CN107831223A - 清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，包括以下步骤：(1)精密称取异槲皮苷标准品加甲醇制成标准溶液；(2)精密称定清浊祛毒丸，研细后置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水使溶解并定量至25ml，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，上大孔吸附树脂柱用水洗脱后用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，然后加50％乙醇定量至50ml，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液；(3)分别对标准溶液和样品溶液进行液相色谱测定。本发明测定结果稳定，能够有效、准确地测定清浊祛毒丸中异槲皮苷含量。

Description

清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法
技术领域
本发明涉及药品中异槲皮苷的含量测定方法，尤其涉及清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法。
背景技术
清浊祛毒丸是广西壮族民间治疗前列腺疾病、泌尿生殖系统疾病的效验方药，是我公司的拳头产品(国药准字Z20025347)拥有自主知识产权、是广西民族药、获国家处方发明专利(专利号ZL200410015042.9)，能清热解毒、利湿祛暑，用于治疗湿热下注所致尿频、尿急、尿痛等。清浊祛毒丸的中的主要原料药材为金沙藤，金沙藤的主要有效成分为异槲皮苷，原标准中没有中异槲皮苷的测定方法，为了使本产品有更好的质量控制方法，保证药品质量。我们对清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法进行了研究，通过反复试验制定了清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)制备标准溶液：精密称取异槲皮苷标准品加甲醇制成标准溶液；
(2)制备样品溶液：精密称定清浊祛毒丸，研细后置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，加水定量至25ml，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置于大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水溶液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，然后加50％乙醇定量至50ml，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液；
(3)测定：分别取标准溶液和样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得异槲皮苷(C21H20O12)含量。
所述步骤(1)中，标准溶液的异槲皮苷浓度为每1ml含20μg。
所述步骤(2)中，清浊祛毒丸与甲醇质量体积比为1:200(g/ml)；超声处理的功率500W，频率40kHz，处理时间30-60分钟。所述大孔细粉树脂为D101型大孔吸附树脂柱，内径1.5cm，长10cm；洗脱用水100ml。
所述步骤(3)中，液相色谱的条件如下：色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈:四氢呋喃:0.2％磷酸水溶液＝15:4:81(V/V)，检测波长为270nm，理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于3000。
本发明提供的清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法是经过了不同样品提取条件、方法学考察及样品的测定、线性关系考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验，精选出最合适的异槲皮苷含量测定方法。其精密度、重复性好，线性关系优异，测定结果稳定，能够有效、准确地测定清浊祛毒丸中异槲皮苷含量，使得清浊祛毒丸的质量可获得全面控制。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代品均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
(1)取异槲皮苷标准品适量，精密称定，加水制成每1ml含20μg的标准品溶液。
(2)取本品20丸，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，转移至25ml量瓶中，并加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长10cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，置50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。
(3)分别精密吸取标准品溶液和待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪。色谱条件：色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈:四氢呋喃:0.2％磷酸水溶液＝15:4:81(V/V)，检测波长为270nm，理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于3000，测定本品按干燥品算，含异槲皮苷(C21H20O12)不得少于6.0mg/g。
实施例2
(1)取异槲皮苷标准品适量，精密称定，加水制成每1ml含20μg的标准品溶液。
(2)取本品20丸，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，转移至25ml量瓶中，并加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长10cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，置50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。
(3)分别精密吸取标准品溶液和待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪。色谱条件：色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈:四氢呋喃:0.2％磷酸水溶液＝15:4:81(V/V)，检测波长为270nm，理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于3000，测定本品按干燥品算，含异槲皮苷(C21H20O12)不得少于6.0mg/g。
实施例3
(1)取异槲皮苷标准品适量，精密称定，加水制成每1ml含20μg的标准品溶液。
(2)取本品20丸，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，转移至25ml量瓶中，并加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长10cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，置50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。
(3)分别精密吸取标准品溶液和待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪。色谱条件：色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈:四氢呋喃:0.2％磷酸水溶液＝15:4:81(V/V)，检测波长为270nm，理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于3000，测定本品按干燥品算，含异槲皮苷(C21H20O12)不得少于6.0mg/g。
实验例
为了进一步验证本发明检查结果的准确性，对上述实施例1中制备的样品进行实验验证。
1.超声波提取和水浴加热提取效果比较
采用超声波提取法和水浴加热法比较提取效果，分别称取样品约0.25g，分别精密加甲醇50ml，称定重量，分别超声提取(功率500W，频率40kHz)1小时和水浴加热1小时，水浴加热提取率只有超声提取的80％左右，超声提取效果明显好于水浴加热提取，故选择超声提取提取。
2.不同超声提取时间提取效果比较
选择甲醇作为提取溶剂，经试验采用(功率500W，频率40kHz)超声提取：分别称取样品约0.25g，分别精密加甲醇50ml，称定重量，考察不同超声时间的提取效果，结果见下表。
表1：不同回流时间的测定结果
试验表明，超声时间对本品提取率影响较大，提取30分钟后基本提取完全，为保证提取完全，保证效率，选用超声30分钟以上。
将供试品溶液制备方法确定如下：取本品20丸，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30-60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，转移至25ml量瓶中，并加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长10cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，置50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
3.方法学考察及样品的测定
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱分析柱，流动相：乙腈-四氢呋喃-0.2％磷酸水溶液(15：4：81)；流速：1.0ml/min；检测波长：270nm；进样量为10μl。在以上色谱条件下，理论塔板数按异槲皮苷峰计，应不低于3000。
标准品溶液的制备取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的异槲皮苷标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的标准溶液。
供试品溶液的制备取本品20丸，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，转移至25ml量瓶中，并加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长10cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，置50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
线性关系考察精密称取异槲皮苷对照品4.18mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液得浓度为83.60μg/ml)。精密量取上述对照品贮备溶液0.5、1、2、5、10ml，分别置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液(浓度分别为1.672μg/ml、3.344μg/ml、6.688μg/ml、16.720μg/ml、33.440μg/ml)按正文拟订的色谱条件分别进样10μl测定。以异槲皮苷对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，则回归方程为：Y＝4.32×104X+1.76×103(r＝0.9999)
结果表明：当进样量在0.0167～0.3344μg范围内时，异槲皮苷进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。
表2：异槲皮苷对照品线性关系试验结果
精密度试验：对同一供试品溶液，按正文拟订的色谱条件，连续测定6次，记录异槲皮苷峰面积。结果6次测定峰面积的平均值为:286505，RSD为1.36％(n＝6)。详见表3。试验表明，本法的精密度良好。
表3：异槲皮苷精密度试验结果
重复性试验：对同一批样品，按正文拟订的方法平行测定6份，结果见表4。6份测定结果的平均值为:6.225mg/g，RSD＝1.86％(n＝6)。结果表明，本法的重复性较好。
表4：异槲皮苷重复性试验结果(测定结果为两次进样平均值)
稳定性试验：对同一供试品溶液，每隔一定时间测定一次，共测定7次，结果7次测定的异槲皮苷平均峰面积为290549，RSD为1.81％(n＝7)，详见表5。试验表明，在12小时内，被测物稳定。
表5：异槲皮苷稳定性试验结果
加样回收率测定：精密称取异槲皮苷对照品(供含量测定用)7.25mg，置1000ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度为7.25μg/ml)。精密称取药材粉末(异槲皮苷含量为6.225mg/g)约0.12g，平行取6份样，分别精密加入上述异槲皮苷对照品溶液100ml，称定重量，按供试品溶液制备项下方法提取、测定，计算回收率，结果平均回收率为100.19％，RSD＝1.04％(n＝6)，符合定量分析的要求，详见表6。
表6：异槲皮苷回收率测定结果
样品测定：按正文拟订的含量测定方法，测定了清浊祛毒丸不同批号的异槲皮苷含量，结果见表7。
表7：样品测定结果
综上所述，本发明提供的清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法是经过了不同样品提取条件、方法学考察及样品的测定、线性关系考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验，精选出最合适的异槲皮苷含量测定方法，使得清浊祛毒丸的质量控制便全面。

Claims (4)

1.清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)制备标准溶液：精密称取异槲皮苷标准品加甲醇制成标准溶液；
(2)制备样品溶液：精密称定清浊祛毒丸，研细后置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水使溶解，加水定量至25ml，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，置于大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水溶液，再用50％乙醇洗脱，弃去前10ml初洗脱液，收集续洗脱液约48ml，然后加50％乙醇定量至50ml，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液；
(3)测定：分别取标准溶液和样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得异槲皮苷(C21H20O12)含量。
2.根据权利要求1所述的清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，其特征是，所述步骤(1)中，标准溶液的异槲皮苷浓度为每1ml含20μg。
3.根据权利要求1或2所述的清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，其特征是，所述步骤(2)中，清浊祛毒丸与甲醇质量体积比为1:200；超声处理的功率500W，频率40kHz，处理时间30-60分钟；所述大孔细粉树脂为D101型大孔吸附树脂柱，内径1.5cm，长10cm；洗脱用水100ml。
4.根据权利要求3所述的清浊祛毒丸中异槲皮苷的含量测定方法，其特征是，所述步骤(3)中，液相色谱的条件：色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈:四氢呋喃:0.2％磷酸水溶液＝15:4:81，检测波长为270nm，理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于3000。
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