CN109725100A

CN109725100A - 大山楂颗粒指纹图谱的检测方法

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Publication number: CN109725100A
Application number: CN201910015016.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡宝昌; 陈海超; 金俊杰; 李国维; 孙戡平; 郑艳萍
Original assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; NANJING HAICHANG CHINESE MEDICINE GROUP CO Ltd
Current assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; NANJING HAICHANG CHINESE MEDICINE GROUP CO Ltd
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN109725100B

Abstract

本发明公开了大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，该方法包括步骤1：供试品溶液的制备；步骤2：对照品溶液的制备；步骤3：分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4：将步骤3中获得的大山楂颗粒指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次大山楂颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成大山楂指纹图谱的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的大山楂指纹图谱能全面、客观的表征大山楂颗粒的质量、本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

大山楂颗粒指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中成药的检测方法，具体涉及大山楂颗粒指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，或者某些生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

大山楂颗粒是由山楂、麦芽、六神曲等制成，具有开胃消食的功能，常用于食积内停所致的食欲不振、消化不良、脘腹胀闷等。目前关于大山楂颗粒指纹图谱的检测方法较少，本发明采用高效液相色谱法建立大山楂颗粒的指纹图谱检测方法，对其中有效成分进行了准确的分析，对全面客观评价大山楂颗粒的质量具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，开发一种大山楂颗粒的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以保证大山楂颗粒的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保大山楂颗粒的安全性和有效性。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)、大山楂颗粒供试品溶液的制备：

分别称取不同批次的大山楂颗粒供试品，置于研钵中，研磨充分后称取适量大山楂颗粒粉末样品，加入甲醇溶液超声处理，冷却，摇匀，过滤，取上清液，然后加入适量甲醇溶液补足重量即可得到大山楂颗粒供试品溶液；

步骤(2)、对照品溶液的制备

精密称定熊果酸对照品，置于容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，得到熊果酸对照品溶液；

步骤(3)、分别精密吸取步骤1各批次供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤(4)、将步骤3中获得的各批次大山楂颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次大山楂颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成大山楂颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，步骤(1)中大山楂颗粒供试品溶液的制备方法为：取10批次的大山楂颗粒研磨充分后精密称定20g，置于100mL锥形瓶中，精密吸取40mL甲醇溶液，超声处理30min，滤过后取上清液，加入甲醇溶液补足重量，得10批次供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，步骤2对照品溶液的制备：取一定量的熊果酸对照品，精密称定后置于容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，制得浓度为0.5mg/mL熊果酸对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的大山楂颗粒的指纹图谱的检测方法，步骤(3)中，液相色谱条件为：色谱柱为YMC-Pack-ODS-A的C18色谱柱；流动相A相为纯水，流动相B相为乙腈，检测波长190nm，柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：10μL，梯度洗脱。

作为优选方案，以上所述的大山楂颗粒的指纹图谱的检测方法，其特征在于，梯度洗脱方式为：

程序	时间/min	A相体积/％	B相体积/％
				1	0	95	5
2	5	95	5
				3	25	90	10
4	30	90	10
				5	60	75	25
6	70	0	100

作为优选方案，以上所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，指纹图谱中选择3个共有峰作为大山楂颗粒指纹图谱的共有峰，熊果酸保留时间为6.172分钟，为1号峰，2号峰保留时间为14.523分钟，3号峰保留时间为48.47分钟。

指纹图谱检测条件的优化

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流)及不同提取溶剂(甲醇、水、乙醇)进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图峰信号差异较小且超声提取效率高，故采用超声提取的方法：另外本发明对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量高，所以选用甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

2.1、本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取190nm、210nm、254nm、 280nm波长处的色谱图，发现检测波长为190nm时，大山楂颗粒的主要药味山楂的有效成分熊果酸和齐墩果酸色谱图清楚，分离度好，且基线平稳，故选取190nm为检测波长；

2.2、本发明比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水3个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果，结果发现以乙腈-含0.1％磷酸水为流动相时，大山楂颗粒中各成分能达到较好的分离效果，故最终选定以乙腈-0.1％磷酸水为流动相。

另外本发明还考察了梯度洗脱方式，实验结果表明，不同的梯度洗脱方式，对各化合物的分离度影响大，本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目，优选得到最佳的梯度洗脱方式为：0～5min：5％～5％的乙腈；5～25min：5％～10％的乙腈；25～30min：10％～10％的乙腈；30～60min：10％～25％的乙腈；60～70min：25％～100％的乙腈。

有益效果：

本发明根据大山楂颗粒中所含的活性成分的结构性之特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的大山楂颗粒指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价大山楂颗粒的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。

用本发明所提供的方法所建立的大山楂颗粒指纹图谱，能有效地表征大山楂颗粒的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定大山楂颗粒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

本发明提供的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现好等优点。

附图说明

图1为本发明的熊果酸的对照色谱图。

图2为本发明的大山楂颗粒供试品的色谱图。

图3为本发明的10批次大山楂颗粒供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高效液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱 CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。

1.2药品与试剂

10批大山楂颗粒样品(由南京海昌中药集团有限公司生产制备得到)见表1；熊果酸(批号170321南京森贝伽生物科技有限公司)；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(分析纯)。

表1 十批次大山楂颗粒样品来源

实施例1一种大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)、大山楂颗粒供试品溶液的制备：

取上述表1的10批次的大山楂颗粒研磨充分后精密称定20g，置于100mL锥形瓶中，精密吸取40mL甲醇溶液，超声处理30min，滤过后取上清液，加入甲醇溶液补足重量，得10批次供试品溶液；

步骤(2)、对照品溶液的制备

取一定量的熊果酸对照品，精密称定后置于容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，制得浓度为0.5mg/mL熊果酸对照品溶液；

步骤(3)、分别精密吸取步骤1各批次供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，对照品色谱图如图1，批号1供试品溶液的色谱图如图2；

步骤(4)、将10批次的大山楂颗粒的供试品溶液HPLC数据导出为AIA格式，导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统2004版”，生成标准指纹图谱，并选择3个色谱峰为特征峰，1号峰为熊果酸，保留时间为6.172分钟，2号峰保留时间为14.523分钟，3 号峰保留时间为48.47分钟，可对指纹图谱相似度进行评价。10个样品的指纹图谱共有模式见图3，10批大山楂颗粒共有峰相对保留时间见表3，10批大山楂颗粒共有峰相对峰面积见表4，相似度评价结果见表5。根据指纹图谱相似度评价结果显示，不同批次的大山楂颗粒具有一定的差异，研究结果显示，指纹图谱相似度分析可以用于区分不同批次的大山楂颗粒，可以用于大山楂颗粒的质量控制。

以上所述的大山楂颗粒的指纹图谱的检测方法，步骤(3)中，液相色谱条件为：色谱柱为YMC-Pack-ODS-A的C18色谱柱；流动相A相为含0.1％磷酸的纯水，流动相B相为乙腈，检测波长190nm，柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：10μL，梯度洗脱如下表2：

表2 梯度洗脱方式

表3 大山楂颗粒共有峰相对保留时间

表4 大山楂颗粒共有峰相对峰面积

编号	峰1	峰2	峰3
				S1	8051658	4034763	3824711
S2	8010082	4108686	3814871
				S3	7812086	4047836	3800418
S4	7812086	4061588	3760418
				S5	8054656	4138048	3816262
S6	7953063	4066315	3816213
				S7	8367994	4034436	38.7393
S8	8354358	4057373	3919781
				S9	8269806	4172028	4050887
S10	8085986	4141920	3795957
				平均值	8077177	4086299	3840691
RSD	2.48	1.22	2.19

表5 不同批次大山楂颗粒指纹图谱相似度

实施例2：方法学考察

1.精密度实验

精密吸取实施例1中的170806批号的供试品溶液，按实施例1下色谱条件连续进样6次，其主要共有峰保留时间的RSD均小于0.41％，相对峰面积RSD均小于2.86％，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表6和表7。

表6 相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3
				1	6.319	14.677	48.937
2	6.326	14.749	48.99
				3	6.274	14.523	48.771
4	6.336	14.545	49.014
				5	6.297	14.615	48.622
6	6.354	14.661	49.203
				平均值	6.318	14.628	48.924
RSD	0.15	0.58	0.41

表7 相对峰面积

序号	峰1	峰2	峰3
				1	8593095	3816466	3671644
2	8162549	4055215	3731056
				3	8498247	3797223	3726675
4	8556573	3755842	3656412
				5	8369841	3801572	3725463
6	8125736	3912245	3645871
				平均值	8323940	3856427	3692853
RSD	2.27	2.86	1.05

2、稳定性试验

取实施例1中的170806批号的供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测定，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于1.66％、相对峰面积RSD均小于2.83％，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表8和表9。

表8 相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3
				1	6.212	14.521	48.633
2	6.197	14.487	48.626
				3	6.176	15.011	48.498
4	6.179	15.064	47.962
				5	6.22	14.655	48.594
6	6.182	14.788	48.243
				平均值	6.194	14.754	48.422
RSD	0.29	1.66	0.56

表9 相对峰面积

3、重复性试验结果

精密吸取实施例1中的170806批号的供试品溶液，以实施例1下的色谱条件进样，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于0.32％，相对峰面积RSD均小于2.5％，表明方法的重复性良好。具体实施例结果见表10和表11。

表10 相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3
				1	6.181	14.656	48.753
2	6.183	14.751	48.782
				3	6.185	14.727	48.759
4	6.189	14.618	48.595
				5	6.179	14.693	48.765
6	6.198	14.702	48.773
				平均值	6.185	14.691	48.737
RSD	0.11	0.32	0.14

表11 相对峰面积

序号	峰1	峰2	峰3
				1	8180646	4086882	3972037
2	7912919	4044934	3961927
				3	8231949	4150760	3851184
4	8301841	4129162	4014509
				5	8354721	4201514	4009825
6	8533654	4119587	3799542
				平均值	8252621	4122139	3934837
RSD	2.5	1.3	2.2

以上实验结果表明，本发明提供的大山楂颗粒指纹图谱检测方法，精密度高、稳定性好、重复性好，能全面客观评价大山楂颗粒的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本发明技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、大山楂颗粒供试品溶液的制备：

步骤(2)、对照品溶液的制备

2.根据权利要求1所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(1)中大山楂颗粒供试品溶液的制备方法为：取10批次的大山楂颗粒研磨充分后精密称定20g，置于100mL锥形瓶中，精密吸取40mL甲醇溶液，超声处理30min，滤过后取上清液，加入甲醇溶液补足重量，得10批次供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2对照品溶液的制备：取一定量的熊果酸对照品，精密称定后置于容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，制得浓度为0.5mg/mL熊果酸对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的大山楂颗粒的指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱条件为：色谱柱为YMC-Pack-ODS-A的C18色谱柱；流动相A相为含0.1％磷酸的纯水，流动相B相为乙腈，检测波长190nm，柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：10μL，梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述的大山楂颗粒的指纹图谱的检测方法，其特征在于，梯度洗脱方式为：

6.根据权利要求1所述的大山楂颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱中选择3个共有峰作为大山楂颗粒指纹图谱的共有峰，熊果酸保留时间为6.172分钟，为1号峰，2号峰保留时间为14.523分钟，3号峰保留时间为48.47分钟。