CN110541029B - 乙醛脱氢酶18a1基因及其编码产物在mycn扩增神经母细胞瘤中的应用 - Google Patents

乙醛脱氢酶18a1基因及其编码产物在mycn扩增神经母细胞瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物在MYCN扩增神经母细胞瘤中的应用，可以作为MYCN扩增神经母细胞瘤的治疗及药物筛选靶点，对MYCN扩增神经母细胞瘤治疗及药物筛选提供了新的思路；同时还可以作为MYCN扩增神经母细胞瘤的诊断标志物，可用于MYCN扩增神经母细胞瘤的早期诊断和预后监测，对MYCN扩增神经母细胞瘤的治疗和诊断具有重要的临床意义。

Description

乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物在MYCN扩增神经母细胞瘤 中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物在MYCN扩增神经母细胞瘤中的应用。
背景技术
神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童最常见的外周神经系统肿瘤。MYCN扩增见于20％左右的NB患者，是NB患者最重要的预后不良因素。探寻靶向MYCN的治疗方案和药物，具有重要的临床意义。然而，由于MYCN所编码蛋白N-myc在结构上的特殊性而导致小分子药物难以直接附着，该分子被认为无药可及而臭名昭著。因此，从MYCN的上下游入手寻找新的NB干预靶点，是一个重要的探索方向。
乙醛脱氢酶18A1(aldehyde dehydrogenase 18A1，ALDH18A1)基因编码吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS)，参与了谷氨酸和脯氨酸代谢，是催化脯氨酸、鸟氨酸和精氨酸合成的关键酶，在脯氨酸、鸟氨酸以及谷氨酸的互变转换以及非必需氨基酸代谢中发挥重要作用。其中，谷氨酸-谷氨酰胺代谢是肿瘤细胞除Warburg效应外又一重要的能量代谢方式，是肿瘤细胞合成代谢不可或缺的物质基础。但是ALDH18A1与NB患者MYCN基因扩增之间的关系未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物作为MYCN扩增神经母细胞瘤患者治疗靶点的应用；本发明的目的之二在于提供乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物作为诊断和预示MYCN扩增神经母细胞瘤标志物的应用；本发明的目的之三在于提供抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备治疗MYCN扩增神经母细胞瘤患者的药物中的应用；本发明的目的之四在于提供检测乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物的试剂在制备诊断和判断MYCN扩增神经母细胞瘤预后的试剂盒中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物作为MYCN扩增神经母细胞瘤患者治疗靶点的应用。
其中编码产物为RNA或蛋白质。
2.乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物作为诊断和预示MYCN扩增神经母细胞瘤标志物的应用。
其中编码产物为RNA或蛋白质。
3.抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备治疗MYCN扩增神经母细胞瘤患者的药物中的应用。
优选的，抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤增殖速率的药物中的应用。
优选的，抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤成球能力的药物中的应用。
优选的，抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤自我更新能力的药物中的应用。
优选的，抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤肿瘤生长速度的药物中的应用。
优选的，抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备延长MYCN扩增神经母细胞瘤生存时间的药物中的应用。
更优选的，所述抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂为shRNA或siRNA，优选的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
本发明中，编码产物为RNA或蛋白质。
4.检测乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物的试剂在制备诊断和判断MYCN扩增神经母细胞瘤预后的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物在MYCN扩增神经母细胞瘤中的应用，为MYCN扩增神经母细胞瘤提供了新的治疗靶点，对MYCN扩增神经母细胞瘤提供了新的治疗思路；同时为MYCN扩增神经母细胞瘤的诊断提供了新的标志物，可用于MYCN扩增神经母细胞瘤的早期诊断和预后监测，对MYCN扩增神经母细胞瘤的治疗和诊断具有重要的临床意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为GSE16476(图1，A)、GSE13136(图1，B)、GSE12460(图1，C)和E-MEXP-669(图1，D)数据集，MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。
图2为GSE45547数据集，MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。
图3为E-MTAB-161(图3，A)、E-MTAB-179(图3，B)和E-MTAB-1781(图3，C)数据集，(图3，D)MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。
图4为ALDH18A1的表达与MYCN扩增的相关性(A：MYCN靶基因集(NMYC_01,HALLMARK_MYC_TARGETS_V1,HALLMARK_MYC_TARGETS_V2)、与MYCN扩增正性相关的基因集(KIM_MYCN_AMPLIFICATION_TARGETS_UP)以及与MYCN处于共扩增状态的基因集(LASTOWSKA_COAMPLIFIED_WITH_MYCN)，显著富集；B：MYCN扩增型NB细胞系IMR32和SK-N-BE(2)以及无MYCN扩增型NB细胞系SK-N-SH进行Western Blot检测；C：ALDH18A1蛋白水平；D：MYCN基因水平)。
图5为ALDH18A1的表达与NB患者临床病理参数及预后的相关性(A：发现ALDH18A1表达水平在NB中明显增高；B-E：GSE16476数据库分析ALDH18A1mRNA在发病年龄较大(大于12月)、INSS肿瘤分级较高和发生肿瘤转移的患者中表达较高；F和G：ALDH18A1蛋白水平与INSS肿瘤分级和MYCN拷贝数等危险因素密切相关；H：ALDH18A1高表达与患者低总生存时间(OS)和无事件生存时间(EFS)显著相关；I：ALDH18A1低表达的患者总体预后较好；J：GSEA分析发现ALDH18A1低表达与预后不良患者中处于下调状态的基因集(ASGHARZADEH_NEUROBLASTOMA_POOR_SURVIVAL_DN)显著相关)。
图6为E-MTAB-161、E-MTAB-179和E-MTAB-1781数据集，ALDH18A1的表达同NB患者临床病理参数的关系。
图7为E-MTAB-161、E-MTAB-179和E-MTAB-1781数据集，ALDH18A1的表达同NB患者预后的关系，生存曲线。
图8为干预ALD18A1后对NB细胞增殖、成球能力、对称分裂、自我更新基因表达以及成瘤能力的影响(A：NB细胞增殖；B：NB细胞的成球能力；C：细胞对称分裂；D：自我更新基因表达；E：成瘤能力；F：肿瘤生长)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、ALDH18A1与NB患者MYCN基因扩增关系
为研究ALDH18A1与NB患者MYCN基因扩增之间的关系，分别在GSE16476、GSE13136、GSE12460、E-MEXP-669和GSE45547(分别含有88、30、47、18和649例NB患者)，以及E-MTAB-161、E-MTAB-179和E-MTAB-1781大样本数据库中ALDH18A1mRNA表达水平和MYCN基因扩增情况，结果如图1，A～D、图2和图3，A～C所示。结果显示，ALDH18A1mRNA表达水平与MYCN基因扩增和MYCN过表达之间，均存在正性相关关系。同时，利用癌细胞系百科全书中的17中NB细胞系进行分析，也获得了相同的结果(图3，D)。进一步，对GSE16476数据库进行基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)提示，高表达ALDH18A1的NB患者中，MYCN靶基因集(NMYC_01,HALLMARK_MYC_TARGETS_V1,HALLMARK_MYC_TARGETS_V2)、与MYCN扩增正性相关的基因集(KIM_MYCN_AMPLIFICATION_TARGETS_UP)以及与MYCN处于共扩增状态的基因集(LASTOWSKA_COAMPLIFIED_WITH_MYCN)，显著富集(图4，A)。此外，对MYCN扩增型NB细胞系IMR32和SK-N-BE(2)以及无MYCN扩增型NB细胞系SK-N-SH进行Western Blot检测，发现ALDH18A1蛋白水平在MYCN扩增型NB细胞系中存在显著的高表达(图4，B)。更为重要的是，通过荧光原位杂交明确49例NB患者MYCN扩增状态后，进行免疫组化(IHC)染色，结果提示ALDH18A1蛋白水平与MYCN基因扩增显著相关(图4，C和D)。
综上所述，ALDH18A1高表达与NB患者的MYCN基因扩增密切相关，提示ALDH18A1可能在MYCN扩增型NB的发生和进展中扮演着重要角色。
实施例2、ALDH18A1的表达同NB患者临床病理参数的关系
为进一步研究ALDH18A1与NB临床病理学参数的关系。利用上述49例NB患者和5例正常组织进行比较，发现ALDH18A1表达水平在NB中明显增高(图5，A)。GSE16476数据库分析提示，ALDH18A1mRNA在发病年龄较大(大于12月)、INSS肿瘤分级较高和发生肿瘤转移的患者中表达较高(图5，B-E)，对E-MTAB-161、E-MTAB-179和E-MTAB-1781数据库进行分析也获得了类似的结果(图6和表1)。同时，对上述49例NB临床样本分析显示，ALDH18A1蛋白水平也与INSS肿瘤分级和MYCN拷贝数等危险因素密切相关(图4，C和D、图5，F和G)。
表1、ALDH18A1的表达同NB患者临床病理参数之间的关系
Figure BDA0001677165210000051
生存分析显示，ALDH18A1高表达与患者低总生存时间(OS)和无事件生存时间(EFS)显著相关(图5，H)，而ALDH18A1低表达的患者总体预后较好(图5，I和图7)。此外，GSEA分析也发现ALDH18A1低表达与预后不良患者中处于下调状态的基因集(ASGHARZADEH_NEUROBLASTOMA_POOR_SURVIVAL_DN)显著相关(图5，J)，进一步提示ALDH18A1对NB患者的疾病进展和预后结局具有预测价值。
Cox生存回归分析结果显示，在GSE16476数据库中，ALDH18A1高表达可作为NB患者EFS和OS的独立危险因素(表2和表3)；在E-MTAB-1781大样本数据库中，ALDH18A1也可作为NB患者EFS的独立预后因子(表4)。值得一提的是，Cox回归分析发现，ALDH18A1在MYCN扩增型NB患者中(E-MTAB-1781数据库)，是EFS和OS独立的预后预测因子(表5和表6)。
表2、GSE16476数据集NB患者各预后预测参数的单变量和多变量分析(总生存时间)
Figure BDA0001677165210000061
表3、GSE16476数据集NB患者各预后预测参数的单变量和多变量分析(无事件生存时间)
Figure BDA0001677165210000062
表4、E-MTAB-1781数据集NB患者各预后预测参数的单变量和多变量分析(无事件生存时间)
Figure BDA0001677165210000063
Figure BDA0001677165210000071
表5、E-MTAB-1781数据集MYCN扩增NB患者各预后预测参数的单变量和多变量分析(总生存时间)
Figure BDA0001677165210000072
表6、E-MTAB-1781数据集MYCN扩增NB患者各预后预测参数的单变量和多变量分析(无事件生存时间)
Figure BDA0001677165210000073
Figure BDA0001677165210000081
以上结果提示，ALDH18A1可能作为一种潜在的癌基因，并且是NB患者的预后不良因素和独立危险因子。因此，进一步研究ALDH18A1是否会对NB生物学行为造成影响。
实施例3、ALDH18A1促进NB细胞的增殖、自我更新和肿瘤起始能力
下调ALDH18A1表达的方法：将表7中的shRNA序列，连接于pLVshRNA-EGFP载体BamHI与EcoRI酶切位点，并与psPAX2和PMD2.G包装质粒一同转入293T细胞，48小时之后收集慢病毒上清并浓缩、纯化。将此慢病毒感染神经母细胞瘤细胞系IMR32、SK-N-BE(2)，扩增后流式细胞术筛选GFP阳性细胞，并进一步挑选单克隆，下调ALDH18A1表达。
表7、ALDH18A1的ShRNA序列
Figure BDA0001677165210000082
上调ALDH18A1表达方法：将ALDH18A1ORF序列(GenBank：NG_012258.1；SEQ IDNO.7)，连接于pLV-EGFP-C载体EcoRI与BamHI酶切位点，并与psPAX2和PMD2.G包装质粒一同转入293T细胞，48小时之后收集慢病毒上清并浓缩、纯化。将此慢病毒感染神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、SH-SY5Y，扩增后流式筛选GFP阳性细胞，并进一步挑选单克隆，上调ALDH18A1表达。
然后进行Methyl-thiazolyldiphenyl-sulfophenyltetrazoliumbromide(MTS)检测。结果发现下调ALDH18A1表达后，MYCN扩增型NB细胞增殖速率显著下降；而过表达ALDH18A1可明显促进无MYCN扩增型NB细胞增殖，证明ALDH18A1对于MYCN扩增型NB细胞增殖具有不可或缺的作用(图8，A)。同时，敲低ALDH18A1后MYCN扩增型NB细胞的成球能力明显下降；外源性表达ALDH18A1可显著增加无MYCN扩增型NB细胞的成球能力(图8，B)。此外，由于细胞对称分裂(SCD)和不对称分裂(ACD)可作为NB细胞自我更新、分化和肿瘤生成的重要调控因素，进一步研究ALDH18A1表达是否影响NB细胞分裂和自我更新能力。通过免疫荧光标记对细胞对称分裂具有重要意义的Numb和神经干细胞的特征性标志物Nestin(图8，C)，发现过表达ALDH18A1后，MYCN非扩增型NB细胞SCD比例明显增加；敲低ALDH18A1表达后，MYCN扩增型NB细胞SCD比例明显减少(图8，D)。综上，ALDH18A1敲低和过表达可诱发MYCN扩增型/无MYCN扩增型NB出现相反的细胞表型，提示ALDH18A1可调控NB细胞的增殖和自我更新能力。
为了明确ALDH18A1对NB细胞自我更新的影响是否涉及自我更新相关基因的差异性表达，比较了Erinn L.Soucie et al报道的自我更新基因集在ALDH18A1敲低SK-N-BE(2)和野生型SK-N-BE(2)细胞系中的表达情况，发现包括AKT1、BMI1、Cirh1a、LIN28B、SOX2、SSEA1和MYCN等7种自我更新基因在敲低ALDH18A1后，其表达水平显著下调(图8，E)，其中MYCN下调最为显著。而大量研究数据证实，MYCN正是对NB肿瘤生成具有重要驱动和调控作用的癌基因。
最后，由于前文发现ALDH18A1与NB患者预后不良显著相关，进一步探索ALDH18A1对NB细胞体内成瘤能力的影响，结果显示敲低ALDH18A1后，SK-N-BE(2)细胞无法在免疫缺陷动物体内形成肿瘤，而对照组均可见较为明显的肿瘤生长(图8，F)，再一次证实ALDH18A1可作为一种癌基因，对NB肿瘤形成和生长具有决定性调控的作用。
以上表明，ALDH18A1具有致癌作用，可促进NB的细胞增殖、自我更新和成瘤能力，尤其是MYCN扩增的NB患者。该基因及其编码产物，可以作为治疗MYCN扩增NB患者的重要治疗候选靶点。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 余时沧
<120> 乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物在MYCN扩增神经母细胞瘤中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggccatta tttgaccaga tcattctcga gaatgatctg gtcaaataat ggtttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa ccattatttg accagatcat tctcgagaat gatctggtca aataatgg 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggcctcag tcgtacacat ggaaactcga gtttccatgt gtacgactga ggtttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa cctcagtcgt acacatggaa actcgagttt ccatgtgtac gactgagg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggcggaac ctcaatggaa cacttctcga gaagtgttcc attgaggttc cgtttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaaaaa cggaacctca atggaacact tctcgagaag tgttccattg aggttccg 58

Claims (8)

1.抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备治疗MYCN扩增神经母细胞瘤患者的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤增殖速率的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤成球能力的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤自我更新能力的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂在制备降低MYCN扩增神经母细胞瘤肿瘤生长速度或延长MYCN扩增神经母细胞瘤患者生存时间的药物中的应用。
6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于：所述抑制乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物表达量的试剂为shRNA或siRNA。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述shRNA的序列，其中shRNA1F如SEQ IDNO.1、shRNA1R如SEQ ID NO.2、shRNA2F如SEQ ID NO.3、ShRNA2R如SEQ ID NO.4、shRNA3F如SEQ ID NO.5、ShRNA3R如SEQ ID NO.6所示。
8.检测乙醛脱氢酶18A1基因及其编码产物的试剂在制备诊断和判断MYCN扩增神经母细胞瘤患者预后的试剂盒中的应用。
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