CN109806404A - 一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于放疗增敏药物领域，涉及一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒及其制备方法与应用。该白蛋白纳米粒主要由白蛋白、全氟化碳和过氧化氢酶组成，其粒径均一，性质稳定，生物安全性良好，能够缓解实体瘤的放疗抵抗问题。实验结果表明，该纳米粒能靶向肿瘤并以双级递氧的方式改善肿瘤乏氧，其双级递氧具体表现为高载氧的全氟化碳通过氧气浓度梯度差直接向乏氧肿瘤供氧(1级递氧)；与此同时，过氧化氢酶催化水解肿瘤部位高浓度的过氧化氢产生氧气间接递氧(2级递氧)，二者协同逆转肿瘤乏氧微环境，有效增敏氧气依赖的肿瘤放疗。

Description

一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒及其制备方法与应用，属于放疗增敏药物领域。

背景技术

临床研究表明乏氧见于90％以上的实体瘤。这是因为恶性肿瘤生长迅速且为无序生长，故对氧气的需求大幅度增多，同时肿瘤血管生成不充分，肿瘤组织内的血液供应相对不足，所以实体瘤内部大多存在乏氧区域。

放射治疗作为肿瘤治疗的三大主要手段之一，广泛地应用在肿瘤治疗中。由于氧在电离辐射杀死肿瘤细胞中发挥着重要的生物学效应，氧气是细胞对射线敏感的增敏剂，水在射线的作用下产生水合电子与自由基，自由基能损伤肿瘤细胞DNA，而乏氧会减少氧自由基对DNA增殖的损伤。因此，乏氧明显增加了肿瘤的放疗抵抗，研究表明乏氧区域的肿瘤细胞抵抗放射的能力比正常含氧量肿瘤细胞大2-3倍，即使放射剂量最大化或改变照射方式，也无法根治肿瘤。临床上曾采用不同的放疗增敏方法，但收效甚微。传统方法是让病人在放疗前吸入高压氧气，但因为吸入的氧气无法有效到达目标肿瘤部位，对于很多癌症患者治疗效果并不好。临床使用的放疗增敏剂现在研究较多的是硝基咪唑类化合物，如MISO等，但其神经毒性限制了服用剂量，以致其临床应用潜力受到限制。因此，在临床治疗中亟须寻找一种高效低毒的放疗增敏剂。

自20世纪60年代起，人们认识到全氟化碳液体的高度稳定化学特性和能携带大量氧的特征，在常温常压下溶氧量是血浆的20-25倍，比血液还要高近2倍，作为血液代用品广泛用于医学领域。但全氟化碳密度大(1.5～1.9g/cm³)，强疏水性，与血液不相容，直接输入血管会引起肺栓塞。目前临床上有较多的白蛋白作为稳定剂的全氟化碳化合物乳剂，如上市的Fluosol、Perftoran等，但主要的医疗用途还是限制在血液替代品范畴之内。

过氧化氢酶(CAT)是一种广泛存在于生物体内的过氧化物酶，在动物的各个组织中都有存在，尤其肝脏中浓度最高。过氧化氢酶是过氧化氢(H₂O₂)的特异性水解酶，能够高效催化H₂O₂肿瘤产生O₂和H₂O，其反应式为：H₂O₂→H₂O+O₂。肿瘤部位含有较高浓度的H₂O₂。当装载有过氧化氢酶的纳米颗粒循环到肿瘤部位后，肿瘤组织间的内源性H₂O₂可被纳米颗粒催化产生氧气，增加肿瘤细胞周围的氧分子浓度，直接有效改善肿瘤部位的乏氧情况，增强放疗疗效。

到目前为止，关于协同全氟化碳和过氧化氢酶来改善肿瘤乏氧，实现放疗增敏的应用目前还未见报道。

发明内容

针对临床上肿瘤乏氧介导肿瘤放疗抵抗的现状，鉴于现有治疗技术的不足，本发明构建了一个能够双级递氧的白蛋白纳米粒，即全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒。该纳米粒可以通过全氟化碳和过氧化氢酶实现肿瘤双级递氧，逆转肿瘤乏氧微环境，提高肿瘤的放疗敏感性。

本发明构建的具备双级递氧能力的白蛋白纳米粒，主要由白蛋白、全氟化碳和过氧化氢酶构成，全氟化碳通过超声包裹于白蛋白纳米粒中心的疏水区域，过氧化氢酶通过超声包裹于白蛋白的亲水区域。

进一步地，所述的全氟化碳占白蛋白纳米粒总体系体积比为5％-30％，优选为10％-20％。

进一步地，所述的过氧化氢酶占白蛋白纳米粒总体系的比重为6-10mg/mL。

进一步地，所述的白蛋白纳米粒在应用时，可被制作成水溶液或冻干粉末。

本发明的有益效果：利用白蛋白包载全氟化碳可以避免全氟化碳直接静脉注射在体内引发肺栓塞等安全性问题。基于蛋白自组装技术，通过超声乳化法将疏水性的全氟化碳包载入白蛋白纳米粒疏水区域，将过氧化氢酶包裹于白蛋白亲水区域，这样的制备方式可以避免了很多有机溶剂参与的传统剂型中潜在的安全和环保问题。

该白蛋白纳米粒在血液循环中通过特异性结合肿瘤表面过表达的SPARC受体(主动靶向)和EPR效应(被动靶向)实现肿瘤靶向蓄积，降低了药物的毒副作用。体内外实验均证明该白蛋白纳米粒本身对细胞和正常组织不具有毒副作用，具有较高的安全性。

本发明所制备的具有双级递氧能力的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒与现有的递氧方式(如高压给氧、硝基咪唑类化合物以及单独全氟化碳纳米粒或过氧化氢酶纳米粒等)相比，具有以下优点：

(1)相比于非肿瘤靶向性的高压给氧和硝基咪唑类化合物，该纳米粒可特异性靶向蓄积到肿瘤部位，减少药物全身副作用。此外，纳米粒制备原料均具有良好的生物安全性；

(2)制剂具备肿瘤双级递氧能力，一方面，高携氧的全氟化碳在达到肿瘤部位后可以为相对乏氧的肿瘤组织直接供氧，实现1级递氧；另一方面，过氧化氢酶可催化肿瘤组织内过氧化氢分解产生氧气，继而实现2级供氧，二者协同为肿瘤组织高效补给氧气，提高放疗敏感性。相比于单独的全氟化碳纳米粒或过氧化氢酶纳米粒，制剂具备更为高效的递氧能力。

(3)全氟化碳具备良好的溶氧和蓄氧能力，可以在肿瘤乏氧部位缓慢递送氧气。同时，全氟化碳还能吸收存储过氧化氢酶催化肿瘤部位过氧化氢产生的氧气，共同构建一个长期为肿瘤供氧的纳米体系。

附图说明

图1是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的表征

图2是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的粒径分布图

图3是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒在过氧化氢溶液中催化产氧情况

图4是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒Balb/C小鼠体内生物分布

图5是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒放疗增敏药效

图6是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒体内安全性评价

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明，以下所述实施例仅用于帮助理解本发明，而不是对本发明的具体限制。

实施例1：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的制备

量取1mL人血清白蛋白原液(10g/50mL)至西林瓶中，加入去离子水稀释至1.9mL，混匀。再加入300μL全氟三戊胺(即全氟三戊胺占制剂总体系体积比为10％)和100μL乙醇(分析纯)，充分吹打混匀。将上述所得纳米乳置于冰水浴中，使用超声探头深入西林瓶内部至靠近液体底部，超声功率为300W，占空比为50％，持续时间2分钟，超声结束后将制剂置于冰水浴中冷却1-2分钟。将700μL质量浓度为30mg/mL的过氧化氢酶溶液加入上述体系之中(即过氧化氢酶占制剂总体系的比重为7mg/mL)，继续按照上述超声条件操作2个循环。最后将样品转移至4mL离心管中，3000rpm离心3min，取上清，即为制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒(PFC-CAT@HSA)。

透射电子显微镜(TEM)观察实施例1制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的形貌，通过动态光散射(DLS)检测纳米粒的粒径大小和粒径分布情况(PDI)。此外，对纳米粒的Zeta电位进行检测，评价其分散体系的物理稳定性。

透射电镜结果显示(见图1)，全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒粒径均一，具有明显的白蛋白外壳结构；

动态光散射结果表明(见图2)所制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒粒径约为135nm，PDI＝0.249；

Zeta电位结果表明所制备的纳米粒Zeta电位绝对值约为37mV。一般情况下，Zeta电位绝对值达到30mV就认为体系比较稳定，由此可见，实施例1制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒稳定性良好。

实施例2：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒载氧及缓慢释氧能力的考察

取200μL实施例1中的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒溶液，用去离子水稀释至3mL，另外再取3mL的去离子水作为对照。两组分别放置于小室中充纯氧20s，然后用氧电极实时检测溶液中的含氧量以及30min和24h之后各溶液含氧量。

结果显示，充氧之后，纯水中的含氧量为356μmol/L，全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒溶液含氧量606μmol/L，由此可见所制备的纳米粒溶液具备优良的载氧能力。30min之后，纯水和纳米粒溶液的含氧量分别变为293μmol/L和581μmol/L；24h之后，二者的含氧量分别变为261μmol/L和495μmol/L，表明全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒具有较好的蓄氧和缓慢释氧的能力。

实施例3：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒在过氧化氢溶液中催化产氧情况

利用过氧化氢酶检测试剂盒对全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒催化过氧化氢活性进行检测。取20μL样品至1.5ml离心管中(以游离的过氧化氢酶溶液作为阳性对照)，加入过氧化氢酶检测缓冲液至40μL，混匀。再加入10μL 250mM过氧化氢溶液，用移液器迅速混匀。25℃反应1-5分钟后加入450μL过氧化氢酶反应终止液，另取一个离心管内加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀。10μL加入到96孔板中，再加入200μL显色工作液，25℃至少孵育15分钟后测定溶液520nm下吸光度。

结果表明(见图3)，全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒能够有效催化过氧化氢产生氧气，提高过氧化氢溶液中的氧含量。

实施例4：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的细胞毒性评价

本实验采用的是Balb/C小鼠结肠癌细胞(CT26)模型，考察实施例1制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的细胞毒性。将HUVEC以5000个/孔的密度接种于96孔板，培养24h后，加入梯度稀释的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒溶液，置于细胞培养箱中培养24h后，每孔加入10μL的CCK-8于培养基中，在37℃，5％CO₂条件下再孵育3h，最后在波长为450nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。

实验结果如表1所示，证明所制备的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒对正常组织细胞不具有毒副作用。

表1、全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒的细胞毒性实验(CT26细胞模型)(n＝5，mean±SD)

实施例5：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒在荷瘤小鼠体内的生物分布情况

选取体重为18-20g的雄性Balb/C小鼠，建立小鼠结肠癌皮下移植模型(CT26)。选取IR780作为荧光追踪剂，将其包载入全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒内。尾静脉注射IR780标记的全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒，48h后处死小鼠，解剖取出肿瘤以及其正常组织(包括心肝脾肺肾)，通过小动物活体成像对不同组织进行生物荧光成像并进行相应的荧光强度定量(见图4)。结果显示，药物主要靶向分布在肿瘤组织，在正常组织中无蓄积情况。

实施例6：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒对皮下移植瘤放疗增敏药效实验

以Balb/C小鼠结肠癌皮下移植模型(CT26)作为评估全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒(实施例1制备)的动物模型。肿瘤接种一周后，将小鼠随机分成4组(n＝6)：①对照组：尾静脉给药生理盐水(0.1mL/10g)；②放疗组；4Gy放疗；③单独给药组：尾静脉给药全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒(0.1mL/10g)；④联合给药组：尾静脉给药全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒(0.1mL/10g)，给药8h之后，进行4Gy放疗。接种肿瘤后7天之后开始给药，测量两周之内的肿瘤体积变化(见图5)。结果所示，放疗能在一定程度上有效地抑制肿瘤生长，但是全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒相对于放疗组，其肿瘤抑制效果更加显著，可以有效增敏放疗疗效。

实施例7：全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒体内安全性评价

取实施例6中生理盐水组和全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒组小鼠的正常组织(包括心肝脾肺肾)做H&E病理切片(见图6)。结果表明，全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒对正常组织没有毒副作用，具有良好的体内安全性。

Claims (8)

1.一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的白蛋白纳米粒包括白蛋白、全氟化碳和过氧化氢酶，所述的全氟化碳通过超声包裹于白蛋白纳米粒中心的疏水区域，过氧化氢酶通过超声包裹于白蛋白的亲水区域。

2.根据权利要求1所述的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的全氟化碳占总体系体积比为5％-30％，优选为10％-20％。

3.根据权利要求1所述的全氟化碳，其特征在于所述的全氟化碳包括但不限于全氟戊烷、全氟三丁胺、全氟三丙烷、四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟萘烷、全氟辛基溴、全氟环己基哌啶，或者它们的组合。

4.根据权利要求1所述的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的过氧化氢酶占总体系的比重为6-10mg/mL。

5.根据权利要求1-4中任一所述的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的纳米粒粒径为90nm-200nm。

6.一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将全氟化碳及助乳剂加入水中，先超声混匀，然后加入适量的过氧化氢酶溶液，进一步超声乳化，得到全氟化碳-过氧化氢酶复合白蛋白纳米粒。

7.一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的白蛋白纳米粒具有肿瘤双级递氧功能，高携氧的全氟化碳在达到肿瘤部位后可以为相对乏氧的肿瘤组织直接供氧(1级递氧)；另一方面，过氧化氢酶可催化肿瘤组织内高浓度过氧化氢产生氧气(2级递氧)，二者协同长期高效改善肿瘤乏氧。

8.一种能够双级递氧的白蛋白纳米粒，其特征在于所述的白蛋白纳米粒可用于肿瘤治疗中的乏氧改善与放疗增敏。