CN107412750B - 含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法，所述含高活性纳豆激酶的组合物由下述重量份的原料制备而成：纳豆激酶8‑12份、糊精80‑85份、香料1‑5份、甜菊糖0.1‑1份、木糖醇1‑5份。本发明所述含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法，从原料的选择，并通过对纳豆激酶的制备方法优化，得出最优组合物；同传统纳豆激酶组合物相比，纳豆激酶因其较好的纤溶酶活，且半衰期长、可口服、副作用小等优点，被视为血栓治疗的良药；本发明纳豆激酶可溶栓、抗凝、调压降脂肪、改善血液循环。保护心脑血管健康。纳豆激酶可将体内尿激酶原激活为鸟激酶，与纤溶酶原激活剂(t‑PA)一同激活纤溶酶原溶解血栓。本发明特点是温和、持续溶栓，抑制血小板凝聚。
Description
技术领域
本发明涉及纳豆激酶技术领域，尤其涉及一种含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法。
背景技术
纳豆是以黄豆为原料，接种纳豆菌，经过发酵而制成的一种保健食品。它具有溶血栓、抗菌及降解毒素、助消化并维持胃肠道健康、防治骨质疏松、抗癌、抗氧化、降血压、消除体内放射性元素等作用。其中，在溶血栓方面应用较为广泛，每年心血管疾病的死亡率居致死原因首位。在我国，估计每年仍260万的人死于心脑血管疾病。此外，全国还有1亿多高血压病患者，每年还以一定的比例增长。鉴于此种情况，纳豆既具有很好的治疗效果，而且制作工艺简单、成本低，给广大心脑血管患者带来了希望。
纳豆激酶自从被发现以来，就作为一种纤溶酶类的产品备受关注，并且因其具有溶栓作用，并被广泛的用作溶栓药物。它主要来源是经过发酵制成的纳豆产品中，其安全性也相应较高。从发现纳豆激酶至今，从纳豆到纳豆激酶的一系列研究都已经逐步完善。比如，该酶的理化性质、溶解血栓的机制以及如何对酶的分离纯化等。关于该酶类的研究，主要分为两个方面：一是溶栓药品，二是保健食品。
纳豆激酶除了含有溶解血栓的作用外，由于纳豆激酶中还含有可以用来治疗高血压的血管紧张素转化酶抑制剂的成分，可以用治疗高血压；口服纳豆激酶，还可以降低深静脉血栓疾病和肢体水肿现象的发生；预防以及治疗骨质疏松疾病和糖尿病；以及可以避免大脑局部缺血的作用。
因此，本发明致力于开发一种含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法，酶活性高，溶栓效果好。
发明内容
针对现有技术存在的诸多缺陷，本发明人经过大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，提供一种酶活性高、溶栓效果好的含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种含高活性纳豆激酶的组合物，由下述重量份的原料制备而成：纳豆激酶8-12份、糊精80-85份、香料1-5份、甜菊糖0.1-1份、木糖醇1-5份。
优选地，所述糊精为β-环糊精和/或麦芽糊精。
优选地，所述香料为柠檬酸。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将80-100重量份发酵原料、5-15重量份酶保活剂、400-600重量份水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料加入发酵罐中经110-120℃灭菌15-25min，冷却至30-40℃，pH控制在6-7，然后接种5-15重量份纳豆芽孢杆菌，通气量为12-18L/min，发酵温度为30-40℃，发酵时间为20-25小时，得到发酵液；
(3)将发酵液先经过0.1-0.5μm的中空纤维膜进行澄清，再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍，得到浓缩液；
(4)将浓缩液真空冷冻干燥即得。
优选地，所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将80-100重量份发酵原料、5-15重量份酶保活剂、400-600重量份水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理1-5分钟，温度为40-50℃，微波功率为300-700W；
(3)将微波处理后的混合料加入发酵罐中经110-120℃灭菌15-25min，冷却至30-40℃，pH控制在6-7，然后接种5-15重量份纳豆芽孢杆菌，通气量为12-18L/min，发酵温度为30-40℃，发酵时间为20-25小时，得到发酵液；
(4)将发酵液先经过0.1-0.5μm的中空纤维膜进行澄清，再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍，得到浓缩液；
(5)将浓缩液真空冷冻干燥即得。
更优选地，所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将80-100重量份发酵原料、5-15重量份酶保活剂、400-600重量份水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理1-5分钟，温度为40-50℃，微波功率为300-700W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理1-5分钟，电场强度15-25KV/cm，脉冲时间150-250μS,脉冲频率100-300Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后的混合料加入发酵罐中经110-120℃灭菌15-25min，冷却至30-40℃，pH控制在6-7，然后接种5-15重量份纳豆芽孢杆菌，通气量为12-18L/min，发酵温度为30-40℃，发酵时间为20-25小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.1-0.5μm的中空纤维膜进行澄清，再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液真空冷冻干燥即得。
优选地，所述发酵原料为大豆粉与玉米粉的混合物、大豆粉与木薯粉的混合物或大豆粉与燕麦粉的混合物物。
更优选地，所述发酵原料由大豆粉与木薯粉按重量比为1:0.4-0.8组成。
优选地，所述酶保活剂为海藻糖、海带多糖、紫菜多糖、黑木耳多糖中一种或多种的混合物。
本发明还提供了上述含高活性纳豆激酶的组合物的制备方法，将各原料混合均匀即得。
本发明所述含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法，从原料的选择，并通过对纳豆激酶的制备方法优化，得出最优组合物；同传统纳豆激酶组合物相比，纳豆激酶因其较好的纤溶酶活，且半衰期长、可口服、副作用小等优点，被视为血栓治疗的良药；目前纳豆激酶生产主要是用大豆发酵而成，而大豆粉为主要原料生产纳豆激酶的研究未见报道。本发明纳豆激酶可溶栓、抗凝、调压降脂肪、改善血液循环。保护心脑血管健康。纳豆激酶可将体内尿激酶原激活为鸟激酶，与纤溶酶原激活剂(t-PA)一同激活纤溶酶原溶解血栓。本发明特点是温和、持续溶栓，抑制血小板凝聚。
具体实施方式
纳豆激酶活力测试方法：
1.标准曲线的测定
依据《中华人民共和国卫生部WS2011(X2006)95》中“尿激酶琼脂糖-纤维蛋白平板法”进行测定。
(1)将牛纤维蛋白原溶解于pH7.4的磷酸盐缓冲液(0.01mmol/L)中，制成100mg/mL可凝结蛋白溶液；凝血酶溶解于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，制成1000IU/mL的溶液。
(2)琼脂糖-纤维蛋白平板制备：取1wt％琼脂糖溶液12mL，先在水浴45℃恒温10min，然后分别将100mg/mL牛纤维蛋白原91μL、1000IU/mL凝血酶溶液47μL溶于0.5mLPBS缓冲液中，45℃水浴中恒温10min。待两者温度一致时，将0.5mL凝血酶、0.5mL牛纤维蛋白原与琼脂糖溶液迅速混匀，立即倒平板，尽量不产生气泡。37℃孵育1h，贮存于4℃冰箱备用，贮存期一般不超过3d。
(3)取尿激酶标准品用0.9％无菌生理盐水稀释成5、10、20、40、60、80和100IU/mL各取10μL点样于新配制的平板上，37℃保温17h。取出后测出标准品和待测品的溶圈最大直径及垂直于最大直径的另一直径，求出溶圈直径的平均值，以溶圈直径平均值的平方表示，从而计算出待测品的活性相当于尿激酶的单位数。以酶活(IU/mL)为横坐标，溶解圈面积(cm2)为纵坐标，得到尿激酶标准曲线和标准曲线的回归方程。
2.纳豆激酶酶活性的测定
将2g纳豆激酶组合物加入5mL质量分数为0.9％生理盐水中，4℃浸提4h，4℃，4500r/min离心20min，上清液即为酶溶液；用微量加样器移取10μL酶溶液点种于纤维蛋白平板上，同时以一定单位的标准尿激酶作对照，做好标记，37℃保温18h，测量透明圈直径，计算溶解圈面积，与标准曲线比对，计算酶活力。
多肽含量测定：准确称取0.5g纳豆激酶于离心管中，加入10mL三氯乙酸，在微量搅拌器中搅拌25min，1500转/分离心10min，取上清液进行凯氏定氮法测定。
实施例中各原料介绍：
木薯粉，采用广西来宾九龙淀粉有限公司提供的食用木薯淀粉。
大豆粉，大豆又名黄豆，采用亳州市保华药业有限公司提供的品牌为YPFEN的黄豆粉。
紫菜多糖，采用专利申请号：201110321923.3中实施例3所示方法制备。
海带多糖，采用专利申请号：200710157574.X中实施例1所示方法制备。
纳豆芽孢杆菌，名称为YJND01，分类命名枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏编号为：CGMCC No.7516，保藏日期为2013年4月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；本发明所用纳豆芽孢杆菌从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买，纳豆芽孢杆菌浓度为108cfu/mL。
实施例1
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg木薯粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(3)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(4)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例2
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg木薯粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(4)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(5)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例3
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg木薯粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(3)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(4)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(5)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例4
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg木薯粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例5
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg玉米粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例6
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.8kg海带多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例7
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.8kg海藻糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例8
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.8kg紫菜多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例9
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.8kg黑木耳多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。
实施例10
更优选地，所述酶保活剂由20-30wt％海带多糖和70-80wt％紫菜多糖组成。
含高活性纳豆激酶的组合物原料(重量份)：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份。将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含高活性纳豆激酶的组合物。
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.2kg海带多糖、0.6kg紫菜多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS,脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到纳豆激酶。纳豆激酶的酶活力和多肽含量测试结果：酶活力为6715IU/g多肽含量为34.18％。
测试例1
对实施例1-9制备的纳豆激酶的酶活力和多肽含量进行测试，具体测试结果见表1。
表1：纳豆激酶的酶活力和多肽含量测试结果表
| 酶活力，IU/g | 多肽含量，％ | |
| 实施例1 | 3057 | 13.38 |
| 实施例2 | 3912 | 21.65 |
| 实施例3 | 3264 | 15.27 |
| 实施例4 | 5428 | 23.93 |
| 实施例5 | 5340 | 24.01 |
| 实施例6 | 5671 | 26.59 |
| 实施例7 | 5695 | 24.88 |
| 实施例8 | 5967 | 25.25 |
| 实施例9 | 5544 | 27.14 |
由表1可知，发酵原料采用微波处理后，纳豆激酶的酶活力和多肽含量得到明显提高，这可能是因为，微波处理杀灭了发酵原料中的有害菌，同时对发酵原料进行了微波消解更易于后续发酵。
Claims (8)
1.一种含纳豆激酶的组合物，其特征在于，由下述重量份的原料制备而成：纳豆激酶8-12份、糊精80-85份、香料1-5份、甜菊糖0.1-1份、木糖醇1-5份；
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将80-100重量份发酵原料、5-15重量份酶保活剂、400-600重量份水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理1-5分钟，温度为40-50℃，微波功率为300-700W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理1-5分钟，电场强度15-25KV/cm，脉冲时间150-250μS，脉冲频率100-300Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后的混合料加入发酵罐中经110-120℃灭菌15-25min，冷却至30-40℃，pH控制在6-7，然后接种5-15重量份纳豆芽孢杆菌，通气量为12-18L/min，发酵温度为30-40℃，发酵时间为20-25小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.1-0.5μm的中空纤维膜进行澄清，再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液真空冷冻干燥即得。
2.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于：所述糊精为β-环糊精和/或麦芽糊精。
3.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于：所述香料为柠檬酸。
4.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于：所述发酵原料为大豆粉与玉米粉的混合物、大豆粉与木薯粉的混合物或大豆粉与燕麦粉的混合物。
5.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于：所述发酵原料由大豆粉与木薯粉按重量比为1:0.4-0.8组成。
6.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于：所述酶保活剂为海藻糖、海带多糖、紫菜多糖、黑木耳多糖中一种或多种的混合物。
7.如权利要求1所述的含纳豆激酶的组合物，其特征在于，由下述重量份的原料制备而成：纳豆激酶10.5份、β-环糊精83份、柠檬酸3份、甜菊糖0.5份、木糖醇3份，将纳豆激酶、β-环糊精、柠檬酸、甜菊糖、木糖醇混合均匀即得含纳豆激酶的组合物；
所述纳豆激酶由下述方法制备：
(1)将6kg大豆粉、3kg燕麦粉、0.2kg海带多糖、0.6kg紫菜多糖、50kg水混合均匀，得到混合料；
(2)将混合料进行微波处理3分钟，温度为45℃，微波功率为600W；
(3)将微波处理后的混合料进行高压脉冲电场处理3分钟，电场强度20KV/cm，脉冲时间200μS，脉冲频率200Hz；
(4)将高压脉冲电场处理后混合料加入发酵罐中经115℃灭菌20min，冷却至35℃，pH控制在6.5，然后接种1kg纳豆芽孢杆菌，通气量为16L/min，发酵温度为36℃，空气相对湿度为90％，搅拌转速为500转/分，发酵时间为22小时，得到发酵液；
(5)将发酵液先经过0.2μm的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为10psi、流速150mL/min，滤出液再用孔径10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20psi、流速120mL/min，最终控制浓缩倍数在6倍，得到浓缩液；
(6)将浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚5mm，设定预冻温度为-30℃，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5℃，解析温度为35℃，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2wt％，得到所述纳豆激酶。
8.一种如权利要求1-6中任一项所述含纳豆激酶的组合物的制备方法，将各原料混合均匀即得。
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