KR20120059258A

KR20120059258A - 생물 활성을 가지는 한방식재료 추출액 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20120059258A
Application number: KR1020100120929A
Authority: KR
Inventors: 김충환; 김태현
Original assignee: 김태현
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-06-08

Abstract

본 발명은 기능성식품 원료 소재화를 위한 생물활성 한방식재료 추출액 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 한방 추출액은 뛰어난 건강증진 및 질병예방 효과가 있어 웰빙산업의 발달과 건강유지의 식단으로 변화되는 소비자의 성향에 크게 각광받아 경제 산업적 효과가 클 것으로 사료되며, 심혈관계 질환 예방 효과, 세포 내 신호전달인자 증가 효과, 손상된 혈관 회복 효과, 암세포 성장 억제 효과 및 정상세포 성장 증식 효과를 나타낸다.

Description

생물 활성을 가지는 한방식재료 추출액 및 이의 제조방법 {ORIENTAL MEDICINE EXTRACT HAVING BIOLOGICAL ACTIVITY AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 기능성식품 원료 소재화를 위한 생물활성 한방식재료 추출액 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

식생활의 서구화에 따른 각종 질병의 원인이 식생활과 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고, 의약품의 과도한 사용에 따른 부작용의 증가 및 삶의 질 개선을 추구하는 이른바 웰빙 추세에 따라 건강 기능성 식품에 대한 관심이 증가하고 있다. 또한 각종 환경오염물질의 생체 내 유입에 의하여 DNA 변형, 단백질 변성 및 세포파괴 등으로 다양한 질병이 유발되고 이러한 질병의 원인인 독성을 제거하고 저해하기 위하여 천연물자원을 이용하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

우리나라 총인구 중 65세 이상 인구가 갖는 비율이 2000년 7%를 넘어서 이미 고령화 사회로 진입하였고 2019년이 되면 고령 사회가 될 것으로 전망하고 있다. 이처럼, 저출산 고령화 사회가 급속히 진행되는 가운데 급증하는 국민의료비의 증가를 막기 위해서는 현재 치료중심의 의료에서부터 예방 중심의 의료로 전환이 요망되고 있으며, 이에 우리나라 정부도 바이오 기능성식품에 대한 중요성과 그 역할에 주목하게 되었으며 식품을 통한 질병의 예방에 대처하려는 움직임도 활발히 전개되고 있다.

기능성 식품이란 여러 생리활성물질을 함유하여 생체조절기능을 나타냄으로써 일반적인 식품의 기능 이외에 예방의학적으로 건강증진 효과가 기대되는 식품을 말한다. 식품의 3차 기능으로서 알려진 면역계, 내분비계, 신경계, 순환계, 소화계의 이상을 개선하는데 관여하는 식품에서 파생되는 각종 생리활성성분을 과학적으로 동정하고 분석해서, 그것을 건강유지, 증진에 이용할 수 있는 바이오 기능성식품의 개발을 활발하기 위해서는 기능성식품에 활용할 새로운 소재의 발굴과 생체내 정확한 기능규명, 새로운 고기능성 식품을 창출하기 위한 바이오기술의 적절히 활용과 응용이 중요하다 하겠다. 일반적으로 식재 및 약재는 인체의 제반 계통을 조절하는 인자가 존재하며 이들은 저농도로 생리활성을 발현하기 때문에 기능성 물질로서 전통의학의 치료수단으로 쓰여 왔다. 최근 식품과 의약품의 경계가 점차 모호해지고 있으며 다양한 건강 기능성 음료가 개발, 유통되고 있는 현실에서 한의학적으로 우수성이 증명되고 식품소재화가 가능한 국내산 한방식재료를 이용한 기능성식품의 개발이 절실히 요구된다. 현재 생약재를 이용한 건강음료의 경우 인삼, 영지, 오미자, 대추, 산수유 등이 이용되고 있으며 생약제의 과량의 당류를 부형제로 혼합한 전통차 형태로 제조되고 있는 실정이다. 따라서 생리활성 기능이 우수한 다양한 생약재를 가공하여 원료자체의 쓴맛, 색깔 등 식품으로써 부적합한 문제를 해결하기 위한 새로운 가공 기술 개발 및 건강 기능성 음료의 고급화가 요구되며 효능에 대한 과학적이며 체계적인 연구가 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 생리활성 기능이 우수한 다양한 생약재를 가공하여 이의 추출액을 제조한 결과, 심혈관계 질환 예방 효과, 세포 내 신호전달인자 증가 효과, 손상된 혈관 회복 효과, 암세포 성장 억제 효과 및 정상세포 성장 증식 효과를 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 생리활성 기능이 우수한 다양한 생약재를 이용한 추출액 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 그 특징으로 한다.

본 발명은 생물 활성을 가지는 한방식재료추출액 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 한방 추출액은 뛰어난 건강증진 및 질병예방 효과가 있어 웰빙산업의 발달과 건강유지의 식단으로 변화되는 소비자의 성향에 크게 각광받아 경제 산업적 효과가 클 것으로 사료된다. 심혈관계 질환 예방 효과, 세포 내 신호전달인자 증가 효과, 손상된 혈관 회복 효과, 암세포 성장 억제 효과 및 정상세포 성장 증식 효과를 나타낸다.

본 발명은 한방식재료 추출물을 이용한 기능성식품을 개발하기 위해서 아래와 같은 연구개발을 수행하였고, 소재 제품화함으로써 우수한 품질의 기능성 식품을 개발하였다.

번호	개발내용	평가방법 및 평가항목	기간 중 개발가능 범위의 목표 및 달성도 (%)
1	한방식재료 추출액 제조법 정립	한방식재료 추출액 제조법 정립 여부	한방식재료 추출액 제조법 정립 (100%)
2	한방식재료 추출액 생산 공정(원료 선별, 약재 세척, 수침, 추출, 농축, 혼합) 구축	기능성이 강화된 한방식재료 추출액에 관한 표준작업공정(SOP) 구축여부	표준작업공정(SOP) 구축 (100%)
3	한방식재료 추출물의 동물세포 보호능 시험	한방식재료 추출액에 의한 자궁경부암세포 및 소동맥 혈관내피세포의 세포증식 및 생존력 분석	동물세포증식 및 생존력 분석 결과 1건 이상 (100%)
4	한방식재료 추출물에 의한 세포의 스트레스 유발 분석	한방식재료 추출액에 의한 자궁경부암세포 및 소동맥 혈관내피세포에 미치는 스트레스 분석	동물세포에 미치는 스트레스 여부에 대한 분석 결과 1건 이상 (100%)
5	한방식재료 추출물이 동물세포 심혈관질환의 회복 가능성에 대한 분석	한방식재료 추출액에 의한 소동맥혈관내피세포에서의 nitric oxide 발현 분석	동물세포에서 nitric oxide 발생 여부 분석 결과 1건 이상 (100%)
6	한방식재료 추출물에 의한 심혈관질환의 target protein인 eNO3 발현량 분석	한방식재료 추출액에 의한 소동맥혈관내피세포에서 eNO3뿐만 아니라 전사인자들의 발현량 분석	동물세포에서 eNO3 발현량 1건이상 분석 (100%)
7	한방식재료 추출물에 의한 세포내 유전자 손상 여부 분석	한방식재료 추출액에 의한 세포내 Parp 단백질양 비교분석	동물세포 BAEC에서의 Parp 단백질 1건 이상 분석 (100%)
8	한방식재료 추출물에 의한 세포내 cAMP 및 PKA 농도 측정	한방식재료 추출액에 의한 신호전달물질 cAMP 및 Protein Kinase의 활성 비교	동물세포 BAEC에서의 신호전달물질 2건이상 분석 (100%)
9	이차원 액상크로마토그래피 기법을 이용한 한방식재료 추출물이 세포내 미치는 영향 분석	한방식재료 추출액에 의한 세포내 단백질 발현에 미치는 영향 평가	한방식재료 추출액에 의한 동물 세포내 단백질 확인 (100%)
10	한방식재료 혼합추출물액의 충진, 멸균, 포장 공정 확립	한방식재료 추출물 충진, 멸균, 포장에 관한 표준작 업공정(SOP) 구축 유무	표준작업공정(SOP) 구축 (100%)
11	한방식재료 추출액의 소재와 시제품 제조	시제품 제조 유무

위와 같은 연구개발을 효과적으로 수행한 결과,

한방이나 민간요법 또는 식품가공 공정에서 그 안정성이 확보된 우수한 한방식재료를 선별하여 기능성 강화 및 약리학적 작용이 최대화 될 수 있도록 한방식재료를 가지고 수침, 추출, 농축, 혼합하는 공정 기술을 확립하였다.

또한 한방식재료 추출물에 의한 자궁경부암세포 및 소동맥혈관내피세포의 세포증식 및 생존력을 분석하였고,

한방식재료 추출물에 의한 자궁경부암세포 및 소동맥혈관내피세포에 미치는 스트레스를 분석하였으며,

한방식재료 추출물에 의한 소동맥혈관내피세포에서의 nitric oxide발현을 분석하였다.

나아가, 한방식재료 추출물에 의한 소동맥혈관내피세포에서 eNO3뿐만 아니라 전사인자들의 발현량을 분석하였고,

한방식재료 추출물에 의한 세포내 Parp 단백질양을 비교분석하였고,

한방식재료 추출물에 의한 신호전달물질cAMP 및 Protein kinase의 활성을 비교하였고,

한방식재료 추출물에 의한 세포내 단백질 발현에 미치는 영향을 평가하였고,

한방식재료 혼합추출물액의 충진, 멸균, 포장 공정을 확립하였으며,

한방식재료 추출액의 소재화 시제품 제조를 하였다.

천연물, 특히 한약재 등 생약자원의 산업적 이용은 무한한 가능성을 지니고 있다. 한약재는 생리적약리적 유효성을 근간으로 하여 식품, 의약품, 화장품 등의 분야에서 고부가가치의 상품의 기능적 소재로 활용가치가 매우 높다. 실제로 많은 제약회사나 바이오벤처기업들이 천연물을 이용한 신약을 개발하고 있으며, 그 전단계로 한약재에서 유효성분을 추출하여 기능성 식품으로 개발하여 상품화하고 있다. 그러나 아직 산업이 국제경쟁력을 가지기 위해서는 다양한 기능성 생리활성 성분이 농축되어 있는 우리 고유의 한약재 소재, 약용식물을 이용한 기능성 소재의 발굴과 산업적 이용이 필요하다. 본 연구개발과제의 성공적인 모델 창출은 관련 기능성식품 및 관련 소재 개발 분야에 추가적인 연구 개발 및 실용화 투자를 촉발하고 국내 기능성식품의 제반 가치를 상승시키기 위한 세계적인 제품개발이 가능한 구조를 만들 것이다.

1. 한방식재료로부터 생리활성 증진 시료의 선정

한방식재료 추출액을 이용한 본 발명의 기능성식품 연구개발, 제조 및 생산을 수행하기 위하여 원료의 선별과정으로 원료의 재배에서 공급까지 농약, 중금속, 미생물로부터 안전하고, 위생적인 한방식재료자원이 확보될 수 있도록 노력하였다. 전통 생약재 시료의 생리활성 증진검색에서 나타난 결과로부터 홍삼, 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초, 영지버섯을 선정하였으며, 이들 한방재료를 추출제조하여 높은 생리활성을 나타내는 식품소재로서 용이하게 하였다. 상기 홍삼, 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초, 영지버섯는 각각 차례대호 1 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100 : 0.01~100의 비로 사용될 수 있으며, 일반적으로 사용되는 기타 유효성분들을 제한 없이 포함할 수 있다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오갈피나무과 인삼속에 속하는 다년생 초본류로서 한방에서는 그 뿌리를 인삼이라 하여 약용으로 사용한다. 인삼은 우리나라를 비롯하여 중국, 일본에서도 지난 수천년간 이용되어 왔고 그 약효를 높이 평가받아 불로장생의 영약으로 취급되어 왔다. 홍삼은 백삼과 달리 수삼을 증숙한 후 건조하여 제조한 것으로 이러한 수치과정에서 수삼 또는 백삼과는 다른 성분이 생성된다고 알려져 있다. 홍삼의 약리효능은 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방, 조혈작용과 혈당치를 저하, 간을 보호, 내분비에 작용하여 성행동이나 생식효능, 항염 및 항종양작용, 방사선에 대한 방어효과 및 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용으로 오랫동안 이용되어 왔다.

가시오가피는 인삼, 산삼과 함께 오가과에 속하는 낙엽관목으로 ‘가시오갈피’라고도 하며 가시가 있는 나무이다. 가시오가피는 인삼과 유사한 점이 많아 ‘시베리아 인삼’이라고 불리 우고 있으며 면역증강, 항산화, 항피로, 내분비기능조절, 혈압조절, 항방사능, 해독작용에 효험이 있는 것으로 알려져 있어 한약재로 사용되어 왔다.

복분자딸기는 우리나라의 제주도, 중부지방, 남부지방과 중국, 일본, 미국 등 해발 1,000 m 아래 산기슭 양지에서 자생하는 장미과에 속하는 산야에 흔히 자라는 나무딸기의 일종이다. 복분자딸기의 과실에는 무색침전상결정인 triterpene 배당체, 가수분해성 탄닌, 인, 철, 칼륨이 함유되어 있고, 특히 비타민 C와 isocitric acid, astragalin, isoquercitrin, tartaric acid, citric acid와 같은 유기산이 영양성분으로 많이 포함되어 있으며 phenol성 화합물이 함유되어 있다. 복분자는 항염작용, 항산화작용, 항 헬리코박터 파이로리에 작용된다고 보고되고 있다.

산수유는 예로부터 다뇨증, 요통, 이명, 폐결핵 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 그 과실은 자양, 강장, 음위, 이조에 약효가 있고, 간경화, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강화작용, 항암 및 항균작용이 있다고 한방자료에 기록되어 있다. 최근 산수유의 생리활성에 관한 연구로는 산수유 종자의 항당뇨효과, 물 추출물의 항히스타민 효과, 납에 의한 조직손상 억제, 부종억제효과, 정자 운동성 증가에 미치는 효과, 항산화 효과, 항암 효과, 항균효과, 티로시나아제 저해작용 등이 보고되고 있다.

오미자는 넝쿨성 식물로서 품종과 재배환경에 따라 차이가 있지만 단맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛, 짠맛의 다섯가지 맛을 내며 붉은 색의 안토시안 색소를 함유하여 식품가공에 이용되고 있다. 한의학에서 오미자는 거담, 자양, 강장 및 눈을 밝게 하고 스트레스 억제, 혈압강화, 당뇨병 예방과 치료효과 등의 여러 가지 효능이 보고되고 있다. 이러한 오미자의 기능성을 이용하여 개발된 기능성 식품으로는 오미자 발효액, 고추장, 요구르트 등이 있으며 앞으로 오미자를 이용한 다양한 건강식품이 개발된 전망이다.

구기자는 나무 전체인 전초가 약품으로 이용되고 있으며 구기자 나무 열매를 구기자라 하고, 잎을 구기엽, 뿌리의 껍질을 지골피라하며 부위에 따라 약효가 달라 그 용도가 다르게 사용되고 있다. 구기자는 자보약으로 자양강장, 익정명목 효능이 있어 간심음, 소갈, 유정을 치료하는데 쓰였으며 구기자에 함유된 성분은 carotenoid, cholin, meliscic acid, zeaxanthin, physaline(dipalmityl zeaxanthin), betaine, ß-sitosterl, vitamin B1과 불포화지방산이 다량 함유되어 있다. 구기자에 대한 생리활성 실험연구는 죽상경화증의 유발물질인 homocysteine의 혈증내 함량감소, 혈증지질 저하효과, 유해산소 및 알코올의 해독효과, 간 보호효과 및 고지혈증 병태모델 혈정지질의 상승억제효과, 혈당강화작용 등이 보고되었다.

동충하초는 나비목의 유충 또는 번데기를 기주로 하여 인공재배가 활발하게 이루어지고 있는 한약자원이다. 최근 항염증, 항균, 항종양, 면역증강 등 외부물질에 대한 보호작용, 자양강장, 정력증강, 항피로, 운동능력 향상, 노화방지, 수면연장 등 기초대사활성 증강작용, 그리고 동맥경화 억제, 콜레스테롤과 중성지질 저하, 혈당강화, 고혈압치료 등의 질병억제 및 완화작용 등 다양한 생리활성이 알려지면서 의약분야 뿐만 아니라 건강기능 소재로서도 널리 이용되어지고 있다.

버섯류는 진균류속에 속하는 담자균과 자낭균 중 자실체를 형성하는 고등균류로서 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질 및 비타민 등의 영양소를 골고루 함유하고 있을뿐더러 독특한 맛과 향기를 지니고 있어 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어 왔으며 자연식품, 저칼로리식품 및 무공해식품으로도 진가가 인정되는 식품이다. 특히 버섯의 항암작용, 면역증강 효과, 항산화 효과, 항돌연변이 효과, 혈당 강하, 콜레스테롤 저하, 뇌졸중, 신장병 등의 여러 가지 생리활성 기능을 나타내기 때문에 암이나 성인병에 대한 예방 및 개선효과가 기대되는 좋은 소재라고 할 수 있고 최근 건강식품 및 의약품 소재로 널리 이용되고 있다. 만년버섯 또는 불로초라고도 불리는 구명장이 버섯과 영지속에 속하는 영지버섯은 예부터 한방에서 건위, 건뇌, 강장, 강심, 이요, 해독, 항균, 면역, 진해, 진통, 신경쇠약, 불면증, 급만성 간염, 위궤양, 혈압강화 등에 효과가 있는 약용버섯으로서 이용되고 있다. 영지버섯의 주요 약리적인 효능은 항균 작용으로 영지버섯 추출물은 박테리아를 사멸시키는 역할을 하며, 신경학적 효능으로 효소(super oxide dismutase, Ka+K+APTase)를 보호하여 대뇌의 기능을 보호하여 신경 안정을 해준다. 또한 호흡기 계통을 개선시키며 항종양 효능, 면역기능 향상, 혈소판 응집을 막아 주어 혈액순환을 도와주며 중성지방과 콜레스테롤 수치를 떨어뜨리는 역할을 한다.

2. 한방식재료 추출액의 제조공정

본 기능성 액상식품 제조방법은 홍삼, 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초, 영지버섯 등을 각각 순환식 환류냉각추출장치로 추출하고 여과한 후, 60^oC 이하에서 갑압농축하여 식물혼합추출물을 만들고, 농축된 식물혼합추출물 84.97%와 액상과당 등을 첨가하는 혼합공정을 거쳐 제조되었다.

3. 기능성 액상차 제조

고유의 향미, 영양성분, 색은 최대한으로 살리고, 유효성분의 추출 효율을 높일 수 있는 고품질의 제품개발이 가능함을 확인하였고 이를 통해 한방식재료 추출물을 이용한 기능성 액상제품 생산을 위한 표준작업공정 (Standard Operation Procedures)를 확립하였다.

가. 한방식재료 건조

한방재료는 농산물이기 때문에 줄기 및 뿌리에는 약 45%, 잎에는 85% 수분상태로 수확하기 때문에 이를 적절한 공정으로 건조하지 않으면 변질되어 사용하기 곤란하다. 특히 이들 주요 성분은 수용성 물질이기 때문에 비나 이슬을 피할 수 있는 곳에서 자연건조 하거나 약 50^oC 미만의 저온 건조기에서 건조해야 한다. 특히 잎의 경우는 햇볕에서 건조하면 갈변현상이 나타나며 생약성분이 소멸되는 것으로 알려져 있다. 따라서 건조기를 사용하거나 통풍이 잘되는 그늘에서 건조시킬 수 있도록 해야 한다.

나. 분쇄시스템

건조된 줄기와 뿌리는 추출성을 향상시키기 위하여 분쇄기를 사용하여 분쇄하여야 한다. 잘 분쇄될수록 추출속도는 빠르게 되기 때문에 추출공정에 사용되는 에너지를 절감할 수 있다. 분쇄기는 미세분말 제조에 사용되는 그라인더형과 잔가지 파쇄에 사용되는 절단형 칼날을 회전시키는 슐레터형 등을 사용할 수 있으며 비용면에서는 귤레더형이 우수하다.

다. 추출액상차의 제조

건조된 한방식재료 줄기, 뿌리, 잎 등을 약 5~10mm정도크기로 절단하여 주재료를 추출용탱크에 넣고 40~50℃의 정제수를 넣고 약 1시간동안 수침하여 약재에 추출액이 고루 스며들게 하고 온도를 서서히 올린다. 온도를 서서히 올려 약 95~100℃에 도달하면 4시간을 고온상태에서 추출하여 유효성분 추출을 극대화 한다. 추출기에는 온도조정 센서 및 온도기록장치를 부착하여 자동온도조절기능과 추출시간별 온도기록을 데이터화 하여 통계자료로 이용하고 있다. 추출이 끝나면 추출액을 1차 여과기(100mesh), 2차 여과기(200mesh)를 통과시켜 여과하고, 원하는 농도로 만들기 위하여 농축기로 보낸다. 이때 추출된 유효성분의 파괴를 막기 위하여 60℃ 이하에서 수분 85% 이하로 감압농축하였다. 이후 농축된 액을 가지고 기타원료와 같이 고온으로 순환시키면서 90℃ 40 RPM 조건에서 액을 균질하게 하는 혼합공정을 거쳐 용액 조제를 마친다. 이렇게 조제된 액은 외부의 노출없이 액 이송 라인을 통하여 위생적으로 안전하게 파우치(병) 포장되며, 추출탱크부터 액이송라인 및 파우치 포장기까지 모두 세척이 용이한 스테인레스스틸로 제작되어 있어 외부 오염이나 미생물오염을 방지하였다. 또한 파우치 포장 후 110℃에서 20분간 멸균과정을 한번더 거치게 되므로 제품의 안정성을 최대한 고려하여 제조하고 있다. 마지막으로 최종 포장공정이 끝나면 품질검사를 마치고 기준에 적합한 제품만을 출하하게 된다.

따라서 액상차 생산에서 제품의 출하까지 전공정을 그림 1에서와 같이 설계할 수 있다.

그림 1. 추출액상차의 제조공정 블록차트

4. 자궁경부암세포 배양법과 소동맥혈관내피세포 배양법 정립

본 발명의 목표인 한방식재료 추출액의 생리활성 검증을 위하여 자궁경부암세포인 HeLa cell과 소동맥혈관내피세포인 BAEC 사용하였다. 사용된 HeLa cell 은 자궁경부암 말기환자로부터 분리되어 세계의 많은 연구기관에서 사용 중인 세포로서 본 연구에서는 홍삼-복합한약재 추출물( 공진옥골드 )의 항암효과 및 정상세포와의 비교를 위해서 사용되었다. 또한 소동맥혈관내피세포인 BAEC는 정상세포로서 혈관을 구성하는 주요 세포이며 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드)에 의한 정상세포의 생리활성 검증 및 암세포와의 비교를 위해서 사용되었다.


(a)	(b)

그림 2. 자궁경부암세포 (HeLa cell)와 소동맥혈관내피세포 (BAEC)

자궁경부암세포 (HeLa cell)는 10% FBS를 함유하는 high glucose DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)를 기초배지로 하여 배양하였으며, 25 unit/ml penicillin, 25 ug/ml streptomycin의 항생물질과 L-glutamine을 첨가하였다. 소동맥혈관내피세포의 경우에는 10% FBS를 함유하는 MEM(Minimal Essential Medium)를 기초배지로 하여 배양하였으며, 25 unit/ml penicillin, 25 ug/ml streptomycin의 항생물질과 L-glutamine을 첨가하였다. 세포들은 75 cm² 세포배양용 플레이트에 넣어 5% CO₂ 조건에서 2~3일 간격으로 배양액을 교환 공급하였다. 세포 배양되어 confluence가 70 ~ 80%에 도달하면 트립신으로 계대배양을 하였고 2~3차에 걸친 계대배양후의 세포들을 본 연구개발에 사용하였다.

5. 한방재료 추출물을 이용한 세포증식 보호능 시험( Cell counting assay )

Cell counting assay는 세포의 증식 및 생존력을 측정하는 방법으로 Trypan blue 시약을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 시험법이다. 생명과학분야에서 물질에 의한 세포의 생존력을 측정하는 가장 간단한 기술이다. 실험에 쓰이는 Trypan blue 시약은 세포막을 확산의 방법으로 통과하여 세포 내부로 유입되는데 생세포는 ATP 에너지를 이용한 exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 배제하게 되나, 에너지를 발생할 수 없는 사세포는 exocytosis를 할 수 없어 청색으로 염색된다. Trypan blue에 의한 염색과정을 거쳐 Hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하여 Cell counting을 실시한다.

그림 3. Trypan blue 시약에 의한 cell의 염색

그림 4. Hemocytometer를 이용한 cell counting

본 발명에 사용된 Cell counting 시험법은 홍삼-복합한약재 추출물( 공진옥골드 )에 의한 자궁경부암세포인 HeLa cell과 소동맥혈관내피세포인 BAEC에 대하여 증식에 미치는 영향 및 생존력을 분석하기 위해 사용되었다.

이를 위해, 홍삼-복합한약재 추출물을 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)의 세 가지 타입으로 준비하였으며 세 가지 타입의 샘플을 HeLa cell과 BAEC에 다양한 농도로 처리하여 시험하였다. 실험을 위한 과정은 다음과 같은 방법에 의해 수행되었다.

Cell counting 방법을 이용한 세포증식 촉진 및 생존력 분석 시험

Cell counting 방법을 이용한 세포증식 촉진 및 생존력 분석 시험
(재) 송도테크노파크 생물공학실
필요한 시약	1) Trypan blue Solution 2) DPBS 3) Trypsin-EDTA solution
필요한 기계	1) Microscope
내용	* 본 시험 용역의 경우 자궁경부암세포인 HaLa cell 과 소동맥혈관내피세포인 BAEC를 사용. * 본 시험 용역의 경우 배양기는 SANYO CO2 incubator 사용하여 5% CO₂, 37^oC에서 배양 함. 1) 적정한 배양용기에 시험에 사용할 HeLa cell 및 BAEC 세포가 80 ~ 85% confluent할 때까지 기른다(전배양). 배양에는 10% FBS와 항생물질 복합체를 함유하는 DMEM 및 MEM(GIBCO)를 사용한다. 2) 전배양 세포가 적정 수준까지 자라면 세포를 배양용기에서 분리(trypsin 처리법)하고, 60p plate에 각각의 세포를 동일한 양으로 접종을 한다. 3) 적정시간 배양하여 60 ~ 70% confluent하게 배양한다. 4) 배양액을 suction으로 제거하고 37^oC로 warming 된 다양한 농도의 홍삼 및 복합한약재 추출물 (공진옥골드)이 첨가된 배지로 교환한다. 5) 24시간 추가로 세포 배양기에서 배양한다. 6) 24시간 후에 처리된 배지를 suction한 후에 200ul의 TE(Trypsin-EDTA) buffer를 처리한 후 Incubator에서 2-3분 동안 방치한다. 7) 1.8ml의 DPBS용액을 첨가한 후 세포를 plate에서 떨어뜨린다. 8) 10ul의 Trypan blue와 10ul의 세포액을 잘 섞은 후 실온에서 3-4분 동안 반응 시킨다. 9) Hemocytometer에 Cover glass를 올려놓은 후에 Hemocytometer와 Cover glass사이의 틈에 8)의 반응물을 10ul 취하여 주입한다. 10) 현미경을 이용하여 염색되지 않은 세포와 염색된 세포를 counting한다.

홍삼추출물(홍삼 Ext.)은 1%이상을 처리하였을 때 암세포에 대해서 성장을 억제하는 것을 확인 할 수 있으며 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)에서는 3%이상에서 급격하게 성장이 저해됨을 확인하였다. 그러나 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에서는 암세포의 성장을 억제하는 효과가 더디게 나타남을 알 수 있었다(그림 5). 암세포의 결과에 비해 정상세포에서는 처리된 홍삼추출물 (홍삼 Ext.) 및 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)의 농도가 높아질수록 세포의 성장을 촉진하는 결과를 얻을 수 있었다(그림 6). 홍삼추출물 (홍삼 Ext.) 및 홍삼-복합한약재 추출물 (공진옥골드 Ext.)에 비해 복합한약재 추출물(GJO Ext.)만을 처리하였을 때는 세포의 성장이 크게 증가하지는 않지만 서서히 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 결과에서 우리는 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)이 암세포의 성장은 저해하며 정상세포의 성장은 촉진한다고 판단하였다.

그림 5. 홍삼추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 자궁경부암세포인 HeLa cell의 세포증식 및 생존력 분석

그림 6. 홍삼추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 소동맥혈관내피세포인 BAEC의 세포증식 및 생존력 분석

6. 한방재료 추출물에 의한 세포의 스트레스 유발 분석

세포는 외부의 스트레스에 대해서 다양한 반응을 하는데 세포내 소기관 중에 하나인 Lysosome은 외부의 스트레스에 의해서 증가하는 경향을 보인다. 따라서 본 연구에서는 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)을 처리하였을 때 유발되는 세포내 스트레스 분석을 위해서 Lysosome의 양을 측정할 수 있는 Lysotracker를 이용하여 스트레스 분석을 실시하였다. Lysotracker는 세포내의 Lysosome에 결합하여 Lysosome의 양을 측정할 수 있게 해주는 시약으로서 형광물질을 내포하고 있으며 이를 이용하여 세포내에 존재하는 Lysosome을 측정하였다. Lysotracker를 이용하여 세포내에서 발생하는 스트레스 분석방법은 다음과 같다.

세포내 스트레스 분석

시험명	홍삼-복합한약재 추출물에 의해 유발되는 세포내 스트레스 분석
시험 장소	(재) 송도테크노파크 생물공학실
필요한 시 약	1) Lysotracker reagent 2) DPBS 3) MEM(minimum Essential Media)
필요한 기계	1) Confocal Microscope
내 용	* 본 시험 용역의 경우 자궁경부암세포인 HaLa cell 과 소동맥혈관내피세포인 BAEC를 사용. * 본 시험 용역의 경우 배양기는 SANYO CO2 incubator 사용하여 5% CO₂, 37도에서 배양 함. 1) 적정한 배양용기에 시험에 사용할 HeLa cell 및 BAEC 세포가 80 ~ 85% confluent할 때까지 기른다(전배양). 배양에는 10% FBS와 항생물질 복합체를 함유하는 DMEM 및 MEM(GIBCO)를 사용한다. 2) 전배양 세포가 적정 수준까지 자라면 세포를 배양용기에서 분리(trypsin 처리법)하고, confocal용 plate에 각각의 세포를 동일한 양으로 접종을 한다. 3) 적정시간 배양하여 60 ~ 70% confluent하게 배양한다. 4) 배양액을 suction으로 제거하고 37^oC로 warming 된 다양한 농도의 홍삼 및 공진옥골드가 첨가된 배지로 교환한다. 5) 24시간 추가로 세포 배양기에서 배양한다. 6) 24시간 후에 배지를 suction한 후에 2ml의 100nM Lysotracker in MEM를 처리하고 20-30분 동안 Incubator에 반응 시킨다. 7) 반응 후에 suction하고 DPBS를 이용하여 조심스럽게 Washing한다. 8) 1ml의 MEM을 첨가한 후에 Confocal microscope를 이용하여 형광을 관찰한다. (Green: 504nm, Red: 577nm)

HeLa cell은 홍삼 및 복합한약재 추출물(공진옥골드)의 처리농도가 증가할수록 Lysosome의 양이 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 세포에 대한 스트레스가 증가하고 있다고 판단된다. 한편 BAEC는 처리농도가 증가하여도 Lysosome의 양이 크게 변화가 없었다. 결국 홍삼 및 복합한약재 추출물(공진옥골드)은 정상세포에는 스트레스가 없지만 암세포에는 스트레스를 유발하여 세포의 성장을 억제하는 역할을 한다고 추측할 수 있다.

그림 7. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)가 자궁경부암세포인 HeLa cell에 미치는 스트레스 분석

그림 8. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext), 복합한약재 추출물(GJO Ext.)가 소동맥혈관내피세포인 BAEC에 미치는 스트레스 분석

7. 한방재료 추출물에 의한 심혈관질환의 회복 가능성에 대한 분석

BAEC는 소동맥혈관내피세포로서 심혈관질환을 연구하는데 주로 사용되는 세포로 본 실험에서는 홍삼 및 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)이 BAEC에 어떠한 영향을 주는지에 대해서 연구하였다. NO는 nitric oxide로서 동물세포에서 신호 전달에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 심혈관질환에서 손상된 혈관내피세포는 NO이 생산능력이 감소하고 이를 회복하지 못하면 질병으로 발전할 수 있다고 알려져 있다. 따라서 NO의 증가는 혈관의 손상을 회복하고 심혈관질환을 예방하는 효과를 얻을 수 있다. 본 연구에서는 홍삼 및 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)에 의해서 BAEC의 NO를 분석함으로서 심혈관질환의 회복가능성에 대한 실험을 하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

BAEC의 NO 변화 측정

홍삼 및 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)에 의한 BAEC의 NO 변화 측정
(재) 송도테크노파크 생물공학실
필요한 시약	Standard reagent : 100uM NaNO2 Kreb's buffer 0.1% NED solution 1% Sulfanilamide solution
필요한 기계	ELISA reader
내용	* 본 시험 용역의 경우 소동맥혈관내피세포인 BAEC를 사용. * 본 시험 용역의 경우 배양기는 SANYO CO2 incubator 사용하여 5% CO₂, 37도에서 배양 함. 1) 적정한 배양용기에 시험에 사용할 HeLa cell 및 BAEC 세포가 80 ~ 85% confluent할 때까지 기른다(전배양). 배양에는 10% FBS와 항생물질 복합체를 함유하는 MEM(GIBCO)를 사용한다. 2) 전배양 세포가 적정 수준까지 자라면 세포를 배양용기에서 분리(trypsin 처리법)하고, 60p plate에 각각의 세포를 동일한 양으로 접종을 한다. 3) 적정시간 배양하여 60 ~ 70% confluent하게 배양한다. 4) 배양액을 suction으로 제거하고 37^oC로 warming 된 다양한 농도의 홍삼 및 GJO가 첨가된 배지로 교환한다. 5) 24시간 추가로 세포 배양기에서 배양한다. 6) 24시간 후에 처리된 배지를 suction한 후에 1ml의 Kreb's buffer를 첨가한 후 Incubator에서 1시간동안 반응한다. 7) 1시간 반응 후 Kreb's buffer를 e-tube에 옮긴 후 4^oC ice에 보관한다. 8) 96well plate의 각 well에 standard를 위한 시약과 sample의 NO를 측정하기 위한 시약을 각각 다음과 같이 넣는다. <standard>¹⁾ <Sample>²⁾ 9) 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 반응 시킨다. 10) ELISA reader를 이용하여 530nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

1)

NaNO2 (100uM)	0	1	2	3	5	7	10
DW	200	199	198	197	195	193	190
0.1% NED	50	50	50	50	50	50	50
1% sulfanilamide	50	50	50	50	50	50	50
Total	300	300	300	300	300	300	300

2)

Kreb's buffer	200 (각각의 plate에서 추출된 buffer)
0.1% NED	50
1% sulfanilamide	50
Total	300

BAEC에 홍삼(홍삼 Ext.) 및 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리하였을 때 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)를 처리한 BAEC에서 NO가 증가함을 알 수 있었다. 즉, 공진옥골드가 BAEC에서 NO의 발생을 증가하도록 영향을 미치며 이렇게 증가한 NO로 인하여 심혈관질환의 예방효과를 보일 수 있음을 추측할 수 있었다.

그림 9. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물 (공진옥골드 Ext.) 및 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 BAEC에서의 NO의 발현 분석

8. 한방재료 추출물에 의한 심혈관질환의 target protein 인 eNOS 발현량 분석

BAEC와 같은 혈관내피세포내에서 고혈압이나 심근경색 증상의 완화를 위해 꼭 합성이 필요한 NO는 eNOS (endothelial nitric oxide synthase) 단백질에 의해 혈관내로 합성이 이루어진다. 따라서 앞서 NO의 증가가 관찰된 것이 eNOS 단백질의 발현, 즉 합성과도 상관관계가 있는지 본 실험에서 규명하고자 하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

eNOS 단백질의 발현

실험
방법

1) BAEC를 100mm dish에 80% confluency가 될 때, 0.5% NCS를 포함한 배지로 갈아주고, 다음날 serum이 포함되지 않은 배지로 교환 하여 serum starvation 상태에서 8시간 동안 전처리하였다.
2) 화학물질을 24시간 동안 처리 후 세포로부터 단백질을 얻었다.
샘플 단백질은 100에서 3분간 끓여 단백질을 완전히 변성시킨 후 얼음에서 30분 동안 방치하고, 4에서 380 g로 10분간 원심분리 하였다.
3) Supernatant를 모은 다음 각각의 sample을 30 씩 취하여 10.0% 의 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동은 Laemmli (Laemmli, 1970)의 불연속 완충액계 SDS- polyacryl -amide gel (SDS-PAGE)를 이용하였다. Separating gel 은 8.0%와 10% polyacrylamide gel (1.5M Tris-Cl, pH 8.8, 10% SDS, 30% Acrylamide-Bis), Stacking gel은 3% polyacrylamide gel (0.5M Tris-Cl, pH6.8, 30% Acrylamide-Bis)을 사용하고, gel을 굳히는 촉매로는 10% ammonium persulfate (APS)와 TEMED를 사용하였다.
4) 전기영동을 실시하여 gel 상에 분리된 단백질들을 PVDF membrane (Amersharm Phamacia)에 transfer 하고 Ponceau S를 사용하여 blotting 된 단백질 band를 확인한 후, TBST (Tris-buffered saline, NaCl, Tris?cl, 0.1% Tween 20)로 Washing 하였다. Membrane을 Blocking buffer (1xT-TBS with 5% skimmed milk)로 2시간 동안 blocking 하였다.
5) Anti-eNOS antibody, anti-Parp antibody, anti-CREB, anti-pCREB과 anti-Smad4, anti-Samd1 antibody는 각각 1:1000으로 dilution buffer (1XT-TBS with 5% BSA)에 희석하여 4에서 하루동안 반응시켰다.
6) 각 lane의 단백질 양은 actin의 양으로 보정하였다. Secondary antibody는 anti-rabbit IgG-HRP (eNOS, CREB, pCREB), anti-goat IgG-HRP(actin, actine), anti-mouse IgG-HRP (parp)를 Blocking Buffer에 1:5000으로 희석하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰으며, Eenhanced Chemiluminescence system (ECL, Amersharm Phamacia)으로 발현 양상을 확인하였다.
7) X-선 필름 (BioMax Light, Kodak)에 발현된 정도의 분석은 각 band의 강도와 면적을 densitometer인 Bioimage 60S (Milligen/ Bioresearch, Division of Millipore)를 이용하여 분석하였다.

본 실험에서는 앞서 NO의 합성량에 영향을 보인 홍삼 추출물 (홍삼 Ext.) 0.01%, 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%, 그리고 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 0.01%를 BAECs에 24시간동안 처리한후 NO 합성 단백질인 eNOS 뿐만 아니라, eNOS로의 세포내 신호전달과정에 중요한 전사인자들인 pCREB (phosphorylated cAMP responsive element binding protein), Smad4, Smad1 세가지를 추가로 분석하였다. 특히나 pCREB의 경우 eNOS promoter의 -922 ~ -926 부위에 직접 결합하여 eNOS 활성을 조절하는 전사인자로 알려져 있다. 아래 그림 10에서 관찰할 수 있는 바와 같이 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%와 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 0.01%의 경우 pCREB 단백질의 양이 급격히 증가하는 것으로 보아 eNOS 활성에 크게 영향을 주는 것으로 확인할 수 있으며, eNOS의 경우도 2배정도 합성이 증가한 것을 그림 10을 통해 확인할 수 있었다. eNOS의 경우, type III NOS 단백질로 세포내 합성량이 거의 일정하게 유지되는 constitutive NOS로도 알려져 있다. 따라서 pCREB으로 인한 전사단계의 변화가 eNOS 단백질 2배 정도 향상을 유도하였고 , 이로 인하여 앞서 그림 9에서와 같이 NO 합성량이 증가한 것으로 확인할 수 있다.

그림 10. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.) 0.01%, 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%, 그리고 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 BAEC에서의 eNOS 뿐만 아니라 전사인자들의 발현량 분석

9. 한방재료 추출물에 의한 세포내 유전자 손상여부 분석

동물세포내에서 유전자 손상이 발생하게 되면 이의 회복을 위하여 Parp (Poly ADP ribose polymerase) 단백질의 활성변화가 유도되게 된다. 원래 116kDA 정도인 Parp 단백질이 유전자 손상이 세포내에서 발생하게되면 이의 repair나 recombination을 위하여 85kDa의 활성형으로 전환되게 되고, 이를 cleaved Parp (c-Parp)라고 부른다. 따라서 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 샘플을 처리한 후 세포내의 Parp, c-Parp 단백질양의 비교 분석을 통해 세포내에서 유발될 수 있는 유전자 손상를 모니터링 할 수 있다. 앞에서와 동일한 western blot 방법을 통하여 이 biomarker 단백질을 분석하고자 하였으며 실험 방법은 앞에서 언급한 것과 동일하다.

그림 11에서 관찰할 수 있는 바와 같이 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%와 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 0.01%의 경우 Parp 단백질의 양이 15%정도 감소하고, 반면에 c-Parp1의 단백질양이 2배 정도 증가하였다. 따라서 이를 첨가물로 인하여 BAEC내에서의 유전자 손상이 다소 발생하고 있음을 확인할 수 있다. 그러나 앞서 세포독성평가에서 거의 BAEC내에서의 독성영향은 관찰되지 않았으므로, 유전자 손상으로 인한 크게 영향이 없는 것으로 확신할 수 있었다.

그림 11. 한방재료 추출물에 의한 BAEC에서의 Parp 단백질 분석

그러나 앞서 세포내 독성이 관찰되었던 HeLa cell line의 경우는 아래 그림 12와 같이 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%와 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 0.01% 샘플 처리시에 Parp 단백질의 급격한 감소가 c-Parp의 증가로 이어지고 있어 BAEC에 비하여 큰 유전자 손상이 발생하고 있는 것을 확인할 수 있다. 그리고 이러한 유전자 손상이 앞서 언급하였던 세포독성으로 이어지고 이것이 세포성장에 큰 영향을 입힌 것으로 분석되어진다. 따라서 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 와 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 샘플의 경우 primary cell인 BAECs 에는 유전자 손상을 거의 유발하지 않으며, 이로 인하여 세포 성장에 영향을 입히지도 않았지만, 반면에 자궁경부암세포인 HeLa에 대해서는 유전자 손상을 비롯한 세포 성장에도 크게 영향을 입히는 것으로 분석할 수 있었다.

그림 12. 홍삼 추출물 (홍삼 Ext.) 및 홍삼-복합한약재 추출물 (공진옥골드 Ext.)에 의한 HeLa에서의 Parp 단백질 분석

10. 한방재료 추출물에 의한 세포내 cAMP 및 PKA 농도 측정

동물세포내에서 가장 중요한 신호전달물질로 인정받고 있는 것이 cAMP이다. cAMP는 대부분의 단백질의 활성을 조절하는 초기물질로 BAECs내에서 NO 생산 단백질인 eNOS의 합성을 증가시키는 물질로도 알려져 있으며, 뿐만 아니라, 동물세포의 대사조절의 근원이 되기도 한다. 따라서 cAMP의 합성량이 증가하는 것은 세포내 활성 및 성장 촉진에 좋은 신호이기도 하다. 본 실험에서는 준비된 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.), 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 샘플을 BAECs에 처리하여 cAMP의 증가량을 측정해 보기로 하였다. 세포내 cAMP 측정방법은 다음과 같다.

세포내 cAMP 측정

실험
방법

1) 한방재료 추출물 샘플을 처리 후 배양한 혈관내피 세포에서의 cAMP 량은 ELISA kits (DE0355, R&D systems)를 이용하여 측정한다.
2) 0.1N HCl을 이용하여 배양된 세포를 lysis한 후, 50μL cAMP conjugate, 50μL cAMP antibody을 첨가한 후 2시간동안 상온에서 shaking 해 준다.
3) 반응 후, Kits내에 있는 wash buffer를 이용하여 세 번씩 반복하여 내용물을 ashing한 후, 200μL pNPP substrate를 첨가한 후 상온에서 shaking 없이 한시간 동안 반응시킨다.
4) 반응종료 후, 50μL stop solution을 첨가하고, 405nm에서 흡광정도를 측정한다.
5) PKA 활성도 측정을 위해서는 일정 조건으로 배양된 세포를 PKA extraction buffer (25mM Tris-HCL (pH7.4), 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 10mM beta-mercaptoethanol, 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml aprotinin)을 이용하여 sonication을 통하여 핵막까지 lysis한다.
6) 활성도 측정은 PepTagAssay Kits (V5340, Promega Co.)를 이용하였으며, say protocols에 따라 5μL PKA reaction buffer, 5μL PepTag A1 peptide, 5μL PKA activator solution, 1μL Peptide protector를 혼합하여 30C에서 1분간 반응시킨 후, 실제 분리된 PKA sample을 각각 첨가한 후 30분간 상온에서 반응시킨다.
7) 반응종료 후에는 95에서 heat inactivation하고 0.8% agaroase gel (50mM Tris-CL)를 이용하여 gel runing한다. UV illumination 후, (-/+) charge로의 이동으로 인산화 된 PKA와 비인산화 PKA를 분류하여 비교 분석한다.

그림 13에서는 BAECs에 홍삼 추출물(홍삼 Ext.) 0.01%, 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 0.01%, 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 0.01%를 24시간동안 처리한 후 세포내에서 증가하는 cAMP 농도를 측정하였다. 앞서 결과와 동일한 패턴으로 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드)와 복합한약재 추출물(GJO)은 8배 이상으로 cAMP 농도가 증가하였고, 이것은 세포 성장을 자극하는 활성증가로 관찰되었다.

그림 13. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 및 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 BAEC에서의 cAMP 농도 분석

또한 cAMP로 인하여 전달되어 제일먼저 활성화에 도달하는 protein kinase A (PKA)의 활성을 분석한 결과, 아래 그림 14에서와 같이 홍삼-복합한약재 추출물 0.01%의 농도로 처리된 BAECs내에서의 PKA의 phosphorylation 정도가 가장 크게 관찰되어 활성증가가 가장 큰 것으로 관찰되었다.

그림 14. 홍삼 추출물(홍삼 Ext.), 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 및 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의한 BAEC에서의 PKA 활성 분석

11. 이차원 액상 크로마토그래피 기법을 이용한 한방재료 추출물이 세포내

미치는 영향 분석 방법

프로테옴 기법은 세포에서의 실질적인 생명현상에 관여하는 단백질 수준에서의 이해를 도모하는 실험 기법으로 유전체 연구 시대 이후의 실험 기법이다. 이는 단일 단백질의 성질을 밝히고 이해하는 것만으로는 세포내에서 일어나는 모든 현상을 이해하는데 어려움이 있어 특정 환경에서 특정한 기능에 관련한 모든 단백질들을 전체적으로 이해하는데 적극 활용되고 있는 기법이다. 단백체 분석 기법 중 이차원 액상 크로마토그래피 기법은 기존 gel 기반의 이차원 전기영동기법에 비해 강산성, 강염기성 단백질 분석에 용이하며, 단백질 동정시 특별한 전처리 없이 동정이 가능하다는 장점을 가지고 있어 최근 많은 단백체 분석에 적극 활용되고 있는 최첨단 기법이다. 이에 본 연구에서는 공진옥골드 가 세포내 미치는 영향을 확인하기 위하여 이차원 액상 크로마토그래피 기법을 활용하였으며, 실험 기법은 다음과 같다.

액상 크로마토그래피 실험

시험명 : 한방재료 추출물이 BAEC 내에 미치는 영향 측정

시험 장소 : (재) 송도테크노파크 생물공학실

필요한 시약 TE buffer : Trypsin-EDTA

RIPA lysis buffer : 25 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40

Start buffer

Elution buffer

1M NaCl

Solution A : 0.1% (v/v) TFA in D.W.

Solvent B : 0.08% (v/v) TFA in acetonitrile:

필요한 기계 : ProteomeLab PF2D

내용 : * 본 시험 용역의 경우 소동맥혈관내피세포인 BAEC를 사용.

* 본 시험 용역의 경우 배양기는 SANYO CO2

incubator 사용하여 5% CO₂, 37도에서 배양 함.

1) 먼저 혈관을 구성하는 주요 세포인 소동맥혈관내피 세포(BAEC)를 10% FBS와 항생물질 복합체를 함유하는 DMEM 및 MEM을 사용하여 80 ~ 85% confluent 될 때까지 전배양을 한다.

2) 전배양 세포가 적정 수준까지 자라면 trypsin 처리 기법을 이용하여 배양 용기로부터 분리하고, 60p plate에 각각의 세포를 동일한 양으로 접종한다.

3) 새로이 접종한 세포가 60 ~ 70% confluent할 때까지 37, 5% CO₂ 조건에서 배양을 진행한다.

4) 1차 배양이 끝난 후, 배양액은 suction으로 제거하고 37로 warming 된 2% 농도의 홍삼, 공진옥골드, GJO가 첨가된 배지로 교환한 후, 24시간을 추가로 배양기에서 배양을 수행한다.

5) 24시간 후에 처리된 배지를 suction한 후에 200ul의 TE (Trypsin-EDTA) buffer를 처리한 후 incubator에서 2~3분 동안 방치한다.

6) 이 후, 1.9 ml의 DPBS 용액을 첨가한 후 세포를 plate에서 떨어뜨린다.

7) 확보된 세포는 원심분리 (4, 250rpm, 10 min)하여 균체만을 회수하였으며, 회수된 균체는 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) buffer 2ml을 이용하여 2번 세척하였다.

8) 세척 후, 회수된 균체는 RIPA lysis buffer (25 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40) 1 ml을 이용하여 재현 탁하였으며, sonicator를 이용하여 세포를 파쇄한다.

9) Sonication 후, 파쇄 현탁된 균체는 13,000 rpm으로 10 min 동안 centrifugation한다.

10) 이렇게 획득한 상층액은 buffer change를 위하여 start buffer (pH 8.5)로 equilibration되어 있는 PD-10 컬럼에 loading한 후, 10 분 동안 방치한다.

11) PD-10 컬럼에 loading 된 단백질을 회수하기 위하여 start buffer 2 ml을 재 loading 하였으며, 회수된 단백질은 Bradford 기법을 이용하여 단백질 정량한다.

12) 이차원 액상 크로마토그래피에 injection할 샘플들은 1.5 mg/ml의 농도로 준비하였으며, 샘플 injection 전에 일차 컬럼은 컬럼 volume 30배의 start buffer로 equilibration 시켜 컬럼 내부의 pH가 8.3 - 8.5가 되도록 만들어 준다.

13) pH에 따른 단백질 분리를 위하여 1.5 mg/ml로 정량된 각 샘플의 단백질들 (BAEC 세포, BAEC에 GJO를 처리한 샘플, BAEC에 홍삼을 처리한 샘플, BAEC에 공진옥골드를 처리한 샘플)을 loop에 injection 한다.

14) 샘플 injection 후, 20분 동안은 start buffer가 loop에 흐를 수 있도록 하였으며, 20 분 후에 elution buffer (pH 4.0)가 loop로 바뀌도록 프로그래밍 한다. ( *유속은 200ul/min으로 수행한다. )

15) 각 샘플의 단백질은 isoelectric point (pI)에 따라 elution되며, pH에 따른 단백질 회수가 끝난 후에는 컬럼 volume 10배의 1 M NaCl solution을 이용하여 컬럼을 세척한다.

16) 각 샘플의 단백질은 pH 0.3의 간격으로 회수되어 1차 2ml의 96 well plate에 모은다.

17) 다양한 pI별 (pH 8.0-4.0)로 분획 회수된 각 샘플들의 단백질 수용액 시료들은 0.2 ml 씩 이차원 크로마토그래피 컬럼에 자동 injection 한다.

18) 이차원 크로마토그래피를 통한 원활한 단백질 회수를 위하여 컬럼은 50 ℃로 유지하였으며, flow rate는 0.75 ml/min으로 유지한다.

19) 단백질을 크기에 따라 분리하기 위하여 D. W에 0.1% (v/v) TFA을 첨가한 Solvent A와 acetonitrile에 0.08% (v/v) TFA을 첨가한 Solvent B를 준비한다.

20) 단백질은 Sovent B를 0-100%의 농도로 gradient를 주어 회수한다. 각 fraction은 30초에 시작하여 24.3초 사이에 회수된다.

21) 일차원 크로마토그래피는 UV 214 nm에서 검출되었으며, 이차원 크로마토그래피는 UV 280 nm에서 검출된다.

22) 이차원 크로마토그래피를 통하여 검출된 단백질 pick은 proteovue program을 이용하여 이미지화 시킨다.

이차원 액상 크로마토그래피 기법을 이용하여 회수된 각 샘플의 단백질들은 먼저 크로마토그래피 포커싱(chromatographic focusing) 단계를 통하여 pI별로 분리되었으며, 다음으로 이차원 리벌스 페이스 칼럼(reverse phase column)을 이용하여 분자량별로 최종 분리되었다. 이렇게 분리된 단일 단백질 수용액은 이차원 전기영동기법 기반의 단백체 분석기법에서의 단백질 분석과 단리 특별한 전처리 공정 없이 바로 MALDI-TOF/TOF MS/MS 등과 같은 다양한 단백질 동정 기법을 이용하여 단백질을 동정할 수 있다.

12. 이차원 액상 크로마토그래피 기법을 이용한 한방재료 추출물이 세포내

미치는 영향 분석 결과

각 샘플들의 단백질들에 대한 이차원 액상 크로마토그래피 분석을 위하여, 먼저 크로마토그래피 포커싱 (chromatographic focusing)단계에서 각 샘플에 포함되어 있는 단백질들은 pI별로 분리하였다. 이때 각 샘플은 pH 8.0 - 4.0에서 분리가 일어나며, 각 well은 pH 0.3 간격으로 분리하였으며, 각 샘플에 대한 크로마토그래피 포커싱 결과는 다음과 같다.

그림 16. BAEC 단백질(A), BAEC에 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 처리(B), BAEC에 홍삼 추출물(홍삼 Ext.) 처리(C), BAEC에 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리한 (D) 각 샘플에 대한 크로마토그래피 포커싱 결과

각 샘플들의 단백질들에 대한 크로마토그래피 포커싱 (chromatographic focusing) 분석 결과 BAEC 세포 단백질, 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 처리한 BAEC 세포 단백질, 홍삼 추출물(홍삼 Ext.) 처리한 BAEC 세포 단백질, 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리한 BAEC 세포 단백질은 pH 8.0-4.0 사이에서 pH 0.3씩 분리가 성공적으로 일어났으며, pH 8.0 이전에 생기는 높은 피크는 pH 8.0 이상의 강알카리 성질을 띠고 있는 단백질로 칼럼에 단백질이 결합하지 못하고 elution된 단백질이며, pH 4.0 이후에 생기는 높은 피크는 자기 pI에서 제때 elution되지 못하고 떨어진 단백질 및 pH 4.0 이하의 강산의 단백질로 NaCl에 의해 washing되어 떨어진 단백질로 분석되었다. 이렇게 분석된 분리 회수된 단백질은 2차 이차원 리벌스 페이스 칼럼(reverse phase column)을 이용하여 분자량별로 최종 분리하였다.

다양한 pI별 (pH 8.0-4.0)로 분획 회수된 각 샘플들의 단백질 수용액 시료들은 0.2 ml 씩 이차원 크로마토그래피 칼럼에 자동 injection하였으며, 이차원 reverse phase column으로 자동 injection된 단백질들은 크기에 따라 분리, 회수하기 위하여 D. W에 0.1% (v/v) TFA을 첨가한 Solvent A와 acetonitrile에 0.08% (v/v) TFA을 첨가한 Solvent B를 0-100%의 농도로 gradient를 주었다. 각 fraction은 30초에 시작하여 24.3초 사이에 회수되었으며, 이차원 크로마토그래피는 UV 280 nm을 이용하여 검출하였다. 이차원 크로마토그래피를 통하여 검출된 단백질 pick은 proteovue program을 이용하여 이미지화 시켰다.

그림 17. BAEC 세포에서 분리된 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과

pH 8.0 - 4.0 사이에서 약 100개의 pick을 확인 할 수 있었으며, pH 5.0 - 4.7에서 보이는 것은 칼럼에 잔존하는 많은 양의 단백질이 한 번에 흘러나오는 것을 확인 할 수 있었다. BAEC 세포 전체 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과를 컨트롤로 BAEC에 복합한약재 추출물(GJO Ext.)을 처리 세포의 전체 단백질, BAEC에 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)을 처리한 세포의 전체 단백질, BAEC에 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리 세포의 전체 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과와 비교 분석하였다.

그림 18. BAEC 세포에 복합한약재 추출물(GJO Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과

BAEC 세포에 복합한약재 추출물(GJO Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질 또한 pH 8.0 - 4.0 사이에 분포되어 있는 단백질의 분포를 확인하였다. 이를 통하여 약 130개 이상의 pick을 확인 할 수 있었으며, 확인된 pick 중 BAEC 컨트롤 세포에 비해 2 - 10배 이상의 단백질이 증가한 단백질을 30개 이상 확인 할 수 있었으며, 7번 lane의 2개 단백질과 23번 lane에서 1개 단백질은 기존에 없었던 단백질임을 확인 할 수 있었다 (그림 12에서 ①, ②로 표기함). 이와 같은 단백질들은 복합한약재 추출물(GJO Ext.)에 의하여 세포내 활성이 증가한 항산화활성, 항암활성 등의 기능을 가진 단백질일 것으로 예측되어 단백질 동정을 위하여 MALDI-TOF/TOF MS/MS 등과 같은 다양한 기법을 이용하여 단백질을 확인하는 실험을 진행 중에 있다.

그림 19. BAEC 세포에 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과

BAEC 세포에 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질 또한 pH 8.0 - 4.0 사이에 분포되어 있는 단백질의 분포를 확인하였으며, 이와 같은 실험을 통하여 약 180개 이상의 pick을 확인 할 수 있었으며, 확인된 pick 중 BAEC 컨트롤 세포에 비해 2 - 50배 이상의 단백질이 증가한 단백질을 60개 이상 확인 할 수 있었다. 특히, 1, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16번 lane에서 기존에 없었던 단백질 13 개를 확인 할 수 있었다 (그림 13에서 ① - ⑬으로 표기함). 이와 같은 단백질들은 홍삼액에 의하여 BAEC 세포내에서 활성이 증가한 항산화활성, 항암활성 등의 기능을 가진 단백질일 것으로 예측되어 단백질 동정을 위하여 MALDI-TOF/TOF MS/MS 등과 같은 다양한 기법을 이용하여 단백질을 확인하는 실험을 진행 중에 있다.

그림 20. BAEC 세포에 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과

그림 21. BAEC 세포, BAEC 복합한약재 추출물(GJO Ext.)처리 세포, BAEC 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)처리 세포, BAEC 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 처리한 세포에서 분리된 단백질들의 이차원 액상 크로마토그래피 결과들에 대한 proteovue program을 이용한 구체적인 비교 분석 결과

BAEC 세포에 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 처리한 샘플에서 분리된 단백질 또한 pH 8.0 - 4.0 사이에 분포되어 있는 단백질의 분포를 확인하였으며, 이와 같은 실험을 통하여 약 150개 이상의 pick을 확인 할 수 있었으며, 확인된 pick 중 BAEC 컨트롤 세포에 비해 2 - 50배 이상의 단백질이 증가한 단백질을 50개 이상 확인 할 수 있었다. 특히, 1, 3, 4번 lane에서 기존 BAEC, BAEC 복합한약재 추출물(GJO Ext.)처리, BAEC 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)처리 샘플에서 분리된 단백질의 이차원 액상 크로마토그래피 결과에서 확인 할 수 없었던 신규 단백질 6 개를 확인 할 수 있었다(그림 20에서 ① - ⑥으로 표기함). 이와 같은 단백질들은 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)에 의하여 BAEC 세포내에서 활성이 증가한 항산화활성, 항암활성 등의 기능을 가진 단백질일 것으로 예측되어 단백질 동정을 위하여 MALDI-TOF/TOF MS/MS 등과 같은 다양한 기법을 이용하여 단백질을 확인하는 실험을 진행 중에 있다. MALDI-TOF/TOF MS/MS 등과 같은 기법을 이용한 단백질 동정을 통하여 BAEC, BAEC 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 처리, BAEC 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)처리, BAEC 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 처리한 세포의 전체 단백질에 대한 이차원 액상 크로마토그래피 비교 분석 결과 BAEC에 복합한약재 추출물(GJO Ext.)처리를 통하여 새로이 발현된 단백질과 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)처리를 통하여 새로이 발현된 단백질, 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.) 처리를 통하여 새로이 발현된 단백질과 기존 복합한약재 추출물(GJO Ext.) 또는 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)처리에서 발현되었다가 발현되지 않은 단백질 등을 확인 할 수 있을 것으로 예상된다. 이와 같은 실험으로 복합한약재 추출물(GJO Ext.), 홍삼 추출물(홍삼 Ext.)이 세포내 미치는 좋은 영향뿐만 아니라, 부작용을 알 수 있으며 홍삼-복합한약재 추출물(공진옥골드 Ext.)을 같이 처리한 세포에 대한 전체 단백질에 대한 이차원 액상 크로마토그래피 분석을 통하여 두 한약재를 함께 처리함으로 기존 세포에 미쳤던 좋은 영향 및 각 한약재에 의해 유발되는 부작용에 대한 상호 상쇄 작용 등을 확인 할 수 있을 것으로 예상된다.

Claims

홍삼과 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초 및 영지버섯으로 이루어진 복합한약재를 추출하여 얻은 추출물이 포함된 암 치료 및 예방용 약제조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 약제조성물.
홍삼과 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초 및 영지버섯으로 이루어진 복합한약재를 추출하여 얻은 추출물이 포함된 심혈관질환 치료 및 예방용 약제조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 심혈관질환은 고혈압, 또는 심근경색인 것을 특징으로 하는 약제조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 추출물은 홍삼 1 중량부와, 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초 및 영지버섯 각각 0.01∼100 중량부를 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는 약제조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 추출물은 홍삼, 오가피, 사상자, 복분자, 산수유, 구기자, 오미자, 숙지황, 동충하초 및 영지버섯으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 또는 2종 이상의 한방식재료를 순환식 환류냉각추출장치로 추출하고 여과한 후, 감압 농축하여 얻은 것을 특징으로 하는 약제조성물.