CN116240176B - 一种分泌型中性粒细胞及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种分泌型中性粒细胞及用途，该分泌型中性粒细胞为蛋白内质网‑高尔基体转运通路处于激活状态的中性粒细胞。本发明针对牙周炎发病机理进行研究，鉴定了一种中性粒细胞分泌表型，其受到去泛素化酶OTUD1调控，能够作为牙周炎、关节炎等炎症性疾病治疗靶点。此外，本发明解决了现有牙周炎治疗方法的靶向性和针对性不足的问题，通过合理调控中性粒细胞迁移，从而维持牙周免疫稳态，实现精准治疗。

Description

一种分泌型中性粒细胞及用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种分泌型中性粒细胞及用途。
背景技术
牙周炎是由菌斑微生物感染引起的累及牙周支持组织的炎症性疾病，宿主免疫调节与微生物间的相互作用是其病理机制研究的重点。中性粒细胞是牙龈缝隙和牙周袋中最丰富的免疫细胞，在牙周炎进程中具有双重作用。当机体受到牙周致病菌侵袭时，中性粒细胞迅速募集到牙周组织，在菌斑生物膜与牙周组织间形成防御屏障，抵抗感染，消除炎症。同时，中性粒细胞过度浸润会造成组织免疫病理损伤并促进炎性骨丢失，加重牙周炎症。因此，合理调控中性粒细胞的募集有助于牙周免疫稳态的维持。
中性粒细胞从血管渗出向炎症部位募集受到细胞膜表面黏附分子的调控，如整合素、选择素等。细胞膜表面CD9、CD47与多种整合素分子相互作用，形成信号转导复合体，促进细胞与细胞外基质的黏附活性，调节中性粒细胞的附着与迁移。
90%的膜蛋白呈递到细胞表面都会经历从内质网到高尔基体的蛋白转运途径，蛋白质的分泌途径包括Sec分泌途径，双精氨酸途径以及信号识别颗粒转运系统，大部分的膜蛋白以及胞外分泌蛋白都会经历Sec分泌途径，即从内质网到高尔基体再到细胞膜或细胞外的过程。蛋白质从内质网向高尔基体的运输过程以囊泡的方式进行，囊泡包被蛋白以复合体的形式发挥功能，其中最重要的蛋白复合体是包被蛋白复合体2(COP II)。COP II由SAR1、SEC23-SEC24以及SEC13-SEC31三部分组成。SAR1是内质网上COP II囊泡形成的启动者，SEC23-SEC24与待转运蛋白结合并引导转运蛋白进入即将生成的囊泡，SEC13-SEC31复合体使内质网膜形成有曲度的弧形，促进囊泡缢裂。中性粒细胞发挥生物学功能很大程度上依赖于膜蛋白(如：整合素、选择素)和分泌蛋白(如促炎因子)。
牙周炎是由菌斑微生物感染引起的累及牙周支持组织的慢性炎症性疾病，影响全球约10%的人口。引起牙周损伤的免疫细胞主要是中性粒细胞，中性粒细胞在牙周浸润不足，会引起致病菌反复持续侵染，诱发牙周炎；而中性粒细胞过度募集也会引起炎性骨丢失，加重牙周炎症。牙周炎所引起的牙龈出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收以及牙龈松动等严重影响患者的生活质量。目前，临床上治疗牙周炎的方式包括机械洁刮治，引导组织再生等牙周支持治疗以及药物辅助治疗。
对牙周炎发病机制不足，合理调控中性粒细胞迁移，尤其是发现中性粒细胞的负调控因子，是维持牙周免疫稳态的关键。现有疗法无法彻底高效地清除生物膜，难以实现精准治疗，因此寻找更具有针对性和靶向性的治疗策略是攻克牙周炎的重点和难点。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，本发明提供一种分泌型中性粒细胞及用途。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种分泌型中性粒细胞，其中，所述分泌型中性粒细胞为蛋白内质网-高尔基体转运通路被激活的中性粒细胞。
本发明的第二方面，提供一种分泌型中性粒细胞，其中，其为选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调的分泌型中性粒细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的分泌型中性粒细胞，其中，使用基因敲除试剂敲除或敲减去泛素化酶Otud1蛋白，从而激活蛋白内质网-高尔基体转运通路，或者使用基因过表达试剂，使得选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调。
本发明的第三方面，提供一种分泌型中性粒细胞的制备方法，其中，所述方法包括使用试剂靶向中性粒细胞的步骤，其中所述试剂用于敲除或敲减去泛素化酶Otud1蛋白，从而激活蛋白内质网-高尔基体转运通路，或者使用基因过表达试剂，使得选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调。
本发明的第四方面，提供一种功能性中性粒细胞，其中，所述功能性中性粒细胞为蛋白内质网-高尔基体转运通路被抑制或阻断的中性粒细胞；
优选地，使用以下试剂抑制或阻断蛋白内质网-高尔基体转运通路：
(1) 基因敲除试剂，其用于敲除或敲减蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制或阻断蛋白质转运；
(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin和Leptomycin B中的至少一种；
(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其用于提高去泛素化酶OTUD1表达量。
本发明的第五方面，提供一种体外调控中性粒细胞分泌细胞因子水平的方法，其包括：
a. 使用蛋白转运抑制剂靶向中性粒细胞的步骤，其中所述蛋白转运抑制剂抑制或阻断蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而抑制中性粒细胞细胞因子水平；或者
b. 使用针对去泛素化酶OTUD1的基因敲除试剂，其中敲除试剂降低靶向中性粒细胞细胞的去泛素化酶OTUD1的表达，从而增加中性粒细胞细胞因子水平。
在某些实施方案中，根据本发明所述的体外调控中性粒细胞分泌细胞因子水平的方法，其中，所述蛋白转运抑制剂包括以下中的至少一种：
(1) 基因敲除试剂，其用于敲除或敲减蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制或阻断蛋白质转运；
(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin和Leptomycin B中的至少一种；
(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其用于提高去泛素化酶OTUD1表达量。
本发明的第六方面，提供一种体外调控中性粒细胞迁移和募集的方法，其包括：
a’. 使用蛋白转运抑制剂靶向中性粒细胞的步骤，其中所述蛋白转运抑制剂抑制或阻断蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而抑制中性粒细胞迁移和募集；或者
b’. 使用针对去泛素化酶OTUD1的基因敲除试剂，其中敲除试剂降低靶向中性粒细胞细胞的去泛素化酶OTUD1的表达，从而促进中性粒细胞迁移和募集；
优选地，所述蛋白转运抑制剂包括以下中的至少一种：
(1) 基因敲除试剂，其用于敲除或敲减蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制或阻断蛋白质转运；
(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin中的至少一种；
(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其用于提高去泛素化酶OTUD1表达量。
本发明的第七方面，提供一种用于筛选对治疗或缓解牙周炎有用的化合物的方法，其包括以第一方面所述的分泌型中性粒细胞或第四方面的功能性中性粒细胞作为筛选模型的步骤。
本发明针对牙周炎发病机理进行研究，发现去泛素化酶OTUD1靶向蛋白转运通路，限制牙周过度炎症反应。此外，本发明解决了现有牙周炎治疗方法靶向性和针对性不足的问题。
本发明鉴定了一种中性粒细胞分泌表型，其受到去泛素化酶OTUD1调控，可作为牙周炎、关节炎等炎症性疾病治疗靶点。此外，通过合理调控中性粒细胞迁移，从而能够维持牙周免疫稳态，实现精准治疗。
附图说明
图1示出了与健康人群相比，牙周炎患者OTUD1转录组水平显著下调。
图2示出了(A)小鼠牙槽骨吸收模型建立；(B-D)micro-CT扫描成像评估小鼠骨吸收程度。
图3示出了炎症因子的转录水平以及蛋白质水平。
图4示出了10X转录组测序结果表明OTUD1主要在中性粒细胞中高表达。
图5聚类分析结果表明，Neu 1在Otud1 -/- 小鼠中比例更高。
图6为Neu 1亚群的差异基因分析结果，其中左侧标示的基因为下调表达，右侧标示的基因为上调表达，中间未标示的基因为稳定表达。
图7为Neu 1亚群差异基因的富集分析以及与其他免疫细胞互作分析结果。
图8为流式以及血常规检测结果。
图9为(A-B)利用蛋白质谱在HL-60细胞中鉴定OTUD1结合蛋白；(C-D)利用RUSH(retention using selective hook)系统检测蛋白质通过内质网-高尔基体囊泡运输的效率。
图10示出了(A)GelMA/BFA具有可塑性；(B)GelMA/BFA具有可注射性。
图11为(A)GelMA/BFA给药系统建立；(B-D)micro-CT扫描成像评估小鼠骨吸收程度。
图12示出了GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更低。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
需要说明的是，本文所述的“量”应做以下广义理解：既可指定量结果，也可指半定量结果，既可指绝对含量，也可指相对含量。
分泌型中性粒细胞
本发明的一个方面，提供了一种分泌型中性粒细胞。以牙周炎作为炎性疾病的一个非限制性实例，本发明人首先发现，与健康人群相比，牙周炎患者去泛素化酶OTUD1转录组水平显著下调，中性粒细胞募集，炎性因子释放增加。然后，本发明构建了去泛素化酶OTUD1敲除的小鼠牙周炎模型，发现促炎因子转录水平显著提高。通过蛋白质谱检测，结果发现OTUD1与蛋白转运通路相关蛋白存在相互作用，最终通过实验验证了OTUD1抑制细胞中蛋白质(包括但不限于膜蛋白、分泌蛋白)从内质网向高尔基体的运输。在敲除小鼠中给予治疗有效量的蛋白转运抑制剂，尤其是蛋白内质网-高尔基体转运抑制剂，结果发现能够减轻牙槽骨吸收，并且负调控中性粒细胞募集和迁移，降低促炎因子转录水平和相关细胞因子的蛋白质水平，表明蛋白转运抑制剂能够用于治疗或改善牙周炎，特别是治疗或改善由于体内靶标细胞(中性粒细胞)中去泛素化酶表达或活性下调、中性粒细胞募集和迁移而导致的促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高的牙周炎。
本发明中，促炎因子转录水平和相关细胞因子的蛋白质水平可采用本领域已知的任何方法进行确定，对此不特别限定，本领域技术人员熟知如何确定相关基因的表达量或相关蛋白的量，例如使用特异性结合上述蛋白的抗体、或相关基因的探针，或能够扩增所述相关基因而设计的引物等。
在某些实施方案中，分泌型中性粒细胞来源于受试者，所述受试者是指脊椎动物，优选为哺乳动物，哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜、人等，优选为人。优选地，受试者为其体内靶标细胞中去泛素化酶表达或活性下调的受试者。还优选地，受试者为其体内靶标细胞去泛素化酶表达或活性下调，使得体内靶标细胞中促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高的受试者。进一步优选地，受试者为由于促炎因子转录水平和相关细胞因子水平升高而患有牙周炎的受试者。此外，在上述每种情况下，受试者为其体内蛋白内质网-高尔基体转运通路处于非抑制或激活状态的受试者，且中性粒细胞作为靶标细胞在体内募集。可以理解的是，在体外获得或在体外培养的生物实体的中性粒细胞及其后代也涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明中，中性粒细胞的来源不特别限定，其来源包括但不限于例如骨髓、血液(如外周血)、组织(如结缔组织)等。
本发明中，术语“分泌型中性粒细胞”是指其蛋白内质网-高尔基体转运通路处于激活状态的中性粒细胞，特别是指当使用基因敲除试剂敲除或敲减去泛素化酶Otud1蛋白，从而激活蛋白内质网-高尔基体转运通路，正向调控中性粒细胞迁移或募集，使炎性细胞因子表达增加，并且选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调。虽然本发明的具体实施例中未示出基因过表达试剂的具体序列，但是本领域可以根据基因数据库进行设计并合成相关核酸序列。
基于同一发明构思，本发明还提供一种功能性中性粒细胞，术语“功能性中性粒细胞”是指其蛋白内质网-高尔基体转运通路被抑制或阻断的中性粒细胞，特别是指当使用蛋白转运抑制剂靶向处理中性粒细胞时，抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，负调控中性粒细胞迁移或募集，使炎性细胞因子表达减少并使选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达下调。
本发明中，使用以下试剂使得蛋白内质网-高尔基体转运通路被抑制或阻断，或者使得选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达下调：
(1) 基因敲除试剂，其用于敲除或敲减蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白，从而抑制蛋白质转运；
(2) 微生物代谢物，其包括布雷非德菌素A、Monensin中的至少一种；
(3) 去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂，其用于提高去泛素化酶OTUD1表达量。
本发明中，基因敲除试剂包括但不限于CRISPR/Cas9系统、干扰RNA或反义寡核苷酸，特别是针对或靶向蛋白内质网-高尔基体转运通路相关蛋白的siRNA或shRNA，虽然本发明的具体实施例中未示出具体序列，但是本领域可以根据蛋白和基因数据库进行设计并合成相关核酸序列。一个非限制实例可以是例如靶向高尔基体Rab33b的siRNA，其序列包括：CACAAACCAUUAAUGCUUAUU；GACCAACAUGGCUAGUUUUU；GAUAGAAGAAUGCAAACAAUU；GAUAUACCACGGUUCUUGUU。在某些实施方案中，本发明的蛋白转运抑制剂包括抗体，例如包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或来源它们的片段。
本发明中，布雷非德菌素A(本文有时也简称为“BFA”)和Monensin可以通过本领域已知的方法合成或可通过市售产品获得，对此不特别限定。
本发明中，蛋白转运抑制剂的其他小分子试剂的实例可以是已公开的靶向降解载体蛋白，特别是跨膜蛋白的小分子化合物，其实例包括但不限于TMPBM、CP－19076070－1、CP－19076070－2或CP－19076070－3等。
本发明中，去泛素化酶OTUD1激动剂或过表达试剂是指能够提高去泛素化酶OTUD1表达量的任何试剂。去泛素化酶OTUD1激动剂的一个实例可以是小分子化合物，例如已公开的能够上调OTUD1表达的VE-822。
本发明中，去泛素化酶OTUD1过表达试剂的实例也可以包括任何能够使去泛素化酶OTUD1过表达的基因工程试剂，例如包含OTUD1的重组载体。过表达可以采用本领域已知的方法，例如构建过表达OTUD1的腺病毒载体，向宿主细胞转染载体后收集病毒；滴加病毒液感染细胞；纯化并浓缩病毒；通过哺乳动物，如小鼠静脉注射使OTUD1过表达。一个非限制性OTUD1过表达的引物序列包括5’-CTAGCTAGCATGGACGAGAAGACCACCGG-3’；5’-CCGCTCGAGCGAGAGCATGCATTTTGTTCAATATACAT-3’。
本发明中，去泛素化酶OTUD1的基因敲除试剂的一个非限制性实例为OTUD1的gRNA，其序列包括：OTUD1-gRNA1-F:CACCGACCGGTCTCGGGCTCGGGCG；OTUD1-gRNA1-R:AAACCGCCCGAGCCCGAGACCGGTC。
本发明中，中性粒细胞迁移和募集可以根据中性粒细胞的数量进行测定，其数量测定可以采用本领域已知的方法，例如但不限于流式细胞术等。
分泌型中性粒细胞的制备方法
本发明还提供一种分泌型中性粒细胞的制备方法，包括使用试剂靶向中性粒细胞的步骤，其中所述试剂用于敲除或敲减去泛素化酶Otud1蛋白，从而激活蛋白内质网-高尔基体转运通路，或者使用基因过表达试剂，使得选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调。
体外调控中性粒细胞分泌细胞因子水平的方法
本发明还提供一种体外调控中性粒细胞分泌细胞因子水平的方法，其包括：
a. 使用蛋白转运抑制剂在体外靶向中性粒细胞的步骤，其中所述蛋白转运抑制剂抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而抑制中性粒细胞细胞因子水平(或量)；或者
b. 使用针对去泛素化酶OTUD1的基因敲除试剂，其中敲除试剂能够在体外降低靶向中性粒细胞细胞的去泛素化酶OTUD1的表达，从而增加中性粒细胞细胞因子水平(或量)。
本发明因此还提供一种体外调控中性粒细胞迁移和募集的方法，其包括：
a’. 使用蛋白转运抑制剂在体外靶向中性粒细胞的步骤，其中所述蛋白转运抑制剂抑制蛋白内质网-高尔基体转运通路，从而抑制中性粒细胞迁移和募集；或者
b’. 使用针对去泛素化酶OTUD1的基因敲除试剂，其中敲除试剂在体外能够降低靶向中性粒细胞细胞的去泛素化酶OTUD1的表达，从而促进中性粒细胞迁移和募集。
此外，本发明还提供一种用于筛选对治疗或缓解牙周炎有用的化合物的方法，其包括以本文所述的分泌型中性粒细胞作为筛选模型的步骤。具体而言，使用试剂测量所述中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态、基因表达量、细胞因子水平(或量)和/或去泛素化酶OTUD1的量得到测量值，并与施用化合物后的测量值进行比较的步骤。此处使用的试剂可以采用本领域已知的试剂，对此不特别限定，例如特异性结合去泛素化酶OTUD1的抗体、炎症相关细胞因子的ELISA检测相关试剂、用于OTUD1表达的转录组测序相关试剂、中性粒细胞数量测定的流式细胞术相关试剂、用于蛋白互作检测的蛋白质谱相关试剂等。
在具体实施方案中，当所述测量值中的中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态处于抑制状态、选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达下调和/或去泛素化酶OTUD1的量升高，则将所述化合物筛选为对治疗或缓减牙周炎有用的化合物；当所述测量值中的中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态处于非抑制状态、选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调和/或去泛素化酶OTUD1的量降低，则将所述化合物筛选为对治疗或缓减牙周炎无用的化合物。
实施例
在已知转录组和疾病相关数据库中进行数据分析，发现与健康人群相比，牙周炎患者去泛素化酶OTUD1转录组水平显著下调，如图1所示。
接下来，构建小鼠模型，鉴定了去泛素化酶OTUD1靶向蛋白转运通路，缓解炎性骨吸收，具体如下：
(1)小鼠牙槽骨吸收模型建立
利用5-0无菌缝线在WT和Otud1 -/- 小鼠双侧上颌第二磨牙处绕牙颈部结扎一圈并在近中牙颈部打结，连续7天在双侧上颌第二磨牙处涂抹109 CFU牙龈卟啉单胞菌，诱导小鼠牙周炎(图2A)，micro-CT扫描评估牙槽骨吸收程度，结果显示Otud1 -/- 小鼠牙槽骨吸收更严重(图2B-D)。取牙龈组织，提取总RNA，逆转录后，qPCR检测组织中炎症因子的转录水平，结果显示Otud1 -/- 小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更高(图3A)。利用ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平，结果显示Otud1 -/- 小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更高(图3B)。
利用DNase和IV型胶原酶将牙龈组织解离为单细胞(CD45+)，并进行10X转录组测序，OTUD1主要在中性粒细胞中高表达(图4)。根据各亚群表达的差异基因，牙龈组织中免疫细胞可分为12个亚群，并且Otud1 -/- 小鼠牙龈组织中的中性粒细胞比例明显升高。
将中性粒细胞进一步聚类分群，根据特征基因表达情况可以分为Neu 1(本发明的分泌型中性粒细胞)和Neu 2两群，并且Neu 1在Otud1 -/- 小鼠中比例更高(图5)。将单细胞转录组测序捕获到的中性粒细胞提取，根据特征基因，中性粒细胞可划分为2个亚群。计算WT和Otud1 -/- 小鼠牙龈组织中各亚群细胞所占比例，Otud1 -/- 小鼠牙龈Neu1比例升高。差异基因分析显示Neu 1上调表达的基因有Cxcl2，Cd44，Cd14，Il1b，Il1a，Il1r2，Il1m，Tnf等(图6)。
对差异基因进行富集分析，Neu 1高表达的基因集中在蛋白质分泌、细胞因子分泌等通路，且OTUD1缺失的中性粒细胞分泌表型更明显(图7A)。通过细胞互作分析，发现OTUD1缺失的分泌型中性粒细胞与其他免疫细胞互作更强(图7B)。其中，图7A的GO和GSEA富集分析显示Neu 1特征为分泌型中性粒细胞，且OTUD1缺失中性粒细胞向分泌型极化。图7B的中性粒细胞与其他免疫细胞互作分析，结果显示OTUD1缺失的分泌型中性粒细胞与其他免疫细胞互作更强。
通过流式以及血常规检测，Otud1 -/- 小鼠牙龈组织中浸润的中性粒细胞数量增加(图8A)，外周血中中性粒细胞数量减少(图8B)，说明OTUD1缺失促进中性粒细胞向炎症组织迁移和募集。
利用蛋白质谱检测在HL-60细胞中检测OTUD1相互作用蛋白，结果显示OTUD1与蛋白转运通路相关蛋白存在相互作用(图9A-B)。通过构建RUSH(retention using selectivehook)体系，发现OTUD1抑制细胞中蛋白质从内质网向高尔基体的运输(图9C-D)。构建同时表达报告蛋白和钩子(hook)的质粒，以Golgin84-EGFP-SBP融合蛋白为报告蛋白，Li-streptavidin融合蛋白为钩子，SBP与streptavidin的结合使得报告蛋白最初滞留在内质网，在细胞培养上清加入生物素，由于竞争作用使报告蛋白从钩子上脱落，沿运输途径转运至高尔基体，利用免疫荧光检测报告蛋白的定位，发现OTUD1抑制蛋白转运。
(2)GelMA包裹BFA
配置0.25%光引发剂LAP，利用0.25%光引发剂配置10%光敏性生物明胶GelMA(EFL-GM-30)，60-70℃水浴避光溶解，负载浓度为500μg/mL的BFA，用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，其中，凝胶具有可塑性和可注射性(图10)。
(3)牙周袋内药物注射
将负载BFA的光敏性水凝胶给小鼠牙周袋内注射5μl，用405nm光源照射30秒使得GelMA固化。
(4)骨吸收评估
建模后第7天处死小鼠，取小鼠上颌骨，micro-CT扫描评估牙槽骨吸收程度，结果显示GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠牙槽骨吸收减轻(图11)。取牙龈组织，提取总RNA，逆转录后，qPCR检测组织中炎症因子的转录水平，结果显示GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠牙龈组织中促炎因子转录水平更低。利用ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平，结果显示GelMA/BFA牙周袋内注射后小鼠血清中炎症相关细胞因子的蛋白质水平更低(图12)。
本发明中，设置的一个对照为10%GelMA不包裹BFA，其他步骤与上述步骤相同，相较于GelMA，牙周袋内注射GelMA/BFA后小鼠骨吸收缓解。另一对照中，小鼠基因型为WT，其他步骤与上述步骤相同，相较于Otud1 -/- 小鼠，WT小鼠牙槽骨吸收更少。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (4)

1.一种用于筛选对治疗或缓解牙周炎有用的化合物的方法，其特征在于，包括以分泌型中性粒细胞作为筛选模型的步骤，其中，所述分泌型中性粒细胞为蛋白内质网-高尔基体转运通路被激活的中性粒细胞，所述方法包括使用试剂测量所述中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态和/或去泛素化酶OTUD1的量得到测量值，并与施用化合物后的测量值进行比较的步骤，当所述测量值中的中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态处于抑制状态、选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达下调和/或去泛素化酶OTUD1的量升高，则将所述化合物筛选为对治疗或缓减牙周炎有用的化合物；当所述测量值中的中性粒细胞蛋白内质网-高尔基体转运通路状态处于非抑制状态、选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调和/或去泛素化酶OTUD1的量降低，则将所述化合物筛选为对治疗或缓减牙周炎无用的化合物。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述分泌型中性粒细胞为选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调的分泌型中性粒细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用基因敲除试剂敲除或敲减去泛素化酶Otud1蛋白，从而激活蛋白内质网-高尔基体转运通路，使得选自Cxcl2、Cd44、Cd14、Il1b、Il1a、Il1r2、Il1m和Tnf的至少一种基因表达上调。
4.蛋白转运抑制剂在制备用于治疗牙周炎的药物中的用途，其特征在于，所述蛋白转运抑制剂为OTUD1。
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