CN110013489A - 一种蚕蛹提取物及其制备工艺和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蚕蛹提取物及其制备工艺和应用，涉及蚕蛹提取技术领域。蚕蛹提取物的制备工艺包括以下步骤：a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；b.将蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；c.将清滤液反渗透浓缩或真空浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物。本发明提供一种蚕蛹提取物，提取物来源动物蛋白，经提取处理后必须氨酸符合人体氨基酸需求，各氨基酸组成合理，能够显著改善免疫功能，有效提高动物和人体免疫力；本发明还提供了蚕蛹提取物适合在增加免疫力的药品、保健食品中、食品、大健康养生产品运用。
Description
【技术领域】
本发明涉及蚕蛹提取技术领域，具体涉及一种蚕蛹提取物及其制备工艺和应用。
【背景技术】
根据中国膳食指南，研究者推算，一般成年人摄入250～300克以上主食、一个鸡蛋、150克瘦肉、100～150克豆类制品、300～500克牛奶，即可满足每日所需蛋白质。但我国目前每日摄入蛋白质水平低于世界平均水平，远低于FAO推荐的水平。消费人群在日常饮食中容易出现蛋白质摄入量不足，或摄入的蛋白质来源单一等问题，进而可能引发亚健康状态。随着人们对高质量生活、饮食的追求逐步提升、生活方式的高节奏运转，人们更倾向于能快速补充营养和解决上述问题的饮食方式。
免疫系统的构成都需要蛋白质，蛋白质对人体而言可以说是-没有蛋白质就没有生命。缺乏蛋白质会导致：营养不良，进行性消瘦；内分泌失调，免疫力低下；儿童发育迟缓、智力发育障碍等问题。蛋白质与肠道健康也息息相关,缺乏蛋白质对肠道带来的影响、以至于对整个免疫系统的影响是巨大的。
目前很多消费者和企业强调蛋白质对人体的重要性，以为只要进食更多的蛋白质便可以强身健体、促进发育等，而忽视蛋白质的主要适用人群特征以及各种蛋白质本身的氨基酸组成特性，未科学地对蛋白产品在机能的影响上作细致的点评。常常造成的问题是，由于补充的蛋白质来源较单一，氨基酸组成及配比不合理，造成非但没有达到补充蛋白提高免疫力的功效，甚至还会由于补充不合理蛋白质，造成蛋白摄入过多，蛋白不合理后的肥胖还会导致各种健康问题。
市面上大多产品主要原料分别为大豆蛋白、乳清蛋白，蛋白质来源较单一，无法满足亟需补充蛋白质人群对大量、持续性氨基酸的需求。同时只强调蛋白质对人体的重要性，却忽视蛋白质的主要适用人群特征以及各种蛋白质本身的氨基酸组成特性，涉及并针对缺乏蛋白质人群、亟需补充优质蛋白质人群；同时，该类人群常伴随有肠道健康问题，而相关蛋白质食品较少关注到此方面。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对因蛋白不足引起的健康问题时，特别是免疫低下时只注重补充蛋白质的数量，不注重补充蛋白来源，不关注补充蛋白质的氨基酸组成和配比，从而造成补充效果不理想甚至反效果的问题，本发明提供一种蚕蛹提取物，提取物来源动物蛋白，经提取处理后必须氨基酸符合人体氨基酸需求，各氨基酸组成合理，能够显著改善免疫功能，有效提高动物和人体免疫力；本发明还提供了蚕蛹提取物的应用范围。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种蚕蛹提取物的制备工艺，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；
b.将蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；
c.将清滤液真空或反渗透浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物。
步骤a中的粉碎方法可以选择干法粉碎或湿法粉碎。
经检测，本方法制备的蚕蛹提取物氨基酸比例适宜，各氨基酸的比例如下，天门冬氨酸：苏氨酸：丝氨酸：谷氨酸：脯氨酸：甘氨酸：丙氨酸：缬氨酸：蛋氨酸：异亮氨酸：酪氨酸：亮氨酸：苯丙氨酸：组氨酸：赖氨酸：精氨酸为0.21：0.26：0.35：0.54：0.61：0.23：0.36：0.24：0.14：0.17：0.19：0.03：0.12：0.31：0.27：0.25。
同时本发明蚕蛹提取物含大量生物活性成分，如干扰素，抗菌肽，超氧化物歧化酶(SOD)等。
该比例组成合理，含有成人人体所需要8种必需氨基酸中的6种，及含有儿童所额外必需氨基酸-组氨酸。成人人体必需氨酸与非必需氨酸的占比合理为34.17％，必需氨基酸占总氨酸酸的比例为25.47％。儿童必需氨酸与非必需氨基酸的占比合理为48.61％，必需氨基酸占总氨酸酸的比例为32.71％。
药理实验表明，相比正常对照组和拘束应激模型组，本发明制备的蚕蛹提取物能改善拘束应激导致的脾指数降低，改善免疫功能；蚕蛹提取物能改善拘束应激造成的免疫细胞凋亡，显著增加Th淋巴细胞的数目，增强免疫功能。蚕蛹提取物高剂量组能显著改善拘束应激造成的CD4+/CD8+T细胞下降，能显著提高拘束应激导致的脾T细胞增殖率下降，改善免疫功能；蚕蛹提取物组均能显著改善的巨噬细胞吞噬功能，进而改善免疫功能。
进一步优化的，在低温高压差连续提取前将蚕蛹细碎物采用超临界CO2萃取，萃取完成后再将蚕蛹细碎物的渣进行步骤b。
进一步优化的，所述超临界CO2萃取的萃取压力为25-35MPa，萃取温度为25-45℃，萃取时间为2-3h，分离压力为4-10MPa，分离温度为15-40℃。
通过超临界CO2萃取步骤后，可有效的去除蚕蛹中的蚕蛹油，蚕蛹油是一种附加值高，可以单独开发的产品，超临界萃取可将蚕蛹原料细分从而更好的进行综合开发利用，提高附加值；更重要的是，本发明目的是改善免疫力，去除蚕蛹油对免疫调节能力更好，蚕蛹提取物中氨基酸的含量提高，配比更合理，同时可有效降低蚕蛹油带来的腥味，显著改善口感，脂肪油含量下降，补充蛋白同时减少血液脂肪含量增加风险。
进一步优化的，得到蚕蛹提取物后进行喷雾干燥得到蚕蛹提取物喷干粉。
进一步优化的，按重量百分比计，在喷雾干燥前，以所述蚕蛹提取物为底物，加入30-85％的麦芽糊精或阿拉伯胶作为粘合剂，混合均匀后进行喷雾干燥。
蚕蛹提取物是一种动物提取物，保存过程中易变质，为保持蚕蛹提取物后续的加工便利，储存方便，本发明进一步将蚕蛹提取物进行喷雾干燥，可以不添加防腐剂的情况下，长时间保存蚕蛹提取物。蚕蛹提取物由于其本身特殊性，我们还对喷雾干燥的方法进行了筛选，实验发现添加麦芽糊精对提取物喷雾干燥后产品的腥味降低，并且成型好，利于后期加工。
进一步优化的，所述蚕蛹(干)原料的水分含量≤10％，鲜蚕蛹经低温干燥至水分含量不大于10％，所述蚕蛹细碎物粒径≤1.2mm。
进一步优化的，所述低温高压差连续提取溶剂为纯净水，所述低温高压差连续提取的压力为20-50MPa，提取温度为15-40℃，提取次数为1-3次。
进一步优化的，所述微滤的方法为：采用陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的过滤孔径为100-500nm。
蚕蛹是一种动物蛋白，本方法采用低温高压差连续提取方法，可以有效提取出蚕蛹中的氨基酸和活性成分，同时克服了多工序操作耗时、耗能的问题，具备连续生产可行性，特有的低温物理提取技术充分保留了蚕蛹生物活性成分营养价值。相比于通过酸提取、碱提取、有机溶剂提取或直接脱脂得到的蚕蛹蛋白，该设备保留了蚕蛹本身具有的天然活性成分，具有快捷、高效的优势。并且根据蚕蛹性质，得到提取关键控制指标，在温度不超过40℃的条件下完成提取，同时得出较优的提取温度为20-30℃范围内，即25℃附近效果较佳；提取压力为20-30MPa时可达到提取要求。
进一步优化的，采用高温瞬时灭菌。
上述任意一项制备工艺制备得到的蚕蛹提取物。
上述任意一项制备工艺制备得到的蚕蛹提取物在制备增强免疫调节药品、食品(含特殊医学用途食品)和/或保健食品、大健康养生产品中运用。
更优化的，在制备治疗或辅助治疗因脾细胞正常结构被破坏免疫细胞凋亡的药品和/或保健食品中应用。
更优化的，在制备提高巨噬细胞吞噬功能的药品和/或保健食品中应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
通过本发明工艺制备的蚕蛹提取物，在药学实验中具有很好的改善免疫功能作用，通过对其氨酸酸组成分析发现，其含有成人6种、儿童7种必需氨基酸，氨酸酸种类达16种、种类丰富，同时工艺最大程度的保留了蚕蛹的活性成分，从而具有良好的改善去免疫功能的作用。通过制剂学知识，可在制备增强免疫调节药品、食品(含特殊医学用途食品)和/或保健食品、大健康养生产品中运用。
工艺可以有效提取出蚕蛹中的氨基酸和活性成分，同时克服了多工序操作耗时、耗能的问题，具备连续生产可行性，特有的低温物理提取技术充分保留了蚕蛹生物活性成分营养价值。
【附图说明】
图1蚕蛹提取物对拘束应激小鼠脾脏指数影响的实验结果；
图2蚕蛹提取物对拘束应激小鼠T细胞亚群影响的实验结果；
图3蚕蛹提取物对拘束应激小鼠T细胞增殖率影响的实验结果；
图4蚕蛹提取物对拘束应激小鼠吞噬细胞吞噬功能影响的实验结果。
【具体实施方式】
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除另有说明外，本发明超临界CO2萃取蚕蛹细碎物采用的是现有技术装置--超临界液体萃取仪，包括放置待萃取物(蚕蛹细碎物)的萃取罐、存放CO2的储罐、分离器、回收装置，储罐内还包括液化器、高压泵、预热器；蚕蛹细碎物放置在萃取罐的萃取床上，萃取时储罐内CO2流向为依次经液化器、高压泵、预热器，CO2流体经加压至萃取压力、加热至萃取温度，输入至萃取罐，从萃取罐底部进入，流经蚕蛹床层，超临界CO2携带蚕蛹蛹油从萃取罐顶出来，萃取罐内超临界CO2调节CO2流体压力至分离压力、温度至分离温度，经分离器至回收装置，回收至储罐。实施例中各数值为仪器设备的设定值。
除另有说明外，蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液步骤中，上述操作均在高效高压差低温连续式提取分离浓缩器中进行，该设备的结构可参见我公司已申报专利：专利号CN200920304058.X，一种连续式提取分离浓缩器,公开(公告)号CN201505465U。实施例中各数值为仪器设备的设定值或提取过程中设备的实时数值范围。
除另有说明外，本发明采用的真空浓缩设备为现有技术，溶液温度不超过40℃，最优不超过30℃。
实施例1
1.一种蚕蛹提取物的制备工艺，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；本实施例中蚕蛹原料选自鲜蚕蛹，鲜蚕蛹直接湿法粉碎，蚕蛹原料粉碎后用筛网孔径为1.2mm的筛网进行过筛，得到蚕蛹细碎物。
b.将蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；本实施例中低温高压差连续提取溶剂为纯净水，所述低温高压差连续提取的压力为20-30MPa，提取温度为20-25℃，提取次数为2次。所述微滤的方法为：采用陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的过滤孔径为100微粒。
c.将清滤液真空浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物。
实施例2
1.一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；本实施例中蚕蛹原料选自干蚕蛹，干蚕蛹的水分含量经检测为8％，蚕蛹原料粉碎后用筛网孔径为1.0mm的筛网进行过筛，得到蚕蛹细碎物。
b.将蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；本实施例中低温高压差连续提取溶剂为纯净水，所述低温高压差连续提取的压力为25-35MPa，提取温度为15-23℃，提取次数为1次。所述微滤的方法为：采用陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的过滤孔径为200微粒。
c.将清滤液真空浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物。
实施例3
取实施例1或2中的样品，按重量百分比计，加入相当于总重量85％的麦芽糊精作为底料，以所述蚕蛹提取物为底物，混合均匀后进行喷雾干燥，得蚕蛹提取物喷干粉。
可以理解，按重量百分比计，还可以分别加入相当于总重量30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、75％、85％，以及30-85％范围内任一数值的麦芽糊精作为底料，均有较好的喷干效果，并可以不同程度改善蚕蛹提取物的口感，减少提取物腥味；上述方案不影响本发明的产品的功能效果，不改变本发明产品的营养配比，可实现本发明目的。
将本实施例1和2中制备得到的样品(含有85％麦芽糊精)，混合均匀后，送自广州检验检测认证集团有限公司检验，检验依据：参照GB5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》对本样品进行氨基酸种类及各氨基酸比例进行检测，检测结果如下：
本实施例中，按重量份比计，各氨基酸的比例如下：天门冬氨酸：苏氨酸：丝氨酸：谷氨酸：脯氨酸：甘氨酸：丙氨酸：缬氨酸：蛋氨酸：异亮氨酸：酪氨酸：亮氨酸：苯丙氨酸：组氨酸：赖氨酸：精氨酸为0.21：0.26：0.35：0.54：0.61：0.23：0.36：0.24：0.14：0.17：0.19：0.03：0.12：0.31：0.27：0.25。
该比例组成合理，含有成人人体所需要8种必需氨基酸中的6种，及含有儿童所额外必需氨基酸—组氨酸。成人人体必需氨酸与非必需氨酸的占比合理为34.17％，必需氨酸占总氨酸酸的比例为25.47％。儿童必需氨酸与非必需氨酸的占比合理为48.61％，必需氨酸占总氨酸酸的比例为32.71％。
同时最大程度的保留了蚕蛹中活性成分。
送检样品中含有85％麦芽糊精，扣除辅料含量，蚕蛹提取物中的氨基酸占物质总量的比例高。
实施例4
取实施例2中的样品，按重量百分比，加入相当于总重量40％的阿拉伯胶作为粘合剂，以所述蚕蛹提取物为底物，混合均匀后进行喷雾干燥，得蚕蛹提取物喷干粉。
可以理解，按重量百分比计，还可以分别加入相当于总重量30％、35％、45％、50％、55％、65％、75％、85％，以及30-85％范围内任一数值的阿拉伯胶作为底料，均有较好的喷干效果，并可以不同程度改善蚕蛹提取物的口感，减少提取物腥味；上述方案不影响本发明的产品的功能效果，不改变本发明产品的营养配比，可实现本发明目的。
实施例5
一种蚕蛹提取物的制备工艺，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；本实施例中蚕蛹原料选自鲜蚕蛹，鲜蚕蛹粉碎，后用筛网孔径为1.0mm的筛网进行过筛，得到蚕蛹细碎物。
b.将蚕蛹细碎物采用超临界CO2萃取，提取完成后得蚕蛹细碎物渣；本实施例中，所述超临界CO2萃取的萃取压力为35MPa，萃取温度为25℃，萃取时间为3h，分离压力为10MPa，分离温度为15℃。
c.将步骤b中蚕蛹细碎物渣采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；低温高压差连续提取溶剂为纯净水。低温高压差连续提取的压力为30-50MPa，提取温度为20-30℃，提取次数为1次。
d.将步骤c中清滤液真空浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物；按重量百分比计，加入相当于总重量30％的麦芽糊精作为粘合剂，混合均匀后进行喷雾干燥。
实施例6
一种蚕蛹提取物的制备工艺，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；本实施例中蚕蛹原料选自鲜蚕蛹，鲜蚕蛹采用温度低于30℃的温度进行干燥，干燥至水分低于5％后，粉碎，后用筛网孔径为1.2mm的筛网进行过筛，得到蚕蛹细碎物。
b.将蚕蛹细碎物采用超临界CO2萃取，提取完成后得蚕蛹细碎物渣；本实施例中，所述超临界CO2萃取的萃取压力为20MPa，萃取温度为45℃，萃取时间为2h，分离压力为4MPa，分离温度为40℃。
c.将步骤b中蚕蛹细碎物渣采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；低温高压差连续提取溶剂为纯净水。低温高压差连续提取的压力为30-50MPa，提取温度为30-35℃，提取次数为1次。
d.将步骤c中清滤液真空浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物；按重量百分比计，加入相当于总重量85％的麦芽糊精作为粘合剂，混合均匀后进行喷雾干燥。
实施例7
实施例1-6中任意一项所述制备工艺制备得到的蚕蛹提取物。
实施例8
实施例1-6中任意一项所述制备工艺制备得到的蚕蛹提取物或蚕蛹提取物喷干粉在制备增强免疫调节药品、食品和/或保健食品中运用。
更优化的，在制备治疗或辅助治疗因脾细胞正常结构被破坏免疫细胞凋亡的药品和/或保健食品中应用。
更优化的，在制备提高巨噬细胞吞噬功能的药品和/或保健食品中应用。
本实施例中说的药品或保健食品，包括但不限于：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
同时蚕蛹提取物或蚕蛹提取物喷干粉也可当食品食用，或与其他食品一起制备成功能食品。
实施例9药理实验
按本实施例3方法制备的本药理实验样品，除麦芽糊精的含量调整为40％外，其他参数与本实施例3相同，得到药理实验样品，标记为蚕蛹提取物样品。实验为委托具有相应药理实验资质的单位完成，具有第三方单位为：暨南大学中药与天然药物研究院。
一、实验目的：
采用拘束应激负荷小鼠免疫低下模型，考察蚕蛹提取物对小鼠免疫功能是否具有改善作用。
二、实验材料
BALB/C雄鼠32只，7周龄，购于广东省医学实验动物中心(许可证号SCXK(粤)2018-0002)；饲养温度23±2℃,湿度50±10％。
蚕蛹提取物(广州泽力医药科技有限公司提供)；PBS溶液；2xPBS溶液；PE标记CD3单克隆抗体；FITC标记的CD4、CD8；红细胞裂解液(Tris-NH4C1)；FBS胎牛血清；RPMI1640培养基。8号和12号灌胃针；lml注射器；蒸馏水；
三、实验步骤
1、分组编号
小鼠随机分为4组，每组8只。组别分别为正常对照组(Control),拘束应激模型组(Stress),Stress+蚕蛹提取物高剂量(Stress+WP-H)，Stress+蚕蛹提取物中剂量(Stress+WP-M)。
2、剂量确定
蚕蛹提取物将0.747g/kg此剂量设置为中剂量；设置高剂量为中剂量的10倍，即7.47g/kg。
蚕蛹提取物根据浓度设置采用蒸馏水溶解，小鼠灌胃量为0.5ml/只/次，每天每只灌胃2次。Control组和Stress组每次给予等剂量的蒸馏水。连续给药21天。
3、拘束造模
从实验的第1天开始，除Control组外，其他组别小鼠每天拘束3小时[1](18:30～21:30)，给药后拘束。拘束装置为[2]通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管，拘束期间小鼠不能进食饮水。control组小鼠同时禁食禁水。小鼠每日称重，最后一天灌胃给药后，异氟烷麻醉小鼠，取材继续下一步实验。
4、免疫功能指标测定：
a.免疫器官指数测定[3]：
取小鼠脾脏，生理盐水清洗后吸干水分称重。按公式免疫器官指数＝免疫器官重(g)/小鼠体重(g)×100％，计算脾脏指数。
b.脾脏免疫细胞检测分析(PE/FITC双染色法分析脾脏T细胞亚群检测[4])：
原代提取脾脏淋巴细胞：置脾脏于玻璃匀浆器中添加1～2ml PBS研磨，再加1mlPBS冲洗玻璃匀浆器，200目筛网过滤。4℃1000rpm离心5min，弃上清液，加入红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)2ml，混匀，2min后加2×PBS溶液4ml终止裂解反应，4℃1000rpm离心5min，弃上清液，用2ml PBS溶液洗两次后，加500μL RPMI1640完全培养基重悬，计数。(除裂解反应外，全程在冰上操作)
用完全RPMI1640培养基调整脾脏淋巴细胞浓度为1x107cells/ml[5]，取流式细胞分析专用管，每管加入细胞悬液100μL。每个样本制备2管，进行FITC/PE双色荧光抗体标记。第一管用1μL PE标记抗CD3抗体和0.5μL FITC标记抗CD4抗体，第二管用1μL PE标记抗CD3抗体和0.5μL FTIC标记抗CD8抗体，室温避光孵育20min后，以1000rpm离心5min，去上清，再加500μLPBS洗，以1000rpm离心5min，去上清，重复一次PBS洗涤和离心去上清操作后，各管加振荡混匀后500μL鞘液，震荡摇匀后上机分析，记录各管CD3+％，CD3+CD4+％，CD3+CD8+％。
c.脾脏T淋巴细胞增殖率的测定[5](MTT法)
用完全RPMI1640培养基调脾细胞浓度为1×106/ml加入96孔板，100μl/孔，再加入100μl ConA(多克隆激活T细胞)，使其终浓度为5μg/ml。置37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时，吸出培养基，并加入1ml 5mg/ml MTT和6ml不完全RPMI1640培养基混合液100μl。再置37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时。孵育结束后，吸出MTT，加入二甲基亚砜150ul。振荡摇匀，10min后，酶标570nm波长测定各孔光吸收值。
d.腹腔巨噬细胞吞噬功能检测[5]：
将麻醉好的小鼠，用75％乙醇消毒5min。消毒后腹腔注射7ml PBS，按摩腹腔2～3min。然后收集腹腔中的液体，在1000rpm转速下离心5min，根据红细胞残留情况适当加入或者不加红细胞裂解液(加红细胞裂解液的，捂2min左右，加两倍量2×PBS终止；1000rpm，5min离心，弃上清，再用PBS洗两次)。接下来，将提取的巨噬细胞重悬于RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至5x106/mL，置于6孔板中孵育3h，每孔2mL。去上清，加入荧光标记的牛血清白蛋白处理的乳胶小珠后，继续孵育40min。40min后，放置于冰上终止吞噬，并收集巨噬细胞，用冰冻PBS洗去表面残留的荧光，再用流式细胞仪分析吞噬功能。
四、数据统计方法
数据以Mean±SD表示，采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，利用One-wayANOVA进行统计学检验，P<0.05表明有统计学差异。GraphPad制作图表。
五、实验结果
a.免疫器官指数
实验结果参见图1，结果显示Stress组相较于Control组脾指数显著降低(P<0.001)，各给药组脾指数相较Stress组均显著上升(P<0.0001或P<0.01)，其中蚕蛹提取物高剂量给药组作用更为明显。
b.脾脏T细胞亚群分析
实验结果参见图2，结果显示Stress组CD3+CD4+T细胞(Th，辅助性T细胞)的比例和Control组相比显著降低(P<0.0001)；与Stress组相比，蚕蛹提取物高、中剂量给药组(P<0.01)比例均显著回升；而CD3+CD8+T细胞(Tc，细胞毒性T细胞)的比例在各组之间未出现显著性差异(P>0.05)。CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值显示，Stress组的结果相较Control组显著降低(P<0.05)，蚕蛹提取物高剂量给药组(P<0.01)比值相较Stress组显著回升，蚕蛹提取物中剂量给药组与Control组比较没有显著性差异(P＞0.05)，有回升趋势。
c.脾脏T淋巴细胞增殖率
实验结果参见图3，结果显示，Stress组脾T淋巴细胞增殖率相较Control组显著降低(P<0.001)，蚕蛹提取物高剂量给药组(P<0.01)相比Stress组显著上升。
d.腹腔巨噬细胞吞噬功能
实验结果参见图4，结果显示，Stress组腹腔吞噬细胞吞噬功能显著下降(P<0.05)，蚕蛹提取物高、中剂量给药组(P<0.01或P<0.05)可显著改善Stress导致的吞噬细胞吞噬功能降低。
六、讨论与结论：
脾脏为机体重要的免疫器官，对机体的体液免疫和细胞免疫起着重要的作用。研究表明拘束负荷导致的脾脏萎缩是由于在应激状态下脾细胞正常结构被破坏，免疫细胞凋亡，其机制可能与应激状态下过量产生的糖皮质激素破坏免疫功能有关。研究结果蚕蛹提取物高中剂量组均能改善拘束应激导致的脾指数降低，改善免疫功能。
BALB/c小鼠的免疫以体液免疫为主，故T细胞中的Th亚型(辅助性T细胞)活化通过分泌细胞因子(如：IL-4，IL-5)使得B细胞分化成浆细胞进行体液免疫的功能显得尤为重要；同时，其分泌的IL-2，IFN-γ等细胞因子在抗感染抗肿瘤等免疫反应过程中也发挥着重要的作用。蚕蛹提取物高中剂量组均能改善拘束应激造成的免疫细胞凋亡，显著增加Th淋巴细胞的数目，增强免疫功能。CD3+CD4+/CD3+CD8+(即Th/Tc)作为免疫系统稳定性的重要指数，对于稳定和调节免疫功能有重要的指示作用[3]。蚕蛹提取物高剂量组能显著改善拘束应激造成的CD4+/CD8+T细胞下降，蚕蛹提取物中剂量组虽未能显著改善CD4+/CD8+T细胞，显示一定的回升作用。脾T淋巴细胞的增殖率作为T细胞活化分型的基础，蚕蛹提取物高剂量组能显著提高拘束应激导致的脾T细胞增殖率下降，改善免疫功能。
研究表明，拘束应激能通过诱导ROS等自由基产生，造成免疫功能的紊乱和损伤，而巨噬细胞对自由基敏感，过量的自由基会影响其吞噬功能，影响机体免疫。蚕蛹提取物组均能显著改善的巨噬细胞吞噬功能，进而改善免疫功能。其机制是通过抗氧化保护免疫防御系统免受自由基损伤，进而改善免疫功能。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (10)
1.一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
a.取蚕蛹原料粉碎得蚕蛹细碎物；
b.将蚕蛹细碎物采用低温高压差连续提取，收集提取液进行离心，取上清液进行微滤得清滤液；
c.将清滤液真空或反渗透浓缩得浓缩液，浓缩液灭菌，即得蚕蛹提取物。
2.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，在低温高压差连续提取前将蚕蛹细碎物采用超临界CO2萃取，萃取完成后再将蚕蛹细碎物的渣进行步骤b。
3.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，得到蚕蛹提取物后进行喷雾干燥得到蚕蛹提取物喷干粉。
4.根据权利要求3所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，按重量百分比计，在喷雾干燥前，以所述蚕蛹提取物为底物，加入30-85％的麦芽糊精或阿拉伯胶作为粘合剂，混合均匀后进行喷雾干燥。
5.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，所述蚕蛹原料的水分含量≤10％，所述蚕蛹细碎物粒径≤1.2mm。
6.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，所述超临界CO2萃取的萃取压力为25-35MPa，萃取温度为25-45℃，萃取时间为2-3h，分离压力为4-10MPa，分离温度为15-40℃。
7.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，所述低温高压差连续提取溶剂为纯净水，所述低温高压差连续提取的压力为20-50MPa，提取温度为15-40℃，提取次数为1-3次。
8.根据权利要求1所述的一种蚕蛹提取物的制备工艺，其特征在于，所述微滤的方法为：采用陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的过滤孔径为100-500nm。
9.权利要求1-8任意一项所述制备工艺制备得到的蚕蛹提取物。
10.权利要求1-8任意一项所述制备工艺制备得到的蚕蛹提取物在制备免疫调节药品、食品、功能性食品和/或保健食品中的运用；更优化的，在制备治疗或辅助治疗因脾细胞正常结构被破坏免疫细胞凋亡的药品和/或保健食品中应用；更优化的，在制备提高巨噬细胞吞噬功能的药品和/或保健食品中应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190716 |
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