CN109415686A - 可给药到活体的水溶液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可给药到活体的水溶液及其制备方法，该可给药的水溶液具有向末稍细胞提供充足氧的功能，在缺氧或无氧刺激下对细胞造成的损伤和伤害较小，并且持续表现出足够高且稳定的细胞保护作用。通过冰埋入法用低温透射电子显微镜测量，本发明的可给药到活体的水溶液含有平均粒径为30 nm以下，密度为每毫升1016个气泡以上，优选平均粒径为1到10 nm，密度为每毫升1017个以上的含氧纳米气泡。本发明的可给药到活体的水溶液含有含氧纳米气泡，该含氧纳米气泡是通过从气缸外部喷射含有溶解氧的水溶液而产生的，该气缸具有沿圆周方向形成的2个以上的小通孔，在大气压或更高压力下，通过这些小通孔，喷射的溶液碰撞，使得水锤在平行于气缸径向的横截面的同一平面上集中在气缸的中心。

Description

可给药到活体的水溶液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种可给药到活体的水溶液及其制备方法，该可给药到活体的水溶液可减少缺氧或无氧刺激下的细胞的损伤和伤害，高效地保护细胞。
背景技术
如非专利文献1中所述，微纳米气泡的特征通常包括：
（a）气泡直径小，
（b）气泡上升速度慢，
（c）气泡减少摩擦阻力，
（d）气泡的内部压力高，
（e）气液界面大，
（f）气体溶解量大，
（g）气泡具有溶解或收缩，以及
（h）气泡表面带负电。
特别地，众所周知，含有纳米气泡的液体不能被视觉检测，从而是无色透明的，原因是纳米气泡非常小，粒径小于1 μm，并且纳米气泡能够长时间保留在液体中而不会漂浮在液体顶面，因为随着粒径减小，与粘性力相比，浮力变得非常小。利用这些特征，有望将纳米气泡应用于医疗领域。
例如，专利文献1公开了一种包含含氧纳米气泡的输注溶液，所述含氧纳米气泡的气泡直径为1至1000 nm，优选50至500 nm。专利文献1中公开的发明提供了具有高氧含量的输注溶液，以补偿具有向末稍细胞供应氧能力的“溶解氧”的不足，因为“溶解氧”在与红细胞结合的“结合氧”中的比率极低，且“溶解氧”溶解于红细胞。该输注溶液旨在用于“脑低温疗法”，“脑部无血手术”或“末梢循环不全症的治疗”。当将该输注溶液应用于小白鼠脑中，进行选择性冷却时，与不含含氧纳米气泡的输注溶液（林格氏溶液）相比，可以实现高的氧分压。专利文献1的实施例1中公开了含有含氧纳米气泡的盐水溶液可以通过专利文献2中记载的方法制备。
此外，专利文献3提出了含有NK（自然杀伤细胞）活化增强剂淋巴细胞，NK活性增强的单核细胞或细胞免疫制剂的输液制剂，其通过在含有纳米气泡水作为活性组分的NK活性增强剂的存在下培养而制备，其中，通过动态光散射法测定，含有气泡的纳米气泡水的数均直径为300 nm。专利文献3中的发明通过动态散射法测定，发现含有数均直径为300 nm以下的细微气泡的纳米气泡水具有增强NK活性的作用。事实上，使用体积平均粒径为0.3734 μm（373,4 nm）和数均直径为0.2995 μm（299,5 nm）的含氧纳米气泡证实了NK活性的增强。
另外，专利文献4公开了含有具有带电稳定，含含氧纳米结构的离子水溶液的水性流体，其中在离子水流中稳定地形成平均直径小于约100 nm的含氧纳米气泡。作为由界面动电而改变的水性流体，用于制备心血管疾病或其状态的治疗药物。还描述了在离子水溶液中包含盐水。
另一方面，含有纳米气泡的输注溶液或生理盐水溶液除了用于上述治疗目的之外，还作为用于治疗或预防癌症的药物正在予以研究。例如，专利文献5的实施例1提出将含氧纳米气泡水及含氧纳米气泡水和含臭氧纳米气泡水混合后得到的盐浓度为0.3质量％的纳米气泡水，用于治疗或预防癌症。文中描述了在此使用的纳米气泡水通过专利文献2中描述的方法制备。
现有技术参考文献
专利文献
专利文献1：专利公开2011-1271号公报
专利文献2：专利公开2005-246294号公报
专利文献3：专利公开2010-75180号公报
专利文献4：专利发表2013-538803号公报
专利文献5：专利公开2009-84258号公报
非专利文献
非专利文献1：Hideki Tsuge, "Basis of Microbubble Nanobubbles," Bull. Soc.Sea Water Sci., Jpn., 2010, 第64卷，4-10页。
发明内容
本发明要解决的问题
已经研究了含有含氧纳米气泡的水溶液，其可以应用于诸如生理盐水溶液，输注溶液或细胞培养溶液的可给药到活体的水溶液，并且在改善氧供应和各种治疗方面具有一定的效果。然而，从确保医疗效率，安全性和保障的观点来看，具体应用尚未取得进展，因为效果小于预期效果，效果存在波动，并且效果不稳定。为了将含有含氧纳米气泡的水溶液应用于生理盐水溶液，输注溶液或细胞培养溶液，必须清楚地证明其效果可以稳定地获得且能够持续。
在上述可给药到活体的水溶液中，生理盐水溶液特别有用，因为它可用作输注溶液、含有各种添加剂的输血或注射药物的溶剂。因此，对生理盐水溶液的需求很大，其具有向末梢细胞提供充足氧的功能，在缺氧或无氧刺激下对细胞的损伤和伤害较小，并且可以增强保护细胞的效果。
尽管上述专利文献1中描述的输注溶液被限定具有1至1000纳米气泡直径的含氧纳米气泡，但实际用于生产输注溶液的生理盐水溶液中包含的含氧纳米气泡的气泡直径为50至500纳米。上述专利文献1描述了与不含含氧纳米气泡的输注溶液（林格氏溶液）相比，在含有含氧纳米气泡的输注溶液中观察到更高的氧分压。然而，其作用尚未定量验证，并且尚不清楚它实际上是否具有在缺氧或无氧刺激下保护细胞的作用。根据本发明发明人的研究，已经证实含有含氧纳米气泡的输液剂在缺氧或无氧刺激的存在下几乎没有保护细胞的效果，并且当可给药到活体的水溶液，例如生理盐水溶液，中含有的含氧纳米气泡的气泡直径为50 nm以上时，与不含含氧纳米气泡的生理盐水溶液相比优势几乎没有差异。已经发现，通过与上述专利文献1中描述的发明相同的方法制备的上述专利文献2中描述的含氧纳米气泡水不足以产生在缺氧或无氧刺激下保护细胞的效果。
通过动态光散射法测定，上述专利文献3中描述的输注制剂具有数均直径为300nm以下的氧气泡，但实施方式之一中实际研究的含氧纳米气泡的气泡直径是数均直径299.5 nm。因此，和上述专利文献1和2一样，是否具有在缺氧或无氧刺激下保护细胞的充分效果并不明确。根据本发明的发明人使用具有气泡直径为50 nm以上的含氧纳米气泡的生理盐水溶液进行上述研究的结果，上述专利文献3中描述的发明也难以获得在缺氧或无氧刺激下保护细胞的效果。
另外，上述专利文献4公开了水性流体，其中在离子水流中稳定地形成平均直径小于约100 nm的含氧纳米气泡。然而，实际上没有测量含氧纳米气泡的平均直径，并且基于当通过孔径为0.22和0.1微米的过滤器时溶解氧的测量结果，仅小于100 nm。此外，在上述专利文献4中没有记载水性流体中含有的含氧纳米气泡的密度。目前尚不清楚它是否是在缺氧或无氧刺激下能够发挥保护细胞效果的水性流体。
此外，如专利文献5所公开的，尽管纳米气泡水，预计可有效地治疗或预防癌症，但因不能获得纳米气泡水稳定持续的显著功效从而受到质疑，目前它在治疗方面应用尚未取得进展。这是因为现有技术中使用的纳米气泡水的气泡直径为至少50 nm或更大。依赖于诸如温度和储存条件的操作环境，所得纳米气泡可能快速消失，并且在对体内细胞和血管的吸收或渗透性方面不能充分发挥作用。即便是在上述专利文献5的发明中，使用的纳米气泡水也是通过专利文献2中描述的方法制备的，并且纳米气泡水的气泡直径为50 nm以上。
本发明是为了解决上述常规问题，基于验证当在可给药到活体的水溶液，例如生理盐水溶液中含有的含氧纳米气泡的平均粒径和密度分别比现有技术小和高时，在缺氧或无氧刺激下可以充分获得保护细胞的效果。本发明的目的是提供一种可给药到活体的水溶液及其制备方法，该方法通过降低其中所含含氧纳米气泡的平均粒径以及增加含氧纳米气泡的密度，从而减少在缺氧或无氧刺激下细胞的损伤或伤害，达到保护细胞的效果以及抑制或防止可能在无氧环境中发生的癌细胞的增殖和过度生长的效果，并稳定地予以维持。
解决问题的手段
本发明解决问题的手段是将生理盐水溶液等可给药到活体的水溶液中所含的含氧纳米气泡平均粒径减小到小于50 nm并且限定较高的密度，以及进一步将具有这种性质和特性的含氧纳米气泡的形成方法应用于制备可给药到活体的水溶液的。
因此，本发明的技术特征如下。
本发明提供一种可给药到活体的水溶液，
[1] 该可给药的水溶液包括含有含氧纳米气泡的水溶液，该含氧纳米气泡的平均粒径为30 nm以下，密度为每毫升水溶液1016以上个气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
[2] 本发明提供了上述[1]中所述的可给药到活体的水溶液，
该可给药的水溶液包括含有含氧纳米气泡的水溶液，该含氧纳米气泡的平均粒径为1至10 nm，密度为每毫升水溶液1017以上个气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
[3] 本发明提供了上述[1]或[2]中所述的可给药到活体的水溶液，
其中该可给药的水溶液是生理盐水溶液，其中所述可给药到活体的水溶液是生理盐水溶液，100质量份的所述可给药到活体的水溶液包含0.85至0.95质量％的氯化钠。
[4] 本发明提供了上述[1]至[3]中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
添加有5％葡萄糖溶液的低渗复合电解质溶液、林格氏溶液和含有高卡路里流体和肝素的生理盐水溶液。
[5] 本发明提供了上述[1]至[4]中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
其中所述可给药的水溶液是细胞培养液。
[6] 本发明提供了上述[1]至[4]中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
其中该可给药的水溶液通过给药或口服摄入到活体来使用，以抑制或预防癌细胞的增殖和过度生长。
[7] 本发明提供了一种制备可给药到活体的水溶液的方法，所述方法包括：
通过气缸中的两个或多个小通孔，在高于大气压的压力下从气缸外部注入水溶液来产生含有溶解氧的水溶液的射流，所述通孔以下述配置设置在气缸的圆周方向，即两个或多个小通孔的各个开口在平行于气缸的径向横截面的同一平面上彼此面对地设置；
在气缸内使水溶液射流进行碰撞，从而射流的水锤集中在气缸中心；和
通过水溶液射流的相互碰撞产生含氧纳米气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径为30 nm以下，密度为每毫升水溶液1016以上个气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
[8] 本发明提供了上述[7]所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中含氧纳米气泡的平均粒径为1至10 nm，密度为每毫升水溶液1017以上个气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
[9] 本发明提供了上述[7]或[8]所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，其中氧气泡由气泡产生装置产生，所述气泡产生装置包括：
分别吸入气体和液体的装置；
对上述气体和液体进行同时加压并将其转移的装置；
通过将转移的含有气体的上述液体与新的氧气混合来富集溶解氧的气液混合槽；以及
使用气液混合槽中处于气液混合状态的溶解液产生纳米气泡的喷嘴。
上述喷嘴包括：
空心气缸；
上述气缸的周方向上的两个以上小通孔的各个开口在平行于气缸的径向横截面的相同平面内彼此面对的上述两个以上的小通孔；
以及设置在空心气缸的至少一端上的纳米气泡排出口;
其中，所述小通孔如此设置，使得穿过每个小通孔的横截面的相应中心的所有延伸线在所述气缸的空腔内部彼此相交。
[10] 本发明提供了上述[7]至[9]中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，四个到八个数量的小通孔在气缸的圆周方向上等距离地布置，在平行于气缸的径向横截面的相同平面内彼此面对，并且通向该气缸空腔的部分的孔径为0.1至0.5毫米。
[11] 本发明提供了上述[7]至[10]中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，可给药到活体的水溶液是生理盐水溶液，100质量份的所述可给药到活体的水溶液包含0.85至0.95质量％的氯化钠。
[12] 本发明提供了上述[11]所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，作为含有上述溶解氧的水溶液，使用了含有0.85至0.95质量％的氯化钠的水溶液用来制造生理盐水溶液。
[13] 本发明提供了上述[11]所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，所述方法包括：
使用不含氯化钠的水溶液作为含有上述溶解氧的水溶液，在制备含有上述含氧纳米气泡的水溶液后，
向上述含有含氧纳米气泡的水溶液中，按100质量份的上述生理盐水溶液含0.85至0.95质量％氯化钠的比例添加氯化钠来制备生理盐水溶液。
[14] 本发明提供了上述[7]至[13]中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中所述可给药的水溶液是输注溶液，所述输注溶液是通过向所述可给药的水溶液中添加至少一种添加剂而制备，
其中所述添加剂含有选自由钾和钙中的至少一种元素，5％葡萄糖溶液，氨基酸和肝素组成的组中的至少一种。
[15] 本发明提供了上述[7]至[14]中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中可给药的水溶液被制成用于培养细胞的细胞培养液。
[16] 本发明提供了上述[7]至[14]中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中可给药的水溶液，用于通过给药或口服摄入到活体来抑制或防止癌细胞的增殖和过度生长。
发明效果
本发明可给药到活体的水溶液含有大量的含氧纳米气泡，其平均粒径小于现有技术中的含氧纳米气泡，其具有向末梢细胞充分供氧的功能，由于在缺氧或无氧刺激下对细胞的损伤或伤害较小，从而提高了保护细胞的效果。此外，不仅具有长期稳定保护细胞的效果，而且还可以大大减少其效果的变化。
此外，由于本发明的可给药到活体的水溶液具有30 nm以下，优选1至10 nm的气泡直径，其小于现有技术中的气泡直径，因此纳米气泡的寿命不受温度或储存条件等操作环境的影响，含有这种纳米气泡的纳米气泡水的吸收性和对生物体内细胞，血管等的渗透性优异。因此，可以稳定且连续地获得抑制可能在无氧环境中出现的癌细胞的增殖和过度生长的效果。
在本发明的制备可给药到活体的水溶液的方法中，与使用传统的纳米气泡发生器制备的纳米气泡相比，可以大量且稳定地生产平均粒径为30 nm以下的含氧纳米气泡。因此，可以容易地制备可给药到活体的水溶液，其具有使细胞在缺氧或无氧刺激下几乎没有损伤或伤害的效果，以及抑制或防止可能在无氧环境中出现的癌细胞的增殖和过度生长的效果，并且这些效果可以稳定且连续地获得。在现有技术中难以制备具有这种效果的可给药到活体的水溶液，其只能通过本发明的方法获得。
附图说明
图1表示本发明的用于制备可给药到活体的水溶液的含氧纳米气泡发生器的正视图和透视图。
图2示出了用于产生含氧纳米气泡的喷嘴形状和用于向图1所示的含氧纳米气泡发生器中注入处理液的喷嘴头的示例。
图3示出了图2中所示的液体碰撞喷嘴12的一种形状。
图4示出了参考实施例1中空气纳米气泡水和不含纳米气泡水的水的无定形冰的电子显微镜图像和纳米气泡的粒径分布的照片。
图5示出了实施例1中的用于含氧纳米气泡水的水的无定形冰的电子显微镜图像的照片。
图6示出了通过使用实施例1中的动态光散射法测量的含氧纳米气泡水的气泡粒径的数量分布。
图7示出了在实施例1和对比例1中在无氧环境中放置前后的细胞的形态变化的照片。
图8示出了在实施例1和对比例1中在无氧气氛中放置前后细胞毒性期间酶（LDH）泄漏量的测量结果。
图9示出了在实施例1和对比例1中在无氧环境中放置前后的细胞生长（细胞活力）的测量结果。
图10示出了显示在实施例1和对比例2中在无氧环境中放置后的细胞中的形态变化的照片。
图11示出了在实施例1和对比例2中在无氧气氛下放置后测量的细胞存活率。
图12示出了用于实施例3和对比例3中的培养癌细胞的市售的缺氧培养试剂盒。
图13示出了实施例3和对比例3中在O2浓度为约1％的缺氧气氛中放置6小时和24小时后HIF-1a和HSC70蛋白的诱导结果。
图14示出了通过图像处理以数字形式转换图13A所示的黑色部分的面积的过程。
符号的说明：
1 氧气纳米气泡发生器 2 波纹管气缸泵 3 气液混合槽
4 泵控制器 5 压力传感器 6 纳米气泡产生的喷嘴附件
7 吸液管 8 吸气口 9 吸气调节阀
10 喷嘴头 11 注入喷嘴 12 液体碰撞喷嘴
13 工作台 14 夹子 15 夹子 16 气体阻隔袋
17 Ｏ2传感器 18 细胞培养孔板 19 气体浓度调节剂。
具体实施方式
如非专利文献1中所述，已经提出了各种用于产生气体微纳米气泡的方法，例如旋流液流型，静态混合型，文丘里型，加压溶解型和孔型。另外，如上述专利文献1和2中所述，也有人提出通过对水溶液中含有的氧微泡进行物理刺激，产生具有更小气泡直径（气泡直径为50至500 nm）的臭含氧纳米气泡的方法。然而，通过这些传统的纳米气泡产生方法获得的气泡直径限制在约50 nm，即使是最小的气泡直径。此外，由于100 nm以下的气态纳米气泡是直径小于可见光和紫外光波长的非常细的颗粒，因此尚未找到能够精确测量粒径的测量技术。通常称为含有气体纳米气泡的水溶液难以清楚地证明存在具有几十纳米以下粒径的纳米气泡。
本发明的发明人已经证实了使用含有50 nm作为最小气泡直径的含氧纳米气泡的生理盐水溶液在缺氧或无氧刺激下保护细胞的有效性，其通过常规的微纳米气泡产生方法获得。在将含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液与浓度为50质量％的细胞培养液混合的状态下，通过定量和定性测量无氧（缺氧）刺激下细胞形态和细胞损伤程度的变化来进行验证，从而确定实际可以实现细胞保护的程度。结果表明，细胞损伤程度与没有含氧纳米气泡的正常生理盐水溶液几乎相同，并且含有气泡直径为50 nm以上的含氧纳米气泡的生理盐水溶液导致大的细胞损伤，从而增加细胞损伤。因此，已经阐明，仅限定生理盐水溶液中包含的含氧纳米气泡的气泡的粒径通常小于1000 nm，小于500 nm，小于300 nm或小于100 nm达不到保护细胞的效果。
根据以上对缺氧或无氧刺激下细胞保护效果的验证结果，本发明通过反复试验研究一种制备含有具有这种性质和特性的含氧纳米气泡的生理盐水溶液的方法，并发现一种可行的方法，基于以下观点：与常规方法相比，通过增加生理盐水溶液中所含含氧纳米气泡的密度，以及减小其中的含氧纳米气泡的平均粒径，可以充分获得缺氧或无氧刺激下对细胞的保护效果。通过使用按照本发明的方法实际制备的生理盐水溶液作为细胞培养液，证实了在缺氧或无氧刺激下细胞的保护效果。下面将在实施例中详细描述验证结果。
本发明的生理盐水溶液中的含氧纳米气泡的尺寸可以通过平均粒径来限定。平均粒径越小，含有的纳米级气泡量越多，粒径越大的气泡量越少。微纳米气泡的尺寸也受粒径分布（粒径的标准偏差）的影响，但影响很小。生理盐水中含有的纳米气泡要求具有小于50nm的平均粒径且尽可能小。
在本发明中，通过冰埋入法用低温透射电子显微镜测量，含氧纳米气泡的平均粒径在30 nm以下，优选1 nm以上且10 nm以下。当含氧纳米气泡的平均粒径为30 nm以下时，由于细胞损伤或伤害较小，可以稳定且连续地获得在缺氧或无氧刺激下保护细胞的好效果。另外，如果平均粒径为10 nm以下，则可以实现显著的效果。另一方面，即使含氧纳米气泡的平均粒径小于1 nm，保护细胞的效果也会趋于饱和，考虑到组装含氧纳米气泡发生器所涉及的高技术障碍，从经济效率和易维护性出发，优选将平均粒径限定为1 nm以上。
在本发明中，不仅需要限定含氧纳米气泡的平均粒径，还需要限定1ml可给药的水溶液，例如生理盐水溶液中所含的数量，即含氧纳米气泡的密度。这是因为为了在缺氧或无氧刺激下充分发挥保护细胞的功能，需要增加每毫升可给药到活体的水溶液，例如生理盐水溶液中含有的氧的总量。另一方面，需要通过使含氧纳米气泡的平均粒径非常小，在30nm以下，从而提高气泡的储存稳定性和粒径保持度。
通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量，本发明中使用的可给药到活体的水溶液，例如生理盐水中含有的含氧纳米气泡的密度为每1ml可给药到活体的水溶液1016以上个气泡，优选1017以上个气泡。首先，本发明中的含氧纳米气泡的平均粒径非常小。如果含氧纳米气泡的密度小于1016，则每单位体积的可给药的水溶液的氧浓度是低的，在缺氧或无氧刺激下保护细胞的效果是不足的。在缺氧或无氧刺激下保护细胞的效果随着氧浓度的增加而增加。另外，当含氧纳米气泡的平均粒径为1至10 nm时，含氧纳米气泡的密度优选为1017个气泡/ml以上，以确保可给药到活体的水溶液中所含的足够的氧浓度。
各种用于测量微纳米气泡的粒径的方法是已知的。其中，通过光学观察测量纳米气泡的方法是困难的。因此，已经提出了诸如使用米氏散射光的光散射法，激光衍射/散射法，用于观察溶液中气泡粒子的布朗运动的纳米粒子跟踪误差分析法，使用孔隙阻力束的共振质量测量法（呼叫计数器法），动态光散射法和MEMS（微机电系统）法。除了这些方法之外，还提出了通过泽塔电位测量确定纳米气泡的粒径的方法和使用自旋诱捕剂通过电子海绵共振（ESR）确认纳米气泡的存在的方法。
本发明的发明人提出了一种通过冰埋入法用低温透射电子显微镜测量微纳米气泡的方法（参见日本专利申请No.2014-230407）。在该方法中，液体中含有的超细气泡在无定形固态液体内固化，然后用透射电子显微镜观察包含在无定形固态液体中的超细气泡，并对含在液体中的超细气泡及其分布状态的图像进行分析。因此，可以精确地测量粒径小于10 nm的超细气泡。除了含氧纳米气泡的平均粒径之外，该方法还可以确定它们的粒径分布和密度。因此，通过该方法确定本发明中限定的含氧纳米气泡的平均粒径和密度。
通过冰埋入法使用低温透射电子显微镜的测量通过将用于在10至300千电子伏（keV）的能量下运行的透射电子显微镜观察的电子数量设置为每Å21至105个电子进行，使用微网格或容纳在微网格中的液体作为样本。
除了通过冰埋入法使用低温透射电子显微镜的测量之外，本发明中的含氧纳米气泡水的气泡粒径可以通过例如动态光散射法（光子相关法）测量。例如，可以使用由大塚电子制造的粒径/分子量测量设备（型号：ELSZ-2000 S）或泽塔电位/粒径/分子量测量系统（型号：ELSZ-2000 ZS）进行特定数据处理来测量10 nm以下的气泡尺寸。这里说的特定数据处理是指，例如，一种通过仅提取在增加累积测量次数时稳定存在的颗粒并仅删除不确定且测量时间随机反映的数据来测量粒径的方法。
作为本发明的发明人的研究结果，证实了通过动态光散射法测量的粒径的测量结果与通过冰埋入法用低温透射电子显微镜的测量结果相同。下面实施例1中所示的具体数据用来描述两种测量方法之间的比较。然而，在动态光散射方法中，极难清楚地区分测量的颗粒是填充的还是未填充的。由于技术限制，含氧纳米气泡密度的高精度测量也是困难的。与动态光散射法相比，本发明中的低温透射电子显微镜测量不仅可以通过用电子显微镜测量来清楚地区分填充颗粒和未填充颗粒之间的差异，还可以高精度地测量含氧纳米气泡的密度。因此，本发明采用冰埋入法使用低温透射电子显微镜测量含氧纳米气泡直径的方法。
本发明的可给药到活体的水溶液可以通过基本上含有0.9质量％的氯化钠而用作生理盐水，使得其渗透压与血液或体液的渗透压相容，如一般的生理盐水溶液那样。即使在某种程度上存在变化，本发明的生理盐水溶液中的氯化钠含量也是可接受的。然而，当氯化钠含量与0.9质量％差别很大时，其使用受到很大限制。因此，当将本发明的可给药到活体的水溶液用作生理盐水溶液时，基于100质量％的生理盐水溶液，优选含有0.85至0.95质量％的氯化钠。
当调节其氧化还原电位以与人体器官或体内反应中的氧化还原电位相匹配时，本发明的生理盐水溶液可含有少量氢纳米气泡或其他电解质溶液。为了调节生理盐水溶液的pH，还可以添加由电解质等组成的pH调节剂。
本发明的可给药的水溶液也可以用作含有各种如下的添加剂的输注溶液。例如，输注溶液包括通过向本发明的生理盐水中添加低渗复合电解质溶液，其中添加有预定量的5％葡萄糖溶液，含有钾或钙的林格氏溶液，含有葡萄糖或氨基酸的高卡路里溶液，含有肝素的生理盐水溶液。在本发明的输注溶液的制备中，由本发明获得的生理盐水溶液通常用作溶剂，但不一定限于含有0.85至0.95质量％的氯化钠的生理盐水溶液。当将本发明的输注溶液给药到活体时，如果输注溶液的渗透压不一定需要与血液或体液的渗透压紧密匹配，可以使用含有少量氯化钠或不含氯化钠水溶液，或含有上述各种添加剂的，高含量的氯化钠的水溶液作为输注溶液使用。
本发明的生理盐水溶液或输注溶液可以用作培养血管平滑肌细胞等各种细胞的水溶液，例如，当试图在运动期间或运动后减少低血糖和缺氧状态下的细胞损伤和伤害并且增强对由心肌梗塞，脑梗塞和其他循环障碍引起的细胞毒性的保护时，能够收到很大的效果。
本发明的可给药到活体的水溶液也可以作为给药或口服摄入到活体的水溶液，以抑制或防止在缺氧浓度的无氧气氛中发生的癌细胞的增殖和过度生长。已知癌细胞倾向于在无氧气氛下生长。因此，认为在癌细胞周围形成高氧浓度的需氧环境，可以抑制癌细胞的增殖和过度生长。因此，例如，如上述专利文献5中所公开的，已经提出可以使用具有50 nm至500 nm的气泡直径的纳米气泡水来治疗癌症。然而，由于体内正常细胞和血管表面上的孔径为30 nm以下，具体为几纳米到几十纳米，所以当含有氧或臭氧的纳米气泡水的气泡直径为50 nm以上时，对体内细胞或血管的吸收或渗透性不一定是足够的。此外，因为生物体通常保持在35-37℃的略微高的温度，所以随着纳米气泡的尺寸变大，气泡的膨胀加速，并且促进气泡消失，这样达不到对癌细胞的增殖和过度生长的抑制或预防效果。即使有效，也不稳定。
与现有技术相比，本发明的可给药到活体的水溶液中含有的含氧纳米气泡是平均粒径为30 nm以下，优选1至10 nm的气泡，并且气泡中的密度非常高，因此它们对体内细胞和血管是高度可吸收的或可渗透的，并且以上述气泡直径存在的纳米气泡寿命相对较长。结果，与常规的含臭氧纳米气泡水或含臭氧和含氧的纳米气泡水并用的情况相比，即使本发明的仅含含氧纳米气泡的水溶液也可以长时间保持癌细胞的周围环境处于高氧浓度的需氧状态，从而提升抑制或预防癌细胞增殖和过度生长的效果。此外，该效果可以持续相对长的时间。因此，本发明的可给药到活体的水溶液作为药物具有抑制或预防癌细胞增殖和过度生长的功能，并且是诸如癌症治疗的医学领域中合适的水溶液。
接下来，将参考附图说明本发明的用于制备生理盐水溶液的含氧纳米气泡发生器。
图1示出了用于本发明的含氧纳米气泡发生器的实例，其基本构造与日本专利第5555892号中记载的相同。图1（a）和图1（b）分别是臭含氧纳米气泡发生器的正视图和透视图。在图1所示的含氧纳米气泡发生器1中，2是波纹管气缸泵，3是气液混合槽，4是泵控制器，5是压力传感器，6是纳米气泡产生的喷嘴附件，7是吸液管，8是吸气口，9是吸气调节阀。
以上部件如图1（b）的透视图所示设置。使用由氟化树脂制成的波纹管气缸泵2，吸液管7和吸气调节阀9调节气体（氧气）的体积。然后，通过吸入泵内液体和氧气混合状态的液体，搅拌它们并将气体溶解在波纹管内将氧气溶解在加压液体内。在本发明中，波纹管气缸泵2可以是不含金属的，其中可以使用除氟化树脂之外的至少一种类型的塑料，例如聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯之类的通用塑料，聚缩醛、聚酰胺、聚碳酸酯和退化聚苯醚之类的工程塑料，以及聚醚砜，聚苯硫醚，聚醚醚酮和液晶聚合物之类的超级工程塑料。在这种情况下，通过使用上述各种塑料，包括氟化树脂，不仅在泵中而且在液体部分中，都可以获得高度可靠的清洁含氧纳米气泡发生器。在本发明中，当不需要通过严格的无金属转化进行清洁或灭菌时，也可以使用金属或陶瓷以及上述塑料。
然后，通过泵2搅拌气体和液体并泵送到气液混合槽3。泵2主要使用的是压缩空气致动的波纹管气缸泵也可以使用电动泵。气液混合槽3中的气体和液体受到来自泵2的压力，这有利于气体的溶解。也就是说，用压力传感器5检查从泵2泵送气体和液体的压力。该方法用于增加溶解气体的量以增加纳米气泡的产生量。尽管在本发明的含氧纳米气泡产生系统中使用波纹管气缸泵作为泵2是实用的，但是也可以应用往复泵，例如活塞泵，柱塞泵或隔膜泵，以及旋转泵，例如齿轮泵，偏心泵或螺杆泵，级联泵，叶片泵等，它们是迄今为止众所周知的进料泵。
泵入气液混合槽3的液体与氧气混合。溶解在液体内的氧气被供给喷嘴附件6以产生纳米气泡。用于产生纳米气泡的喷嘴附件6对应于连接到喷嘴的部分，用于产生平均直径为30 nm以下，优选1 nm到10 nm的大量含氧纳米气泡。
此时，压力传感器5通过观察喷嘴6和气液混合槽3之间的液体压力的变化来监测液体中气体的溶解状态。这样，需要控制生成喷嘴的恒压条件以产生稳定的纳米气泡。
在本发明中，使用图1A和图1B所示的含氧纳米气泡发生器进行气泡生成步骤详述如下。使用吸液管7，吸气（氧气）入口8和吸气调节阀9吸入各种气体和液体的步骤。通过压力传感器5调节压力。接下来，使用波纹管气缸泵2对含有气体，包括氧气，的液体加压的步骤的是气液加压步骤。随后，为了将含有加压气体的液体与新氧混合，使用泵控制器4和气液混合槽3进行的步骤是溶解气体富集步骤。之后，将如下所述的本发明中使用的生成喷嘴连接到用于生成含氧纳米气泡的喷嘴附件6，然后生成含氧纳米气泡。该步骤被称为溶解气体细微化步骤，其中含氧纳米气泡可以通过从具有两个以上个小通孔的气缸外部通过小通孔以高于大气压的压力注入，然后在气缸内部一点处的射流相互碰撞而产生。
在用于本发明的含氧纳米气泡发生器中，可以使用尽可能多地除去空气的液体，其中通过在真空下处理含有空气的常用液体来获得该液体。在溶解气体富集步骤中，脱气液体通过与从气体入口8吸入的氧气和/或与新氧气混合而用作含有含氧纳米气泡的液体。然后通过本发明中使用的气泡发生喷嘴产生含氧纳米气泡，作为含有含氧纳米气泡的液体使用。该方法优选用于本发明的制备方法中，因为它提供了在后续氧气混合和溶解步骤中通过在混合氧气之前对液体进行脱气来增加液体中的氧气浓度的效果。
图2示出了产生含氧纳米气泡的喷嘴形状和喷嘴头的实例，该喷嘴头将处理溶液分别注入图1的清洁装置中。图2的（a），（b）分别是喷嘴头10的横截面图和俯视图。图2（a）示出了图2（b）的D-D横截面。
如图2（a）和图2（b）所示，喷嘴头10由用于注入处理液的注入喷嘴11，以及用于排出含氧纳米气泡的液体碰撞喷嘴12和工作台13构成。一个或多个液体碰撞喷嘴12安装在工作台13上。文中，液体碰撞喷嘴12是用于产生含氧纳米气泡的喷嘴形状的实例。
图3是喷嘴头10的液体碰撞喷嘴12如图2（a）所示布置的部分的放大视图。如图3所示，在一种形状的液体碰撞喷嘴12中，12a中的小通孔朝向12的中心开口。通过该小通孔12a，在高压下进入的液体射流在液体碰撞喷嘴12的中心处相互碰撞产生纳米气泡，然后沿箭头Q所示的方向喷射。实验表明，控制溶液的速度V会增加产生的纳米气泡的量和气泡的寿命。作为速度V的一个标准，溶液的速度超过25米/秒就会产生稳定的纳米气泡。
从图2和3中的液体碰撞喷嘴12喷射的水溶液（Q），例如，当制备含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液时，根据以下两种方法调整。第一种方法是含有氯化钠0.85～0.95质量％的水溶液作为图1所示的吸液管7吸入的溶液。将氧溶解到该水溶液后，从注入喷嘴11注入所得到的气液混合液作为生理盐水溶液的方法。在第二种方法中，含有含氧纳米气泡的水溶液是使用不含添加剂如氯化钠（包括纯水）的水溶液作为图1所示的吸液管7吸入的溶液，在制备含氧纳米气泡的水溶液后，针对100质量份生理盐水溶液添加0.85～0.95质量％的氯化钠，作为生理盐水溶液使用。
另外，当水溶液（Q）作为输注溶液制备时，含有至少一种选自由钾和钙中的至少一种元素，5％葡萄糖溶液，氨基酸和肝素组成的组的添加剂的水溶液可以用作图1中所示的吸液管7吸入的溶液。通过从注入喷嘴11注入获得的气液混合物可以在氧溶解在水溶液中之后用作输注溶液。此时，如果需要，可以同时含有氯化钠。除了该方法之外，不含添加剂的水溶液用作图1所示的吸液管7吸入的溶液。在制备含有含氧纳米气泡的水溶液之后，将该含有纳米气泡以及添加有预定含量的添加剂的水溶液用作输注溶液。此时，不仅可以使用纯水而且可以使用含有氯化钠的生理盐水溶液作为不含添加剂的水溶液。
下面将说明使用从液体喷嘴11喷入的水流产生含氧纳米气泡的方法。由于压力从由波纹管气缸泵2组成的高压泵的排出压力（高于大气压）状态快速释放，因此从高速喷射液体喷嘴11喷射的溶解有氧的液体的射流相互碰撞，利用由射流的水锤力引起的破裂力，通过用气体破坏溶解液体来形成含有大量含氧纳米气泡状态的液体。但是由于压力释放方法的不同，会出现产生含氧纳米气泡的量减少的情况。然而，本发明的设备可以产生大量的含氧纳米气泡。
当在大气压（约0.1MPa）或更高压下注入气-液混合状态的溶解液时，例如，通过使用具有图2和3中所示结构的液体碰撞喷嘴12，本发明的生理盐水溶液中含有的含氧纳米气泡的产生量可以等于或高于常规溶液的量。另外，通过将压力设定为0.2MPa或更高，可以制备含有足量含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液。因此，由于溶解溶液的注射压力的下限可以降低至0.2MPa，低于现有技术，所以可以使用用于消除金属污染影响的合适的泵，例如由含氟聚合物制成的压缩空气驱动或电动波纹管气缸泵2。没有规定溶解氧的液体的注入压力的上限，但是当通过注入压力的增加来减少含氧纳米气泡产生设备1的负荷时，优选将其设定为1.0MPa以下。
用于制备本发明的含含氧纳米气泡的生理盐水溶液的含氧纳米气泡发生器的喷嘴按照如下方式设计，使在高于大气压的压力下，优选0.2MPa以上的压力，仍然低于现有技术的压力，仍然可以注入溶解溶液的射流。设F是通过溶解有气体的溶液的射流的喷射和碰撞获得的水锤力。对于水锤力F，当溶液的密度为ρ，小通孔的尺寸为S，并且溶液的速度为V时，建立F=ρSV2的关系。考虑到通孔尺寸S和速度V之间的关系的优化设计是优化F所必需的。
在用于本发明的含氧纳米气泡发生器中，形成在图2和3中12所示的液体碰撞喷嘴中的通孔S的直径，即小通孔12a的直径优选为0.1至0.5 mm，更优选为0.2至0.4 mm。文中，当液体碰撞喷嘴12的孔12a的直径小于0.1 mm时，具有小粒径的细微含氧气泡的产生量趋于增加，但是粒径为1 nm以上的气泡的产生量显着降低，导致含氧纳米气泡的产生量减少和含氧纳米气泡的密度显着降低。另外，当液体碰撞喷嘴12的孔12a的直径超过0.5 mm时，粒径为1 nm或更大的气泡的总产生量增加。另一方面，10 nm以下的小粒径气泡的产生量急剧下降。因此，随着平均粒径的增加，含氧纳米气泡的稳定性急剧下降，不能充分体现本发明的效果。因此，更优选的是，本发明中的液体碰撞喷嘴12的通孔直径在0.1至0.5 mm的范围内，以便将含氧纳米气泡的平均粒径减小至30 nm以下，并且将含氧纳米气泡的密度增加到每毫升水溶液1016以上个气泡。此外，通过将液体碰撞喷嘴12的通孔直径设置在0.2至0.4mm的范围内，含氧纳米气泡的平均粒径和密度可以分别是1至10 nm和每毫升水溶液1017以上个气泡。
通过从四个侧面向喷嘴气缸的中心注入溶解的液体并将水集中在其中心上，从而提高速度，可以实现相同的效果，从而产生大量的具有较小平均粒径的含氧纳米气泡。因此，在从四个侧面注水的情况下，如果注水速度相同，则根据通孔中的孔的数量可以获得更好的效果。例如，当设置四个通孔时，由于每个通孔的F集中在中心，因此在中心收集的力变为F=ρSV2的四倍F=4ρSV2。在这种情况下，与两个通孔的情况相比，可以获得两倍的水锤力。当增加喷嘴中的小通孔的数量以集中由液体射流在中心的碰撞产生的水锤力时，由于高流速，液体的碰撞能量增加。关于含氧纳米气泡的产生量，随着液体的碰撞能量增加，可以产生大量的具有较小平均粒径的含氧纳米气泡。
在本发明中，液体碰撞喷嘴12的通孔直径限定为0.1至0.5 mm，从而增加溶解有氧气的溶液的速度V。通过速度V的增加，可以获得降低所产生的含氧纳米气泡的平均粒径的效果。另外，由于需要同时增加含氧纳米气泡的密度，所以液体碰撞喷嘴12的通孔优选地在液体碰撞喷嘴12的气缸的圆周方向上以相等的间隔设置为4个以上且8个以下的数量。如果液体碰撞喷嘴12中的通孔的数量在3个以下，则含氧纳米气泡的密度显着降低。当通孔的数量在9个以上时，不仅增加含氧纳米气泡的密度的效果饱和，而且制造液体碰撞喷嘴12也非常困难，因为需要高精度定位液体碰撞喷嘴12中的通孔。
在用于本发明的含氧纳米气泡发生器中，液体碰撞喷嘴12的形状设有四到八个小通孔12a，它们在其圆周方向上以相等的间隔排列。另外，例如，通孔可以在液体碰撞喷嘴12的纵向上以两排以上平行钻孔，以在两个以上位置处形成液体的水锤。这可以产生大量纳米气泡，这是用于喷嘴小型化和提高效率的有效方法。此外，由于可以通过同时从四个以上小通孔注入液体来增加水锤的强度，因此可以在不增加液体速度V的情况下产生大量平均粒径为30 nm以下的含氧纳米气泡。这可以不再需要使用在高压下排出液体的泵，从而减轻了负担，使得可以通过工业领域中非常有用的技术开发节能喷嘴。
实施例
以下具体描述本发明的实施例。然而，这些描述的实施例决不限制本发明的范围。
<参考例1>
根据日本专利第555892号公报中公开的方法，使用纳米气泡水生成装置ModelΣPM-5（波纹管泵型，Sigma Technology Co., Ltd.的产品）生产空气纳米气泡水，并用纯水稀释100倍后作为测量样品。使用图2所示的液体碰撞喷嘴12。形成在液体碰撞喷嘴12中的通孔在包括液体碰撞喷嘴12的气缸的圆周方向上以六个相等的间隔设置，以便在与气缸的径向横截面平行的同一平面内相面对，并且通向气缸内腔的部分的孔尺寸为0.3 mm。在产生纳米气泡之前，纯水也用作参考样品。纳米气泡产生步骤之前的纯水对应于不含纳米气泡的水。
通过使用Vitrobot Mark IV（FEI Co., Ltd.的产品）的样品快速冷冻设备在其生产之后立即快速冷冻空气纳米气泡水，制备埋入水的无定形冰中的纳米气泡样品，并且用作观察样品。样品厚度为200 nm。另一方面，针对不含纳米气泡的水（纯水），也用样品快速冷冻设备进行快速冷冻，用作参考样品。样品厚度为200 nm。使用电子能量为300keV的Titan Krios低温透射电子显微镜（FEI Co., Ltd.的产品）直接在约80K的样品温度下观察埋入无定形冰中的纳米气泡。根据低剂量技术，用于观察的电子束约为20电子/Å2，并且在成像期间样品温度几乎没有增加。
图4分别示出了从含有空气纳米气泡的纯水冷冻的无定形冰和从纯水（无纳米气泡的水）冷冻的无定形冰的电子显微镜图像的照片。对于空气纳米气泡水，气泡的尺寸分布（显示粒径变化的直方图）显示在电子显微镜图像下方。
图4左侧所示的电子显微镜图像的照片示出了由ΣPM-5生产后立即观察到的空气纳米气泡的图像。在图4的照片中观察到的圆形对比是纳米气泡。作为图像处理的结果，平均粒径为7 nm。用于测量直方图的无定形冰的体积为3.2×10-14cc（400 nm×400 nm×200nm厚度），其中包含约260个气泡。由于观察的是100倍稀释的纳米气泡水，所以纳米气泡水中的空气纳米气泡的浓度为8.1×1017气泡/cc（ml）（81京个气泡/cc（ml））。另一方面，图4右侧所示的电子显微镜图像的照片表示没有对比度变化。从图4中可以确认照片是不含气泡的纯水的无定形冰的。因此，本发明的测量方法和装置不仅将水中纳米气泡的存在直接识别为图像，而且还获得关于纳米气泡的粒径，数量，粒径分布和形状的信息。
<实施例1>
除了使用氧气代替空气之外，使用与参考例1中类似的装置，通过相同的方法制备含含氧纳米气泡的水溶液。使用根据该实施例的含含氧纳米气泡的生理盐水溶液，在与参考例1相同条件下用Titan Krios低温透射电子显微镜（FEI Co., Ltd.的产品）测量含氧纳米气泡的平均粒径和密度。图5示出了从含有含氧纳米气泡的纯水冷冻的无定形冰的电子显微镜图像的照片。
在图5中，在靠近照片底部的实心圆线所围绕的区域中观察到对应于3 nm的平均粒径的暗对比度。另外，在由照片中心附近的虚线圆线围绕的区域中观察到通过连续连接暗对比度而看作线的部分，其也表示含氧纳米气泡。从该结果可以确定，平均粒径为3 nm的含氧纳米气泡是部分聚集而不是分离的。发现在1.8×10-14cc（300 nm×300 nm×200 nm厚度）的无定形冰体积中含有360个含氧纳米气泡。因为使用100倍稀释的水观察含氧纳米气泡水，所以纳米气泡水中的含氧纳米气泡的密度为2×1018气泡/cc（ml）（200京个/cc（ml））。
供参考，图6示出了本实施例中含氧纳米气泡水的气泡粒径的数量分布，其通过动态光散射法使用大塚电子制造的产品分布和分子量测量系统（ELSZ-2000S）测量。图6中所示的数量分布基于在进行如上所述的特殊数据处理之后获得的测量结果。如图6所示，本实施例的含氧纳米气泡分布在1至10 nm的窄粒径范围内。含氧纳米气泡的粒径分布类似于图5中所示的结果。另外，很容易看出平均粒径接近3 nm。因此，与动态光散射法相比较，确定本发明的通过冰埋入法使用低温透射电子显微镜的测量方法也可以用来精确地测量含氧纳米微泡水的气泡粒子。
本实施例中的生理盐水溶液通过在以这种方式制备的含含氧纳米气泡的水中混合0.9质量％的氯化钠（基于100质量份的生理盐水溶液）来制备。该生理盐水溶液用作实施例1。
<对比例1>
在产生上述参考文献1中讨论的空气纳米气泡之前，通过在纯水中混合氯化钠制备对比例1的生理盐水溶液，其中氯化钠的含量为0.9质量％，基于100质量份的正常的生理盐水溶液。
如上所述制备的含有含氧纳米气泡的细胞培养液（实施例1）和不含含氧纳米气泡的细胞培养液（对比例1）用于定量和定性测量无氧（缺氧）刺激下细胞形态和细胞损伤水平的变化，以验证细胞保护程度。验证按以下方法进行。
使用实施例1和对比例1的生理盐水溶液制备细胞培养液。在得到的细胞培养液中，将血管平滑肌细胞在无氧环境中培养12小时。在无氧环境中培养之前和之后拍摄细胞的形态变化，并在两者之间进行比较。另外，在细胞置于无氧环境之前和之后测量LDH的量，因为在细胞损伤的情况下在细胞毒性期间泄漏的酶（LDH）的量高。LDH意味着其量越高，细胞毒性越高。另外，为了比较实施例1和对比例1之间的线粒体功能（MTT测定），在暴露于无氧条件之前和之后测量细胞生长（细胞活力）。细胞活力表明其水平越低，病症越高。
图7，8和9分别示出了在实施例1和对比例1的生理盐水溶液中拍摄细胞的形态变化，LDH的量和细胞活力的测量结果。在图7中，“验证前”显示在正常细胞培养液中发现的血管平滑肌细胞的形式。在该图中，“对比例1（之前）”和“实施例1（之前）”是指在置于无氧气氛下之前的形态，而“对比例1（之后）”和“实施例1（之后）”是分别指在无氧气氛下放置12小时后的形态。
如图7所示，实施例1甚至在无氧气氛下培养12小时后也保持细胞形态，而对比例1显示出细胞小且将要死亡的现象。此外，从图8中所示的LDH量的测量结果可以看出，与对比例1相比，LDH在无氧气氛下放置12小时后，实施例1的LDH流出量显著减少。相对于图9所示的细胞活力值，实施例1还表明，在无氧气氛下暴露12小时之前和之后的值之间的差异小于对比例1中的值，表明保留了线粒体功能。
这些结果证实，实施例1（含有含氧纳米气泡的细胞培养液）在血管平滑肌细胞中保护细胞和线粒体免受无氧（缺氧）刺激具有非常好的功能。在上述验证中，使用血管平滑肌细胞作为例子。然而，推断对于所有细胞，而不仅仅是血管平滑肌细胞，都可以获得相同的结果。例如，本发明的含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液可以减少低血糖状态下的细胞损伤和伤害，因此，可以预期在运动期间或之后降低低血糖状态的细胞毒性的作用。另外，本发明的含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液可以减少缺氧状态下的细胞损伤和伤害，因此预期对由心肌梗塞，脑梗塞以及其他循环灌注紊乱引起的细胞毒性具有保护效果。
<对比例2>
根据上述专利文献2中公开的方法制备含有气泡尺寸为50至500 nm的含氧纳米气泡的水溶液。该水溶液用于制备细胞培养液。该细胞培养液用作对比例2。为了确认对比例2的细胞培养液中的细胞毒性，首先在正常环境下培养血管平滑肌一夜。使用常规细胞培养液和上述实施例1中制备的含有含氧纳米气泡的细胞培养液作为对比。作为细胞毒性的指标，定性和定量地测量细胞形态和细胞损伤程度的变化以验证细胞保护水平，并将细胞保护程度与上述实施例1中的生理盐水溶液的程度进行比较。以与实施例1相同的方法进行验证。在作为测试（MTT测定）的无氧气氛下放置后测量细胞活力以测量线粒体功能，同时观察放置在无氧气氛下的细胞的形态变化。
图10和图11分别示出了拍摄实施例1和对比例2的细胞培养液中细胞的形态变化的结果，以及通过MTT测定的细胞活力的测量结果。在图10中，在顶行左侧示出的“正常细胞培养液”的照片是在置于无氧气氛之前的条件下不含含氧纳米气泡的细胞培养液。在图10中，上中心和右上侧是显示在无氧气氛下过夜培养后细胞的形态变化的照片。另一方面，在图10中，下排的中间和右侧是显示仅使用不含细胞的培养液，在无氧气氛下过夜培养后培养液变化的照片。
从图10顶部所示的照片可以看出，实施例1甚至在无氧气氛下培养过夜后也保留了细胞形态，并且在培养基中未观察到细胞毒性。另一方面，对比例2（含有气泡尺寸为50-500 nm的含氧纳米气泡的水溶液的细胞培养液）显示出非常高的细胞毒性，并且在过夜暴露后几乎所有细胞都被杀死。另外，在图10的下部仅示出的培养液的照片中，观察到实施例1没有沉淀物，而对比例2在培养液中有许多沉淀物。因此，推断对比例2的培养液通过其中蛋白质的凝集导致细胞毒性。从图11中所示的细胞活力测量结果也可以容易地理解该结果。即，实施例1示出在无氧气氛下过夜培养后细胞存活没有变化，而对比例2示出细胞存活率大大降低。根据上述结果，首次证实使用本发明的生理盐水溶液可以降低细胞毒性并且可以安全地给药到活体，该生理盐水溶液含有大量平均粒径为30 nm以下，优选1至10 nm的含氧纳米气泡，密度为1×1016以上个气泡，优选1×1017以上个气泡。
<实施例2>
除了使用含有0.85至0.95质量％的氯化钠的水溶液之外，使用与实施例1中相同的装置，通过相同的方法在相同的条件下制备含有含氧纳米气泡的生理盐水溶液。该溶液在产生含氧纳米气泡后，在没有添加氯化钠的情况下用作生理盐水溶液。在与上述相同的条件下用相同的方法，用低温透射电子显微镜Titan Krios（由FEI Co., Ltd.制造）测量，证实该实施例的含含氧纳米气泡的生理盐水溶液的含氧纳米气泡的平均粒径为3 nm，密度为2×1018个气泡/cc（ml）。该实施例的生理盐水溶液用作实施例2。
使用此方式获得的实施例2的生理盐水溶液制备的细胞培养液用于定量和定性测量无氧（缺氧）刺激下细胞形态和细胞损伤程度的变化，以验证细胞保护水平，并将细胞保护水平与实施例1的生理盐水溶液进行比较。以与实施例1相同的方法进行验证。测量在细胞紊乱期间泄漏的酶（LDH）的量和细胞生长的值（细胞活力），观察放置在无氧条件前后细胞形态的变化。
实施例2的细胞培养液中的验证结果与实施例1中的相似，表明没有细胞毒性。因此，发现使用本发明的生理盐水制备的细胞培养液在产生含氧纳米气泡的步骤之前和之后不受氯化钠添加的影响，并且证实了在两种情况下都获得了在无氧（缺氧）刺激下保护细胞的类似效果。
<实施例3>
在该实施例中，使用本发明的可给药到活体的水溶液来验证抑制或预防癌细胞增殖和过度生长的效果。使用以与上述实施例1中所述相同的方法制备的含有平均粒径为3 nm的含氧纳米气泡的水溶液来具体制备含有血清和培养基的细胞培养液。当将肺鳞状细胞系EBC1的肺癌细胞注射到用于细胞培养的玻璃孔板中时，测量由肺癌细胞诱导的蛋白质（HIF-1a）的产生程度，然后将其置于缺氧状态下持续预定时间。
图12示出了培养癌细胞时使用的市售缺氧培养试剂盒。如图12所示，缺氧培养试剂盒沿着线A和B线设置有夹子14，15，并且气体阻隔袋16的内部可以分成两个空间以保持每个空间被夹子14，15封闭。O2传感器17设置在线A后面，填充有培养液的细胞培养孔板18紧挨着O2传感器17。气体浓度调节剂19设置在线A和线B之间。气体浓度调节剂19在使用时，开封铝袋后取出，放置在A线的入口点附近，用线B中的夹子14密封。这使得O2短期吸收在气体阻隔袋16内，创造一个缺氧环境。气体阻隔袋16内的O2浓度通过O2传感器17的刻度监测，当接近所需的O2浓度时，细胞培养孔板18内的空气被气体阻隔袋16内的空气代替。并且，当O2浓度略低于期望值时，气体阻隔袋被设置在线A中的夹子15阻挡，以停止吸收O2。线A和线B间的空间中的O2浓度可以使用线A中的夹子15来调节。在该实施例中，线A和线B间的空间中的O2浓度调节为约1％。
当置于缺氧气氛下时，通过Western印迹技术测定由肺癌细胞诱导的蛋白质（HIF-1a）的产生程度。蛋白质印迹方法代表了一种技术，其结合优异的电泳分辨率和对抗原-抗体反应的高特异性，以检测蛋白质混合物中的特定蛋白质，这称为用于蛋白质检测和分析的测量方法。在该实施例中，除了由肺癌细胞诱导的蛋白质（HIF-1a）之外，还测量肺鳞状细胞癌细胞系EBC1中包含的b-肌动蛋白蛋白质作为蛋白质产生的对照，以确保细胞培养孔板中的样品肯定含有蛋白质，并且Western印迹法中使用的总蛋白质含量是恒定的。
<对比例3>
除了使用不含含氧纳米气泡的水溶液代替实施例3的含有含氧纳米气泡的水溶液以外，采用与实施例3中所述相同的方式确认肺癌细胞诱导的蛋白质（HIF-1a）的产生程度。通过实施例3中所述Western印迹法测量由肺癌细胞诱导的蛋白质（HIF-1a）的产生程度。该验证实例为对比例3。
图13示出了实施例3和对比例3的HIF-1a和HSC70蛋白的诱导结果，其中将每个溶液放置在O2浓度为约1％的缺氧气氛下6和24小时。图13所示的[常氧]，[缺氧6h]和[缺氧24h]分别表示在放入缺氧气氛之前，在其中放置6小时之后，以及在其中放置24小时之后的样品。图中[介质]上显示的“O2”和“DW”分别表示实施例3和对比例3。在图中，“O2”和“DW”中的垂直列显示了在每个验证的样品中测量的蛋白质的产生结果。
图13（a）示出了通过蛋白质印迹法测量的测定结果，其中图中的黑色部分代表HIF-1a和HSC70蛋白的产生。图中黑色部分越暗，蛋白质的产生程度越强。图13（b）显示了通过计算图13（a）中所示的黑色部分的面积获得的每个样品中HIF-1a的黑色部分与HSC70的黑色部分的面积比。图13（a）中所示的黑色部分的面积可以通过进行图14所示的图像处理转为数值。在图14中，例如，着眼于在放置在缺氧气氛之前的状态（常氧），几乎观察不到HIF-1a的产生，黑色部分的面积计算为平均值32.21（如“平均值”栏所示），对应于HSC70产生的黑色部分计为平均值226.902（如“平均值”栏所示），表明HIF-1a与HSC70的面积比（如“比率”栏所示）是0.14。可以看出HSC70的产生几乎是恒定的，在缺氧气氛之前和之后没有实质性变化。此外，在缺氧气氛下放置6小时和24小时后，对实施例3（O2）和对比例3（DW）进行相同的步骤。假设常氧情况为1，通过计算面积比（比率）并将它们归一化（参见归一化）获得HIF-1a产生的黑色部分与HSC70产生的黑色部分的面积比。图13（b）所示的结果表示HIF-1a与HSC70的归一化面积比。
如图图13（b）所示，当假定常氧情况归一化面积比为1时，在缺氧条件下放置6小时（缺氧6h）后未观察到实施例3（O2）和对比例3（DW）之间HIF-1a产生有大的差异。另一方面，在缺氧气氛下长期放置（缺氧24小时）后，观察到两者对HIF-1a产生的抑制作用的巨大差异，表明与对比例3相比，在实施例3中HIF-1a的产生显着降低。这表明在缺氧气氛下放置6小时仅显示出瞬时现象，由于放置时间短而基本上没有观察到含氧纳米气泡的影响。然而，缺氧24小时的结果表明随着放置时间的增加，含氧纳米气泡的影响增加。尽管未在图13中示出，以类似的方法进行了在缺氧气氛中放置48小时的测试。结果证实，抑制效果等于或大于放置24小时的抑制效果。因此，可以推断含有含氧纳米气泡的水溶液充分具有抑制癌细胞增殖的效果。
如上所述，本发明的可给药到活体的水溶液具有向末梢细胞充分供应氧气的功能，由于在缺氧或无氧刺激条件下对细胞损伤和伤害较少而增强了细胞保护效果，以及抑制或防止可能在无氧环境中发生的癌细胞增殖和过度生长的效果。此外，可以长期获得保护细胞的稳定效果，并且可以显着降低其效果的变化。因此，本发明的水溶液可以安全地给药或口服摄入到活体。
在制备本发明的可给药到活体的水溶液的方法中，与用于产生纳米气泡的常规方法相比，还可以大量且稳定地产生具有较小粒径的含氧纳米气泡。该方法还可以制备可给药到活体的水溶液，通过该溶液，可以长期稳定地获得在缺氧或无氧刺激下保护细胞的效果，以及抑制或防止在无氧环境下可能发生的癌细胞增殖和过度生长的效果。在现有技术中难以制备具有这种效果的含含氧纳米气泡的水溶液，通过本发明的制备方法可以首次获得这种水溶液。
工业实用性
因此，作为生理盐水溶液或输注溶液给药或口服摄入，或用作细胞培养溶液，本发明的可给药到活体的水溶液可以在缺氧或无氧刺激下保护细胞，抑制或防止在相同环境中癌细胞的增殖和过度生长。因此，本发明的可给药的水溶液在各种医学领域中具有极高的实用性。

Claims (16)

1.一种可给药到活体的水溶液，
所述可给药到活体的水溶液包括含有含氧纳米气泡的水溶液，所述含氧纳米气泡的平均粒径为30 nm以下，密度为每毫升水溶液1016个以上，
其中所述含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
2.根据权利要求1所述的可给药到活体的水溶液，
所述可给药到活体的水溶液包括含有含氧纳米气泡的水溶液，所述含氧纳米气泡的平均粒径为1至10 nm，密度为每毫升水溶液1017个以上，
其中所述含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入方法用低温透射电子显微镜测量。
3.根据权利要求1或2所述的可给药到活体的水溶液，
其中所述可给药到活体的水溶液是生理盐水溶液，100质量份的所述可给药到活体的水溶液包含0.85至0.95质量％的氯化钠。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
其中所述可给药到活体的水溶液是选自由以下溶液组成的组的输注溶液：添加有5％葡萄糖溶液的低渗复合电解质溶液、林格氏溶液和含有高卡路里流体和肝素的生理盐水溶液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
其中所述可给药到活体的水溶液是细胞培养液。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的可给药到活体的水溶液，
其中可给药到活体的水溶液通过给药或口服摄入到活体来使用，以抑制或预防癌细胞的增殖和过度生长。
7.一种制备可给药到活体的水溶液的方法，所述方法包括：
通过气缸中的两个以上的小通孔，在高于大气压的压力下从气缸外部注入水溶液来产生含有溶解氧的水溶液的射流，所述通孔以下述配置设置在气缸的圆周方向，即两个以上的小通孔的各个开口在平行于气缸的径向横截面的同一平面上彼此面对地设置；
在气缸内使水溶液射流进行碰撞，从而射流的水锤集中在气缸中心；以及
通过水溶液射流的相互碰撞产生含氧纳米气泡，
其中含氧纳米气泡的平均粒径为30 nm以下，密度为每毫升水溶液1016个以上，
其中含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
8.根据权利要求7所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中含氧纳米气泡的平均粒径为1至10 nm，密度为每毫升水溶液1017个以上，
其中所述含氧纳米气泡的平均粒径和密度通过使用冰埋入法用低温透射电子显微镜测量。
9.根据权利要求7或8所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中含氧纳米气泡由纳米气泡产生装置产生，所述纳米气泡产生装置包括：
分别吸入气体和液体的装置；
对上述气体和液体进行同时加压并将其转移的装置；
通过将转移的含有气体的上述液体与新的氧气混合来富集溶解氧的气液混合槽；以及
使用气液混合槽中处于气液混合状态的溶解液产生纳米气泡的喷嘴，
上述喷嘴包括：
空心气缸；
上述气缸的周方向上的两个以上小通孔的各个开口在平行于气缸的径向横截面的相同平面内彼此面对的上述两个以上的小通孔；
以及设置在空心气缸的至少一端上的纳米气泡排出口;
其中，所述小通孔如此设置，使得穿过每个小通孔的横截面的相应中心的所有延伸线在所述气缸的空腔内部彼此相交。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，四个到八个数量的小通孔在气缸的圆周方向上等距离地设置，在平行于气缸的径向横截面的相同平面内彼此面对，并且通向该气缸空腔的部分的孔径为0.1至0.5毫米。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，可给药到活体的水溶液是生理盐水溶液，100质量份的所述可给药到活体的水溶液包含0.85至0.95质量％的氯化钠。
12.根据权利要求11所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中，作为含有上述溶解氧的水溶液，使用了含有0.85至0.95质量％的氯化钠的水溶液用来制造生理盐水溶液。
13.根据权利要求11所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，所述方法包括：
使用不含氯化钠的水溶液作为含有上述溶解氧的水溶液，在制备含有上述含氧纳米气泡的水溶液后，
向上述含有含氧纳米气泡的水溶液中，按100质量份的上述生理盐水溶液含0.85至0.95质量％氯化钠的比例添加氯化钠来制备生理盐水溶液。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中所述可给药到活体的水溶液是输注溶液，所述输注溶液是通过向所述可给药的水溶液中添加至少一种添加剂而制备，其中所述添加剂含有选自由钾和钙中的至少一种元素、5％葡萄糖溶液，氨基酸和肝素组成的组中的至少一种。
15.根据权利要求7至14中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中所述可给药到活体的水溶液被制成用于培养细胞的细胞培养液。
16.根据权利要求7至14中任一项所述的制备可给药到活体的水溶液的方法，
其中所述可给药到活体的水溶液，用于通过给药或口服摄入到活体来抑制或防止癌细胞的增殖和过度生长。
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