TWI542352B - 一種用以減少疤痕形成的醫藥組合物 - Google Patents

Description

一種用以減少疤痕形成的醫藥組合物

本揭示內容是有關於用以減少一個體之疤痕的醫藥組合物及方法。更具體來說，本揭示內容是有關於一種包含三種核酸之混合物的用途，其係可用以減少疤痕的形成。

皮膚為人類最大的器官，可保護內部器官/組織免於外在環境的傷害。大多數人都有過皮膚受傷的經驗，不論是源自於外傷、燒傷、其他外部物理因素，或是因壓力、靜脈淤滯(venous stasis)及糖尿病等疾病所造成。傷口治療的主要目的包含使傷口快速癒合以及再生出外觀良好的皮膚組織。然而，傷口癒合是一種涉及多種因子互動參與的動態過程，因此即便目前相關產業對於細胞及分子生物領域已有相當瞭解，肥厚性(hypertrophic)疤痕的發生率依舊偏高。肥厚性疤痕常會導致功能障礙及心理疾病，且往往產生更高的醫療費用。

已知胎兒的傷口是以幾近完美而無疤的方式 癒合。藉由探討胎兒及成人皮膚傷口癒合的差異，或可界定出參與疤痕形成過程的重要因子。在眾多參與的因子中，轉化生長因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)於傷口癒合及疤痕形成過程中扮演著關鍵角色。

TGF-β是一種細胞激素(cytokine)，在生物系統中，廣泛地調控細胞生長、分化、凋亡、纖維化及發育等過程。一般來說，TGF-β是以不易察覺的(latent)形式被分泌出來，再藉由第一型TGF-β受體(TGF-β receptor type I,TGFBRI)及第二型TGF-β受體(TGFBRII)進行蛋白分解而活化。人類的TGF-β具有三種同型異構式(isoforms)：TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3；該些同型異構式的功能彼此重疊，且主要是透過細胞內的SMAD路徑來產生效用。在皮膚傷口癒合的過程中，已知TGF-β1與免疫抑制、纖維母細胞遷移及生長、傷口收縮、肉芽組織形成、膠原蛋白合成及堆積、血管新生及上皮再次形成(re-epithelialization)有關。研究胎兒及成人傷口中TGF-β同型異構式的個別表現可發現，在成人傷口會出現較高量的TGF-β1量，在胎兒傷口則是TGF-β3表現量較高，意即TGF-β1可能會在成人傷口造成疤痕的形成，而TGF-β3的表現增高則使胎兒傷口以無疤痕形式癒合。

相關領域已設法利用抗-TGF-β1抗體或標的至TGF-β1的siRNA來降低傷口位置之TGF-β1的表現量，期望藉此達到無疤痕的癒合目標。然而，TGF-β/SMAD訊息傳遞路徑牽涉到眾多傳遞訊息的中間分子，且傷口癒合是一種需要不同分子參與的多階段過程。因此，僅 僅減低TGF-β1的表現量並無法產生令人滿意的療效。舉例來說，在缺乏TGF-β1的老鼠(TGF-β1-deficient mice)中，全層傷口(full-thickness wounds)在早期可以正常地癒合；然而，TGF-β1的缺陷在晚期卻會導致發炎進而阻礙傷口癒合。另外，相對於免疫缺陷(immuno-deficient,Scid-/-)卻仍保有野生型之Tgfb1對偶基因(allele)的小鼠，缺乏T及B細胞的TGF-β1基因剔除鼠(knockout mice)(即Tgfb1-/- Scid-/-小鼠)，其傷口癒合時間約會延遲一週(Crowe M et al.,J.Invest.Dermatol,2000,115,3-11)。

有鑑於此，相關領域亟需一種能減少疤痕形成的有效治療方式或組合物。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施方式的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。

在一態樣中，本發明是有關於一種醫藥組合物，其係用於一有需要之個體以減少該個體身上的疤痕。該醫藥組合物包含三種能標的到人類第一型TGF-β受體(TGF-β receptor type I,TGFBRI)基因的核酸。

依據本揭示內容不同的實施方式，所述醫藥 組合物包含有效量的第一、第二及第三核酸，以及其之藥學上可接受的載體(carrier)。三種核酸可以是核糖核酸(ribonucleic acids,RNAs)或去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acids,DNAs)。在三種核酸為RNAs的情況下，所述三種核酸的序列分別包含序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3所示之序列。在三種核酸為DNAs的情況下，所述三種核酸的序列分別包含對應於序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3的DNA序列。

在本揭示內容的某些實施方式中，醫藥組合物更包含一轉染(transfection)有效量的一轉染試劑。轉染試劑的範例包含陽離子脂質或可穿透細胞的(cell-penetrating)胜肽。

依據某些實施方式，第一核酸、第二核酸及第三核酸中至少有一種核酸是建構於一病毒載體中。舉例來說，病毒載體可以是腺相關病毒(Adeno-associated virus)載體或慢病毒(lentivirus)載體。在不同實施方式中，三種核酸可以分別建構至三個獨立的病毒載體中；或者是，三種核酸可以建構至同一病毒載體中；亦或者是，三種核酸中的二種可以建構至同一病毒載體，而另一種則建構至一不同的病毒載體。

依據本揭示內容不同的實施方式，第一核酸、第二核酸及第三核酸可以是小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acids,siRNAs)、小髮夾核糖核酸(small hairpin ribonucleic acids,shRNAs)或微核糖核酸(micro-ribonucleic acids,miRNAs)。

在本揭示內容的某些實施方式中，第一核酸、第二核酸及第三核酸是siRNAs，其中第一、第二及第三核酸的正股(sense strand)分別具有序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3所示之序列。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本揭示內容實施例1所闡明之人類肥厚性疤痕纖維母細胞(human hypertrophic scar fibroblasts)於第3天的TGFBRI相對mRNA表現柱狀圖(n=3)；第2圖為依據本揭示內容實施例1所闡明之西方墨點代表圖，其係為人類肥厚性疤痕纖維母細胞於第5天的TGFBRI及GAPDH蛋白表現；第3圖為依據本揭示內容實施例1所呈現之以控制組siRNA(scrambled siRNA)或siTGBRI混合物(siTGFBRI-mix)進行轉染5天後，TGFBRI的免疫螢光染色代表圖；第4圖為依據本揭示內容實施例2所闡明之以siTGBRI混合物或控制組siRNA轉染人類肥厚性疤痕 纖維母細胞後第3、7及10天的生長曲線(n=5)；第5圖為依據本揭示內容實施例2所闡明之以siTGBRI混合物或控制組siRNA轉染人類肥厚性疤痕纖維母細胞，在有或無TGF-βI刺激下，第3、7及10天的生長曲線(n=5)；第6圖為依據本揭示內容實施例3所闡明之人類肥厚性疤痕纖維母細胞於第3天之不同基因的相對mRNA表現柱狀圖(n=5)；第7圖為依據本揭示內容實施例3所闡明之以控制組siRNA或siTGBRI混合物進行轉染7天後，利用酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)來分析細胞分泌第一型膠原蛋白的結果(n=5)；第8圖為依據本揭示內容實施例3所闡明之以控制組siRNA或siTGBRI混合物進行轉染6天後，纖維粘連蛋白(fibronectin)的免疫螢光染色代表圖；第9圖為依據本揭示內容實施例4所闡明之兔耳於受傷後第6、10及14週的傷口肉芽組織代表圖；比例尺=500μm；第10圖為依據本揭示內容實施例4所闡明之柱狀圖，其歸納了兔耳於受傷後第6、10及14週的溫哥華疤痕量表(Vancouver scar scale)；第11圖為依據本揭示內容實施例5所提供的皮膚切面代表圖，其係為受傷後第6、10及14週所採集之疤痕組織(左圖；比例尺=2μm)，而皮膚切面的局部放大圖則顯示於中圖及右圖(比例尺=100μm)；以及 第12圖為依據本揭示內容實施例5所闡明的柱狀圖，其總結了兔耳於受傷後第6、10及14週的疤痕增高指數(scar elevation index)。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

為求方便，此處將本說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙整理餘下。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者慣用者相同。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。同時，在此處「至少一」以及「一或多」等詞彙當包含一、二、三或更多種。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實 施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。

除非本說明書另有定義，否則本文中核苷酸的標記方式依循一般原則，即左手端是5’-端，而右手端為3’-端。

在此說明書中，「減少(reduce,reducing)」一詞對於疤痕形成而言，係指相對於無人為介入治療時自然形成的疤痕來說，能降低疤痕形成的發生率、疤痕大小(以現有或未來評估方法)、疤痕面積或疤痕體積。

「一有效量(an effective amount)」一詞在本文係指一藥物的用量足以產生所欲求的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。或者是，有效量亦可以醫藥組合物中活性成份的濃度來表示，例如莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度 (volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。

具體來說，本文中用以形容核酸之「有效量(effective amount)」一詞，係指足以減少一個體疤痕形成的核酸量。相似地，「一轉染有效量(a transfection-effective amount)」係指足以造成核酸有效轉染的轉染試劑的用量。

於本說明書中，「一藥學上可接受之載體(a pharmaceutically acceptable carrier)」是指一物質，其適用於人類及/或動物而不會產生過度的有害副作用(如毒性、刺激及過敏反應)，具有一適當的效益/危害比。另外，各載體必須為「可接受的」(acceptable)，即與該藥劑組合物之其餘成分相容。賦形劑可以是固態、半固態、液態稀釋液、膏狀物或膠囊的形式。

「載體」(carrier)一詞此處是指任何惰性(inert)物質(例如粉末或液體)，其係能成為本揭示內容之核酸的載具(vehicle)/賦形劑(excipient)。載體可以是任何於醫藥業中已知可用以製備醫藥組合物的物質，例如填充劑、稀釋劑、黏著劑、黏結劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、著色劑、潤溼劑、崩解劑等。

「應用」(application)或「投予」(administration)在此為可互換的詞彙，皆是用以闡述將本發明之核酸或包含本發明核酸之醫藥組合物提供至一個體，以減少或改善疤痕的方法。依據本揭示內容不同的 實施方式，局部的投予、局部的注射及透過皮膚來傳送為常見的傳送路徑。舉例來說，本揭示內容的核酸或醫藥組合物是局部投予至個體的皮膚，藉由將核酸或醫藥組合物塗抹至標的處(例如皮膚)來減少或改善疤痕的形成。

「個體(subject)」一詞是指一包含人類的哺乳動物，其係可接受本發明之核酸、醫藥組合物及/或方法的治療。除非特定指出單一性別，否則「個體」一詞同時意指雄性及雌性。

本發明部份是基於發明人首次發現三種可標的至人類TGFBRI基因(NM_004612.2)不同區域的混合物，其能於傷口癒合過程中減少疤痕的形成。特別是，組合使用三種siRNAs可增加僅使用單一種siRNA來減少疤痕的功效。因此，在一態樣中，本揭示內容是有關於一種包含所述三種siRNAs的混合物。另外，該siRNA混合物依據本揭示內容可用以減少(包含預防)疤痕的形成；舉例來說，其可用以製備(例如，被包含於一醫藥組合物中)一種可減少疤痕組織的藥物。本發明之siRNA混合物及包含該siRNA混合物的醫藥組合物，亦可應用於一種用以減少疤痕形成的方法。因此，本揭示內容亦係有關於用以在一有需要之個體上減少疤痕形成的方法。

依據本揭示內容的某些實施方式，三種siRNAs分別具有一包含序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3的正股。siRNAs通常為具有平滑末端(blunt)、3’-凸出(overhang)或5’-凸出的雙股形式。以下提供的操 作例中，siRNAs為平滑末端，且siRNAs的負股(anti-sense strands)為相對於正股的完全互補。

如相關領域習知技藝人士所知，可以藉由siRNAs以外的核苷酸分子來靜默(silencing)或抑制mRNA的轉譯(translation)，而該些核苷酸分子亦涵蓋於本發明內容。舉例來說，shRNA為一種RNA分子，其係藉由一小段核苷酸所形成的間距(spacer)來連結正股及負股，因而形成一環形(loop)結構，且依據本揭示內容的實施方式，第一、第二及第三核酸可以是shRNAs，其中該些shRNAs的正股分別等同於序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3所示之序列。在其他實施方式中，核酸係以miRNA或其前驅物(例如，pri-miRNA或pre-miRNA)的形式提供，且miRNA或其前驅物分別具有一包含序列編號：1、序列編號：2及序列編號：3所示之序列。亦或者，本核酸可以是任何雙股或單股的負股寡核苷酸(oligonucleotides)，其係分別包含序列編號：1-3的序列(或相對應之DNA序列)。

在某些實施方式中，所述醫藥組合物可以更包含一足以使siRNAs轉染至標的(宿主)細胞的轉染試劑。當可想見，轉染試劑及siRNA混合物可以配製為單一配方或獨立配方。另外，可藉由一或多種如電穿孔(electroporation)或磷酸鈣的外來刺激處理標的細胞，以增加轉染效率。

依據本揭示內容的某些實施方式，轉染試劑可以是陽離子脂質。市面上可得的陽離子脂質包含，但 不限定於Oligofectamine^TM、LipofectArnine^TM及LipofectAmine 2000^TM(Invitrogen)。在某些實施方式中，轉染試劑可以是能穿透細胞的胜肽，例如PepMute^TM(SignaGen)、N-TER^TM奈米粒子(N-TER^TM Nanoparticle,Sigma-Aldrich)及DeliverX^TM(Isogen)。

所述包含siRNAs的醫藥組合物還可以包含額外的成份，藉以穩定siRNA、延長siRNA的效期、促進siRNA之功效或將siRNA標的至特定組織/細胞。

在可任選的實施方式中，可將包含於本醫藥組合物之三種核酸建構於一或多個病毒載體上；例如腺相關病毒(Adeno-associated virus)載體或慢病毒(lentivirus)載體。在不同實施方式中，一病毒載體可以帶有三種核酸；或者是，複數個病毒載體分別帶有三種核酸中的一或二種。

依據本揭示內容不同的實施方式，可以將所述siRNA混合物(或者是shRNA混合物、miRNA混合物或一或多種上述病毒載體；以下等同於此)或包含該混合物的醫藥組合物投予至一個體；特別是，投予至該個體的特定標的位置，藉此在傷口的癒合過程中改善疤痕的形成。舉例來說，可以局部投予siRNA混合物或包含該siRNA混合物的醫藥組合物至一個體的受傷部位。或者是，可以將siRNA混合物或包含該siRNA混合物的醫藥組合物配製為一種藥劑形式，使該藥劑在投予至個體的表皮後，能穿透皮膚到達位於真皮層之受傷部位。亦或者是，可以局部注射siRNA混合物或包含該siRNA混合 物的醫藥組合物至傷口位置。除了局部給予外，亦可藉由諸如靜脈注射等全身性地投予方式對該個體投予該siRNA混合物或包含該siRNA混合物的醫藥組合物，再循環至受傷組織部位。在該些例子中，醫藥組合物可以非必要地包含一或多種載體，以改善siRNA混合物於局部或全身性的傳送過程。

依據本揭示內容可任選的實施方式，用以減少疤痕形成的方法更包含投予個體一轉染有效量的轉染試劑。在不同的實施方式中，siRNA混合物係可於投予轉染試劑之前、併行或是之後投予。在同時投予siRNA混合物及轉染試劑的例子中，siRNA混合物及轉染試劑可以配製為單一配方或獨立配方。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處提的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例

材料及方法

培養人類肥厚性疤痕纖維母細胞

初代培養的人類肥厚性疤痕纖維母細胞(human hypertrophic scar fibroblasts,hHSF)是取自於5個皮膚檢體(4位男性及1位女生，年齡分別介於36-86 歲之間)。所有的皮膚檢體皆為疤痕修復手術中的廢棄疤痕組織。檢體採集流程係遵照三軍總醫院審查委員會(Institutional Review Board of Tri-Service General Hospital,Taipei,Taiwan,R.O.C.)的準則來執行，且於告知各捐贈者後經其同意後簽署書面同意書。檢體樣本是依照下述步驟來進行。簡單來說，先將檢體切塊，並以含有0.2%分離酶(Dispase II,Roche Applied Science,Mannheim,Germany)的Leibovitz's L-15培養液(Gibco,Grand Island,NY)進行分解以移除上皮組織。再將真皮層浸泡在含有0.05%膠原酶(collagenase)及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Gibco)的改良伊格爾培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM,Gibco)中，置於37℃且含有5% CO₂的環境下24小時。所得的細胞係培養於含有10% FBS之DMEM中。每隔2-3天置換一次培養液。收集第3到6代的纖維母細胞進行下述實驗。

siRNA轉染

標的TGFBRI的siRNA是參考BLOCK-iT^TM RNAi Designer(Invitrogen,Carlsbad,CA)及NCBI-BLAST兩種程式來設計。三種選定的siRNA雙鏈體(duplexes)(即，siTGBRI-a：GACAUCUAUGCAAUGGGCUUAGUAU(序列編號：1)；siTGBRI-b：GCAUCUCACUCAUGUUGAUGGUCUA(序列編號：2)及siTGBRI-c：AGUAAGACAUGAUUCAGCCACAGAU(序列編號：3))涵 蓋了人類TGFBRI mRNA(NM_004612.2)正股的不同區域。三種siRNA雙鏈體亦設計為可與兔子的TGFBRI mRNA(XM_002708153.1)相吻合。該些標的至TGFBRI的siRNA序列係由Invitrogen客製化完成。控制對照組則包含一種不具標的專一性的控制組siRNA(scrambled siRNA,5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',MDbio,Taipei,Taiwan)。利用PepMute轉染套組(PepMute transfection kit,SignaGen,Rockville,MD)，個別地或共同地將三種TGFBRI siRNAs及控制組siRNA反轉染至纖維母細胞。簡單來說，將TGFBRI siRNA混合物或單一個TGFBRI siRNA稀釋於100μl的轉染緩衝液後，加入1μl的PepMute試劑，再將混合物置於室溫15分鐘。將細胞以含有10% FBS之900μl的DMEM均勻分散後，種植於含有100μl之稀釋siRNA雙鏈體的6孔盤(2×10⁵細胞/孔)中，置於含有5% CO₂的37℃環境。siRNA的最終濃度為60nM，此濃度係經測試後所決定出的最佳濃度。24小時後，以含有5% FBS且有或無外加2ng/ml TGF-β I(Invitrogen)的DMEM置換培養液。五種hHSF細胞株係以相同步驟進行處理。

分離、反轉錄及以即時定量聚合脢連鎖反應定量RNA

經siRNA轉染72小時後，分析細胞的基因表現。先利用RNeasy Mini kit(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)來分離總RNA。藉由NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE)來測定RNA的質與 量。再以MultiScript High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems,Foster City,CA)將RNA轉換為cDNA。使用QuantiFast^® Probe Assay kit (Qiagen)來進行即時定量聚合脢連鎖反應(quantitative real-time PCR)以分析TGFBRI及3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基因表現量。關於第一型膠原蛋白(Type I collagen)、第三型膠原蛋白(Type III collagen)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)及纖維粘連蛋白的基因表現，係以適當的引子(表1)及Power SYBR Green PCR master mix(Invitrogen)來進行定量，而GAPDH的基因表現在此則係作為組間對照之用。TaqMan即時定量聚合脢連鎖反應及SYBR Green即時定量聚合脢連鎖反應皆是以LightCycler 480 System(Roche Applied Science)來進行測定及分析。

以西方墨點法來分析TGFBRI的蛋白表現量

以西方墨點法來分析經TGFBRI siRNA轉染 5天後，細胞內TGFBRI的蛋白表現量。先以含有蛋白酶抑制劑(protease inhibitors,Roche Applied Science)的Pro-Prep蛋白萃取溶液(Pro-Prep protein extraction solution,Intron,Seoul,Korea)來溶解細胞。將蛋白萃物注入4-20%不同濃度的凝膠(gradient gel,Bio-Rad,Hercules,CA)後，再將其轉印(transferred)至PVDF膜上。以兔子抗人類TGFBRI抗體(GeneTex,San Antonio,TX)及作為組間對照之老鼠抗GAPDH抗體(GeneTex,San Antonio,TX)對PVDF膜進行免疫偵測。再將膜浸置於適當且接有HRP的第二抗體中，以活化後續的化學冷光受質(chemiluminescent substrate,Visual protein,Taipei,Taiwan)。最後以UVP BioImaging System(UVP,Upland,CA)來偵測及定量蛋白表現量。

纖維母細胞增殖試驗

利用細胞計數套組-8(Cell Counting Kit-8,Boster Biological Technology,Wuhan,China)來定量纖維母細胞的增生。簡單來說，將該些由5種皮膚檢體取得的hHSF種植於96孔盤(5×10³細胞/孔洞)，並予以三次重覆實驗，而後再投予如上所述之60nM的TGFBRI siRNAs。投予一天後，以包含或不包含2ng/ml TGF-β I的細胞培養液置換培養液。每二天置換一次培養液。於投予後的第3、7及10天，先於不含酚紅(phenol red)的90μlDMEM中加入10μl CCK-8溶液，再一起加至各孔洞。培養1小時後，以450nm紀錄吸光值。

以酵素連結免疫吸附法來分析第一型膠原蛋 白

為測定以TGFB RI siRNA轉染之纖維母細胞上清液中第一型膠原蛋白的表現量，將經siRNA轉染的纖維母細胞培養於含有2ng/ml之TGF-β I的培養液中，而後置於37℃、5% CO₂環境培養。每隔一天置換一次培養液。於第7天時，收集培養液，並利用酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)來偵量上清液，其中酵素連結免疫吸附法係使用人類第一型膠原蛋白酵素連結免疫吸附套組(human collagen Type I ELISA kit,BlueGene,Shanghai,China)來進行。藉由分光光度計(Bio-Rad)於450nm來紀錄吸光值，並佐以標準曲線來計算。所有的測定皆是於5種hHSF細胞株中，以三次重覆實驗來進行，且以μg/mL作表示。

動物模式

飼養於國防醫學院動物中心的成年紐西蘭白兔(Adult New Zealand white rabbits)係購買自動物衛生研究所(New Taipei City,Taiwan)。所有手術操作方式及實驗流程皆經由國防醫學院動物中心及使用委員會認證許可。將六個月大的兔子(3-3.5公斤)由肌肉打入舒泰(zoletil,1mg/kg)及賽拉嗪(xylazine,3mg/kg)予以鎮定處理，再吸入1.5-4%的異氟烷(isoflurane)進行麻醉。在實驗操作過程中，施予凱妥普洛芬(Ketoprofen,10mg/kg)作為止痛劑。於每耳的凹面側切割四個1.8×1.8平方公分且移除軟體膜(perichondrium)的全層皮膚缺損傷口。以凡士林紗布覆蓋傷口，並以彈性繃帶(CoBan,3M Healthcare,St Paul,MN)加以固定，二週的復原期間，除非傷口發生感染，否則不需更換敷布。依此步驟會在第14天於傷口的邊緣形成約5mm的肉芽組織。將總計88個傷口分成TGFBRI siRNA治療組及對照組。在以TGFBRI siRNA治療的組別中，在受傷後的第2、3及4週分別於各傷口的肉芽處注入240pmol的TGFBRI siRNAs，其係溶於含有2.5μl之PepMute試劑的40μl轉染緩衝液中。對照組除了不投予siRNA之外，其餘操作步驟皆相同。在注入siRNA前，先以上述方式使動物鎮定。於皮膚缺損手術後的第6、10及14週，以溫哥華疤痕量表(Vancouver scar scale,VSS)(Fearmonti,R.,Bond,J.,Erdmann,D.& Levinson,H.(2010).A review of scar scales and scar measuring devices.Eplasty 10：e43.)來評估傷口的修復程度。最後將動物以過量麻醉的方式予以犠牲後，收集其疤痕檢體。疤痕檢體依序以10%福馬林固定、再以石蠟包埋、切為5μm薄片後置於玻璃玻片上，最後以梅森三色染色法(Masson's trichrome stain,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)進行染色。利用疤痕增高指數(scar elevation index,SEI)(Kloeters,O.,Tandara,A.& Mustoe,T.A.(2007).Hypertrophic scar model in the rabbit ear：a reproducible model for studying scar tissue behavior with new observations on silicone gel sheeting for scar reduction.Wound Repair Regen 15 Suppl 1：S40-45.)來評估皮膚增厚的程度。

統計分析

所有結果皆表示成平均值±標準差。以單向(one-way)ANOVA進行統計分析。除非說明書另有定義，否則p值小於0.05即代表具有統計上的顯著差異(P<0.05)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

實施例1

TGBRI siRNA混合物可減少TGFBRI的基因表現

在此實施例中，人類肥厚性疤痕纖維母細胞係以60nM的siTGBRI-a、siTGBRI-b、siTGBRI-c或控制組siRNA，或是包含siTGBRI-a、siTGBRI-b及siTGBRI-c之60nM的siTGBRI混合物進行轉染。依據上述步驟，於第3天利用定量反轉錄PCR分析來確認TGFBRI的基因表現。將以控制組siRNA轉染之細胞的mRNA量定量為1，第1圖所顯示的數據係以對照組及各治療組間的倍數差異來表示。

如第1圖所示，不論是單獨或是合併投予，三種siRNAs皆可顯著降低TGFBRI基因的mRNA表現量。然而，本發明發現相較於三種siRNAs個別之單一投予，siRNA混合物(siTGBRI-mix)更能有效地抑制TGFBRI的mRNA表現。換言之，將三種siRNAs合併投予能產生加乘性的功效(synergistic effect)。再者，統計分析顯示，以siTGFBRI混合物治療的組別與任一種以單一siRNA治療的組别具有相當顯著的統計差異。因此，該加乘功效乃是此領域相關先前技術所無法輕易達成或推知的結果。

西方墨點分析(第2圖)及免疫螢光染色(第3圖)亦進一步確認siTGFBRI混合物可減少TGFBRI的蛋白表現量。

實施例2

TGBRI siRNA混合物可抑制人類皮膚纖維母細胞的增生

在以siRNA轉染後的第3、7及10天，分析該些以不同濃度(15、60或150nM)siTGBRI混合物進行轉染之人類肥厚性疤痕纖維母細胞的細胞增生情形。如第4圖所示，投予15-150nM的siTGBRI混合物能有效抑制纖維母細胞增生。在轉染後的早期(例如第一週)，siTGBRI混合物的濃度並不會顯著地影響抑制效果；然而，於轉染後10天，可觀察到與劑量相關地抑制作用，其中較高濃度的siTGBRI混合物可對纖維母細胞的增生產生較佳的抑制作用。

另外，以60nM的siTGBRI混合物或60nM的控制組siRNA轉染人類肥厚性疤痕纖維母細胞後，選擇性地加入TGF-β I(2ng/ml)。第5圖總結了在轉染後第3、7及10天，各組的細胞數量。藉由比較投予「控制組siRNA+TGF-β I」及「siTGBRI混合物+TGF-β I」的組別，可發現投予siTGBRI混合物，可顯著地抑制纖維母細胞增生。

實施例3

降低TGFBRI可抑制ECM生成

細胞外基質(extracellular matrix)的形成需要 不同的中間分子及成份參與其中，例如第一型膠原蛋白、第三型膠原蛋白、纖維粘連蛋白及結締組織生長因子。在此實施例中，為了解上述蛋白之相對mRNA表現量，以60nM的siTGBRI混合物或控制組siRNA轉染人類肥厚性疤痕纖維母細胞，並外加或不外加TGF-β I處理，利用即時定量聚合脢連鎖反應於轉染72小時後進行分析。將以控制組siRNA轉染且以TGF-β 1刺激(正對照組)之細胞的mRNA定量為1，第6圖的結果係以各組相對於正對照組的倍數差異來表示。

第6圖的結果顯示，相較於投予「控制組siRNA+TGF-β I」的組別，投予「siTGBRI混合物+TGF-β I」組別之第一型膠原蛋白、第三型膠原蛋白、纖維粘連蛋白及結締組織生長因子的mRNA表現皆會明顯下降。

在以siRNA轉染後的第7天，收集細胞的培養液，且以ELISA來分析細胞分泌的第一型膠原蛋白。如第7圖的ELISA結果顯示，以siTGBRI混合物轉染可大幅降低第一型膠原蛋白於纖維母細胞中的生成。

第8圖為纖維粘連蛋白的免疫螢光染色照片。如第8圖所示，於轉染後6天可觀察到以siTGBRI混合物進行轉染可減少ECM中的纖維粘連蛋白。

有鑑於此，投予siTGBRI混合物可減少轉染之纖維母細胞中ECM的生成。

實施例4

TGFBRI siRNA混合物可於活體減少肥厚性 疤痕的形成

在受傷後之2、3及4週，將siTGBRI混合物注入兔子耳朵受傷部位的肉芽組織。再於受傷後的6、10及14週對該些癒合組織進行攝影。

在第9圖中，相較於對照組的傷口，投予siTGBRI混合物之兔子的傷口癒合較佳。具體來說，接受siTGBRI混合物之兔子的疤痕面積及疤痕體積皆較對照組小許多。另外，由疤痕的癒後顏色來看，投予siTGBRI混合物之兔子的傷口亦較不具有色素沉澱。

利用溫哥華疤痕量表(Vancouver scar scale,VSS)來評估傷口的修復程度，第10圖總結該些結果。VSS係評估修復組織的血管分佈、高度/厚度、柔韌性及色素沉澱，且已廣泛使用於治療的評估及燒傷研究的測量。依據VSS量表，0級代表完美或接近完美的癒合組織。第10圖的結果証實投予siTGBRI混合物可有效改善活體之肥厚性疤痕的形成。

實施例5

TGFBRI siRNA混合物可於活體減少膠原蛋白的堆積

於受傷後之6、10及14週收取該些接受上述實施例4治療的兔子疤痕組織，並以上述之「材料及方法」步驟製備組織切片。

第11圖提供了代表性的修復組織顯微照片。如第11圖所示，接受siTGBRI混合物治療的組別，其膠原蛋白(藍色部份)會較不密集，顯示投予siTGBRI 混合物可顯著地減少膠原蛋白於修復組織的堆積。

更進一步利用疤痕增高指數(scar elevation index,SEI)來評估修復組織。SEI為一種組織測量，其係用以量測疤痕相對於正常組織的高度。各疤痕的肥厚程度為總創傷區域相對於正常組織之組織高度比，其中SEI為1時係表示疤痕的高度沒有增加。第12圖總結了SEI結果，該結果指出接受siTGBRI混合物治療的兔子，其疤痕相較於對照組之兔子，疤痕增加的高度較少。

當可理解上述實施方式與實施例僅為例示，且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備，並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 王怡文 戴念梓

<120> 一種用以減少疤痕形成的醫藥組合物

<130> P2760-TW

<160> 13

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> TGFBRI siRNA-a

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

Claims (9)

1. 一種用以減少疤痕形成的醫藥組合物，包含：一有效量的一第一核酸，其中該第一核酸的序列為序列編號：1所示之序列或與其相對應的DNA序列；一有效量的一第二核酸，其中該第二核酸的序列為序列編號：2所示之序列或與其相對應於的DNA序列；一有效量的一第三核酸，其中該第三核酸的序列為序列編號：3所示之序列或與其相對應的DNA序列；以及一藥學上可接受的載體。
2. 如請求項1所述之醫藥組合物，更包含一轉染(transfection)有效量之一轉染試劑。
3. 如請求項2所述之醫藥組合物，其中該轉染試劑為一陽離子脂質或一可穿透細胞的(cell-penetrating)胜肽。
4. 如請求項3所述之醫藥組合物，其中該轉染試劑包含一或多種可穿透細胞的胜肽。
5. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中該第一核酸、該第二核酸及該第三核酸中至少有一個是建構於一病毒載體中。
6. 如請求項5所述之醫藥組合物，其中該病毒載體為一腺相關病毒(Adeno-associated virus)載體或一慢病毒(lentivirus)載體。
7. 如請求項5所述之醫藥組合物，其中該第一核酸、該第二核酸及該第三核酸係分別建構於三個病毒載體中。
8. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中該第一核酸、該第二核酸及該第三核酸為小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acids,siRNAs)、小髮夾核糖核酸(small hairpin ribonucleic acids,shRNAs)或微核糖核酸(micro-ribonucleic acids,miRNAs)。
9. 如請求項8所述之醫藥組合物，其中該第一核酸、該第二核酸及該第三核酸為小干擾核糖核酸。