CN116173218B - 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途，该药物组合物包括蛋白转运抑制剂和可选的药学上可接受的载体。本发明针对牙周炎发病机理进行研究，发现去泛素化酶OTUD1通过靶向蛋白转运通路，抑制牙周过度炎症反应。

Description

蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途。

背景技术

牙周炎是由菌斑微生物感染引起的累及牙周支持组织的炎症性疾病，宿主免疫调节与微生物间的相互作用是其病理机制研究的重点。牙周炎所引起的牙龈出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收以及牙龈松动等严重影响患者的生活质量。目前，临床上治疗牙周炎的方式包括机械洁刮治，引导组织再生等牙周支持治疗以及药物辅助治疗。

目前对于牙周炎发病机制研究不足，现有疗法无法彻底高效地清除生物膜，难以实现精准治疗，因此寻找更具有针对性和靶向性的治疗策略是攻克牙周炎的重点和难点。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中的技术问题，本发明提供蛋白转运抑制剂在制备用于治疗牙周炎的药物中的用途。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种治疗或缓解牙周炎的药物组合物，其包括蛋白转运抑制剂和可选的药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述蛋白转运抑制剂包括以下中的至少一种：

(1) 基因表达抑制剂，其能够下调蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制蛋白质转运；

(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin中的至少一种；

(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其能够提高去泛素化酶OTUD1表达量。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中，布雷非德菌素A浓度为200-800 μg/ml。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述载体包括凝胶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中，所述凝胶浓度为5%-50%。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，通过向受试者给予治疗有效量的所述蛋白转运抑制剂实现所述治疗或缓解，其中，所述治疗包括抑制炎性细胞因子的表达和/或抑制破骨细胞性骨吸收。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述蛋白转运抑制剂通过靶向中性粒细胞，抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而负调控中性粒细胞迁移，使炎性细胞因子表达减少，从而治疗或缓解牙周炎。

本发明的第二方面，提供蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途。

本发明的第三方面，提供蛋白转运抑制剂在制备用于降低或抑制促炎细胞因子的表达或其蛋白的量的药物中的用途。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述蛋白转运抑制剂包括以下中的至少一种：

(1) 基因表达抑制剂，其能够下调蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制蛋白质转运；

(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin和Leptomycin B中的至少一种；

(3) 去泛素化酶OTUD1激活剂或活化剂，其能够提高去泛素化酶OTUD1表达量。

本发明针对牙周炎发病机理进行研究，发现去泛素化酶OTUD1靶向蛋白转运通路，限制牙周过度炎症反应引起的牙槽骨丧失。此外，本发明解决了现有牙周炎治疗方法靶向性和针对性不足的问题，开发了一种针对抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路的药物组合物，从而可用于牙周炎辅助治疗。

附图说明

图1示出了与健康人群相比，牙周炎患者OTUD1转录组水平显著下调。

图2中的A图示出了qPCR检测牙周炎模型中小鼠牙龈组织中炎症因子mRNA水平；图2中的B图示出了ELISA检测牙周炎模型中小鼠血清中促炎因子蛋白水平。

图3中的A图和图3中的B图示出了利用蛋白质谱在HL-60细胞中鉴定OTUD1结合蛋白；图3的C图和图3中的D图示出了利用RUSH(retention using selective hook)系统检测蛋白质通过内质网-高尔基体囊泡运输的效率。

图4示出了(A)GelMA/BFA具有可塑性；(B)GelMA/BFA具有可注射性。

图5为(A)GelMA/BFA给药系统建立；(B)qPCR检测小鼠牙龈组织中炎症因子mRNA水平；(C)ELISA检测小鼠血清中促炎因子蛋白水平。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。

用途

本发明的一个方面，提供了蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途。本发明人首先发现，与健康人群相比，牙周炎患者去泛素化酶OTUD1转录组水平显著下调，中性粒细胞募集。然后本发明构建了去泛素化酶OTUD1敲除的小鼠牙周炎模型，发现促炎因子转录水平显著提高。通过蛋白质谱检测，结果发现OTUD1与蛋白转运通路相关蛋白存在相互作用，最终通过实验验证了OTUD1抑制细胞中蛋白质(包括但不限于膜蛋白、分泌蛋白)从内质网向高尔基体的运输。在敲除小鼠中给予治疗有效量的蛋白转运抑制剂，尤其是蛋白内质网-高尔基体转运抑制剂，结果发现能够降低促炎因子转录水平和相关细胞因子的蛋白质水平，表明蛋白转运抑制剂能够用于治疗、缓解或改善牙周炎，特别是治疗或改善由于体内靶标细胞(中性粒细胞)中去泛素化酶表达或活性下调而导致的促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高的牙周炎。

本发明人还研究发现，蛋白转运抑制剂通过靶向中性粒细胞，抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而负调控中性粒细胞迁移，由此治疗或改善由于体内靶标细胞中去泛素化酶表达或活性下调而导致的促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高的牙周炎。优选地，促炎因子包括IL1β、TNFα、IL6。

本发明中，促炎因子转录水平和相关细胞因子的蛋白质水平可采用本领域已知的任何方法进行确定，对此不特别限定，本领域技术人员熟知如何确定相关基因的表达量或相关蛋白的量，例如使用特异性结合上述蛋白的抗体、或相关基因的探针，或能够扩增所述相关基因而设计的引物等。

本发明中，通过向受试者给予治疗有效量的所述蛋白转运抑制剂实现所述治疗或缓解。本发明使用的术语“受试者”指任何动物(如哺乳动物)，其包括但不限于将接受特定治疗的人类、非人灵长类动物、啮齿动物以及诸如此类。优选地，受试者为其体内靶标细胞中去泛素化酶表达或活性下调的受试者。还优选地，受试者为其体内去泛素化酶表达或活性下调，使得体内靶标细胞中促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高的受试者。进一步优选地，受试者为由于促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高而患有牙周炎的受试者。此外，在上述每种情况下，受试者为其体内蛋白内质网-高尔基体转运通路处于非抑制或激活状态的受试者，且中性粒细胞作为靶标细胞在体内募集。通常情况下，“受试者”和“患者”在本发明中可互换使用，都指的是受试人。

本发明所用术语“给予”、“施用”或“给药”是指植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其它方式引入蛋白转运抑制剂或包含其的药物组合物。

本文所用术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本文中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。

在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如牙周炎的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。需要治疗的包括那些已经患有牙周炎疾病的人或者那些需要预防、缓解或改善牙周炎的人。

本发明中，缓解或治疗包括但不限于抑制炎性细胞因子的表达和/或抑制破骨细胞性骨吸收。

本发明中，蛋白内质网-高尔基体转运抑制剂的实例包括但不限于：

(1) 基因表达抑制剂，其能够下调或抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白表达，从而抑制蛋白质转运；

(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin中的至少一种；

(3) 去泛素化酶OTUD1激活剂或活化剂，其能够提高去泛素化酶OTUD1表达量。

本发明中，基因表达抑制剂包括但不限于CRISPR/Cas9系统、干扰RNA或反义寡核苷酸，特别是针对或靶向蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白的siRNA或shRNA，虽然本发明未示出具体序列，但是本领域可以根据蛋白和基因数据库进行设计并合成相关核酸系列。上述siRNA的非限制实例例如靶向高尔基体Rab33b的siRNA，其序列包括：CACAAACCAUUAAUGCUUAUU；GACCAACAUGGCUAGUUUUU；GAUAGAAGAAUGCAAACAAUU；GAUAUACCACGGUUCUUGUU。在某些实施方案中，本发明的蛋白转运抑制剂包括抗体，例如包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或来源它们的片段。

本发明中，布雷非德菌素A(本文有时也简称为“BFA”)和Monensin可以通过本领域已知的方法合成或可通过市售产品获得，对此不特别限定。

本发明中，蛋白转运抑制剂的其他小分子试剂的实例可以是已公开的靶向降解载体蛋白，特别是跨膜蛋白的小分子化合物，其实例包括但不限于TMPBM、CP-19076070-1、CP-19076070-2或CP-19076070-3等。

本发明中，去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂是指能够提高去泛素化酶OTUD1表达量的任何试剂。去泛素化酶OTUD1激动剂的一个实例可以是小分子化合物，例如已公开的能够上调OTUD1表达的VE-822。

本发明中，去泛素化酶OTUD1过表达试剂的实例也可以包括任何能够使去泛素化酶OTUD1过表达的基因工程试剂，例如包含OTUD1的重组载体。过表达可以采用本领域已知的方法，例如构建过表达OTUD1的腺病毒载体，向宿主细胞转染载体后收集病毒；滴加病毒液感染细胞；纯化并浓缩病毒；通过哺乳动物，如小鼠静脉注射使OTUD1过表达。

药物组合物

本发明的另一方面，还提供一种药物组合物，其包括蛋白转运抑制剂和可选的药学上可接受的载体，所述蛋白转运抑制剂蛋白转运抑制剂包括以下中的至少一种：

(1) 基因表达抑制剂，其能够下调蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白的表达，从而抑制蛋白质转运；

(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin中的至少一种；

(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其能够提高去泛素化酶OTUD1表达量。

本发明的药物组合物中，所述蛋白转运抑制剂通过靶向中性粒细胞，抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而负调控中性粒细胞迁移，限制牙周过度炎症反应，特别是抑制促炎细胞因子的表达，从而能够用于由于体内靶标细胞中去泛素化酶表达或活性下调而导致的牙周炎。

本发明的药物组合物中，所使用的布雷非德菌素A浓度为200-800 μg/ml，例如200、300、400、500、600、700、800 μg/ml或上述范围之间的任意浓度值。

本发明所用术语“药学上可接受的载体”指的是一种药学上可接受的材料、组合物或载体，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，且该类药学上可接受的材料、组合物或载体参与将药剂从一个器官或身体的某一部位运载或运送至另一个器官或身体的另一部位。每种载体必须是“可接受的”，即指其与配方的其他成分相容且不损害患者。在药学上可接受的载体的部分示例如下：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物和类似物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物制剂中使用的其他无毒且相容的物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基磺酸钠、硬脂酸镁、和聚氧乙烯-聚环氧丙烷共聚物以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

在某些实施方案中，药学上可接受的载体为甲基丙烯酸酰化明胶，在所述药物组合物中，所述凝胶浓度为5%-50%，优选为5%-40%，还优选为5%-30%，最优选为10%。

本发明中，药物组合物可以以任何合适的剂型施用至受试者/患者，施用方式没有特别限制。本发明中，所述药物组合物的剂型的实例包括但不限于如混悬剂、溶液剂、乳膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

实施例

在已知转录组和疾病相关数据库中进行数据分析，发现与健康人群相比，牙周炎患者去泛素化酶OTUD1转录组水平显著下调，如图1所示。

接下来，构建小鼠模型，鉴定了去泛素化酶OTUD1靶向蛋白转运通路，防止牙周过度炎症反应，从而治疗或缓解牙周炎，具体如下：

(1)小鼠牙槽骨吸收模型建立

利用5-0无菌缝线在WT和Otud1 ^-/- 小鼠双侧上颌第二磨牙处绕牙颈部结扎一圈并在近中牙颈部打结，连续7天在双侧上颌第二磨牙处涂抹10⁹ CFU牙龈卟啉单胞菌，诱导小鼠牙周炎。

7天后取牙龈组织，提取总RNA，逆转录后，qPCR检测组织中炎症因子的转录水平，结果显示Otud1 ^-/- 小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更高(图2中的A图)。利用ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平，结果显示Otud1 ^-/- 小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更高(图2中的B图)。

利用蛋白质谱检测在HL-60细胞中检测OTUD1相互作用蛋白，结果显示OTUD1与蛋白转运通路相关蛋白存在相互作用(图3中的A图和图3中的B图)。通过构建RUSH(retentionusing selective hook)体系，发现OTUD1抑制细胞中蛋白质从内质网向高尔基体的运输(图3中的C图和图3中的D图)。构建同时表达报告蛋白和钩子(hook)的质粒，以Golgin84-EGFP-SBP融合蛋白为报告蛋白，Li-streptavidin融合蛋白为钩子，SBP与streptavidin的结合使得报告蛋白最初滞留在内质网，在细胞培养上清加入生物素，由于竞争作用使报告蛋白从钩子上脱落，沿运输途径转运至高尔基体，利用免疫荧光检测报告蛋白的定位，发现OTUD1抑制蛋白转运。

(2)GelMA包裹BFA

配置0.25%光引发剂LAP，利用0.25%光引发剂配置10%光敏性生物明胶GelMA(EFL-GM-30)，60-70℃水浴避光溶解，负载浓度为500μg/mL的BFA，用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，其中，凝胶具有可塑性和可注射性(图4)。

(3)牙周袋内药物注射

将负载BFA的光敏性水凝胶给小鼠牙周袋内注射5μl，用405nm光源照射30秒使得GelMA固化。

(4) 牙周炎评估

建模后第7天处死小鼠，取牙龈组织，提取总RNA，逆转录后，qPCR检测组织中炎症因子的转录水平，结果显示GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更低。利用ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平，结果显示GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更低(图5)。一个对照为10%GelMA不包裹BFA，其他步骤与上述步骤相同，相较于GelMA/BFA，牙周袋内注射GelMA后小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更高，小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更高。另一对照中，小鼠基因型为WT，其他步骤与上述步骤相同，相较于Otud1 ^-/- 小鼠，WT小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更低，小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更低。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (1)

1.蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途，其中所述蛋白转运抑制剂选自OTUD1和布雷非德菌素A。