CN104280464A - 一种中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，具体方法由以下步骤组成：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备以及测定，该测定方法有助于药物的质量控制，提高药物的安全性和可靠性。

Description

一种中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及中药组合物中具体成分的含量测定方法。

背景技术

中药治疗疾病已经有几千年的历史了，随着科学技术的发展，中药也面临着现代化，要走上世界市场，这就要求必须做好中药质量的控制，中药的成分含量的质量控制则是最关键的，尤其是对于复方的中药制剂，要想全面的控制中药的质量，必须做好各成分的含量的精确测定。

本发明的中药组合物由黄芪、女贞子、滑石、夏枯草、荔枝核、琥珀、肉桂、关黄柏组成，采用健脾益肾、利水散结的原则，治疗前列腺增生。对于该中药组合物，目前只公开了药物成分和制备方法，并没有给出相应的药物成分的含量测定方法。该中药组合物有的化学成分复杂，在测定各成分含量时，必须能除去干扰因素，精确的测定含量，做到效的控制药物质量，保证药物的安全。

发明内容

本发明目的是提供一种有效测定中药组合物中黄芪甲苷的含量的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，该中药组合物由下列重量份数的原料药组成：黄芪35-140份、女贞子9-25份、滑石9-25份、夏枯草15-35份、荔枝核15-35份、琥珀1-4份、肉桂2-5份、关黄柏5-15份组成；测定方法由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取制剂，加入甲醇，浸泡过夜，超声处理，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液，蒸干，残渣用水转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

作为优选方式，测定方法由以下步骤组成： 

a、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量4-45g的制剂，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

作为优选方式，所述步骤c中高效液相色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器为蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器漂移管温度为75-85℃，气体流速为2.3-2.7L/min；流动相为体积比为75:25的甲醇-水，流速为0.7-0.9ml/min。

为实现上述方案，将该中药组合物制成胶囊剂、片剂或丸剂。

 作为优选方式，黄芪甲苷的含量测定由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量13.5g的该中药组合物胶囊4g，，倒出内容物，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器为蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器漂移管温度为80℃，气体流速为2.5L/min；流动相为体积比为75:25的甲醇-水，流速为0.8ml/min，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

所述中药组合物的活性成分的制备方法如下：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加50-70%乙醇，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，备用；

（3）取女贞子，加6-10倍量70-90%乙醇，加热回流提取1-3次，时间为每次1-3小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20-1.25的清膏，备用；

（4）取肉桂，加4-8倍量水浸泡1-2小时，提取挥发油2-6小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10倍量水，煎煮二次，第一次1-3小时，第二次1-2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，备用，

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

步骤（2）所得清膏、步骤（3）所得清膏、步骤（4）所得挥发油、步骤（5）所得清膏和步骤（6）所得细粉构成该中药组合物的活性成分。

该中药组合物胶囊剂的制备由以下步骤构成：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加6-12倍量50-70%乙醇，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.2-1.25的清膏，真空干燥，干膏备用；

（3）取女贞子，加6-10倍量70-90%乙醇，加热回流提取1-3次，时间为每次1-3小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20-1.25的清膏，真空干燥，干膏备用；

（4）取肉桂，加4-8倍量水浸泡1-2小时，提取挥发油2-6小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10倍量水，煎煮二次，第一次1-3小时，第二次1-2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，真空干燥，干膏与黄芪、关黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

（7）取干膏粉、原药粉和淀粉，混合均匀，用80%乙醇为粘合剂，搅拌制粒，60-70℃烘干，整粒；

（8）筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀,密闭，装胶囊，即得。

作为优选方式，所述中药组合物胶囊剂的制备由以下步骤构成：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加6倍量50%乙醇，加热回流提取1次，每次0.5小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（3）取女贞子，加6倍量70%乙醇，加热回流提取1次，时间为每次1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（4）取肉桂，加4倍量水浸泡1小时，提取挥发油2小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8倍量水，煎煮二次，第一次1小时，第二次1小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.2的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏与黄芪、关黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

（7）取干膏粉、原药粉和淀粉，混合均匀，用80%乙醇为粘合剂，搅拌制粒，60℃烘干，整粒；

（8）筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀，密闭，装胶囊，即得。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

本发明的方法能准确的测定出该中药组合物中黄芪甲苷的含量，有助于药物的质量控制，提高药物的安全性和可靠性。

本发明的测定方法的精密度、准确度、回收率等的检验

专属性试验

按实施例1处方量称取除黄芪外的药材，按制备工艺的要求制得空白样品，空白对照液的处理方法同供试品溶液的处理方法。分别吸取空白样品溶液、对照品溶液及供试品溶液，按照选定测定条件进行检测，结果表明：在黄芪甲苷相应的保留时间，空白样品无相应波峰出现，空白样品不干扰测定，见图1。

线性关系考察：

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液3、5、10、20、50μl注入高效液相色谱仪中，进行测定。测定结果见表1：

表1  线性关系测定结果

结果表明： 样品量在3—50μl (即0.29664—4.944μg)范围内呈良好线性关系，其进样量与峰面积积分值自然对数回归方程为：Lny=1.7215Lnx+7.1601   r=0.9998。

对照品纯度检测：经对黄芪甲苷对照品进行面积归一化法测定，结果黄芪对照甲苷对照品的纯度为 99.43％。

精密度考察：

   吸取实施例1的对照品溶液及供试品溶液各10μl，分别连续进样5次，测定峰面积。检测结果见表2：

表2 精密度试验结果

    结果表明：对照品和样品峰面积 RSD值分别为0.39%和0.68%。表明仪器性能良好。

稳定性考察：

吸取实施例1的黄芪甲苷对照品溶液与供试品溶液各10μl，每隔一定时间注入高效液相色谱仪中测定一次峰面积，测定了24小时内的变化情况，结果见表3：

表3 稳定性试验结果

结果表明：对照品和样品峰面积 RSD值分别为2.63%和2.46%。表明在24小时内，对照品和供试品溶液均稳定。

重现性试验：

取实施例1中的供试品，按高、中、低剂量取样，每个剂量取3份，进行提取，制备，测定，结果见表：

表4 重现性试验结果

结果表明：同一批供试品的9份平行供试品，所测定的黄芪甲苷的平均含量为0.5536mg/g，RSD为2.88%，说明方法的重现性良好。

回收率试验：

采用加样回收试验。取实施例1中的胶囊9份，分别加入低、中、高三个浓度的该中药组合物对照品甲醇溶液50ml，按供试品含量测定项下方法，进行提取，制备，测定，计算回收率。结果见表5：

表5  回收率试验测定结果

以上结果表明：黄芪甲苷的平均回收率为99.64%（n=9）， RSD为1.66%，说明方法准确度良好。

附图说明

图1是黄芪甲苷专属性实验结果图，A是黄芪甲苷对照品，B是阴性，C是供试品。

具体实施方式

实施例1

该中药组合物的配比如下：

黄芪700g、女贞子140g、滑石140 g、夏枯草210 g、荔枝核210 g、琥珀21 g、肉桂28 g、关黄柏70 g。

该中药组合物胶囊剂的制备过程为：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；（2）取黄芪、关黄柏，加6倍量50%乙醇，加热回流提取1次，每次0.5小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.2的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（3）取女贞子，加6倍量70%乙醇，加热回流提取1次，时间为1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.2的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（4）取肉桂，加4倍量水浸泡1小时，提取挥发油2小时，挥发油另器收集，出油率不少于1.0%，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8倍量水，煎煮二次，第一次1小时，第二次1小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.2的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏与黄芪、关黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

（7）取干膏粉、原药粉和淀粉，混合均匀，用80%乙醇为粘合剂，搅拌制粒，60℃烘干，整粒；

（8）筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀。密闭，装胶囊，即得。

制得1000粒，每粒0.45g，相当于生药量1.519g。

该中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量4g的该中药组合物胶囊，大约1.2g，倒出内容物，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，功率为250W，频率40kHz，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为80℃，气体流速为2.5L/min，流动相为体积比75:25的甲醇-水，流速为0.8ml/min测定，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000，以外标两点法对数方程式计算，每粒含黄芪以黄芪甲苷计，不少于0.19mg，测得黄芪甲苷含量为0.223g。

实施例2

该中药组合物的配比如下：

黄芪140g、女贞子25g、滑石25 g、夏枯草35 g、荔枝核35 g、琥珀4 g、肉桂5 g、关黄柏15 g。

该中药组合物片剂的制备过程为：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；（2）取黄芪、关黄柏，加70%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.25的清膏，备用；（3）取女贞子，加10倍量90%乙醇，加热回流提取3次，时间为每次3小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.25的清膏，备用；（4）取肉桂，加8倍量水浸泡2小时，提取挥发油6小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加10倍量水，煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.25的清膏，备用，（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；（7）按照常规方法制成片剂；制成200片，每片0.45g，相当于1.42g的生药量。

该中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量45g的该中药组合物片剂，大约14g，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，功率为250W，频率40kHz，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为75℃，气体流速为2.3L/min，流动相为体积比75:25的甲醇-水，流速为0.7ml/min测定，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量为0.046g。

精密度考察：

  对照品和样品峰面积 RSD值分别为0.38%和0.66%。

稳定性考察：

对照品和样品峰面积 RSD值分别为2.62%和2.43%。表明在24小时内，对照品和供试品溶液均稳定。

重现性试验：

同样的9份平行供试品，所测定的黄芪甲苷的平均含量为0.5532mg/g，RSD为2.86%，说明方法的重现性良好。

回收率试验：

采用加样回收试验。黄芪甲苷的平均回收率为99.65%（n=9）， RSD为1.65%，说明方法准确度良好。

实施例3

该中药组合物的配比如下：

黄芪350g、女贞子90 g、滑石90 g、夏枯草150 g、荔枝核150g、琥珀10g、肉桂20 g、关黄柏50 g。

该中药组合物丸剂的制备过程为：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；（2）取黄芪、关黄柏，加60%乙醇，加热回流提取2次，每次1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.23的清膏，备用；（3）取女贞子，加8倍量80%乙醇，加热回流提取2次，时间为每次2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.22的清膏，备用；（4）取肉桂，加6倍量水浸泡2小时，提取挥发油4小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加9倍量水，煎煮二次，第一次2小时，第二次2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.24的清膏，备用，（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；（7）按照常规方法制成丸剂；制成500丸，每丸0.45g，相当于生药量1.84g。

该中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量13.5g的该中药组合物丸剂，大约3.3g，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，功率为250W，频率40kHz，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为85℃，气体流速为2.7L/min，流动相为体积比75:25的甲醇-水，流速为0.9ml/min测定，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量为0.117g。

精密度考察：

   对照品和样品峰面积 RSD值分别为0.36%和0.65%。

稳定性考察：

对照品和样品峰面积 RSD值分别为2.61%和2.43%。表明在24小时内，对照品和供试品溶液均稳定。

重现性试验：

同样的9份平行供试品，所测定的黄芪甲苷的平均含量为0.5536mg/g，RSD为2.78%，说明方法的重现性良好。

回收率试验：

采用加样回收试验。黄芪甲苷的平均回收率为99.74%（n=9）， RSD为1.61%，说明方法准确度良好。

实施例4

该中药组合物的配比如下：

黄芪350g、女贞子180g、滑石120 g、夏枯草190 g、荔枝核250 g、琥珀25 g、肉桂45 g、关黄柏130 g。

该中药组合物胶囊剂的制备过程为：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；（2）取黄芪、关黄柏，加12倍量70%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20的清膏，备用；（3）取女贞子，加9倍量70%乙醇，加热回流提取1.5次，时间为每次1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.25的清膏，备用；（4）取肉桂，加7倍量水浸泡1小时，提取挥发油5小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加9倍量水，煎煮二次，第一次1小时，第二次1小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.25的清膏，备用，（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；（6）按照常规方法制成胶囊剂；制成1000粒。每粒0.45g，相当于生药量1.29g。

该中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量20g的该中药组合物将囊剂，大约7g，倒出内容物，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，功率为250W，频率40kHz，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为80℃，气体流速为2.5L/min，流动相为体积比75:25的甲醇-水，流速为0.8ml/min测定，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000，以外标两点法对数方程式计算，每粒含黄芪以黄芪甲苷计，不少于0.19mg，测得黄芪甲苷含量为0.115g。

精密度考察：

  对照品和样品峰面积 RSD值分别为0.41%和0.63%。

稳定性考察：

对照品和样品峰面积 RSD值分别为2.61%和2.48%。表明在24小时内，对照品和供试品溶液均稳定。

重现性试验：

同样的9份平行供试品，所测定的黄芪甲苷的平均含量为0.5546mg/g，RSD为2.85%，说明方法的重现性良好。

回收率试验：

采用加样回收试验。黄芪甲苷的平均回收率为99.64%（n=9）， RSD为1.66%，说明方法准确度良好。

实施例5

该中药组合物的配比如下：

黄芪380g、女贞子160g、滑石130 g、夏枯草200 g、荔枝核260 g、琥珀30 g、肉桂35 g、关黄柏140 g。

该中药组合物胶囊剂的制备过程为：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；（2）取黄芪、关黄柏，加12倍量70%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20的清膏，备用；（3）取女贞子，加9倍量70%乙醇，加热回流提取1.5次，时间为每次1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.25的清膏，备用；（4）取肉桂，加7倍量水浸泡1小时，提取挥发油5小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加9倍量水，煎煮二次，第一次1小时，第二次1小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.25的清膏，备用，（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；（6）按照常规方法制成胶囊剂1000粒；每粒重0.45g，相当于生药量1.335g。

该中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量35g的该中药组合物将囊剂，大约12g，倒出内容物，研细，加入甲醇60ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，功率为250W，频率40kHz，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液30ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次25ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是25ml、20ml、30ml、25ml、30ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤3次，每次15ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为80℃，气体流速为2.5L/min，流动相为体积比75:25的甲醇-水，流速为0.8ml/min测定，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000，以外标两点法对数方程式计算，每粒含黄芪以黄芪甲苷计，不少于0.19mg，测得黄芪甲苷含量为0.114g。

精密度考察：

  对照品和样品峰面积 RSD值分别为0.42%和0.62%。

稳定性考察：

对照品和样品峰面积 RSD值分别为2.59%和2.38%。表明在24小时内，对照品和供试品溶液均稳定。

重现性试验：

同样的9份平行供试品，所测定的黄芪甲苷的平均含量为0.5546mg/g，RSD为2.86%，说明方法的重现性良好。

回收率试验：

采用加样回收试验。黄芪甲苷的平均回收率为99.65%（n=9）， RSD为1.67%，说明方法准确度良好。

Claims (8)

1.一种中药组合物中黄芪甲苷的含量测定方法，该中药组合物由下列重量份数的原料药组成：黄芪35-140份、女贞子9-25份、滑石9-25份、夏枯草15-35份、荔枝核15-35份、琥珀1-4份、肉桂2-5份、关黄柏5-15份组成；其特征在于测定方法由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取制剂，加入甲醇，浸泡过夜，超声处理，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液，蒸干，残渣用水转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于测定方法由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量4-45g的制剂，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤c中高效液相色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器为蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器漂移管温度为75-85℃，气体流速为2.3-2.7L/min；流动相为体积比为75:25的甲醇-水，流速为0.7-0.9ml/min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂或丸剂。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于黄芪甲苷的含量测定由以下步骤组成：

a、供试品溶液的制备：取相当于生药量13.5g的该中药组合物胶囊4g，倒出内容物，研细，加入甲醇50ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足重量，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml转移至分液漏斗中，再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，弃去三氯甲烷，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，正丁醇每次用量分别是20ml、20ml、20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，用0.5%NaOH溶液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，合并NaOH洗液和水洗液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加75%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中至刻度，摇匀，即得；

b、对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

c、测定：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL以及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，测定，高效液相色谱中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器为蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器漂移管温度为80℃，气体流速为2.5L/min；流动相为体积比为75:25的甲醇-水，流速为0.8ml/min，以外标两点法对数方程式计算，测得黄芪甲苷含量。

6.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药组合物的活性成分的制备方法如下：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加50-70%乙醇，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，备用；

（3）取女贞子，加6-10倍量70-90%乙醇，加热回流提取1-3次，时间为每次1-3小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20-1.25的清膏，备用；

（4）取肉桂，加4-8倍量水浸泡1-2小时，提取挥发油2-6小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10倍量水，煎煮二次，第一次1-3小时，第二次1-2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，备用，

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

步骤（2）所得清膏、步骤（3）所得清膏、步骤（4）所得挥发油、步骤（5）所得清膏和步骤（6）所得细粉构成该中药组合物的活性成分。

7.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于该中药组合物胶囊剂的制备由以下步骤构成：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加6-12倍量50-70%乙醇，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.2-1.25的清膏，真空干燥，干膏备用；

（3）取女贞子，加6-10倍量70-90%乙醇，加热回流提取1-3次，时间为每次1-3小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20-1.25的清膏，真空干燥，干膏备用；

（4）取肉桂，加4-8倍量水浸泡1-2小时，提取挥发油2-6小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10倍量水，煎煮二次，第一次1-3小时，第二次1-2小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，真空干燥，干膏与黄芪、关黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

（7）取干膏粉、原药粉和淀粉，混合均匀，用80%乙醇为粘合剂，搅拌制粒，60-70℃烘干，整粒；

（8）筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀,密闭，装胶囊，即得。

8.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于所述胶囊剂的制备由以下步骤构成：

（1）取上述中药材，分别选净，粉碎，按组方称量；

（2）取黄芪、关黄柏，加6倍量50%乙醇，加热回流提取1次，每次0.5小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（3）取女贞子，加6倍量70%乙醇，加热回流提取1次，时间为每次1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度1.20的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏备用；

（4）取肉桂，加4倍量水浸泡1小时，提取挥发油2小时，挥发油另器收集，水提取液过滤收集，残渣备用；

（5）取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8倍量水，煎煮二次，第一次1小时，第二次1小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.2的清膏，放入真空干燥箱，在温度60℃，真空度0.04Mpa条件下减压干燥，干膏与黄芪、关黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；

（6）取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；

（7）取干膏粉、原药粉和淀粉，混合均匀，用80%乙醇为粘合剂，搅拌制粒，60℃烘干，整粒；

（8）筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀，密闭，装胶囊，即得。