的取代基可以特别具有以下含义：
n具有根据上述B)的任何含义，并且其余的取代基可具有A)和C)至I)中定义的任何含义。
R1具有根据上述C)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)和B)和D)至I)中所定义的任何含义。
R2具有根据上述D)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至C)和E)至H)或I)中所定义的任何含义。
R3具有根据上述E)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至D)和F)至I)中所定义的任何含义。
R4具有根据上述F)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至E)和G)至I)中所定义的任何含义。
A1具有根据上述G)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至F)和H)或I)中所定义的任何含义。
A2具有根据上述H)的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至G)和I)中所定义的任何含义。
R2和A1具有如I)中定义的任何含义，并且其余的取代基可具有如A)至C)、E)、F)和H)中所定义的任何含义。
本发明一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(I)化合物的新盐，其中
X1是N或O；和
X2是N，S或O；
前提是X1和X2不同；
R1为氢；
n是1、2或3；
A1为亚甲基或乙烷-1,2-二基；
A2为亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；
R2为氢或C1-C4烷基；
或
A1和R2及与之键合的氮原子共同形成任选的取代4元环；
R3表示1或2个任选的取代基，其可以独立地选自如下组成的群组
-卤素，
-氰基，
-烷基，可以被1、2或3个卤原子取代，
-任选的取代烷氧基，以及
-羧基；
R4选自如下组成的群组
-氢
-Cl，
-甲基，乙基，异丙基，以及
-三氟甲基；
其中所述盐选自式(I)化合物与酸形成的盐，所述酸选自由苯甲酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，乳酸，苹果酸，马来酸，甲磺酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；
其中排除了如上定义的3HCl盐。
本发明的另一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(I)化合物的新盐，其中
X1为N或O；和
X2为N、S或O；
前提是X1和X2不同；
R1为氢；
n为1或2；
A1为亚甲基或乙烷-1,2-二基；
A2为亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；
R2为氢或甲基；
或
A1和R2及与之键合的氮原子共同形成未取代4元环；
R3表示1或2个任选的取代基，其可以独立地选自如下组成的群组
-F和Cl，
-氰基，
-三氟甲基，
-甲氧基，以及
-羧基；
R4选自如下组成的群组
-氢，
-Cl，
-甲基，以及
-三氟甲基；
其中所述盐选自式(I)化合物与酸形成的盐，所述酸选自苯甲酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，乳酸，苹果酸，马来酸，甲磺酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；并且
其中排除了如上定义的3HCl盐。
本发明另一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(I)化合物的新盐，其中
X1为N或O；和
X2为N、S或O；
前提是X1和X2不同；
R1为氢；
n为1；
A1为亚甲基或乙烷-1,2-二基；
A2为亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；
R2为氢；
或
A1和R2及与之键合的氮原子共同形成未取代的4元环；
R3表示氢，从而形成未取代末端的苯并咪唑基环；
R4选自如下组成的群组
-氢，
-Cl，以及
-甲基；
其中所述盐选自式(I)化合物与酸形成的盐，所述酸选自苯甲酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，乳酸，苹果酸，马来酸，甲磺酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；并且
其中排除了如上定义的3HCl盐。
本发明另一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(I)化合物的新盐，其中
X1为N或O；和
X2为N，S或O；
前提是X1和X2不同；
R1为氢；
n为1；
A1为亚甲基或乙烷-1,2-二基；
A2为亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；
R2为氢；
或者
A1和R2及与之键合的氮原子共同形成未取代的4元环；
R3表示氢，从而形成未取代末端的苯并咪唑基环；
R4为氢；
其中所述盐选自式(I)化合物与酸形成的盐，所述酸选自苯甲酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，乳酸，苹果酸，马来酸，甲磺酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；并且
其中排除了如上定义的3HCl盐。
本发明另一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(I)化合物的新盐，其中
n＝1；
R3＝氢；
R4＝氢；
A1＝乙烷-1,2-二基；
A2＝亚甲基，乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；
R2＝氢；
或A1和R2及与之键合的氮原子共同形成任选的取代4元环，以形成下面式(II)或(III)的化合物：
其中在式(II)和(III)中
m为1、2或3的整数以及
X1、X2和R1具有如上包括式(I)化合物的本发明任何实施方式中所定义的含义。
特别是，在式(II)和(III)中，X1和X2具有如上A)中所定义的含义。
在式(II)中，R1和R2优选为氢。
在式(III)中，R1优选为氢，以及m优选为2。
本发明另一个优选的实施方式涉及如上定义的通式(II)化合物的新盐，其中
X1和X2选自N和O并且不同；
R1＝氢；
R2＝氢；以及
m＝2。
在下文中，形成本发明的盐的化合物(I)、(II)或(III)也称为“碱”或“游离碱”。游离碱形式的根据式(I)、(II)或(III)化合物具有至少一个碱性基团，例如氨基，酸性基团可以与之结合。
根据本发明，如上本发明任何实施方式中所定义的式(I)、(II)或(III)化合物的盐可选自具有碱((化合物(I)、(II)或(III)))：酸比例为1至2：1至3的盐，其中关于形成酸的盐可参考上文定义的选择。
本发明还包括碱(化合物(I)、(II)或(III))与上述一种或多种酸形成的混合盐，根据本发明，其可具有相同或不同的碱：酸比例。酸为阳离子形式的化合物(I)、(II)或(III)提供抗衡阴离子。因此，本发明的所选的酸提供以下抗衡阴离子：
根据本发明，化合物(I)、(II)或(III)的盐的特征在于所选择的碱：酸比例，即如上定义的化合物(I)、(II)或(III)：酸，在1.0至2.0(mol碱)：1.0至3.0(mol酸)的范围内。在一个特别的具体实施方式中，所选择的碱：酸的比例为1.0至2.0(mol碱)：1.0至2.0(mol酸)。
具体实例包括以下比例的碱：酸，即如上定义的化合物(I)、(II)或(III)：酸为
1.0(mol碱)：1.0(mol酸)；
1.0(mol碱)：1.25(mol酸)：
1.0(mol碱)：1.35(mol酸)；
1.0(mol碱)：1.5(mol酸)；
1.0(mol碱)：1.75(mol酸)；
1.0(mol碱)：2.0(mol酸)；以及
2.0(mol碱)：1.0(mol酸)。
其中，碱：酸比为1：1的盐也称为“单盐”或“1：1盐”。例如，单HCl盐也称为1HCl或1HCl盐。
其中，碱：酸比为1：2的盐也称为“二盐”或“1：2盐”。例如，二HCl盐也称为2HCl或2HCl盐。
其中，碱：酸比为1：3的盐也称为“三盐”，“三聚盐”或“1：3盐”。例如，三HCl盐也称为3HCl或3HCl盐。
碱：酸的比例为1：1.25的盐也称为“1：1.25盐”。
碱：酸比率为1：1.35的盐也称为“1：1.35盐”。
碱：酸比为1：1.5的盐也称为“1：1.5盐”。
碱：酸的比率为1：1.75的盐也称为“1：1.75盐”。
碱：酸比为2：1的盐也称为“半盐”或“2：1盐”。
在本发明的另一个优选的实施方式中，如上定义的式(I)化合物的盐选自含有如上定义的一种或多种酸的单盐(1：1盐)。
本发明的另一个实施方式涉及如上定义的式(I)、(II)或(III)化合物的盐，其中所述酸选自柠檬酸，盐酸，马来酸，磷酸和硫酸组成的群组。
本发明的另一个实施方式涉及如上定义的式(I)、(II)或(III)的化合物的盐，其中所述酸选自磷酸和硫酸组成的群组。
根据本发明的化合物的盐可以以无定形，多晶型，结晶和/或半结晶(部分结晶)的形式以及盐的溶剂化物形式存在。
优选地，本发明的盐以结晶和/或半结晶(部分结晶)的形式和/或以其溶剂化物的形式存在。
本发明的盐或盐的溶剂化物的优选结晶性可通过使用常规分析方法来测定，例如特别是通过使用各种X射线的方法，可以使盐化合物的分析更为清楚和简单。特别是，结晶度可以通过使用例如下面实施例中所述的粉末X射线衍射(反射)方法，或通过使用如在例如下文中所述的粉末X射线衍射(透射)方法来测定或确认(以下也均缩写为PXRD)。对于具有相同化学组成的结晶固体，通过术语“多态性”来概括所得的不同晶栅。
优选地，本发明的盐用本文所述的PXRD方法测量的结晶度显示出大于30％，更优选大于40％，还更优选大于50％，例如至少为55-60％。
本发明的盐可以作为溶剂化物和/或水合物存在，其可以通过在本发明的盐的晶栅中的溶剂分子的吸引、缔合、吸附、粘附、嵌入或络合形成。可以嵌入晶栅中的溶剂分子可以来自用于结晶的溶剂以及由相对湿度产生的水。
用于结晶的溶剂包括乙腈，二氯甲烷，醇，例如特别是甲醇，乙醇，2-丙醇(异丙醇)，醛，酮，尤其是丙酮，醚，例如四氢呋喃(THF)或二恶烷，酯，例如乙酸乙酯，或烷烃，例如尤其是戊烷，己烷，庚烷或环己烷和水，及其混合物。优选的用于结晶的溶剂选自乙腈，二氯甲烷，甲醇，乙醇，2-丙醇，乙酸乙酯，THF，水及其混合物组成的群组。
特别优选的用于结晶的溶剂选自乙腈，甲醇，乙醇，2-丙醇，乙酸乙酯，THF，水及其混合物组成的群组。优选的水/溶剂的混合物包括水和丙酮的混合物，水和乙醇的混合物，以及水和甲醇的混合物，其中优选的是水和乙醇的混合物以及水和甲醇的混合物。
特别优选的是用于结晶的溶剂，其选自乙腈，二氯甲烷，乙醇，2-丙醇(异丙醇)，丙酮和乙酸乙酯以及其与水的混合物组成的群组，例如特别是乙醇和水的混合物以及丙酮和水的混合物。特别优选的混合物是下列溶剂和水的混合物(本文任何地方给出的溶剂混合物的比例总是指体积：体积)：
丙酮：水＝9：1(体积：体积)
丙酮：水＝95：1(体积：体积)
乙醇：水＝4：1(体积：体积)
乙醇：水＝3：1(体积：体积)
乙醇：水＝8：2(体积：体积)。
所选溶剂或水在结晶中和随后的工艺步骤中形成溶剂化物或水合物或直接形成游离碱的程度通常是不可预测的，并且取决于工艺条件和所选化合物(I)、来自所选酸的抗衡阴离子与所选溶剂之间的各种相互作用以及湿度条件的组合。可以优选的是盐的溶剂化物或水合物，因为晶体结构中的溶剂或水分子被强的分子间力所结合，从而可以表现为这些晶体的元素形成的结构，其部分地可以改善盐的稳定性。然而，溶剂和/或水分子也存在于某些晶格中，这些晶格受到相当弱的分子间力的束缚。这种分子或多或少地在晶体结构形成中成为一体，但具有较低的能量效应。溶剂化物中的溶剂和/或水含量还取决于干燥和环境条件(即相对湿度)。在稳定的溶剂化物或水合物的情况下，活性化合物(即，本发明的盐)和溶剂或水通常具有明显的化学计量比。在许多情况下，这些比例不能完全满足化学计量值，通常由于某些晶体缺陷而与理论相比较其接近于较低的值。由于与水较弱的结合，有机分子与溶剂或水分子的比例可以在相当大的范围内变化，例如，以二-，三-或四-水的速率扩展。另一方面，在无定形固体中，溶剂和/或水的分子结构分类不是化学计量；然而，分类也可能仅偶然是化学计量。在一些情况下，不可能对溶剂或水分子进行精确的化学计量分类，因为层结构的形成使得嵌入的溶剂或水分子不能以确定的形式来测定。
无定形固体以及结晶溶剂化物或水合物中的溶剂和/或水的含量通常可以通过常规方法来测定，例如通过使用众所周知的卡尔-费休(Karl-Fischer)滴定方法，通过进行动态蒸汽吸附(DVS)测量，通过进行热重量测量(TG-FTIR)，如例如在以下实施例中所述的那样。元素分析或结构分析方法，如1H NMR光谱或拉曼光谱(FT拉曼光谱)可提供有关溶剂化物或水合物形成程度的信息，和/或可用于确认或验证卡尔-费休(KF)，DVS或TG-FTIR测量的结果。
根据本发明的溶剂化物和/或水合物的实例包括例如半-(0.5)、单-、倍半-(1.5)、二-、三-、四-、五-、六-、七-、八-、九-、十-等各种溶剂化物或水合物。进一步的中间溶剂化度也是可能的，例如用2.5、3.5、4.5个等溶剂和/或水分子的溶剂化。
溶剂化物和/或水合物的优选实例包括具有约1.5、2.5、3、4和7个水分子的水合物。溶剂化物和/或水合物的进一步优选实例包括具有约0.5、1.5、2.5、3、4、6和7个水分子的水合物。还优选的是无水盐。另外可能的是，溶剂和/或水残余物以非化学计量的量保留在盐中。
此外，水和溶剂的混合物可能保留在盐中，形成所谓的混合水合物/溶剂化物的形式。这种混合水合物/溶剂化物形式的实例特别包括
丙酮/水，优选比例为1至4：1；比如特别是4：1；
甲醇/水，优选比例为3至9：1；例如特别是3：1、4：1和9：1；
乙醇/水，优选比例为1至4：1；例如特别是3：1和4：1。
上下文中任何提及的根据本发明的盐应理解为还指相应的溶剂化物，例如水合物，溶剂化物和水合物/溶剂化物的混合形式，同质多晶变体，以及无定形形式，视情况和方便而定。
本发明的新型盐在储存和配送过程中表现出良好的溶解性以及稳定性，并且质量良好。
所得的结晶或无定形固体以盐，溶剂化物和水合物(包括水合物/溶剂化物的混合形式)的形式的相应稳定性，以及相应的盐溶剂化物或盐水合物，可通过常规实验来测定。改善的稳定性可包括改善的吸湿性，改善的熔化焓。用于例如干燥、筛分、研磨的理化过程以及在进行药物赋形剂的盖伦过程中(即在混合过程、造粒、喷雾、压片中)的纯化活性物质的质量的一个基本特征是该活性物质的吸水或失水，其取决于随着相关的环境的温度和相对湿度。对于某些制剂，无疑游离水和结合水是由赋形剂引入的，和/或由于与相应制剂方法相关的原因而将水加入到工艺物质中。以这种方式，依据不同活性的温度(蒸气分压)，药物活性物质在相当长的时间内暴露于游离水中。由此可见，特别稳定的纯化合物在药物-盖伦制剂的观点下显而易见是有利的，并且它们适合于在所有盖伦制剂工艺阶段和不同剂型形式中配制。
根据本发明的盐可以以分离的和基本上纯的形式存在，例如≥65％，优选≥70％，更优选≥75％，更优选≥80％的纯度。
在本发明的意义上，如本文所用的术语“盐”包括相应的溶剂化物、水合物和水合物/溶剂化物的混合形式等，以及其不同的多晶型物，例如特别是本文所述的特定多晶型物。
本发明的盐可以通过常规方法在结构上表征，例如，元素分析、热重分析(TG-FTIR)、1H NMR光谱和拉曼光谱(FT拉曼光谱)、用于测定熔点的差示扫描量热法(DSC)，它们分别在如下面的实施例中有描述，以及所述方法的组合，特别是与上述用于测定溶剂化物/水合物程度的方法的组合。
本发明的另一个实施方式涉及制备如本文所定义的盐的方法。制备盐的过程可描述如下：
盐的形成在溶剂体系中进行，其中两种反应物，即碱化合物(I)、(II)或(III)和各自的酸是充分可溶的。这有利于使用溶剂或溶剂混合物，其中所得的盐仅微溶或根本不溶，以实现结晶或沉淀。根据本发明的盐形成的一种变体是使用其中各自的盐极易溶解的溶剂，并随后向该溶液中加入抗溶剂，该抗溶剂为所得的盐在其中仅具有较差的溶解度的溶剂。盐形成的另一变体包括浓缩该盐溶液，例如通过加热，如果需要的话在减压下进行，或通过例如在室温下缓慢蒸发溶剂，或通过添加晶种接种，或通过设定水合物形成所需的水活性。其中，可以使用如上定义的溶剂。
为了制备水合物，可以使用溶解和结晶方法，或水平衡结晶方法。
溶解和结晶过程可以通过以下步骤描述：
(i)作为游离碱的化合物(I)、(II)或(III)溶解在有机溶剂中，
(ii)将如上定义的所选酸，优选作为水溶液，加入到步骤(i)中所得的溶液中，
(iii)将溶液静置以诱导结晶，
(iv)将晶体过滤并干燥，得到盐。
在步骤(i)的溶解过程中，所用的有机溶剂有利地是乙腈，二氯甲烷，甲醇，乙醇，2-丙醇，乙酸乙酯，THF，水及其混合物，更优选的是乙腈，甲醇，乙醇，2-丙醇，乙酸乙酯，THF，水或其混合物，例如特别是与水的混合物，例如水和乙醇的混合物，水和甲醇的混合物，或水和丙酮的混合物。如果需要，可以将溶剂加热至室温以上，例如，25至60℃，更优选的是30至50℃。
在步骤(ii)的过程中，所用酸的水溶液有利地为5至30％，更优选的5至25％，例如10％的相应酸的溶液。特别是，碱：酸的比例为1：1(mol：mol)。在使用磷酸或硫酸的情况下，也可以使用10：1(mol：mol)的碱与酸的比例。
在步骤(iii)的过程中，有利地将溶液静置以缓慢蒸发溶剂。这优选通过冷却至室温或更低温度来进行，更优选至-10至20℃，还更优选-5至10℃，最优选0至5℃。或者，溶液的浓缩也可以通过加热到室温以上来实现，例如至>25至100℃，更优选30至70℃。通常将其静置8至48小时，优选17至36小时，更优选20至30小时。
在步骤(iv)的过程中，干燥优选在升高的温度下进行，更优选20至50℃，最优选30至40℃。在任何情况下，干燥必须在低于相应盐的熔点的温度下进行。压力优选选择为1至100毫巴，优选10至50毫巴，更优选20至40毫巴，例如30毫巴。通常进行干燥直至获得恒定质量。根据干燥条件，干燥可需要5至48小时，优选10至24小时，例如15至20小时。
还可以通过加入合适的结晶引发剂来加速结晶，例如，至少一粒晶种。
在本发明的另一个优选的实施方式中，属于上述通式(I)、(II)或(III)所定义的化合物的3HCl(3HCl)盐将排除在外。
本发明的一个具体实施方式涉及如上述任一实施方式中所定义的式(I)化合物的盐，其中式(I)的化合物选自如下组成的群组：
更优选的式(I)的化合物选自如下组成的群组：
甚至更优选地，本发明涉及上述任一实施方式中所定义的盐，其中式(I)的化合物为：
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及如上述任一实施方式中所定义的式(I)化合物的盐，其中所述酸选自磷酸和硫酸组成的群组。
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及如上述任一实施方式中所定义的式(I)化合物的盐，其中用于结晶的溶剂选自乙腈，二氯甲烷，乙醇，2-丙醇(异丙醇)，丙酮和乙酸乙酯，及其与水的混合物组成的群组，例如特别是乙醇和水的混合物以及丙酮和水的混合物。特别优选的混合物是以下溶剂和水的混合物：
-丙酮：水＝9：1(体积：体积)
-丙酮：水＝95：1(体积：体积)
-乙醇：水＝4：1(体积：体积)
-乙醇：水＝3：1(体积：体积)
-乙醇：水＝8：2(体积：体积)。
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及如上述任一实施方式中所定义的式(I)化合物的盐，其中的酸为磷酸，并且所述磷酸盐的特征在于化合物(I)：酸的比例为1至2：1，优选化合物(I)：酸的比例为1：1或2：1。
更优选地，这种优选的磷酸盐通过使用选自乙腈，乙醇，2-丙醇(异丙醇)，丙酮和乙酸乙酯，及其与水的混合物组成的群组的溶剂结晶而获得，例如特别是乙醇和水的混合物以及丙酮和水的混合物。其中，特别优选的混合物是乙醇：水＝8：2的混合物。
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及如上述任一实施方式中所定义的式(I)化合物的盐，其中的酸为硫酸，并且所述硫酸盐的特征在于化合物(I)：酸的比例为1：1。
更优选地，这种优选的硫酸盐是通过使用选自乙腈，二氯甲烷，乙醇，2-丙醇(异丙醇)和丙酮，及其与水的混合物组成的群组的溶剂的结晶获得的，例如特别是乙醇和水的混合物以及丙酮和水的混合物。其中，特别优选的混合物选自如下混合物
-丙酮：水＝9：1(体积：体积)
-丙酮：水＝95：1(体积：体积)
-乙醇：水＝4：1(体积：体积)
-乙醇：水＝3：1(体积：体积)。
进一步特别优选的是，上述优选的磷酸盐和硫酸盐为选自如上表所示的实施例化合物No.1、2、4、40、94、118、126、127、193、206、208、233的式(I)化合物的盐。其中更优选地，式(I)的化合物选自实施例化合物No.1、40、94、127、208。甚至更优选地，其中式(I)的化合物选自实施例化合物No.1和127，最优选的是实施例化合物No.127。
因此，下面的盐是特别优选的：
实施例化合物No.127的磷酸盐(1：1盐)
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及根据实施例化合物No.127的化合物的磷酸盐，其中化合物(I)：酸的比例为1：1，其特征在于为下面实施例中详细定义的PM2多晶型物。
本发明的另一个特别优选的实施方式涉及根据实施例化合物No.127的化合物的硫酸盐，其中化合物(I)：酸的比例为1：1，其特征在于为下面实施例中详细定义的PM1多晶型物。
令人惊讶地发现，本文所述的化合物具有良好或甚至改善的长期稳定性，包括在升高的温度下降低的或没有溶剂的释放和/或质量损失，它们变得更少吸湿或不吸湿，从而即使在不同温度和/或湿度条件下长期储存，它们也能保持固态结构，晶体形式也能抵抗真空干燥，该化合物显示出在所述制备方法下具有高纯度和低副产物或降解产物的高重复性，并且即使在不同的温度和湿度条件下长期储存也能保持其溶解度特征。本发明的发明人惊奇地发现，特别是上述实施例化合物No.127的优选的硫酸盐和磷酸盐(1：1盐)，特别是如本文详细描述的PM1(硫酸盐)和PM2(磷酸盐)多晶型物，获得了所述的有利特征。这使得这些多晶型物特别适合作为用于本文所述的预防和治疗的药物制剂中的活性成分。与其中测试的其他多晶型物相比，所述特定优选的PM1(1：1硫酸盐)和PM2(1：1磷酸盐)多晶型物包含较少的水，这对于所期望的长期稳定性是有利的。
根据其结构，根据本发明的盐在不对称碳原子的存在下可以以立体异构的形式(对映异构体，非对映异构体)存在。因此，本发明包括对映异构体或非对映异构体及其各自的混合物。纯的对映体形式可任选地通过常规的光学拆分方法获得，例如通过与光学活性化合物反应使其非对映异构体分级结晶。由于根据本发明的化合物可以以互变异构的形式存在，因此本发明涵盖所有互变异构形式的用途。根据本发明的盐可以作为各种可能的异构形式的混合物存在，特别是立体异构体，例如E-和Z-，顺式和反式，以及光学异构体。在此要求保护E-异构体，Z-异构体，光学异构体，以及这些异构体的任何混合物。
本发明进一步涉及如本文所描述的根据式(I)、(II)或(III)化合物的新盐的新型多晶型物。
在相同的物质组合物以不同的晶格排列结晶的情况下发生的多晶形式将导致不同的热力学性质，以及针对特定多晶型物形式的稳定性。
本发明的一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的柠檬酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)包含以在24.5和5.3±0.25度，或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约24.3、21.6、17.1、5.9、25.3、8.1、15.1、20.1或12.6±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约24.3、21.6、17.1、5.9、25.3、8.1、15.1、20.1或12.6处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在24.5、5.3、24.3、21.6和17.1中的每一处以及可选地5.9、25.3、8.1、15.1、20.1或12.6±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，实施例化合物No.127的柠檬酸盐的所述多晶型物是1：1盐的形式。
本发明的另一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的马来酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)，其包含以在19.0和24.5±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约25.1、17.5、18.7、25.7、18.3、21.9、9.6或6.1±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约25.1、17.5、18.7、25.7、18.3、21.9、9.6或6.1处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在19.0、24.5、25.1、17.5和18.7中的每一处以及可选地25.7、18.3、21.9、9.6或6.1±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，实施例化合物No.127的马来酸盐的所述多晶型物为1：1.75盐的形式。
本发明的另一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的磷酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)，其包含以在27.2和4.6±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约16.8、22.0、24.5、5.4、8.9、13.1、12.3、19.7或15.9±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约16.8、22.0、24.5、5.4、8.9、13.1、12.3、19.7或15.9处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在27.2、4.6、16.8、22.0和24.5中的每一处以及可选地5.4、8.9、13.1、12.3、19.7或15.9±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，实施例化合物No.127的磷酸盐的所述多晶型物为2：1盐的形式。
本发明的另一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的磷酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)，其包含以在26.1和16.5±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约15.5、18.4、17.4、14.7、25.4、20.4、13.2或22.1±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约15.5、18.4、17.4、14.7、25.4、20.4、13.2或22.1处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在26.1、16.5、15.5、18.4和17.4中的每一处以及可选地14.7、25.4、20.4、13.2或22.1±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，实施例化合物No.127的磷酸盐的所述多晶型物为1：1盐的形式。
本发明的另一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的硫酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)，其包含以在25.4度和18.1±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约4.5、25.1、16.8、18.5、18.6、14.9、15.6或17.6±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约4.5、25.1、16.8、18.5、18.6、14.9、15.6或17.6处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在25.4、18.1、4.5、25.1和16.8中的每一处以及可选地18.5、18.6、14.9、15.6或17.6±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，所述实施例化合物No.127的硫酸盐的多晶型物为1：1盐的形式。
本发明的另一个特定的具体实施方式涉及实施例化合物No.127的硫酸盐的多晶型物，其特征在于粉末X-射线衍射图(PXRD图)，其包含以在25.5和4.5±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约18.1、18.4、16.8、6.2、14.9、25.2、15.6或13.1±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含一个或多个以选自约18.1、18.4、16.8、6.2、14.9、25.2、15.6或13.1处的2θ角表示的进一步的峰。
更优选地，在这种多晶型物的实施方式中，PXRD图谱包含以在25.5、4.5、18.1、18.4和16.8中的每一处以及可选地6.2、14.9、25.2、15.6或13.1±0.20度或±0.10度或±0.05度中的每一处中的一处或多处、两处或多处、三处或多处的2θ角表示的特征结晶峰。
优选地，所述实施例化合物No.127的硫酸盐的多晶型物为1：1盐的形式。
非常特别地，本发明包括如本文所描述的具有以下PXRD峰谱的实施例化合物No.127的以下盐的多晶型物：
实施例化合物No.127的柠檬酸盐(1：1盐)
实施例化合物127的马来酸盐(1：1.75盐)
实施例化合物No.127的磷酸盐(2：1盐)
尤其是，
实施例化合物No.127的磷酸盐(1：1盐)
实施例化合物No.127的硫酸盐(1：1盐)
特别是，
实施例化合物127的硫酸盐(1：1盐)
特别优选的是，根据本发明，基于所述新型盐化合物的总重量，≥70wt％，优选≥75wt％，≥85wt％，≥90wt％，≥95wt％的本发明的各个新盐(即活性化合物)为这种特定的多晶型物形式。因此，本发明的特别的具体实施方式涉及下述组合物、药剂或药物制剂，其中≥70wt％，优选≥75wt％，≥85wt％，≥90wt％，≥95wt％的各种新型盐作为活性化合物(基于所述新型活性化合物的总重量)为这种特定的多晶型物形式。
本申请中描述的所有化合物(游离碱或盐，包括溶剂化物、水合物、水合物/溶剂化物的混合形式和多晶型物等)为膜铁转运蛋白抑制剂。本专利申请中描述的所有新盐确实保留了膜铁转运蛋白抑制活性，并且还可以改善膜铁转运蛋白抑制活性，和/或改善化合物的药代动力学特征，和/或改善化合物的理化性质以使其更容易配制成盖伦形式，和/或具有以结晶形式分离的优点，其可以改善化合物的理化性质以使这些化合物更容易配制成盖伦形式或更易于处理/加工或提高其稳定性。因此，根据本发明的新型盐适合用作药剂，例如特别是用于作为膜铁转运蛋白抑制剂的用途。
如上所述，膜铁转运蛋白是铁转运蛋白，其负责通过肠来吸收所释放的铁并将其转移到血液循环中，从而将铁输送到适当的组织和器官。膜铁转运蛋白的失活或抑制使铁的输出失效，从而减少了肠中铁的吸收。因此，本发明意义上的膜铁转运蛋白抑制包括从细胞进入血液循环的铁转运的抑制和肠中的铁吸收的抑制。其中，铁转运和/或铁回流的抑制可以通过不同的机理方式实现，包括例如抑制膜铁转运蛋白的铁转运活性以及由此带来的铁回流的抑制，引发膜铁转运蛋白的内化、降解和/或减少，施用铁调素激动剂，即与铁调素或通过化合物竞争的化合物，其可抑制铁调素与膜铁转运蛋白的结合。
可以通过铁响应测定法(BLAzer-Assay)测量膜铁转运蛋白介导的铁转运活性的抑制来确定膜铁转运蛋白抑制，如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。此外，膜铁转运蛋白抑制可以通过以膜铁转运蛋白内化和降解测定法(FACS)或以膜铁转运蛋白泛素化和降解检测法所测量的膜铁转运蛋白内化和/或降解来确定，分别如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。此外，膜铁转运蛋白抑制可以通过测量作为铁调素激动剂的活性来确定，例如通过以铁调素内化测定法(J774)所确定的铁调素与膜铁转运蛋白的结合能力，如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。此外，膜铁转运蛋白抑制可以通过确认铁调素与膜铁转运蛋白结合的抑制来确定，例如通过生物物理膜铁转运蛋白-铁调素结合测定法(Hep Bind FP)，如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。此外，膜铁转运蛋白抑制可以通过测定化合物关于其通过膜铁转运蛋白阻断铁输出的能力的活性来确定，例如通过铁外流抑制测试法，如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。
因此，本发明意义上的膜铁转运蛋白抑制可以特别地通过上述至少一种测试方法中表现出的膜铁转运蛋白抑制活性来定义，特别是通过以下方式显示：
以铁响应测定法(Blazer Assay)测定膜铁转运蛋白介导的铁转运活性的抑制：IC50值[μm]不大于100(≤100)，优选不大于50(≤50)，更优选小于50(<50)。
膜铁转运蛋白内化和降解测定法(FACS)：EC50值[μm]不大于100(≤100)，优选不大于50(≤50)，更优选小于50(<50)。
膜铁转运蛋白泛素化和降解法：Western印迹的目测效果为“与铁调素相比为+”，“中间效果+/-”和“更强的中间效果+/+/-”，优选效果为“+”或“+/+/-”，最优选的是效果“+”。
铁调素内化测定法(J774)：IC50值不大于100(≤100)，优选不大于50(≤50)，更优选小于50(<50)。
生物物理膜铁转运蛋白-铁调素结合测定法：IC50值不大于100(≤100)，优选不大于50(≤50)，更优选小于50(<50)。
铁外流抑制法：IC50值不大于100(≤100)，优选不大于50(≤50)，更优选小于50(<50)。
膜铁转运蛋白抑制可以进一步通过体内模型来确定，如下文更详细描述的实施例中所描述的那样。合适的体内模型可包括，例如，通过测量血清铁的减少来检查空白小鼠的低铁血症；通过测量血清铁的抑制来检测预防贫血大鼠的铁吸收；通过测量血清铁的减少来检测纠正β2-微球蛋白缺陷型小鼠的高铁血症；通过测量脾脏或肝脏中的总铁来检测预防β2-微球蛋白缺陷型小鼠的铁过载；检测中间型β-地中海贫血小鼠模型中的贫血，无效性红细胞生成和铁过载的改善。
作为膜铁转运蛋白抑制剂的本发明的盐的活性尤其可以通过以下实施例中描述的方法测定。
如上所述，膜铁转运蛋白的抑制可以例如通过铁调素来影响，因此铁调素是铁吸收的基本调节因子，其抑制膜铁转运蛋白并因此阻断铁从细胞转运到血液循环中以及铁的吸收。还令人惊讶地发现，如本文所定义的几种盐可以充当铁调素模拟物或铁调素激动剂，其也包括在本发明意义上的膜铁转运蛋白抑制内。
因此，本发明中定义的盐也适用于抑制铁从细胞转运到血液循环中和抑制肠中的铁吸收，以及用作铁调素模拟物或铁调素激动剂。
由于本文定义的盐作为膜铁转运蛋白抑制剂的活性，本发明的盐进一步特别适用于抑制由膜铁转运蛋白介导的铁转运，从而适用于预防和/或治疗铁代谢紊乱导致的铁水平增加，与铁水平增加相关或由铁水平增加高引起的疾病，铁吸收的增加或铁过载，例如特别是组织铁过载，与无效性红细胞生成相关的疾病，或由铁调素水平降低引起的疾病。此外，本发明化合物适用于辅助治疗，即通过限制病原微生物如创伤弧菌可获得的铁的量，从而预防或治疗由所述病原微生物引起的感染。
其中，与铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)或无效性红细胞生成相关，涉及铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)或无效性红细胞生成，由铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)或无效性红细胞生成引起，或者会导致铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)或无效性红细胞生成的疾病包括地中海贫血症，血红蛋白病，例如血红蛋白E病(HbE)，血红蛋白H病(HbH)，血色素沉着症，溶血性贫血，如镰状细胞性贫血(镰状细胞病)和先天性红细胞生成障碍性贫血。
本发明的盐在治疗镰状细胞性贫血(镰状细胞病)中的活性可以通过使用小鼠模型来确定，例如，由Yulin Zhao等人在“MEK1/2 inhibitors reverse acute vascularocclusion in mouse models of sickle cell disease"；The FASEB Journal Vol.30,No.3,pp 1171-1186,2016中所描述的。所述小鼠模型可以适当地适用于确定本发明的盐在治疗镰状细胞性贫血中的活性。类似地，如上述未公开的国际申请PCT/EP2016/075305和PCT/EP2016/075306中所述的化合物的活性通常涉及在治疗镰状细胞性贫血中具有作为游离碱形式的膜铁转运蛋白抑制剂活性和/或药学上可接受的盐的形式的化合物，可以通过使用所述小鼠模型来检测，可能需要适当地适应优化的测试条件，这属于本领域技术人员的常规工作。
与铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)相关，涉及铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)，由铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)引起，或者会导致铁水平增加、铁吸收增加、铁过载(例如组织铁过载)的疾病进一步包括神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病和帕金森病，其中这些化合物被认为通过限制组织或细胞中铁的沉积或增加来起作用。
本发明的盐还适用于预防和/或治疗由过量铁或铁过载引起的自由基，活性氧族(ROS)和氧化应激的形成，还适用于预防和/或治疗铁过量或铁过载导致的心脏、肝脏和内分泌损害，以及进一步地适用于预防和/或治疗铁过量或铁过载所引发的炎症。
与无效性红细胞生成相关的疾病尤其包括骨髓发育不良综合征(MDS，骨髓增生异常)和真性红细胞增多症，以及先天性红细胞生成障碍性贫血。
进一步的疾病、病症和/或罹病状况包括由涉及感知全身性铁储存的基因，例如铁调素(Hamp1)，血色素沉着症蛋白(HFE)，铁调素调节蛋白(HJV)和转铁蛋白受体2(TFR2)的突变引起的铁过载，例如特别是与HFE和HJV基因突变有关的疾病，慢性溶血相关疾病，镰状细胞病，红细胞膜疾病，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD缺乏症)，红细胞生成性卟啉症，瑞克氏运动失调症，以及铁过载的亚群，例如输血性铁过载，铁中毒，肺含铁血黄素沉着症，骨质缺乏，胰岛素抵抗，非洲铁过载，哈勒沃登-施帕茨病，高铁蛋白血症，血浆铜蓝蛋白缺乏症，新生儿血色素沉着症和红血细胞病症(包括地中海贫血，包括α地中海贫血，β地中海贫血和δ地中海贫血，中间型地中海贫血，镰状细胞病和骨髓增生异常综合征)。
与铁水平增加相关的进一步的疾病和/或病症和/或罹病状况包括但不限于铁水平增加的疾病，包括运动失调、瑞克氏运动失调症、年龄相关性黄斑变性、年龄相关性白内障、年龄相关性视网膜疾病和神经退行性疾病，如泛酸激酶依赖型神经退行性疾病，不宁腿综合症和亨廷顿舞蹈病。
本发明的盐进一步地可适用于预防和治疗由铁调素缺乏引起的疾病。
鉴于此，本发明的另一个目的涉及含有一种药剂，其含有如上文所定义的盐中的一种或多种，例如特别是用于预防和治疗如上定义的任何适应症、状态，障碍或疾病的药剂。
本发明的一个进一步的目的涉及药学组合物和药剂，其包含如上文所定义根据本发明的盐中的一种或多种，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体和/或辅助物质和/或溶剂。本发明的一个进一步的目的涉及药学组合物和药剂，其包含如上文所定义的根据本发明的盐的一种或多种，以及任选地一种或多种进一步的药学上有效的化合物。该药学组合物包含，举例来说，至多99重量％或至多90重量％或至多80重量％或至多70重量％的本发明的盐，其余分别由药学上可接受的载体和/或辅剂和/或溶剂和/或任选地进一步的药学活性化合物形成。
当中，药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂为普通的药学载体、辅助物质或溶剂，包括惯常用于药学目的，尤其是用于固体医药制剂的各种有机或无机载体和/或辅助材料。例子包括赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；黏结剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟基丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素的钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、十二烷基苯磺酸钠；食用香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橘粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(paraben)(例如甲基对羟基苯甲酸酯、乙基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、丁基对羟基苯甲酸酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸及来自依地酸(titriplex)系列的多元羧酸，例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡，脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林；等等。
液体医药制剂，例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。而且，此类液体制剂还可含有pH-调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂(举例来说，甲基纤维素)、染料和/或调味剂，举例来说，如上文所定义。组合物是等渗的，即它们可具有与血液相同的渗透压。该组合物的等渗性可通过使用氯化钠及其他药学上可接受的试剂来调整，例如，举例来说，葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇及其他无机或有机的可溶物质。液体组合物的黏度可通过药学上可接受的增稠剂来调整，例如甲基纤维素。其他合适增稠剂包括，举例来说，黄原胶、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、卡波姆(carbomer)等等。增稠剂的优选的浓度将取决于所选的试剂。
可使用药学上可接受的防腐剂以增加液体组合物的储存寿命。苯甲醇是合适的，即使还可以使用包括，举例来说，对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇和苯扎氯铵的多种防腐剂。
上文提及的药学组合物适用于，举例来说，静脉内、腹膜内、肌内、阴道内、口腔内、经皮、皮下、黏膜皮肤、口服、直肠、经皮吸收、局部、皮内、脑池内或皮内施用，并举例来说，以丸剂，片剂(肠溶包衣片剂)，薄膜片剂、层状片剂，用于口服、皮下或皮肤给药(尤其作为膏药)的缓释制剂，长效制剂，糖衣丸，栓剂，凝胶剂，药膏，糖浆剂，粒剂，栓剂，乳剂，分散剂，微胶囊，微型制剂，纳米制剂，脂质体制剂，胶囊，肠溶衣胶囊，粉剂，吸入粉剂，微晶制剂，吸入喷剂，撒布粉(epipastics)，滴剂，滴鼻剂，鼻喷剂，气雾剂，安瓿，溶液剂，果汁，悬浮剂，输入溶液剂或注射溶液剂等的形式提供。
本发明进一步的目的涉及药剂或联合制剂，其含有一种或多种如上文定义的盐和至少一种进一步的药学活性化合物，例如尤其是用于预防和治疗铁过载及相关症状的化合物，优选地为铁螯合化合物，或用于预防和治疗上文定义的任何状态、障碍或疾病的化合物，例如尤其是用于预防和治疗地中海贫血症、血色素沉着症、镰状细胞病、神经退行性疾病(例如阿兹海默症或帕金森氏症)和相关症状的药学活性化合物。
本发明进一步的目的涉及如上文定义的盐本身与一种或两种其他活性成分(药物)在联合治疗(用于连续使用的固定剂量或自由剂量的组合)中的用途。此类联合治疗包含本发明的盐和至少一种额外的药学活性化合物(药物)共同给药。在固定剂量的联合治疗中，联合治疗包含共同投予本发明的盐和至少一种额外的药学活性化合物以固定剂量的制剂形式的共同给药。在自由剂量的联合治疗中，联合治疗包含本发明的盐和至少一种额外的药学活性化合物以各自化合物的自由剂量通过单种化合物的同时给药或通过单种化合物在分布的一段时间内的连续使用来共同给药。该至少一种额外的药学活性化合物(药物)尤其包含用于降低铁过载的药物(例如Tmprss6-ASO)或铁螯合剂，尤其是姜黄素、SSP-004184、去铁素(地夫立群，Deferitrin)、地拉罗司、去铁胺和/或去铁酮；或抗氧化剂，例如n-乙酰半胱胺酸、抗糖尿病药例如GLP-1受体激动剂、抗生素例如万古霉素(Van)或托普霉素、治疗疟疾的药物、抗癌剂、抗真菌药物、治疗神经退行性疾病，例如阿兹海默症和帕金森氏症的药物(例如多巴胺激动剂，例如左旋多巴)、抗病毒药物例如干扰素-α或利巴韦林、或免疫抑制剂(环孢菌素A或环孢菌素A的衍生物)、铁补充剂、维生素补充剂、红细胞生成刺激剂(例如，红细胞生成素，Epo)、抗炎症生物制剂、抗溶栓药、他汀类药物、升压药物及变力性(inotropi)化合物。
本发明进一步的一个目的涉及预防和/或治疗缺乏铁调素或铁代谢紊乱所导致的疾病的上述联合用药的用途，例如尤其是铁过载状态，例如尤其是地中海贫血症、镰状细胞病和血色素沉着症，以及本申请所述的其他病症。
本发明进一步的一个目的涉及将本文定义的盐本身或本文的上述联合治疗在与输血联合中的用途。
本发明的盐与其他治疗剂(第二药剂)的潜在协同或累加效应可通过中间型地中海贫血症(Hbbth3/+或Hbbth1/th1，杰克逊实验室)或重型地中海贫血症(C57-FLCth3/th3)的小鼠模型的组合研究来评价，从而在地中海模型中评价本发明的盐本身(即单独的盐)或与其他化合物联合对贫血、造血、铁过载、活性氧族(ROS)的产生、脾脏增大和其他生物标志物的影响。除了前一段中已经列出的联合疗法之外，根据本发明的联合疗法还包含本发明的盐与下列第二药剂之一的联合：
·修饰的激活素受体类型IIA或IIB融合蛋白(如Suragani RN等人的"Modifiedactivin receptor IIB ligand trap mitigates ineffective erythropoiesis anddisease complications in murine β-thalassemia."Blood.2014 Jun 19；123(25):3864-72和Dussiot M等人的"An activin receptor IIA ligand trap correctsineffective erythropoiesis inβ-thalassemia."Nat Med.2014 Apr；20(4):398-407中所述)，作为转化生长因子β(TGFβ)超家族成员的配体陷阱，例如RAP-011或RAP-536(ACE-011的小鼠类似物，Sotatercept或ACE-536，分别在专利申请WO2010019261中描述或在美国专利US8361957中要求权利保护的Luspatercept，Acceleron/Celgene)，或者TGFβ超家族成员的其他拮抗剂(抗体，抗体片段，非抗体支架药物或产生激活素受体配体陷阱的细胞)。
·JAK1/2或JAK2抑制剂，包括但不限于Ruxotilinib(诺华，在美国专利US7,598,257和US8,415,362中要求权利保护)或Fedratinib(赛诺菲)，如Casu C等人的"Short-termadministration of JAK2 inhibitors reduces splenomegaly in mouse models of β-thalassemia intermedia and major."；Haematologica,2017中所述。
·pan-HDAC抑制剂，例如帕比司他(LC实验室，美国，并且在美国专利US6,552,065和US6,833,384中要求权利保护)，或HDAC3抑制剂RGFP966(Selleckchem，如Pasricha SR等人的"Hepcidin is regulated by promoter-associated histone acetylation andHDAC3."Nat Commun.2017 Sep 1；8(1):403中所述)。
·蛋白裂解酶-2(也称为跨膜丝氨酸蛋白酶6(Tmprss6))的拮抗剂，如脂质纳米粒(LNP)配制的Tmprss6 siRNA或靶向小鼠Tmprss6的反义寡核苷酸(ASO)(如Guo S等人的"Reducing TMPRSS6 ameliorateshemochromatosis and β-thalassemia in mice."J.ClinInvest.2013 Apr；123(4):1531-41或Schmidt PJ等人"An RNAi therapeutic targetingTmprss6 decreases iron overload in Hfe(-/-)mice and ameliorates anemia andiron overload in murine β-thalassemia intermedia."Blood.2013 Feb 14；121(7):1200-8中所述)。
·外源性脱铁转铁蛋白(如Li H等人的“Transferrin therapy amelioratesdisease in beta-thalassemic mice."Nat Med.2010 Feb；16(2):177-82中所述)。
·铁调素诱导类固醇(HIS)作为环硫雄醇，黄体酮和米非司酮或黄体酮受体膜组分-1的拮抗剂(PGRMC1)，参考文献7。
·红系因子(erythroferron)拮抗剂，如抗体或配体陷阱
·重组促红细胞生成素(epo)。可供用作本发明治疗剂的促红细胞生成素是通过重组DNA技术在细胞培养中生产的，包括红细胞生成素针剂/普罗克里特(α依泊汀)和Aranesp(α达泊汀)或Myrcera(β依泊汀和甲氧基聚乙二醇)。
·甘氨酸转运蛋白1(GlyT1)抑制剂，如bitopertin(罗氏公司)。
本发明的盐可以作为单一药剂以10、30和60mg/kg每天两次口服给药，或者与上面列出的化合物之一(第二药剂)组合起来口服给药。更具体地，第二药剂将作为单一治疗剂量给药，或与本发明如下的盐共同给药：
·RAP-011或RAP-536可以以1、10或30mg/kg每周两次皮下注射，持续8周。
·JAK1/2抑制剂可以在不存在或存在本发明的盐的情况下每天口服给药两次。
·在不存在或存在本发明的盐的情况下，Ruxotilinib(60或180mg/kg)或Fedratinib(40或120mg/kg)可以每天一次口服给药，持续2周。
·在不存在或存在本发明的盐的情况下，帕比司他或RGFP966可以以10或20mg/kg每天一次给药。
·每天腹腔注射脱铁转铁蛋白100或300mg/kg，持续8周
·可以每天腹腔注射米非司酮(30或100mg/kg)，持续2周
·可以通过皮下注射每周两次施用对红系因子特异的抗体或配体陷阱
·促红细胞生成素可以每天200IU腹腔注射，持续2周
·甘氨酸转运蛋白1(GlyT1)抑制剂如bitopertin(罗氏公司)也可通过合适的途径给药。
根据本发明的盐、药剂及或联合制剂可以口服、肠胃外和静脉内给药。
为此目的，根据本发明的盐优选地以丸剂，片剂(例如肠溶包衣片剂)，薄膜片剂和多层片剂，用于口服给药的缓释制剂，长效制剂，糖衣丸，粒剂，乳剂，分散剂，微胶囊，微型制剂，纳米制剂，脂质体制剂，胶囊(例如肠溶衣胶囊)、粉剂、微晶制剂、撒布粉、滴剂、安瓿、溶液剂、悬浮剂、输入溶液剂或注射溶液剂的形式或适合吸入的制剂形式提供药剂或药学组合物。
在本发明优选的实施方式中，该盐以如上文所定义的片剂或胶囊的形式给药。这些可以，举例来说，以耐酸的形式或带有pH依赖性的包衣存在。
作为活性物质的本发明的盐可以，举例来说，以0.001mg/kg至500mg/kg体重的单位剂量，举例来说，一天1至4次给药。然而，该剂量可根据患者的年龄、体重、健康状况、疾病的严重性或给药类型而增加或减少。
据此，本发明进一步的一个目的涉及用于制备尤其是用于预防和治疗如上文定义的任何适应症、状态、病症或疾病，尤其是用于口服或肠胃外给药的药剂的如上文定义的盐、药剂、组合物和联合制剂。
本发明进一步的一个目的涉及用于进行如上文定义的预防和治疗的方法，例如尤其是用于预防和/或治疗与铁水平增加且尤其是与铁过载有关或导致铁水平增加且尤其是铁过载的铁代谢紊乱、与铁水平增加或铁过载相关或导致铁水平增加或铁过载的疾病、与铁水平增加有关或导致铁水平增加的铁贮积疾病，以及与无效红细胞生成有关的疾病，该方法包括向需要其的患者(人或动物)施用如上定义的盐、药剂、组合物或联合制剂。
其中，与铁水平增加或铁过载有关、相关的疾病，由铁水平增加或铁过载导致的疾病，或会导致铁水平增加或铁过载的疾病定义如上。
本发明进一步的一个目的涉及用于制备药剂的如上文定义的盐的用途，尤其是用于预防和治疗如上文定义的任何适应症、状态、病症或疾病。
附图说明
图1：本发明的式(I)
图2：所应用的DVS测量程序的可视化示例
图3.1：游离碱形式的实施例化合物No.127的结构，示出了所计算的pKa值
图3.2：SP236-FB-P1在DMSO-d6中的1H NMR
图3.3：SP236-FB-P1在50到3500cm-1处的FT-拉曼光谱的概况
图3.4：SP236-FB-P1在50到1800cm-1处的FT-拉曼光谱的指纹区
图4：SP236-FB-P1的PXRD图谱
图5.1：SP236-CIT-P1，SP236-CIT-P1(2)，SP236-CIT-P2和SP236-CIT-P3的PXRD图谱的比较
图5.2：SP236-CIT-P2的TG-FTIR热谱图
图5.3：SP236-CIT-P3的DSC热谱图
图5.4：SP236-CIT-P3和SP236-FB-P1在50到3500cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.5：SP236-CIT-P3和SP236-FB-P1在50到1800cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.6：SP236-CIT-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图5.7：SP236-CIT-P3的样品质量(％)和相对湿度(％)在时间上的曲线图，显示了由测量程序设定的样品质量(左侧y轴)和相对湿度(右侧y轴)
图5.8：SP236-CIT-P3的水蒸汽吸附等温线曲线图
图5.9：SP236-MLE-P1，SP236-MLE-P2和SP236-MLE-P3的PXRD图谱的比较
图5.10：SP236-MLE-P1的TG-FTIR热谱图
图5.11：SP236-MLE-P3的DSC热谱图
图5.12：SP236-MLE-P3和SP236-FB-P1在50到3500cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.13：SP236-MLE-P3和SP236-FB-P1在50到1800cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.14：SP236-MLE-P1在DMSO-d6中的1H NMR
图5.15：SP236-MLE-P3的样品质量(％)和相对湿度(％)在时间上的曲线图，显示了由测量程序设定的样品质量(左侧y轴)和相对湿度(右侧y轴)
图5.16：SP236-MLE-P3的水蒸汽吸附等温线曲线图
图5.17：SP236-PO4-P1和SP236-PO4-P2的PXRD图谱的比较
图5.18：SP236-PO4-P2的TG-FTIR热谱图
图5.19：SP236-PO4-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图5.20：SP236-PO4-P2在DMSO-d6中的31P NMR
图5.21：SP236-PO4-P2、SP236-PO4-P5、SP236-PO4-P6、SP236-PO4-P7和SP236-PO4-P8的PXRD图谱的比较
图5.22：SP236-PO4-P8和SP236-FB-P1在50到3500cm-1处的FT-Raman光谱的比较
图5.23：SP236-PO4-P8和SP236-FB-P1在50到1800cm-1处的FT-Raman光谱的比较
图5.24：SP236-PO4-P8的TG-FTIR热谱图
图5.25：SP236-PO4-P6的DSC热谱图
图5.26：SP236-PO4-P8的DSC热谱图
图5.27：SP236-PO4-P8的样品质量(％)和相对湿度(％)在时间上的曲线图，显示了由测量程序设定的样品质量(左侧y轴)和相对湿度(右侧y轴)
图5.28：SP236-PO4-P8的水蒸汽吸附等温线曲线图
图5.29：SP236-SO4-P1和SP236-SO4-P3的PXRD图谱的比较
图5.30：SP236-SO4-P3在DMSO-d6中的1H NMR
图5.31：SP236-SO4-P4、SP236-SO4-P5和SP236-SO4-P6的PXRD图谱的比较
图5.32：SP236-SO4-P4的TG-FTIR热谱图
图5.33：SP236-SO4-P6的样品质量(％)和相对湿度(％)在时间上的曲线图，显示了由测量程序设定的样品质量(左侧y轴)和相对湿度(右侧y轴)
图5.34：SP236-SO4-P6的水蒸汽吸附等温线曲线图
图5.35：SP236-SO4-P6的DSC热谱图
图5.36：SP236-SO4-P4在DMSO-d6中的1H NMR
图5.37：SP236-SO4-P6和SP236-FB-P1在50到3500cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.38：SP236-SO4-P6和SP236-FB-P1在50到1800cm-1处的FT-拉曼光谱的比较
图5.39：用于SP236-FB-P1的放大HPLC跟踪图
图5.40：用于SP236-CIT-P3的放大HPLC跟踪图
图5.41：用于SP236-MLE-P3的放大HPLC跟踪图
图5.42：用于SP236-PO4-P8的放大HPLC跟踪图
图5.43：用于SP236-SO4-P6的放大HPLC跟踪图
图6.1：SP236-BNZ-P2的PXRD图谱
图6.2：SP236-BNZ-P2的TG-FTIR热谱图
图6.3：SP236-BNZ-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图6.4：SP236-FUM-P1和SP236-FUM-P2的PXRD图谱的比较
图6.5：SP236-FUM-P2的TG-FTIR热谱图
图6.6：SP236-FUM-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图6.7：SP236-MLA-P1和SP236-MLA-P2的PXRD图谱的比较
图6.8：SP236-MLA-P1在DMSO-d6中的1H NMR
图6.9：SP236-SUC-P2的PXRD图谱
图6.10：SP236-SUC-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图6.11：SP236-SUC-P2的TG-FTIR热谱图
图6.12：SP236-LTAR-P1和SP236-LTAR-P2的PXRD图谱的比较
图6.13：SP236-LTAR-P1的TG-FTIR热谱图
图6.14：SP236-LTAR-P2的TG-FTIR热谱图
图6.15：SP236-LTAR-P1在DMSO-d6中的1H NMR
图6.16：SP236-LTAR-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图6.17：SP236-TOS-P1和SP236-TOS-P2的PXRD图谱的比较
图6.18：SP236-TOS-P2在DMSO-d6中的1H NMR
图7.1：根据制备实施例7.2的实施例化合物No.127的HCl-单盐的HPLC分析。
图7.2：根据制备实施例7.2的实施例化合物No.127的HCl-单盐的DSC热谱图。
图8.1：PP566-SO4-P1的PM1至PM6多晶型物PXRD图谱概况，从下到上为PP566-SO4-P2(PM1)、P5(PM2)、P6(PM3)、P8(PM4)、P10(PM5)和P11(PM6)
图8.2：PM1(PP566-SO4-P2)多晶型物的PXRD图谱
图8.3：PM1(PP566-SO4-P2)多晶型物的1H NMR
图8.4：PM1(PP566-SO4-P2)的DSC热谱图
图8.5：PP566-SO4-P1的PM1 DVS行为
图9.1：PP566-PO4-P1的PM1至PM11多晶型物的PXRD图谱概况，从下到上为PP566-PO4-P4(PM1)、P4-DRY(PM9)、P5(PM2)、P8(PM3)、P10(PM4)、P11(PM5)、P13(PM6)、P13-DRY(PM10)、P15(PM7)、P15-DRY(PM11)和P19(PM8)
图9.2：PM2(PP566-PO4-P5)多晶型物的PXRD图谱
图9.3：PM2(PP566-PO4-P5)多晶型物的1H NMR
图9.4：PM2(PP566-PO4-P5)的TG-FTIR热谱图
图9.5：PM2(PP566-PO4-P12)的TG-FTIR热谱图
图9.6：样品PP566-PO4-P2，P5，P6，P9，P12的PM2多晶型物的PXRD图谱概况，从下到上为PP566-PO4-P2，P5，P6，P9和P12
图9.7：PP566-PO4-P2(PP566-PO4-P12)的DVS行为
图10：用抗Fpn抗体MTP1免疫沉淀的免疫印迹
图11：铁调素(IC50：0.086μM)和实施例化合物No.127(IC50：0.080μM)的铁外流抑制
图12A和12B：由铁调素和根据实施例化合物94(实施例化合物No.94)的膜铁转运蛋白抑制剂所诱导的血清铁减少的量，其中
图12A：用合成的铁调素(5mg/kg)在指定时间腹腔注射(i.p.)的空白C57BL/6小鼠(naive C57BL/6mice)中的血清铁动力学；与
图12B：用指定量的铁调素(i.p.)或实施例化合物94(实施例化合物No.94)(p.o.)处理空白C57BL/6小鼠3h时的血清铁水平
图13：通过用膜铁转运蛋白抑制剂的实施例化合物No.40/甲基纤维素(A.)和实施例化合物No.40/聚氧乙烯蓖麻油EL(B.)处理的b2m-/-小鼠中的完全校正的升高的血清铁水平。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更详细地说明。这些实施例仅为说明，本领域的技术人员可将这些具体实施例扩展到进一步所要求保护的盐，例如特别是如本文所述的进一步的盐，其通过如图1中所示的根据式(I)的化合物形成。
在下文中，样品以SP236-XYZ-Pw形式的识别代码表示，其中XYZ指盐的共晶形成剂(即酸的种类)，Pw表示特定样品/实验(w＝1，2，...，n)。
作为起始化合物，使用实施例化合物No.127的游离碱。
I.实施例化合物No.127的各种盐的制备
1.缩略语
DCM 二氯甲烷
DMSO 二甲基亚砜
DSC 差示扫描量热法
DVS 动态蒸汽吸附
EtoAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇乙醇
FT Raman 傅立叶变换拉曼光谱
1H-NMR 质子核磁共振
i-PrOH 异丙醇
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
n-BuOH 1-丁醇
r.h./RH 相对湿度
r.t./RT 室温(22-25℃)
Tg 玻璃化转变温度
TG-FTIR 热重耦合傅里叶转换红外光谱
THF 四氢呋喃
PXRD 粉末X射线衍射
2.一般实验细节
DSC：差示扫描量热法用TA Instruments Q2000仪器(关或开，金或铝样品盘，无论是否使用针孔)进行。通常，加热速率为10K/min。在大多数情况下，熔点被理解为起始峰。
动态蒸汽吸附：使用自普优米德(ProUmi，以前称为“Projekt Messtechnik”)的“Sorptions Prüfsystem”SPS1 1-100n、August-Nagel-Str.23,89079 Ulm(德国)或使用自Surface Measurement Systems的DVS-1仪器进行DVS测量。将约5-20mg样品放入铝样品盘中。使用每小时5％的湿度变化率。应用测量程序的示例可视于图2中。基于在TGA中观察到的质量损失来调节显示水的有效含量的表现。在某些情况下进行双循环。
在多晶型物的评定测试中，将样品置于微量天平顶部的铝支架上，并在开始预定义的湿度程序之前在50％RH下平衡：
(1)在50％RH下2小时
(2)50→0％RH(5％/h)；在0％RH下5小时
(3)0→95％RH(5％/h)；在95％RH下5小时
(4)95→50％RH(5％/h)；在50％RH下2小时
吸湿性分类吸湿性根据相对于初始质量在85％RH下的质量增加进行分类如下：潮解性(吸收足够的水以形成液体)，非常吸湿(质量增加≥15％)，吸湿性(质量增加<15％但≥2％)，略微吸湿(质量增加<2％但≥0.2％)，或不吸湿性(质量增加<0.2％)。
元素分析：元素分析已在艾力蒙塔(Elementar)制造的'vario EL cube'分析仪上进行。分析仪使用燃烧将元素转换成简单的气体，例如，CO2、H2O、N2。通过选择性捕集柱分离产物气体，并作为热导率的函数来测量。通过热解将氧气转化为一氧化碳，并随后也可以根据热导率来测量。
1H-NMR：Bruker DPX300光谱仪；质子频率为300.13MHz；30°激发脉冲；循环延迟1秒；累计扫描16次；氘代DMSO作为溶剂；用于参考的溶剂峰；用TMS标尺显示所报告的化学位移。
HPLC：安捷伦(Agilent)系列1100HPLC系统，配有带有Chromeleon 6.8版软件的安捷伦1260 Infinity脱气装置。
卡尔-费休滴定：卡尔-费休滴定可以按照众所周知的方法进行，例如，根据ISO760-1978：水的测定-卡尔费休法(通用法)。
pKa-测量：Sirius T3滴定仪。对于具有低水溶性的样品，使用共溶剂应用光度或电位分析法。
粉末X射线衍射(反射)：使用Bruker D8 Advance粉末X射线衍射仪进行反射(Bragg-Brentano)几何形状来测量。2θ值通常是准确的，在±0.1-0.2°的误差范围内。除了施加轻微压力以获得平坦表面之外，通常在没有任何特殊处理的情况下制备样品。硅单晶样品架用于0.5mm深度的多晶型物的筛选。通常在未覆盖的情况下测量样品。管电压为40kV，电流为40mA。PXRD衍射仪配有LynxEye检测器。使用具有3°窗口的可变差异的狭缝。步长为0.02°2θ，步进时间为37秒。在测量期间，样品以0.5rps旋转。样品制备和测量在环境空气气氛中进行。
粉末X射线衍射(透射)：配有MythenI K探测器的Stoe Stadi P、Cu-Kα1辐射；标准测量条件：透射；40kV和40mA管电源；弯曲Ge单色器；0.02°2θ步长，12s或48s步进时间，1.5-50.5°2θ扫描范围；检测器模式：步进扫描；1°2θ检测器步；标准样品制备：将10至20mg样品置于两个乙酸酯箔之间；样品架：Stoe透射样品架；在测量期间旋转样品。所有样品制备和测量均在环境空气气氛中进行。
在多晶型物的评定测试中，将每个样品(25-40mg粉末)置于两个醋酸纤维素箔之间，所述两个醋酸纤维素箔用金属垫圈(0.4mm厚，12mm内径)间隔开。将该三明治元件转移到用于强效物质(SCell)的特殊样品架中，再次用醋酸纤维箔密封。在制备样品时没有使用特殊处理。所有的测量均使用环境空气气氛，并且在测量期间每个样品都旋转。
拉曼光谱：FT-Raman光谱在Bruker MultiRAM FT-Raman系统上记录，该系统具有在1064nm下操作的近红外Nd：YAG激光器和液氮冷却的锗检测器。分辨率为2cm-1的64次扫描累积在3500至-50cm-1的范围内；然而，由于滤波器截止效应，仅评价高于100cm-1的数据。标称激光功率通常为100或300mW。
溶解度：通过向约10mg的化合物中逐步添加溶剂来测定近似的溶解度。如果加入总共至少10mL的溶剂该物质不溶解，则溶解度表示为<1mg/mL。由于该方法固有的实验误差，溶解度值旨在被视为粗略估计，并且仅用于结晶实验的设计。
TG-FTIR：使用与Bruker FTIR光谱仪Vector 22(具有针孔的样品盘，N2气氛，加热速率10K/min)偶联的Netzsch Thermo-Microbalance TG 209进行热重测量。
近似溶解度：通过向约10mg化合物中逐步添加溶剂来测定近似的溶解度。如果加入总共至少10mL的溶剂解该物质不溶，则溶解度表示为<1mg/mL。由于该方法固有的实验误差，溶解度值被认为是粗略估计，并且仅用于结晶实验的设计。
3.起始材料的表征
起始化合物(游离碱/FB)：
实施例化合物No.127(SP236-FB-P1)
起始化合物的pKa计算：
使用ACD/pKa DB Vers.10.00，Release 10.00软件来计算理论上的pKa值。所获得的值在图3.1中与起始化合物(游离碱)的结构一起呈现。
起始化合物的1H NMR光谱：
SP236-FB-P1的NMR光谱在DMSO-d6中记录，如图3.2所示。该光谱包含在化学位移～δ12ppm处的至少一个宽信号，但该光谱似乎与所提供的化学结构一致。在NMR光谱中也观察到残留的乙醇和二氯甲烷。
拉曼光谱：
SP236-FB-P1的FT-拉曼光谱在50至3500cm-1的区域有记录，如图3.3所示，其中50至1800cm-1处的指纹区的放大视图如图3.4所示。
粉末X射线衍射：
以透射模式记录SP236-FB-P1的PXRD图谱如图4所示，其证实样品(为游离碱的形式)本质上是无定形的。
起始化合物的近似溶解度：
在许多不同的溶剂和溶剂混合物中测定SP236-FB-P1的近似溶解度，以帮助指导盐/共结晶实验。结果如下：
4.结晶实验
结晶条件：
在所有实验中，使用游离碱：酸的比例为1：1(mol：mol)；对于PO4和SO4的情况，还进行了游离碱：酸比例为10：1的两个实验。许多实验已经产生了结晶产物，如其PXRD图谱所示，这将在下面进行更详细地讨论。那些仅产生无定形产品的实验没有进一步详细介绍(即LLAC和MES)。
所选定的酸和结晶溶剂：
在下文中，进一步详细描述了根据上述条件的所选的盐的制备和表征：
5.所选择的实施例化合物No.127的盐
5.1实施例化合物No.127的柠檬酸盐
在乙醇中使用柠檬酸的结晶实验首先得到无定形物质，其在30℃加热并间歇超声处理后结晶(SP236-CIT-P1(2))。PXRD图谱与在甲醇中实验获得的结晶材料匹配(图5.1，SP236-CIT-P2)。该结晶形式的制备也可以在实验SP236-CIT-P3中以～600mg的规模再现。样品-P2含有的～0.9％的水和甲醇在～150℃时损失掉(图5.2)。在加热至200℃时，另有8.1％的水会损失。样品SP236-CIT-P3的DSC表明盐在起始温度153℃处熔化(图5.3)。在图5.4和图5.5中，将SP236-CIT-P3的FT-拉曼光谱与其游离碱的FT-拉曼光谱进行比较，并且在两个光谱之间可以看出明显的差异。在DMSO-d6中记录的SP236-CIT-P2的1H NMR光谱具有另外的信号～δ2.6ppm，其整合至3.8并且表明为1：1的游离碱：酸盐(图5.6)。假设该比例是正确的，TG-FTIR观察到的8.1％的水表明为1：1盐的三水合物。有趣的是，DVS显示从测量开始时相对样品重量的减少，样品最终在0％相对湿度下变为无水(图5.7和图5.8)。然后，一旦相对湿度增加，其就开始吸水，并且0和95％相对湿度下的相对样品质量之间的差异为～8％，这与TG-FTIR的结果很好地对应。元素分析结果也与1：1盐很好地匹配，但通过卡尔-费休滴定法测定的水含量表明样品是无水的：
| 元素/种类 | 理论上1:1的盐 | SP236-CIT-P3结果 |
| C | 54.0 | 53.0 |
| H | 4.9 | 5.1 |
| N | 14.0 | 13.7 |
| O | 24.0 | 24.2 |
| H2O | — | 0.5(卡尔-费休) |
5.2实施例化合物No.127的马来酸盐
在2-丙醇和THF中使用马来酸的筛选结晶实验产生结晶固体，其PXRD图谱彼此非常匹配(图5.9)。在2-丙醇中以约500mg的规模比例放大该合成，得到样品SP236-MLE-P3的相同结晶形式。TG-FTIR表明样品基本上是无水的，但从～170℃开始经历大量的质量损失和分解(图5.10)。在密封的金盘中的样品SP236-MLE-P3的DSC表明熔点为～161℃(图5.11)。记录了SP236-MLE-P3的FT-拉曼光谱，显示出与游离碱有多处差异(图5.12和图5.13)。SP236-MLE-P1的1H NMR光谱具有在δ6.1处积分为3.5的归属于马来酸的信号，这表明游离碱：酸的比例为1：1.75(图5.14)。当相对湿度降低到0％时，DVS显示质量损失为～1％，然后一旦相对湿度再次增加就会吸收水分(图5.15和图5.16)。在95％相对湿度下可达到～6.5％的最大质量增加，这对应于每摩尔盐～2.5水(假设游离碱：MLE的比例为1：1.75)。SP236-MLE-P3的元素分析与1：1.75盐完全吻合，卡尔-费休滴定法的水含量为0.4％，与TG-FTIR的结果一致：
5.3实施例化合物No.127的磷酸盐
以乙腈(SP236-PO4-P1)和2-丙醇(SP236-PO4-P2)作为溶剂使用磷酸筛选的结晶实验产生两种不同的PXRD结晶固体(图5.17)。重要的是要注意，这两个实验具有的游离碱：酸摩尔比为10：1。样品-P2的TG-FTIR表明在130℃下质量损失为1.0％，这是由2-丙醇损失的，于200℃以上分解开始(图5.18)。该样品还通过1H和31P NMR进行了研究，后者显示了磷酸根离子的证据(图5.19和图5.20)。两个实验以相同的方式进行，但游离碱：酸的摩尔比为1：1。这些实验仅得到无定形固体，因而未进一步研究。还进行了几个实验以进一步研究该系统并更好地理解合成。在SP236-PO4-P5中，重复实验-P2以确认其再现性。样品-P5的PXRD图谱与-P2的匹配(图5.21)，磷分析表明样品-P5是半磷酸盐(即2：1游离碱：磷酸盐(表5.3)。在实验SP236-PO4-P6中，以0.1摩尔当量逐步加入含水磷酸，直至达到2：1比例的游离碱：酸。PXRD图谱证实在-P2和-P5中获得了相同的结晶形式(图5.21)，并且2.83质量％磷的结果再次表明为半磷酸盐。实验SP236-PO4-P7以与-P6类似的方式进行，但是加入磷酸直至达到1：1的游离碱：酸比例，以试图获得单磷酸盐。所得固体的PXRD分析再次表明获得了半磷酸盐(图5.21)。在实验SP236-PO4-P8中以～600mg的规模放大该合成，也成功地产生了相同的结晶形式。在图5.22和图5.23中，将该样品的FT-拉曼光谱与游离碱的FT-拉曼光谱进行比较，并显示出实质性差异。令人惊讶的是，尽管具有相同的PXRD图谱，但SP236-PO4-P8的TG-FTIR显示出更多的水和2-丙醇存在于样品中(图5.24)。因此，看起来这种磷酸盐具有同晶型的溶剂化/水合和非溶剂化/水合的形式。密封于金盘中的样品SP236-PO4-P6和-P8的DSC显示出相当可重复的熔点，其起始温度为79和80℃(图5.25和图5.26)。这些值很好地对应于2-丙醇的沸点，并表明溶剂的释放和固体的熔化同时进行。DSC测量最有可能也应该在敞口的盘中进行研究。因为相对湿度从50％降低至0％(这在第一次循环期间未完成)，样品SP236-PO4-P8的DVS因而显示出质量即刻损失。在DVS的第二次循环期间观察到更大的质量损失，并且最高和最低的相对样品质量之差为～12.5％，这与TG-FTIR观察到的质量损失一致。12.5％的水含量对应于每2：1盐为～7分子的水。样品SP236-PO4-P5和-P8的元素分析有些一致，尽管碳含量变化很大：
另外值得注意的是通过卡尔-费休滴定法测定的8质量％的水含量，其显著低于在DVS中假定吸收12质量％的水，但可表明仍然存在一些2-丙醇。
5.4实施例化合物No.127的硫酸盐
用硫酸进行的第一次筛选实验是以10：1摩尔比的游离碱：酸进行的。在2-丙醇(SP236-SO4-P1)中的结晶产生结晶固体，其以较大规模(-P3)再生，而在乙腈(-P2)中的实验未能得到任何固体(图5.29)。结晶固体的1H NMR光谱并不能表明分子完全分解(图5.30)。以类似的方式进行另外两个实验，但这次使用的游离碱：酸摩尔比为1：1。由于使用了最初所需的原料比，因此这些结果更受关注。两种溶剂中的结晶实验产生了非常相似的PXRD结晶形式，并且在2-丙醇中的实验可以在～600mg规模上再现(图5.31)。TG-FTIR表明样品-P4含有～5.5％质量％的水，其在两种不同的步骤期间失去4％和1.5％，并在200℃以上开始分解(图5.32)。水含量为4％对应于每盐～1水，而1.5质量％的水则表示每盐0.5水(假设游离碱：硫酸盐为1：1)。DVS表示相对湿度从50降低到0％期间恒定的质量损失，然后一旦相对湿度再次增加，其质量也立即增加(图5.33和图5.34)。DVS中最小和最大相对样品重量之差在～5和5.5％之间，这与TG-FTIR的结果非常吻合，并且表明每盐总共1.5水(假设盐为1：1)。通过在密封的金盘中进行DSC测定，样品SP236-SO4-P6的熔化起始温度为173℃(图5.35)。SP236-SO4-P4的1H NMR光谱未显示分子的任何分解(图5.36)，并且硫酸盐的FT-拉曼光谱显示出与游离碱相比存在显著差异(图5.37和图5.38)。表5.4中的元素分析结果与1.5水相当吻合，尽管卡尔-费休滴定法测定的氧含量和水含量有些矛盾：
5.5所选择的盐的水溶解度和HPLC纯度概述
测定每种所选盐的水溶性和HPLC纯度，结果显示于下表中：
| 样品 | 溶解度(mg/mL) | 饱和溶液的pH | 纯度(相对面积％) |
| SP236-CIT-P3 | 23.6 | 4.3 | 88.2 |
| SP236-MLE-P3 | 14.2 | 4.2 | 82.2 |
| SP236-PO4-P8 | 29.8 | 7.0 | 93.1 |
| SP236-SO4-P6 | 8.2 | 3.2 | 77.9 |
在水中测得的溶解度范围从硫酸盐的～8mg/mL到磷酸盐的～30mg/mL。然而，必须注意，SP236-PO4-P8是2：1的游离碱：磷酸盐，因此提供了两个游离碱分子。该样品的饱和溶液的pH也显著高于其他盐的pH(pH～7对比于pH 3.2-4.3)。每种盐的纯度也通过使用主峰的相对面积百分比与检测到的所有其他峰的相对面积百分比的比较来确定，范围从SP238-SO4-P6的78％到SP236-PO4-P8的93％，测试样品的放大HPLC跟踪显示于图5.39(SP236-FB-P1)、图5.40(SP236-CIT-P3)、图5.41(SP236-MLE-P3)、图5.42(SP236-PO4-P8)和5.43(SP236-SO4-P6)：
6.其他成盐形成剂的筛选实验
6.1苯甲酸
使用苯甲酸进行了两次结晶实验。当使用2-丙醇作为溶剂(SP236-BNZ-P1)时没有获得固体，但是在实验中使用乙酸乙酯(SP236-BNZ-P2，图6.1)获得了结晶固体。通过TG-FTIR可以检测到样品中仍然含有～0.6％的乙酸乙酯，并在～200℃以上开始分解以及失去苯甲酸(图6.2)。1H NMR光谱表明另外5个芳香质子，并且表明为1：1的游离碱：BNZ盐(图6.3)。
6.2富马酸
使用THF作为溶剂体系(SP236-FUM-P1)在结晶实验中使用富马酸形成白色沉淀，然而通过PXRD发现该固体在性质上仅部分是结晶的。使用2-丙醇的实验似乎在25至30℃之间回火反应后得到更多的结晶样品(图6.4，SP236-FUM-P2)。后者样品的TG-FTIR表明在～140℃下有～2.6％的2-丙醇损失(图6.5)，并且1H NMR谱基于δ6.6ppm的信号表明游离碱：酸的比例为1：1.35。
6.3L-苹果酸
在2-丙醇中用L-苹果酸进行的结晶实验最初得到油状固体，其在25和30℃之间回火时结晶(SP236-MLA-P1，图6.7)。在THF中，类似实验仅得到无定形固体(SP236-MLA-P2)。前者样品的1H NMR光谱在δ2.4和3.9处具有归属于L-苹果酸的信号，表明游离碱：酸的比例为1：1(图6.8)。
6.4琥珀酸
使用THF作为溶剂，用琥珀酸进行的结晶实验产生了部分结晶的固体，其通过1HNMR显示出琥珀酸盐与游离碱为1：1比例的证据(SP236-SUC-P2，图6.9和图6.10)。TG-FTIR表明，在110℃时由于THF的损失，质量损失了3.1％，同时在150℃以上开始分解(图6.11)。使用乙醇作为溶剂(SP236-SUC-P1)的实验仅得到了粘稠的固体，未进一步研究。
6.5L-酒石酸
使用乙醇(-P1)和甲醇(-P2)作为溶剂，用L-酒石酸进行结晶实验。获得的固体的PXRD图谱表明两种样品都是结晶的，并且可能在结构上相似(图6.12)。这两种结晶产物含有相似质量百分比的溶剂/水(即～5.3％，见图6.13和图6.14)，它们的1H NMR谱基于～δ4ppm处的信号表明游离碱：LTAR的比例为1：1(见图6.15和图6.16)。
6.6甲苯磺酸
用甲苯磺酸的结晶实验在2-丙醇(-P1)和THF(-P2)中进行。PXRD表明获得的固体形式可能相似，但使用THF的实验产生了更多结晶样品(图6.17)。不幸的是，这些结晶的产率非常低，仅回收了少量细小的高静电固体。可以测量样品-P2的1H NMR光谱，并且表明游离碱：TOS的比例为1：1.5，样品中剩余～10摩尔％的THF(图6.18)。
7.制备实施例化合物No.127的HCl-单盐
7.1从游离碱开始的盐的形成
单HCl盐在乙醇中的溶解度比3HCl盐(已经从本发明的范围中放弃)高得多。
因此，单盐的产率更低。为了提高产率，可以使用乙醇-水的混合物作为结晶溶剂。
为了通过游离碱制备单HCl盐，将1.4g(3.4mmol)游离碱形式的实施例化合物No.127溶解在86ml乙醇中并加热至50℃。逐滴加入0.61g(1.05当量)32％HCl，并在2小时内将溶液冷却至0-5℃。过滤所得悬浮液，并用10ml 2-丙醇洗涤。将湿产物在45℃下真空(<100毫巴)干燥至少10小时。
产量为0.51g(理论计算产率为34％)，为白色固体形式。
7.2从实施例化合物No.127的3HCl-盐开始的盐的形成
由于单HCl盐在水中的溶解度降低，因此在pH>5时析出。
为了通过3HCl盐制备单HCl盐，将5g(9.7mmol)3HCl盐形式的实施例化合物No.127溶解在20-25℃的50ml水中。然后用30％NaOH将pH调节至pH 5-6，并将悬浮液搅拌10分钟。过滤悬浮液并用10ml 2-丙醇洗涤。将湿产物在45℃下真空(<100毫巴)干燥至少10小时。
产量为3.7g(理论计算产率为85％)，为白色固体形式。
单盐产物的特征在于根据申请人INS005324IPV-DE03v.2的内部方法通过常规滴定测定Cl-含量：
V＝体积AgNO3 0.01M
f＝AgNO3标准值0.01M 1.004
E＝初始重量[g]
理论计算值为7.97％，其证实了单盐的形成。
元素分析：
| 样品编号 | C(％) | H(％) | N(％) | Prot(％) |
| 理论计算上的单价盐 | 56.69 | 4.98 | 18.89 | |
| 样品1-1 | 55.47 | 5.589 | 18.36 | 0.000 |
| 样品1-2 | 55.71 | 5.684 | 18.40 | 0.000 |
| 平均 | 55.59 | 5.636 | 18.38 | 0.000 |
| 绝对标准偏差 | 0.17 | 0.068 | 0.03 | 0.000 |
| 相对标准偏差(％) | 0.3 | 1.199 | 0.16 | 0.000 |
| δ(％) | 0.23 | 0.096 | 0.04 | 0.000 |
结晶发生在pH 5-5.5。
假设δ由残余的水产生。
图7.1显示了通过HPLC分析确认的单盐
图7.2显示了通过DSC测量确认的单盐。
II.实施例化合物No.127所选定盐的多晶型物的评价
在下文中，样品由PP566-XYZ-Pw形式的识别代码表示，其中XYZ特指为盐/共晶形成剂(即酸的种类)，其为硫酸盐的SO4或磷酸盐的PO4，Pw表示具体的样品/实验(w＝1，2，...n)。
多晶型物编号为PMx，即PM1、PM2、PM3......等。
1.实施例化合物No.127的硫酸盐的多晶型物
以下实验描述了实施例化合物No.127硫酸盐的各种多晶型物的评价，并确定了固态实施例化合物No.127的硫酸盐的稳定形式(或水合物)。本文评价的所有硫酸多晶型物为化合物No.127的1：1盐。
1.1原料特性(PP566-SO4-P1)
粉末X射线衍射：
以反射模式(未示出)记录PP566-SO4-P1的PXRD图谱，其证实样品本质上是无定形的。
TG-FTIR分析：
TG-FTIR表明无定形硫酸盐PP566-SO4-P1含有约.5％wt，并在约160℃时开始分解(未显示)。
DSC分析：
PP566-SO4-P1首先在53℃下产生一个与ΔH为4.7J/g有关的小的吸热事件。在78℃时，可以观察到一个与ΔH为52J/g有关的剧烈放热事件，可能为结晶作用。在59℃时可以看到一个额外的小的热事件。假定该信号对应于无定形部分的玻璃化转变，然而这尚未最终确认。在164℃会发生广泛的吸热事件，这可能是由于伴随化合物分解的新结晶相的熔化产生的。
1H NMR光谱：
通过1H-NMR来验证化合物PP566-SO4-P1的化学完整性。光谱显示出以10ppm为中心的分配给氢键形成剂或可能不完全的去质子化的酸(可能为HSO4)(光谱未显示)的广泛特征。
DVS研究：
分析了DVS中物质的行为。该化合物在50％r.h.下非常快速地吸收水(约4.5％wt)。并达到稳定水平，表明结晶水合物的形成。在0％r.h.下，样品损失了初始重量的约5％wt(在50％r.h.时为重量的9％)，但是没有达到稳定水平，这表明一些水仍然存在于化合物中，但该物质可能最终会达到无水状态。然而，这个假设状态非常不稳定，因为在5％r.h.时，其已经开始吸水，在55％r.h.下能获得超过10％wt，此时其经历了约3％wt的骤减，表明湿度能诱导重结晶，其中产生较少水合的结构。这个过程一直持续到大约65％r.h.，此时化合物达到最小值，然后物质慢慢吸收水直到80％r.h.(2％wt的量级)；但是当达到一个关键的r.h.时，在几分钟内，样品吸收将超过13％wt并达到一个看起来非常稳定的平台期，即使相对湿度降低至50％也是如此，这表明形成了更高的水合物，其稳定性超过50％(未显示)。
在DVS循环之后进行了PXRD，其显示了结晶材料(图谱未在此显示)。
1.2多晶型物的评价
通过将材料悬浮于各种溶剂和溶剂混合物中来研究化合物PP566-SO4-P1的多晶现象，以研究各种物理条件和水活性。到目前为止，已经鉴定出至少6种结晶形式(PM1至PM6)，但可以假设有更多。通过在45℃下的真空干燥来测试固体形式。结果概况如下表所示：
所得的PM1至PM6形式的PXRD概况描述于图8.1中。
1.3多晶型物形式PM1
PM1多晶型物形式自MeCN、i-PrOH，DCM，丙酮，丙酮：水95：5和丙酮：水9：1中获得。PXRD显示了宽峰，表明结晶性差(图8.2)，但1H-NMR显示化学完整性得以保持(图8.3)。样品PP566-SO4-P2的TG-FTIR显示出2.5％wt的水分损失，其开始于约50℃直至150℃，表明为半水合物(图8.4)。在丙酮-水9：1中从样品中获得PM1形式，该事实表明PM1在水活度高达0.7时是稳定的。令人惊讶的是，在实验中PM1形式可以用无水溶剂获得。在这些情况下，水可能来自具有约5％水的原料，如在各自的TG-FTIR中可见(本文未显示)。PM1形式耐真空干燥，即使在45℃和p<30毫巴下过夜干燥(实验PP566-SO4-P9-DRY)后仍保持结晶性。该形式也可以在独立实验中重复和独立地获得。通过DVS、TG-FTIR、DSC和NMR进一步研究该形式。
DVS在两个周期的湿度斜坡中进行(图8.5)。同样在PM1形式的情况下(如本文未示出的无定形起始材料)，该材料在热谱中显示出极其复杂的行为。当湿度降低至0％RH时，几乎没有％wt损失，并且热谱达到最小值，当RH增加时，样品回到接近原始重量，并缓慢吸水(2-3％wt)，然而，当达到80％RH时，材料迅速吸收约15％wt的水，没有达到稳定水平，如果材料在95％RH下保持更长时间，可能会继续吸收质量。当湿度回到50％时，水合程度看起来是稳定的，然后当接近0％时，急剧损失18％wt。在第二循环期间，吸收更快，并且类似于在无定形相中观察到的(本文未示出)，突然急剧下降表明重结晶。然后该材料快速吸收质量至几乎20％wt，直到在循环结束时稳定在50％wt。这种行为给出了水合物形成机理的一些洞见，并表明当盐达到高水合水平并暴露于干燥条件时，晶格坍塌并经受非晶相；这是由观察到的PM6形式的行为所支持(见下文)。当在5℃和50℃下悬浮于EtOH：水为4：1和3：1的混合物中时，PM1形式看起来也是稳定的。
总之，PM1形式在严格的湿度控制条件下(约50％，在任何情况下低于70％RH)保持稳定，这通过将10mg PM1暴露于53％RH下10天然后进行PXRD(实验PP566-SO4-P24)来确认。多晶型物仍然是PM1。
理论的和实验的水合物
| 水化 | 水含量％ |
| 半水化合物 | 1.8 |
| 一水化合物 | 3.7 |
| 结果 | 2.5 |
1.4多晶型物形式PM2
PM2多晶型物形式是高度结晶的，并且仅从EtOH获得。1H-NMR和TG-FTIR表明为单一的EtOH溶剂化物(本文未显示)。有趣的是，在TG-FTIR中仅存在痕量的水，表明EtOH(约8.3％wt)取代了晶格中的水，并且倾向于形成高度有序的系统。这与溶剂在120和150℃之间(远高于乙醇的沸点)的急剧损失一致。该形式也耐真空干燥，并且如实验PP566-SO4-P5-DRY所证实的那样，在30mbar、45℃下过夜干燥后PXRD没有改变。
1.5多晶型物形式PM3
PM3多晶型物形式从EtOAc中的浆液中获得，结果表明结晶性差。PM3形式在线宽方面与PM1形式几乎没有相似之处，但PXRD中的峰位置基本上不同(本文未示出)。1H-NMR证实了化合物的化学完整性(本文未显示)，并且TG-FTIR证实了该形式的溶剂化性质，显示出在高达150℃下释放EtOAc(本文未显示)。该形式也耐真空干燥，并且如实验PP566-SO4-P6-DRY所证实的那样，在30mbar、45℃下过夜干燥后PXRD保持不变。
1.6多晶型物形式PM4
PM4多晶型物形式为高度结晶形式，其在MeOH和几种MeOH：水的混合物中的浆液实验中获得的。通过1H-NMR和TG-FTIR揭示了该形式的溶剂化性质(本文未显示)。尽管存在一些水，但大部分水在100℃左右损失掉，因此不太可能存在混合的水合物/溶剂化物。另一方面，在约110℃开始释放MeOH，高于该溶剂的沸点35℃以上，并且在约170℃结束，表明MeOH与晶格紧密结合。PM4形式是稳定的，直至水活度至少为0.6时，如实验PP566-SO4-P13至P16所示的那样。
1.7多晶型物形式PM5
PM5多晶型物形式由THF中的悬浮平衡获得，并显示出具有锐利反射的良好的结晶度(本文未示出)。该化合物是具有少量水的THF溶剂化物，所述水是不可量化的。1H-NMR显示盐化合物的化学完整性得以保持，THF在1.76ppm处也可见，但3.63ppm处的共振与其他信号重叠(图9.16)。由于信号与水重叠，在TG-FTIR中近似估计THF的量，其小于3.9％wt。该相的溶剂化性质可通过在高达160℃的热谱中可以观察到THF的事实得到证实，这表明其与晶格紧密结合(图9.17)。这可以通过以下事实得到证实：其也耐真空干燥，并且如通过实验PP566-SO4-P10-DRY所证实的那样，在30mbar、45℃下过夜干燥后PXRD没有变化。
1.8多晶型物形式PM6
PM6多晶型物形式是在本实验中获得的水合最高的形式，并且是从水中悬浮平衡获得的。该形式显示出高度的结晶性(这里未示出)，并且即使r.h.降至50％，其在合理的时间内也看起来是稳定的。与本文评估的其他多晶型物形式相似，盐化合物的化学完整性未被改变(1H-NMR，本文未显示)。包含在晶格中的水为19.6％wt，接近六水合物，并且释放到约150℃下释放(本文未显示)，与用DVS观察到的值(约19％wt)一致。如实验PP566-SO4-P17-DRY所证实的那样，一旦在真空下干燥过夜，该形式就转变成无定形相。
2.实施例化合物No.127的磷酸盐的多晶型物
以下实验描述了实施例化合物No.127的磷酸盐的各种多晶型物的评价，并确定了固态的实施例化合物No.127的磷酸盐的稳定形式(或水合物)。本文评价的磷酸多晶型物PM1和PM3至PM11为化合物No.127的2：1盐。本文评价的磷酸多晶型物PM2为化合物No.127的1：1盐。
2.1原料特性(PP566-PO4-P1)
粉末X射线衍射：
以反射模式记录PP566-PO4-P1的PXRD图谱，其证实样品为部分结晶或介晶态(本文未显示)。
TG-FTIR分析：
TG-FTIR表明磷酸盐复合物含有约1.3％wt的异丙醇。PP566-PO4-P1在120℃左右开始分解。(本文未示出)。
DSC分析：
PP566-PO4-P1具有复杂的热行为。在约47℃下可以观察到玻璃化转变，与约0.8J/g℃的热容量变化有关。然后在约57℃下发生吸热的热事件。样品为部分结晶或由介晶(玻璃状液晶)材料组成(本文未示出)。
1H NMR光谱：
通过1H-NMR验证化合物PP566-PO4-P1的化学完整性。在磷酸盐光谱中可以观察到少量的异丙醇，这与TG-FTIR一致。该光谱具有以5.7ppm为中心的广泛特征，分配给氢键形成剂或可能没有完全去质子化的酸(H2PO4 -，HPO4 2-)。
DVS研究：
通过DVS分析物质的行为。化合物PP566-PO4-P1表明形成了几种水合物。样品在几分钟内吸收水，然后显示在50％r.h.达到稳定水平，然后在0％r.h.下形成可能的无水相，对水非常敏感(在约5％r.h.下开始吸收质量)。最终在95％r.h.下达到稳定水平，但是这种优异的水合状态在较低的r.h.下不稳定，并且在50％r.h.下时失水到达新的稳定水平(但与实验开始时观察到的初始稳定水平不同)。在50％r.h.下的最终含水量约为10％。
在DVS循环后进行PXRD，其显示存在PM5形式的水合物(本文未显示)。
元素分析：
将原料进行CHNF分析，由ICP-OES测定磷含量。化学计量接近于实施例化合物No.127：PO4为2：1的比例。
元素分析结果概况
| 复合物 | C(％) | H(％) | N(％) | F(％) | P(％) |
| 1:1(理论) | 50.1 | 4.2 | 16.7 | 3.6 | 6.1 |
| 2:1(理论) | 55.1 | 4.6 | 18.3 | 3.9 | 3.4 |
| 结果 | 54.0 | 5.0 | 18.0 | 4.0 | 3.4 |
2.2多晶型物的评价
通过将材料悬浮于各种溶剂和溶剂混合物中来研究化合物PP566-PO4-P1的多晶现象，以研究各种物理条件和水活性。迄今为止已鉴定出至少11种结晶形式(PM1至PM11)，但可以假设有更多。结果概况如下表所示：
所得的PM1至PM11形式的PXRD概况描述于图9.1中。
2.3多晶型物形式PM1
PM1多晶型物形式通过DCM获得，并显示中等结晶性(本文未显示)，1H-NMR显示化学完整性得以保持(本文未显示)。1H-NMR在5.57ppm处的信号表明存在DCM。TG-FTIR显示DCM的损失为14.2％wt，其开始于约30℃，可能是物理吸附的DCM；然而，质量会损失持续直到150℃，表明其为溶剂化物(本文未显示)。当在45℃下真空干燥12小时时，该形式逐渐形成少量结晶的形式。
2.4多晶型物形式PM2
PM2多晶型物形式是高度结晶的，并且仅从EtOH中获得，但也可从其他几种溶剂中获得，这表明其可能是无水相(图9.2和图9.6)。尽管实验PP566-PO4-P5的1H-NMR和TG-FTIR表明它可以为半乙醇溶剂化物(分别为图9.3和9.4)，因为乙醇一直释放直到170℃，但TG-FTIR记录得到了PM2形式的另一个样品(实验PP566-PO4-P12，来自丙酮的浆料)，并且热谱显示没有溶剂释放，也没有质量损失直至在约150℃下的分解温度。这表明该化合物的结构可以在晶格中容纳不同的溶剂，并保持为相同的固体状态结构。结晶形式在45℃下耐真空干燥过夜。针对该形式也进行了DVS。材料在95％r.h.下吸收了约0.7％wt，达到了稳定水平，并在该循环后恢复到略低的重量(图9.7)。该材料仅略微吸湿。
对该材料也进行了元素分析，结果与1：1盐一致：
PP566-PO4-P24的元素分析结果
| 复合物 | C(％) | H(％) | N(％) | F(％) | P(％) |
| 1:1(理论) | 50.1 | 4.2 | 16.7 | 3.6 | 6.1 |
| 2:1(理论) | 55.1 | 4.6 | 18.3 | 3.9 | 3.4 |
| 结果 | 49.1 | 4.6 | 16.1 | 3.6 | 5.9 |
2.5多晶型物形式PM3
PM3多晶型物形式为高度结晶的形式，其是在MeOH中的浆料实验中获得的，在MeOH：水为95：5的混合物中形成与PM7的混合物(见下文)。通过1H-NMR和TG-FTIR揭示该形式的溶剂化性质(本文未显示)。MeOH的释放在约90℃开始，高于该溶剂的沸点35℃以上，并且在约120℃以急剧的步骤结束，表明MeOH与晶格紧密结合。值得注意的是，该相的形成具有非常窄的水活度范围，并且逐渐形成混合的溶剂化物：水合物的形式(形式PM7)，略低于aw＝0.2，并且在aw＝0.3时没有这种形式的痕迹。
2.6多晶型物形式PM4
PM4多晶型物形式是在THF中的悬浮平衡获得的，并且显示出低度结晶性和宽的反射(本文未示出)。该化合物为THF溶剂化物。1H-NMR显示API的化学完整性得以保持，并且THF在1.76ppm和3.63ppm处也是可见的(本文未显示)。THF的量可以通过TG-FTIR估算，并且为约2.8％wt。该相的溶剂化性质通过以下事实得到证实：直至180℃都可以在热谱中观察到THF，并伴随着分解，这表明其与晶格紧密结合(本文未示出)。
2.7多晶型物形式PM5
PM5多晶型物形式是在本实验中获得的水合最高的形式。它是从水中悬浮平衡获得的，并以95％r.h.下储存材料(参见起始材料的DVS)。该形式显示出高度的结晶性(本文未示出)。如所获得的其他形式那样，API的化学完整性未被改性(1H-NMR，本文未显示)。包含在晶格中的水不能通过TG-TFIR定量，因为在实验PP566-PO4-P11中没有足够的材料可以回收，但可以通过DVS推断出为约11％重量(本文未显示)。
2.8多晶型物形式PM6
PM6多晶型物形式是低于PM5的水合物，其从MeOH：水为3：1和4：1的混合物中获得。该形式显示出高度的结晶性(本文未示出)。如所获得的其他形式那样，化合物的化学完整性未被改性(1H-NMR，本文未显示)。在TG-FTIR实验期间以两个步骤释放水(本文未示出)。通过TG-FTIR和NMR光谱都没有观察到痕量的甲醇。该形式在中等水活度(约0.4至0.6)下获得。
2.9多晶型物形式PM7
PM7多晶型物形式为混合的水合物溶剂化物，其从甲醇：水为9：1(aw＝0.3)的混合物中获得，并且为纯晶相(本文未显示)，其中甲醇和水都与晶格结合。该形式在相对低的水活度下获得。TG-FTIR显示两种溶剂在两个独立步骤中的释放质量(本文未显示)。
2.10多晶型物形式PM8
PM8多晶型物形式被认为是混合溶剂化物/水合物，并且在水活度在0.5和0.7之间时产生(本文未示出)。有趣的是，当在室温下在纯丙酮中搅拌化合物时，未观察到丙酮溶剂化物(实验PP566-PO4-P12)。
2.11多晶型物形式PM9
在将材料PP566-PO4-P4暴露于30毫巴和45℃下约12小时后获得PM9多晶型物形式。推测该形式是来自PM1(DCM溶剂化物)的去溶剂化形式。该形式的结晶性差，并且在衍射图中显示宽峰(本文未显示)。
2.12多晶型物形式PM10
在将材料PP566-PO4-P13暴露于30毫巴和45℃下约12小时后获得PM10多晶型物形式(此处未示出)。有趣的是，该形式与PM5的水合物形式而不是PM6具有一些相似性(本文未显示)，但结晶较少，且向较高2θ的轻微偏移，这表明单位细胞略小(导致假设它可能为较低的水合物)。这通过TG-FTIR证实(本文未显示)。
2.13多晶型物形式PM11
在将材料PP566-PO4-P15暴露于30毫巴和45℃下约12小时后，获得PM11多晶型物(此处未示出)。该形式的结晶性差，TG-FTIR表明存在水(本文未显示)。
III.药理学分析
用选择的实施例化合物以相应的游离碱形式和/或以HCl三重盐的形式进行下列药理学测定。由于根据式(I)的化合物主要构成了活性原理，因此对于根据本发明的相应盐来说可以预期有相当的活性结果。以下实验结果支持根据本专利申请的新盐(包括它们的溶剂化物，水合物和多晶型物等)保留有膜铁转运蛋白抑制活性，并且还可以改善膜铁转运蛋白抑制活性，和/或改善化合物的药代动力学特征，和/或改善化合物的理化性质以使其更容易配制成盖仑制剂形式，和/或具有以结晶形式分离的优点，其可以改善化合物的理化性质，以使这些化合物更容易配制成盖伦形式或更容易处理/加工或提高其稳定性。
特别是，在以下试验中，已经测试了以三盐(3HCl)的形式和/或以游离碱的形式的实施例化合物，如下：
| 实施例化合物编号 | 碱 | 3氯盐 |
| 1 | + | + |
| 2 | + | - |
| 4 | + | - |
| 40 | + | + |
| 94 | + | + |
| 118 | - | + |
| 126 | + | + |
| 127 | + | + |
| 193 | + | - |
| 206 | + | - |
| 233 | + | - |
| 234 | + | - |
| 208 | + | - |
| 225 | + | + |
1.铁调素内化试验(J774)
此细胞试验容许通过显微检测荧光标记的铁调素进入J774细胞的内化来对铁调素和膜铁转运蛋白(Fpn)的结合进行定量。J774是小鼠巨噬细胞细胞系，其在与铁孵育时显示能内源表达Fpn(Knutson et al,2005)。与Fpn结合的铁调素能触发铁调素和Fpn的内化和降解。然而，在铁调素肽骨架降解后，与铁调素结合的TMR(6-羧基四甲基罗丹明)的荧光团仍与细胞有关。因此，与细胞有关的TMR的荧光的显微检测是铁调素与Fpn结合以及铁调素和Fpn的内化的一种措施。假使阻止TMR-铁调素与Fpn结合，则细胞的TMR荧光会保持低位(Dürrenberger et al,2013)。如下所述，在该试验中评价了小分子量的Fpn抑制剂化合物在体外的效果。
从约80％汇合培养中收集的J774细胞以8×105个细胞/ml接种在含有200μM Fe(III)NTA(次氮基三乙酸)的完全培养基(DMEM、10％FBS、1％青霉素-链霉素)中、每孔100μl的96孔MicroClear板(Greiner；Cat.655090)，并于37℃、5％CO2下生长。在培育过夜后，将细胞用预温的DMEM w/o酚红洗涤3次，在最后洗涤之后，添加每孔30μl的DMEM w/o酚红，并以一式三份添加每孔10μl连续稀释的测试化合物。使J774细胞与测试化合物于37℃、5％CO2下预培育15min，之后添加25nM终浓度的TMR-铁调素。使细胞以50μl总体积于37℃、5％CO2下培育2小时，随后将Hoechst 33342染料加至0.5μg/ml最终浓度来染色细胞核，并于37℃、5％CO2下培育10min。细胞用PBS洗涤3次，并在室温下固定于100μl 4％的多聚甲醛的PBS中15min。在移除多聚甲醛溶液后，将细胞用PBS洗涤3次，留下每孔100μl并用铝箔板密封该板。使用带有20×高NA物镜的ScanR平板成像器(Olympus)获得TMR(530-550nm激发/575-625nm发射/400ms暴露时间)和Hoechst 33342(360-370nm激发/420-460nm发射/10ms暴露时间)的荧光影像。每孔取四张照片，荧光通道覆盖每孔约1500个细胞。获得的影像数据用ScanR影像分析软件进行分析。影像分析包括细胞核的检测(Hoechst 33342荧光)、细胞相关区域的识别、虚通道的应用以及降低滚动球类型背景的阈值，接着应用和(平均)算法来测量细胞相关的TMR荧光，以作为内化的TMR-铁调素的定量测度。用和(平均)原始数据通过使用Prism5软件(GraphPad Software Inc.，版本5.02)的“log(抑制剂)vs应答”曲线拟合来计算出IC50值。就各数据组而言，将“log(抑制剂)vs应答(三个参数)”模型的拟合与“log(抑制剂)vs应答–可变斜率(四个参数)”模型的拟合相比，使用优选模型的IC50数据。在铁调素内化试验中测定的Fpn抑制剂的IC50数据列于表1。在此试验中未标记铁调素的IC50为0.015±0.011μM。
表1在铁调素内化试验中测定的Fpn抑制剂的平均(AVE)IC50数据以多次测量显示
表1
| 实施例化合物编号 | J774 IC50(μm) |
| 1 | 0.012 |
| 2 | 0.035 |
| 4 | 0.155 |
| 40 | 0.049 |
| 94 | 0.012 |
| 118 | 0.103 |
| 126 | 0.096 |
| 127 | 0.009 |
| 193 | 0.287 |
| 206 | 0.18 |
| 208 | 0.012 |
| 233 | 16 |
2.生物物理膜铁转运蛋白-铁调素结合试验
使用生物物理试验来更直接地确认与膜铁转运蛋白(Fpn)结合的铁调素的抑制作用。将TMR-铁调素与从毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞(其表达有带有C-端FLAG亲和标签的人Fpn)中分离的纯化的人Fpn的培育(Bonaccorsi di Patti，2014)致使TMR-铁调素配体的荧光极化(FP)增加。测试小分子量Fpn抑制剂对TMR-铁调素与Fpn的结合的抑制作用，其通过TMRFP信号的剂量依赖性减少来测定，如下文详述。
置于含有50mM Tris-HCl pH7.3、200mM NaCl、0.02％DDM、0.1％BSA的FP测定缓冲液中的1.3μM的人Fpn和30nM的TMR-铁调素的混合物以每孔16μl接入384孔黑色低容量圆底板(Corning，Cat.3677)中。以一式两份添加8μl连续稀释的测试化合物，以达到分别为1μM和20nM的最终的Fpn和TMR-铁调素浓度。使该板于室温培育90分钟，于SynergyH1荧光读取器(BioTek)中测量平行(S)和垂直(P)荧光。FP值根据下面的公式以mP计算。
IC50值以计算的mP值测定，如铁调素内化试验所述，并且列于表2。此试验中未标记的铁调素的IC50为0.37±0.067μM。
表2在生物物理铁调素-膜铁转运蛋白结合试验中测试的Fpn抑制剂的平均(AVE)IC50数据以多次测量显示
表2
3.在铁应答试验中的膜铁转运蛋白介导的铁输出活性的抑制
在此试验中，通过监测与人铁蛋白启动子以及包含在铁蛋白mRNA的5'非翻译区中的相关铁调节元件(IRE)融合的β-内酰胺酶(BLA)报告基因的活性来间接测量细胞内铁水平。在此类细胞系中的膜铁转运蛋白(Fpn)的表达导致铁流出和较低的铁水平，其通过报告基因的较低活性反映出来。另一方面，Fpn-介导的铁流出的抑制导致细胞铁水平升高，其通过报告基因活性的增加检测到。如下文所述，在此体外铁应答试验中针对剂量依赖效应测量了小分子量Fpn抑制剂化合物。
HEK-293细胞系#354是通过(i)向多西霉素可诱导型pTRE-Tight-BI质粒的衍生体(Clontech,Cat.631068)中插入人Fpn-GFP的融合构建体以及(ii)人铁蛋白启动子-BLA报告基因转入HEK-293 Tet-ON Advanced细胞系的衍生物(Clontech)的稳定整合所生成。为了生成铁蛋白-BLA报告基因构建体，人铁蛋白H启动子的1.4kb片段通过PCR从人基因组DNA(上游引子5’-CAGGTTTGTGAGCATCCTGAA-3’；下游引子5’-GGCGGCGACTAAGGAGAGG-3’)中扩增，并插入到存在于pcDNATM6.2/cGeneBLAzerTM-DEST质粒(Invitrogen,Cat.12578-043)中的BLA基因的前面，由此置换原始的CMV启动子，并将调节铁蛋白基因翻译的IRE置于报告基因的起始密码子的上游约170bp处。从约80％的汇合培养物中收集#354细胞，以1.8×105个细胞/ml接种在DMEM/F12 GlutaMAXTM培养基(Invitrogen,Cat.31331-028)中，其中培养基中含有10％FBS(Clontech,Cat.631106)、1％青霉素-链霉素、200μg/ml潮霉素B(Invitrogen,Cat.10687-010)、杀稻瘟菌素(Blasticidin)5μg/ml(Invitrogen,Cat.R210-01)、4μg/ml多西霉素(Clontech,Cat.631311)，于384孔PDL包被板中每孔50μl，并于37℃和5％CO2中生长。在过夜培育后，以一式四份添加10μl/孔的连续稀释的测试化合物，并使该板于37℃和5％CO2中再培育过夜。细胞用HBSS洗涤3次，每孔余留25μl。BLA活性通过向细胞中添加5μl/孔的GeneBlazer试剂CCF4-AM(Invitrogen,Cat.K1085)来检测。在板于18℃黑暗培育60min后，通过Safire2荧光读板机(Tecan)测量蓝色和绿色荧光信号，于410nm激发并于458nm(蓝)和522nm(绿)发射。计算作为BLA活性测度的蓝色/绿色荧光的比例，EC50值以该计算的蓝色/绿色荧光的比例进行确定，如铁调素内化试验所述。受测的Fpn抑制剂的EC50数据列于表3。在此试验中，铁调素的EC50为0.096±0.063μM(n＝37)。
表3在铁应答试验中测试的Fpn抑制剂的平均(AVE)EC50数据以多次测量显示。
表3
4.膜铁转运蛋白内化和降解试验
用HEK-293细胞系#354(在实施例3中有描述)通过荧光激发细胞分选术(FACS)来测量化合物诱导膜铁转运蛋白(Fpn)内化和降解的能力。使HEK-293#354细胞在含有多西霉素的培养基中生长，以诱导人Fpn-GFP融合蛋白在细胞表面上表达。来自10个独立实验的数据显示，在4μg/ml多西霉素存在下培育HEK#354细胞48h，可以诱导平均42.6％±6.4％Fpn-GFP的阳性细胞。通过在HEK-293细胞系#354上的Fpn-GFP平均荧光强度(MFI)来针对剂量依赖效应测试小分子量Fpn抑制剂化合物，如下文所述。
从约80％的汇合培养物中收集HEK#354细胞，以0.6×106细胞/ml接种在DMEM/F12GlutaMAXTM培养基(Invitrogen,Cat.31331-028)中，其中培养基含有10％FBS(Clontech,Cat.631106)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen,Cat.15140-122)、200μg/ml潮霉素B(Invitrogen,Cat.10687-010)、杀稻瘟菌素5μg/ml(Invitrogen,Cat.R210-01)、4μg/ml多西霉素(Clontech,Cat.631311)，于384孔PDL包被板(Greiner；Cat.781091)中每孔50μl，并于37℃和5％CO2中生长。在过夜培育后，以一式四份添加10μl/孔的连续稀释的测试化合物，并使该板于37℃和5％CO2中再培育过夜。细胞用FACS缓冲液(PBS，含有1％FBS、2mMEDTA和0.05％NaN3)洗涤一次，收获于含有0.5μg/ml碘化丙啶(SigmA，Cat.P4864)的FACS缓冲液中，并于配有高通量取样器的流式细胞仪(CANTOtmII,BD Biosciences)中分析。活的HEK#354细胞被闸控作为碘化丙啶阴性群体并用于分析Fpn-GFP的表达。用于每种化合物稀释度的>2000个活细胞的Fpn-GFP的MFI使用FlowJo(TreeStar's,Oregon)来计算，并且Fpn-抑制剂诱导Fpn-GFP内化和降解的效力以如铁调素内化试验所述那样进行计算。通过FACS在膜铁转运蛋白内化和降解试验中受测的Fpn抑制剂的EC50数据列于表4。在此试验中，铁调素的平均EC50值为0.004±0.002μM。
表4在膜铁转运蛋白内化和降解试验中测试的Fpn抑制剂的平均(AVE)EC50数据以多次测量显示。
表4
| 实施例化合物编号 | EC50(μm) |
| 1 | 0.22 |
| 2 | 0.63 |
| 4 | 1.198 |
| 40 | 0.81 |
| 94 | 0.22 |
| 118 | 4.908 |
| 126 | 0.757 |
| 127 | 0.081 |
| 193 | 3.946 |
| 193-B | 1.391 |
| 206 | 2.072 |
| 208 | 0.15 |
5.膜铁转运蛋白泛素化和降解
已经知道，表达膜铁转运蛋白(Fpn)的细胞暴露会触发Fpn泛素化并随后内化和降解(Qiao,2012)。通过使用以铁处理表达Fpn的J774小鼠巨噬细胞细胞系的免疫沉淀试验，对Fpn抑制剂诱导Fpn泛素化和降解的潜力进行了研究。
J774细胞(DSMZ,Cat.ACC170)以0.8×106细胞/ml接种在于10cm组织培养皿(Greiner Cat.664160)的15ml培养基(DMEM Gibco Cat.11971-025、10％热失活FBS GibcoCat.10500-064、1％青霉素-链霉素Gibco Cat.15140-122)中，其中培养基中含有200μMFe(III)-NTA，于37℃和5％CO2下生长过夜。使细胞和合成的人铁调素(Bachem,Cat.H-5926)或Fpn抑制剂化合物培育10min或120min。洗涤细胞，并用以包括1×HALT蛋白酶抑制剂混合物(Life technologies,Cat.78429)和10mM碘乙酰胺(SigmA，Cat.I6125)的冰冷裂解缓冲液(Pierce,Life Technoligies,Cat.87787)裂解，以稳定泛素化蛋白质。免疫沉淀使用Pierce Classic IP试剂盒(Life Technologies,Cat.26146)，依照制造商手册执行。简言之，1.25ml IP裂解缓冲液中的2mg蛋白质和控制琼脂珠于4℃下混合培育1h，以预先清除裂解物并减少非特异性信号。随后使未结合的裂解物与每反应12μg亲和纯化的抗Fpn抗体F308抗体培育过夜，其中抗体为抗小鼠Fpn氨基酸224-308的GST融合蛋白。免疫复合物通过移出每反应14μl沉降的Pierce蛋白A/GPlus琼脂珠(Life Technologies,Cat.20423)来捕获，使浆状物于4℃培育1.5h，同时温和地翻转倒置混合。洗涤珠子，免疫复合物直接以含有DTT(Life Technologies,Cat.NP0009)的75μl SDS NuPAGE LDS样品缓冲液(LifeTechnologies,Cat.NP0007)洗脱。
在免疫沉淀后，通过Western印迹法，使用兔抗-小鼠MTP1抗血清(AlphaDiagnostic International,Cat.MTP11-A)和小鼠单抗-和多聚泛素化配合物单克隆抗体(Enzo Lifesciences,Cat.BML-PW8810)分别检测膜铁转运蛋白和泛素来分析样品。使用小鼠单克隆抗兔IgG轻链(Abcam,Cat.ab99697)和抗小鼠IgG H&L(Abcam,Cat.ab6789)HRP配合物作为二抗。
选择十一种Fpn抑制剂在此试验中测试并与铁调素比对。如图10和表5所示，用Fpn抑制剂处理的细胞导致Fpn在10分钟内的快速泛素化(图10上方)，并在2小时后降解(图10下方)。通过Fpn抑制剂的Fpn降解程度与铁调素的效应相仿。然而，相较于Fpn抑制剂处理，铁调素处理导致具较高分子量的泛素化的Fpn，表明通过铁调素与Fpn抑制剂分别引起多聚泛素化和单泛素化。
表5在Fpn泛素化和降解试验中测试的Fpn抑制剂总结。以Fpn抑制剂处理对Fpn降解和Fpn泛素化的效应通过目视观察Western印迹计分(+相仿于铁调素；-无效应；+/-中间效应)。
表5
| 实施例化合物编号 | 浓度(μm) | Fpn泛素化(10min) | Fpn降解(120min) |
| 1 | 0.12 | + | + |
| 40 | 1.9 | + | + |
| 94 | 0.3 | + | + |
| 126 | 0.8 | +/- | + |
| 127 | 0.1 | + | + |
| 208 | 0.2 | + | + |
| 铁调素 | 0.15 | + | + |
图10Fpn抑制剂触发表达在小鼠巨噬细胞细胞系中的Fpn的泛素化和降解。J774细胞系与Fe(III)-NTA培育过夜，以诱导Fpn表达。随后细胞用约10倍的如铁调素内化试验(参阅表1)所测定的铁调素(铁调素，150nM)或Fpn抑制剂实施例化合物编号208(210nM)、实施例化合物编号167(1.5μM)、实施例化合物编号127(120nM)、实施例化合物编号152(40nM)的IC50浓度处理10或120min，之后收获并用抗Fpn抗体F308进行免疫沉淀。模拟处理细胞在120min后收获(对照组)。
以抗Fpn抗体MTP1进行的免疫沉淀的免疫印迹揭示出膜铁转运蛋白在用Fpn抑制剂处理后的120min消失，与以铁调素处理的样品(上方)有类似的程度。在以Fpn抑制剂和铁调素处理细胞10min后观察到Fpn的快速泛素化。蛋白分子量标准以kD表示在左边。
6.通过膜铁转运蛋白抑制剂抑制铁流出
在T47D细胞(ECACC,Cat.85102201)中测定了铁调素和关于通过膜铁转运蛋白阻断铁输出的能力的膜铁转运蛋白抑制剂化合物的活性，如下所述。
将细胞以含有350000个细胞/孔接种于24孔板(Greiner,Cat.662160)中，并置于含有生长培养基的500μM L-抗坏血酸(Sigma Aldrich,Cat.795437)中与100μM 58Fe硫酸盐(58Fe(II)，Vifor Pharma批号ROR3085)培育过夜。细胞用500μl铁摄入缓冲液(IUB；PIPES40mM，Cat.P1851，一水葡萄糖10mM，Cat.49158，氯化钠260mM，Cat.71379，氯化钾20mM，Cat.P9541，硫酸镁2mM，Cat.63138，Sigma Aldrich)洗涤一次，随后用去除缓冲液(培育2min，BPDS 100μM,Cat.11890和Na2S2O4 500μM,Cat.157953,Sigma Aldrich，于IUB中)洗涤一次，并再用IUB洗涤两次。连续稀释的铁调素(Bachem)或膜铁转运蛋白抑制剂(4μM-0.0064μM，5倍稀释)以每孔0.6ml的总体积添加。使细胞于37℃和5％CO2培育20h。收集上清液并使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS,Thermo Scientific,Element 2)测量58Fe。收集沉淀以供蛋白浓度测量。以细胞裂解物中的每mg蛋白的上清液中的ng58Fe绘制结果。实施例化合物编号127以为内源性Fpn配体铁调素的类似的效力抑制铁流出(图11)。
图11铁调素(IC50：0.086μM)和实施例化合物编号127(IC50：0.080μM)的代表性铁外流抑制。
7.空白小鼠的低铁血症
注射合成的铁调素至野生型(WT)空白小鼠中，导致血清铁水平降低(与载体对照组相差40-50％)且处理后3-4小时达到最大效应(Rivera，2005；图12A)。此数据表明，所注射的铁调素在十二指肠肠细胞和脾细胞上结合至膜铁转运蛋白并触发膜铁转运蛋白(Fpn)内化，导致血清铁骤降。同样地，口服施用小分子量Fpn抑制剂以剂量依赖方式减少WTC57BL/6小鼠的血清铁水平，功效相仿于铁调素。此数据验证了使用WT小鼠作为测试Fpn抑制剂的体内急性功效的简单可靠模型。
9周龄的雌性C57BL/6小鼠(Janvier,France)以标准饮食(Harlan Provimi Kliba3436)饲喂，并以10ml/kg体重的体积的化合物或相应量的载体口服(p.o.)处理。Fpn抑制剂以0.5％甲基纤维素/水或20％聚氧乙烯蓖麻油EL/水制成制剂，并以口服向小鼠以10、30或100mg/kg体重的剂量给药。三小时后，小鼠在异氟醚室中进行预先麻醉，并通过眼眶出血收集血液。通过颈脱位处死小鼠并收集脾、肝和十二指肠用于生物标记分析。所有实验均按照主管兽医当局批准的许可证进行。血清以血液离心分离至含有凝胶的微型容器中，并通过MULTIGENT铁试验(AbbottDiagnostics，6K95)测定血清铁。使用每组八只小鼠，进行单因素ANOVA和Bonferroni多重比较测试，以分析实验组之间的统计学差异。选定的Fpn抑制剂在WTC57BL/6小鼠中的功效显示于表6。
图12由铁调素和根据实施例化合物94(实施例化合物编号94)的膜铁转运蛋白抑制剂引致的血清铁降低。
A以腹膜内(i.p.)注射合成的铁调素(5mg/kg)空白C57BL/6小鼠在规定时间的血清铁动力学。*-***-表示与PBS处理的小鼠相比统计学上血清铁显著降低。
B以指定量的铁调素(i.p.)或实施例化合物94(实施例化合物编号94)(p.o.)处理空白C57BL/6小鼠达3h的血清铁水平。
表6在空白小鼠血铁过少症模型中测试Fpn抑制剂的功效。由选定膜铁转运蛋白抑制剂以10、30和100mg/kg的剂量口服给药至空白WT C57BL/6小鼠引致的血清铁降低。定量给药3h后的相对血清铁降低通过从载体处理动物的血清铁的平均值中减去以Fpn抑制剂定量给药的动物的血清铁的平均值来计算。随后将载体和化合物处理组之间的血清铁平均值之差除以载体对照组的血清铁的平均值，并以百分比列示。
表6
8.预防贫血大鼠中的铁吸收
为了评估膜铁转运蛋白(Fpn)抑制剂阻断铁吸收的体内功效，针对铁吸收在贫血大鼠模型中测试了一系列的Fpn抑制剂。维斯塔大鼠(3-4周龄，n＝5，JanvierLabs)低铁饮食(Provimi-KlibA，Cat.2039)饲喂，直到它们的血红素(Hb)值在施用Fpn抑制剂化合物前一天达到7-8g/dl。在口服使用0.5mg/kg硫酸亚铁的一小时前，以甲基纤维素或聚氧乙烯蓖麻油配制成制剂的测试化合物以口服定量给药。在施用铁一小时前(-1h)、在定量施用Fpn抑制剂后立即(0h)和施用测试化合物后一小时(1h)、三小时(3h)以及偶尔长达6小时(6h)，通过尾静脉穿刺采集血液样品。测量血清铁水平(AbbottDiagnostics,Cat.6K95)并计算施用测试化合物三小时后的血清铁升高抑制，以作为Fpn抑制剂在阻断铁吸收的功效的量度(表7)。如图4所示，在定量施用铁三小时后，相较于载体对照组动物在定量施用铁前的血清铁水平并校正以未接受铁剂量的载体对照组动物的基线血清铁水平，口服施用3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的Fpn抑制剂实施例化合物编号55分别降低了54％、72％和89％的血清铁水平。
表7在用于抑制铁吸收的贫血大鼠模型中受测的Fpn抑制剂。显示了血清铁水平的相对抑制值(％)，其以未接受口服铁剂量的对照组的平均基线血清铁水平校正，且与在定量施用铁之前以载体处理的对照组进行比较。显示了以指定剂量的Fpn抑制剂处理的群组(n＝5)平均值。示出了在化合物处理组和载体处理组之间观察到统计学上的显著的(2-因素ANOVA和Bonferroni后测试)差异(***p<0.001；**p<0.01，*p<0.05)。
表7
9.纠正β2-微球蛋白缺失小鼠的高铁血症
涉及感知全身性铁储存，例如铁调素(Hamp1)、血色素沉着症蛋白(HFE)、铁调素调节蛋白(HJV)和转铁蛋白受体2(TFR2)的基因突变会导致小鼠和人类的铁过载。肝细胞上的HFE、HJV和TFR2分子就传递适当铁调素生产的信号而言是不可或缺的，它们的缺乏会导致病理生理学上的低铁调素水平和过量的铁吸收。HFE突变是白种人成人中遗传性血色素沉着症(HH)的最常见原因。HFE是和β2-微球蛋白有关的MHC族I-样膜分子，并通过骨形态发生蛋白受体(BMPR)通路参与铁调素转录调控。HFE-/-小鼠具有减少的铁调素水平，发展出高铁血症和高肝铁水平，使得它们成为研究人铁过载的合适的动物模型(Zhou，1998)。缺失β2-微球蛋白(b2m-/-)的小鼠发展出类似于HFE-/-动物的高铁血症和血色素沉着症，因为β2-微球蛋白对HFE的细胞表面表达和功能是不可或缺的(Rothenberg and Voland,1996)。由于无法获得HFE-/-小鼠，因此采用b2m-/-小鼠作为铁过载的模型。初步研究证实，HFE-/-和b2m-/-小鼠具有类似的铁代谢相关参数。
6至7周龄雌性和雄性纯合b2m-/-小鼠由Jackson实验室供应(B6.129P2-B2mtm1Unc/J,Stock Number：002087)，并喂食自由取用的标准饮食(Harlan Provimi Kliba3436)。年龄和性别匹配的WTC57BL/6小鼠由Charles River供应。为研究膜铁转运蛋白(Fpn)抑制剂在铁过载中的急性效应，b2m-/-小鼠以10ml/kg体重的体积的化合物或相应量的载体处理。Fpn抑制剂化合物以0.5％甲基纤维素/水或20％聚氧乙烯蓖麻油EL/水配制成制剂，并以50mg/kg体重向小鼠口服定量施用。WT对照组仅接受载体。三小时后，小鼠在异氟醚室中进行预先麻醉，并通过眼眶出血收集血液。通过颈脱位处死小鼠，并收集脾、肝和十二指肠用于生物标记分析。所有实验均按照主管兽医当局批准的许可证进行。血清以血液离心分离至含有凝胶的微型容器(BDBiosciences)，并通过MULTIGENT铁试验(AbbottDiagnostics,Cat.6K95)测定血清铁。使用每组四至九只小鼠，应用单因素ANOVA和Bonferroni多重比较测试，以分析实验组之间的统计学差异。
为调查Fpn抑制剂实施例化合物编号40和实施例化合物编号94在铁过载状况中的效应，对b2m-/-小鼠或WT对照组定量施用Fpn抑制剂或载体达3h。由于其基因缺失所致，用载体处理的b2m-/-小鼠显示出与WT小鼠相比显著更高的血清铁水平(图13，A的组平均值为60μM，B为56μM)。以50mg/kg实施例化合物编号40或实施例化合物编号94处理3h的b2m-/-小鼠将升高血清铁纠正至WT对照组观察到的水平。这些数据证实小分子量膜铁转运蛋白抑制剂在疾病相关模型中的急性功效。在进一步的研究中观察到的血清铁纠正概括于表8。
图13在b2m-/-小鼠中以膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物编号40/甲基纤维素(A)和实施例化合物编号94/聚氧乙烯蓖麻油EL(B)处理3h的完全纠正的升高的血清铁水平。
表8在β2-微球蛋白缺失小鼠模型中测试Fpn抑制剂，以降低升高的血清铁水平。
向β2-微球蛋白缺失小鼠口服施用指定剂量的Fpn抑制剂1(#)或3(##)小时后收集血液，并测量血清铁浓度。显示了血清铁水平的相对降低(％)，其通过从载体处理动物的血清铁的平均值中减去以Fpn抑制剂定量给药的动物的血清铁的平均值来计算。随后将载体处理组和化合物处理组之间的血清铁平均值之差除以载体对照组的血清铁的平均值，并以百分比列示。雌性(♀)和雄性
动物的数值分别列出，因为注意到功效有明显的性别依赖性差异。还示出了在化合物处理组和载体处理组之间观察到的统计学上显著的(2-因素ANOVA和Bonferroni后测试)差异(***p<0.001；**p<0.01，*p<0.05)。
表8
10.预防β2-微球蛋白缺失小鼠的铁过载
由于铁调素水平下降和铁吸收增加，实行标准饮食的β2-微球蛋白缺失(b2m-/-)小鼠在肝、心脏和胰腺中有过量的铁累积。初步研究显示，b2m-/-的肝铁负载在3-4周龄开始，并且在6周龄肝的铁水平达到野生型(WT)小鼠的肝铁含量的高至4倍。此外，在断奶后立即给3周龄的b2m-/-小鼠喂食低铁含量(LID)的饮食，防止到6-7周龄时肝铁负载。在b2m-/-小鼠中调查了Fpn抑制剂防止肝铁累积的功效。喂食LID的三周龄b2-/-小鼠定量施用Fpn抑制剂或载体(甲基纤维素；10ml/kg)。小鼠饮用补充有1mM58Fe(II)-硫酸盐和10mM抗坏血酸的水。定量施用Fpn抑制剂或载体，接着暴露至含铁的水重复14天。小鼠被安乐死，肝和脾的铁含量通过ICP-OES(全部为铁同位素)分析，还分析了肝组织的58Fe浓度(ICP-MS)。整理于表9的数据说明，在b2m-/-小鼠中两周的口服给药Fpn抑制剂防止了肝的铁负载和脾的铁浓度增加，这表明在肠和脾中皆抑制了膜铁转运蛋白。
这些数据证实小分子量膜铁转运蛋白抑制剂防止b2-/-小鼠的肝铁负载的功效，其提供了在疾病相关模型中的概念证明。
表9在β2-微球蛋白缺失小鼠模型测试Fpn抑制剂的抑制肝的铁过载。
于指定剂量的Fpn抑制剂处理(p.o.；b.i.d)14天后收集β2-微球蛋白缺失小鼠的肝和脾。总的肝和脾的组织铁浓度使用ICP-OES测量，58Fe的肝浓度以ICP-MS测定。组织铁水平的相对变化(％)通过对定量施用Fpn抑制剂的动物的组织铁的平均值与载体对照组的载体处理动物的组织铁的平均值之间的差异进行归一化来计算。雌性(♀)和雄性
动物的数值分别列出，因为注意到功效有明显的性别依赖性差异。还示出了在化合物处理组和载体处理组之间观察到的统计学上显著的(2-因素ANOVA和Bonferroni后测试)差异(***p<0.001；**p<0.01，*p<0.05)。其中nd为未测定；na为不适用。
表9
11.在β-中间型地中海贫血小鼠模型中改善贫血、无效红细胞生成和铁过载
β-地中海贫血是由血红素的β-珠蛋白基因突变所导致的遗传性贫血，导致伴有寿命缩短的异常细胞。最严重的形式是重型地中海贫血，需要输血，而输血会导致继发性铁过载。患有中间型地中海贫血的患者具有中度输血依赖性贫血，但由于无效红细胞生成和铁调素生产的慢性压迫，仍然发展出铁过载。
如先前实施例显示，在体外，口服类似于铁调素的膜铁转运蛋白(Fpn)抑制剂可阻断膜铁转运蛋白介导的铁从细胞输出，在野生型小鼠中定量给药能瞬时降低血清铁。基于这些发现和已发表的研究(Schmidt PJ,et al,Blood 2013,Guo S,et al,JCI,2013和CasuC.et al,Blood,2016)，通过限制铁吸收并从衰老的红细胞中再利用来检测在中间型地中海贫血中Fpn抑制剂与其预防铁负载以及改善红细胞生成相关的能力。Fpn抑制剂的功效使用与输血无关的β-地中海贫血小鼠模型来调查。敲除β1和β2球蛋白基因的杂合性小鼠(称为Hbb th3/+小鼠)在脾、肝和肾脏中发展出与输血无关的贫血、无效红细胞生成、脾肿大和继发性铁过载。8-18周龄的杂合性Hbb th3/+小鼠由Jackson实验室供应(B6；129P-Hbb-b1tm1Unc Hbb-b2tm1Unc/J，库存号：002683)，在实验期间喂食自由取用的低铁饮食(Harlan Provimi Kliba 2039,13.4ppm Fe)。Hbb th3/+小鼠以20或60mg/kg化合物或以作为载体的甲基纤维素(10ml/kg,SigmA，Cat.274429)每天定量给药两次。在两剂之间，小鼠饮用补充有1mM58Fe(II)-硫酸盐(Vifor PharmA，批号ROR3096)和10mM抗坏血酸(Sigma,Cat.795437)的饮用水达6h。饮用水中补充的58Fe(II)-硫酸盐的浓度已调整至替代啮齿动物标准饮食的含有250ppm的铁含量的摄入。在其余18h，提供不含58Fe(II)-硫酸盐和抗坏血酸的水。在单独的实验中，定量施用Fpn抑制剂或载体，接着暴露至含铁的水，重复20至46天。
如先前在野生型和b2m-/-小鼠中所显示的那样，在Hbb th3/+小鼠中定量施用Fpn抑制剂3h还在此小鼠品系中有效地了降低血清铁水平(表10)，证实这些小分子导致铁限制的能力。
Hbb th3/+小鼠为贫血小鼠，其血红素水平介于70-80g/L的范围。与载体处理的小鼠相比，向Hbb th3/+小鼠口服施用Fpn抑制剂两周显著地增加了血红素水平(表10)。在研究结束时，与载体处理组相比，定量施用化合物的血红素水平的变化达到19-22g/L。使用自动化血细胞分析仪测量最终血液的额外血液参数。以Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠增加了红细胞计数、红细胞比容，并且减少了网织红细胞浓度和红细胞分布宽度(RDW)，这表明改善了红细胞生成。此外，与载体组相比，接受Fpn抑制剂的Hbb th3/+小鼠在血液中具有显著更低的白细胞计数，进一步证实了Fpn抑制剂在该疾病模型中纠正病理变化参数的有益效应。因此，在中间型地中海贫血小鼠模型中，Fpn抑制剂显著地改善了贫血并纠正了血液组成。
Hbb th3/+小鼠的无效红细胞生成导致脾中的红细胞样前体过度增殖，从而导致脾肿大。以Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠导致脾重量显著降低，因此突出了Fpn抑制剂反转脾肿大的潜力(表10)。
Fpn抑制剂对红细胞生成的效应通过使用流式细胞术和Ter119(eBioscience,Cat.17-5921)以及CD44(BioLegend,Cat.103028)标记来分析在骨髓和脾中的红细胞样前体的百分比来研究。与载体处理Hbb th3/+小鼠相比，从以Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠中分离的骨髓或脾细胞含有百分比显著降低的早期红细胞样前体的原始红细胞、嗜碱性成红血细胞与多染性幼红细胞，以及百分比增加的成熟红细胞(表10)。这些数据证实了Fpn抑制剂可改良Hbb th3/+小鼠的无效红细胞生成，并与血液中改善的血液参数一致。
由于对贫血、缺氧和无效红细胞生成的反馈，Hbb th3/+小鼠中的和患有地中海贫血的患者中的血清促红细胞生成素的水平向上调控(Guo et al.JCI,2013)。与载体组相比，以Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠生产显著更少的血清促红细胞生成素(DuoSetELISA R&D Systems,Cat.DY959)，最可能的结果是部分纠正的贫血与改善的红细胞生成(表10)。
Hbb th3/+小鼠的促红细胞生成素水平升高可诱发红富铁激素(一种已知能够抑制铁调素的红细胞样调节激素)的过表达(KautzL.et al,Nat.Genet.,2014)。与血清促红细胞生成素的降低一致，与仅施用载体的小鼠相比，红富铁激素的mRNA的表达在Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠的脾中显著地降低(表10)。红富铁激素由Hbb th3/+小鼠的脾中大量增殖的红细胞前体生产，此为髓外红细胞生成的结果。因此，Fpn抑制剂对于脾中的红富铁激素表达的影响通过改善的红细胞生成所介导。
患有地中海贫血的患者由于无效红细胞生成和长期的低铁调素水平所致的铁需求增加导致器官铁负载与相关病症，例如肝细胞癌和心力衰竭(RivellaS.Haematologica,2015)。作为相对于肝、脾和肾的高铁含量以及十二指肠中增加的膜铁转运蛋白表达的铁调素水平不够低的结果，Hbb th3/+小鼠吸收过量的铁(GardenghiS.,Blood,2007)。以载体或Fpn抑制剂处理的Hbb th3/+小鼠的总肝铁与器官中58Fe的含量分别通过电感耦合的等离子体发射光谱术(ICP-OES)和电感耦合的等离子体质谱术(ICP-MS)来分析。与载体处理小鼠相比，定量施用Fpn抑制剂的Hbb th3/+小鼠的肝和脾中的58Fe的浓度显著地更低，表明Fpn抑制剂能防止器官铁累积(表10)。
因为Fpn抑制剂是全身可利用的，所以它们能够阻断所有膜铁转运蛋白表达组织，包括十二指肠、脾和肝的铁输出。据此，预期Fpn抑制剂能防止从十二指肠中吸收铁，然而，它们无法移除肝和脾中既存的铁。确实，以Fpn抑制剂或载体处理的小鼠的总肝铁维持不变(未显示)。重要的是，Fpn抑制剂显著降低了Hbb th3/+小鼠的脾和肝中的58Fe的浓度，证实了这些小分子防止铁负载的能力。
再者，使用荧光指示剂CM-H2DCFDA(Thermo Fisher Scientific,Cat.C6827)在骨髓细胞中检测到活性氧族(ROS)。流式细胞分析显示，与载体处理的Hbb th3/+小鼠相比，Fpn抑制剂显著地减少了成熟的红细胞样细胞中的ROS(表10)。
这些数据证实了在β-中间型地中海贫血疾病模型中，口服施用小分子量的膜铁转运蛋白抑制剂在改善贫血和无效红细胞生成，以及减少脾肿大和防止进一步的肝和脾铁负载中的疾病修正能力。
表10
表10膜铁转运蛋白抑制剂在中间型地中海贫血小鼠模型(Hbb th3/+小鼠)中的功效。所示的Fpn抑制剂每天给药两次，持续20天(实施例化合物1和2)，27天(实施例化合物127)或46天(实施例化合物40)。对于血红蛋白，数据表示为与载体对照组的差异；对于所示的所有其他参数，数据表示为与载体对照组的％变化。
12.确定小鼠模型中镰状细胞贫血症的治疗
使用Yulin Zhao等人在"MEK1/2inhibitors reverse acute vascularocclusion in mouse models of sickle cell disease"；The FASEB Journal Vol.30,No.3,pp 1 171-1 186,2016中描述的小鼠模型，本发明的盐在治疗镰状细胞性贫血症中的活性通过如下测定：
膜铁转运蛋白抑制剂可预防镰状细胞病的小鼠模型中的急性血管闭塞和器官损伤。
血管闭塞危象(VOC)是镰状细胞病(SCD)患者发病和死亡的主要原因。缺氧、脱水、炎症或溶血都归因于镰状细胞红细胞(SSRBC)、中性粒细胞和血小板对小血管中活化内皮的增加的依从性，从而促进凝血，血管阻塞，疼痛危象和多种器官的不可逆损伤。高的白细胞计数，尤其是活化的中性粒细胞，与SCD患者的早期死亡，无症状性脑梗塞，出血性中风和急性胸部综合症相关(Platt OS，NEJM，1994)。SCD危象中的溶血起因于受损的镰状红细胞膜，导致慢性贫血以及将Hb释放到循环中，其通过消耗NO促发炎症，产生氧化应激并释放血红素。在SCD中，SSRBC释放微泡，其触发内皮细胞产生活性氧(ROS)，促进白细胞粘附，并以磷脂酰丝氨酸依赖性方式诱导内皮细胞凋亡，促成急性VOC(Camus M,Blood,2012)。
通过施用膜铁转运蛋白抑制剂的慢性铁限制减少了β-地中海贫血小鼠中形成的ROS进入RBC，如上文未公开的国际申请PCT/EP2016/075305和PCT/EP2016/075306中所述的化合物所示(The Jackson Laboratories，Yang B，et al，PNAS.1995)。基于该数据，可以假设膜铁转运蛋白抑制剂可以通过减少SSRBC中的溶血和ROS形成并连续地防止白细胞粘附到内皮上来减轻SCD中的VOC。
为了测试该假设，将载体或膜铁转运蛋白抑制剂在Townes小鼠的SCD模型中以30或100mg/kg每天两次(BID)口服给药4周(Ryan T，Science，1990)。这些小鼠经过了基因工程改造以专门表达人源血红蛋白(hα/hα::βS/βS，The Jackson Laboratories)。Townes小鼠患有贫血症，网织红细胞计数升高，脾脏增大，血管炎症，并且在缺氧，炎症和溶血时易于发生VOC。为了研究膜铁转运蛋白抑制剂对白细胞和SSRBC对发炎内皮的粘附的影响，将用载体或膜铁转运蛋白抑制剂处理25天的Towines小鼠麻醉，并在无菌条件下将窗口室手术植入背部皮肤皱褶内，如前所述(Kalambur VS et al,Am J.Hematol.2004；Zennadi，R etal,Blood,2007)。手术后3天，给小鼠注射0.5μg TNFα(R&D Systems)以诱导导致VOC的炎症。施用TNFα后90分钟，通过分别静脉内注射罗丹明标记的Ly6G(Sigma)和藻红蛋白标记的抗TER119mAb(BioLegend)在体内标记白细胞和RBC。如前所述(Zhaoet al,FASEB J 2016)，通过荧光活体显微镜在接下来的90分钟内监测白细胞和RBS对微血管内皮的粘附。简而言之，将携带有窗口室的麻醉动物维持在37℃，使用连接到荧光显微镜(Axoplan显微镜，卡尔蔡司)的数字摄像机C2400(Hamamatsu Photonics KK，滨松，日本)记录血流量和细胞粘附事件。每只小鼠检查二十至三十个微毛细管区段，并通过使用ImageJ软件测量粘附荧光标记细胞的荧光强度，通过静止图像来定量细胞粘附。结果用每百万细胞的荧光单位表示。
13.实施例化合物No.127作为H2SO4或HCl单盐在雄性Spraque Dawlev大鼠中的单剂量静脉和口服药代动力学研究
为了确定实施例化合物No.127作为H2SO4(MW 604.6g/mol)或HCl(MW 444.9g/mol)单盐的药代动力学(PK)，向雄性Sprague Dawley大鼠静脉(1mg/kg)或每次口服(30mg/kg)施用单剂量的这些盐化合物(每种途径n＝3)。使用的剂量以化合物的重量(MW408.43g/mol)为基准校正。
将大鼠饲养在通风笼中，温度为22至25℃，湿度为40-70％RH，以及12小时光照/12小时黑暗循环，并随意提供标准啮齿动物的饮食和水。在PK研究之前，将大鼠禁食过夜并在给药后4小时喂食。该步骤由CRO的机构动物伦理委员会(GVK Biosciences Pvt.Ltd.，海得拉巴，印度)审查和批准。
实施例化合物No.127的H2SO4单盐或实施例化合物No.127的HCl单盐在含有5％DMSO和10％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(Solutol)的PBS中配制，使用27-纱针以5ml/kg静脉内给药至大鼠尾静脉，浓度为0.2毫克/毫升。
对于30mg/kg的口服给药，将盐化合物以6mg/ml的浓度配制在含有5％DMSO的0.5％甲基纤维素溶液中，并以5ml/kg口服给药。
在以下时间点从肝素锂预装柱中的大鼠的管状颈静脉收集0.20-0.30mL的血液样品：给药后5、15、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时。通过在4℃下以2500×g离心15分钟来制备血浆。通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测量化合物的血浆浓度，并使用Phoenix软件6.4版本的非隔离模型测定标准PK参数，例如C0，Cmax，Tmax，Cl，Vd，AUCIast，T1/2，MRT，％F。
结果显示良好/改善的药代动力学特征。
III.联合治疗的评价
关于本文所述盐的上述可能的联合治疗与其它活性成分共同具有作为膜铁转运蛋白抑制剂的活性，该联合治疗可以在中间型β-地中海贫血的小鼠模型中研究。
本发明的盐与其他治疗剂(第二药剂)的潜在协同或累加效应可通过中间型地中海贫血的小鼠模型(Hbbth3/+或Hbbth1/th1，杰克逊实验室)或重型地中海贫血(C57-FLCth3/th3)中的组合研究来评价，如Casu C等人的"Short-term administration of JAK2inhibitors reduces splenomegaly in mouse models of β-thalassemia intermediaand major."；Haematologica,2017所述。将本发明的盐本身(即单独的盐)或与其他化合物的组合在地中海贫血模型中对贫血、造血、铁过载、活性氧族(ROS)的产生、脾脏增大和其他生物标志物的影响进行测试。来自12周龄的两种性别的小鼠用本发明的盐本身或与下列第二种药剂之一联合来处理：
·修饰的激活素受体类型IIA或IIB融合蛋白(如Suragani RN等人"Modifiedactivin receptor IIB ligand trap mitigates ineffective erythropoiesis anddisease complications in murine β-thalassemia."Blood.2014 Jun 19；123(25):3864-72和Dussiot M等人"An activin receptor IIA ligand trap correctsineffective erythropoiesis in β-thalassemia."Nat Med.2014Apr；20(4):398-407所述)，作为转化生长因子β(TGFβ)超家族成员的配体陷阱，例如RAP-011或RAP-536(ACE-011的小鼠类似物，Sotatercept或ACE-536，分别在专利申请WO2010019261中描述或在美国专利US8361957中要求权利保护的Luspatercept，Acceleron/Celgene)，或者其他TGFβ超家族成员的拮抗剂(抗体，抗体片段，非抗体支架药物或产生激活素受体配体陷阱的细胞)。
·JAK1/2或JAK2抑制剂，包括但不限于Ruxotilinib(诺华-在美国专利US7,598,257和US8,415,362中要求了权利保护)或Fedratinib(赛诺菲)，如Casu C等人的"Short-term administration of JAK2 inhibitors reduces splenomegaly in mouse modelsof β-thalassemia intermedia and major."；Haematologica,2017中所述。
·pan-HDAC抑制剂，例如帕比司他(LC实验室，美国，并且由美国专利US6,552,065和US6,833,384要求了权利保护)或HDAC3抑制剂RGFP966(Selleckchem，如Pasricha SR等人的"Hepcidin is regulated by promoter-associated histone acetylation andHDAC3."Nat Commun.2017 Sep 1；8(1):403中所描述的)。
·蛋白裂解酶-2(也称为Tmprss6)的拮抗剂，如脂质纳米粒(LNP)-配制的Tmprss6siRNA或靶向小鼠Tmprss6的反义寡核苷酸(ASO)(如Guo S等人"Reducing TMPRSS6ameliorates hemochromatosis and β-thalassemia in mice."J.Clin Invest.2013Apr；123(4):1531-41或Schmidt PJ等人"An RNAi therapeutic targeting Tmprss6decreases iron overload in Hfe(-/-)mice and ameliorates anemia and ironoverload in murine β-thalassemia intermedia."Blood.2013Feb 14；121(7):1200-8所描述的)。
·外源性脱铁转铁蛋白(如Li H等人"Transferrin therapy amelioratesdisease in beta-thalassemic mice."Nat Med.2010 Feb；16(2):177-82所描述的)。
·铁调素诱导类固醇(HIS)作为环硫雄醇，黄体酮和米非司酮或黄体酮受体膜组分-1的拮抗剂(PGRMC1)，参考文献7。
·红系因子拮抗剂，如抗体或配体陷阱
·重组促红细胞生成素(epo)。可供用作本发明治疗剂的促红细胞生成素是通过重组DNA技术在细胞培养中生产的，包括红细胞生成素针剂/普罗克里特(α依泊汀)和Aranesp(α达泊汀)或Myrcera(β依泊汀和甲氧基聚乙二醇)。
·甘氨酸转运蛋白1(GlyT1)抑制剂，如bitopertin(罗氏公司)。
本发明的盐在地中海贫血小鼠中可以作为单一药剂以10、30和60mg/kg每天两次口服给药，或者与上面列出的化合物之一(第二药剂)组合起来口服给药。地中海贫血小鼠对照组仅接受第二种药剂。年龄和性别匹配的载体治疗的地中海贫血和野生型(WT)小鼠用作对照。在一些实验中，本发明的盐也可以定量加入到饮用水中，以促进其他口服给药的药物的共同给药。
更具体地，第二药剂将作为单一治疗剂量，给药或与本发明的如下盐共同给药：
·RAP-011或RAP-536可以以1、10或30mg/kg每周两次皮下注射，持续8周。
·JAK1/2抑制剂可以在不存在或存在配制到饮用水中的本发明的盐的情况下每天口服两次。
·在配制到饮用水中的本发明的盐的存在或不存在下，Ruxotilinib(60或180mg/kg)或Fedratinib(40或120mg/kg)可以每天一次口服给药，持续2周。
·在不存在或存在定量配制到饮用水中的本发明的盐的情况下，帕比司他或RGFP966可以以10或20mg/kg每天一次给药。
·每天腹腔注射脱铁转铁蛋白100或300mg/kg，持续8周
·可以每天腹腔注射米非司酮(30或100mg/kg)，持续2周
·可以通过皮下注射每周两次施用对红系因子特异的抗体或配体陷阱
·促红细胞生成素可以每天200IU腹腔注射，持续2周
·甘氨酸转运蛋白1(GlyT1)抑制剂如bitopertin(罗氏公司)也可以通过合适的给药途径给药。
每周监测小鼠的血红蛋白变化，并在研究结束时收集血液和器官。将脾脏重量归一化为体重，并评价为对髓外红细胞生成的治疗影响。通过电感耦合的等离子体(ICP)与光学发射光谱仪(OES)测量肝脏、脾脏、肾脏和心脏的铁的浓度。使用自动计数器测量全血细胞计数。通过用CD71、CD44和Ter119抗体标记细胞并通过流式细胞术检测红细胞样细胞来分析骨髓和脾脏中的红细胞生成。通过HPLC定量红细胞(RBC)上的膜结合的α珠蛋白部分。通过使用荧光指示剂氯甲基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色来测量RBC中的活性氧族(ROS)的存在。通过比色分析法使用基于呋喃三嗪二钠盐(Ferene-S)的试剂(Abbott)来测量血清铁。通过ELISA(R&D，duo set)定量血清促红细胞生成素。通过ELISA(IntrinsicLifesciences)测量血清铁调素。通过qRT-PCR定量肝脏铁调素、骨髓和脾脏红系因子基因的表达。
Claims (22)
1.根据式(I)化合物的盐
其中
X1是N或O；以及
X2为N、S或O；
前提是X1和X2不同；
R1为氢；
n为1；
A1为亚甲基或乙烷-1,2二基；和
A2为亚甲基、乙烷-1,2二基或丙烷-1,3二基；
R2为氢；
或
A1和R2以及与之所键合的氮原子共同形成未取代的4元环；
R3为氢；
R4为氢；
其中，所述盐选自式(I)的化合物与酸形成的盐，所述酸选自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸组成的群组，其特征在于，化合物(I)：酸的比例为1至2：1至3；及其溶剂化物、水合物和多晶型物；并且
其中排除以下3HCl盐：
2.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其中
n＝1；
R2＝氢；
R3＝氢；
R4＝氢；
A1＝亚甲基或乙烷-1,2-二基；
A2＝亚甲基，乙烷-1,2-二基，或丙烷-1,3-二基；
或者，A1和R2以及与之所键合的氮原子共同形成任选的取代4元环，形成根据式(II)或(III)的化合物
其中，在式(II)和(III)中，
m为1、2或3的整数，以及
X1、X2和R1具有如权利要求1中所定义的含义，
及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
3.根据权利要求1或2所述的式(I)化合物的盐，其中，所述盐选自其单盐、溶剂化物、水合物和多晶型物。
4.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其中，所述酸选自柠檬酸、盐酸、马来酸和硫酸组成的群组，及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
5.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其中，所述酸选自磷酸和硫酸组成的群组，及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
6.根据权利要求1或2所述的式(I)化合物的盐，其中所述酸选自磷酸，以形成式(I)化合物：PO4为2：1的盐，及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
7.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其中，排除3HCl盐，及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
8.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其中，式(I)化合物选自以下组成的群组：
及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
9.根据权利要求8所述的式(I)化合物的盐，其选自以下组成的群组：
及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
10.根据权利要求8或9所述的式(I)化合物的盐，其选自以下组成的群组：
及其溶剂化物、水合物和多晶型物。
11.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其为具有下式的1：1硫酸盐：
及其多晶型物。
12.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其为具有下式的1：1磷酸盐：
及其多晶型物。
13.根据权利要求1所述的式(I)化合物的盐，其选自具有以下结构的化合物的多晶型物组成的群组：
(i)由X-射线粉末衍射图表征的所述化合物的柠檬酸盐的多晶型物，包括在24.5和5.3±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰，
(ii)由X-射线粉末衍射图表征的所述化合物的马来酸盐的多晶型物，包括在19.0和24.5±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰，
(iii)由X-射线粉末衍射图表征的所述化合物的磷酸盐的多晶型物，包括在27.2和4.6±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰，
(iv)由X-射线粉末衍射图表征的所述化合物的磷酸盐的多晶型物，包括在26.1和16.5±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰，
(v)由X-射线粉末衍射图表征的所述化合物的硫酸盐的多晶型物，包括在25.4度和18.1±0.25度或±0.20度或±0.10度或±0.05度处的2θ角所表示的特征结晶峰。
14.根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备药物中的用途。
15.根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备作为膜铁转运蛋白抑制剂的药物中的用途和/或在用于制备用于抑制由膜铁转运蛋白介导的铁转运的药物中的用途。
16.根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备用于预防和/或治疗导致铁水平增加或铁吸收增加的铁代谢紊乱的药物中的用途，在用于制备用于预防和/或治疗铁过载的药物中的用途，和/或在用于制备用于预防和/或治疗与铁水平增加、铁吸收增加或铁过载有关或由其引起的疾病的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备药物中的用途，其中，所述与铁水平增加或铁吸收增加或铁过载相关或由其引起的疾病为选自地中海贫血、血红蛋白病、血色素沉着症、溶血性贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血和先天性红细胞生成障碍性贫血组成的群组，所述地中海贫血包括α-地中海贫血，β-地中海贫血和δ-地中海贫血。
18.根据权利要求16所述的根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备药物中的用途，其中，所述与铁水平增加或铁吸收增加或铁过载相关或由其引起的疾病为血红蛋白E病或血红蛋白H病。
19.根据权利要求1至13中任意一项所述的盐、及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备用于预防和/或治疗与无效性红细胞生成相关的疾病的药物中的用途，包括骨髓发育不良综合症，真性红细胞增多症和先天性红细胞生成障碍性贫血，或在用于制备通过限制包括创伤弧菌的病原微生物可利用的铁的量以治疗由所述病原微生物引起的感染的辅助治疗的药物中的用途，或在用于制备通过限制组织或细胞中铁的沉积或增加来预防和/或治疗包括阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病，或在预防和/或治疗自由基、活性氧族和氧化应激的形成的药物中的用途，或在用于制备用于预防和/或治疗由铁过载引起的心脏、肝脏和内分泌损伤的药物中的用途，或在用于制备用于预防和/或治疗由过量铁引发的炎症的药物中的用途。
20.一种药物，其含有一种或多种如权利要求1至13中任意一项所定义的所述的盐，包括其溶剂化物、水合物和多晶型物，以用于如权利要求15至19中任意一项所定义的所述预防和/或治疗，其中所述药物可任选地进一步含有一种或多种药物载体和/或助剂和/或溶剂，和/或至少一种另外的药物活性化合物，包括用于预防和治疗铁过载，地中海贫血，血色素沉着症或镰状细胞病，包括阿尔茨海默病或帕金森病的神经退行性疾病，以及相关症状的活性化合物，或铁螯合化合物。
21.根据权利要求20所述的药物，其为用于口服或肠胃外给药的制剂的形式。
22.如权利要求1至13中任意一项所定义的所述的盐，及其溶剂化物、水合物和多晶型物在用于制备用于联合治疗的药物中的用途，包括共同施用如权利要求1至13中任意一项所定义的包括溶剂化物、水合物和多晶型物的所述的盐和至少一种另外的药物活性化合物，其中所述联合治疗的共同给药通过在固定剂量联合治疗中以固定剂量制剂的形式共同施用权利要求1至13中任意一项所定义的包括溶剂化物、水合物和多晶型物的所述的盐和至少一种另外的药物活性化合物来进行，或其中联合治疗的共同给药通过在自由剂量联合治疗中以各自组分的自由剂量以单种组分同时给药或单种组分在分布的一段时间内连续使用来共同施用如权利要求1至13中任意一项所定义的包括溶剂化物、水合物和多晶型物的所述的盐和至少一种另外的药物活性化合物来进行，并且其中联合治疗包括共同施用权利要求1至13中任意一项所定义包括溶剂化物、水合物和多晶型物的所述的盐与一种或多种用于减少铁过载的另外的药物活性化合物，其选自Tmprss6-ASO、铁螯合剂、姜黄素、SSP-004184、去铁素、地拉罗司、去铁胺和/或去铁酮；和/或与一种或多种另外的药物活性化合物，其选自抗氧化剂；抗糖尿病药；抗生素；治疗疟疾的药物；抗癌剂；抗真菌药；用于治疗神经退行性疾病的药物；抗病毒药物；免疫抑制剂；铁补充剂；维生素补充剂；红细胞生成刺激剂；抗炎症生物制剂；抗溶栓药；他汀类药物；升压药；和变力性化合物。
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