JP7554253B2 - 輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）の治療で使用するためのフェロポーチン阻害剤 - Google Patents

輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）の治療で使用するためのフェロポーチン阻害剤 Download PDF

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Description

本発明は、輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）並びにそれに関連する症状及び病的状態を治療するための、フェロポーチン阻害剤として作用する一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
鉄は、ほとんど全ての生物にとって不可欠な微量元素であり、特に成長及び血液の形成に関連する。この場合、鉄代謝のバランスは、老化赤血球のヘモグロビンから、肝臓における鉄貯蔵からの鉄回収レベル及び食事性鉄の十二指腸吸収レベルで主に調節される。放出された鉄は、特に、特定の輸送系（ＤＭＴ－１、フェロポーチン）を介して腸を介して取り込まれ、血液循環に移され、それによって適切な組織及び器官（トランスフェリン、トランスフェリン受容体）に運ばれる。人体において、鉄元素は、とりわけ、酸素輸送、酸素取り込み、細胞機能（例えば、ミトコンドリア電子伝達、認知機能等）、及び最終的にエネルギー代謝全体にとって非常に重要である。哺乳類生物は能動的に鉄を排出することができない。鉄代謝は、マクロファージ、肝細胞及び腸細胞からの鉄の細胞放出を介して、ヘプシジンによって実質的に制御される。ヘプシジンは、腸及び胎盤を介した鉄の吸収並びに細網内皮系からの鉄の放出に作用する。ヘプシジンの形成は、生物の鉄レベルと直接相関して調節される、すなわち、生物に十分な鉄及び酸素が供給されると、より多くのヘプシジンが形成され、鉄及び酸素レベルが低い場合又は赤血球生成が増加した場合、形成されるヘプシジンが少なくなる。小腸粘膜細胞及びマクロファージにおいて、ヘプシジンは、慣用的に細胞の内部から血液中に鉄を輸送する輸送タンパク質フェロポーチンと結合する。輸送タンパク質フェロポーチンは、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、腸及び胎盤で発現される５７１個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質である。特に、フェロポーチンは、腸上皮細胞の側底膜に局在する。従って、このように局在したフェロポーチンは、食事に含まれる鉄を血液中に送出するように作用する。ヘプシジンがフェロポーチンに結合すると、フェロポーチンは細胞の内部に輸送され、そこで細胞からの鉄の放出がほぼ完全に遮断されるように、その破壊が起こる。フェロポーチンがヘプシジンによって失活又は阻害されることで、粘膜細胞に貯蔵されている鉄を送出することができないようになった場合、腸での鉄の吸収が遮断される。ヘプシジンの減少は、活性フェロポーチンの増加をもたらし、したがって、貯蔵された鉄の放出が強化され、食事に含まれる鉄の吸収が強化されることから、血清鉄レベルが上昇する。病的な場合では、鉄レベルの上昇は鉄過剰をもたらす。
たとえば、肝臓及び心臓などの臓器での過剰な鉄の取り込みは、鉄の蓄積につながる。さらに、脳における鉄蓄積が、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患を患う患者で観察されている。循環する鉄の大部分は、遊離鉄の存在を妨げる古典的な鉄輸送分子であるトランスフェリンに関連している。トランスフェリン（又はヘム、アポフェリチン、ヘモジデリンなどの他の従来の鉄結合分子）に結合していない鉄画分は、まとめて非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）と呼ばれる。鉄過剰の状態及び疾患のさらなる側面では、多くの問題及び病的状態が、血漿及び血清中の過剰レベルの遊離鉄、すなわち、ＮＴＢＩから生じる。
遊離鉄のそのような過剰の特定の有害な側面は、ラジカルの望ましくない形成である。特に、鉄（ＩＩ）イオンは、反応性酸素種（ＲＯＳ）の形成を触媒する（特にフェントン反応を介して）。これらのＲＯＳは、ＤＮＡ、脂質、タンパク質、炭水化物に損傷を与え、細胞、組織及び臓器において広範囲にわたる影響を及ぼす。ＲＯＳの形成はよく知られており、いわゆる酸化ストレスを引き起こすことが文献に記載されている。ＮＴＢＩは、細胞損傷を起こす毒性の可能性を有するそのようなＲＯＳを誘発する高い傾向を示すと広く報告されており、心臓、膵臓、腎臓及び造血に関与する臓器などの主要な臓器が鉄毒性の影響を受ける。したがって、鉄過剰は、心臓、肝臓、内分泌の損傷などの組織や臓器の損傷を引き起こすことが知られている（Ｐａｔｅｌ Ｍ． ｅｔ ａｌ． ″Ｎｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｂｏｕｎｄ Ｉｒｏｎ： Ｎａｔｕｒｅ， Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ″ Ｉｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０１２； ２７（４）： ３２２－３３２；及びＢｒｉｓｓｏｔ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｖｉｅｗ ″Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ： Ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ″ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２０１２； １８２０， ４０３－４１０）。
鉄過負荷症β－サラセミアは、ヘモグロビン（Ｈｂ）のβ－グロビン遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性貧血であり、短寿命の異常赤血球（ＲＢＣ）を生じる（Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１９； １３３（１）， ５１－８及びＴａｈｅｒ Ａ． Ｔ． ″Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ Ｄ． Ｊ． ａｎｄ Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ Ｍ． Ｄ． ″Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ″ Ｌａｎｃｅｔ， ２０１８； ３９１（１０１１６）， １５５－６７）。健常対象者では、Ｈｂは、鉄含有ヘム基とともに、組織に酸素を効率的に送達するために赤血球内にα２β２機能性ヘテロ四量体を形成するα－グロビン鎖及びβ－グロビン鎖から構成されている。β－サラセミアにおける主要な病態生理学的機序は、β－グロビン鎖合成の減少に起因するものであり、ＲＢＣの膜上に不対α－グロビン凝集体の蓄積を引き起こす。沈殿したα－グロビン凝集体はヘム及び鉄を含み、それがＲＯＳを生成して、短寿命のＲＢＣ、貧血、及び組織低酸素症を生じさせる（Ｍｅｔｔａｎａｎｄａ Ｓ．， Ｇｉｂｂｏｎｓ Ｒ． Ｊ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｓ Ｄ．Ｒ． ″ａｌｐｈａ－Ｇｌｏｂｉｎ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１５； １２５（２４）， ３６９４－７０１及びＲｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｓ： ｐａｒａｄｉｇｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２０１５； １００（４）， ４１８－３０）。β－サラセミア患者におけるＲＢＣの寿命短縮に対する代償応答として、赤血球形成が大幅に刺激されて、骨髄（ＢＭ）及び脾臓や肝臓などの骨髄以外の部位における赤血球前駆体の増殖増加及び分化低下（無効造血）を生じさせる（Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．， ２０１２； ２６ Ｓｕｐｐｌ １， Ｓ１２－５）。β－サラセミアにおける無効造血は、鉄の過剰吸収を引き起こして、Ｈｂ合成に対する鉄需要の増加を支援し、血漿中の鉄濃度の上昇、そして最終的には臓器の鉄過剰を引き起こす。肝臓、脾臓、心臓及び膵臓は一般的に鉄過剰の影響を受ける組織であり、治療的介入がなければ、鉄過剰症は肝硬変、心不全及び糖尿病などの臓器損傷を引き起こし得る。
β－サラセミアにおける無効造血は、低酸素に対するフィードバック補償応答のために、鉄の過剰吸収を引き起こし、それがヘプシジンを抑制する（Ｋａｔｔａｍｉｓ Ａ．， Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｉ．， Ｐａｌａｉｏｌｏｇｏｕ Ｄ．， Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｕ Ｆ．， Ｇａｌａｎｉ Ａ．， Ｌａｄｉｓ Ｖ．， Ｓａｋｅｌｌａｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ．， ａｎｄ Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｇ． ″Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｂｕｒｄｅｎ ｏｎ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２００６； ９１（６）， ８０９－１２）。ヘプシジンの抑制に起因する異常に高い鉄レベルは赤血球生成をさらに刺激することから、貧血及び鉄過剰症が悪循環で悪化する。ＨＩＦ２αはエリスロポエチン（ＥＰＯ）の合成と、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）、十二指腸シトクロムＢ（ＤＣｙｔＢ）及びフェロポーチンの産生の両方を刺激することから、ＨＩＦ２αは赤血球生成と鉄吸収を結びつける上で主要な役割を果たす（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ． Ａ．， Ｎｉｚｚｉ Ｃ． Ｐ．， Ｃｈａｎｇ Ｙ． Ｉ．， Ｄｅｃｋ Ｋ． Ｍ．， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｐ． Ｊ．， Ｇａｌｙ Ｂ．， Ｄａｍｎｅｒｎｓａｗａｄ Ａ．， Ｂｒｏｍａｎ Ａ． Ｔ．， Ｋｅｎｄｚｉｏｒｓｋｉ Ｃ．， Ｈｅｎｔｚｅ Ｍ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ． ″Ｔｈｅ ＩＲＰ１－ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ ａｘｉｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｒｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．″ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ， ２０１３； １７（２）， ２８２－９０及びＳｃｈｗａｒｔｚ Ａ． Ｊ．， Ｄａｓ Ｎ． Ｋ．， Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ． Ｋ．， Ｊａｉｎ Ｃ．， Ｊｕｒｋｏｖｉｃ Ｍ． Ｔ．， Ｗｕ Ｊ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， Ｌａｋｈａｌ－Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ Ｓ．， Ｃｏｌａｃｉｎｏ Ｊ． Ａ．， ａｎｄ Ｓｈａｈ Ｙ． Ｍ． ″Ｈｅｐａｔｉｃ ｈｅｐｃｉｄｉｎ／ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ ａｘｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｉｒｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｒｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｏｖｅｒｌｏａｄ．″ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２０１９； １２９（１）， ３３６－４８）。ＥＰＯは、赤芽球の増殖を刺激し、赤血球因子エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）の産生を誘発し、それが次に、ヘプシジンを抑制する（Ｋａｕｔｚ Ｌ．， Ｊｕｎｇ Ｇ．， Ｖａｌｏｒｅ Ｅ． Ｖ．， Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， ａｎｄ Ｇａｎｚ Ｔ． ″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｆｅｒｒｏｎｅ ａｓ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．″ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２０１４）。したがって、ヘプシジン合成の誘発又はヘプシジン模倣物の補充による不均衡な鉄吸収の補正が、β－サラセミアにおける調節不全の鉄代謝を正常化するための魅力的な治療アプローチとして評価される。
Ｔｍｐｒｓｓ６発現の阻害によって内因性ヘプシジン合成を増加させる、非天然アミノ酸（ミニヘプシジン類）又はオリゴヌクレオチドを含む短縮ヘプシジン由来ペプチドなどの実験医薬が、非輸血依存性β－サラセミア媒介物のＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスモデルでの鉄過剰を低下させることを示している（Ｃａｓｕ Ｃ．， Ｏｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ Ｐ． Ｒ．， Ｃｈｅｎ Ｈ．， Ｎａｎｄｉ Ｖ．， Ｇｉｎｚｂｕｒｇ Ｙ．， Ｐｒａｓａｄ Ｐ．， Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｒ． Ｅ．， Ｓｈａｈ Ｙ． Ｍ．， Ｖａｌｏｒｅ Ｅ． Ｖ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， ｅｔ ａｌ． ″Ｍｉｎｉｈｅｐｃｉｄｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ．″ Ｂｌｏｏｄ ２０１６； １２８（２）， ２６５－７６及びＳｃｈｍｉｄｔ Ｐ． Ｊ．， Ｔｏｕｄｊａｒｓｋａ Ｉ．， Ｓｅｎｄａｍａｒａｉ Ａ． Ｋ．， Ｒａｃｉｅ Ｔ．， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｓ．， Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ Ｂ． Ｒ．， Ｈｅｔｔｉｎｇｅｒ Ｊ．， Ｂｕｍｃｒｏｔ Ｄ．， ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｍ． Ｄ． ″Ａｎ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｍｐｒｓｓ６ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ Ｈｆｅ（－／－） ｍｉｃｅ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１３； １２１（７）， １２００－８及びＧｕｏ Ｓ．， Ｃａｓｕ Ｃ．， Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ Ｓ．， Ｂｏｏｔｅｎ Ｓ．， Ａｇｈａｊａｎ Ｍ．， Ｐｅｒａｌｔａ Ｒ．， Ｗａｔｔ Ａ．， Ｆｒｅｉｅｒ Ｓ．， Ｍｏｎｉａ Ｂ． Ｐ．， ａｎｄ Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＴＭＰＲＳＳ６ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．″ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２０１３； １２３（４）， １５３１－４１）。非輸血依存性β－サラセミアのモデルであるｔｈ３／＋マウスへのヘプシジン模倣ペプチドの投与は、無効造血の軽減、赤血球生存時間の延長、及び貧血の改善をもたらした。このモデルでは、食事に含まれる鉄の吸収の減少による鉄過剰の予防が、ヘプシジン模倣薬療法の追加の利点であることがわかった。
さらに、合成ヒトヘプシジン（ＬＪＰＣ－４０１）、並びにヘプシジンペプチド模倣薬（ＰＴＧ－３００）、及びＴｍｐｒｓｓ６を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＯＮＩＳ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＬＲＸ）が臨床試験で試験されている。
サラセミアの治療に関しては、サラセミアの各種の形態及び表現型を区別する必要がある。サラセミアには主に２種類：α－サラセミア（アルファ－サラセミア）とβ－サラセミア（ベータ－サラセミア）があり、それらはヘモグロビン分子の異なる部分に影響を及ぼす。α－サラセミアは、アルファグロビンをコードするＨＢＡ１及び／又はＨＢＡ２遺伝子の変異（染色体１６の遺伝子欠失）によって引き起こされ、β－サラセミアは、ベータグロビンをコードするＨＢＢ遺伝子の変異によって引き起こされる。各人が、これらの遺伝子のそれぞれの二つのコピーを有しており、一つは母親から、もう一つは父親から受け継がれている。ＨＢＡ１及び／又はＨＢＡ２遺伝子の一部又はすべてが失われる（欠失）と、アルファグロビンの不足が生じてα－サラセミアに至り、ＨＢＢ遺伝子における変異はベータグロビンのレベルが低下して、それがβ－サラセミアを引き起こす。
β－サラセミアでは、臨床表現型は、ベータグロビン産生が損なわれる程度に基づいて三つの群に分類される。
・軽症型β－サラセミア（又は形質）
・中間型β－サラセミア
・重症型β－サラセミア。
軽症型β－サラセミア（形質）は、ヘテロ接合体（β／β＋又はβ／β０）で発生し、通常は軽度から中等度の小球性貧血を伴い無症候性である。この表現型は、β＋／β＋の軽度の症例でも発生し得る。軽症型β－サラセミア（形質）を患う患者は、一般的に治療を必要としない。軽症型β－サラセミアを患う患者は、軽度の貧血を発症し得るか、その状態の徴候や症状を全く持たない可能性がある。
中間型β－サラセミアは、二つのβ－サラセミア対立遺伝子（β＋／β０又はβ＋／β＋の重度例）の遺伝的形質によって生じる重症型サラセミアと軽症型サラセミアの間の中間である可変臨床像である。軽度ないし中等度の中間型β－サラセミアを患う患者は、軽度から中等度の中間型β－サラセミアを患う患者は、その疾患及びそれの合併症を管理するために、時折又は断続的な希な輸血を必要とする場合がある。
重症型β－サラセミア（又はクーリー貧血）は、ホモ接合体（β０／β０、β＋／β＋）又は重度の複合ヘテロ接合体（β０／β＋）で起こり、重度のベータグロビン欠乏から生じる。重症型β－サラセミアは、最も重度型のβ－サラセミアである。
これらの患者は、重度の貧血と骨髄の活動亢進を発症する。重症型β－サラセミアは、１～２歳までに現れ、重度の貧血及び輸血性及び吸収性の鉄過剰症の症状を有する。患者は黄疸になり、下腿潰瘍及び胆石症が発生する。脾腫が一般的であり、多くの場合大きい。脾臓の隔離が進行し、輸血された正常赤血球の破壊が加速し得る。骨髄の活動亢進は、頭蓋骨の肥厚と頬骨の隆起を引き起こす。長骨の関与が病的骨折の素因となり、成長を損ない、思春期を遅らせたり抑制する可能性がある。鉄過剰症があると、心筋における鉄沈着が心不全を引き起こし得る。肝硬変が代表的であり、機能障害及び肝硬変を生じる。重症型β－サラセミアを患う患者は、生存するために定期的な（生涯の）ＲＢＣ輸血（輸血）を必ず必要とする。
また、ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）と各種形態のサラセミアとの相互作用は、非常に多様な臨床的障害を引き起こすが、それのβ－サラセミアとの共遺伝は、ヘモグロビンＥβ－サラセミアと呼ばれる状態であり、それはアジアにおいて最も一般的な重度型のβ－サラセミアであり、世界的には、臨床的に重度のβ－サラセミア障害の約５０％を占めている（Ｓｕｔｈａｔ Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ． Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ″Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｅ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｓ″， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．， ２０１２； ２（８））。ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）は、多くのアジア諸国で高頻度に発生する非常に一般的な構造的ヘモグロビン変異体である。これは、わずかに低速度で産生されるために軽度型のβ－サラセミアの表現型を有するβ－ヘモグロビン変異体である。ＨｂＥ単独では重大な臨床的問題は引き起こさないが、各種形態のα－及びβ－サラセミアとのそれの相互作用により、非常に広範囲の多様な重度の臨床症候群が生じる。
ヘモグロビンレベル、疾患の発症年齢、最初の輸血を受けた年齢、輸血の必要性、脾臓の大きさ、成長及び発達という六つの独立したパラメータに基づく評点システムが開発されて、臨床症状に従って０、０．５、１、又は２として評点される六つの臨床基準からなる評点システムで、患者を軽度、中等度及び重度の三つの異なる重度カテゴリーに分類した。合計評点が０～３．５、４～７、及び７．５～１０の範囲のＨｂＥ β－サラセミア患者を、それぞれ軽度、中等度、及び重度の症例として群分けする。重度患者は非常に貧血性であり、輸血に依存している。一部の患者は著しい成長遅延を示し得るが、軽度の症例は軽度貧血を有し、通常は正常な成長及び発達を有する（Ｓｒｉｐｉｃｈａｉ Ｏ． ｅｔ ａｌ． ″Ａ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ／Ｈｂ Ｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ″， Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ， ２００８； ８３： ４８２－４８４）。
２０１２年に、
・非輸血依存性β－サラセミア（ＮＴＤＴ）と
・輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）
との間を識別する、サラセミアの臨床分類のための新しい用語が、サラセミア国際連盟によってそれのガイドラインで採用された。
サラセミアのこの臨床分類は、例えばＶｉｐｒａｋａｓｉｔ Ｖ． ｅｔ ａｌ． ″Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ″ Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎ． Ａｍ．， ２０１８； ３２： １９３－２１１に記載されている。その文献で、図１が、ＮＴＤＴ／ＴＤＴが連続体であること、そしてＮＴＤＴとＴＤＴの両方が、β－対立遺伝子の重症度に応じて、ＨｂＥ／β－サラセミアに起因し得ることを示している。
ＮＴＤＴには、重症型β－サラセミアや重度型のヘモグロビンＥ β－サラセミア患者とは異なり、生存のために定期的な輸血療法を必要としない各種表現型を含む。最も一般的に研究されている形態は、中間型β－サラセミア、ヘモグロビンＥ α－及びβ－サラセミア（軽度型及び中間型）、及び中間型α－サラセミア（ヘモグロビンＨ病）である。しかしながら、そのような患者における輸血非依存性には副作用がないわけではない。疾患プロセスの顕著な特徴である無効造血、末梢溶血、及び不十分なヘプシジン産生は、鉄過剰症や凝固亢進を含む各種のその後の病態につながる可能性があり、それは最終的には、成長の遅延、思春期遅発症、骨の問題及び／又は脾腫などの多くの深刻な臨床的病的状態につながる。
対照的に、ＴＤＴには、重症型β－サラセミア及び重度型のヘモグロビンＥ β－サラセミア患者などがあり、その患者は生存のために定期的な赤血球（ＲＢＣ）輸血を必要とする。ＴＤＴは最も重度型のβ－サラセミアであり、定期的な輸血の必要性を特徴とし、これは必然的に二次鉄過剰症を引き起こし、これは定期的に鉄キレート療法で治療される。重度型のβ－サラセミアを患う患者は、重度の貧血、食欲不振、蒼白、暗色尿、皮膚の黄色変（黄疸）、及び肝臓若しくは心臓の肥大も経験し得る。定期的な輸血と鉄キレート療法は、疾患の基礎的な病理機序に対処するものではなく、感染と副作用のリスクの増加に関連している。さらに、定期的な輸血は、患者にとってかなりの負担となり、患者の生活の質を大幅に低下させる。
診断及び臨床分類は、認められた臨床的及び血液学的パラメータを適用する臨床評価によって行われる。
鉄過剰症は、重症型サラセミア及び中間型サラセミアの両方で共通であるが、それぞれにおいて異なる病因を有する（Ｍｕｓａｌｌａｍ ＫＭ， ｅｔ ａｌ． ″Ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ． ２０１３； １３０（２）： ６４－７３及びＭｕｓａｌｌａｍ ＫＭ， ｅｔ ａｌ． ″Ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．″ ２０１３； ２０（３）： １８７－１９２．）。
重症型サラセミア患者は定期的にＲＢＣ輸血を受け、鉄キレート療法を行わずに、これらの輸血からの鉄含有量は、患者の体内の循環鉄及び貯蔵鉄のレベルを大幅に上昇させ得る。
中間型サラセミア患者では、輸血の頻度が低いため、輸血は鉄過剰の主因ではない。しかしながら、中間型サラセミア患者は、主として慢性貧血、無効造血、及び組織低酸素症に起因するヘプシジンの血清レベルの低下によって引き起こされる鉄の腸管吸収の増加のために鉄過剰症を経験する。
鉄過剰症の病理的影響は、重症型サラセミア患者及び中間型サラセミア患者の両方で広範であり、全身的であり、いくつかの異なる及びいくつかの重複する臨床的続発症を伴う（Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ＭＤ， ｅｔ ａｌ． ″Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ （ＴＤＴ）″ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， ２０１４及びＴａｈｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． ″Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｎ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ （ＮＴＤＴ）″， ２０１３）。
重症型サラセミア及び中間型サラセミアの両方の患者集団は、鉄過剰症による内分泌系の混乱を経験する可能性があり、糖尿病、甲状腺機能低下症及び性腺機能低下症を発症する可能性がある。しかし、重症型サラセミア患者は一般に、中間型サラセミアの患者よりも人生の早い段階で鉄過剰症を経験し、従って、成長遅延及び思春期遅発症を経験する可能性がある。さらに、重症型サラセミア患者は、鉄誘発性心筋症による心不全のリスクが高くなり、この状態は中間型サラセミア患者ではそれほど頻繁には発生しない（Ｍｕｓａｌｌａｍ ＫＭ， ２０１３）。中間型サラセミア患者では、肝臓鉄濃度上昇と肝線維症及び肝不全の発症との間に関連が観察され、肝細胞癌につながる可能性がある（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ Ｅ． ″Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．″ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｏｐｉｎｉｏｎ． ２０１６； ３２（１）： １９１－２０４）。
サラセミアを患う患者の長期予後は、状態の種類と重度によって決まる。たとえば、重度のサラセミアは心不全又は肝臓合併症による早期死亡を引き起こす可能性があるが、比較的重度の低い形態のサラセミアは寿命を縮めない場合が多い。重症型サラセミア患者は、十分に輸血され、鉄キレート療法を順守していれば、４０歳を超えて生きることができる。サラセミアの主要な死亡の大半（７１％）は、鉄過剰症に起因する心臓合併症に関連している（Ｇａｌａｎｅｌｌｏ Ｒ， Ｏｒｉｇａ Ｒ． ″Ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ２０１０； ５： １１）。
β－サラセミアの診断は、重症型サラセミアと中間型サラセミアで異なる。重症型サラセミア患者は、一般に、小球性貧血、軽度の黄疸、及び肝脾腫からなる症状を伴って、生後６～２４か月で発症する。血液学的所見には、７ｇ／ｄＬ以下のヘモグロビンレベル、５０～７０ｆＬのＭＣＶ（平均赤血球容積）、及び／又は１２～２０ｐｇのＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン）などがある（Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ＭＤ， ２０１４）。
中間型サラセミア患者は、代表的には、より重度に発現する症例で２歳～６歳の重症型サラセミア患者より遅く発症するが、相対的に軽度の患者では、成人期まで無症候性のままである可能性がある。一般に、中間型サラセミア患者は、重症型サラセミア患者と比較して類似しているがより軽度の症状を示し、中間型サラセミア患者は髄外造血を示す場合が多い。血液学的所見には、７～１０ｇ／ｄＬのヘモグロビンレベル、５０～８０ｆＬのＭＣＶ、及び／又は１６～２４ｐｇのＭＣＨなどがある（Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ＭＤ， ２０１４）。
臨床症状と血液学的所見に基づいて、ある診断が疑われると、遺伝子解析によってそれが確認される。変異特異的ＰＣＲ増幅及び完全β－グロビン遺伝子配列決定の両方が利用可能である（Ｇａｌａｎｅｌｌｏ Ｒ， ２０１０）。
鉄過剰症又は軽度及び軽度ないし中等度の表現型のβ－サラセミア、例えば軽症型β－サラセミア及び非輸血依存性中間型β－サラセミアの治療については、鉄キレート剤の群からの各種薬学的に活性な薬物が存在する。
重度の輸血依存性β－サラセミアを治療又は緩和についての販売承認を申請している高度な臨床検査でのさらなる薬剤は、ＲＢＣの成熟を遅延させるＴＧＦ－βファミリーからの特定のタンパク質を中和するように設計されたＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達阻害剤として作用する組換え遺伝子操作タンパク質であるラスパテルセプトである。ラスパテルセプトは非経口投与される。ラスパテルセプト及び輸血依存性サラセミアの治療におけるそれの使用は、例えばＷＯ２０１６１８３２８０に記載されている。
Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社の合成ヒトヘプシジンＬＪＰＣ－４０１とＰｒｏｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のヘプシジンペプチド模倣ＰＴＧ－３００は、どちらも非経口投与用であり、β－サラセミア治験のＩＩ相に入った。
しかし、薬物の非経口投与には通常、医師の診察が必要であり、そのことは、治療費をさらに増加させ、患者のコンプライアンスに悪影響を及ぼし、患者への追加負担をかけるものである。対照的に、経口薬物投与は、患者、特に小児による投与の容易さ、投与量及び製剤の高度な柔軟性、費用効果、無菌性の制約及び感染のリスク、注射部位反応、及び抗薬物抗体の発生の低いことなど、非経口投与に勝る利点を提供するものである。現在、重症型のβ－サラセミア、特にＴＤＴにおける貧血を治療するための経口薬で承認されているものはない。
ＴＤＴなどの重症型のβ－サラセミアを患う患者の重大な生命を脅かす状況を考慮すると、重度のβ－サラセミアに冒された患者の生存率上昇及びより良好な生活の質を達成する新たな及び改善された治療選択肢が必要であることは明らかである。
Ｊ． Ｈ． Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ． ″Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ， ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ， ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ″； Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０２０ Ｍａｒ； ６０（３）：５１３－５２３レポートは、モルモットを用いるモデルでの急性赤血球輸血直後に、Ｖｉｆｏｒ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社によって提供された小分子フェロポーチン阻害剤であるＶＩＴ－２６５３を静脈投与することによって、血漿鉄、ＮＴＢＩレベル、酸化ストレス及び細胞傷害の減弱が生じることが報告されている。
ラスパテルセプトによる記載された治療に加えて、ＴＤＴはこれまで、従来法で、定期的な輸血によって引き起こされる二次鉄過剰に起因する過剰鉄の一定の除去を目的とした鉄キレート化合物との定期的な同時治療を伴う定期的な輸血（ＲＢＣ輸血）で治療される。
キレート療法で使用される確立された薬剤には、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ又はＤｅｓｆｅｒａｌ（登録商標）としても知られる）が含まれる。サラセミアを治療するために定期的な輸血を受けて鉄過剰症を発症する患者に使用するために認可された鉄キレート療法用の二つの新しい薬は、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ（登録商標）としても知られる）及びデフェリプロン（Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ（登録商標）としても知られる）である。
ＷＯ２０１３／０８６３１２Ａ１は、基礎作用機序として鉄キレート化を介して、非輸血依存性サラセミア及び輸血依存性の遺伝性及び後天的貧血を患う対象者の治療などの鉄過剰症を治療するためのデサザデスフェリチオシンポリサー（ＤＡＤＦＴ－ＰＥ）類縁体を含む経口製剤について説明している。
定期的輸血のみによるＴＤＴの治療、及びキレート療法によって発生する二次鉄過剰症の同時治療の不利な点は、身体から過剰な鉄を定期的に除去する継続的な必要性、及び患者にとっての生涯にわたる定期的な輸血及びキレート療法の負担である。さらに、鉄キレート療法のための確立された薬物は、毒性の可能性を示すことが知られており、それは、ＴＤＴ療法が生涯必要であることによって引き起こされる長期投与において特に問題となる。
しかしながら、本発明の実施例に示されるように、併用療法における従来のキレート療法と本発明のフェロポルチン阻害剤との組み合わせが、特にＴＤＴにおけるサラセミアの新規な治療におけるさらなる効果的なアプローチであることがわかった。
フェロポーチン阻害剤としての活性を有する低分子量化合物、及び経口投与による軽度及び中等度のβ－サラセミア（例えば、中間型β－サラセミア）における鉄過剰症の治療のためのそれの使用が、国際出願ＷＯ２０１７／０６８０８９及びＷＯ２０１７／０６８０９０に記載されている。さらに、国際出願ＷＯ２０１８／１９２９７３は、ＷＯ２０１７／０６８０８９及びＷＯ２０１７／０６８０９０に記載されている選択されたフェロポーチン阻害剤の特定の塩に関する。前記三つの国際出願に記載されているフェロポーチン阻害剤は、本発明の新たな医学的適応症で使用される式（Ｉ）による化合物と重複している。
しかしながら、前記文書のいずれも、重症型の輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）の治療における前記フェロポーチン阻害剤の効力を記載しておらず、ＴＤＴを効果的に治療する可能性又は従来のＴＤＴ治療法に関連する負担を改善する可能性も開示していない。
ＷＯ２０１３／０８６３１２Ａ１． ＷＯ２０１７／０６８０８９． ＷＯ２０１７／０６８０９０． ＷＯ２０１８／１９２９７３．
Ｐａｔｅｌ Ｍ． ｅｔ ａｌ． ″Ｎｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｂｏｕｎｄ Ｉｒｏｎ： Ｎａｔｕｒｅ， Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ″ Ｉｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０１２； ２７（４）： ３２２－３３２． Ｂｒｉｓｓｏｔ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｖｉｅｗ ″Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ： Ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ″ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２０１２； １８２０， ４０３－４１０． Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１９； １３３（１）， ５１－８． Ｔａｈｅｒ Ａ． Ｔ． ″Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ Ｄ． Ｊ． ａｎｄ Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ Ｍ． Ｄ． ″Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ″ Ｌａｎｃｅｔ， ２０１８； ３９１（１０１１６）， １５５－６７． Ｍｅｔｔａｎａｎｄａ Ｓ．， Ｇｉｂｂｏｎｓ Ｒ． Ｊ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｓ Ｄ．Ｒ． ″ａｌｐｈａ－Ｇｌｏｂｉｎ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１５； １２５（２４）， ３６９４－７０１． Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｓ： ｐａｒａｄｉｇｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２０１５； １００（４）， ４１８－３０． Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．， ２０１２； ２６ Ｓｕｐｐｌ １， Ｓ１２－５． Ｋａｔｔａｍｉｓ Ａ．， Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｉ．， Ｐａｌａｉｏｌｏｇｏｕ Ｄ．， Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｕ Ｆ．， Ｇａｌａｎｉ Ａ．， Ｌａｄｉｓ Ｖ．， Ｓａｋｅｌｌａｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ．， ａｎｄ Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｇ． ″Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｂｕｒｄｅｎ ｏｎ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２００６； ９１（６）， ８０９－１２． Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ． Ａ．， Ｎｉｚｚｉ Ｃ． Ｐ．， Ｃｈａｎｇ Ｙ． Ｉ．， Ｄｅｃｋ Ｋ． Ｍ．， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｐ． Ｊ．， Ｇａｌｙ Ｂ．， Ｄａｍｎｅｒｎｓａｗａｄ Ａ．， Ｂｒｏｍａｎ Ａ． Ｔ．， Ｋｅｎｄｚｉｏｒｓｋｉ Ｃ．， Ｈｅｎｔｚｅ Ｍ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ． ″Ｔｈｅ ＩＲＰ１－ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ ａｘｉｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｒｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．″ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ， ２０１３； １７（２）， ２８２－９０． Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ａ． Ｊ．， Ｄａｓ Ｎ． Ｋ．， Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ． Ｋ．， Ｊａｉｎ Ｃ．， Ｊｕｒｋｏｖｉｃ Ｍ． Ｔ．， Ｗｕ Ｊ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， Ｌａｋｈａｌ－Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ Ｓ．， Ｃｏｌａｃｉｎｏ Ｊ． Ａ．， ａｎｄ Ｓｈａｈ Ｙ． Ｍ． ″Ｈｅｐａｔｉｃ ｈｅｐｃｉｄｉｎ／ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ ａｘｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｉｒｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｒｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｏｖｅｒｌｏａｄ．″ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２０１９； １２９（１）， ３３６－４８． Ｋａｕｔｚ Ｌ．， Ｊｕｎｇ Ｇ．， Ｖａｌｏｒｅ Ｅ． Ｖ．， Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， ａｎｄ Ｇａｎｚ Ｔ． ″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｆｅｒｒｏｎｅ ａｓ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．″ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２０１４． Ｃａｓｕ Ｃ．， Ｏｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ Ｐ． Ｒ．， Ｃｈｅｎ Ｈ．， Ｎａｎｄｉ Ｖ．， Ｇｉｎｚｂｕｒｇ Ｙ．， Ｐｒａｓａｄ Ｐ．， Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｒ． Ｅ．， Ｓｈａｈ Ｙ． Ｍ．， Ｖａｌｏｒｅ Ｅ． Ｖ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ．， ｅｔ ａｌ． ″Ｍｉｎｉｈｅｐｃｉｄｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ．″ Ｂｌｏｏｄ ２０１６； １２８（２）， ２６５－７６． Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｐ． Ｊ．， Ｔｏｕｄｊａｒｓｋａ Ｉ．， Ｓｅｎｄａｍａｒａｉ Ａ． Ｋ．， Ｒａｃｉｅ Ｔ．， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｓ．， Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ Ｂ． Ｒ．， Ｈｅｔｔｉｎｇｅｒ Ｊ．， Ｂｕｍｃｒｏｔ Ｄ．， ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｍ． Ｄ． ″Ａｎ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｍｐｒｓｓ６ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ Ｈｆｅ（－／－） ｍｉｃｅ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１３； １２１（７）， １２００－８． Ｇｕｏ Ｓ．， Ｃａｓｕ Ｃ．， Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ Ｓ．， Ｂｏｏｔｅｎ Ｓ．， Ａｇｈａｊａｎ Ｍ．， Ｐｅｒａｌｔａ Ｒ．， Ｗａｔｔ Ａ．， Ｆｒｅｉｅｒ Ｓ．， Ｍｏｎｉａ Ｂ． Ｐ．， ａｎｄ Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ． ″Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＴＭＰＲＳＳ６ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．″ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２０１３； １２３（４）， １５３１－４１． Ｓｕｔｈａｔ Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ． Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ″Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｅ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｓ″， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．， ２０１２； ２（８）． Ｓｒｉｐｉｃｈａｉ Ｏ． ｅｔ ａｌ． ″Ａ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ／Ｈｂ Ｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ″， Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ， ２００８； ８３： ４８２－４８４． Ｖｉｐｒａｋａｓｉｔ Ｖ． ｅｔ ａｌ． ″Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ″ Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎ． Ａｍ．， ２０１８； ３２： １９３－２１１． Ｍｕｓａｌｌａｍ ＫＭ， ｅｔ ａｌ． ″Ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ． ２０１３； １３０（２）： ６４－７３． Ｍｕｓａｌｌａｍ ＫＭ， ｅｔ ａｌ． ″Ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．″ ２０１３； ２０（３）： １８７－１９２． Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ＭＤ， ｅｔ ａｌ． ″Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ （ＴＤＴ）″ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， ２０１４． Ｔａｈｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． ″Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｎ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ （ＮＴＤＴ）″， ２０１３． Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ Ｅ． ″Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．″ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｏｐｉｎｉｏｎ． ２０１６； ３２（１）： １９１－２０４． Ｇａｌａｎｅｌｌｏ Ｒ， Ｏｒｉｇａ Ｒ． ″Ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ２０１０； ５： １１． Ｊ． Ｈ． Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ． ″Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ， ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ， ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ″； Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０２０ Ｍａｒ； ６０（３）：５１３－５２３．
発明の目的
本発明の目的は、特に輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）などの重症型のβ－サラセミアの新規な治療方法を提供することである。本発明の特定の目的は、ＴＤＴ及びそれに関連する症状及び病的状態を効果的に治療するための、又は従来のＴＤＴ治療方法に関連する負担を改善するための新規薬物化合物を提供することに見られ得る。特に、ＴＤＴとそれに関連する症状及び病的状態を治療するための、又は特に経口投与などの改善された投与経路を使用する従来のＴＤＴ治療方法に関連する負担を改善するための新規薬剤化合物は、投与を簡素化し、非経口投与によって生じる副作用を減らし、患者コンプライアンスを高め、治療コストを節約し（ｓａｆｅ）、患者における治療負担を低減するために提供されるべきである。さらなる態様において、本発明の目的は、ＴＤＴ及びそれに関連する症状及び病的状態を治療するための化合物であって、組換え遺伝子操作タンパク質又は遺伝子操作薬物化合物に基づく薬物よりも製造が容易かつ安価である化合物を提供する点に見ることができる。さらなる態様は、鉄キレート剤、特にデフェラシロクスとの併用療法において本明細書に記載のような経口フェロポーチン阻害剤を投与することによる、特にＴＤＴなどの重症型のβ－サラセミアを治療するための新たな併用療法を提供することに関する。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、フェロポーチン阻害剤（ＦｐｎＩ）として作用する、本明細書で定義の一般式（Ｉ）の化合物が、輸血依存性β－サラセミアなどの重症型のβ－サラセミア、例えば特に重症型β－サラセミア及びヘモグロビンＥ β－サラセミア及びそれに関連する症状及び病的状態、例えば特には骨髄における赤血球産生の欠陥、無効造血、低ヘモグロビンレベル／貧血、多臓器機能不全、鉄過剰症、肝臓の鉄負荷及び心臓の鉄過剰症、蒼白、疲労、黄疸、及び脾臓肥大の治療に使用できることを見出した。
したがって、本発明の第１の態様は、輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）の治療で使用するための、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体も含む下記式（Ｉ）による化合物に関する。
Figure 0007554253000001
式中、
Ｘ１は、Ｎ又はＯであり；
Ｘ２は、Ｎ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
Ｒ１は、
－水素、及び
－置換されていても良いアルキル
からなる群から選択され；
ｎは１～３の整数であり；
Ａ１及びＡ２は、独立にアルカンジイルの群から選択され；
Ｒ２は、
－水素、又は
－置換されていても良いアルキル
であり；
又は
Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていてもよい４～６員環を形成しており；
Ｒ３は、１、２若しくは３個の任意の置換基を示し、その置換基は独立に、
－ハロゲン、
－シアノ、
－置換されていても良いアルキル、
－置換されていても良いアルコキシ、及び
－カルボキシル基
からなる群から選択され；
Ｒ４は、
－水素、
－ハロゲン、
－Ｃ１－Ｃ３－アルキル、及び
－ハロゲン置換アルキル
からなる群から選択される。
適応症
本発明は、重症型のβ－サラセミア、例えば特に輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）、特には重症型β－サラセミア及び重症型のヘモグロビンＥ β－サラセミアの治療のための、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物及びそれの塩、溶媒和物、水和物及び多形体の新たな医学的使用に関する。上記のように、重症型のβ－サラセミア及びヘモグロビンＥβ－サラセミアは、それらを患う患者が定期的な輸血／赤血球輸血（ＲＢＣ輸血）を行うことを必要とする。したがって、このような重症型のβ－サラセミアは、輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）としてもまとめられる。
したがって本発明はさらに、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体を含む、１以上の本明細書で定義の本発明の式（Ｉ）の化合物を、処置を必要とする患者に投与することによる、重症型のβ－サラセミア、例えば特に輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）、特には重症型β－サラセミア及び重症型のヘモグロビンＥ β－サラセミアを治療する方法に関するものである。
本発明による新しい使用及び治療方法は、β－サラセミア又はヘモグロビンＥ β－サラセミアを患っており、定期的な輸血を必要とする患者への、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体を含む本明細書で定義される本発明の式（Ｉ）の化合物の投与を含む。
特に、本発明による新しい使用及び治療方法は、重症型β－サラセミア及び／又は重度のヘモグロビンＥ β－サラセミアを患う患者への、より詳細には重症型β－サラセミアを患う患者への、本明細書で定義の本発明の式（Ｉ）の化合物の投与を含む。
本発明の新たな使用の文脈における「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、輸血依存性β－サラセミアの少なくとも一つの症状又はそれに関連する病的状態の改善を含む。輸血依存性β－サラセミアに関連する症状又は病的状態の非限定的な例には、骨髄における赤血球産生の欠陥、無効造血、ヘモグロビンレベルの不足、多臓器機能不全、鉄過剰、貧血、肝臓の鉄負荷及び心臓の鉄過剰、蒼白、疲労、黄疸及び脾腫などがある。
本発明の文脈における「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、例えば、輸血の前又は輸血に伴って本発明の化合物を投与することによって、輸血によって引き起こされる病的状態を予防又は少なくとも軽減することによる予防を含む。
ＴＤＴの患者は、定期的な輸血（ＢＴ）のために重度の鉄過剰を有する。β－サラセミアの治療における輸血療法の主な目標は、貧血状態を矯正し、赤血球形成を抑制することである。これは、≧９ｇ／ｄＬのＨｂレベルで達成されると考えられる。ＢＴはヘプシジンの一過性上昇を引き起こし、それはヘモグロビン（Ｈｂ）レベルが低下すると基底値に戻る（Ｐａｓｒｉｃｈａ Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． ″Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１３； １２２（１）， １２４－３３）。本発明による式（Ｉ）のフェロポーチン阻害剤化合物の投与は、輸血の合間に腸の鉄吸収を防ぐのに役立ち、それはＴＤＴ患者におけるさらなる鉄負荷を減らすのに役立つ。
さらに重要なことに、ＢＴは非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）を生成し、それは、輸血されたＲＢＣ単位に含まれる損傷ＲＢＣをリサイクルするマクロファージによって放出され、酸化ストレス、血管損傷、及び臓器鉄過剰を誘発する（Ｂａｅｋ Ｊ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， ″Ｉｒｏｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｒｅｄ ｂｌｏｏｄ．″ ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ２０１７； ２（９））。したがって、定期的なＢＴ及び鉄キレート療法を受けているサラセミア患者は、ＮＴＢＩレベルが上昇しており、これは心疾患の存在と相関している（Ｐｉｇａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ″Ｈｉｇｈ ｎｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２００９； ８４（１）， ２９－３３）。フェロポーチン阻害剤として作用する本発明の式（Ｉ）の化合物は、マクロファージ中の鉄を隔離し、したがってβ－サラセミアにおける悪循環を妨害することにより、これらの有害な効果を防止することが見出されている。
本発明の発明者らは、本発明の式（Ｉ）の化合物が、有毒なアルファグロビン凝集体の形成のための鉄の利用可能性を制限することにより、輸血依存性サラセミアの治療に特に適していることを見出した。さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物が、赤血球前駆体中の活性酸素種（ＲＯＳ）を制限することで、ＴＤＴなどの重症型のβ－サラセミアを患う患者における赤血球形成を改善することにより、輸血依存性サラセミアの治療に特に適していることが認められている。その結果、寿命が延びたＲＢＣが増えることで、ＴＤＴ患者における貧血が改善され、組織の酸素化が改善される。ＴＤＴにおいて、式（Ｉ）の化合物はさらに、上昇したＮＴＢＩレベルを効率的に低下させ、それは、例えば、心臓の鉄過剰症、したがって心疾患など、それに由来する病的状態の発生を防ぐ上で役立つ。
ＮＴＢＩは、トランスフェリンと強く会合していないすべての形態の血清鉄を含み、化学的及び機能的に不均一である。ＬＰＩ（不安定血漿鉄）は、酸化還元活性及びキレート性の両方であり、臓器に浸透して組織の鉄過剰を誘発することができるＮＴＢＩの構成要素を表す。式（Ｉ）の化合物は、ＴＤＴにおける高ＬＰＩレベルを効率的に低下させることができる。
新しい医療用途における本発明の化合物の有効性を評価するために、次のパラメータ：血清鉄、ＮＴＢＩレベル、ＬＰＩ（不安定血漿鉄）レベル、エリスロポイエチン、ＴＳＡＴ（トランスフェリン飽和）、Ｈｂ（ヘモグロビン）、Ｈｃｔ（ヘマトクリット値）、ＭＣＶ（平均細胞体積）、ＭＣＨ（平均細胞ヘモグロビン）、ＲＤＷ（赤血球分布幅）及び網状赤血球数、完全血球算定、脾臓及び肝臓の重量、脾臓及び骨髄における赤血球生成、脾臓及び肝臓の鉄含有量、及びＲＢＣ膜でのα－グロビン凝集体を測定することができる。その測定は、従来の当技術分野の方法を用いて、特に以下により詳細に説明する方法によって実施することができる。本発明の化合物（Ｉ）は、これらのパラメータの少なくとも一つを改善するのに適している。
正常な生理的条件においてＰａｔｅｌら（２０１２；上記引用）が説明しているように、トランスフェリンのレベルは遊離鉄の完全除去には十分であり、ＮＴＢＩが存在しないことを保証するものであり、したがって、正常な健常個体におけるＮＴＢＩレベルは１μｍｏｌ／Ｌを超えず、最も一般的な方法によってはほとんど検出できない。トランスフェリン非存在下では、最大２０μｍｏｌ／ＬのＮＴＢＩレベルが報告されており、不十分なトランスフェリン存在下では、最大１０μｍｏｌ／ＬのＮＴＢＩレベルが認められている。しかし、Ｐａｔｅｌら（２０１２）及びＢｒｉｓｓｏｔら（２０１２）が記載しているように、その測定は、適用される方法及び使用されるアッセイに強く依存し、不均一化学型の循環ＮＴＢＩの測定に起因する技術的困難を考慮しなければならない。たとえば、０．１μＭ／Ｌまでの再現可能な精度での蛍光測定が、Ｂｒｉｓｓｏｔら（２０１２）によって引用されたＨｉｄｅｒら（２０１０）によって記載されている。Ｐａｔｅｌら（２０１２；表１）によると、臨床鉄過剰状態での高ＮＴＢＩレベルは、０．２５～４．０μｍｏｌ／Ｌの範囲である（精度及び測定方法は可変）。これを考慮すると、本発明の意味において、ＮＴＢＩレベルは、公知の方法（例えば、Ｐａｔｅｌら（２０１２）又はＢｒｉｓｓｏｔら（２０１２）に記載されている方法）で検出可能である場合、好ましくは０．１μｍ／Ｌを超える場合、上昇したと見なされる。
特定の態様では、本発明の新規な治療によって、患者におけるＮＴＢＩレベルが、投与後最長７２時間、最長６０時間、最長４８時間、最長３６時間、最長２４時間、又は最長１２、８、６、５、４、３、２、１及び０．５時間の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前０．５、１、２、３、４、５、６、８、１２、２４、３６若しくは４８時間、又は最長＜１週間以内のいずれかの時間点で測定される患者におけるＮＴＢＩレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は少なくとも１００％低下する。ＮＴＢＩは、下記の実施例に記載されているアッセイに従って測定することができる。
特定の態様では、本発明の新規な治療によって、患者におけるＬＰＩレベルが、投与後最長７２時間、最長６０時間、最長４８時間、最長３６時間、最長２４時間、又は最長１２、８、６、５、４、３、２、１及び０．５時間の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前０．５、１、２、３、４、５、６、８、１２、２４、３６若しくは４８時間、又は最長＜１週間以内のいずれかの時間点で測定される患者における総ＬＰＩレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は少なくとも１００％低下する。ＬＰＩは、下記の実施例に記載のアッセイに従って測定することができる。
さらなる態様において、本発明の発明者は、ＲＢＣ中のアルファグロビン凝集体の定量が、輸血の存在下又は非存在下での本発明の化合物の効力の重要なバイオマーカーであることを見出した。アルファグロビン凝集体は、下記の実施例に記載の方法によって測定される。
沈殿したα－グロビン凝集体はヘム及び鉄を含み、それが反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成して、短寿命のＲＢＣ、貧血、及び組織低酸素症を生じさせる。ＴＤＴ患者のＲＢＣ中のα－グロビン凝集体を減少させることにより、本発明の式（Ｉ）の化合物は、赤血球形成を改善し、ＴＤＴ患者における輸血負担を減少させる可能性がある。ドナーＲＢＣにおけるＲＯＳレベルに対する本発明の化合物の効果は、例えば、下記の実施例に記載されるように、市販の遠赤外又は緑色発光ＲＯＳ感受性センサーによってモニタリングすることができる。
したがって、さらなる態様において、本発明の新たな治療によって、患者におけるα－グロビン凝集体レベルが、初回投与後最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される患者におけるα－グロビン凝集体レベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は少なくとも１００％低下する。
さらなる態様において、本発明の新たな治療によって、患者でのＲＢＣにおけるＲＯＣレベルが、初回投与後最長５日、最長６日、最長７日、最長８日、最長９日、最長１０日、最長１１日、最長１２日、最長１３日、最長１４日、最長１５日、最長１６日、最長１７日、最長１８日、最長１９日、最長２０日、最長２１日及び最長１ヶ月の期間内のいずれかの時点で測定して、及び／又は本発明の治療開始前１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内のいずれかの時点で測定される患者のＲＢＣにおけるＲＯＳレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は少なくとも１００％低下する。ＲＢＣでのＲＯＳレベルは、は、下記実施例に記載のアッセイに従って測定することができる。
上記で説明した通り、高ＮＴＢＩ及びＬＰＩレベルの低下は、肝臓鉄濃度及び心筋鉄濃度を低下させるのに役立つ。
したがって、さらなる態様では、新しい治療によって、患者の肝臓鉄濃度が、初回投与後最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される患者における肝臓鉄濃度レベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は少なくとも１００％低下し得る。肝臓鉄濃度は、下記実施例に記載のアッセイに従って測定することができる。
さらなる態様では、新しい治療によって、患者での心筋鉄濃度が、初回投与後最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される対象者における心筋鉄濃度と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも１００％低下し得る。心筋鉄濃度は、下記実施例に記載のアッセイに従って測定することができる。
さらなる態様では、新しい治療によって、患者での脾臓の大きさが、初回投与後最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される対象者における脾臓の大きさと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも１００％低下し得る。脾臓の大きさは、従来の方法に従って測定することができる。
さらなる態様では、新しい治療によって、Ｈｃｔ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＲＤＷ及び網状赤血球数のうちの少なくとも一つが、初回投与後最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される対象者における個々のパラメータと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも１００％改善され得る。前記パラメータは、従来の方法に従って測定することができる。
さらなる態様では、新しい治療によって、患者での少なくとも３３％、好ましくは少なくとも５０％の輸血負荷低減を含む赤血球応答が生じ得る。基本的に、赤血球応答は、患者での少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の輸血負荷低減を含み得る。さらなる態様では、新しい治療によって、患者における輸血負荷を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、最長１８ヶ月、最長２４ヶ月にわたり又はそれをさらに超えて輸血非依存となるまで少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％低減することを含む赤血球応答を生じ得る。さらなる態様では、新しい治療によって、患者での赤血球輸血の少なくとも１、２、３、４又はそれ以上の赤血球単位低下を含む赤血球応答を生じ得る。さらなる態様では、新しい治療によって、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、最長１８ヶ月、最長２４ヶ月にわたり又はさらにそれを超えて赤血球単位の輸血非依存となるまで、患者における赤血球輸血の少なくとも１、２、３、４又はそれ以上の赤血球単位の低下を含む赤血球応答を生じ得る。赤血球応答は、上記改善の１以上を含むことも可能である。赤血球応答は、下記の実施例で記載の方法に従って測定することができる。
ここで、１単位の赤血球とは、約２００～５００ｍＬの献血に由来するパック入り赤血球の量を指す。通常、輸血は、年齢、疾患の重度、及び患者の開始時の血液パラメータに応じて調節される。輸血の量を選択するためのガイドラインは、例えば以下のものが推奨される。
Figure 0007554253000002
個々の輸血量は、次の式でさらに計算できる。
（望ましい－実際のＨｂ）ｘ体重［ｋｇ］ｘ３／輸血単位のヘマトクリット＝輸血されるｍＬ
重症型サラセミアに推奨される輸血計画によれば、年間体重１ｋｇあたり１００～２００ｍＬの純粋な赤血球（ＲＢＣ）／ｋｇ／年に相当する量を輸血する。
さらなる態様では、新たな治療によって、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間又は４週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月以内の患者における輸血負荷と比較して患者での輸血負荷低下が生じ得る。
さらなる態様では、新たな治療によって、本発明の新たな方法に従って治療される輸血依存性β－サラセミア患者が、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月又はそれ以上にわたり、治療後の赤血球輸血からの非依存となるまで赤血球輸血を必要としないようにすることができる。
さらなる態様では、新たな治療によって、例えば、患者に投与される１以上の鉄キレート化治療薬の用量又は回数の減少など、患者における毎日の鉄キレート療法の減少が生じ得る。鉄キレート化治療薬の非限定的な例には、上記のものなどがある。
さらなる態様では、新たな治療によって、患者における血清フェリチンレベルに、初回投与から最長１週間、最長２週間、最長３週間、最長４週間、最長３ヶ月の期間内のいずれかの時間点で測定して、本発明の治療開始前１週間、２週間、３週間、又は４週間以内のいずれかの時間点で測定される患者での血清フェリチンレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも１００％の低下があり得る。血清フェリチンレベルは、従来のアッセイに従って測定することができる。
さらなる態様では、新たな治療によって、１以上の輸血依存性β－サラセミア臨床合併症に関連する症状の軽減が生じ得る。輸血依存性β－サラセミア症状の非限定的な例には、成長遅延、蒼白、黄疸、筋肉組織不良、外反膝、肝脾腫大症、下肢潰瘍、髄外造血による腫瘤の発症、骨髄の拡張に起因する骨格変化、及び慢性赤血球輸血の臨床的合併症、例えばＢ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染及びヒト免疫不全ウイルス感染、同種免疫、及び鉄過剰による臓器損傷、例えば肝臓損傷、心臓損傷及び内分泌腺の損傷などがある。式（Ｉ）の化合物は、成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）に直接影響を与えるとは予想されないが、髄外造血の減少によって引き起こされる骨格変形の減少も起こり得る。したがって、本明細書で定義の式（Ｉ）の化合物は、この病的状態を間接的に改善する可能性を有する。
さらなる態様では、新たな治療によって、本発明の治療開始前１、２、３、又は４週間以内に求められる患者での生活の質と比較して、患者での生活の質の改善がもたらされ得る。生活の質の改善は、治療開始後３、６、９、１２、１５、１８、２１、又は２４か月以内に求められる。生活の質は、下記実施例に記載のアッセイに従って測定することができる。
本発明による新たな治療方法により、前記改善の１以上を達成することができる。
患者群
本発明は、重症型のβ－サラセミアの治療のための本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物及びそれの塩、溶媒和物、水和物及び多形体の新たな医学的使用に関する。
基本的に、本発明による新たな使用で治療される対象者は、齧歯動物及び霊長類などの哺乳動物であることができ、好ましい態様では、当該新たな医学的使用は、ヒトの治療に関する。重度のβ－サラセミアに罹患し、本発明による新たな方法で治療される対象者もまた、「患者」と指定される。
治療される対象者は年齢を問わない。本発明の好ましい態様は、小児及び青年の治療に関する。したがって、本発明の好ましい態様では、本明細書に記載の新たな方法で治療される対象者は、１８歳未満である。詳細には、本明細書に記載の新たな方法で治療される対象者は、１６歳未満、１５歳未満、１４歳未満、１３歳未満、１２歳未満、１１歳未満、１０歳未満、９歳未満、８歳未満、７歳未満、６歳未満、又は５歳未満である。本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の新たな方法で治療される対象者は、１～３歳、３～５歳、５～７歳、７～９歳、９～１１歳、１１～１３歳、１３～１５歳、１５～２０歳、２０～２５歳、２５～３０歳、又は３０歳超である。成人を治療する場合、本明細書に記載の新たな方法で治療される対象者は、１８～２５歳、２０～２５歳、２５～３０歳、３０～３５歳、３５～４０歳、４０～４５歳、４５～５０歳、５０～５５歳、５５～６０歳、又は６０歳超である。高齢患者を治療する場合、本明細書に記載の新たな方法で治療される対象者は、６０～６５歳、６５～７０歳、７０～７５歳、７５～８０歳、又は８０歳超である。
本発明の式（Ｉ）のフェロポーチン阻害剤化合物による治療によって提供されるかなりの利点のために、小児及び青年の治療が特に好ましい。前記化合物は経口投与することができ、それはこれまでに利用可能な薬物（例えば、ラスパテルセプト）の非経口投与より有利である。さらに、本発明の経口で生物学的に利用可能なフェロポーチン阻害剤は、中程度の生物学的利用能及び体内での半減期を有することから、比較的迅速にウォッシュアウトされることが判明した。これにより、副作用が少なくなり、薬の可逆性が速くなり、それは小児の治療において特に重要なものである。
重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、以下を有する対象者（患者）から選択される。
ａ）β０／β０、β＋／β＋，β０／β＋ 、及びβ０／ＨｂＥ、好ましくはβ＋／β＋，β０／β＋ 、及びβ０／ＨｂＥからなる群からの遺伝子型、及び／又は
ｂ）２つの重大なヘモグロビンβ鎖変異の共遺伝を含む遺伝子型。ここで、「β０」は、ベータグロビンサブユニット合成の欠乏に関連した対立遺伝子を指す。「β＋」は、ベータグロビンサブユニット合成の低下に関連する対立遺伝子を指す。「Ｈｂ」はヘモグロビンタンパク質を指す。「ＨｂＥ」又は「ヘモグロビンＥ」は、従来認識されている用語であり、変異型のヘモグロビン、例えば、ヒトヘモグロビンを指す。ヘモグロビンＥは、二つのアルファサブユニット及び二つのベータサブユニットを含み、ベータサブユニットの２６位がグルタミン酸からリジンに変異している（Ｅ２６Ｋ）。「ＨｂＥ β－サラセミア」は、ヘモグロビンＥ及びβ０対立遺伝子の共遺伝を指す。
さらなる態様では、本発明の新たな方法で治療される患者群は、遺伝性高胎児ヘモグロビン症をさらに有する。
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、高ＮＴＢＩレベルを有する対象者（患者）から選択される。上記の既知の方法で検出可能な場合、ＮＴＢＩレベルは上昇したと見なされる。好ましくは、ＮＴＢＩレベル≧０．１μＭ／Ｌが、ＴＤＴ患者で上昇していると見なされる。より好ましくは、本発明によるＴＤＴ患者（「重症型ＴＤ及びＣＨ」；ＣＨ＝キレート化を受ける）における高ＮＴＢＩレベルは、ｄｅ Ｓｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． ″Ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｏｕｎｄ ｒｏｂｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｌａｂｉｌｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｒｏｎ－ｏｖｅｒｌｏａｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２０１６； １０１（１）： ３８－４５， Ｔａｂｌｅ ２に記載の個々の測定方法でＮＴＤＴ患者（「重症型未投与」又は「中間型未投与」）において測定された値を超えるＮＴＢＩ値である。
Figure 0007554253000003
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、高ＬＰＩレベルを有する対象者（患者）から選択される。上記の既知の方法で検出可能な場合、ＬＰＩレベルは上昇したと見なされる。好ましくは、本発明によるＴＤＴ患者（「重症型ＴＤ及びＣＨ」）における高ＬＰＩレベルは、ｄｅ Ｓｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． ″Ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｏｕｎｄ ｒｏｂｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｌａｂｉｌｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｒｏｎ－ｏｖｅｒｌｏａｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ″ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２０１６； １０１（１）： ３８－４５， Ｔａｂｌｅ ２に記載の個々の測定方法でＮＴＤＴ患者（「重症型未投与」又は「中間型未投与」）において測定された値を超えるＬＰＩ値である。
Figure 0007554253000004
通常、ヘモグロビンレベル（Ｈｂ）が、サラセミアの重度及び形態を分類するのに使用される。軽度及び軽度ないし中等度型のサラセミア、例えば軽症型サラセミア又は中間型サラセミアを患う患者は、それぞれ９～１２ｇ／ｄＬ又は６～７ｇ／ｄＬのＨｂレベルを維持している。本明細書に記載の重度型のサラセミアを患う患者、すなわちＴＤＴ患者は、通常、２回の連続試験で＜７ｇ／ｄＬのＨｂレベルにより、又は顔面の変化、骨格骨折、髄外造血又は成長遅延も見られるヘモグロビンレベルが≧７ｇ／ｄＬである患者に分類される。ＴＤＴ患者におけるＨｂレベルは、４～５ｇ／ｄＬと低い可能性がある。国際ガイドラインでは、ヘモグロビン範囲９～０ｇ／ｄＬに達し、至適輸血後範囲が１３～１４ｇ／ｄＬである患者に輸血することを推奨しているが、臨床診療では、通常、定期的な輸血を行わずに最大７ｇ／ｄＬのＨｂレベルで十分であると見なされ、その後、輸血下では、通常の目的は、患者を９．５～１０ｇ／ｄＬのヘモグロビンレベルに維持することである。１３～１４ｇ／ｄＬの推奨されるより高いＨｂレベルに達するには、輸血負担を過度に増やす必要がある。しかしながら、必要な血液量は患者によって大きく異なり、患者の体重及び目標ヘモグロビンレベルに大きく影響される。
これを考慮すると、本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルが７ｇ／ｄＬ以下であるか、ヘモグロビンレベルが≧７ｇ／ｄＬであるが顔面変化、骨格骨折、髄外造血若しくは成長遅延も見られる対象者（患者）から選択することができる。
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、ＭＣＶが５０～７０ｆＬである対象者（患者）から選択することができる。
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、ＭＣＨが１２～２０ｐｇである対象者（患者）から選択することができる。
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、ａ）７ｇ／ｄＬ以下のＨｂレベル又はヘモグロビンレベル≧７ｇ／ｄＬ及び顔面変化、骨格骨折、髄外造血若しくは成長遅延、ｂ）５０～７０ｆＬのＭＣＶ、及びｃ）１２～２０ｐｇのＭＣＨを含む特徴の１以上を有する対象者（患者）から選択することができる。
本発明のさらなる態様において、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、定期的な輸血を受ける。２４週間当たり５回を超える輸血を必要とするサラセミア患者（Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ＭＤ， ｅｔ ａｌ． ″Ｔｈｅ Ｂｅｌｉｅｖｅ Ｔｒｉａｌ： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ Ｐｈａｓｅ ３， Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， Ｄｏｕｂｌｅ－Ｂｌｉｎｄ， Ｐｌａｃｅｂｏ－Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｂｅｔａ－Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｈｏ Ｒｅｑｕｉｒｅ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ （ＲＢＣ） Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ″． Ｂｌｏｏｄ ２０１８による）はＴＤＴ患者とみなされるが、２４週間当たり５回以下の輸血を必要とする患者は通常、なおもＮＴＤＴ患者と考えられる。しかしながら、上記で詳細に説明したように、さらなる臨床症状及びパラメータも、ＴＤＴ対ＮＴＤＴ状況を決定する上で重要な役割を果たす。定期的な輸血はさらに、少なくとも最長２か月の時間間隔内で、又はそれより短い間隔での赤血球（ＲＢＣ）単位の複数回の反復輸血を意味する。間隔は等しい長さであることができるか、個々の患者、疾患の経過、それの重度、及び治療応答に応じて異なることもあり得る。定期的な輸血はさらに、後続の輸血時点での等しい又は変動する輸血単位の反復輸血を含み得る。定期的な輸血には、次のものが含まれ得る。
－可変の後続の時間間隔での等しいＲＢＣ単位の反復輸血、又は
－等しい後続の時間間隔での等しいＲＢＣ単位の反復輸血、又は
－等しい後続の時間間隔での可変のＲＢＣユニットの反復輸血、又は
－可変の後続の時間間隔で、可変のＲＢＣ単位の反復輸血。
本発明のさらなる態様では、定期的な輸血は、３ヶ月以下、好ましくは２ヶ月以下の無輸血期間を意味する。
本発明のさらなる態様では、重症型のβ－サラセミアを患い、本発明による新たな方法で治療される患者群又は集団は、定期的鉄キレート療法を必要とする対象者（患者）から選択される。
定期的な鉄キレート療法を必要とするそのような患者群又は集団は、上記で定義の特徴の１以上によってさらに特徴付けることができる。
投与形態
本発明のさらなる態様では、輸血依存性β－サラセミア及び／又は重症型β－サラセミアなどの重症型のβ－サラセミアの治療は、それぞれ本明細書のいずれかの箇所に記載されている式（Ｉ）の化合物、それの塩、溶媒和物。水和物若しくは多形体の１以上を、処置を必要とする患者に経口投与することを含む。
これに関しては、本発明による式（Ｉ）の化合物は好ましくは、経口投与形態の形態の医薬品又は医薬組成物で提供され、例えば、丸薬、錠剤、例えば腸溶性コート錠、フィルム錠剤及び層状錠剤、経口投与用徐放製剤、デポー製剤、糖衣錠、粒剤、乳濁液、分散液、マイクロカプセル、マイクロ製剤、ナノ製剤、リポソーム製剤、カプセル、例えば腸溶コートカプセル、粉剤、微結晶製剤、散布剤、滴剤、アンプル、液剤及び経口投与用懸濁液などの経口投与形態での医薬又は医薬組成物で提供される。
本発明の好ましい実施形態において、本発明による式（Ｉ）の化合物は、上記で定義の、錠剤又はカプセルの形態で投与される。これらは、例えば、耐酸性形態として、又はｐＨ依存性コーティングとともに存在し得る。
したがって、本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体を含む本発明による式（Ｉ）の化合物、並びに経口投与形態での重症型のβ－サラセミア、例えば特には輸血依存性β－サラセミア及び／又は重症型β－サラセミアの治療での使用のためのそれを含む医薬品、組成物及び組み合わせ調製物に関するものである。
投与法
本発明のさらなる態様は、本発明による使用のための本発明による式（Ｉ）の化合物であって、治療が、下記の投与法のうちの一つを特徴とする化合物に関するものである。
１態様では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、処置を必要とする患者に、０．００１～５００ｍｇの用量で、例えば、１日１～４回投与することができる。しかしながら、その用量は、年齢、体重、患者の状態、疾患の重度、又は投与の種類に応じて増減し得る。本発明のさらなる態様では、式（Ｉ）の化合物は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、１６０ｍｇ、１６５ｍｇ、１７０ｍｇ、１７５ｍｇ、１８０ｍｇ、１８５ｍｇ、１９０ｍｇ、１９５ｍｇ、２００ｍｇ、２０５ｍｇ、２１０ｍｇ、２１５ｍｇ、２２０ｍｇ、２２５ｍｇ、２３０ｍｇ、２３５ｍｇ、２４０ｍｇ、２４５ｍｇ、２５０ｍｇ、２５５ｍｇ、２６０ｍｇ、２６５ｍｇ、２７０ｍｇ、２７５ｍｇ、２８０ｍｇ、２８５ｍｇ、２９０ｍｇ、２９５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇの用量として投与することができる。
０．５～５００ｍｇの用量が好ましく、より好ましくは１～３００ｍｇ又は３～３００ｍｇであり、より好ましくは１～２５０ｍｇ又は５～２５０ｍｇである。
５ｍｇ、１５ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ又は２４０ｍｇの用量が最も好ましい。
上記で定義の投与量を、１日１回の投与で、又は１日２回以上投与のための小分け用量に分割して総１日投与量として投与することが可能である。
さらなる態様では、０．００１～３５ｍｇ／ｋｇ、０．０１～３５ｍｇ／ｋｇ、０．１～２５ｍｇ／ｋｇ、又は０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び最大２０ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。特に好ましいのは、体重が＞５０ｋｇの患者には１２０ｍｇの用量であり、体重が＜５０ｋｇの患者には６０ｍｇの用量であり、各場合で１日１回又は２回である。
さらなる態様では、上記で定義の投与量の一つを初期用量として選択し、その後、１～７日、１～５日、好ましくは１～３日の繰り返し間隔で、又は２日に１回で上記で定義のものの同一用量若しくは可変用量を１回以上を投与することが可能である。
初回用量及び後続の用量は、上記で定義の用量の中から選択し、提供された範囲内でＴＤＴ患者のニーズに応じて調節／変更することができる。
特に、その後の用量は、個々の患者、疾患の経過、及び治療応答に応じて適切に選択することができる。１、２、３、４、５、６、７、及びそれ以上の用量を投与することが可能である。
初回用量は、１以上の後続の用量と等しいか異なっていることができる。さらに、後続の用量は等しいか異なっていることができる。
反復間隔は、同じ長さにすることも、個々の患者、疾患の経過、及び治療応答に応じて変えることもできる。
好ましくは、後続の用量は、後続の投与回数の増加とともに減少する量である。
好ましくは、３ｍｇ～３００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ～２５０ｍｇ、最も好ましくは５ｍｇ、１５ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ又は２４０ｍｇの用量を、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間の治療期間にわたって１日１回投与する。さらに好ましい態様では、６０ｍｇ又は１２０ｍｇの用量を１日１回投与する。さらに好ましい態様では、総１日用量１２０ｍｇを、６０ｍｇ用量を１日２回投与することによって投与する。
さらに好ましい態様では、総１日用量２４０ｍｇを、１２０ｍｇ用量を１日２回投与することによって投与する。上記の用量は安全でかつ十分に耐容されることがわかっている。
好ましい投与計画はさらに、投与後１５～３０分という早い時期に検出可能なレベルで急速な経口吸収を示した。反復投与しても吸収レベルを安定に保つことができ、重大な蓄積は認められない。
好ましい投与法はさらに、平均血清鉄レベル及び平均計算トランスフェリン飽和度を効率的に低下させ、平均血清ヘプシジンピークをシフトさせることがわかっており、それはＴＤＴの治療へのそれの効率の良さを示している。
本発明のさらなる態様では、初回投与及び１以上の後続の投与は、治療される患者のヘモグロビン濃度に応じて調節される。ヘモグロビン濃度は、従来の方法によって求められる。
フェロポーチン（Ｆｐｎ）阻害剤化合物
本発明は、本明細書で定義の式（Ｉ）の化合物の新たな医学的使用に関する。
Figure 0007554253000005
本発明において、そして本発明全体を通して、置換基は、本明細書のいずれかの箇所で詳細に定義される意味を有する。
置換されていても良いアルキルには好ましくは、好ましくは１～８個、より好ましくは１～６個、特に好ましくは１～４個、さらにより好ましくは１、２又は３個の炭素原子を含む直鎖若しくは分岐のアルキルなどがあり、Ｃ１－Ｃ４－アルキル又はＣ１－Ｃ３－アルキルとしても示される。
置換されていても良いアルキルにはさらに、好ましくは３～８個、より好ましくは５又は６個の炭素原子を含むシクロアルキルなどがある。
１～８個の炭素原子を含むアルキル残基の例には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｉ－ペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔ－ペンチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、１－エチルブチル基、２－エチルブチル基、３－エチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１－エチル－１－メチルプロピル基、ｎ－ヘプチル基、１－メチルヘキシル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、１－エチルペンチル基、２－エチルペンチル基、３－エチルペンチル基、４－エチルペンチル基、１，１－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、４，４－ジメチルペンチル基、１－プロピルブチル基、ｎ－オクチル基、１－メチルヘプチル基、２－メチルヘプチル基、３－メチルヘプチル基、４－メチルヘプチル基、５－メチルヘプチル基、６－メチルヘプチル基、１－エチルヘキシル基、２－エチルヘキシル基、３－エチルヘキシル基、４－エチルヘキシル基、５－エチルヘキシル基、１，１－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、５，５－ジメチルヘキシル基、１－プロピルペンチル基、２－プロピルペンチル基などがある。１～４個の炭素原子を含むもの（Ｃ１－Ｃ４－アルキル）、例えば特にはメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、n－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルが好ましい。Ｃ１－Ｃ３アルキル、特には、メチル、エチル、プロピル及びｉ－プロピルがより好ましい。最も好ましいものは、Ｃ１及びＣ２アルキル、例えばメチル及びエチルである。
３～８個の炭素原子を含むシクロアルキル残基には好ましくは、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基及びシクロオクチル基などがある。シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基及びシクロヘキシル基が好ましい。シクロプロピル基が特に好ましい。
上記で定義の置換されていても良いアルキルの置換基には好ましくは、例えば、下記で定義のハロゲン、例えば好ましくはＦ、上記で定義のシクロアルキル、例えば好ましくはシクロプロピル、下記で定義の置換されていても良いヘテロアリール、例えば好ましくはベンゾイミダゾリル基、下記で定義の置換されていても良いアミノ、例えば好ましくはアミノ基又はベンジルオキシカルボニルアミノ、カルボキシル基、下記で定義のアミノカルボニル基、並びにアルキレン基、例えば特には例えばメチレン置換されたエチル基を形成するメチレン基（ＣＨ３－（Ｃ＝ＣＨ２）－又は
Figure 0007554253000006
、＊は結合部位を示す。）からなる群から選択される同一若しくは異なる置換基の１、２又は３個などがある。
本発明の意味の範囲内で、ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素、好ましくはフッ素又は塩素などがあり、最も好ましいものはフッ素である。
ハロゲンによって置換され、１～８個の炭素原子を含む直鎖若しくは分岐のアルキル残基の例には、、下記のものなどがある。
フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモメチル基、ジブロモメチル基、トリブロモメチル基、１－フルオロエチル基、１－クロロエチル基、１－ブロモエチル基、２－フルオロエチル基、２－クロロエチル基、２－ブロモエチル基、ジフルオロエチル基、例えば１，２－ジフルオロエチル基、１，２－ジクロロエチル基、１，２－ジブロモエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、２，２－ジクロロエチル基、２，２－ジブロモエチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、ヘプタフルオロエチル基、１－フルオロプロピル基、１－クロロプロピル基、１－ブロモプロピル基、２－フルオロプロピル基、２－クロロプロピル基、２－ブロモプロピル基、３－フルオロプロピル基、３－クロロプロピル基、３－ブロモプロピル基、１，２－ジフルオロプロピル基、１，２－ジクロロプロピル基、１，２－ジブロモプロピル基、２，３－ジフルオロプロピル基、２，３－ジクロロプロピル基、２，３－ジブロモプロピル基、３，３，３－トリフルオロプロピル基、２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル基、２－フルオロブチル基、２－クロロブチル基、２－ブロモブチル基、４－フルオロブチル基、４－クロロブチル基、４－ブロモブチル基、４，４，４－トリフルオロブチル基、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロブチル基、パーフルオロブチル基、２－フルオロペンチル基、２－クロロペンチル基、２－ブロモペンチル基、５－フルオロペンチル基、５－クロロペンチル基、５－ブロモペンチル基、パーフルオロペンチル基、２－フルオロヘキシル基、２－クロロヘキシル基、２－ブロモヘキシル基、６－フルオロヘキシル基、６－クロロヘキシル基、６－ブロモヘキシル基、パーフルオロヘキシル基、２－フルオロヘプチル基、２－クロロヘプチル基、２－ブロモヘプトイル基、７－フルオロヘプチル基、７－クロロヘプチル基、７－ブロモヘプチル基、パーフルオロヘプチル基など。フルオロアルキル、ジフルオロアルキル及びトリフルオロアルキルが特に挙げられ、トリフルオロメチル及びモノ及びジフルオロエチルが好ましい。特に好ましいものはトリフルオロメチルである。
シクロアルキル置換されたアルキル基の例には、１～３個、好ましくは１個のシクロアルキル基を含む上記のアルキル残基、例えばシクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチルシクロヘキシルメチル、２－シクロプロピルエチル、２－シクロブチルエチル、２－シクロペンチルエチル２－シクロヘキシルエチル、２－又は３－シクロプロピルプロピル、２－又は３－シクロブチルプロピル、２－又は３－シクロペンチルプロピル、２－又は３－シクロヘキシルプロピルなどがある。好ましいものはシクロプロピルメチルである。
ヘテロアリール置換されたアルキル基の例には、１～３個、好ましくは１個の（置換されていても良い）ヘテロアリール基を含む上記のアルキル残基、例えばピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チオフェニル、又はオキサゾリル基、例えばピリジン－２－イル－メチル、ピリジン－３－イル－メチル、ピリジン－４－イル－メチル、２－ピリジン－２－イル－エチル、２－ピリジン－１－イル－エチル、２－ピリジン－３－イル－エチル、ピリダジン－３－イル－メチル、ピリミジン－２－イル－メチル、ピリミジン－４－イル－メチル、ピラジン－２－イル－メチル、ピラゾール－３－イル－メチル、ピラゾール－４－イル－メチル、ピラゾール－５－イル－メチル、イミダゾール－２－イル－メチル、イミダゾール－５－イル－メチル、ベンゾイミダゾール－２－イル－メチル、チオフェン－２－イル－メチル、チオフェン－３－イル－メチル、１，３－オキサゾール－２－イル－メチルなどがある。
好ましいものは、ベンゾイミダゾリル基で置換されているアルキル基であり、例えばベンゾイミダゾール－２－イル－メチル及びベンゾイミダゾール－２－イル－エチルである。
アミノ置換されたアルキル残基の例には、１～３個、好ましくは１個の（置換されていても良い）下記で定義のアミノ基を含む上記アルキル基などがあり、例えばアミノアルキル（ＮＨ２－アルキル）又はモノ若しくはジアルキルアミノ－アルキル、例えばアミノメチル、２－アミノエチル、２－又は３－アミノプロピル、メチルアミノメチル、メチルアミノエチル、メチルアミノプロピル、２－エチルアミノメチル、３－エチルアミノメチル、２－エチルアミノエチル、３－エチルアミノエチルなどであり、３－アミノプロピルが好ましく、又は下記式：
Figure 0007554253000007
［式中、Ｒはフェニル基を定義する。］による基などの置換されていても良いアルキルオキシカルボニルアミノ基で置換されていても良いアルキル基がベンジルオキシカルボニルアミノプロピル基を形成している。
本発明による置換されていても良いアミノには好ましくは、アミノ（－ＮＨ２）、置換されていても良いモノ若しくはジアルキルアミノ（アルキル－ＮＨ－、（アルキル）２Ｎ－）などがあり、「アルキル」に関しては、上記の置換されていても良いアルキルの定義を参照する。好ましいものは、モノ若しくはジメチルアミノ、モノ若しくはジエチルアミノ及びモノプロピルアミノである。最も好ましいものは、アミノ基（－ＮＨ２）、及びモノプロピルアミノである。
さらに、本発明の意味において、カルボキシル基は基［－（Ｃ＝Ｏ）－ＯＨ］を示し、アミノカルボニル基は基［ＮＨ２－（Ｃ＝Ｏ）－］を示す。
置換されていても良いアルコキシには、置換されていても良いアルキル－Ｏ－基などがあり、アルキル基についての前述の定義を参照する。好ましいアルコキシ基は、最大６個の炭素原子を含む直鎖若しくは分岐のアルコキシ基であり、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、ｉ－プロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｉ－ブチルオキシ基、ｓｅｃ－ブチルオキシ基、ｔ－ブチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｉ－ペンチルオキシ基、ｓｅｃ－ペンチルオキシ基、ｔ－ペンチルオキシ基、２－メチルブトキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、ｉ－ヘキシルオキシ基、ｔ－ヘキシルオキシ基、ｓｅｃ－ヘキシルオキシ基、２－メチルペンチルオキシ基、３－メチルペンチルオキシ基、１－エチルブチルオキシ基、２－エチルブチルオキシ基、１，１－ジメチルブチルオキシ基、２，２－ジメチルブチルオキシ基、３，３－ジメチルブチルオキシ基、１－エチル－１－メチルプロピルオキシ基、並びにシクロアルキルオキシ基、例えばシクロペンチルオキシ基又はシクロヘキシルオキシ基である。メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基及びｉ－プロピルオキシ基が好ましい。メトキシ及びエトキシ基がより好ましい。特に好ましいものはメトキシ基である。
本発明を通じて、置換されていても良いアルカンジイルは、好ましくは、ハロゲン、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキソ基（Ｃ＝Ｏ；カルボニル又はアシル基［－（Ｃ＝Ｏ）－］を形成）及び上記で定義のアルキル基、例えば好ましくはメチルからなる群から選択される１～３個、好ましくは１又は２個の置換基を有していても良い、１～６個、好ましくは１～４個、より好ましくは１、２又は３個の炭素原子を有する二価の直鎖若しくは分岐アルカンジイル基である。好ましい例として挙げることができるものは、メチレン、エタン－１，２－ジイル、エタン－１，１－ジイル、プロパン－１，３－ジイル、プロパン－１，１－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、プロパン－２，２－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ブタン－１，２－ジイル、ブタン－１，３－ジイル、ブタン－２，３－ジイル、ブタン－１，１－ジイル、ブタン－２，２－ジイル、ブタン－３，３－ジイル、ペンタン－１，５－ジイルなどである。特に好ましいものは、メチレン、エタン－１，２－ジイル、エタン－１，１－ジイル、プロパン－１，３－ジイル、プロパン－２，２－ジイル、及びブタン－２，２－ジイルである。最も好ましいものは、メチレン、エタン－１，２－ジイル及びプロパン－１，３－ジイルである。
好ましい置換されたアルカンジイル基は、ヒドロキシル置換されたアルカンジイル、例えばヒドロキシル置換されたエタンジイル、オキソ置換されたアルカンジイル、例えばカルボニル又はアシル（アセチル）基を形成するオキソ置換されたメチレン又はエタンジイル基、ハロゲン置換されたアルカンジイル基、例えばＦ及びＣｌから選択される１個若しくは２個のハロゲン原子で置換されているアルカンジイル、好ましくは２，２－ジ－フルオロ－エタンジイル、又はメチル基で置換されているアルカンジイル基である。
本発明によれば、さらに、上記で定義の直鎖若しくは分岐のアルカンジイル基の意味を有するＡ１、及び上記で定義の置換されていても良いアルキル基の意味を有するＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、上記で定義の１～３個の置換基で置換されていても良い、置換されていても良い４～６員環を形成していることができる。従って、Ａ１及びＲ２が、下記式：
Figure 0007554253000008
のうちの一つによる基を形成していることができる。ここで、（置換された又は置換されていない）４員環形成が好ましく、例えば非常に特には下記の基：
Figure 0007554253000009
である。ここで、左側の結合部位は、本発明の式（Ｉ）における位置Ｘ１及びＸ２間の複素環５員環への直接結合部位を示している。右側の結合部位は、本明細書で定義のアルカンジイル基の意味を有する基Ａ２への結合部位を示している。
本明細書のいずれかの箇所で定義の式（Ｉ）において、ｎは、１～３の整数、例えば１、２又は３の意味を有していることから、メチレン基、エタン－１，２－ジイル基又はプロパン－１，３－ジイル基を示している。より好ましくはｎは１又は２であり、さらにより好ましくはｎは１であり、メチレン基を示している。
本発明において、上記式（Ｉ）の個々の置換基は、下記の意味を有することができる。
Ａ）Ｘ１はＮ又はＯであり；
Ｘ２はＮ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
従って、下記式による５員複素環を形成している。
Figure 0007554253000010
式中、＊はアミノカルボニル基への結合部位を示し、＊＊はＡ１基への結合部位を示している。
Ｂ）ｎは１、２又は３の整数であり；好ましくはｎは１又は２であり、より好ましくはｎは１である。
Ｃ）Ｒ１は、
－水素及び
－置換されていても良いアルキル（上記で定義の通り）
からなる群から選択され；
好ましくはＲ１は水素又はメチルであり、より好ましくはＲ１は水素である。
Ｄ）Ｒ２は、
－水素、及び
－置換されていても良いアルキル（上記で定義の通り）
からなる群から選択され；
好ましくはＲ２は水素又はＣ１－Ｃ４－アルキルであり、より好ましくはＲ２は水素又はメチルであり、さらにより好ましくはＲ２は水素である。
Ｅ）Ｒ３は１、２又は３個の任意の置換基を示し、それは独立に
－ハロゲン（上記で定義の通り）、
－シアノ、
－置換されていても良いアルキル（上記で定義の通り）、
－置換されていても良いアルコキシ（上記で定義の通り）、及び
－カルボキシル基（上記で定義の通り）
からなる群から選択されても良く；
好ましくはＲ３は１又は２個の任意の置換基を示し、それは独立に
－ハロゲン、
－シアノ、
－１、２又は３個のハロゲン原子（上記で定義の通り）で置換されていても良いアルキル（上記で定義の通り）、
－置換されていても良いアルコキシ（上記で定義の通り）、及び
－カルボキシル基（上記で定義の通り）
からなる群から選択されることができ；
より好ましくはＲ３は１又は２個の任意の置換基を示し、それは独立に
－Ｆ及びＣｌ、
－シアノ、
－トリフルオロメチル、
－メトキシ、及び
－カルボキシル基
からなる群から選択されることができ；
さらにより好ましくはＲ３は水素であり、式（Ｉ）における置換されていない末端ベンゾイミダゾリル環を示している。
Ｆ）Ｒ４は
－水素、
－ハロゲン（上記で定義の通り）、
－Ｃ１－Ｃ３－アルキル、及び
－ハロゲン置換されたアルキル（上記で定義の通り）
からなる群から選択され；
好ましくはＲ４は
－水素、
－Ｃｌ、
－メチル、エチル、イソ－プロピル、及び
－トリフルオロメチル
からなる群から選択され；
より好ましくはＲ４は
－水素、
－Ｃｌ、
－メチル、及び
－トリフルオロメチル
からなる群から選択され；
より好ましくはＲ４は
－水素、
－Ｃｌ、及び
－メチル
からなる群から選択され；
さらにより好ましくはＲ４は水素である。
Ｇ）Ａ１はアルカンジイルであり；
好ましくはＡ１はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり、より好ましくはＡ１はエタン－１，２－ジイルである。
Ｈ）Ａ２はアルカンジイルであり；
好ましくはＡ２はメチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイルであり；
より好ましくはＡ２はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり；
さらにより好ましくはＡ２はエタン－１，２－ジイルである。
Ｉ）又は、Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていても良い上記で定義の４～６員環を形成しており；
ここで、Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、好ましくは置換されていても良い上記で定義の４員環を形成しており；
ここで、Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともにより好ましくは置換されていない４員環（アゼチジニル環）を形成している。
下記（Ｉ）の化合物の置換基は、特に、以下の意味を有することができる。
ｎは、上記Ｂ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）及びＣ）～Ｉ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ｒ１は、上記Ｃ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）及びＢ）及びＤ）～Ｉ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ｒ２は、上記Ｄ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｃ）及びＥ）～Ｈ）又はＩ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ｒ３は、上記Ｅ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｄ）及びＦ）～Ｉ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ｒ４は、上記Ｆ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｅ）及びＧ）～Ｉ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ａ１は、上記Ｇ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｆ）及びＨ）又はＩ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ａ２は、上記Ｈ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｇ）及びＩ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
Ｒ２及びＡ１は、Ｉ）で定義の意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）～Ｃ）、Ｅ）、Ｆ）及びＨ）で定義の意味のいずれかを有することができる。
本発明の好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物は、以下によって定義される。
Ｘ１はＮ又はＯであり；
２はＮ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
Ｒ１は水素であり；
ｎは１、２又は３であり；
Ａ１はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり；
Ａ２はメチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイルであり；
Ｒ２は水素又はＣ１－Ｃ４－アルキルであり；
又は
Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていても良い４員環を形成しており；
Ｒ３は、１又は２個の任意の置換基を示し、それは独立に、
－ハロゲン、
－シアノ、
－１、２若しくは３個のハロゲン原子で置換されていても良いアルキル、
－置換されていても良いアルコキシ、及び
－カルボキシル基
からなる群から選択されることができ；
Ｒ４は、
－水素、
－Ｃｌ、
－メチル、エチル、イソ－プロピル、及び
－トリフルオロメチル
からなる群から選択される。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物は、以下によって定義される。
Ｘ１はＮ又はＯであり；
Ｘ２はＮ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
Ｒ１は水素であり；
ｎは１又は２であり；
Ａ１はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり；
Ａ２はメチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイルであり；
Ｒ２は水素又はメチルであり；
又は
Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていない４員環を形成しており；
Ｒ３は、１又は２個の任意の置換基を示し、それは独立に、
－Ｆ及びＣｌ、
－シアノ、
－トリフルオロメチル、
－メトキシ、及び
－カルボキシル基
からなる群から選択されることができ；
Ｒ４は、
－水素、
－Ｃｌ、
－メチル、及び
－トリフルオロメチル
からなる群から選択される。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物は、以下によって定義される。
Ｘ１はＮ又はＯであり；
Ｘ２はＮ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
Ｒ１は水素であり；
ｎは１であり；
Ａ１はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり；
Ａ２はメチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイルであり；
Ｒ２は水素であり；
又は
Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていない４員環を形成しており；
Ｒ３は水素を示し、したがって置換されていない末端ベンゾイミダゾリル環を形成しており；
Ｒ４は、
－水素、
－Ｃｌ、及び
－メチル
からなる群から選択される。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物は、以下によって定義される。
Ｘ１はＮ又はＯであり；
Ｘ２はＮ、Ｓ又はＯであり；
ただし、Ｘ１及びＸ２は異なっており；
Ｒ１は水素であり；
ｎは１であり；
Ａ１はメチレン又はエタン－１，２－ジイルであり；
Ａ２はメチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイルであり；
Ｒ２は水素であり；
又は
Ａ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていない４員環を形成しており；
Ｒ３は水素を示し、したがって置換されていない末端ベンゾイミダゾリル環を形成しており；
Ｒ４は水素である。
さらなる態様において、本発明は、式（Ｉ）による化合物、又はそれの塩、溶媒和物、水和物及び多形体が上記で示した式（Ｉ）の化合物から選択され、
ｎ＝１；
Ｒ３＝水素；
Ｒ４＝水素；
Ａ１＝メチレン又はエタン－１，２－ジイル；
Ａ２＝メチレン、エタン－１，２－ジイル又はプロパン－１，３－ジイル；
又はＡ１及びＲ２がそれらが結合している窒素原子とともに、置換されていても良い４員環を形成していることで、
下記式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）による化合物：
Figure 0007554253000011
を形成しており、
式（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）中、
ｌは０又は１であり；
ｍは１、２又は３の整数であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１及びＲ２は、本明細書のいずれかの箇所で式（Ｉ）の化合物について定義される意味を有する、本明細書で定義の新たな使用及び方法に関する。
好ましくは、式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｘ１及びＸ２は、Ａ）で上記において定義の意味を有する。
式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は好ましくは水素である。
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１は好ましくは水素であり、ｍは好ましくは２である。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、一般式（ＩＩ）の化合物は、以下によって定義される。
Ｘ１及びＸ２はＮ及びＯから選択され、異なっており；
Ｒ１＝水素；
Ｒ２＝水素；
ｌ＝１；及び
ｍ＝２。
さらなる好ましい態様において、本発明は、式（Ｉ）による化合物がそれの薬学的に許容される塩、又はそれの溶媒和物、水和物及び多形体の形態で使用される、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
本明細書のいずれかの箇所で定義される式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の好適な薬学的に許容される塩に関しては、国際出願ＷＯ２０１７／０６８０８９、ＷＯ２０１７／０６８０９０、特にＷＯ２０１８／１９２９７３を参照する。本明細書に開示の薬学的に許容される塩の定義は、参照により本明細書に組み込まれる。
フェロポーチン阻害剤として作用し、本明細書で定義の重症型のβ－サラセミアの治療に適しているさらなる化合物が、ＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１に記載されており、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で定義の重症型のβ－サラセミアの治療に適している、ＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１に記載されているものの中で、特定の化合物を、以下からなる群から選択することができる。
Figure 0007554253000012
Figure 0007554253000013
Figure 0007554253000014
さらなる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物又はＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１による化合物の薬学的に許容される塩が、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、及びトルエンスルホン酸からなる群から選択される、本明細書で定義の新たな使用及び処理方法に関する。好ましくは、クエン酸、塩酸、マレイン酸、リン酸及び硫酸からなる群からの酸が選択される。
さらなる好ましい態様において、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の薬学的に許容される塩がモノ塩（１：１塩）、トリプル塩（１：３塩）及び化合物（Ｉ）、（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）の酸に対する比率が１～２：１～３であることを特徴とする塩から選択され、それの溶媒和物、水和物及び多形体を含む、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
ここで、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の塩は、１．０～２．０（ｍｏｌ塩基）：１．０～３．０（ｍｏｌ酸）の範囲の塩基：酸、すなわち化合物（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：上記で定義の酸の選択された比率によって特徴付けられ得る。特定の実施形態において、塩基：酸の選択された比率は、１．０～２．０（モル塩基）：１．０～２．０（モル酸）である。
特定の例は、下記の塩基：酸の比、すなわち化合物（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：上記で定義の酸の比を含む。
１．０（ｍｏｌ塩基）：１．０（ｍｏｌ酸）；
１．０（ｍｏｌ塩基）：１．２５（ｍｏｌ酸）：
１．０（ｍｏｌ塩基）：１．３５（ｍｏｌ酸）；
１．０（ｍｏｌ塩基）：１．５（ｍｏｌ酸）；
１．０（ｍｏｌ塩基）：１．７５（ｍｏｌ酸）；
１．０（ｍｏｌ塩基）：２．０（ｍｏｌ酸）；
１．０（ｍｏｌ塩基）：３．０（ｍｏｌ酸）；及び
２．０（ｍｏｌ塩基）：１．０（ｍｏｌ酸）。
ここで、塩基：酸の比が１：１である塩は、「モノ塩」又は「１：１塩」とも称される。たとえば、モノＨＣｌ塩は１ＨＣｌ又は１ＨＣｌ塩とも称される。
ここで、塩基：酸の比が１：２である塩は、「ジ塩」又は「１：２塩」とも称される。たとえば、ｄｉ－ＨＣｌ塩は２ＨＣｌ又は２ＨＣｌ塩とも称される。
ここで、塩基：酸の比が１：３である塩は、「トリ－塩」、「トリ塩」又は「１：３塩」とも称される。たとえば、トリＨＣｌ塩は３ＨＣｌ又は３ＨＣｌ塩とも称される。
塩基：酸の比率が１：１．２５の塩は、「１：１．２５塩」とも称される。
塩基：酸の比率が１：１．３５の塩は、「１：１．３５塩」とも称される。
塩基：酸の比率が１：１．５の塩は、「１：１．５塩」とも称される。
塩基：酸の比率が１：１．７５の塩は、「１：１．７５塩」とも称される。
塩基：酸の比率が２：１の塩は、「ヘミ塩」又は「２：１塩」とも称される。
本発明による式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の塩は、非晶質、多形体、結晶形態及び／又は半結晶（部分結晶）形態、並びに塩の溶媒和物の形態で存在し得る。好ましくは、本発明による式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の塩は、結晶形態及び／又は半結晶（部分結晶）形態及び／又はそれの溶媒和物の形態で存在する。
塩又は塩溶媒和物の好ましい結晶化度は、従来の分析方法を使用することによって、例えば特には塩化合物の明瞭かつ簡単な分析を可能にする各種のＸ線法を用いることで求めることができる。特に、結晶化度の等級は、粉末Ｘ線回折（反射）法又は粉末Ｘ線回折（透過）法（ＰＸＲＤ）を用いて測定又は確認できる。同一の化学組成を有する結晶固体の場合、得られる異なる結晶格子は、多形という用語で要約される。特定の結晶化度を有する溶媒和物、水和物及び多形体並びに塩に関しては、国際出願ＷＯ２０１８／１９２９９３を参照するが、それは参照により本明細書に含まれる。
さらなる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物が以下のものからなる群、及びそれの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体から選択される、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
Figure 0007554253000015
Figure 0007554253000016
Figure 0007554253000017
さらなる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物が以下のものからなる群、及びそれの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体から選択される、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
Figure 0007554253000018
さらなる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物が以下のものからなる群から選択される、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
Figure 0007554253000019
さらなる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物が以下のものからなる群、及びそれの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体から選択される、本明細書で定義の新たな使用及び治療方法に関する。
Figure 0007554253000020
本発明のさらにより好ましい態様では、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物は以下のものからなる群、及びそれの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物及び多形体から選択される。
Figure 0007554253000021
本発明のさらにより好ましい態様では、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物は以下の塩からなる群、及びそれらの多形体から選択される。
下記式を有する１：１硫酸塩：
Figure 0007554253000022
下記式を有する１：１リン酸塩：
Figure 0007554253000023
下記式を有する２：１リン酸塩（ヘミリン酸塩）：
Figure 0007554253000024
下記式を有する１：３ＨＣｌ塩：
Figure 0007554253000025
ＷＯ２０１７／０６８０８９、ＷＯ２０１７／０６８０９０、及びＷＯ２０１８／１９２９７３に記載のように、式（Ｉ）の化合物はフェロポーチン阻害剤として作用する。したがって、当該化合物のフェロポーチン阻害剤活性に関しては、前記国際出願を参照する。
フェロポーチン阻害剤化合物を含む医薬品
本発明のさらなる態様は、本明細書のいずれかの箇所で定義の重症型のβ－サラセミアの新たな使用及び治療方法のための、本明細書のいずれかの箇所で定義の式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の１以上を含む医薬品又は医薬組成物に関する。
そのような医薬品はさらに、１以上の医薬担体及び／又は１以上の補助剤及び／又は１以上の溶媒を含み得る。
好ましくは、その医薬品は、例えば上記で定義されたような経口剤形の形態である。
好ましくは、医薬担体及び／又は補助剤及び／又は溶媒は、経口剤形を調製するための好適な化合物の中から選択される。
前記医薬組成物は、例えば、最大９９重量％又は最大９０重量％又は最大８０重量％又は最大７０重量％の本発明のフェロポーチン阻害剤化合物を含み、残りはそれぞれ、である。薬理的に許容される担体及び／又は補助剤及び／又は溶媒及び／又は任意にさらなる薬学的に活性な化合物によって形成される。
ここで、薬学的に許容される担体、補助剤又は溶媒は、医薬目的、特に固体医薬製剤のために慣用的に使用される種々の有機若しくは無機担体及び／又は補助剤を含む、一般的な医薬担体、補助剤又は溶媒である。例としては、賦形剤（サッカロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）；結合剤（セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、サッカロース、デンプンなど）；崩壊剤（デンプン、加水分解デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのカルシウム塩、ヒドロキシプロピルデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウムなど）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウムなど）；香味剤（クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ粉末など）；保存剤（安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、パラベン（例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン）など）；安定剤（クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸及びｔｉｔｒｉｐｌｅｘシリーズの多価カルボン酸、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）など）；懸濁化剤（メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）；分散剤；希釈剤（水、有機溶剤など）；ワックス、脂肪及び油（ミツロウ、カカオ脂など）；ポリエチレングリコール；白色ワセリン等が挙げられる。
液剤、懸濁剤及びゲルなどの液体医薬製剤は、通常、水及び／又は薬学的に許容される有機溶媒などの液体担体を含む。さらに、このような液体製剤は、例えば、上で定義される、ｐＨ調整剤、乳化剤又は分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、ゼラチン化剤（例えばメチルセルロース）、染料及び／又は香味剤を含むこともできる。組成物は等張性であってもよい、すなわち血液と同じ浸透圧を有することができる。組成物の等張性は、塩化ナトリウム及び他の薬学的に許容される薬剤、例えば、デキストロース、マルトース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール及び他の無機又は有機可溶性物質を用いることによって調整することができる。液体組成物の粘度は、メチルセルロースなどの薬学的に許容される増粘剤によって調整することができる。他の好適な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択される薬剤に依存する。
液体組成物の貯蔵寿命を延ばすために薬学的に許容される保存剤を使用することができる。例えば、パラベン、チメロサール、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムを含む複数の保存剤も使用することができるが、ベンジルアルコールが適切であり得る。
併用療法
本発明のさらなる目的は、本明細書のいずれかの箇所で定義のフェロポーチン阻害剤化合物の１以上及び少なくとも一つのさらなる薬学的に活性な化合物（「併用療法化合物」）、好ましくは、本明細書で定義の重度のβ－サラセミアの治療、特にＴＤＴの治療で有用である追加の活性化合物を含む医薬品又は組み合わせ調製物に関するものである。好ましい併用療法化合物は、特に、鉄過剰症及び関連する症状の予防及び治療に使用される化合物である。最も好ましい併用療法化合物は、鉄キレート化合物、又は鉄過剰症及びβ－サラセミアを伴う又はそれに起因する状態、障害又は疾患のいずれかの予防及び治療のための化合物である。好適な併用療法化合物は、サラセミア、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球症、神経変性疾患（アルツハイマー病又はパーキンソン病など）及び関連する症状の予防及び治療のための薬学的に活性な化合物から選択され得る。好ましくは、少なくとも一つの追加の薬学的に活性な併用療法化合物は、鉄過剰症を低下させる薬剤（例えば、Ｔｍｐｒｓ６－ＡＳＯ）及び鉄キレート剤、特にはクルクミン、ＳＳＰ－００４１８４、デフェリトリン、デフェラシロクス、デフェロキサミン及びデフェリプロン、並びにヒドロキシル尿素又はＪＡＫ２阻害剤から選択される。鉄キレート化合物の群からの最も好ましい併用療法化合物はデフェラシロクスである。
さらなる好ましい併用療法化合物は、ラスパテルセプト、レンチグロビンＢＢ３０５（Ｂｌｕｅｂｉｒｄ Ｂｉｏ社によって開発された遺伝子療法）、合成ヒトヘプシジン（ＬＪＰＣ－４０１）、ヘプシジンペプチド模倣薬ＰＴＧ－３００及びＴｍｐｒｓｓ６を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＯＮＩＳ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＬＲ Ｘ）などのβ－サラセミアを治療するための薬剤から選択することができる。
さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義のフェロポーチン阻害剤化合物を、上記で定義される１以上の併用療法化合物との併用療法において、それを必要とする患者に投与される。固定用量で又は順次使用のための自由用量組み合わせで、上記で定義の併用療法化合物の１以上との併用療法で、処置を必要とする患者に投与する、本明細書で定義の新たな使用及び医学的治療に関する。そのような併用療法は、少なくとも一つの追加の薬学的に活性な化合物（薬物／併用療法化合物）と本発明で定義のフェロポーチン阻害剤化合物を同時投与することを含む。
固定用量併用療法での併用療法は、本明細書で定義のフェロポーチン阻害剤化合物と、固定用量製剤中の少なくとも一つの追加の薬学的に活性な化合物との同時投与を含む。
自由用量併用療法での併用療法は、個々の化合物の同時投与又はある期間にわたって分布された個々の化合物の順次使用のいずれかによって、個々の化合物の自由用量で、本明細書で定義のフェロポーチン阻害剤化合物及び少なくとも一つの追加の薬学的に活性な化合物の同時投与を含む。
特に好ましい実施形態において、併用療法は、以下に記載される実施例化合物Ｎｏ．１２７による経口フェロポーチン阻害剤及び鉄キレート剤デフェラシロクスの同時投与を含む。
本発明のさらなる実施形態は、フェロポーチン阻害剤化合物が、ＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１に記載されるものの中から選択されるもの、特に上記のそれの特定の実施例化合物の一つである、上記の併用療法に関する。好ましくは、そのような併用療法は、フェロポーチン阻害剤化合物及び鉄キレート剤デフェラシロクスの同時投与を含む。
図１：Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスからのＲＢＣにおける膜結合グロビンのＴＡＵゲル電気泳動分析。ＷＴ ＲＢＣからの可溶性α及びβヘモグロビンを基準として示している（左）。デンシトメトリーによるα－グロビン帯域のシグナル強度の定量（右）。治療群間の有意差を示す：＊＊＊ｐ＜０．００１（ボンフェローニの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図２：Ｆｐｎ１２７は、１日２回６０ｍｇ／ｋｇの経口投与を８（Ａ）又は１５（Ｂ）日行った後、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの成熟ＲＢＣにおけるＲＯＳレベルを低下させた。 図３：Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスの肝臓での、肝臓重量（左）、すべての動物の総Ｆｅ濃度（中央）、及び分離された雄（ｍ）及び雌（ｆ）の総Ｆｅ濃度（右）。個々の値と平均±ＳＤを表示している。ビヒクル処理されたＨｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定）。 図４：Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスの脾臓での、相対脾臓重量（左）、すべての動物の総Ｆｅ濃度（中央）、及び分離した雄（ｍ）と雌（ｆ）の総Ｆｅ濃度（右）。個々の値と平均を表示している。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図５：Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスの腎臓での、腎臓重量（左）、すべての動物の総Ｆｅ濃度（中央）、及び分離された雄と雌の総Ｆｅ濃度（右）。個々の値と平均を表示している。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋ＶＩＴ－２７６３群と比較した有意差を示している：＃ｐ＜０．０５（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図６：治療群におけるＨｂレベルの発達。１日目から研究終了までの、すべての動物（左上）、雄（Ｍ；左下）、及び雌（Ｆ；右下）Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおけるＨｂ。データは平均±ＳＤとして表される。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（二元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定）。 図７：第２３日の雄及び雌のＨｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスからの選択された血液学的パラメータ。個々の値を平均とともに示している。ビヒクルで処理されたＨｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差が示されている：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図８：第２３日の雄及び雌のＨｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスの血液中の白血球、好中球、及びリンパ球の数。ビヒクルで処理されたＨｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差が示されている：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析）。 図９：赤血球分化の異なる段階での脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。Ｔｅｒ１１９及びＣＤ４４に対する抗体で染色することにより、赤血球を確認した。赤血球の異なる発達段階を、親Ｔｅｒ１１９＋脾臓細胞のパーセントとして示している。個々の値と平均±ＳＤを表示している。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図１０：第２３日のＤＦＸの最終投与から１時間後に採取した雄及び雌のＨｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスからの血清サンプルで血清鉄、ＴＳＡＴ、及びＥＰＯを測定した。個々の値と平均±ＳＤを表示している。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定）。 図１１：第２３日のＤＦＸの最終投与から１時間後にサンプリングしたすべての治療群の血漿中のＤＦＸ及びＦｐｎ１２７の濃度。個々の値は平均で示している。 図１２：Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスでの細胞内ＲＯＳ、ＰＳ曝露（アネキシンＶ結合）、及び全血中ミトコンドリアの保持のフローサイトメトリー分析。ＲＯＳ陽性（左）、アネキシンＶ陽性（中央）、及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性（右）の成熟ＲＢＣのパーセントを、個々の値と平均±ＳＤとして示している。ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋群と比較した有意差を示している：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図１３：Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでの輸血（ＢＴ）後３時間での血漿中のＮＴＢＩ濃度に対するＦｐｎ１２７の効果。個々の値及び平均±ＳＤを示しており、ダネットの多重比較検定で一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、すべての処理群をビヒクル処理ＢＴ群と比較することによって統計解析を行った。＊ｐ＜０．０５、ｎ＝マウス４匹／群。
図中の「ＶＩＴ－２７６３」は、試験化合物Ｆｐｎ１２７（実施例化合物Ｎｏ．１２７）を示している。
以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。実施例は説明に過ぎず、当業者は、具体的な実施例を、本発明によるさらなるフェロポーチン阻害剤化合物に拡張することができる。
Ｉ．フェロポーチン阻害剤実施例化合物
本明細書に記載の具体的なフェロポーチン阻害剤実施例化合物番号１、２、４、４０、９４、１１８、１２６、１２７、１９３、２０６、２０８及び２３３の製造及びそれらの薬学的に許容される塩の製造に関しては、国際出願ＷＯ２０１７／０６８０８９、ＷＯ２０１７／０６８０９０及びＷＯ２０１８／１９２９７３を参照する。
ＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１に記載の具体的なフェロポーチン阻害剤化合物の製造に関しては、前記国際出願ＷＯ２０２０／１２３８５０Ａ１に記載されている製造方法を参照する。
ＩＩ．薬理アッセイ
ＩＩ．１ 中間型β－サラセミアのマウスモデルと輸血を組み合わせたＲＯＳバイオマーカーベースのＴＤＴマウスモデルにおけるフェロポーチン阻害剤実施例化合物Ｎｏ．１２７の効力
実施例化合物Ｎｏ．１２７（Ｆｐｎ１２７）による臨床段階の化合物などの経口で生物学的に利用可能なフェロポーチン阻害剤が、β－サラセミアのＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデルにおいて、無効造血を改善し、貧血を改善し、肝臓の鉄負荷を予防することが明らかになっている。臨床段階の実施例化合物Ｎｏ．１２７などのフェロポーチン阻害剤は、赤血球前駆体における有毒なアルファグロビン凝集体及び活性酸素種（ＲＯＳ）の形成のための鉄の利用可能性をさらに制限し、それによって無効造血を改善する。その結果、寿命が延びたより多くのＲＢＣによって貧血が改善され、組織の酸素化が改善される。
これに基づいて、本発明の発明者らは、前述のフェロポーチン阻害剤が、重症型のβ－サラセミア、特に輸血依存性サラセミア（ＴＤＴ）を治療するのに特に効率的であることを見出した。ＴＤＴの患者は、定期的な輸血（ＢＴ）のために重度の鉄過剰症を患っている。ＢＴはヘプシジンの一過性上昇を引き起こし、それはヘモグロビン（Ｈｂ）レベルが低下すると基底値に戻る（Ｐａｓｒｉｃｈａ Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． ″Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ．″ Ｂｌｏｏｄ， ２０１３； １２２（１）， １２４－３３）。輸血の合間の期間にフェロポーチン阻害剤による腸の鉄吸収を防ぐことは、ＴＤＴ患者のさらなる鉄負荷を減らすのに役立つ。さらに重要なことに、ＢＴは非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）を生成し、それは、損傷したＲＢＣを再利用するマクロファージによって放出され、酸化ストレスと血管損傷を引き起こす（Ｂａｅｋ Ｊ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， ″Ｉｒｏｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｒｅｄ ｂｌｏｏｄ．″ ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ２０１７； ２（９））。さらに、定期的なＢＴ及びキレート療法を受けているサラセミア患者はＮＴＢＩレベルが上昇しており、これは心臓病の存在と相関している（Ｐｉｇａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ″Ｈｉｇｈ ｎｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ．″ Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２００９； ８４（１）， ２９－３３）。
フェロポーチン阻害剤の実施例化合物Ｎｏ．１２７などの本発明による経口フェロポーチン阻害剤が、マクロファージ中の鉄を隔離し、したがってβ－サラセミアにおける悪循環を妨害することにより、これらの有害効果を防止する可能性があることが見出された。ＴＤＴ患者におけるヘモグロビンレベル、ＮＴＢＩレベル及びＬＰＩレベルに対するフェロポーチン阻害療法で達成される有益な効果により、本発明のフェロポーチン阻害剤化合物は、輸血されるＲＢＣ単位の低減、したがってＴＤＴ患者における輸血負荷の軽減を達成する可能性を有する。
標準治療として、ＴＤＴ患者は必然的に定期的ＢＴを含む。本実施例の輸血マウスモデルを用いて、輸血を組み合わせた新たに開発されたβ－サラセミアマウスモデルにおいてバイオマーカーを使用して、ＴＤＴの治療における本発明のフェロポーチン阻害剤化合物の有益な効果を求めることができる。
フェロポーチン阻害剤の効力は、実施例化合物Ｎｏ．１２７（Ｆｐｎ１２７）をフェロポーチン阻害剤化合物として使用して調べることができる。このフェロポーチン阻害剤化合物は、中間型β－サラセミアの改変Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスモデルに経口投与でき、これは、薬効を評価するためのバイオマーカーを使用した輸血の新たな投与法と組み合わせて、輸血β－サラセミアマウスモデルを提供する。ここで、８～１２週齢の雌雄のＨｂｂｔｈ３／＋マウス（性別ごとにｎ＝５）を、以下の試験群に分布させた（表１）。
Figure 0007554253000026
表１．試験群、マウス系統及び治療スケジュール。
マウスは、研究開始前の３日間、鉄含有量＜１０ｍｇ／ｋｇ未満の鉄食に適応させる。第１日に、マウスに、０．５ｍＭ５８のＦｅ（ＩＩ）ＳＯ４、１０ｍＭアスコルビン酸及び１％グルコースの存在下に飲料水中で製剤したビヒクル又はＦｐｎ１２７（１ｍｇ／ｍＬ）の投与を行う。安定な同位体補完５８Ｆｅの飲料水への補充によって、試験前又は試験中に吸収される食物摂取鉄間を区別することができる。ビヒクル群の飲用水に、０．５ｍＭ５８Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４、１０ｍＭアスコルビン酸及び１％グルコースを補充する。試験中（６週間）、マウスは、自由に飼料及び飲料水を自由に摂取できる。さらに、群３及び４のマウスには、すでに公開されている方法に従って（Ｃａｓｕ Ｃ ｅｔ ａｌ ″Ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ａｎｄ ｍａｊｏｒ″， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２０１７）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６ドナーマウス（（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＵＢＣ－ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／Ｊ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔｏｃｋ＃００４３５３））からのＲＢＣ輸血（血液３００μＬ）を行う。群３及び４のマウスには、Ｈｂ及びドナーのＧＦＰ－ＲＢＣカウントのレベルに応じて、第１４日及び第２８日にＢＴを行う。
以下の基準を用いて、追加のＢＴの必要性を判断する。
・第１４日に、群１及び３の平均と比較することで統計的差（ｔ検定）が検出されない形で、群３の平均Ｈｂレベル（Ｈｂｂｔｈ３／＋／ビヒクル／ＢＴ）が群１の値（Ｈｂｂｔｈ３／＋／ビヒクル）に近い場合、第１４日に第２のＢＴを行う。同じ手順が、第２８日に行う可能性がある第３のＢＴにも適用される。
・群３での平均Ｈｂレベルが群１からの値と統計的に異なる（より高い）場合、第１４日のＢＴは実行しない。このような場合、群１及び３のＨｂを第２１日に測定し、群１と３のＨｂ値が統計的に有意に異なっていない場合には、第２のＢＴを行うことができると考えられる。
第１日（初回ＢＴ後）、その後ＢＴの前には週１回、及び試験終了時に、従来の方法に従ってフローサイトメトリーによって、ドナーＧＦＰ－ＲＢＣカウントを評価する。
ＢＴとＨｂｂｔｈ３／＋マウスでの鉄負荷の低減との間の間隔中のフェロポーチン阻害剤による腸鉄吸収の防止の指標として、ＢＴ前の隔週の間隔で従来法に従って、血清ヘプシジンを評価する。
研究終了後（ｄ４２）、下記で記載の方法を用いて、血清鉄、ＮＴＢＩ、ＬＰＩ、エリスロポイエチン、ＴＳＡＴ、Ｈｂ、全血球計算値、脾臓及び肝臓重量、脾臓及び骨髄における赤血球形成、脾臓及び肝臓の鉄含有量及びＲＢＣ膜におけるアルファグロビン凝集体などの広範囲の血液学的パラメータについてマウスを分析する。
ＢＴの存在下又は非存在下でのフェロポーチン阻害剤、例えばＦｐｎ１２７の効力を評価するための特定のバイオマーカーとして、ＲＢＣ中のアルファグロビン凝集体の定量化を用いる。沈殿したアルファ－グロビン凝集体は、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成するヘム及び鉄を含むため、ＲＢＣの寿命が短くなり、貧血や組織低酸素に至る。
ＩＩ．２ Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスのＲＢＣにおけるアルファ－グロビン凝集体形成の減少
赤血球膜に関連するα－グロビンの検出と定量化：
既報の方法に従って（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｓ， Ｒｕｂｉｎ Ｅ， Ｐｏｌｓｔｅｒ Ｈ， Ｍｏｈａｎｄａｓ Ｎ， Ｓｃｈｒｉｅｒ Ｓ． ″Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．″ Ｂｌｏｏｄ． １９９０ Ｍａｒ １５；７５（６）：１３３３－６）、各群からのマウスの新鮮なＥＤＴＡ血液サンプルを蓄積し（マウス２匹からの血液／プール）、溶解し、膜脂質を抽出した。不溶性膜画分を、トリトン酢酸尿素（ＴＡＵ）ゲルでの電気泳動によって分離し、クーマシー染色によって視覚化した（Ａｌｔｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ， Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ４４：５２７， １９８０）。α－グロビン帯域のシグナル強度を、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ｖ．３ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＬＡＳ－４０００ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いるデンシトメトリーによって定量した。
ＴＡＵゲル電気泳動によるアルファグロビン凝集体の分析により、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋動物と比較して、Ｆｐｎ１２７処理Ｈｂｂｔｈ３／＋動物のＲＢＣ膜骨格調製物における有毒なα－グロビン／ヘム凝集体のレベルの有意な用量依存的低下が示された（図１）。
ＩＩ．３ Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおけるＲＯＳ＋ＲＢＣの割合の低下
ドナーＧＦＰ－ＲＢＣでのＲＯＳレベルに対するフェロポーチン阻害剤、例えばＦｐｎ１２７の効果を、市販の遠赤色発光ＲＯＳ感受性センサーでモニタリングすることができる。
ＢＴ非存在下では、Ｆｐｎ１２７は、その化合物の経口投与の第８日現在でＨｂｂｔｈ３／＋マウスのＲＢＣにおけるＲＯＳレベルを低下させた（図２Ａ）。ＲＯＳレベルは１５日間の治療後にさらに低下した（図２Ｂ）。これらのデータは、Ｆｐｎ１２７などの本発明のフェロポーチン阻害剤がＨｂｂｔｈ３／＋マウスでの赤血球形成に比較的急速な効果を及ぼし、したがってＲＢＣにおけるＲＯＳレベルを適切なバイオマーカーとして使用して、本明細書に記載のＢＴと組み合わせた新規なＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデルでのフェロポーチン阻害剤の効力を評価することができることを示している。
ＩＩ．４ Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでのＮＴＢＩ及びＬＰＩレベルに対するＦｐｎ１２７の効果
上記のように、ＴＤＴにおけるＢＴは、損傷したＲＢＣを再利用するマクロファージからのフェロポーチン介在の鉄排出の結果として血漿ＮＴＢＩレベルの上昇をもたらす（Ｐｉｇａ Ａ． ｅｔ ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００９）。ＢＴと組み合わせたＦｐｎ１２７などの本発明のフェロポーチン阻害剤の投与は、血漿ＮＴＢＩ（及びＬＰＩ）のレベル及び関連する有害作用を低減する可能性を有する。
Ｆｐｎ１２７は、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでＢＴによって生成される非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の放出を防ぐ。
輸血（ＢＴ）後のＨｂｂｔｈ３／＋マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２－Ｈｂｂ－ｂ１ｔｍ１Ｕｎｃ Ｈｂｂ－ｂ２ｔｍ１ Ｕｎｃ／Ｊ、＃００２６８３）でのＮＴＢＩ生成の動態を確認するため、パイロット実験を実施した。Ｈｂｂｔｈ３／＋の野生型（ＷＴ）同腹仔を、輸血用の血液ドナーとして用いた。雌マウス３～５匹から眼窩後方経路を介して終末麻酔したＷＴマウスから、末梢血を採取し、血液７部を１４％クエン酸－リン酸－デキストロースアデニン１部と混合し、輸血まで４℃で保存した（２４時間又は１５日）。輸血前に、ドナー血液を３７℃に予熱した。１２週齢のＨｂｂｔｈ３／＋マウスに、１２０ｍｇ／ｋｇのＦｐｎ１２７又はビヒクル（ｄｄＨ２Ｏ中の０．５％メチルセルロース）の単回経口投与を行った。投与の３０分後、マウスに、尾静脈注射によりＷＴ血液０．２ｍＬを輸血した。ＢＴを受けていないビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの群を非輸血対照として用いた。ＢＴの３時間後に終端麻酔マウスから採血を行った。
Ｇｏｓｒｉｗａｔａｎａ Ｉらによって公開されたプロトコル（不飽和トランスフェリンの存在下での非トランスフェリン結合鉄の定量。Ｇｏｓｒｉｗａｔａｎａ Ｉ， Ｌｏｒｅａｌ Ｏ， Ｌｕ Ｓ， Ｂｒｉｓｓｏｔ Ｐ， Ｐｏｒｔｅｒ Ｊ， Ｈｉｄｅｒ ＲＣ． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９９ Ｓｅｐ １０；２７３（２）：２１２－２）から調整した、Ｆｅ－ニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）ベースのアッセイによって、マウス血漿サンプルでＮＴＢＩを測定した。最初に、８００ｍＭニトリロトリアセテート酸（ＮＴＡ）三ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、７２５６５）の溶液及び８００ｍＭ ＮＴＡ二ナトリウムの溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｎ０１２８）を調製し、次に、一緒に混合して、ｐＨ７．０の溶液を得た。第２に、血漿サンプル（ヘパリン中で調製）９０μＬを、８００ｍＭ ＮＴＡ溶液１０μＬとともに室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間中、ＮＴＡはタンパク質非結合鉄（ＮＴＢＩ）をキレートし、トランスフェリン結合鉄を妨害しない。一方、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋｄａ， Ｍｅｒｃｋ ＵＦＣ５０１０９６）を、０．５ｍｌの１０ｍＭ ＮＴＡ（８００ｍＭ ＮＴＡ溶液の１：８０希釈）で前洗浄し、１００００ｇで１０分間遠心し、続いて脱イオン水による２段階洗浄を行い、それぞれ１００００ｇで１０分間遠心沈降させた。インキュベーション後、サンプルをフィルターに移し、４℃で１時間にわたり１００００ｇで遠心分離した。比色分析に基づくＦｅ－ＮＴＡ測定の場合、６０ｍＭのバソフェナントロリンジスルホン酸（ＢＤＡ、Ｓｉｇｍａ、１４６６１７）及び１２０ｍＭのチオグリコール酸（ＴＧＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ６７５０－１００ｍＬ）を調製し、１：１の比で混合した。Ｆｅ－ＮＴＡ １０ｍＭ原液を脱イオン水で連続希釈（５０－１０－５－２．５－１．２５－０．６２５－０μＭ）することで、標準曲線を得た。Ｆｅ－ＮＴＡ原液は、２ｍｍｏｌ（０．５５０ｇ）のＮＴＡ三ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、７２５６５）と１ｍｍｏｌ（０．２７０ｇ）の塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物（Ｓｉｇｍａ、３１２３４）を１ｍＭ ＨＣｌ １００ｍＬ中で混合することによって事前に調製した。限外ろ過サンプル６０μＬ又は鉄標準液６０μＬを、９６ウェルプレートでＢＤＡ－ＴＧＡ溶液３０μＬと混合した。室温で３０分間インキュベートした後、サンプルをプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃ）において５３７ｎｍで測定した。
輸血されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスは、ビヒクルのみを投与された対照の非輸血動物と比較して、輸血後３時間でより高い血漿中ＮＴＢＩレベルを示した（図１３）。興味深いことに、Ｆｐｎ１２７の投与は、輸血後の循環中のＮＴＢＩの増加を防いでおり、そのことは、フェロポーチンの阻害が輸血誘発性鉄過剰からＨｂｂｔｈ３／＋マウスを保護する可能性があることを示唆している。
さらなる試験設定では、ＢＴの非存在下でのＨｂｂｔｈ３／＋マウスにおけるＮＴＢＩのレベルを、ビヒクル又はＦｐｎ１２７などの本発明のフェロポーチン阻害剤のいずれかで６週間処理されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスで調べる。既報であるニトリロトリアセテート－ＮＴＢＩ法（ＮＴＡ－ＮＴＢＩ）（Ｓｉｎｇｈ Ｓ， Ｈｉｄｅｒ ＲＣ， Ｐｏｒｔｅｒ ＪＢ．″ Ａ ｄｉｒｅｃｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ．″ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９０ Ｍａｙ １；１８６（２）：３２０－３）にわずかな変更を加えて使用する。
すなわち、８００ｍＭ ＮＴＡ（ｐＨ５．７）０．０２ｍＬをマウス血清プール０．１８ｍＬに加え、２２℃で３０分間静置する。溶液を、Ｗｈａｔｍａｎ Ｖｅｃｔａｓｐｉｎ超遠心分離装置（３０ｋＤａ）を１２３２０ｇで使用して限外ろ過し、限外ろ過液（０．０２ｍＬ）を、５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）中の５％アセトニトリル及び３ｍＭデフェリプロン（ＤＦＰ）で平衡とした高速液体クロマトグラフィーカラム（ＣｈｒｏｍＳｐｈｅｒ－ＯＤＳ、５μＭ、１００ｘ３ｍｍ、適切な保護カラムを備えたガラスカラム）に直接注入する。次に、ＮＴＡ－鉄錯体が交換して、Ｗａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイによって４６０ｎｍで検出されるＤＦＰ－鉄錯体を形成する。８０ｍＭ ＮＴＡ中で調製された標準濃度の鉄の注入を用いて、検量線を作成する。サンプルの処理と標準の調製に使用される８００ｍＭ ＮＴＡ溶液を２μＭ鉄で処理して、試薬を汚染するバックグラウンド鉄を正規化する。これは、それがＮＴＡ錯体としての追加されたバックグラウンド鉄を含むことから、ゼロ標準が正のシグナルを与えることを意味している。不飽和トランスフェリンが血清中に存在する場合、この追加のバックグラウンド鉄を空のトランスフェリン部位に提供して、バックグラウンドシグナルを失わせ、負のＮＴＢＩ値を得ることができる。
ＮＴＢＩも、Ｇａｒｂｏｗｓｋｉ ＭＷ， Ｍａ Ｙ， Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ Ｓ， Ｓｒｉｃｈａｉｒａｔａｎａｋｏｏｌ Ｓ， Ｈｉｄｅｒ Ｒ， Ｐｏｒｔｅｒ ＪＢ． ″Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｉｒｏｎ ｖａｌｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｅａｄ ａｓｓａｙ．″ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ． ２０１６に記載の代替法（ＣＰ８５１ビーズ－ＮＴＢＩ）アッセイを使用して測定される。このアッセイの標準は次のように調製される。１００ｍＭ ＮＴＡ及び１８ｍＭ原子吸光標準鉄溶液から調製した１ｍＭの鉄－ＮＴＡ錯体（１：２．５モル比）を、ＭｉｌｌｉＱ水で０～１００μＭの最終濃度に希釈する。標準曲線については、プローブ標識ビーズ懸濁液１２０μＬを既知濃度の緩衝ＮＴＡ－鉄溶液２０μＬと室温で２０分間インキュベートし、続いて野生型マウスからの対照血清（遊離鉄なし）２０μＬ及び最終濃度２％のパラホルムアルデヒド（ＭＯＰＳ中１０％）４０μＬを加える。密封９６ウェルプレート中の懸濁液を振盪しながら３７℃で１６時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによる蛍光測定を行う。鉄濃度が不明な血清サンプルの場合、１４０μＬ量のビーズを血清サンプル２０μＬと２０分間インキュベートし、続いて最終濃度２％のパラホルムアルデヒド４０μＬを添加する。キレート可能な蛍光ビーズを対照として野生型マウスからの血清と混合して蛍光を１００％に設定し、それに応じてキレート可能な蛍光ビーズとＨｂｂｔｈ３／＋マウスからの血清との相対蛍光を計算する。測定はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００フローサイトメーターで行い、分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアで行う。ゲートは、未処理のビーズ集団のドットプロットに基づいた。１０，０００事象の蛍光中央値を記録し、ビーズの自己蛍光について補正を行った。検量線を、可変勾配Ｓ字形用量応答関数に適合させた。
ＮＴＢＩは、トランスフェリンと強く会合していないすべての形態の血清鉄を含み、化学的及び機能的に不均一である。ＬＰＩは、酸化還元活性とキレート性の両方であり、臓器に浸透して組織の鉄過剰を誘発することができるＮＴＢＩの構成成分を代表するものである。ＬＰＩアッセイ（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ＢＰ１， Ｂｒｅｕｅｒ Ｗ， Ｓｉｒａｎｋａｐｒａｃｈａ Ｐ， Ｐｏｏｔｒａｋｕｌ Ｐ， Ｈｅｒｓｈｋｏ Ｃ， Ｃａｂａｎｔｃｈｉｋ ＺＩ． ″Ｌａｂｉｌｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ ｉｎ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ： ｒｅｄｏｘ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ．″ Ｂｌｏｏｄ． ２００３）は、所定のサンプルがＲＯＳを産生する鉄特異的能力を測定し、病的な鉄過剰症に関与する最も関連性の高い反応性鉄種の一つと考えられる。
ＦｅＲＯＳ（商標名）ＬＰＩキット（Ａｆｅｒｒｉｘ Ｌｔｄ．）を用いて、ＢＴの存在下又は非存在下で６週間にわたり、ビヒクル又はＦｐｎ１２７などの本発明のフェロポーチン阻害剤のいずれかで処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスの血清中のＬＰＩを測定する。
ＢＴを受けるＨｂｂｔｈ３／＋マウスにおけるＮＴＢＩ及びＬＰＩレベルは、経口フェロポーチン阻害剤療法の効率の評価を可能にする翻訳マーカーとして役立つことがわかっている。
このモデルは、ＴＤＴ患者におけるフェロポーチン阻害剤（例えばＦｐｎ１２７など）の投与法を最適に設計するのにも用いることができる。それにより、輸血（ＢＴ）及び経口フェロポーチン阻害剤投与の組み合わせを用いて、ＴＤＴの最適な併用療法を確立することができる。
上記のモデル及び実施例を使用すると、輸血の負担を改善し、輸血依存性β－サラセミアの有害な副作用を改善する上での経口投与フェロポーチン阻害剤の能力を実証することが可能である。
ＩＩＩ．ＲＢＣ中のアルファグロビン凝集体の測定
血液サンプルを１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で氷冷ＤＰＢＳで３回洗浄し、氷冷低張溶解緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｕｌｔｒａプロテアーゼ阻害剤を含むｐＨ７．６、Ｒｏｃｈｅ）で溶解させる。可溶性Ｈｂを採取して、ゲルの標準として使用する。低張溶解緩衝液に再懸濁し、２１，０００×ｇで遠心分離することにより、赤血球ゴーストをさらに３回洗浄する。膜脂質を、５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロテアーゼ阻害剤で抽出する。３０，０００ｘｇで最後の３０分間遠心した後、上清を完全に除去し、膜細胞骨格に相当するトリトン不溶性ペレットを急速凍結する。ＴＡＵポリアクリルアミドゲル（１２％アクリルアミド／０．０８％ビスアクリルアミド（６０：０．４％アクリルアミド／ビス－アクリルアミド、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、５％酢酸、６Ｍ尿素（両方ともＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を投入し、ＳＥ６６０高標準デュアル冷却垂直電気泳動ユニット（Ｈｏｅｆｅｒ）で運転させる。重合後、ゲルを、５％酢酸中、陽極を一番上にして１４０Ｖで３．５時間にわたり、次に、ゲルをスカベンジャー溶液（１Ｍシステアミン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５Ｍ尿素、５％酢酸と重ねて２００Ｖでさらに３時間にわたり前電気泳動する。膜細胞骨格をＴＡＵサンプル緩衝液（６Ｍ尿素、５％酢酸、５％β－メルカプトエタノール、０．０２％ピロニンＹ（どちらもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから））１００μＬに溶かし、ウェルあたり２０μＬを負荷した。サンプルを２００Ｖ定電流で終夜電気泳動し、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅＧ－２５０で染色する。
ＩＶ．輸血負担
本発明の方法に従って治療される対象者における輸血負荷は、例えば、従来の及び臨床的に認められた評価による赤血球輸血の必要量及び／又は回数を介して、患者の輸血要件を決定することによって評価することができる。
Ｖ．鉄レベル
例えば、肝臓又は心筋の鉄レベルなどの鉄レベルは、従来のアッセイを使用して測定することができる。例えば、鉄レベル（例えば、肝臓鉄濃度又は心筋鉄濃度）は、磁気共鳴画像法によって求めることができる。
ＶＩ．血清フェリチンレベルの決定
血清フェリチンレベルは、従来のアッセイを使用して決定することができる。
ＶＩＩ．赤血球応答
赤血球応答の持続時間を、次のアルゴリズムを使用して応答を達成する被験者について計算することができる。
応答の第１日＝応答を示す最初の１２週間間隔の第１日。
応答の最終日＝応答を示す最後の連続１２９週間間隔の最終日。
最終評価日＝まだ薬物を服用している被験者の最終来院日、又は治療を中止した被験者の中止日のいずれか。
赤血球応答の持続時間は、その応答が最終評価日より前に終了するか否かに応じて、次のように計算できる。
１．応答が治療期間の終わりまで継続せず、応答の期間が打ち切られず、次のように計算される被験者：
応答期間＝応答の最終日－応答の第１日＋１；
２．治療期間の終了後に赤血球応答を示し続け、応答の終了日が打ち切られ、応答の持続時間を次のように計算される被験者：
応答期間＝最後の応答評価の日付－応答の第１日＋１。
最初の赤血球応答までの時間は、次のように計算できる。
治験薬の初回投与から応答開始の第１日までの日を、以下の式を使用して計算する。
応答までの時間＝応答の第１日－初回治験薬の日付＋１。
ＶＩＩＩ．ヘモグロビン測定
ヘモグロビンレベルは、従来のアッセイを使用して求めることができる。
ＩＸ．生活の質
生活の質の評価は、Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ（３６） Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｖｅｙ（ＳＦ－２６）を用いて評価することができ、及び／又は例えばＷＯ２０１６／１８３２８０に記載されているＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｅｓｓｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ａｎｅｍｉａ（ＦＡＣＴ－Ａｎ）を使用することができる。
Ｘ．モルモットにおける赤血球輸血後の血漿鉄、酸化ストレス及び腎障害を減弱させるフェロポーチン阻害剤ＶＩＴ－２６５３（実施例化合物Ｎｏ．４０）の効力
ＴＤＴの治療における本発明のフェロポーチン阻害剤化合物の効力は、Ｊ． Ｈ． Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ． ″Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｉｒｏｎ， ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ， ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ″； Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０２０ Ｍａｒ； ６０（３）：５１３－５２３の結果によってさらに確認されている。
前記実験は、本発明の実施例化合物Ｎｏ．４０に相当する小分子フェロポーチン阻害剤ＶＩＴ－２６５３を静脈投与することによって実施され、本発明の所見をさらに裏付けるものである。
交換輸血後のＮＴＢＩ及びＨｂレベルは、フェロポーチン阻害剤の投与によって大幅に改善された。
また、輸血後の腎臓の総鉄分は、フェロポーチン阻害剤の投与によって低下させることができる。腎鉄負荷に対する循環Ｈｂの寄与と、それに続く酸化ストレス及び細胞傷害への効果を評価したところ、輸血されたモルモットへのフェロポーチン阻害剤の投与により、早期急性腎障害（ＡＫＩ）の指標として使用される血漿クレアチニン＞０．３ｍｇ／ｄＬにおける変化の発生が大幅に減ることが明らかになった。
実験の詳細及び試験条件及び具体的な研究結果は、言及した論文から導き出すことができる。
ＸＩ．β－サラセミアのマウスモデルにおけるフェロポーチン阻害剤の実施例化合物Ｎｏ．１２７（Ｆｐｎ１２７）及びデフェラシロクスとの併用療法
ＸＩ．１ 緒言
上記で説明したように、キレート療法による鉄過剰症の管理は、β－サラセミアの従来の治療、特にＴＤＴなどのそれの重症型の治療において主な焦点となっている。しかしながら、鉄キレート化は、基礎にある疾患機序を標的とするものではない。ヘプシジン合成の誘発又はヘプシジン模倣物の補給による不均衡な鉄吸収を矯正することが、β－サラセミアにおける調節不全の鉄代謝を正常化することが示されている（Ｃａｓｕ Ｃ， ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， ２０１８）。フェロポーチン阻害剤化合物Ｎｏ．１２７（Ｆｐｎ阻害剤Ｎｏ．１２７；Ｆｐｎ１２７）による鉄利用能の制限は、中間型β－サラセミアのＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデルにおける貧血及び調節不全の鉄恒常性を改善することが示されている（Ｍａｎｏｌｏｖａ Ｖ， ｅｔ ａｌ： ″Ｏｒａｌ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ″； ＪＣＩ， ２０１９）。多くのβ－サラセミア患者がキレート療法を受けていることから、本発明の発明者らは、従来の鉄キレート剤デフェラシロクス（ＤＦＸ）とＦｐｎ１２７の同時使用が中間型β－サラセミアのＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデルにおける何らかの治療的相互作用を引き起こすか否か及び本発明によるそれぞれの併用療法における可能性を調べた。
ＸＩ．２ マウスモデル試験システムの選択
ヘテロ接合性Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスは、無効造血、貧血、脾腫及び臓器鉄過剰を特徴とする患者において、輸血非依存性β－サラセミアを厳密に再現する表現型を示す。内因性ヘプシジン又はヘプシジンアゴニストを誘発する実験薬を用いるＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデルを使用したいくつかの公開された研究により、鉄キレート化と組み合わせたＦｐｎの阻害による鉄制限が、鉄過剰を減らし、ｔｈ３／＋マウスにおける貧血を改善する有効なアプローチであることが明らかになった（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＰＪ， ｅｔ ａｌ， Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０１５， Ｃａｓｕ Ｃ， ｅｔ ａｌ， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２０１５ ａｎｄ Ｃａｓｕ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ， ２０１６）。したがって、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスは現在、β－サラセミアの新規な治療法を調べるために利用できる最良の動物モデルを代表するものであり、ＴＤＴなどのさらにより重度の形態でのそれぞれの有効性の指標としてさらに役立つ可能性がある。
ＸＩ．３ 試験のセットアップ
この試験の目的は、３週間にわたり、３０ｍｇ／ｋｇで単独で、又は１２０ｍｇｈｋｇで１日１回（ＱＤ）投与されるＦｐｎ１２７と組み合わせて、ＱＤ投与される鉄キレート剤ＤＦＸの同時使用が、中間型β－サラセミアのマウスモデル（Ｈｂｂｔｈ３／＋；Ｂ６；１２９Ｐ－－ｂ１ｔｍ１Ｕｎｃ－ｂ２ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ：００２６８３）で何らかの治療相互作用を引き起こしているか否かを調べることにあった。これらのマウスは、βメジャー及びβマイナーの両方のＨｂ遺伝子の標的欠失を有している（Ｙａｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， １９９５）。
Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスに、低鉄食（ｌｉｄ）を１８時間与え、ＤＦＸ投与の３時間後から１日６時間標準食（ｓｄ）を摂取させた。試験第２３日（投与第１７日）にＤＦＸの最終投与から１時間後に動物を屠殺した。血液及び臓器（脾臓、肝臓、及び腎臓）を採取して、血清パラメータに対する化合物の効果を分析した。
この試験は、動物保護法に完全に準拠したものである。
試験化合物Ｆｐｎ１２７を、０．５％メチルセルロース（ＭＣ）に溶かした３×ＨＣｌ塩の形態で１５．２４ｍｇ／ｍＬで投与して、１０ｍＬ／ｋｇ容量で１２０ｍｇ／ｋｇのＦｐｎ１２７遊離塩基の動物への投与量を提供しておいた。
ＤＦＸは、Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（カタログ番号Ｄ１０６３）から提供され、３ｍｇ／ｍＬで３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒに溶かして、３０ｍｇ／ｋｇでの動物への投与量を提供した。
Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ｃ５１３５、ロットＢＣＢＶ８９６８）から購入し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ精製水で３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（ｗ／ｖ）溶液を作った。
３０ｍｇ／ｋｇでのＤＦＸ単独の１日投与量が、３週間（ＷＥなし）にわたり十分に耐容され、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおける肝臓鉄を減らすのに優れた効力を示した。したがって、この併用試験では、ＤＦＸの最大用量として３０ｍｇ／ｋｇを選択した。給餌法を選択して、消化管でキレート剤が食餌鉄と接触するのを防いだ（投与後３時間のｌｉｄ）。試験期間全体にわたりｌｉｄを給餌する過去の試験で自発的肝臓脱鉄化が観察されたことから、ｓｄへのアクセス制限（６時間）を導入して、モデルのダイナミックレンジを改善した。経口投与Ｆｐｎ１２７は、げっ歯類において約２時間の比較的短い半減期を有する。ラットでの１００ｍｇ／ｋｇの単回経口投与により、少なくとも８時間血清鉄濃度の低下が起こされる。慢性状況では、１日２回６０ｍｇ／ｋｇの用量が確立され、いくつかの試験で一貫した効力が示された。この試験では、両方の化合物を経口投与する必要があったため、本発明者らは、経口投与の回数を最小限に抑えるために、Ｆｐｎ１２７について１日１回１２０ｍｇ／ｋｇの単回経口投与を選択した。試験された用量での各化合物の蓄積は、それらの半減期が中等度であることから予想していない。
表２．治療群の概要。雄（ｍ）及び雌（ｆ）のマウスを各群で使用した。
＊ビヒクルはＭｉｌｌｉ－Ｑ精製水中の３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ及びＭｉｌｌｉ－Ｑ精製水中の０．５％メチルセルロースである。
＊＊ＤＦＸとＦｐｎ１２７は３時間離して投与する。
＊＊＊ＷＴはｔｈ３／＋繁殖からの繁殖同腹仔として得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスである。
Figure 0007554253000027
ＸＩ．４ マウスの治療
表３．治療群及び適用用量、濃度及び計画。
＊ビヒクルはＭｉｌｌｉ－Ｑ精製水中の３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ及びＭｉｌｌｉ－Ｑ精製水中の０．５％メチルセルロースである。
＊＊ＤＦＸとＦｐｎ１２７は３時間離して投与する。
＊＊＊ＷＴはｔｈ３／＋繁殖から繁殖同腹仔として得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスである。
Figure 0007554253000028
ｌｉｄに切り替えた１日後、基底線Ｈｂレベルを求めるために、尾静脈切開によって採血を行った。ＨｂはＨａｅｍｏＣｕｅ（登録商標）装置を用いて測定した。Ｈｂは、投与前の午前中第８、１５、２２日にも測定した。動物には、２３日間の試験中、合計１７回の投与において、３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ中の３０ｍｇ／ｋｇ ＤＦＸ、０．５％ＭＣ中の１２０ｍｇ／ｋｇ Ｆｐｎ１２７、又はその両方を経口投与した。３０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ及び０．５％のＭＣをビヒクルとして投与した。ＤＦＸの用量は、暗サイクル（活動期）開始時９：００に投与し、その後３時間ごとにｌｉｄ摂取させた。次に、マウスにＦｐｎ１２７（又は０．５％ＭＣ）を投与し、６時間にわたりｓｄを摂取させてから、ｌｉｄに戻した。ＷＥについては、投薬を休止し、マウスには自由にｌｉｄを摂取させた。
すべての懸濁液／溶液は、渦攪拌することによって混合し、直後に投与した。好適な注射器に取り付けられたバルブド（ｂｕｌｂｅｄ）針（カタログ番号１９１３００、Ｐｒｏｖｅｔ， Ｌｙｓｓａｃ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、１０ｍＬ／ｋｇで強制経口投与を行った。すべての投与量は、数秒以内にボラスとして投与した。
ＸＩ．５ 連続観察
臨床観察及び死亡率
動物及びそのケージは、作業日の試験中に実験者が毎日チェックした。実験段階では、１週間に最低１回は動物の体重を測定し、それの臨床症状：ＢＷ、行動及び活動全般、被毛状態の外観、目及び鼻に従って評点した。臨床観察がある場合は、別のスコアシートに記録した。
体重
ＢＷは、第－１日の実験段階の開始前に１回記録した。実験段階では、投与体積を計算し、体重減少をモニタリングするために、個々のＢＷを１週間に１～２回記録した。
ヘモグロビン
Ｈｂは、第１、８、１５、及び２２日に測定した。個々のＨｂ値は、実験の開始日（第１日）とその後は実験期間中、週１回、最初の１日用量前の午前中に測定した。尾静脈切開により採血を行い、ＨｅｍｏＣｕｅ（登録商標）ＤＭ２０１ Ｈｂ光度計を用いてＨｂを測定した。
屠殺及び臓器サンプリング
試験終了後（第２３日）に、イソフルランを用いて動物に死亡直前まで麻酔を施し、眼窩後出血によってＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管（カタログ番号３６５９６７及び３６５９７５）に血液を採取した。その後、個々の動物を頸椎脱臼によって屠殺した。
最終試験研究日（第２３日）に、脾臓、肝臓、及び腎臓を採取し、以下に概説するようなさらなる分析のために液体窒素で急速冷凍した。脾臓、肝臓、腎臓の湿重量を記録した。
組織鉄
総Ｆｅの含有量は、ｔｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｖｉｆｏｒ （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） Ｌｔｄ．， Ｓｔ． ＧａｌｌｅｎのＩＣＰ－ＯＥＳによって、脾臓、肝臓、及び腎臓の断片で測定した。
血液学及び赤血球形成
全血球計算を、社内の自動血球分析装置（ＰｒｏＣｙｔｅ Ｄｘ（登録商標）、ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で新鮮なＥＤＴＡ血液について行った。
雌マウスの脾臓における赤芽球細胞分化の異なる段階を、ＰＥ結合ラット抗マウスＣＤ７１（トランスフェリン受容体－１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２－０７１１）、ＡＰＣ結合ラット抗マウスＴｅｒ１１９（赤血球系統マーカー、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７－５９２１）及びＡＰＣ－Ｃｙ７結合ラット抗マウスＣＤ４４（発生中の赤血球細胞の表面で徐々に減少する接着分子、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０３０２８）抗体を用いてフローサイトメトリー（ＣＡＮＴＯＩＩサイトメーター、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって確認した。データは、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、バージョン１０．１）を用いて解析した。
血清パラメータ
第２３日（試験終了）に、投与の１時間後、血清鉄、トランスフェリン、エリスロポイエチン、及び化合物曝露を測定するために、死亡直前（ｐｒｅ－ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）麻酔を施したマウスから眼窩後方出血によりＢＤマイクロテナーチューブ（カタログ番号３６５９６７及び３６５９７５）に血液を採取した。続いて、麻酔を施した動物を、頸椎脱臼によって屠殺した。
鉄の血清レベルを、ＭＵＬＴＩＧＥＮＴ鉄アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号６Ｋ９５）を用いて三連で測定した。血清トランスフェリン（Ｔｆ）を、製造者の説明書（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５７７２４）に従って、マウス特異的ＥＬＩＳＡを用いて二連で測定した。トランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）を、次の式を用いて計算した。
Figure 0007554253000029

血清ＥＰＯを、製造者の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９５９）に従って、マウス特異的ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。Ｆｐｎ１２７及びＤＦＸの血漿中濃度を、ＧＶＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｙｄｅｒａｂａｄ， ＩＮで測定した。
細胞内ＲＯＳ、ミトコンドリア、及びＰＳ曝露のフローサイトメトリー分析
第２２日に尾静脈切開によって採取された末梢血において、ＲＯＳを指示薬クロロメチル－２′，７′－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、ミトコンドリアの存在を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、ＰＳ曝露を、Ｔｅｒ１１９及びＣＤ７１抗体で標識された成熟ＲＢＣにおいてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。
すべての分析について、細胞はＣＡＮＴＯＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、データはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、バージョン１０．２）を用いて解析した。
ＸＩ．６ データ管理
体重
個々の値を記録した。グラム単位でのＢＷの平均±ＳＤを、記録日に各群について計算した。ＢＷはグラフ表示している。
組織鉄
臓器の個々の湿重量を記録した。総Ｆｅの個々の値を、肝臓、脾臓、及び腎臓で測定した。総Ｆｅ含有量及び濃度の個々の値を計算した。肝臓、脾臓、及び腎臓における総Ｆｅ及び含有量の平均±ＳＤを各群について計算した。臓器重量及び総Ｆｅ濃度をグラフ表示している。
ヘモグロビン
個々の値を記録した。ｇ／Ｌ単位のＨｂレベルの平均±ＳＤを、測定日に各群について計算した。Ｈｂレベルはグラフ表示している。
血液学及び赤血球形成
血液パラメータの個々の値を記録した。各群について平均±ＳＤを計算した。選択された血液学的パラメータをグラフ表示する。
雌マウスの脾臓における赤血球分化段階の割合を個別に記録した。各群における各画分の平均±ＳＤを計算し、グラフ表示している。
血清パラメータ
血清鉄の個々の平均を、二連の測定値から計算した。Ｔｆ及びＥＰＯレベルを、二連測定値から求めた。ＴＳＡＴを、Ｔｆ及び血清鉄濃度から計算した。血清鉄、ＴＳＡＴ、及びＥＰＯの平均±ＳＤを各群について計算した。血清鉄、ＴＳＡＴ、及びＥＰＯのデータをグラフ表示している。
細胞内ＲＯＳ、ミトコンドリア、及びＰＳ曝露のフローサイトメトリー分析
ＲＯＳ、ミトコンドリア、及びアネキシンＶについて陽性染色する赤血球のパーセントを個別に記録した。各群の平均±ＳＤを計算し、グラフ表示している。
ＸＩ．７ 統計解析
ＢＷデータ及びＨｂについての統計解析を、時間経過効果の反復測定を行う二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実行した。有意な効果が観察された場合、ダネットの多重比較検定を用いて事後検定を実行した。他のすべてのパラメータの解析では、対応する図の凡例に示されているように、ダネットの多重比較検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡを実行した。雄と雌を別個に分析するために、ダネットの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを実行した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。統計解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を用いて実行した。
ＸＩ．８ 結果
臨床観察、評点及び死亡率
Ｆｐｎ１２７及びＤＦＸ投与ＱＤは一般に良好に耐容され、試験の２３日間に臨床症状は全く観察されなかった。動物７（Ｈｂｂｔｈ３／＋ビヒクル）は、第１４日から第１７日までＢＷの＞２０％を失い、動物福祉上の理由で屠殺した。最もあり得る理由として、この動物は強制経口投与時に負傷し、食物摂取で衰弱したものである。動物７はそれ以降のすべての解析から除外される。
体重
マウスの平均ＢＷを表４にまとめている。
表４．研究全体における治療群のＢＷ発達。データは、治療群あたりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。値は、すべての動物について、及び雄及び雌について別々に表示されている。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的に有意な差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000030
Figure 0007554253000031
Figure 0007554253000032
Figure 0007554253000033
第１日のＢＷは、２４．５±１．４ｇ（ｔｈ３／＋ビヒクル雄）；１９．３±１．６ｇ（ｔｈ３／＋ビヒクル雌）；２３．７±１．３ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ雄）；１９．２±１．３ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ雌）；２４．７ｇ±１．１（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７雄）；２０．０±０．８ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７雌）；２５．１±１．０ｇ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７雄）；１９．４±１．０ｇ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７雌）；２４．４±０．８ｇ（ＷＴビヒクル雄）；及び２０．５±１．１ｇ（ＷＴビヒクル雌）であった。２３日間で、ＢＷは、すべての群でわずかに増加するか、一定のままであった（表４）。成長が見られないのは、かなりの部分、本試験で使用した動物の年齢に起因する可能性がある。全体として、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウス（雄及び雌）又はＷＴマウスと比較した場合、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでは、試験期間中（最終ＢＷは屠殺前日に量った。ｄ２２）、１日１回Ｆｐｎ１２７で処理した後のＢＷに影響はなかった。ＤＦＸ単独又はＦｐｎ１２７との組み合わせによる雄の治療により、ビヒクル治療Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスと比較して、試験終了までにわずかではあるが有意に低いＢＷとなった。
組織鉄
肝臓重量を試験終了後に評価した。ＷＴマウス（１０５３±１６９ｍｇ）と比較してｔｈ３／＋マウス（１１７６±１９６ｍｇ）の肝臓重量に差はなかった。Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスをＤＦＸ、Ｆｐｎ１２７、又は両方のＱＤで処理しても、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスと比較した場合に、肝臓重量に対して影響はなかった（表５；図３）。
総肝臓鉄濃度（μｇ／ｇ）は、ＷＴマウス（８８．２±２５．７μｇ／ｇ）と比較してｔｈ３／＋マウス（３４８．２±７５．４μｇ／ｇ）で強く上昇した（表５、図３）。ＤＦＸ単独又はＦｐｎ１２７との併用による治療は、ビヒクル処理ｔｈ３／＋マウスと比較した場合、総肝臓鉄濃度を有意に低下させた（図３、中央）：３４８．２±７５．４μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ビヒクル）；１９６．３±６２．５μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；及び１７８．９１±５４．４μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）。ＤＦＸ単独及びＦｐｎ１２７との併用の効力は同等であった。すでに示したように、Ｆｐｎ１２７単独では、肝臓の鉄濃度に影響はなかった：３３２．２±７５．２μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）。
試験終了後に、脾臓の重量を評価し、ＢＷに対して正規化した（ｄ２３）。相対的脾臓重量（体重のパーセントとして表される）は、ＷＴ動物（０．２８±０．０６％）と比較してＨｂｂｔｈ３／＋動物（１．９４±０．３６％）で有意に高かった（図４、表６）。Ｆｐｎ１２７単独又はＤＦＸと組み合わせてのＨｂｂｔｈ３／＋マウスの治療は、ｔｈ３／＋動物の相対的脾臓重量を有意に低下させたが、ＤＦＸ単独では効果を示さなかった（図４、表６）：１．９４±０．３６％（ｔｈ３／＋ビヒクル）。１．９８±０．２６％（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；０．９２±０．１３％（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）；及び０．９９±０．１８％（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）。
総脾臓鉄濃度（μｇ／ｇ）は、ＷＴマウス（５９６．９±１６４．４μｇ／ｇ）と比較してＨｂｂｔｈ３／＋マウス（１６６４．０±１８５．６μｇ／ｇ）で強く上昇した（表６、図４）。ＤＦＸ単独の治療効果は総脾臓鉄濃度に関しては認められなかったが、Ｆｐｎ１２７単独又はＤＦＸとの組み合わせでの治療は、ビヒクル処理ｔｈ３／＋マウスと比較してｔｈ３／＋マウスにおける脾臓鉄濃度を有意に上昇させた（表６、図４）：１６６４．０±１８５．６μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ビヒクル）；１５５３．０±１４４．７μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；３０５１．０±２５８．４μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）；２７３８．０±３００．８μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）；及び５９６．９±１６４．４μｇ／ｇ（ＷＴビヒクル）。脾臓鉄濃度については性差は観察されなかった（図４、下）。Ｆｐｎ１２７で治療されたｔｈ３／＋マウスにおける脾臓鉄濃度の上昇は、脾臓マクロファージにおけるフェロポーチン阻害の結果としての脾臓重量の減少及び鉄の保持に関連している。
腎臓の重量を、試験終了後に評価した。腎臓の重量は、ＷＴマウス（２８６±３４ｇ）と比較してＨｂｂｔｈ３／＋マウス（２９７±５５ｇ）において相違はなかった（図５）。Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスをＤＦＸ、Ｆｐｎ１２７、又は両方の化合物で処理しても、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスと比較した場合、腎臓重量に影響はなかった（表７、図５上）。
総腎臓鉄濃度（μｇ／ｇ）は、ＷＴマウス（７５．３±６．５μｇ／ｇ）と比較してＨｂｂｔｈ３／＋マウス（１５５．５±４２．９μｇ／ｇ）で有意に上昇した（表７）。すべての処理で、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスと比較して総腎臓鉄濃度が有意に低下した（図５中央）：１５５．５±４２．９μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ビヒクル）。１２５．１±２２．２μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；９６．６±１２．８μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）；１２６．７±２３．６μｇ／ｇ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）；及び７５．３±６．５μｇ／ｇ（ＷＴビヒクル）。驚くべきことに、ＤＦＸとＦｐｎ１２７の組み合わせは、ＤＦＸ又はＦｐｎ１２７単独と比較して肝臓鉄濃度の大幅な低下をもたらした（それぞれｐ＝０．０２及びｐ＝０．０１）。この相加効果は、ＤＦＸによる鉄除去と、Ｆｐｎ１２７による腎臓へのさらなる鉄の負荷の防止による可能性があると考えられる。腎臓鉄濃度については性差は観察されなかった（図５、下）。
表５．試験終了後の治療群における肝臓重量及び鉄濃度。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000034
Figure 0007554253000035
表６．試験終了後の治療群における脾臓重量及び鉄濃度。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000036
Figure 0007554253000037
表７．試験終了後の治療群における腎臓重量及び鉄濃度。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000038
Figure 0007554253000039
ヘモグロビン
Ｈｂ濃度を、第１日及びその後週１回（第８、１５、２２日）に投与する前に全血で測定した。その日の最初の用量の前に採血を行った。Ｈｂｂｔｈ３／＋動物は、投与前（第１日）に、ＷＴ動物と比較して有意に低下したＨｂレベルを示した（図６、表８）：８３±３ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ビヒクル雄）；９０±３ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ビヒクル雌）；８２±３ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ雄）；８６±２ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ雌）；８６±６ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７雄）；８７±３ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７雌）；８５±６ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７雄）；８５±４ｇ／Ｌ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７雌）；１５３±３ｇ／Ｌ（ＷＴビヒクル雄）；及び１５４±５ｇ／Ｌ（ＷＴビヒクル雌）。研究期間中、Ｈｂレベルは、Ｆｐｎ１２７単独又はＤＦＸと組み合わせて治療されたＨｂｂｔｈ３／＋動物で経時的に上昇した（図６）。ＤＦＸ単独では、第８日のみでＨｂレベルに一時的上昇が生じた。有意な性差は観察されなかった。
血液学及び赤血球形成
血液学的パラメータを、試験最終日（第２３日）に採取された全血サンプルで測定した。Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスは、調べたすべての血液学パラメータにおいてＷＴマウスとは有意に異なっていた（表９）。ＤＦＸ単独では、ＲＢＣ数、ヘマトクリット値、ＲＤＷ、網状赤血球数などのＲＢＣ指標を改善しなかった。これらすべてのパラメータは、Ｆｐｎ１２７単独で又はＤＦＸと組み合わせて処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスで有意に改善され、赤血球生成効率の改善を反映している（表９、図７）。
Ｆｐｎ１２７単独で又はＤＦＸと組み合わせて処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスの白血球、好中球、及びリンパ球の数は、ＷＴと同様のレベルに減少した。しかしながら、ＤＦＸ単独では、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおける総白血球数及びリンパ球数に有意な変化はなかった（表９、図８）。興味深いことに、ＤＦＸ単独によるＨｂｂｔｈ３／＋マウスの処理により、好中球数に有意な増加があり、それは潜在的な炎症応答を示している。単球の数は、いかなる処理によっても影響を受けなかった（データは不図示）。
β－サラセミアでは、赤血球前駆体の分化が制限され、アポトーシスが増加することで、髄外造血と骨髄及び脾臓での赤血球拡大が生じる。Ｆｐｎ１２７が、未成熟赤血球細胞の割合を減少させ、一方でＨｂｂｔｈ３／＋マウスのＢＭ及び脾臓における成熟ＲＢＣを増加させることがすでに明らかになっている。したがって、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでは、脾臓において赤血球前駆細胞のパーセントが高く、成熟ＲＢＣのパーセントが低かった（図９、表１０）。ＤＦＸ単独では、この表現型を元に戻すことはできなかった。対照的に、Ｆｐｎ１２７単独で又はＤＦＸと組み合わせて処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスにおいて、未成熟赤血球細胞のパーセントが著しく減少し、ＲＢＣのパーセントが増加し（図９、表１０）、それは無効造血の減少及び分化の増加を示している。
要約すると、鉄キレート化単独ではＨｂｂｔｈ３／＋マウスの血液学パラメータを改善しなかったが、ＤＦＸの存在下又は非存在下でのＦｐｎ１２７は、赤血球形成を改善した。
表８．全試験期間における治療群のＨｂ濃度［ｇ／Ｌ］。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。平均値は、すべての動物、及び雄及び雌で別々に表示されている。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000040
Figure 0007554253000041
表９．試験終了後に各治療群からのすべてのマウスの選択された血液パラメータ。データは、治療群あたりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。血液パラメータに性差が観察されなかったため、男性と女性を別々に表示していない。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000042
Figure 0007554253000043
表１０．試験終了後にフローサイトメトリーによって測定されたＨｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスの脾臓における赤血球細胞集団。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000044
血清パラメータ
第２３日にＤＦＸ投与（最終日にはＦｐｎ１２７を投与しなかった）の１時間後に試験を終了し、血清鉄、Ｔｆ、計算ＴＳＡＴ、ＥＰＯ、及び複合血漿曝露の分析のために血清及び血漿を採取した。
ビヒクル処理ｔｈ３／＋動物及びＷＴ動物と比較して、血清鉄は、Ｆｐｎ１２７（２０時間前に投与した最終投与）単独又はＤＦＸと組み合わせて投与したＨｂｂｔｈ３／＋動物で有意に減少したが、ＤＦＸ単独で処理したマウスでは変化は観察されなかった（図１０左、表１１）：２８．７±５．８μＭ（ｔｈ３／＋ビヒクル）；３０．８±５．９μＭ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；２３．１±３．５μＭ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）；１９．９±３．３μＭ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）；及び２９．９±２．８μＭ（ＷＴビヒクル）。Ｆｐｎ１２７の最終用量から約２０時間後のＨｂｂｔｈ３／＋マウスでの血清鉄の減少は以前の試験と同様に予想外であり、血清鉄は、１２０ｍｇ／ｋｇＦｐｎ１２７を２０時間投与したＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスにおいて基底線レベルに回復した。一つの可能性は、Ｈｂｂｔｈ／３＋マウスにおけるＦｐｎ１２７の血漿曝露が、ＷＴマウスと比較して２０時間で異なることである。この疑問を扱うには、Ｈｂｂｔｈ３／＋及びＷＴマウスを使用したＰＫＰＤ試験が必要である。性差は認められなかった。
ＴＳＡＴは、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋動物の方がＷＴ動物より有意に低かった。ＴＳＡＴレベルは主に血清鉄レベルを反映しており、Ｆｐｎ１２７単独で処理されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスで有意に低下し、ＤＦＸとの組み合わせでは、ある傾向を示している（図１０中央、表１１）。血清鉄の変化がないことと一致して、ＤＦＸ単独はＴＳＡＴに影響を与えなかった。
血清ＥＰＯ値は、ＷＴ群でのＥＰＯ値と比較して、すべてのＨｂｂｔｈ３／＋群で大きく変動した。以前に示したように、ＥＰＯレベルは、ＷＴ動物（１４７０±５６６ｐｇ／ｍＬ）と比較して、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋動物（７１４４±３２１６ｐｇ／ｍＬ）で有意に上昇した。Ｆｐｎ１２７単独又はＤＦＸとの組み合わせによる処理は、Ｈｂｂｔｈ３／＋動物でのＥＰＯレベルを低下させたが、ＤＦＸ単独では統計的有意差に達しなかった（表１１；図１０、下）：７１４４±３２１６ｐｇ／ｍＬ（ｔｈ３／＋ビヒクル）；５２７７±１７１０ｐｇ／ｍＬ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ）；４４６０±１３３０ｐｇ／ｍＬ（ｔｈ３／＋ＤＦＸ＋Ｆｐｎ１２７）、３９３８±１１６７ｐｇ／ｍＬ（ｔｈ３／＋Ｆｐｎ１２７）；及び１４７０±５６６ｐｇ／ｍＬ（ＷＴビヒクル）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる化合物濃度の測定のために、第２３日にＤＦＸ投与の１時間後に、血漿を採取した。ＦＸの血漿曝露は、ＤＦＸ単独又はＦｐｎ１２７と組み合わせて投与された動物で同様であった（図１１、表１２）。同様に、Ｆｐｎ１２７の血漿曝露は、ＤＦＸの存在下又は非存在下で同等であった。予想通り、Ｆｐｎ１２７の最後の投与から約２０時間後に血漿をサンプリングしたため、Ｆｐｎ１２７の血漿レベルは低かった。
表１１．試験終了後の治療群の血清鉄濃度、ＴＳＡＴ及びＥＰＯレベル。データは、治療群あたりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000045
表１２．試験終了後のＤＦＸ及びＦｐｎ１２７の血漿曝露。データは、治療群あたりの示された動物数（ｎ）の平均及びＳＤとして表される。ｎｄ：値の測定せず。
Figure 0007554253000046
細胞内ＲＯＳ、ＰＳ曝露、及びミトコンドリアのフローサイトメトリー分析
β－サラセミアでは、Ｈｂのα－及びβ－グロビン鎖の不均衡な合成により、ヘミクロム、遊離ヘム及び鉄を含む不溶性α－グロビン凝集体が形成され、活性酸素種（ＲＯＳ）の形成とＲＢＣのアポトーシスが引き起こされる。蛍光指示薬ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを使用する血中ＲＯＳのフローサイトメトリー分析は、単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７が、ビヒクル又はＤＦＸ単独で処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスと比較してＲＯＳ産生ＲＢＣの割合を有意に低下させることを明らかにした（表１３、図１２上）。
サラセミアの患者及びマウスからのＲＢＣの原形質膜は、損傷されたリン脂質及びタンパク質構成を有しており、その結果、ＰＳが外膜に曝露されてアポトーシスにつながった。アネキシンＶ染色で示されるように、Ｆｐｎ１２７単独での処理は、ＰＳ陽性ＲＢＣの割合を有意に低下させた（表１３、図１２中央）。ＤＦＸ単独ではＰＳ曝露に影響はなかったが、Ｆｐｎ１２７と組み合わせたＤＦＸは、ＰＳ曝露低下の方向の有意ではない傾向を示した。
ＲＢＣは解糖によってエネルギーを産生し、成熟すると健常個体の網状赤血球はマイトファジーによってミトコンドリアをクリアする（Ｚｈａｎｇ Ｊ．， Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２００９）。しかしながら、サラセミアではマイトファジーは不完全であり、成熟したＲＢＣは、酸化的リン酸化の結果としてＲＯＳを生成するミトコンドリアを含む。単独又はＤＦＸと組み合わせてのＦｐｎ１２７で処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスは、ビヒクル処理及びＤＦＸ処理したＨｂｂｔｈ３／＋マウスと比較して、ミトコンドリアを含むＲＢＣが少なく（表１３、図１２の下）、これはＦｐｎ１２７のみがＲＢＣの成熟を改善することを示唆している。
要約すると、ＤＦＸは酸化ストレス、アポトーシス、成熟に関してＲＢＣ機能を改善しなかったが、単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７による治療により、ＲＢＣの質が改善された。
表１３．試験終了後（死亡直前（ｐｒｅ－ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）ｄ２２）の全血中のマーカー陽性成熟ＲＢＣのパーセント。データは、治療群当たりの示された動物数の平均±ＳＤとして表される。ｔｈ３／＋ビヒクル群との統計的有意差は、太字の値で示されている。
Figure 0007554253000047
ＸＩ．９ 結論
ＤＦＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｐｎ１２７（１２０ｍｇ／ｋｇ）及び両方の化合物の組み合わせの１７日間の投与は、雄及び雌のＨｂｂｔｈ３／＋マウスのＢＷに有意な影響を与えず、良好に耐容された。
サラセミアマウスは、肝臓、脾臓、腎臓の鉄含有量が高いのに比べてヘプシジンレベルが不十分に低く、十二指腸でのＦｐｎ発現が増加した結果、過剰量の鉄を吸収する（Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， ２００７）。ビヒクル、ＤＦＸ、Ｆｐｎ１２７、又は両方の組み合わせのいずれかで処理されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスの臓器の総鉄含有量を、誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ－ＯＥＳ）によって分析した。
単独又はＦｐｎ１２７と組み合わせたＤＦＸの投与を受けたＨｂｂｔｈ３／＋マウスの肝臓中の総鉄濃度は、ビヒクル処置マウスのものと比較して有意に低下した。以前に示したように、Ｆｐｎ１２７単独では、肝臓の鉄濃度を下げることができなかった。
Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおける腎臓の総鉄濃度は、ビヒクル処理マウスと比較して、すべての化合物処理マウスで有意に低下した。予期せぬことに、Ｆｐｎ１２７とＤＦＸの組み合わせは、いずれかの処置単独よりも、腎臓の鉄濃度を低下させるのに強力であった。これらのデータは、Ｆｐｎ１２７がキレート治療を妨害しないこと、及びＦｐｎ１２７とＤＦＸの併用療法が、いずれか処置単独よりも、腎臓の鉄濃度を低くすることにより、驚くべき相乗効果があることを明瞭に示している。
ＤＦＸ単独の投与は臓器鉄濃度の低下に奏功したが、それは、脾臓重量（図４）、Ｈｂ（図６）、ＲＢＣ及び網状赤血球数、ヘマトクリット値（図７）、血清ＥＰＯ（図１０）などの赤血球形成のパラメータを改善しなかった。これらパラメータはいずれも、単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７で処理されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスで大幅に改善され、赤血球生成効率の向上を示している。これらの結果と一致して、赤血球前駆体の拡大が、Ｆｐｎ１２７投与を受けたすべての群の脾臓で有意に低下したが（図９）、ＤＦＸ単独は効果がなかった。
特に、単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７は、ビヒクル処理マウスと比較して、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでのＨｂレベルを有意に上昇させた。Ｆｐｎ１２７又はその組み合わせを投与されたマウスにおけるＨｂレベルの変化は、ビヒクル処理マウスと比較して、研究終了までにそれぞれ１３ｇ／Ｌ及び１８ｇ／Ｌに達した。単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７によるＨｂｂｔｈ３／＋マウスの処理によって、ＲＢＣ数、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）が増加し、網状赤血球数及びＲＢＣ分布幅（ＲＤＷ）が減少し、それは赤血球形成の改善を反映したものであった。ＤＦＸ単独での処置は、赤血球形成を改善しなかった。さらに、単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７は、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの血中の白血球数をＷＴマウスの正常レベルに直したが、ＤＦＸ単独は効果を示さなかった。
Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスを単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７で処置すると、脾臓重量が大幅に減少したが、ＤＦＸ単独は効果を示さなかった。赤血球形成を、Ｔｅｒ１１９／ＣＤ４４マーカーによって識別され、フローサイトメトリーによって分析された、脾臓における分化中の赤血球前駆体のパーセントを分析することによっても調べた。ＤＦＸの存在下及び非存在下でのＦｐｎ１２７は、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの脾臓における初期赤血球前駆体前赤芽球、好塩基性、多染性、及び正染性赤芽球のパーセントを大幅に減少させ、ビヒクル処理Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスと比較して成熟ＲＢＣのパーセントを増加させ、ＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７で処置したら、それはビヒクル群と比較して有意に低かった。ＤＦＸ単独での処置も、血清ＥＰＯレベル低下の傾向を示したが、統計的有意性には達しなかった。
さらに、Ｆｐｎ１２７の存在下でのみ、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの末梢血中の増加した白血球数は有意に減少し、それは、β－サラセミアでの炎症を軽減させるＦｐｎ１２７の可能性を示している。
Ｈｂのα－及びβ－グロビン鎖の不均衡な合成は、遊離ヘム及び鉄を含む不溶性α－グロビン凝集体の形成をもたらし、ＲＯＳ形成及び後期赤血球前駆細胞のアポトーシスを引き起こす。以前の研究で一貫して示されているように、Ｆｐｎ１２７は、ＲＯＳ陽性ＲＢＣのパーセントを大幅に低下させ、ミトコンドリアを含む成熟ＲＢＣの割合を低下させ、ＲＢＣ上のアポトーシスシグナル（ホスファチジルセリン、ＰＳ）を減少させた。
単独又はＤＦＸと組み合わせたＦｐｎ１２７による処置は、成熟ＲＢＣの品質も向上させた、すなわち、それは、細胞内ＲＯＳ産生が減少させ、ＰＳ曝露を減少させ、ミトコンドリアの保持を減少させた（図１２）。いずれの面でも、ＤＦＸはＲＢＣの品質を改善しなかった。
ＤＦＸとの併用治療は、ＲＢＣ表現型に対するＦｐｎ１２７の有益な効果を妨害しなかったが、ＤＦＸ単独は効果がなかった。
まとめると、本試験は、Ｆｐｎ１２７によるＦｐｎ阻害にもかかわらず、肝臓からのＤＦＸ誘発性鉄排泄が達成できることを示している。さらに、単独又はＤＦＸと一緒に投与されたＦｐｎ１２７は、貧血、赤血球形成の改善、及びｔｈ３／＋マウスの脾臓サイズの低下において同様の効力を示した。
それとともに、結果は、（ｉ）Ｆｐｎ１２７が鉄キレート化を妨害せず、（ｉｉ）赤血球形成に対するＦｐｎ１２７の正の効果が鉄キレート療法によって影響されないことを明瞭に示している。したがって、経口フェロポーチン阻害剤Ｆｐｎ１２７と鉄キレート剤ＤＦＸの同時投与は実行可能であり、確立された鉄過剰を逆転させ、β－サラセミアにおける赤血球形成を改善するという利点を提供する可能性がある。鉄キレート化とＦｐｎ１２７の組み合わせは、β－サラセミアのＨｂｂｔｈ３／＋モデルにおける赤血球形成を改善することで、確立された鉄過剰を逆転させるという利点を提供する。
これらのデータは、例えば特にはＴＤＴなどの重度の形態でのβ－サラセミアの治療における、本発明のフェロポーチン阻害剤と従来の鉄キレート療法、例えばデフェラシロクスとの併用療法の効力を裏付けるものである。

Claims (15)

  1. 輸血依存性β－サラセミアの治療で使用するための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    輸血依存性β－サラセミアの治療が、以下の輸血依存性β－サラセミアに関する特徴
    鉄過剰
    無効造血
    不足したヘモグロビンレベル
    貧血
    ＮＴＢＩレベルの上昇
    ＬＰＩレベルの上昇
    活性酸素種（ＲＯＳ）
    有害なアルファグロビン凝集体の形成
    の１つ以上の改善または軽減を意味する、前記医薬組成物。
  2. 請求項１に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    輸血依存性β－サラセミアの治療が、
    上昇した血漿ＮＴＢＩレベルの低下
    上昇した血漿ＬＰＩレベルの低下
    有害なアルファグロビン凝集体の制限
    の１つ以上を意味する、前記医薬組成物。
  3. 請求項１又は２に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記治療が、β－サラセミア及び／又はヘモグロビンＥ β－サラセミアを患い、定期的な輸血を必要とする患者に、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む前記化合物を投与することを含む、医薬組成物。
  4. 請求項３に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    定期的な輸血が、
    ａ）可変の後続の時間間隔での等しい赤血球（ＲＢＣ）単位の反復輸血、又は
    ｂ）等しい後続の時間間隔での等しいＲＢＣ単位の反復輸血、又は
    ｃ）等しい後続の時間間隔での可変のＲＢＣユニットの反復輸血、又は
    ｄ）可変の後続の時間間隔で、可変のＲＢＣ単位の反復輸血
    を含む、医薬組成物。
  5. 請求項４に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    定期的な輸血が２４週間当たり５回を超える輸血を意味する、医薬組成物。
  6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、患者が重症型β サラセミア及び／又は重度のヘモグロビンＥ β サラセミアを患っている、医薬組成物。
  7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    β－サラセミアを患い、定期的な輸血を必要とする患者が、
    ａ）β０／β０、β＋／β＋，β０／β＋、及びβ０／ＨｂＥから成る群からの遺伝子型、又は
    ｂ）２つの重大なヘモグロビンβ鎖変異の共遺伝を含む遺伝子型、
    及び任意に、遺伝性高胎児ヘモグロビン症をさらに有すること
    を特徴とする、医薬組成物。
  8. 請求項１から７のいずれか１項に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、
    β－サラセミアを患い、定期的な輸血を必要とする患者が、
    ａ）検出可能なＮＴＢＩレベルを示すこと、及び／又は
    ｂ）７ｇ／ｄＬ以下のＨｂレベルを有すること、及び／又は
    ｃ）５０～７０ １０ｆＬのＭＣＶを有すること、及び／又は
    ｄ）１２～２０ｐｇのＭＣＨを有すること
    を特徴とする、医薬組成物。
  9. 請求項１から８のいずれか１項に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記治療が、当該治療を必要とする患者への、前記化合物又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体の１以上の経口投与を含む、医薬組成物。
  10. 請求項１から９のいずれか１項に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記治療が、当該治療を必要とする患者に、５ｍｇ、１５ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ又は２４０ｍｇの用量；好ましくは体重＞５０ｋｇの患者については１２０ｍｇの用量及び体重＜５０ｋｇの患者については６０ｍｇの用量を１日１回又は２回投与することを含む、医薬組成物。
  11. 下記式
    の化合物が、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸及びトルエンスルホン酸からなる群からの酸との、
    好ましくはクエン酸、塩酸、マレイン酸、リン酸及び硫酸からなる群からの酸との薬学的に許容される塩の形態、又はその溶媒和物、水和物もしくは多形体の形態で存在する、請求項１から１０のいずれかに記載の使用のための化合物を含む医薬組成物。
  12. 請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物であって、下記化合物
    又は下記の塩：
    下記式を有する１：１硫酸塩：
    下記式を有する１：１リン酸塩：
    下記式を有する１：３ＨＣｌ塩：
    及びそれらの溶媒和物、水和物及び多形体の群から選択される前記化合物の薬学的に許容される塩を含む、前記医薬組成物。
  13. 請求項１から１２のいずれか１項で定義の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物がさらに、１以上の医薬担体及び／又は補助剤及び／又は溶媒、及び／又は１以上の追加の薬学的に活性な化合物を含む医薬組成物。
  14. 請求項１から１３のいずれか１項で定義の輸血依存性β－サラセミアを治療するための併用療法での使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記併用療法が、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む前記化合物の１以上の他の追加の薬学的に活性な化合物との共投与を含み、
    前記併用療法の前記共投与を、固定用量製剤でのその塩、溶媒和物、水和物及び多形体を含む前記化合物と、１以上の他の追加の薬学的に活性な化合物との共投与による固定用量併用療法で行うことができ、又は
    前記併用療法の前記共投与を、個々の化合物の同時投与又はある期間をかけて投与される個々の化合物の順次使用のいずれかにより、個々の化合物の自由用量でのその塩、溶媒和物、水和物及び多形体を含む前記化合物及び前記１以上の他の追加の薬学的に活性な化合物を共投与することによって自由用量併用療法で行うことができる、医薬組成物。
  15. 請求項１４に記載の使用のための、下記式
    による化合物、または該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物もしくは多形体を含む医薬組成物であって、前記追加の薬学的に活性な化合物が鉄キレート剤デフェラシロクスである、医薬組成物。
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