CN1071333A - 钙受体活性分子 - Google Patents

Abstract

治疗患有一种或多种组分不正常水平为特征的 疾病的病人的有用的方法与组合物，而组分的活性是 由一种或一种以上的Ca²⁺受体的活性调节或影响 的。还提供了在这些方法和组合物中使用的新化合 物。该方法包括给病人服用在一种或多种Ca²⁺受体 活性的、治疗上有效量的一种分子作激动剂或拮抗 剂。最好是该分子能在选自于下述细胞组成的组中 和一种或多种细胞、但不是所有细胞的Ca²⁺受体上 起着选择性的激动剂或拮抗剂的作用：甲状旁腺细 胞、骨破骨细胞、近肾小球细胞、近管肾细胞、角化细 胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层以及一种可药用 载体。

Description

本申请是Nemeth等人于1992年2月11日提出的题为钙受体活性分子申请案的部分后续申请，后者是Nemeth等人于1991年8月23日提出的题为钙受体活化剂的美国07/749451号申请的部分后续申请，二者均被全文（包括附图）引入本文作为参改。

本发明涉及能以类似于细胞上胞外钙离子方式作用的新模拟钙分子（Calcimimetic）的设计、研制、组成和应用，还涉及阻断细胞上胞外钙离子活性的溶解钙分子（Calcilytic），及其使用和鉴定方法。

下面说明提供了与本发明相关的资料的摘要。这不是承认本文所提供的任何资料为现请求保护发明的现有技术，也不能认为任何具体或非具体引用的公开出版物是本发明的现有技术。

体内的某些细胞不仅对化学信号响应，而且也对离子如胞外钙离子（Ca²⁺）响应。胞外Ca²⁺（本文称为“[Ca²⁺]”）浓度的变化会改变这些细胞的功能响应。该特定细胞之一种是能分泌甲状旁腺激素（PTH）的甲状旁腺细胞。PTH是调节血液和胞外流体中Ca²⁺体内平衡的主要内分泌因子。

PTH通过在骨和肾细胞中起作用，从而增加血液中Ca²⁺浓度。然后[Ca²⁺]的这种增加可用作负反馈信号，抑制PTH分泌。[Ca²⁺]和PTH分泌之间的相互关系形成了保持体内Ca²⁺体内平衡的主要机制。

胞外Ca²⁺直接作用于甲状旁腺以调节PTH的分泌。有人提出存在甲状旁腺细胞表面蛋白质，该蛋白质能测定[Ca²⁺]的变化。该蛋白质用作胞外Ca²⁺的受体（Ca²⁺受体），并认为它可测定[Ca²⁺]的变化，并可启动功能性细胞响应，PTH分泌。例如，Ca²⁺受体和胞外Ca²⁺对于调节胞内Ca²⁺和细胞功能方面的作用在Nemeth等人，11 Cell Calcium319，1990中作了述评。Ca²⁺受体在类卵泡和甲状旁腺细胞中的作用在Nemeth，11 Cell Calcium323，1990中进行了讨论;Ca²⁺受体在骨的破骨细胞上的作用的讨论可参见Zaidi，10 Bioscien ce Reports493，1990。

体内其它细胞，特别是骨中破骨细胞，肾中的近肾小球细胞和近管肾细胞，表皮中的角化细胞，甲状腺中的类卵泡细胞，胎盘中的滋养层均具有感觉[Ca²⁺]变化的能力。现已提出这些细胞上也存在细胞表面Ca²⁺受体，这使它们能测定、启动或能响应[Ca²⁺]变化。

在甲状旁腺细胞、破骨细胞、类卵泡细胞（C-细胞）、角化细胞、近肾小球细胞和滋养层中，[Ca²⁺]的增加能引起胞内游离Ca²⁺浓度（“[Ca²⁺]_i”）的增加。这种增加可由胞外Ca²⁺流入或来自胞内的细胞器的Ca²⁺迁移引起。用荧光分析指示如fura-2或indo-1（分子探针，Eugene，OR）容易监测和定量[Ca²⁺]_i的变化。[Ca²⁺]_i的测定为确定分子在Ca²⁺受体上用作拮抗剂或对抗剂的能力提供了鉴定方法。

在甲状旁腺细胞中，胞外Ca²⁺浓度增加能引起[Ca²⁺]_i的快速和瞬时增加，随后[Ca²⁺]_i慢慢而持续地增加。[Ca²⁺]_i的瞬时增加是由胞内Ca²⁺的迁移引起的，而其缓慢而持续增加是由胞外Ca²⁺的流动引起的。胞内Ca²⁺的迁移伴随生成的肌醇-1，4，5-三磷酸酯（IP₃）和二酰基丙三醇增加，这两种生化指示剂与各种其它细胞中受体依赖性胞内Ca²⁺迁称有关。

除Ca²⁺外，其它各种二价和三价阳离子，如Mg²⁺、Sr²⁺、Ba³⁺、La³⁺和Gd³⁺也能使甲状旁腺细胞中的胞内Ca²⁺迁移。Mg²⁺和La³⁺也能增加IP₃的生成;所有这些无机阳离子均能抑制PTH的分泌。因此在甲状旁腺细胞上假设的Ca²⁺受体是混杂的，因为它能测定各种各样的胞外二价和三价阳离子。

各种化合物对体外模拟胞外Ca²⁺的能力在下列文献中进行了讨论，即Nemeth等人，（Spermine and Spermidine）的“Calcium-Binding Proteins in Health and Disease”，1987，Academic Press，Inc.，PP.33-35;Brown等人.，（e.g.，neomycin）128 Endocrinology 3047，1991;Chen等人.，（diltiazem and its analog，TA-3090）5 J.Bone and Mineral Res.581，1990;和Zaidi等人.，（Verapamil）167 Boichem Biophys Res Comm 807，1990。

Brown等人，在6 J.Bone and Mineral Res.11，1991中对有关Ca²⁺在甲状旁腺细胞上的作用的现有理论进行了讨论，并提出该结果可用如下二种机制即类受体机制和受体非依赖性机制进行解释：

多价阳离子（如，二价和三价阳离子）对甲状旁腺功能（如抑制甲状旁腺激素（PTH）的分泌和CAMP积聚，刺激磷酸肌醇酯的积聚，细胞溶质钙浓度提高）有各种影响。这些作用被认为是通过“类受体”机制间价的。例如，二价和三价阳离子对主动肌刺激的CAMP积聚的抑制作用，在用百日咳毒素预培养后可以被阻断。因此，这种推想的多价阳离子受体可以被偶合通过抑制乌嘌呤核苷酸调节的（G）蛋白质，G_i抑制腺苷酸环化酶。

近来我们已证明聚阳离子的抗菌素，新霉素在甲状旁腺功能的多方面能模拟二价和三价阳离子的作用。为确定这些作用是否对这些试剂具有特异性或代表聚阳离子和更一般的作用，我们测试了强碱性肽、聚精氨酸和聚赖氨酸以及精蛋白在相同参数的分散牛甲状旁腺细胞中的作用。结果表明，甲状旁腺细胞可能通过类似的生化途径对各种聚阳离子以及多价阳离子响应。根据近来假设的在其它体系中用聚阳离子对G蛋白质进行“受体非依赖性”调节，对这些结果进行讨论。

已推测Ca²⁺受体类似其它G蛋白质偶合的受体（如，糖蛋白），但是对于其它类型细胞的近来研究提出聚阳离子可能通过另外的或附加的机制调节细胞功能。在乳突细胞中，例如，各种两亲阳离子，包括mastoparan，来自黄蜂毒液的肽，48/80，合成的聚阳离子和聚赖氨酸均通过百日咳毒素敏感机制增加其分泌，并提出它们包含G蛋白质。还未发现能够间介这些不同试剂的典型细胞表面受体。而且，已证明这些相同的化合物能在溶液或在人造磷脂小泡中直接活化已纯化的G蛋白质。基于这些观察结果，已提出两亲阳离子活化G蛋白质，并且依次通过“受体非依赖性”机制分泌乳突细胞。

也已证明聚阳离子能与酸性磷脂强烈相互作用。改变链长的聚赖氨酸（20-1000氨基酸）能与人造磷脂小泡结合，其离解常数为0.5nM-1.5μM。这种结合的亲合性直接与聚赖氨酸链的长度有关，对于1000氨基酸聚合物而言，Ka为0.5nM，较短的聚合物具有更高的Ka值，赖氨酸的相互作用程度不明显。能力与链长之间的关系与已测得的聚赖氨酸10200、聚赖氨酸3800以及赖氨酸对于甲状旁腺功能的影响相类似。

聚阳离子与生物膜的结合可能产生某些生物作用。假设在某些类型细胞中用各种成孔试剂，包括聚阳离子诱导的血浆膜渗透可通过其与一种类磷脂酰丝氨酸结构相互作用而间介。另外，若将这些蛋白质加入到磷脂小泡中，用两亲阳离子使纯化的G蛋白质“受体非依赖性”活化更有效。

钙离子（毫克分子浓度范围）在膜结构中也产生明显变化。在某些情况下，钙既能抵消又能增强聚阳离子与膜脂的相互作用。这些研究提出多价阳离子和聚阳离子在甲状旁腺细胞中的作用可能包括无需典型的细胞表面G蛋白质偶合受体存在的一种受体非依赖性机制。然而，还需进一步研究以解释对于这类和其它类细胞Ca²⁺敏感的分子基础（引用文略）。

Shoback和Chen在（6（supplement 1），J.Bone and Mineral Res.1991，S 135）和Racke等人在（6（suppleMent 1），J.Bone and Mineral Res.1991，S 118）叙述的试验，表明在甲状旁腺细胞中存在Ca²⁺受体或Ca²⁺感受器。从这些细胞中分离的信使RNA能在卵母细胞中表达，并导致具有表现型的那些卵母细胞产生，这说明存在Ca²⁺受体蛋白质。

申请人已说明Ca²⁺受体蛋白质使某些特定的身体Ca²⁺代谢细胞能测定和响应胞外Ca²⁺浓度的变化。虽然这些受体具有某些一般特征，它们能选择性受不同药剂影响。如下所述，用甲状旁腺细胞，破骨细胞和C-细胞中Ca²⁺受体的选择活性可鉴定某些分子。

Ca²⁺受体构成用于一类新分子的分离分子靶，该分子能模拟（“模拟钙”）或对抗（“溶解钙”）胞外Ca²⁺的作用。这种受体存在于细胞表面，对胞外Ca²⁺的亲合力低（通常Kd约大于0.5mM）。该受体包括自由或结合的效应基团机理，如Cooper Bloom和Roth，“The Biochemical Basis of Neuropharmacology”，ch.4，所定义的。因此该受体性质不同于胞内Ca²⁺受体，如调钙蛋白和肌钙蛋白。例如，模拟钙，选择性作用于Ca²⁺受体以直接或间接抑制甲状旁腺细胞或破骨细胞功能，或刺激C-细胞功能。本发明的模拟钙和溶解钙为甲状旁腺机能亢进、骨质疏松及其它与钙有关的疾病提供了新的疗法。本申请涉及这三种细胞之每一种和其它类型细胞上的靶Ca²⁺受体，该受体测定和响应[Ca²⁺]变化。

申请人是第一个证明甲状旁腺细胞中的Ca²⁺受体蛋白质，并从药理学上区分在其它细胞，如C-细胞和破骨细胞中的Ca²⁺受体。申请人也是第一个叙述了方法，通过该方法可以识别在这些Ca²⁺受体上有活性的分子，而且这些分子可用作发现、研究、设计、改性和/或构建在Ca²⁺受体上具有活性的有用的模拟钙或溶解钙的引导分子。该模拟钙或溶解钙在以一种或多种成分，如多肽，如激素、酶或生长因子含量异常为特征的各种病态治疗中是有用的，其表达和/或分泌受到一种或多种Ca²⁺受体活性调节或影响。而且，不同类型细胞中不同Ca²⁺受体的鉴定，及该受体对不同引导分子的特定响应能设计和构建对治疗特定疾病有活性的特定分子，该分子能受该特定Ca²⁺受体作用影响。例如，该特定分子能影响甲状旁腺激素的异常分泌量，但不会改变其它Ca²⁺调节激素及类似物的分泌量。

由可以前没有高产率的筛选系统以发现活性分子，也没有基于设计有效药剂候选物的结构资料，阻碍了该引导分子的鉴定。通过克隆甲状旁腺细胞Ca²⁺受体和功能性相关受体，并系统研究活化已克隆Ca²⁺受体和功能性相关受体的某些引导分子的结构特征，现在已消除这些障碍。Ca²⁺受体的克隆也能研制转染的细胞系，该细胞系适用于天然产物或分子库和合成分子的高产率筛选。这与下面讨论的结构一活性研究一起，提供了研制新模拟钙和溶解钙所需的技术。

在本申请中申请人使该方法得以实现。例如，通过对非洲蟾蜍属（Xenopus）卵母细胞中的功能表达进行筛选可以克隆人甲状旁腺细胞Ca²⁺受体cDNA，通过所选天然产物或其它分子库的试验，及后来的结构一活性研究可测定对Ca²⁺受体具有活性的有机分子的结构特征。

因此，第一方面，本发明特征为一种药物组合物，该组合物含有一种分子，该分子或者引起细胞中[Ca²⁺]_i增加模拟胞外Ca²⁺活性，或者阻断由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。该分子具有的EC₅₀小于或等于5μM，它不是鱼精蛋白。

所谓“模拟”意思是指该分子在胞外Ca²⁺响应细胞上具有一种或多种特定的胞外Ca²⁺的作用。该术语并不要求模拟胞外Ca²⁺的所有生物功能，而只要模拟该功能中的至少一种。此外，不要求该分子结合于受体（如同胞外Ca²⁺受体一样）的相同位点（参见如，新化合物NPS467及其在下列实例20中的作用）。所谓“阻断”意思是指用该分子能减弱或阻止Ca²⁺的某一作用。EC₅₀能用下述分析方法进行测定，该分析测量了模拟活性，并且最大模拟作用的一半时模拟分子的浓度是EC₅₀。相反，溶解钙的IC₅₀是阻断最大活性之一半的量。最好，该分析测量Ca²⁺]_i增加，并用下述方法或其等效方法证实该方法对Ca²⁺受体具有特异性。

在优选实施方案中，本文所述的生物检定法证明细胞中[Ca²⁺]_i增加是暂时的，其持续时间少于一分钟，而且[Ca²⁺]_i增加是快速的，在30秒内发生;该分子还能（a）引起[Ca²⁺]_i持续增加（大于30秒），（b）引起肌醇-1，4，5-三磷酸酯和/或二酰基丙三醇浓度增加，例如在少于60秒时间内。（c）抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激的环状AMP生成。此外，用10mM氟化钠使该细胞预处理10分钟，能消除[Ca²⁺]_i暂时增加，或用蛋白激酶C的一种活化剂，如佛波醇肉豆蔻酸盐乙酸酯（Phorbol myristate acetate）（PMA），瑞香（mezerein）或吲哚肉酰胺（一）indolactam V短暂处理该细胞（不多于10分钟）可减少其暂时增加。

在甲状旁腺细胞中，上述所有检定中起作用的那些分子在本发明中是特别有用的，因为它们对于这种细胞的Ca²⁺受体的作用具有特异性。上述PMA预处理效果特别理想。

在更优选的实施方案中，该细胞是甲状旁腺细胞，该分子能抑制由该细胞分泌的甲状旁腺激素;该分子导致用mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中的Cl^-传导增加，该mRNA来自甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞或胎盘滋养层。

在其它优选实施方案中，该分子能引起胞内Ca²⁺迁移，以导致[Ca²⁺]_i增加;该细胞是C-细胞或破骨细胞，该分子抑制骨体内再吸收;该细胞是一种破骨细胞，该分子抑制骨体外重新吸收;或该细胞是C-细胞，该分子刺激降钙素（Calcitonin）在体外或在体内分泌;最好该分子是模拟钙或溶解钙，它们在Ca²⁺受体中具有的EC₅₀或IC₅₀小于或等于5μM，更优选为小于或等于1μM，100 n molar，10 n molar或1 n molar。这种低EC₅₀或IC₅₀值是有利的，因为它们可使体内或体外用于治疗或诊断的分子浓度降低。这种低EC₅₀或IC₅₀分子的发现使设计和合成类似的有效和效力大的分子成为可能。

所谓“模拟钙”分子意思是指一种任意的分子，该分子具有一种或多种胞外Ca²⁺活性，并且最好在Ca²⁺受体上模拟Ca²⁺活性。例如，当用于甲状旁腺细胞时，它是一种分子，若在体外对甲状旁腺细胞进行试验，该分子具有下列一种或多种，最好全部按现有技术中众所周知方法测定的特性：

1、该分子能导致难以用1μM La³⁺或Gd³⁺抑制的[Ca²⁺]_i快速（到峰时间＜5秒）和暂时增加。在缺少胞外Ca²⁺的情况下，[Ca²⁺]_i的增加持续进行，但用伊屋诺霉素（在缺少胞外Ca²⁺情况下）预处理则该增加消除;

2、由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加不能用二氢吡啶抑制。

3、该分子引起的[Ca²⁺]_i暂时增加可通过用10mM氟化钠预处理10分钟而消除;

4、该分子引起的[Ca²⁺]_i暂时增加，通过用蛋白激酶C的活化剂（PKC），如佛波醇肉豆蔻酸盐乙酸酯（PMA）、瑞香或（一）-吲哚内酰胺V预处理而减少。该蛋白激酶C活化剂的综合作用是使该分子的浓度响应曲线移向右边不会影响最高响应;

5、该分子导致快速增加（＜30秒）肌醇-1，4，5-三磷酸酯二酰基丙三醇的生成。

6、该分子抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激环状AMP的生成;

7、该分子抑制PTH分泌;

8、用百日咳毒素预处理（100ng/ml，＞4小时）可阻断该分子对环状AMP生成的抑制作用，但不会影响[Ca²⁺]_i、肌醇-1，4，5-三磷酸酯、或二酰基丙三醇的增加，也不会使PTH分泌减少;

9、该分子引起用富集多聚腺苷酸（Poly（A）⁺）mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-传导增加，该mRNA来自牛或人甲状旁腺细胞，但它不会影响用水或鼠脑或肝mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞;和

10、同样，采用得自甲状旁腺细胞的已克隆受体，该分子将在用编码该受体的特定CDNA或mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中引起响应。

所谓“溶解钙”分子意思是指任意一种分子，该分子在胞外Ca²⁺敏感细胞上能阻断该胞外Ca²⁺一种或多种活性，最好在Ca²⁺受体中起拮抗剂作用。例如，当用于甲状旁腺细胞时，它是一种分子，该分子在体外对甲状旁腺细胞进行试验时具有下列一种或多种，最好全部按现有技术中众所周知方法测定的特性：

1、该分子部分或完全阻断胞外Ca²⁺浓度增加的能力以：

（a）增加[Ca²⁺]_i;

（b）使胞内Ca²⁺迁移;

（c）增加肌醇-1，4，5-三磷酸酯的生成，

（d）减少多巴胺或异丙基肾上腺素刺激环状AMP的生成，和

（e）抑制PTH的分泌;

2、在低[Ca²⁺]，即0.5mM时，该分子本身不会改变[Ca²⁺]_i;

3、该分子阻断用多聚腺苷酸-mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中的Cl^-传导增加，该mRNA来自由胞外Ca²⁺或模拟钙化合物引起的牛或人甲状旁腺细胞，但它不影响用水或鼠脑或肝mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞;

4、同样，采用来自甲状旁腺细胞的克隆受体，该分子将阻断注入了编码该Ca²⁺受体的特定cDNA或mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞中由胞外Ca²⁺或模拟钙化合物引发的响应。

在其它类型细胞上的Ca²⁺受体中有用的模拟钙和溶解钙的类似定义从下列实施例中可清楚知道。

Ca²⁺受体能检测和响应某种无机聚阳离子和聚阳离子的有机分子。例如，甲状旁腺细胞不会由于这些有机聚阳离子的加入而明显增加胞外Ca²⁺浓度，大概是因为这些有机分子作用与Ca²⁺受体上的胞外Ca²⁺完全一样。本发明的模拟钙分子是Ca²⁺受体的特别好的拮抗剂，可用作药剂，该药剂能改变选定细胞的功能，如甲状旁腺细胞的PTH分泌。与Ca²⁺不同，这些分子中大多仅作用于一个或多个，而不是所有Ca²⁺受体，因此具有专门以一种Ca²⁺受体为目标的能力。

在[Ca²⁺]_i和[Ca²⁺]起作用的各种疾病，如甲状旁腺机能亢进、骨质疏松症、佩吉特病、高血压、肾病和癌的治疗中，这些分子还提供了更新治疗效果研究的引导结构。

该模拟钙和溶解钙可配制成药物组合物，将该药物组合物给予病人后，可用于调节病人的胞外游离Ca²⁺含量、在选自上述的细胞中模拟胞外Ca²⁺的作用。在本发明之前，申请人还未见到任何这类分子，它能作用于Ca²⁺受体，能用于治疗由Ca²⁺受体的使用或调节失常而引起的疾病或具有正常Ca²⁺受体的动物疾病（它能通过该Ca²⁺受体的活化或去活化而治疗）。

在又一个优选实施方案中，该分子在选自下列的一个或多个但不是所有细胞中具有的EC₅₀小于或等于5μM，这些细胞为甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞（C-细胞）和胎盘滋养层。

在本发明中该分子的特殊作用是特别有用的，因为它便于在体内和体外进行特定的治疗和诊断，和发现附加的模拟钙或溶解钙分子。

在特定的优选实施方案中，该分子在生理PH中是带正电的，它选自分枝或环状聚胺、带正电的聚氨基酸、和芳烷基胺，例如，分枝的聚胺化学式为H₂N-（CH₂）_j-（NR_j-（CH₂）_j）_K-NH₂，其中k是1-10的整数，每个j可相同或不同，它是2-20的整数。每个R_j可相同或不同，它选自氢和-（CH₂）_j-NH₂，其中j限定如上，至少一个R_j不是氢。

在另一个实施方案中，该分子具有如下化学式

其中每个X任意选自H、CH₃、CH₃O、CH₃CH₂O、Br、Cl、F、CF₃、CHF₂、CH₂F、CF₃O、CH₃S、OH、CH₂OH、CONH₂、CN、NO₂和CH₃CH₂;Ar是一种疏水本体;每个R任意选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2，3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫代二氢吲哚基、2-，3-，或4-哌啶基;Y是选自CH、氮和不饱和碳;Z选自氧、氮、硫，

其中n各分别为1-4（包括1和4）的数，m各分别为0-5（包括0和5）的数。最好该分子为模拟钙或溶解钙。

在优选实施方案中，疏水本体选自苯基、2-，3-，或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、苄基和苯氧基;该分子是R-二苯基丙基-α-苯乙胺衍生物，该分子具有如下化学式：

其中每个X最好独立选自Cl、F、CF₃、CH₃和CH₃O。

按本发明优选方式，提供的新苯基-α-苯乙胺类似物和衍生物具有如下化学式：

其中alk是具有1-6个碳原子的直链或支链亚烷基;R₁是1-3个碳原子的低级烷基或为1-3个碳原子（用1-7个卤素原子取代的）低级卤代烷基;R₂和R₃独立选自碳环芳基或环烷基，可以是单环或双环，具有用1-5个取代基任意取代的5-或6-节环，该取代基独立地选自1-3个碳原子的低级烷基，1-3个碳原子（用1-7个卤素原子取代的）低级卤烷基，1-3个碳原子的低级烷氧基、卤素、硝基、氨基、烷基氨基、酰氨基、1-3个碳原子的低级烷酰氨基、氰基、羟基、2-4个碳原子的酰基、1-3个碳原子的低级羟烷基或1-3个碳原子的低级硫代烷基。合适的碳环芳基具有1或2个环，至少一个环具有芳香性，它包括碳环芳基，如苯基，双环碳环芳基如萘基。从上述化学式显而易见，本文所包括的化合物可以以外消旋混合物和以独立的立体异构体形式存在。特别优选的是R-苯基丙基α-苯乙胺衍生物，认为它们在降低血清电离钙中具有增强的活性。

优选的化合物包括alk为正丙烯的那些化合物。也优选的是R₁为甲基的化合物。也优选的是R₂和R₃为任意取代的苯基的那些化合物。

特别优选的化合物包括R₂为单取代苯基的那些化合物，更优选为间位取代。特别优选的R₃基包括未取代的或单取代苯基，尤其是邻位取代。优选的R₂取代基包括氢、卤烷基，最好为三卤甲基和烷氧基，优选为甲氧基。优选的R₃取代基包括卤素。

第二相关方面，本发明特征为提供对病人的治疗方法，该病人患有一种疾病，或其病情以一种或多种细胞或在血液或血浆或胞外液体中[Ca²⁺]或[Ca²⁺]_i异常为特征。该方法包括对病人给药步骤，该药为治疗有效量的一种分子，该分子通过引起细胞中[Ca²⁺]_i增加模拟胞外Ca²⁺活性或阻断胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。

所谓“异常”意思是指与一般人相比，该病人具有不同的Ca²⁺代谢，这是由于受血液或胞外体液中一种或多种蛋白质（如，激素）的影响，或者是其它分子影响胞内和/或胞外Ca²⁺的含量。因此，该疾病包括甲状旁腺机能亢进、骨质疏松症和其它骨和与矿物质有关的疾病，以及类似的病（如普通医学教课书中所述，如“Harrison的Principles of Internal Medicine”）。在本发明中用模拟或阻断一种或多种Ca²⁺作用的分子来治疗该疾病，由此直接或间接地影响病人体内蛋白质或其它分子的含量。

所谓“治疗有效量”意思是指使疾病的一种或多种症状或病人的病情减轻到某种程度的量。另外，所谓“治疗有效量”意思是指使与疾病或病情起因有关的生理或生化参数部分或全部恢复正常的量。通常，该量约为该分子的1nmole至1μmole之间，这取决于它的EC₅₀，及病人的年龄、身材和有关疾病。

在优选实施方案中，该分子具有EC₅₀小于或等于5μM，它不是鱼精蛋白;最好在Ca²⁺受体中的作用如同模拟钙或溶解钙。最好该分子选自上述那些分子之一种。

在另一优选实施方案中，病人所患疾病特征为一种或多种成分含量异常，该成分含量可用一种或多种Ca²⁺受体活性调节或影响，该分子作用于细胞的Ca²⁺受体，而该细胞选自甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

在又一个优选实施方案中，该分子降低病人血清中甲状旁腺激素的含量，如，降到正常人的水平，或降到足以引起血浆中Ca²⁺减少的程度;所提供的该分子数量足以对病人有治疗作用。

第三方面，本发明特征是为病人提供疾病或病情诊断方法，即监测病人体内一种或多种Ca²⁺受体的数目和/或位置（和/或功能完整性），并将数目和/或位置（和/或功能完整性）与从正常病人测得的相比较，作为疾病和病情存在的指示。

在优选实施方案中，该方法是免疫分析法，在该方法中用一种Ca²⁺受体的抗体测定Ca²⁺受体的数目和/或位置和/或功能完整性，这种测定包括提供一种与Ca²⁺受体结合的标记模拟钙或溶解钙分子;诊断的疾病是一种癌，如，甲状旁腺的异位瘤，或一种病情特征为骨中破骨细胞数目高于正常水平，或骨中破骨细胞活性增加。

第四方面，本发明特征为提供一种鉴定分子的方法，该分子用作治疗分子。该方法包括筛选能模拟细胞中胞外Ca²⁺活性或阻断由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加的潜在的有用分子，并测定该分子具有的EC₅₀或IC₅₀是否小于或等于5μM。

第五方面，本发明特征是提供重组体Ca²⁺受体，含有重组体Ca²⁺受体的细胞，编码Ca²⁺受体的纯化的核酸，分子NPS019的生物活性和应用，物质NPS459、NPS467、NPS551、和NPS568的新化合物或组合物（参见图36），以及有用的模拟钙或溶解钙分子的鉴定方法，即鉴定分子在第一个Ca²⁺受体而不是在第二个Ca²⁺受体中模拟或阻断一种或多种Ca²⁺活性，例如用一种重组体Ca²⁺受体。

所谓“重组体”意思是包括用重组DNA方法生产的任何Ca²⁺受体，因此其位置、纯度或结构均不同于天然存在的Ca²⁺受体。一般来说，这种受体会以不同于通常在自然状态下观察到的量存在于细胞中。

所谓“纯化”意思是指该抗体或核酸不同于天然存在的抗体或核酸，它是从天然存在（如，在载体体系中）的抗体或核酸中分离出来的，因此，它能用于表达重组体Ca²⁺受体。最好，该抗体或核酸是用标准方法得到的均匀制剂。

这种克隆受体能在所需的细胞中表达，分离并结晶以测定其结构。这样一种结构能设计本发明与Ca²⁺受体结合的有用分子。此外，用第一个克隆作其它细胞、CDNA或基因库中克隆的探针，可克隆该受体的等同物。

可以分离克隆受体的抗体，并用作本发明治疗剂，或作为诊断工具以测定Ca²⁺受体数目和/或位置和/或功能完整性，从而诊断与Ca²⁺有关的疾病或病情。通过静脉给药，作为模拟钙或溶解钙，该抗体也能在体内使用。

因此，一般说来，本发明特征是提供模拟钙或溶解钙分子，该分子能在一种或多种但不是所有的细胞的Ca²⁺受体上用作选择性激动剂或相应的对抗剂，所述的细胞选自甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。这样一种组合物可以含有现有技术公知的任何可药用载体以提供一种药物组合物。

本发明特征还在于用标准方法，如抗敏和有关方法（如ribozymes）调节病人的Ca²⁺受体数目，作为对病症的治疗。

本发明提供用于鉴定分子的方法，该分子影响Ca²⁺受体活性，用如下限定的鉴定方法可测定模拟钙和/或溶解钙。而且，通过使用该鉴定方法或抗体或下述其它方法能够有效地减弱或增强Ca²⁺受体的转录或转译水平上的表达的分子可以被确定用于治疗。

本发明的其它特征和优点将在下面优选实施方案以及权利要求中得到说明。

首先简单的描述附图。

图1  描述用于本发明中的有代表性的分子。

图2 说明在quin-2或fura-2-载带牛甲状旁腺细胞中由胞外Ca²⁺诱导的[Ca²⁺]_i的增加。初始[Ca²⁺]为0.5mM（用CaCl₂），在每个箭头处，以0.5mM增加量增加。

图3 说明在牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的迁移。初始[Ca²⁺]为0.5mM，由于加入EGTA而减少到＜1μM（如图所示）。（a）在缺少胞外Ca²⁺情况下，胞外Mg²⁺（8mM，最终）诱导[Ca²⁺]_i增加。（b）用伊屋诺霉素（1μM）预处理阻断对Mg²⁺的响应。（c）用5μM的分子1799（一种线粒体解偶联剂）预处理没有影响对Mg²⁺的响应。

图4 说明低浓度Gd³⁺使[Ca²⁺]_i稳态增加而高浓度Gd³⁺使[Ca²⁺]_i暂时增加的优先抑制作用。上图为对照。胞外Ca²⁺的初始浓度为0.5mM，在各个箭头处增加0.5mM。中间图：Gd³⁺（5μM）阻断由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i稳态而不是暂时增加。下图：Gd³⁺（50μM）引起[Ca²⁺]_i暂时增加，并消除与胞外Ca²⁺的暂时和持续响应。在中图和下图，只要加入足量EGTA以优先螯合Gd³⁺：Ca²⁺注入的阻断作用被消除，并使[Ca²⁺]_i迅速增加。

图5 说明增加胞外Ca²⁺浓度克服PMA对[Ca²⁺]_i、IP₃生成、和PTH分泌的影响。对于各种变化来说，胞外Ca²⁺的浓度一响应曲线均移向右边。还应注意，当[Ca²⁺]线性增加时，该浓度一响应曲线呈S形变化。

图6 说明由精胺引起的[Ca²⁺]_i增加随着[Ca²⁺]的增加而逐渐降低。在箭头所示时间加入精胺（200μM）。在本图及后面所有图中，曲线所附数字是以n M为单位的[Ca²⁺]_i。

图7 说明精胺能使牛甲状旁腺细胞中的胞内Ca²⁺迁移。在加入精胺（200μM）以前，加入EGTA以使[Ca²⁺]减少到＜1μM，如左边曲线所示。用伊屋诺霉素（1μM）预处理可阻断对精胺的响应（右边曲线）。

图8 A和B说明精胺类似于胞外Ca²⁺，能使[Ca²⁺]_i增加，并能抑制牛甲状旁腺细胞中的PTH分泌。精胺剂量一浓度响应曲线的数据点是两次试验的平均值。

图9 说明PMA在与胞外细胞Ca²⁺响应中和与牛甲状旁腺细胞ATPrS响应中的反作用。左图：说明由于PMA（100nM）使胞外Ca²⁺诱导的抑制环状AMP生成的浓度一响应曲线移向右边。中图：PMA不会影响ATPrS增加[Ca²⁺]_i的能力。还应注意，ATRrS浓度一响应曲线表明传统的反曲特性为浓度的对数函数，与胞外二价阳离子相反。

图10说明由胞外Mg²⁺引起的人甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺的迁移。这些细胞从腺瘤中得到，并浸在含有0.5mM胞外Ca²⁺的缓冲液中。（a）由胞外Mg²⁺（10mM最终）引起的[Ca²⁺]_i暂时和持续增加说明，持续增加不受硝苯吡酯（1μM）影响，但可用La³⁺（1μM）抑制，并且当La³⁺被低浓度EGTA选择性螯合时又快速返回。（b）La³⁺（1μM）阻断由胞外Mg²⁺引起[Ca²⁺]_i;持续而不是暂时增加。（c）在缺少胞外Ca²⁺的情况下，用胞外Mg²⁺引起细胞溶质Ca²⁺暂时增加可持续进行。

图11说明用新霉素或鱼精蛋白能引起牛甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺迁移。在所有曲线中，初始[Ca²⁺]和[Mg²⁺]分别为0.5和1mM。在曲线（a）和（b）中，Ca²⁺和Mg²⁺浓度分别从0.5和1mM增加到2和8mM。在其它曲线，（c）到（i）中，按指示加入新霉素B（30μM）或鱼精蛋白（1μg/ml）按指示加入La³⁺（1μM）、EGTA（1mM）或伊屋诺霉素（100nM）。各曲线均表示用至少3种不同的细胞制剂进行5或更多次试验所看到的图形。标线＝1分钟。

图12说明 新霉素B能阻断胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i暂时增加，但不能阻断其稳态增加。左曲线对照：[Ca²⁺]最初为0.5mM，在加入新霉素B（30μM）以前，在各个空心箭头处以0.5mM的增加量增加。右曲线：在Ca²⁺之前加入新霉素B（30μM）。标线＝1分钟。

图13说明 新霉素B或鱼精蛋白在能引起[Ca²⁺]_i增加的浓度下抑制PTH分泌。在存在0.5mM胞外Ca²⁺的情况下。用所示浓度的有机聚阳离子培养细胞30分钟。空心符号：在存在0.5（圆圈）或2mM（菱形）胞外Ca²⁺的情况下，对PTH分泌的对照响应。[Ca²⁺]_i值为菱形符号。将牛细胞用于鱼精蛋白试验中，将人（腺瘤）甲状旁腺细胞用于新霉素B的试验中。各点均为3次试验的平均值±SEM。

图14说明用精胺瞬时得到的细胞溶质Ca²⁺中PMA的优先抑制作用，初始[Ca²⁺]为0.5mM;按指示加入精胺（200μM）或ATP（50μM）。标线＝1分钟。

图15说明PMA使胞外Ca²⁺和新霉素诱导的[Ca²⁺]_i增加的浓度一响应曲线移向右边。在增加[Ca²⁺]之前或加入新霉素B之前，按要求用PMA预处理细胞1分钟。各点是3-5次试验的平均值±SEM。

图16说明PMA使胞外Ca²⁺-和精胺-引起的PTH分泌的抑制的浓度一响应曲线移向右边。在有（实心环）或没有（空心环）100nM PMA的情况下，用所示的[Ca²⁺]和精胺培养细胞30分钟。各点均为3次试验的平均值±SEM。

图17说明鱼精蛋白增加肌醇磷酸酯的生成。甲状旁腺细胞在含4μci/ml³H一肌-肌醇的培养基中培养过夜，洗涤，并用所示浓度的鱼精蛋白，在37℃培养。30秒钟以后，加入CH₃Cl₃∶MeOH∶HCl和用阳离子交换色谱分离得到的IP₁（圆形）和IP₃（三角）使反应终止。各点均为2次试验的平均值，每次试验重复三次。

图18说明PMA能抑制由胞外Ca²⁺或精胺引起的IP₁的生成。在反应终止和用阴离子交换色谱测定IP₁之前，将³H-肌-肌醇标记的细胞暴露于所示[Ca²⁺]或精胺中30秒钟。阴影柱：在[Ca²⁺]增加或加入精胺以前，细胞用PMA（100nM）预处理5分钟。各值均为2次试验的平均值，每次试验重复进行三次。

图19说明在人（腺瘤）甲状旁腺细胞中，用新霉素B引起的[Ca²⁺]_i暂时和持续增加。[Ca²⁺]为0.5mM。（a）用La³⁺抑制由新霉素B引起的[Ca²⁺]_i持续增加。（b）La³⁺不影响由新霉素B引起的[Ca²⁺]_i暂时增加。（c）在缺少胞外Ca²⁺的情况下，[Ca²⁺]_i暂时增加持续进行。

图20说明新霉素B在表达Ca²⁺受体的非洲蟾蜍属卵母细胞中会引起Cl^-传导波动增加。上部曲线得自注入人（增生）甲状旁腺细胞多聚腺苷酸⁺-mRNA三天后的卵母细胞。下部曲线得自注入水的卵母细胞。在5个注入水的卵母细胞中新霉素B没能引起响应，而在一个（如图所示）细胞中碳酰胆碱能引起响应。在这两部分曲线中，均保持电压-76mV。

图21说明新霉素B不能在C-细胞中引起基本的或引发的增加。对照，左曲线：在[Ca²⁺]增加到3mM以前最初将载带fura-2的rMTC6-23细胞浸在含1mM Ca²⁺的缓冲液中。右曲线：用5mM新霉素B预处理。

图22说明胞外Ca²⁺引起鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i增加。微型荧光计自动记录用载带mdo-1单个鼠破骨细胞和在此所示时间（实心条）用含所示[Ca²⁺]的缓冲液使其过冷。正常的缓冲液（在实心条之间过冷）含1mM Ca²⁺。

图23说明精胺或新霉素B没能引起鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i增加。将载带mdo-1破骨细胞用所示浓度的精胺或新霉素B（空白条）（单独或与20mMCa²⁺一起（实心条））过冷。

图24说明黄金蛛毒素（如图中黄金蛛（argiopine）所示，结构也如图1所示）659和黄金蛛毒素636对牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的不同影响。初始[Ca²⁺]为0.5mM，后增加到1.5mM，如右曲线所示。按指示加入黄金蛛毒素659（300μM）或黄金蛛毒素636（400μM）。

图25说明胞外Mg²⁺或Gd³⁺能引起注入牛甲状旁腺细胞多聚腺苷酸⁺-mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-传导波动增加。在图（a）中，胞外Ca²⁺浓度＜1μM，在图（b），为0.7mM，图（c）说明胞外Mg²⁺不能在仅注入物质K受体mRNA的卵母细胞中响应，尽管用物质K过冷会引起响应。保持电压-70-80mV。

图26说明胞外Ca²⁺能引起注入人（增生）甲状旁腺组织多聚腺苷酸⁺-mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-传导波动增加。该卵母细胞注入50ng多聚腺苷酸⁺-mRNA三天后检定其与胞外Ca²⁺的响应性。保持电压-80mV。

图27说明用budmunchiamine引起的牛甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺的迁移。在指示处，加入budmunchiamine（结构也已图示，300μM）。

图28说明甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺的迁移能力是立体特异的。在加入指示浓度的各种分子之前，最初将用载带fura-2的甲状旁腺细胞悬浮在含0.5mM胞外Ca²⁺的缓冲液中。

图29说明La³⁺对破骨细胞中[Ca²⁺]_i的影响。所示的有代表性的图形得自用载带mdo-1的单个鼠破骨细胞。在低浓度情况下，La³⁺部分阻断由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。

图30A和B说明在鼠破骨细胞中，由胞外Mn²⁺引起的胞内Ca²⁺的迁移。胞外Mn²⁺引起[Ca²⁺]_i浓度依赖性增加（图30A），而这种增加在缺少胞外Ca²⁺的情况下能持续。（图30B）。

图31A和31B说明由称为NPS449（见图38）的分子引起的鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i的迁移，将载带indo-1的已分离的鼠破骨细胞用指示浓度的NPS449[在有（图31A）或没有（图31B）1mM胞外CaCl₂的情况下]过冷。

图32说明由NPS019（参见图1）引起的C-细胞中胞内Ca²⁺的迁移。将rMTC6-23细胞用载带fura-2，并浸在含0.5mM[Ca²⁺]_i的缓冲液中。按指示，加入NPS019使其最终浓度为10μM。有代表性的图形说明由NPS019引起[Ca²⁺]_i暂时增加是难以用La³⁺抑制的（中间曲线）并且在缺少胞外Ca²⁺的情况下能持续进行（右曲线）。

图33说明NPS456（图36）能引起已注入牛甲状旁腺细胞多聚腺苷酸⁺-mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-电流波动增加。

图34说明胞外Ca²⁺引起已注入人破骨细胞mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-电流波动增加。注入总量为50ng的多聚腺苷酸⁺mRNA三天后检测该卵母细胞与胞外Ca²⁺的响应性。

图35说明用2.5-3.5Kb的mRNA编码甲状旁腺细胞Ca²⁺受体。在变性甘油梯度液中使牛甲状旁腺细胞多聚腺苷酸⁺-mRNA按大小分级，并分成10份。每份分别注入非洲蟾蜍属卵母细胞（50ng/份）。三天后，检测该卵母细胞与胞外Ca²⁺的响应及Cl^-传导的波动增加。

图36表示由二苯基丙基-α-苯乙胺衍生的分子的化学结构，该图说明了这类分子，这类分子被制备和筛选以得到本发明有用的分子。

图37说明NPS021是一种溶解钙化合物，它能阻断胞外Ca²⁺对牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的影响。最初将细胞浸在含0.5mM CaCl₂的缓冲液中，如图所示，[Ca²⁺]增加到最终为2mM（左曲线）。加入NPS021（200μM）不会引起[Ca²⁺]_i变化，但能抑制由胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加（右曲线）。

图38说明在体内Ca²⁺对NPS467响应。

图39说明在体内PTH对NPS467响应。

图40说明在体内Ca²⁺对25mg/kgNPS467响应。

图41和42说明在体内Ca²⁺对NPS467的不同对映异构物响应。

图43a描述用于制备苯乙二苯丙胺或图36所述的苯乙二苯丙胺类似物或衍生物的反应流程图。图43b描述用于合成NPS467的反应流程图。

图44描述剂量响应曲线，它说明当口服给药时，NPS能降低血清离子化钙。

模拟钙和溶解钙分子

用于本发明的模拟钙和溶解钙分子一般如上所述。用筛选方法以确定这些分子模拟或对抗Ca²⁺受体中Ca²⁺的活性容易鉴定这些分子。下面例举了这些方法的例子。这些例子不是为了限制本发明，而仅仅为了说明这些本领域技术人员易于使用或适应的方法。

通常，通过筛选仿照下面所述的分子（所谓引导分子）仿制的分子确定模拟钙和溶解钙分子。如下所见，有几种用于各种Ca²⁺受体的特定的模拟钙和溶解钙。用标准方法容易设计衍生的分子，并以本领域技术人员公知的许多方案之一种进行试验。许多分子很容易被筛选以鉴定本发明中最有用的分子。

模拟或对抗其它体系中Ca²⁺作用的有机阳离子分子具有对Ca²⁺受体有活性的所要求的结构。其它有用分子的合理设计包括已知是模拟钙或溶解钙的一种分子的研究，然后改变这种已知分子的结构。例如，聚胺可能是模拟钙，因为精胺在体外几种体系中模拟Ca²⁺作用。结果表明精胺确实能引起[Ca²⁺]_i和PTH分泌变化，使人回想起由胞外二价和三价阳离子所能引起的那些变化（如下所见）。因此下面概述的试验目的在于说明这种现象（由精胺得到的），包括胞外Ca²⁺所用的相同机理。为此，测定精胺对于以活化Ca²⁺受体为特征的各种生理和生化参数的影响。具有相同作用的那些分子在本发明中是有用的，并且通过选择或使这些分子具有类似精胺的结构可以发现它们。一旦发现另一种有用的分子，该选择方法便容易重复。

为清楚起见，下面提供一系列具体筛选方案以确定这些有用的分子，该分子在甲状旁腺细胞Ca²⁺受体上具有活性，或可用作响应[Ca²⁺]变化的细胞拮抗剂或对抗剂。用等效的分析方法可用于在其它Ca²⁺受体上的分子活性，或换句话说，该分子能模拟或对抗由[Ca²⁺]调节的细胞功能。这些分析举例表明了用于发现本发明的模拟钙分子的方法。可以用等效的方法发现溶解钙分子，即通过筛选最能对抗胞外Ca²⁺作用的那些分子。通过标准方法用体外分析表征这些模拟钙和溶解钙的选择性、饱和度和可逆性。

筛选方法

通常，开始将载带fura-2的牛甲状旁腺细胞悬浮在含0.5mM CaCl₂的缓冲液中，将试验物质加到小体积试管（5-15μl）中，注意荧光信号的任何变化。使试管中试验物质浓度逐渐增加，直到达到预定浓度，或看到荧光变化。若未见荧光变化，则认为该分子是无活性的，不必再进行试验。试验开始时，例如，用聚胺型分子，测试的分子浓度高达5或10mM。按照目前公知的更有效的分子（如下所见），该浓度上限降低。例如更新的分子在至多为500μM或更低的浓度下进行试验。若在此浓度未见荧光变化，则认为该分子是无活性的。

对引起[Ca²⁺]_i增加的分子进行另外的试验。能被看作模拟钙分子的分子的两个基本特征是胞内Ca²⁺的迁移及对PKC活化剂的灵敏性。现已明确发现，以PMA敏感方式引起胞内Ca²⁺迁移的分子必定是模拟钙分子，并且它能抑制PTH分泌。若需要的话，可进行另外的试验以巩固这种信念。通常，有关模拟钙或溶解钙活性的所有种种试验（如上所见）均未进行。当然，若一种分子以PMA-敏感方式引起胞内Ca²⁺迁移，则最好筛选人甲状旁腺细胞。例如，进行[Ca²⁺]_i的测定以确定EC₅₀，并测定该分子抑制人甲状旁腺细胞中PTH分泌的能力，而该甲状旁腺细胞得自进行厚发性或继发性甲状旁腺机能亢进外科手术的病人。EC₅₀或IC₅₀越低，该分子作为模拟钙或溶解钙就更有力。

用fura-2测定[Ca²⁺]_i提供了一种快速筛选新有机分子活性的方法。一个下午可分析10-15个分子，并且评估它们使胞内Ca²⁺迁移或不迁移的能力。还能测定任何观测到[Ca²⁺]_i增加对PMA抑制的灵敏性。此外单细胞制剂能提供关于[Ca²⁺]_i、环状AMP含量、IP₃和PTH分泌的数据。常用的方法是给细胞载带fura-2，然后将该细胞悬浮液分成两份，该细胞大部分用于测定[Ca²⁺]，其余部分进行培养以测定其对环状AMP和PTH分泌中的影响。由于对环状AMP和PTH放射免疫测定的灵敏性，在含有0.3ml细胞悬浮液（约500000个细胞）的单个培养管中，两种变化均能测到。测定的肌醇磷酸酯是筛选的时间一消耗项目。然而，用氯化物（而不是用甲酸盐）洗提离子交换柱提供了一种筛选IP₃生成的快速方法，因为无需旋转蒸发（约花费30小时）。该方法可在一个下午处理大约100个样品。然后，将通过[Ca²⁺]_i、环状AMP、IP₃和PTH测定证明是有用的那些分子，再进行更精确的分析，测定生成的各种肌醇磷酸酯，并用HPLC测定其同分异构形式。

然后，对用这些方法检定的有用分子进行特性测定如，用例如鼠MTC6-23细胞系测定其在分泌降钙素的C-细胞中对[Ca²⁺]_i的影响。

下面是用于这些筛选过程的方法的说明。各种模拟钙或溶解钙分子试验的典型结果的实例如图2-34所示。

甲状旁腺细胞的制备

甲状旁腺得自当地屠宰场新屠宰的小牛（12-15周），并将冰冷的甲状旁腺细胞缓冲液（PCB）转移到实验室，该缓冲液含有（mM）：NaCl，126;KCl，4;MgCl₂，1;Na-HEPES，20;PH7.4;葡萄糖，5.6及可变量的CaCl₂，如，1.25mM。人甲状旁腺得自进行甲状旁腺组织外科切除手术的患原发性尿毒症级甲状旁腺机能亢进（HPT）的病人，其处理方法类似牛组织。切除腺的多余脂肪和结缔组织，然后用小剪刀切成约为2-3mm的立方体。通过胶原酶消化制得已溶解的甲状旁腺细胞。然后通过在percoll缓冲液中离心以纯化溶解的细胞。得到的甲状旁腺细胞制剂基本上没有血红细胞、脂质细胞（adipocytes）和毛细组织（用反相显微镜和Sudan B染色测定）。已溶解和纯化的甲状旁腺细胞以含有5-20个细胞的小团存在。如不相容的锥虫蓝或菲啶溴红所示，细胞存活率通常为95%。

虽然该细胞此时能用于试验目的，但生理反应（PTH分泌的抑制率和剩余（resting）[Ca²⁺]_i含量）在该细胞培养过夜后更好。一级培养物还具有如下优点，即能用同位素标记细胞以接近同位素平衡;因为这是涉及肌醇磷酸酯代谢测定的研究（如下所见）所必须的。在Percoll梯度液中纯化后，将细胞在添加50μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、5μg/ml庆大霉素和ITS⁺的Ham'sF12-Dulbecco's改性的Eagles培养基（GIBCO）的1∶1混合物中洗涤几次。ITS⁺是一种含有胰岛素、转铁蛋白、硒和牛血清白蛋白（BSA）-亚麻酸（Collaborative Research，Bedford，MA）的预混合溶液。然后将该细胞移到塑料瓶（75或150cm²，Falcon）中，在含5%CO₂的潮湿气氛中，在37℃下培养。对这些过夜培养物不添加血清，因为它的存在会使该细胞粘附于塑料上，迅速扩大并难以分开。在上述条件下培养的细胞通过倾泻很容易以瓶中取出，其存活率与新制备的细胞相同。

细胞溶质Ca²⁺的测定

将纯化的甲状旁腺细胞再悬浮在含1uM fura-2-乙酸基甲基酯的1.25mM CaCl₂-2%BSA-PCB中，在37℃下培养20分钟。然后将该细胞制成丸状，悬浮在缺少酯的相同缓冲液中，在37℃下再培养15分钟。接着用含0.5mM CaCl₂和0.5%BSA的PCB洗涤该细胞两次，并在室温保存（约20℃）。使用前将该细胞用预热的0.5mM CaCl₂-PCB稀释5倍以得到最终BSA浓度为0.1%。在荧光记录小容器中的细胞浓度为1-2×10⁶/ml。

在37℃下，在分光荧光计（Biomedical Instrumentation Group，University of Pennsylvania，Philadelphia，PA）（装有耐热小容器架和磁性搅拌器）中分别用340和510nm的激发波长和发射波长测定指示剂载带细胞的荧光。该荧光表示细胞溶质Ca²⁺的含量。用洋地黄皂甙（50μg/ml，最终）校准荧光信号，得到最大荧光（Fmax），用EGTA（10mM，PH8.3，最终）可得到最小荧光（Fmin）以及224nM的解离常数。染料的漏损取决于温度，大多发生在该细胞在小容器中加热的最初2分钟，此后染料漏损只是很慢地增加。为核对标定的染料漏损，将细胞放在试管中，在37℃下搅拌2-3分钟。然后取出细胞悬浮液，将细胞制成丸状，将上层液再放入一个干净试管中。然后与上述得到染料漏损估计值同样的方法用洋地黄皂甙和EGTA处理上清液，该估计值通常为总Ca²⁺依赖性的荧光信号的10-15%。从表现Fmin中减去该估计值。

PTH分泌的测定

在多数试验中，将载带fura-2的细胞用于PTH分泌研究中。载带fura-2的甲状旁腺细胞不改变其对胞外Ca²⁺的分泌响应。将细胞悬浮在含0.5mM CaCl₂和0.1%BSA和PCB中。在含有0.3ml细胞悬浮液（含或不含少量CaCl₂和/或有机聚阳离子）的塑料管（Falcon 2058）中进行培养。在37℃下培养不同时间（一般为30分钟），然后将该管放在冰上，在2℃使该细胞成丸状。用醋酸使上清液样品的PH为4.5，在-70℃下贮存。本方案适用于牛和人的甲状旁腺细胞。

对牛细胞来说，用最终稀释1/45000的GW-1抗体或其等同物，通过类似的放射免疫分析法测定上清液样品中PTH的量。用¹²⁵I-PTH（65-84;INCSTAR，Stillwater，MN）作示踪剂，用葡聚糖活化的活性炭分离各馏份。在Packard Cobra 5005r计数器上进行样品的计数和数据处理。

对人细胞来说，因为GW-1抗体难以识别人PTH，所以使用从市场上买到的放射免疫盒（INS-PTH;Nichols  Institute，Los  Angeles，CA），该盒能认别完整的和N-末湍人PTH。

环状AMP的测定

按上述方法培养细胞以用于PTH分泌研究，在培养结束时，取0.15ml样品，移入0.85ml热（70℃）水中，并在此温度加热5-10分钟。接着使该管冷冻和解冻几次，通过离心沉淀细胞碎片。使上清液部分乙酰化，用放射免疫分析法测定环状AMP的浓度。

肌醇磷酸酯生成的测定

用4μci/ml³H-myo-肌醇培养甲状旁腺细胞20-24小时以标记磷脂膜。然后洗涤细胞，并再悬浮在含0.5mM CaCl₂和0.1%BSA和PCB中。在缺少或存在不同浓度有机聚阳离子的情况下，在microfuge管中培养不同时间。加入1ml氯仿/甲醇/12N HCl（200∶100∶1;V/V/V）以终止反应。然后加入肌醇六磷酸水解产物（200μl;25μg磷酸酯/管）水。使该管离心，将600μl的水相稀释到10ml水中。

使用氯化物或甲酸盐形式的AG1-X8通过离子交换色谱分离肌醇磷酸酯。当仅测定IP₃浓度时，用氯化物形式，而甲酸盐形式用于分析主要的肌醇磷酸酯（IP₃、IP₂、和IP₁）。若只测定IP₃，将经稀释的样品加到氯化物形式柱中，用10ml 30mM HCl，再用6ml 90mM HCl洗涤柱子，用3ml500mM HCl洗提IP₃。将最后的洗提液稀释并计数。为测定所有的肌醇磷酸酯，将已稀释的样品加到甲酸盐形式柱中，接着用增加浓度的甲酸盐缓冲液洗提IP₁、IP₂、和IP₃。以甲酸盐柱中洗提的样品旋转蒸发，残渣在鸡尾酒中培养并计数。

用HPLC测定IP₃的同分异构形式。加入1ml 0.45M高氯酸使反应终止，在冰上贮存10分钟。离心后，用NaHCO₃调节上清液的PH为7-8。然后将提出物加到Partisil SAX阴离子交换柱中，用线性梯度的甲酸铵洗提。然后用Dowex使各种镏分脱盐，接着在Packard Tri-Carb 1500LSC中进行液体闪烁计数前旋转蒸发。

对于所有肌醇磷酸酯分离方法来说，若有机聚阳离子干扰分离，用可信标准作合适对照以用于测定。如果是这样的话，在分离肌醇磷酸酯之前，要用阳离子交换树脂处理样品以去除这种讨厌的分子。

在C-细胞中细胞溶质Ca²⁺的测定

将得自American Type Culture Collection（ATCC NO.1607）鼠髓甲状腺癌（rMTC 6-23）的赘生性C-细胞在缺少抗体的情况下，在Dulbecco's改性的Eagle's培养基（DMEM）加15%马血清中单层培养。为测定[Ca²⁺]_i，用0.02%EDTA/0.05%胰蛋白酶收获该细胞，用含1.25mM CaCl₂和0.5%BSA的PCB洗涤二次，并且按上述对甲状旁腺细胞所用方法载带fura-2。按上述适当校正染料漏损的方法进行[Ca²⁺]_i的测定。

在鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i的测定

破骨细胞是采用无菌条件得自1-2天的Sprague-Dawley鼠。用断头术杀死小鼠，切除后腿，快速取出股骨软组织，放在预热的F-12/DMEM培养基中（DMEM含有10%牛胎儿血清和抗生素（青霉素-链霉素-庆大霉素;100U/ml-100μg/ml-100μg/ml）。将得自两只小鼠的骨沿长度方向切断，放在1ml培养基中。用塑料吸管将骨断片慢慢捣碎得到骨细胞，并用培养基稀释。使骨碎片沉降，将等量（约1ml）的培养基移到带有25mm玻璃盖片的6孔培养板上。在潮湿的5%CO₂空气气氛中，在37℃下使该细胞沉降1小时。然后用新鲜介质洗玻璃盖片三次以去除非粘附细胞。在去除非粘附细胞6-8小时内进行破骨细胞中[Ca²⁺]_i的测定。

通过在F-12/DMEM缺少血清而含有0.5%BSA中用5uMindo-1乙酸基甲基酯/0.01%普卢兰尼克（Pluronic）F 28在37℃下培养30分钟，使粘于盖玻片的细胞载带indo-1。接着洗涤该盖玻片，在37℃，在F-12/DMEM缺少酯条件下再培养15分钟，然后移到过冷容器中，该容器安装在显微荧光计的Nikon Diaphot倒象显微镜的载物台中。由于破骨细胞体积大且存在多个核，所以容易鉴定。用缓冲液（通常PCB含有0.1%BSA和1mM Ca²⁺），以1ml/分有或没有试验物质情况下使该细胞过冷。在340nm激发发射的荧光直接通过显微镜影象部射到440nm分色镜上，用光电倍增管收集强度为495和405nm的荧光。使光电倍增管的输出放大，计数化，并贮存在80386 PC中。用荧光强度的比率测定[Ca²⁺]_i。

卵母细胞表达

在另外的分析中，在筛选方案中，采用注入来自牛或人甲状旁腺细胞mRNA的非洲蟾蜍属卵母细胞，Cl^-传导测定作为监测[Ca²⁺]_i增加的一种间接方法。下面是测试新霉素影响的一个例子。

用富多聚腺苷酸⁺的mRNA注入卵母细胞，该mRNA得自人甲状旁腺组织（来自继发性HPT病例的增生腺）。三天后，测试该卵母细胞对新霉素的响应。新霉素B引起Cl^-传导波动增加，用无药盐水过冷可使波动增加中止（见图20）。在100μM-10mM浓度下观测对新霉素B的响应。为确信由新霉素B引起的响应是随甲状旁腺mRNA的注入而定的，测定了注入水的卵母细胞中新霉素B对电流的影响。在5次卵母细胞试验中，新霉素B（10mM）均不使电流发生任何变化。已知约40%的卵母细胞对碳酰胆碱响应，一种由内源蕈毒受体间介的作用。在5次试验的卵母细胞中，有一次表明在对碳酰胆碱响应中产生电流，如图20的下部曲线所示。因此，在表达能增加[Ca²⁺]_i和Cl^-传导的蕈毒受体的细胞中，新霉素B不会引起响应。这说明对新霉素B的响应取决于用甲状旁腺细胞mRNA编码的特定蛋白质的表达。应强调指出，在完整的细胞中，新霉素B直接作用于Ca²⁺受体以改变甲状旁腺细胞功能。

由引导分子设计药物

某些有机分子通过在Ca²⁺受体中的作用模拟或对抗胞外Ca²⁺的作用（如本文所述）。然而，已试验的分子未必都适合作药物候选物，但它们能用来证明基于Ca²⁺受体的治疗设想是正确的。这些分子可用于测定能使它们作用于Ca²⁺受体的结构特性，因此还能用于选择本发明的有用分子。

该分析方法的一个例子如下：在下面实施例中详细描述了这例子，这里用它来说明由本文所讨论的引导分子设计本发明有用分子的理论基础。在该实施例中所规定的分析步骤是本技术人员公认的，在其它引导分子中能进行类似的分析直到大多数所要的模拟钙或溶解钙被确定。

下面还提供了其它实例，现有数据均说明有用的引导分子将含有芳基，最好在一个或多个位置取代，并可按需要含有分支或线性取代或未取代的烷基。此外，重要的是选择合适的立体有择分子以确保所要Ca²⁺受体的高亲合力。因此，这些资料给本领域普通专业人员指明了合适的引导分子，这些分子可以被衍生（derivatised）以发现本发明所要的最佳分子，正如下面所述。

虽然试验的这些分子结构各不相同，但研究表明它们具有共同特性。在本例中，测定了净正电荷与胞内Ca²⁺迁移效能之间的相互关系。在引起甲状旁腺细胞[Ca²⁺]_i迁移中，鱼精蛋白（+21;EC₅₀＝40nM）比新霉素B（+6;EC₅₀＝20μM，在人甲状旁腺细胞上和40μM在牛甲状旁腺细胞上）更有效，后者又比精胺（+4;EC₅₀＝150μM）更有效。这些结果产生下列问题，即是否仅由正电荷决定效能的问题，或是否有其它结构特性影响Ca²⁺受体中的活性问题。在最初进行确定是重要的，因为它深深影响Ca²⁺受体是具有有效和特定治疗分子的目标的观点。因此，可研究与新霉素B和精胺有关的种种其它有机聚阳离子以确定分子的净正电荷和其使胞内Ca²⁺迁移效能之间的关系。

研究的第一组分子是氨基糖甙类。在牛甲状旁腺细胞中检定该分子。并测定其对于胞内Ca²⁺迁移的EC₅₀。对氨基糖甙类而言，促使细胞溶质Ca²⁺暂时迁移的效能排列次序为：新霉素B（EC₅₀＝20或40μM）＞庆大霉素（150μM）＞卡那霉素B（200μM）＞链霉素（600μM）。当在500μM浓度下试验时，卡那霉素和林可霉素没有作用。在PH为7.3，在这些氨基糖甙类上的净正电荷为新霉素B（+6）＞庆大霉素（+5）＝卡那霉素B（+5）＞卡那霉素（平均+4.5）＞链霉素（+3）＞林可霉素（+1）。而且，这组氨基糖甙类内，净正电荷之间有某种关系，但这不是绝对的;卡那霉素被预言比链霉素更有效，但它却没有活性的。

各种聚胺的试验在净正电荷和效能之间呈现更多和更明显的矛盾。对三类聚胺结构进行试验：（1）直链，（2）支链，和（3）环状。检定的聚胺结构如图1所示。在直链聚胺中，精胺（+4;EC₅₀＝150μM）比五亚乙基六胺（+6;EC₅₀＝500μM）和四亚乙基五胺（+5;EC₅₀＝2.5mM）更有效，即使后种分子具有更多的净正电荷。

我们合成了一些支链聚胺，它们具有不同数目的仲氨基和伯氨基，从而改变了净正电荷。检定了这些分子中的二种，即NPS381和NPS382对牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的作用。NPS382（+8;EC₅₀＝50μM）的效能约为NPS381（+10;EC₅₀＝100μM）的二倍，即使它所含的正电荷少2个。

在环状聚胺的试验中也看到正电荷和效能之间的类似矛盾，例如，hexacyclen（+6;EC₅₀＝20μM）比NPS383（+8;EC₅₀＝150μM）更有效。由这些聚胺得到的结果表明正电荷不是影响效能的唯一因素。

另外的研究使我们了解到分子的结构特性，这些结构特性使甲状旁腺细胞Ca²⁺受体具有活性。结构上的重要特性之一是氮（它带有正电荷）之间的分子内距离。因此，在引起牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i增加的效能方面，精胺比三亚乙基四胺（EC₅₀＝8mM）高50倍，尽管两种分子均带有+4的净正电荷。这两种聚胺之间结构中的差别仅在于隔开氮的亚甲基数目不同：在精胺中为3-4-3，而在三亚乙基四胺中为2-2-2。看来氮间隔中的很小变化对其效能有极大影响，并认为分子内氮的结构关系是关键性的。由hexacyclen和五亚乙基六胺得到的结果支持这种结论。前种分子仅仅是后者的环状类似物，所有氮之间所含的亚甲基数目相同，这种环结构的存在也使其效能增加25倍。这些结果表明正电荷本身不是决定有机分子对Ca²⁺受体的活性的关键因素。

另一组试验揭示芳基在决定对Ca²⁺受体活性中的重要性。该结果是用Argiope lobata蜘蛛的毒液中分离的二种芳烷基胺得到的。这些分子，黄金蛛毒素636和黄金蛛毒素659具有相同的聚阳离子部分，它与不同的芳基相连接（图24）。当在100-300μM的浓度下进行试验时，黄金蛛毒素659引起牛甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i暂时增加。相反，当在相同浓度下试验时，黄金蛛毒素636没有作用。这二种芳烷基胺结构之间差别仅在于该分子的芳族部分不同：黄金蛛毒素659含有4-羟基吲哚部分，而黄金蛛毒素636含有2，4-二羟基苯基基团。在这二种芳基烷基胺中的净正电荷是相同（+4）的，所以其效能的差别必然是由不同的芳基引起的。这说明净正电荷不能独立的决定效能。然而，这些研究的客观重要性在于发现芳族基团能明显影响分子活化Ca²⁺受体的能力。

EC₅₀分别为6和22μM的Agatoxin毒素489（NPS017）和Agatoxin毒素505（NPS015）两者均能引起甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺迁移。这些分子结构上的差异仅在于吲哚部分中的羟基不同（图1）。这些说明该分子芳族部分中的取代会影响其效能。这表明研究的另外一些引导分子将包括具有取代了的芳基部分的那些分子。

本文所述系统改变的引导分子结构特性包括：（1）净正电荷，（2）分隔氮的亚甲基数目，和（3）环的型式，如，聚胺，在亚甲基间距和净正电荷中有和没有变化;此外，如，在各种由胡蜂和蜘蛛毒液分离的芳烷基胺中可以检定芳基结构和位置的规则变化;将市售的芳基部分与黄金蛛属毒素聚胺部分偶合可制备合成分子。该黄金蛛属毒素聚胺部分容易与任何含有一个羧酸的芳基部分偶合。因此，系统筛选苯乙酸和苯甲酸以及羟基吲哚乙酸系的羟基和甲氧基衍生物是简单的。并且能制备含有杂芳族功能团的类似物，并测定其活性。

这些分子中效能和效力的比较可揭示正电荷不变时芳族基团的最佳结构和位置。

似乎会提高效能的聚胺主链（motif）的结构变化之一是存在直链母分子的环状变体从植物Albizia amara中分离的Budmunchiamine A是精胺的环状衍生物（图1）。在牛甲状旁腺细胞中加入Budmunchiamine A会引起[Ca²⁺]_i快速和暂时增加，在缺少胞外Ca²⁺的情况下会持续增加，用PMA预处理会使增加减慢。因此，它引起甲状旁腺细胞中胞内Ca²⁺迁移，可能是由于在Ca²⁺受体上的作用。它差不多与精胺（EC₅₀约为200μM）等效，而所带正电荷（+3）比精胺少一个。

由budmunchiamine  A得到的结果证明了结构一活性研究的预言能力，通过天然产物的试验可获得新的结构资料。因此，天然产物的筛选，根据结构资料合理地选择，是容易进行的，例如，基于完全确立的化学分类学原则，用合适的资料能选择分子，如Napralert。例如，能筛选从与Albizia如，Pithecolobium有关的Papilionoid豆料植物衍生的六环聚胺生物碱和其它由植物衍生的分子。

图36提供能筛选测定本发明有用分子的一系列分子的第二个例子。这些分子通常从苯乙二苯丙胺衍生，并试验测定它们各自的EC₅₀。此外，有关分子如NPS447和NPS448的试验揭示了分子结构的立体有择作用。目前试验的大多数活性化合物，是称为NPS467和NPS568的新化合物，它们的EC₅₀值小于5μM。本领域普通技术人员通过研究这系列分子，能测定其它可以在本发明中被测示的适用的衍生物。

这些例子说明了用于本发明的一般设计和筛选方法并指出另外的化合物和天然产物库能被本领域技术人员按要求筛选以测定其它有用的引导分子或本发明的新分子。

正如上面讨论指出，用作模拟钙的分子例子包括分支或环状聚胺，带正电荷的聚氨基酸、和芳烷基胺。此外，其它带正电荷的有机分子，包括天然存在的分子及其类似物也是有用的模拟钙。最好这些天然存在的分子及其类似物所具有的正电荷与质量比率与本文所例举的那些分子的比率相关。（这些例子包括从海生动物，节肢动物毒液、陆生植物中分离的物质以及从细菌和真菌得到的发酵液体培养基）。可以预料用作模拟钙的的一组优选天然存在的分子和类似物将具有的正电荷：分子量比（以道尔顿表示）约为1∶40-1∶200，优选为约1∶40-1∶100，这些分子的更具体例子如下所述。

聚胺

在本发明中适于用作模拟钙的聚胺可以是分支的或环状的。分支或环状聚胺可能比其直链类似物具有更高的模拟钙活性。即，分支或环状聚胺比它们的相应线性聚胺（在生理PH下具有相同的有效电荷）势必具有更低的EC₅₀（见表1）。

表1

分子 净(+)电荷 EC₅₀(μM)

新霉素  +6  20或40

六聚环乙胺(Hexacyclen)  +6  20

NPS382  +8  50

NPS381  +10  100

NPS383  +8  150

庆大霉素  +5  150

精胺  +4  150

卡那霉素B(Bekanamycin)  +5  200

黄金蛛属毒素-659  +4  300

五亚乙基六胺(PEHA)  +6  500

链霉素  +3  600

亚精胺  +3  2000

四亚乙基五胺(TEPA)  +5  2500

1.12-二氨基十二烷(DADD)  +2  3000

三亚乙基四胺(TETA)

(Triethylene-tramine)  +4  8000

本文所用的“分支聚胺”是指一种链分子，它由短烷基桥或通过氨基键合连接在一起的烷基组成，并含有链分支的点。这些“支点”可以位于碳原子或氮原子，最好是氮原子。通常氮原子支点为叔胺，但也可为季胺。分支的聚胺有1-20个支点，最好有1-10个支点。

通常，分支聚胺中烷基桥和烷基支链长度为1-50个碳原子，优选2-6个碳原子。烷基支链也可以被1个或多个杂原子（氮、氧或硫）断开，或者用下列功能基取代，例如：卤素包括氟、氯、溴、或碘;羟基;硝基;酰氧基（R'COO-），酰氨基（R'CONH-），或烷氧基（-OR'），其中R'可以含有1-4个碳原子。烷基支链也可用在生理PH下是正电荷的基团取代，例如氨基或胍基。这些功能性取代基可增加或改变其物理性能如溶解度以增加该分子的活性、传送或生物可用性。

该分支聚胺具有3个或更多个链和分支终点。这些终点可为甲基或氨基，优选氨基。

一组优选的分子是具有下列化学式的分支聚胺：

其中k为1-10的整数，每个j可以相同或不同，它可以是2-20的整数，每个R_i可以相同或不同，它选自氢和-（CH₂）_j-NH₂，其中j的限定如上，并且至少一个R_i不是氢。

本发明特别优选的分支聚胺是分子N¹，N¹，N⁵，N¹⁰，N¹⁴，N¹⁴-六-（3-氨基丙基）精胺和N1，N⁵，N¹⁴，N¹⁴-四（3-氨基丙基）精胺，它们在图1中分别称为NPS381和NPS382。

本文所用的“环状聚胺”是指含有2个或更多个杂原子（氮、氧或硫）的杂环，其中至少两个杂原子是氮原子。该杂环圆周通常约为6-20个原子，最好圆周约为10-18个原子。氮杂原子被2-10碳原子分开。该杂环在氮位置上也可以用氨基烷或氨基芳基（NH₂R-）（其中R是氨基芳基或2-6个碳原子的低级烷基）取代。

本发明特别优选的环状聚胺如图1所示，为hexacyclen（1，4，7，10，13，16-六氮杂-环辛烷）和NPS383。

聚氨基酸

用于本发明的聚氨基酸在生理PH条件下可以含二个或更多个正电荷氨基酸残基。这些正电荷氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。这些多肽的长度将在2-800个氨基酸长度变化，更优选为20-300个氨基酸长度。这些多肽可包括简单重复的氨基酸残基，或者可以具有各种天然存在的蛋白质或酶。

含有聚氨基酸的氨基酸残基可为20种天然存在的氨基酸中的任何一种或其它可选择的残基。可选择的残基包括，例如，ω-氨基酸，其化学式为H₂N（CH₂）_nCOOH，其中n为2-6，这些是中性的、非极性的氨基酸，如肌氨酸、叔丁基氨基丙酸，叔丁基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，苯基甘氨酸，瓜氨酸，甲硫氨酸亚砜，环己基氨基丙酸和羟基脯氨酸。鸟氨酸是一种可选择的正电荷氨基酸残基。本发明的聚氨基酸也可以是用公知方法化学衍生的。

本发明特别优选的聚氨基酸包括聚精氨酸、聚赖氨酸和聚（精氨酰-酪氨酸），含有20-300个残基。另一个优选的聚氨基酸是鱼精蛋白或鱼精蛋白的类似物。

芳烷基胺

本文所用的“芳烷基胺”是指一类由节肢动物毒液得到的正电荷毒素。本发明优选的芳烷基胺包括大头泥蜂毒素（Philanthotoxin）-433，黄金蛛属毒素-636和黄金蛛属毒素-659，agatoxin  505、agatoxin  489，（其结构如图1所示），以及其它仿制这些天然产物的合成分子，例如NPS019。

附加组分

本发明的组合物不仅至少包括一种模拟钙或溶解钙，而且还包括某些附加成分，这些附加组分包括靶组分、标记物和其它能用于本申请的功能性成分，如用于筛选胞外Ca²⁺拮抗物或对抗物的成分。

例如，免疫球蛋白或其部分、或者对甲状旁腺细胞或Ca²⁺受体具有特异性配体均可用作特定的靶组分。免疫球蛋白可为多克隆或单克隆抗体，并且可以含有完整的抗体或这些抗体的免疫反应片段，如F_ab′、F_ab、或（F_ab′）₂也可以使用特定的受体配体。

本发明的组合物也可以含有用作标记物的分子或离子衍生的某些成分。可以使用各种标记部分，包括放射性同位素、发色团和荧光标记物。放射性同位素标记尤其便于在体内检测。放射性同位素可以在卟淋体系中作为阳离子配位偶合。有用的阳离子包括锝、镓和铟。在该组合物中，正电荷分子能与标记物连接或缔合。

合成方法

聚胺的合成和改性方法包括使用各种各样的胺保护基团（苯二甲酰亚氨基、BOC、CBZ、苄基和腈），，它们可以被选择性地去除以构成官能分子。所包括的合成方法是模拟用于构成argiopines  636和659和从蜘蛛毒液得到的其它芳烷基胺的方法。

2-4亚甲基的链延伸通常是通过用相应的N-（溴代烷基）苯邻二甲酰亚胺烷基化而完成的。使胺与溴代烷基苯邻二甲酰亚胺的1∶1.2混合物在乙腈中、在存在50%KF/硅藻土的情况下进行回流。链的延伸也可通过用丙烯腈或丙烯酸乙酯使给定的胺烷基化而完成。反应进程用TLC监测，用二氯甲烷、甲醇和异丙胺混合物在硅胶上纯化中间产物。通过阳离子交换（HEMA-SB）和RP-HPLC（VydacC-18）纯化最终产物。纯度和结构鉴定用¹H-和¹³C-NMR和高辨质谱法（EI、CI和/或FAB）完成。

在存在催化量的二甲基氨基吡啶的情况下，在二氯甲烷中，用二叔丁基碳酸氢酯处理胺（1°或2°）从而加入BOC保护基。以下列二种方法之一种加入苄基保护基：（1）将1°胺与苯甲醛缩合，然后进行硼氢化钠还原，或（2）在KF存在情况下，用苯甲酰溴使2°胺烷基化。酰胺连接和环化通常是通过胺（1°或2°）与给定酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应而完成的。这可以通过在稀释条件下用二环己基碳二亚胺处理“氨基酸”而直接完成（在环化情况下）。

苯二甲酰亚氨基官能团的脱保护是在回流的甲醇中用肼还原而完成的。BOC官能团的脱保护是在无水TFA中完成的。苄基、睛和CBZ保护官能团的脱保护是在催化量的氢氧化钯/碳存在条件下、在55psi氢气下、通过在冰醋酸中还原而完成的。在海锦状阮内镍存在条件下、在氢气氛条件下可选择性还原腈官能团（在苄基和CBZ基团存在条件下）。

具体地说，分支聚胺通常由简单的二氨基链烷烃（化学式为NH₂-（CH₂）_n-NH₂）或简单的聚胺如亚精胺或精胺制备。二个主要（末端）胺之一用下列保护基保护或“掩蔽”，例如，BOC（叔丁氧羰基），苯二（甲）酰亚氨基，苄基，2-乙睛（胺与丙烯腈的Michael缩合产生的产物）或酰胺。典型的反应是用二叔丁基碳酸氢酯（BOC酐）处理从而加入BOC保护基团：

用简单的色谱法或蒸镏法从未保护和二保护产物中分离单保护的产物。

然后用烷基化（或酰化）试剂使单保护产物中其余的游离胺选择性烷基化（或酰化）。为确保单烷基化，该游离胺通过与苯甲醛缩合。然后用硼氢化钠还原生成N-苄基衍生物而达到部分保护。

然后使N-苄基衍生物与烷基化试剂反应。典型的烷基化试剂是N-（溴代烷基）苯邻二甲酰亚胺，其反应如下：

例如，用N-（溴代丁基）苯邻二甲酰亚胺使具有四个亚甲基单元的链延长或分支。另一种方法是，先与丙烯腈反应，再用氰基还原使链延长三个亚甲基和一个氨基。

然后可以将所得到的链延长分子的保护基选择性断裂以产生新的游离胺。例如，用三氟乙酸除去BOC基团;用催化氢化减少腈官能团并除去苄基;按下图所示用肼除去苯二（甲）酰亚氨基：

新游离胺可以再按上述方法烷基化（或酰化）以增加该聚胺长度。重复该方法直到获得所需的链长和支链数目。最后步骤为产物的脱保护，结果得到所需的聚胺。而且，在按下述方法脱保护前保护终止时可再进行修饰：

例如，在BOC脱保护前，用3，4-二甲氧基苯基乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯使聚胺酰化以生成二保护的聚胺：

最终将产生芳基聚胺。

然后用三氟乙酸选择性除去BOC基团，以暴露出其他能按上述方法延长的氨基末端。

在上述形成的聚胺中通过使游离的伯和仲胺同时烷基化或酰化生成了某些分支的聚胺。例如，用过量丙烯腈处理精胺，然后催化还原，得到如下结果：

按上述方法，用起始原料如1，4，7，10，13，16-六氮杂-环辛烷（hexacylen）（Aldricn  Chem）可以制备环状聚胺。

本发明范围内的聚氨基酸可以采用现有技术已知的重组技术制成或者采用现有技术已知的标准固相技术合成。固相合成是用α-氨基保护的氨基酸从肽的羧基末端开始。BOC保护基可用于所有的氨基，即使其它保护基也是适用的。例如，BOC-lys-OH能被酯化以载于氯甲基化的聚苯乙烯树脂载体上。该聚苯乙烯树脂载体最好是苯乙烯与约0.5-2%二乙烯基苯（作为一种交联剂，它能使聚苯乙烯聚合物完全不溶于某些有机溶剂）的共聚物（参见Stewart等人.，固相肽合成（1969），W.H.Freeman  Co，San  Francisco和Merrifield，J.Am.Chem.Soc.（1963）85：2149-2154。这些和其它肽合成方法也在美国专利US3862925;US3842067;US3972859和4105602中举例说明。

该多肽合成可以用手工操作方法或自动进行，例如，采用Applied  Biosystems403A肽合成器（Foster  City，California）或Biosearch  SAM  Ⅱ自动肽合成器（Biosearch，Inc.，San  Rafael，California），按制造商提供的使用指南中的指导操作。

本发明的芳烷基胺是用已知技术分离的天然产物，或者按Jasys等人在Tetrahedron  Lett（1988）29：6223-6226和Nason等人在Tetrahedron  Lett（1989）30：2337-2340中所述方法合成。

制备苯乙二苯丙胺（或图36所示的苯乙二苯丙胺类似物的）的一般方案如下。在装有磁搅棒和橡皮隔膜的10ml圆底烧瓶中，用1.1m mole苯酚和1.0m mole乙酰苯（或取代的乙酰苯）处理在2ml乙醇中的1.0m mole 3，3'-双苯基丙胺（或伯烷基胺）。在此溶液中加入2.0m mole MgSO₄和1.0m mole NaCNBH₃。在氮气氛下、在室温（约20℃）搅拌该反应物24小时。将反应物倒入50ml乙醚中，用1N NaOH洗涤3次，并用盐水洗涤1次。用无水K₂CO₃干燥醚层，并真空中浓缩（reduced）。然后用柱色谱法或引入了二氧化硅固定相和CH₂Cl₂-甲醇-异丙胺（通常为3%甲醇和0.1%异丙胺在二氯甲基烷中）混合物的HPLC纯化产物。

制备苯乙二苯丙胺或苯乙二苯丙胺类似物（如图36所示那些）的优选方法采用异丙氧基钛，并按J.Org.Chem.55：2552（1990）所述方法加以改进。对于合成NPS544而言，用四氯化钛（如Tetrahedron  Letters  31：5547（1990）所述方法）代替异丙氧基钛（Ⅳ）。反应流程如图43a所示。在图43a中，R、R′和R″表示烃基。按照一个实施方案，在一个4ml玻璃瓶中，将1m  mole胺（1）（通常为伯胺）和1mmole酮或醛（2）（通常为乙酰苯）混合，然后用1.25m  mole异丙氧基钛（Ⅳ）（3）处理，使其在室温下静置（偶尔搅拌）约30分钟。另一种方法是，用仲胺代替（1）。注意：某些反应将得到大量沉淀或固体，在反应过程中可将该固体加温/加热（到其熔点）以使其搅拌/混合几次。用1ml含有1m  mole氰基硼氢化钠（4）的乙醇处理反应混合物，然后使得到的混合物在室温静置（偶尔搅拌）约16小时。然后加入约500μl水使反应物骤冷。然后用乙醚将反应混合物稀释到约4ml的总体积，再进行离心。取出上层有机相，在旋转蒸发器中浓缩（reduced）。得到的产物（b）经色谱法通过二氧化硅短柱（或者另一种方法是在二氧化硅上采用预备TLC），使用二氯甲烷∶甲醇∶异丙胺（通常为95∶5∶0.1）的混合物进行部分纯化，然后经HPLC纯化，（正相用含二氯甲烷∶甲醇∶异丙胺的二氧化硅，或反相，C-18含0.1%TFA，乙腈或甲醇）。

若合适或需要的话，手性拆解可采用如实施例21中所述方法完成。

制剂和给药

正如本文所证明的本发明的分子可用于：（a）模拟或对抗胞外Ca²⁺的一种或多种作用;（b）影响各个胞外游离Ca²⁺浓度;和（c）治疗疾病，例如甲状腺机能亢进、骨质疏松症和高血压病。通常该分子已表明对甲状旁腺细胞具有影响，同时它们也能调节其它细胞中的Ca²⁺受体，这些细胞包括骨破骨细胞，近肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞，及胎盘滋养层。

这些分子通常用于治疗人的疾病，同时它们也能用于治疗其它温血动物中类似或相同的疾病。这类动物是例如其它的灵长目动物、饲养场动物如猪、牛和鸡鸭等;和运动用动物及人们喜爱的动物如马、狗和猫。

在治疗和/或诊断应用中，本发明分子可以按不同给药方式（包括全身和表面或局部给药）配制。配制方法和制剂通常在Remington's  Pharmaceutical  Sciences，Mack  Publishing  Co.，Easton，PA中可找到。

对于全身给药，最好是口服给药。另一种方法，可用注射方法，例如肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。用于注射时，将本发明分子制成液态溶液，最好是在生理可匹配的缓冲液中，如Hank氏溶液或Ringer溶液。此外，该分子可制成固体剂型，使用前再立即溶解或悬浮。还包括冷冻干燥剂型。

全身给药也可以通过透粘膜或透皮方式，或将该分子以口服方式给药。对于透粘膜或透皮给药，在制剂中使用能透过阻挡物的合适渗透剂。这些渗透剂通常是现有技术中公知的，包括，例如，用于透粘膜给药的胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，可以使用去污剂以利于渗透。透粘膜给药可以通过例如鼻子喷雾，或者使用栓剂，对于口服给药，该分子可配成常规口服给药剂型，例如胶囊、片剂和滋补药。

对于局部给药，通常采用现有技术公知的方法，将本发明的分子配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。

如下面实施例所述，本发明各种化合物的必需用药量可用标准方法测定。通常其量为1-50mg/kg受治疗的动物。

重组Ca²⁺受体

通常天然产物筛选可提供研制各种治疗分子的引导结构。然而，在以前对Ca²⁺受体具有活性的天然产品库或其他分子库的高产率筛选是不可能的。要达到这种能力，最好是克隆Ca²⁺受体cDNA，然后建立适于高产率筛选的转染细胞系。还可用受体的结构来加深理解配体结合位点的分子几何结构，并且如前面所讨论的那样，用这些资料来扩大合理的药物设计程序。有限的结构活性研究工作以及对所选择的天然产品分子进行的试验，可提供指导合理的天然产品筛选和药物设计所必需的起始结构数据基础。

可以通过非洲蟾蜍属卵母细胞中的功能表达克隆牛和人甲状旁腺细胞Ca²⁺受体cDNA。通过测定通过内在的Ca²⁺活化的Cl^-通道的流可以间接地监测非洲蟾蜍属卵母细胞中胞内Ca²⁺的增加。由这种信号传导途径提供的响应放大作用能够测定很低水平的由mRNA编码的受体蛋白质。这样就能够测定受体特异性cDNA克隆，而不需要高亲合性配体，特异性抗血清或蛋白质或核酸序列资料。这样一种方法的实施例如下。

由非洲蟾蜍属I（Ann  Arbor.MI）得到成年雌性Xenopus  laevis，并根据标准方法养护。将卵巢叶从低温麻醉的蟾蜍上切除。将卵母细胞簇移入改性的Barth盐水（MBS）中。在含有2mg/ml胶原酶（Sigma，Type  1A）的MBS中于21℃培养2小时，得到单个的卵母细胞，选择Ⅴ-Ⅵ期的卵母细胞进行注射。

把玻璃毛细管（直径1mm）拉成细尖，用手折断，其尖的直径为15uM。一滴mRNA（1ng/nl，在焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中）放在巴拉膜（Parafilm）上，并吸入毛细管中。然后把毛细管与波可溅珠泡水（Picospritzer）（WPI仪器公司）相连，调节空气脉冲微滴的体积以输送50ng  mRNA（通常为50nl）。使用具有固定在底部的尼龙料盖35mm的培养皿，以保证在将mRNA注射到植物极过程中卵母细胞的安全。将已注射的卵母细胞放入35mm培养皿中，其中含有MBS、100ug/ml青霉素和100U/ml链霉素，于18℃培养3天。

培养之后，将卵母细胞放入100ul塑料槽中，利用蠕动泵以0.5ml/min流速用MBS使其过冷。通过将管子快速插入不同的缓冲液，加入试验分子或无机聚阳离子。记录与通过电流的电极由拉制成电阻为1-3M欧的薄壁毛细管构成，并装有3M  KCl。在显微镜观察下，用两个电极刺穿卵母细胞（在动物极），并与Axon  Instruments  Axoclamp  2A电压钳放大器相连，该放大器用来设定支持电位（-70至-80mV，holding  potential），以及测定维持支持电位所通过的电流，电流直接记录在长条纸记录器上。

为了制备mRNA，从患有继发性HPT的腓肠或进行外科切除甲状旁腺的病人得到组织。无需制备纯化的细胞;用整个腺制备指导非洲蟾蜍属卵母细胞中Ca²⁺受体表达的mRNA。用酸性硫氰酸胍/苯酚提取均化的腺制备全细胞RNA。用低-dT纤维素色谱法通过标准方法选择poly（A）⁺mRNA。对于mRNA大小分离，可以使用甘油梯度离心分离。用20mm甲基汞氢氧化物使mRNA变性，然后将其装入（50-100ug，浓度为1mg/ml）线性15-30%甘油梯度柱，其梯度柱是用BeckmanTLS55管制备的。以34000rpm离心16小时后，收集到0.3ml梯度馏分，用等体积含5mMβ-巯基乙醇的水稀释。然后两次循环乙醇沉淀回收mRNA。如果需要，可在1.2%琼脂糖/6.0M尿素制备凝胶上分离mRNA（50-100ug poly（A）⁺），只是要使用各种RNA大小标记。用溴化乙锭染色目测mRNA之后，切下含有～1.5-2.0kb大小梯级的RNA的凝胶切片。用RNAid结合基质从琼脂糖凝胶切片上回收mRNA（根据Supplier标准方案;Stratagcne，Inc.），并将回收的mRNA馏分洗脱到DEPC一处理的水中。

用紫外吸收测量方法对所回收的mRNA进行定量分析。使用少量的每种样品（0.5μg）经甲醛/琼脂糖凝胶电泳测定每个馏分中所含mRNA的大小范围。通过体外转化每个样品可以测定整体mRNA。使用网状细胞溶胞产物（在市场可购买到的药盒;BRL）转化0.05-0.5ug的每个mRNA馏分。所得到的³⁵S-标记蛋白质用SDS-PAGE进行分析。完整的mRNA能够指导整个大小范围的蛋白质的合成，这样的大小范围大致相应于各个mRNA馏分的大小。

在修改Gubler和Hoffman技术之后，在载体λZAPⅡ中构建cDNA库。在卵母细胞检验中，具有最佳响应的馏分中的RNA可用作原料。用低-dT/NOt  I引物连接物引导第一股cDNA链合成。再通过RNase  H/DNA聚合酶I自身引导法引导第二股链的合成。用T4DNA聚合酶使双链cDNA钝化，并用74连接酶将Eco  RI接合体钝化端与cDNA连接。在NOt  I消化以切掉连接物之后，在Sephacry1  500HA上通过排阻色谱法对全长cDNA进行大小选择。第一股cDNA链用α-³²P-dATP进行放射标记，在引入放射性之后，监测整个合成和回收步骤。将从分级柱上回收的全长cDNA与Eco RI/Not I消化的λZAPⅡ臂连接起来。用市售高效封装提取物（Stratagen，Inc），对连接混合物进行组装（packaged）试验，并在适当的宿主菌株（XLI-blue）上平板培养。当该库是在IPTG和X-gal上平板培养时，通过白色斑点对兰色斑点的比率测定重组噬菌体的百分数。

从十个随机选择的克隆测定插入子的平均大小。噬菌体DNA“mini-preps”是用Eco  RI和Not  I消化而放出其插入子的，并由琼脂糖凝胶电泳测定其大小。该库由＞90%的重组噬菌体和1.5-4.2kb大小的插入子组成。大规模组装重组连接生成800000个最初的克隆。校准组装混合物，并以每15cm平板50000个斑点进行平板培养。用SM缓冲液洗脱50000个克隆的每个库，并且单独贮存。

小规模制备噬菌体DNA使用每个克隆库的平板胞溶产物储备物。噬菌体颗粒经聚乙二醇沉淀被浓缩，用蛋白酶K消化后用苯酚∶氯仿提取纯化噬菌体DNA。将20微克DNA用Not I消化，并用作体外转录敏感链RNA的模板。根据标准方案，在50ul总反应体积中用T7 RNA聚合酶和5'帽类似物m⁷GppG进行上述体外转录。在DnaseI/蛋白酶K消化和苯酚/氯仿提取后，用乙醇沉淀法浓缩RNA，并将RNA用于卵母细胞注射。

用来自每个亚库为50000单个克隆构成的16个库的亚库中的合成mRNA（cRNA）注射卵母细胞。在培养3-4天后，对卵母细胞进行10mM新霉素引起Ca²⁺依赖性Cl^-流的能力的分析。指定为6的库给出正信号，因此它含有编码功能钙受体的cDNA克隆。为了减少6库的复杂性，并因此继续纯化该库中所含的钙受体克隆，以每块板约20000斑点再平板培养6库噬菌体，并得到12块平板。由这些亚库中的每个亚库制备DNA并合成cRNA。再用cRNA注射卵母细胞，并在3-4天后，对10mM新霉素引起Ca²⁺依赖性Cl^-流的能力进行分析。亚库6-3是正的，并使该库进行下一轮平板培养，将库的复杂性降低到每个库约5000克隆。通过制备cRNA并在卵母细胞中注射再次检验各库。亚库6-3.4是正的。为了加快进一步纯化库6-3.4中的正克隆，通过用辅助噬菌体ExAssist重复感染从这个库中挽救出噬菌体DNA作为质粒DNA。所挽救的质粒转染到细菌菌株DH5alphaF'中，在青霉素平板上生成转化的细菌菌落。在每个库有900克隆的库中得到这些细菌菌落。然后由每个亚库制备出质粒DNA，并合成cRNA，并以常见的方式予以检验。亚库6-3.4.4是正的。在每个亚库为约50克隆的亚库中平板培养出含质粒亚库6-3.4.4的细菌。这种过程希望持续下去以生成编码功能钙受体的单个克隆。

开始的实验使用了非洲蟾蜍属卵母细胞，这种细胞注入了水或从牛甲状旁腺细胞得到的Poly（A）+富集的mRNA（50ng）。三天之后，检测卵母细胞响应胞外二价与三价阳离子浓度的增加而增加胞内Ca²⁺的能力。用记录与通过流的电极刺穿卵母细胞，并通过测量内源Ca²⁺-活化的Cl^-通道的流间接检测[Ca²⁺]_i。在用牛（或人，图26）甲状旁腺细胞的Poly（A）⁺-富集的mRNA注射的卵母细胞中，胞外Ca²⁺浓度由0.7mM增加到3、5或10mM，引起Cl^-传导快速瞬时增加，其传导然后在较高传导基础上波动。胞外Mg²⁺浓度由1mM增加到10mM，同样引起Cl^-传导波动增加。当胞外Cl²⁺浓度降到＜1μM时，Cl^-传导持续对胞外Mg²⁺响应（图25）。

不渗透的三价阳离子Gd³⁺（600uM）也引起Cl^-传导的波动增加（图25）。当允许卵母细胞表达其他Ca²⁺-迁移受体和用适当的配体（例如，物质K，图25）刺激该卵母细胞时，注意到Cl^-传导率的这种增加，该传导名义上无胞外Ca²⁺的波动和持续。在这些情况下，Cl^-传导的增加反映胞内Ca²⁺的迁移。这些初始研究工作同样表明，在甲状旁腺细胞的注射mRNA的卵母细胞中，胞外多价阳离子迁移胞内Ca²⁺。

用水注射的卵母细胞在与胞外Ca²⁺（10mM）或Mg²⁺（20或30mM）接触时，未显示任何Cl^-流的变化。在一系列实验中，用编码物质K受体的mRNA注射卵母细胞。在这些卵母细胞中，胞外Mg²⁺（20mM）没有引起任何流，但这些细胞对所加的物质K产生强烈响应（图25）。这些实验表明卵母细胞对胞外Ca²⁺或Mg²⁺没有内在的敏感性。

使用由人甲状旁腺（继发性HPT患者的增生组织）得到的poly（A）⁺-富集的mRNA注射的卵母细胞进行类似实验。在这些卵母细胞中，胞外Ca²⁺浓度的增加引起Cl^-传导的可逆波动增加（图26）。补充300μMLa³⁺同样引起Cl^-传导的波动增加。胞外Mg²⁺浓度由1mM增加到10mM引起在无胞外Ca²⁺时Cl^-传导持续增加。另外的试验表明，对胞外Ca²⁺的响应是浓度依赖性的。因此，在三种mRNA注射的卵母细胞中，Cl^-传导在3mM胞外Ca²⁺时增加到最大值111±22nA，在10mM胞外Ca²⁺时增加到最大值233±101nA。

在非洲蟾蜍属卵母细胞中得到的结果证明在编码蛋白质的甲状旁腺细胞中存在mRNA，而该蛋白质在正常无反应的细胞中可能具有对胞外Ca²⁺的敏感性。而且，在没有胞外Ca²⁺的情况下，胞外Mg²⁺引起Cl^-流波动增加的能力证明：Cl^-流取决于胞内Ca²⁺的迁移而不是胞外Ca²⁺的流入。用La³⁺得到的结果同样表明，所表达的蛋白质与胞内Ca²⁺迁移相关。同时，这些资料表明，所表达的蛋白质起细胞表面受体而不是通道的作用。这些研究提供了有力的证据，证明在甲状旁腺细胞表面上存在Ca²⁺受体蛋白质，并且证明了用非洲蟾蜍属卵母细胞系统获得Ca²⁺受体cDNA分子克隆的可行性。

在另外一系列实验中，将用甲基汞氢氧化物变性的甲状旁腺细胞mRNA通过甘油梯度离心进行大小分级。收集十份馏分。将每组注入非洲蟾蜍属卵母细胞中，在三天培养期之后，检验卵母细胞的Ca²⁺受体表达。用馏分4-6注射的卵母细胞表明，对胞外Ca²⁺响应的Cl^-传导最大和最协调地增加（图35）。这些结果表明Ca²⁺受体是由2.5-3.5kb大小的mRNA编码。这表明由转录载体cDNA库合成的直接表达RNA的策略是可行的。进行大小分级这类试验，并且在三种不同的分级试验的每一个试验中得到了相似的结果。

可以对所得到的并且具有前述试验中特征的mRNA馏分注入卵母细胞中进行检验。对于每个mRNA馏分，将浓度为1ng/nl（在水中）的50ng RNA注入10-20个卵母细胞中。已注射的卵母细胞于18℃维持48-72小时，其后测量Cl^-流以检验细胞Ca²⁺受体的表达。对于每组已注射的卵母细胞，测定受体表达呈阳性的数目，以及测定所测量的Ca²⁺依赖性Cl^-流大小。作为负对照，用老鼠肝poly（A）⁺-富集的mRNA、酵母RNA或水注入卵母细胞。

预料2.5-3.5kb的mRNA可编码该受体。其更大的mRNA，在卵母细胞注射之前可能需要以甲状旁腺mRNA的杂交缺失为基础的克隆法。为了取得成功，这种策略不取决于全长cDNA克隆的增殖。如果用单一大小的mRNA馏分得不到受体表达，则用混合大小馏分注入卵母细胞以确定导致功能受体的组合。如果生成功能受体需要多重亚单位，则使用杂交缺失表达克隆战略。在这种方法中，根据使全部mRNA群体中的特殊mRNA缺失的能力来选择克隆。根据其防止生成活性多亚单位复合物的能力确定编码单个亚单位的克隆。通过详细的筛选有可能确定出编码所有必需亚单位的克隆。

这种方法能够分离编码生成功能受体复合物所需要的各个亚单位的克隆。利用用于分析原始mRNA馏分的相同技术，检验克隆库的合成RNA诱导非洲蟾蜍属卵母细胞中Ca²⁺受体表达的能力。最初检测了10个代表100000个初级克隆的库。以较低（通常为4-10倍）复杂性筛选显示正响应的克隆库，还要对正库进一步细分和筛选。接着进行库亚分离过程，直到确定出各个正克隆。作为卵母细胞表达检验的负对照，由诱导正响应的那些DNA模板的T7转录产生抗敏感转录本，抗敏感转录本不能得到真正的受体，这将控制由注入合成RNA出现的任何非特异性正信号。另一个所关切的事是合成的RNA可能通过一种未确定的机制，偶然地使已注射的卵母细胞中的转译“中毒”。为了对这种可能性加以控制，将含有甲状旁腺细胞mRNA的不同的稀释液与提供负响应的合成RNAs一同注射，以确定它们是否非特异性干扰Ca²⁺受体的表达。

在确定编码Ca²⁺受体的各个克隆时，从入载体切去cDNA插入子，并且用于大规模生产合成RNA。这种单一RNA的卵母细胞注射使得能够精确估价所表达受体的特性。

如果编码Ca²⁺受体的mRNA大小对于通过直接转录和表达而克隆来说是太大的话，或者如果涉及多重亚单位的话，则使用筛选克隆库的杂交缺失技术。从由大小选择的甲状旁腺细胞cDNA库得到的克隆库制备cDNA插入子DNA。在生成DNA/RNA双螺旋的条件下，将这种DNA与甲状旁腺细胞mRNA杂交。回收未退火的杂交缺失RNA，并用于卵母细胞注射。从整个甲状旁腺细胞mRNA群体中的这种mRNA中，排除含有表示Ca²⁺受体mRNA的序列的克隆库的DNA，由于卵母细胞注射，该受体的表达减少或缺少。接着对降低复杂性的克隆库进行细分级过程，在每一步骤对克隆的DNA进行检验，该克隆的DNA使整个甲状旁腺细胞mRNA群体的Ca²⁺受体编码的mRNA缺失。在杂交缺失检验过程中使用内对照以保证杂交缺失的RNA是完整的，并且能在卵母细胞中被转译。

人甲状旁腺细胞表达与腺苷酸环化酶偶合的β-肾上腺素能受体。这种受体可以在卵母细胞中被表达，在卵母细胞中它具有兴奋剂诱导活化内源腺苷酸环化酶的能力。在杂交缺失筛选Ca²⁺受体克隆过程中，对用杂交缺失的mRNA注射的卵母细胞进行异丙基肾上腺素诱导的腺苷酸环化酶活化分析。该分析中的正响应表明任何观察到的Ca²⁺受体响应的抑制作用是特异性的，并不是由于整个mRNA群体的一般抑制作用。

杂交缺失筛选策略可能导致分离不包括完整蛋白质编码区的克隆。将通过这种筛选策略分离的正克隆排出顺序以确定它们的蛋白质编码能力。人甲状旁腺RNA的mRNA印迹分析能够测定相应于特定克隆的完整mRNA的大小。如果正克隆不是全长的话，那么已克隆的cDNA可以作为杂交探针以筛选整个cDNAs的甲状旁腺cDNA库。

许多细胞系都能将外源表达的受体与内源功能响应联系起来。可以对许多这些细胞系（如NIH-3T3、HeLa、NG115、CHO、HEK、293和COS7）进行试验以证实它们缺少内源Ca²⁺受体。那些对外部Ca²⁺没有响应的细胞系可以用于建立表达已克隆的Ca²⁺受体的稳定转染的细胞系。

由表达克隆确定的Ca²⁺受体cDNA克隆的序列分析可以描述编码受体蛋白质的开放阅读框架。该cDNA的编码区将亚克隆到真核表达载体pMSG的多克隆位点上。这种载体使得由小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子驱动高水平的转录，并且在很多哺乳动物细胞中这种载体都是活性的。这种载体还含有对霉酚酸具有抗性的gpt基因，该霉酚酸处于SV40早启动子的控制之下，该载体还含有在细菌中选择与生长所必需的序列。从大肠杆菌中生长和纯化出大量表达载体/受体cDNA质粒结构。

用质粒DNA转染真核细胞系的最有效的方法随所给出的细胞类型而变化。采用适宜的技术，或者Ca²⁺磷酸盐沉淀、DEAD-葡聚糖转染、脂染（lipofection），或者electroporation，将Ca²⁺受体表达结构引入培养的细胞中。在转染步骤之后，在抗生素G418存在下使细胞生长，以选择表达新霉素抗性基因的细胞。再将G418抗性转染体菌落亚克隆，并建立为单个细胞系。在G418抗性细胞中的Ca²⁺受体蛋白质的表达可用几种方法检验。Southern印迹分析和slot印迹分析将证实受体cDNA序列的存在和复制数、使用Northern印迹分析将证实受体mRNA是由质粒结构转录的。通过测量对外施Ca²⁺受体兴奋剂响应的胞内Ca²⁺的迁移作用，可以确定受体蛋白质的功能表达。

Ca²⁺受体克隆能从结构与功能两方面研究这种新的受体。可以将重组制备的受体结晶用于结构研究。表达该受体的稳定转染细胞系可用于高产率筛选天然产品或其他化合物库。对具有必不可少的效能和专一性的分子可进行标记（放射性法和萤光法）。试验分子显示这样一种标记分子的提取物的能力将构成高产率筛选试验的基础。

如果提供表达其他钙受体的适宜细胞或组织，则这些受体可以按照与前面对甲状旁腺细胞钙受体描述的相似方法进行克隆。例如，人破骨细胞瘤组织的mRNA编码破骨细胞钙受体（图34）。因此，要分离人破骨细胞受体克隆，人们只需要从破骨细胞瘤组织分离mRNA，按前面所叙述的方法制备一个cDNA库和检验/分离亚库。再者，优选的药物筛选用的受体是来源于人的。可以使用编码一个物种的钙受体的克隆，以通过本技术领域专业人员众所周知的交叉杂交方法得到相应的人cDNA克隆。此外，这种甲状旁腺细胞或其他细胞Ca²⁺受体的克隆能分离编码其他细胞中类似Ca²⁺-敏感蛋白质的基因，并且表达那些蛋白质。可以用许多方法做到这一点。利用Ca²⁺受体cDNA作杂交探针，对人基因组DNA进行Southern印迹分析将显示出该基因组中所编码的相关序列数。不同程度的杂交将显示出相关序列中的偏离程度。这将提供有关编码相关受体蛋白质的基因潜在数量的信息。以Ca²⁺受体cDNA作探针的Northern印迹分析将确定在各种组织中是否有相同或相关的转录本存在。若探测出与甲状旁腺细胞Ca²⁺受体相似的相关转录本，则通过筛选合适的cDNA库或采用聚合酶链反应（PCR）技术得到这些mRNA的克隆就是相当简单的事情。这样得到的新受体克隆就可以在卵母细胞中或在转染的细胞系中通过表达进行功能检测。表达细胞特异性Ca²⁺受体的转染细胞系可以提供一种专门对例如破骨细胞或肾小球细胞的Ca²⁺-敏感机制起作用的分子进行高产率筛选的方法。

在另一方法中，通过在真核细胞中表达可以对钙受体进行克隆。例如，可以由甲状旁腺mRNA制备cDNA库，并将该库克隆到真核表达载体pCDNA1中。来自这个库的亚库可以被转染到诸如COS7或HEK293细胞之类的真核细胞中，这些真核细胞导致已编码的cDNA序列较高水平的瞬时表达。用功能钙受体克隆转染的细胞将表达能被钙、新霉素或其他模拟钙化合物活化的钙受体。若细胞首先载有[Ca²⁺]_i的萤光指示剂，则钙受体的活化导致萤光增加。因此，含钙受体库的亚库可以在转染到真核细胞中时，利用它们诱导钙或模拟钙特异性萤光增加的能力进行确定。可以使用萤光计或萤光活化细胞分拣器（FACS）测定其萤光。

在另一种方法中，可以用所产生的抗该受体的单克隆抗体克隆Ca²⁺受体。单克隆抗体提供了免疫亲合性纯化特殊蛋白质的强有力的工具。一旦纯化，就可以从有意义的蛋白质得到已限定的氨基酸序列资料，并且该资料用于设计低核苷酸序列探针，以筛选完整cDNA序列的克隆。

为生产杂交瘤，使用整个牛的甲状旁腺细胞作免疫原。根据已建立的方法，得到纯化的分散细胞，并且将活细胞制剂腹膜内注射到适当的老鼠种内。对于免疫程序和生产杂交瘤来说要遵照标准方案。用两步筛选法确定分泌可识别Ca²⁺受体的单克隆抗体的杂交瘤。开始筛选将确定那些可识别甲状旁腺细胞表面抗原的单克隆。然后用免疫组织化学技术筛选杂交瘤上清液，以挑选出存在与甲状旁腺细胞表面结合的老鼠抗体的那些上清液。这种筛选在甲状旁腺组织的固定切片上进行，或者在一级培养物中的分散细胞上进行。文献中已经很好地建立了这种检验技术。

这种筛选将确定产生对各种细胞表面决定子的单克隆抗体的杂交瘤，并且可以预料对Ca²⁺受体具有特异性的单克隆只包括它们的小亚群。要确定与Ca²⁺受体结合的单克隆抗体，就要对在开始筛选时实验证明呈阳性的杂交瘤上清液进行分析，以分析其阻断培养的甲状旁腺细胞对Ca²⁺受体兴奋剂响应的能力。可以预料一些与胞外区域中的受体结合的抗体能够抑制或活化配体结合，或者反过来干扰或影响受体活化。

通过Western印迹法、免疫沉淀和免疫组织化学法表征在两种筛选中呈阳性的单克隆抗体。这样就决定了所识别的抗原的大小及其组织分布。然后依据标准技术，将适宜的单克隆抗体用于免疫亲合色谱法纯化Ca²⁺受体蛋白质。得到足够量的蛋白质就能确定有限的氨基酸顺序。然后根据肽序列信息可以设计变性的低核苷酸探针。再利用这些探针筛选Ca²⁺受体的全长克隆的甲状旁腺cDNA库。在卵母细胞系统中和在培养的哺乳动物细胞系中，利用DNA序列和功能表达可以表征所得到的克隆。

另外一方面，可以使用该抗体筛选诸如在λgt11中的cDNA之类的表达库或其等同物，以确定表达抗原性反应蛋白质的那些克隆。然后可以排出这些克隆的序列，以确定它们是否能够编码也许是Ca²⁺受体的蛋白质。

本技术领域的专业人员还应该知道，可以用噬菌体显示库克隆和分析钙受体而不是单克隆抗体。在这些库中，抗体的可变区或随机的肽漫无目的的克隆到噬菌体表达载体中，以致抗体区或肽在噬菌体粒子表面上显示出来。显示能高度专一结合到钙受体上的抗体区或肽的噬菌体将结合到显示这些受体的细胞上（例如甲状旁腺细胞、C-细胞、破骨细胞等）。可以拍摄到数百万这种噬菌体（包括结合到钙受体上的那些噬菌体），它们对抗这些仅仅选择可结合到这些细胞上的那些噬菌体的细胞类型。以这种方式可以极大地降低库的复杂性。随后，前面有关单克隆抗体的筛选可用于分离能显示结合钙受体的抗体或肽区域的噬菌体。这些噬菌体可用于分离用于结构鉴定和克隆目的的钙受体。制备这种噬菌体显示库的药盒在市场上是可以买到的（例如，Stratacyte，或Cambridge  Antibody  Technology  Limited）。被赋予这种结合钙受体性质的重组噬菌体还可以代替单克隆抗体用于各种钙受体分析中。在高产率结合竞争筛选中，也可以使用这种噬菌体以确定能够与钙受体功能结合的有机化合物，这些化合物可以作为结构引导，来研究作用于钙受体的人体治疗方法。

在另一种情况下，如Pilch & Czech（1 Receptor Biochem，Methodol.161，1984）所述，放射配体与它们的受体的亲合交联可用于分离受体蛋白质。放射配体的共价连接物使得能够充分洗涤以除去非特异性结合物。例如，将高亲合性分子如精氨酸与酪氨酸的随机共聚物（MW＝22K，精氨酸与酪氨酸之比为4∶1）（它能够迁移胞内Ca²⁺，EC₅₀为约100nM或更少），用¹²⁵I碘化，并且交联。如Dottavio-Martin & Ravel（87 Analyt.Biochem 562，1978）所描述的，鱼精蛋白因其小得多而在交联研究中是更可取的，并且烷基化可能被降低。

在未标记的多价、二价和三价阳离子存在下，非特异性标记因交联作用而保持在最低。这些分子在浓度高时，其标记物与该细胞表面的非特异性相互作用可能被减少。

应用

用高钙血和升高水平的循环PTR表征原发性副甲状腺机能亢进（HPT）。HPT中主要缺陷之一表明是甲状旁腺细胞对胞外Ca²⁺的负反馈调节的灵敏度降低。因此，在患有原发性HPT的病人组织中，胞外Ca²⁺的“设定点”向右移动，这样就需要高于正常浓度的胞外Ca²⁺来抑制PTH分泌。而且，在原发性HPT中甚至高浓度的胞外Ca²⁺也常常只是部分抑制PTH分泌。在继发性（尿毒症）HPT中，观察到胞外Ca²⁺设定点的类似增加，尽管对于这种增加来说Ca²⁺抑制PTH分泌的程度是正常的。PTH的分泌通过[Ca²⁺]_i变化而平行变化：胞外Ca²⁺诱导的[Ca²⁺]_i增加的设定点向右移动，并且这种增加幅度降低。而且，在腺瘤和增生的甲状旁腺细胞中，具有识别Ca²⁺受体的单克隆抗体的组织染色被降低。

Ca²⁺受体构成了药理干预用的分离的分子实体。模拟或对抗胞外Ca²⁺作用的分子在长期治疗原发和继发性HPT方面都是有益的。这种分子提供了需要抑制只是高钙血条件不能达到的PTH分泌的附加刺激。这种比胞外Ca²⁺有更高效能的分子可以战胜在腺瘤组织中特别困难的表观不能抑制PTH分泌的组分。另外，这种分子可以抑制PTH的合成，正如所表明的延长高钙血以抑制牛和人腺瘤甲状旁腺组织中的prepro PTH mRNA水平。延长高钙血也抑制体外甲状旁腺细胞增生，这样模拟钙在限制继发性HPT的甲状旁腺细胞增生特性方面也可能是有效的。

体内其他细胞可以直接对胞外Ca²⁺浓度的生理变化响应。甲状腺（C-细胞）中由类卵泡细胞分泌降钙素是通过胞外Ca²⁺浓度变化调节的。同PTH分泌一样，由肾中肾小球细胞分泌血管紧张肽原酶通过胞外Ca²⁺浓度增加而被抑制。胞外Ca²⁺引起这些细胞中胞内Ca²⁺的迁移。已分离的破骨细胞对胞外Ca²⁺浓度的增加产生响应，后者伴随着相应的[Ca²⁺]_i增加，[Ca²⁺]_i相应增加部分是由于胞内Ca²⁺迁移造成的。破骨细胞中[Ca²⁺]_i增加是与和甲状旁腺细胞中PTH分泌类似的功能响应（骨吸收）的抑制作用相关的。因此，有足够迹像表明，除了作为胞内信号的普遍作用之外，Ca²⁺还可作为细胞外信号调节某些特殊细胞的响应。本发明的分子可用于治疗与这些细胞中已中断的Ca²⁺响应相关的疾病。

在甲状旁腺细胞和其他细胞上克隆Ca²⁺受体将允许在其他细胞中存在同种蛋白质以直接进行检验。于是可以得到一组结构类似的Ca²⁺受体蛋白质。这种受体将使得能够理解到这些细胞如何检验胞外Ca²⁺，并且能对在本文所描述的有效治疗HPT、骨质疏松和高血压，以及其他涉及骨和矿物质的疾病新的治疗方面作为治疗作用位点的机制作出评价。

其他应用在上面已有讨论。例如，在治疗中可以使用重组Ca²⁺受体蛋白质，并且该蛋白质可通过标准方法（如转染编码那种蛋白质的核酸）引入。此外，这种蛋白质在本发明模拟钙分子的检验方面是有用的。

下面的实施例说明本发明但不限制其范围。

实施例

在这里叙述的研究工作中，发现许多有机分子都能迁移细胞外Ca²⁺和抑制甲状旁腺细胞中PTH分泌。这些分子在结构上是不同的，但大多数在生理PH条件下具有净正电荷。有机分子的阳离子性质起着重要的作用，但不是决定活性的唯一因子。

实施例1：在牛甲状旁腺细胞上筛选模拟钙分子

在Percoll梯度柱上纯化已离解的牛甲状旁腺细胞，并在无血清培养基中培养过夜。接着使这些细胞载带fura-2，和萤光法测定游离细胞内Ca²⁺的浓度。利用[Ca²⁺]_i变化筛选在Ca²⁺受体上具有活性的分子。考虑到模拟钙，要求分子显示出由于细胞外Ca²⁺增加所引起的，并由Ca²⁺受体活化所触发的正常效应。这就是：

1）该分子必须在没有细胞外Ca²⁺时持续地诱发[Ca²⁺]_i增加（证明细胞内Ca²⁺迁移）;

2）该分子必须引起异丙基肾上腺素刺激的环形AMP形成的降低，该形成被百口咳毒素阻断;

3）该分子必须抑制在引起[Ca²⁺]_i增加的相同浓度范围内PTH分泌。

4）由该分子引起的Ca²⁺迁移和PTH分泌浓度响应曲线必须由诸如肉豆蔻酸醋酸佛波醇酯（PMA）之类的PKC活化剂将其向右移动。

试验过在结构上不同的几类分子：聚胺、氨基糖甙抗菌素、鱼精蛋白和赖氨酸或精氨酸的聚合物。这些分子的结构绘于图1。图1中包括分子的净正电荷和引起牛甲状旁腺细胞中细胞内Ca²⁺迁移的EC'₅₀。

一般而论，分子的净正电荷越大，则引起细胞内Ca²⁺迁移的能力也越大。但是已发现，正如下面所讨论的，这种表现规律有一些很例外。

由图可以看到，在载带fura-2的牛的甲状旁腺细胞中，精胺、新霉素B和鱼精蛋白引起[Ca²⁺]_i的快速、瞬时增加（图6、7、11）。然而，它们不能引起在牛的甲状旁腺细胞中持续稳定的[Ca²⁺]_i增加（图6、11），尽管它们在人体甲状旁腺细胞中也引起增加（图19）。在这方面，它们类似于由细胞外Mg²⁺引起的细胞溶质Ca²⁺的响应，Mg²⁺引起在牛细胞中因细胞外Ca²⁺流入而未伴随的细胞内Ca²⁺的迁移（图11b）。由精胺、新霉素B或鱼精蛋白引起的瞬时[Ca²⁺]_i增加不会被低浓度（1μM）La³⁺或Gd³⁺阻断（图11f、g）。在没有细胞外Ca²⁺时，该分子聚阳离子引起细胞溶质Ca²⁺瞬变状态持续下去，但用伊屋诺霉素预处理而减少Ca²⁺的细胞贮存物时则被阻断（图7，11h，i）。因此，所有这些分子都能引起在甲状旁腺细胞中细胞内Ca²⁺的迁移。

另外还表明，该分子聚阳离子迁移细胞内Ca²⁺的相同库，如由细胞外Ca²⁺使用的那样。因此，提高细胞外Ca²⁺浓度逐渐抑制由精胺引起的[Ca²⁺]_i瞬时增加（图6）。反之，精胺或新霉素B的最大有效浓度（图12）阻断由细胞外Ca²⁺引起的瞬时但不是稳定态[Ca²⁺]_i增加。

有意义地，精胺、新霉素B和鱼精蛋白抑制PTH分泌的程度与细胞外Ca²⁺相同。这些对分泌的抑制作用是以引起细胞内Ca²⁺迁移的浓度得到的（图8、13）。这些发现是与对细胞外Ca²⁺调节PTH分泌的作用机制的认识有关的。因为各种无机聚阳离子都抑制分泌，而只有细胞外Ca²⁺引起持久、稳定态的[Ca²⁺]_i增加，所以这样的[Ca²⁺]_i增加不可能与分泌调节很有关。细胞内Ca²⁺的迁移，而不是细胞外Ca²⁺流入，才是与抑制PTH分泌相关的重要机制。这是重要的，因为如分子是影响PTH分泌的话，则它确定了充分影响机制;选择性地刺激流入细胞外Ca²⁺的分子，相对地在抑制PTH分泌方面则是无效的。反过来，只是引起细胞内Ca²⁺迁移的分子，在抑制PTH分泌方面正好与细胞外Ca²⁺一样有效。

正象由细胞外Ca²⁺引起细胞内Ca²⁺的迁移一样，分子聚阳离子引起的这种迁移受到PMA的抑制。图14示出了一个有代表性的试验，该试验表明PMA对由精胺引起的细胞溶质Ca²⁺瞬变状态的优先抑制作用。由ATP引起的细胞溶质Ca²⁺瞬变是不受影响的，甚至使用次最大浓度的ATP也是如此。PMA对由其分子聚阳离子引起的细胞溶质Ca²⁺瞬变状态的影响与它对细胞外Ca²⁺的响应的影响是并行的;在这两种情况下，浓度响应曲线向右移动（图15）。因增强对有机聚阳离子较高浓度所克服的分泌作用的影响而伴随有PMA对[Ca²⁺]_i的抑制作用（图16）。

由分子聚阳离子引起的细胞内Ca²⁺的迁移与肌醇磷酸酯生成增加相关。例如，鱼精蛋白引起因IP₁水平提高而伴随生成IP₃的快速（30秒内）增加。这两种作用都取决于细胞外鱼精蛋白的浓度（图17）。因此，PMA的预处理钝化了由分子聚阳离子引起的肌醇磷酸酯的生成。用精胺得到的有代表性的结果列于图18。

精胺、新霉素B和鱼精蛋白抑制异丙基肾上腺素诱发的环状AMP的增加。类似细胞外Ca²⁺对环状AMP生成的抑制作用，由分子聚阳离子引起的那些作用被百口咳毒素预处理所阻断（表2）。

表2

环状AMP(对照的%)

对照 +PT_×

0.5mM Ca²⁺100 106±8

2.0mM Ca²⁺19±4 94±2

0.5mM Ca²⁺,200μM精胺 23±5 93±6

0.5mM Ca²⁺,30μM新霉素B 28±8 87±6

0.5mM Ca²⁺,2μg/ml鱼精蛋白 20±4 89±9

百日咳毒素（PT_X）阻断细胞外Ca²⁺和分子聚阳离子对环状AMP的抑制作用。牛的甲状旁腺细胞在有或没有100ng/ml百日咳毒素的情况下培养16小时。接着洗涤这些细胞，并在有或没有指定浓度的细胞外Ca²⁺或分子聚阳离子情况下，用10uM异丙基肾上腺素培养15分钟。用RIA法测定了总环状AMP（细胞十上清液），其结果是以0.5mM Ca²⁺得到的水平百分数表示的（112±17p mole/10⁶细胞）。

每个值是三次试验的平均值±SEM。

在人体甲状旁腺细胞中，除了快速瞬时增加外，细胞外Mg²⁺还引起持续、稳定态[Ca²⁺]_i的增加（图10）。如相应于细胞外Ca²⁺在牛甲状旁腺细胞中一样，在人体甲状旁腺细胞中Mg²⁺引起的稳定态[Ca²⁺]_i增加是由于Ca²⁺通过对电压不灵敏通道流入造成的（图10a）。Mg²⁺对人体甲状旁腺细胞中稳定态[Ca²⁺]_i的这种影响在腺瘤和增生组织中都可以见到。

曾试验过新霉素B和鱼精蛋白对由腺瘤组织制备的人体甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的影响。新霉素B的有代表性的试验结果示于图19。新霉素B在人体甲状旁腺细胞中不仅引起瞬时的，而且还引起稳定态[Ca²⁺]_i的增加（图19a）。因此，在人体细胞中，由胞外Ca²⁺、Mg²⁺或新霉素B引起的[Ca²⁺]_i变化图样是非常相似的。

由新霉素B引起的细胞溶质Ca²⁺瞬变在La³⁺（1μM）存在下并且无胞外Ca²⁺时都是持续的。这样，新霉素B引起人体甲状旁腺细胞中细胞内Ca²⁺的迁移。新霉素B在能引起细胞内Ca²⁺迁移的浓度下抑制人体甲状旁腺细胞的PTH分泌（图13）。然而，人与牛的甲状旁腺细胞对新霉素B的响应有一些差别。对于细胞内钙的迁移来说，新霉素B的EC₅₀在牛中为40μM，在人体甲状旁腺细胞中为20μM（参见图13和15）。而精氨的效能在牛和人的甲状旁腺细胞中是相似的（EC₅₀＝150μM）。因此，尽管牛细胞可以用作筛选活性试验分子的初步研究工作，但重要的是用人的甲状旁腺细胞进行继续研究。

为了检验分子聚阳离子对C-细胞的影响，使用了由老鼠神经甲状腺癌得到的赘生性细胞株（rMTC 6-23细胞）。精胺（10μM）和新霉素B（5mM）对这些细胞中基本[Ca²⁺]_i没有影响。这两种分子也不影响对后来添加的细胞外Ca²⁺的响应。图21示出有关缺少新霉素B作用的代表性结果。新霉素B（1mM）或精胺（1或5mM）没有诱发破骨细胞中任何[Ca²⁺]_i的增加（图23）。有点迹象显示，对细胞外Ca²⁺浓度相继增加的响应似乎有些加强，尽管这不是一种始终如一的发现。在这两种细胞中，精胺（5mM）也是对基本[Ca²⁺]_i没有影响，并且对细胞外Ca²⁺诱导的[Ca²⁺]_i增加引起小小的抑制（约15%）。在第三种细胞中，新霉素B（5mM）对基本[Ca²⁺]_i没有影响，也不影响由细胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。由这些研究工作展示出总图画是，精胺和新霉素B对破骨细胞中细胞溶质Ca²⁺的基本水平或刺激水平都没有影响。

分子聚阳离子影响C-细胞或破骨细胞的Ca²⁺灵敏机制的失败，证明有能力发现或设计新的引导分子，这种分子专门对甲状旁腺细胞Ca²⁺受体起作用，或者调节甲状旁腺细胞对[Ca²⁺]_i正常响应的一种或多种功能。

下面详细地叙述筛选各种其他的分子，并将结果汇集于表1。

实施例2：聚胺筛选

如实施例1筛选出直链聚胺（精胺、亚精胺、TETA、TEPA和PEHA）以及两种衍生物（NPS381和NPS382）。发现所有这些分子都迁移牛甲状旁细胞中的细胞内Ca²⁺。它们的效能顺序及括号中所列的净正电荷列于如下：

表3

分子 EC₅₀(以μ M为单位)

NPS382  (+8)  50

NPS381  (+10)  100

精胺  (+4)  150

PEHA  (+6)  500

亚精胺  (+3)  2000

TEPA  (+5)  2500

TETA  (+4)  8000

腐胺（+2）和尸胺（+2）在2mM浓度都是失活的。

另一个直链聚胺、DADD与其他聚胺的表现稍有差异，在实施例7中予以叙述。

实施例3：环状聚胺的筛选

按实施例1筛选了两种环状聚胺，hexacyclen和NPS383。Hexacyclen（+6，EC₅₀＝20μM）比NPS 383（+8，EC₅₀＝150μM）强7倍。希望是这种转变（converse）完全基于净正电荷作为Ca²⁺受体活性的结构特征。

实施例4：氨基糖甙抗生素筛选

按实施例1筛选六种抗生素。

细胞内Ca²⁺迁移的最终EC₅₀，按效能顺序排列是：

表4

抗生素 EC₅₀(以μ M为单位)

新霉素  (+6)  10

庆大霉素  (+5)  150

卡那霉素B(+5)  200

链霉素(+3)  600

卡那霉素（+4，5）和林可霉素（+1）在浓度为500uM时没有作用。在氨基糖甙系列中，净电荷与效能之间有一种相关性。然而，新霉素比其他正电荷相同或大些的聚胺（NPS381、NPS382、NPS383、PEHA）强得多。

实施例5：肽和聚氨基酸筛选

鱼精蛋白和赖氨酸或精氨酸的按肽长度而改变的聚合物，按照实施例1以它们迁移细胞内Ca²⁺的能力进行筛选。所得到的细胞内Ca²⁺迁移EC₅₀，按效能顺序排列如下：

表5

肽(以KD计MW) EC₅₀(以mM为单位)

polyArg  (100)  4

polyArg  (40)  15

polyLYS  (27)  30

鱼精蛋白  (4.8)  75

polyArgTyr  (22)  200

polyLYS  (14)  1000

polyLYS  (3.8)  3000

这些聚合物的净正电荷随MW增加而增加。因此，如对氨基糖甙来说，这组聚氨基酸中净电荷与效能间存在正相关。鱼精蛋白实质上是净正电荷为+21的polyArg。

实施例6：芳烷基胺筛选

按照实施例1叙述的，从黄蜂和蜘蛛毒液衍生的这类芳烷基胺毒素中选择的分子进行筛选。

大头泥蜂gtxz麦青素（Philanthotoxin）-433（+3）在浓度为500μM时无作用。在结构上，它与下面叙述的黄金蛛毒素是相似的。

黄金蛛毒素（Argiotoxin）-636（400μM）没有引起[Ca²⁺]_i增加，但它确实增强了细胞溶质Ca²⁺对后续添加细胞外Ca²⁺的响应。这是可活化Ca²⁺受体的所有分子共同特征，并且对于许多细胞外二价阳离子来说这也都是已知的。在实施例7更详细地说明了这一点。

与黄金蛛毒素-636相反，黄金蛛毒素-659引起[Ca²⁺]_i增加，且EC₅₀为300μM。黄金蛛毒素-659与黄金蛛毒素-636不同在于前者具有羟基化的吲哚单元而不是二羟基苯基基因。这便是这两种分子在结构上的唯一区别。因此，效能的差别在于芳香基的性质，而不在于带正电荷的聚胺链。

实施例7：Ca²⁺通道阻断剂的筛选

Ca²⁺通道阻断剂，也就是阻断细胞外Ca²⁺通过电压敏感的Ca²⁺通道流入的那些分子，按照实施例1筛选上述阻断剂。Ca²⁺通道阻断剂有三种结构类型：（1）二氢吡啶，（2）苯烷基胺和（3）benzothiazipine。

所试验的二氢吡啶（硝苯吡啶、硝吡乙甲酯、BAY K 8644，和（-）202-791和（+）202-791）在1μM进行试验时，没有一个对基本[Ca²⁺]_i或细胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加有任何影响。以前的研究工作表明，甲状旁腺细胞缺少电压敏感Ca²⁺通道，但确实具有受Ca²⁺受体调节的电压不敏感Ca²⁺通道。

所试验的苯烷基胺是戊脉安、D-600（戊脉安的甲氧基衍生物）、TMB-8及TMB-8类似物、NPS384。前三种分子试验浓度为100μM。苯烷基胺的行为与其他的所研究分子不同。它们加到处于含有低浓度细胞外Ca²⁺的缓冲溶液的细胞时则没有引起[Ca²⁺]_i的变化。但是戊脉安、D-600和TMB-8增强了由细胞外二价阳离子引起的细胞内Ca²⁺的迁移，它们还阻断了细胞外Ca²⁺流入。当细胞外Ca²⁺处于中等水平（1-1.5mM）时，这些分子能引起由细胞内Ca²⁺迁移造成的小而强的[Ca²⁺]_i增加。

苯烷基胺的作用不同于有机聚阳离子，如新霉素。其数据表明，戊脉安、D-600和TMB-8在Ca²⁺受体附近是部分激动剂，而相反地，其他所研究的分子是完全激动剂。

浓度为300μM的分子NPS384不引起[Ca²⁺]_i增加，但它阻断细胞外Ca²⁺流入。以更高浓度试验有可能揭示这种分子具有使细胞内Ca²⁺迁移的能力。

这些分子阻断流入的能力是有迷惑力的，而且并非是完全意想不到的，这些分子引起[Ca²⁺]_i瞬时增加的能力（由于细胞内Ca²⁺迁移的结果）是重要的。

测定甲状旁腺细胞中的[Ca²⁺]_i的大量试验表明，[Ca²⁺]_i瞬时增加几乎肯定地是由于细胞内Ca²⁺迁移的结果，因而反应了Ca²⁺受体的活化作用。

所研究的benzothiazipine、硫氮苯酮在各个方面与戊胺安和D-600都是相近的，而且在100μM也是有效的。

应该指出的是，除苯烷胺外，上面试验的所有活性分子引起[Ca²⁺]_i增加幅度与最大有效浓度的细胞外Ca²⁺所引起的是相近的。这表明这些分子同细胞外二价阳离子是同等有效的。这一点与似乎只起部分激动剂作用的苯烷基胺活性相反。

在苯烷基胺中，出现了一些有意义的结构一活性关系式。像TMB-8和NPS384分子效能差别很大。100μM的TMB-8增强瞬时[Ca²⁺]_i增加，而NPS384甚至300μM都没有这种增强作用，而这些分子都携带相同的净正电荷。由此得出，一些其他的与净电荷无关的结构特征赋予TMB-8更大的效能。

实施例8：在人体甲状旁腺细胞上的分子筛选

试验过精胺和新霉素对由外科手术取出的甲状旁腺得到并按实施例1制备的人体甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i的影响。在人的甲状旁腺细胞中，发现精胺试验浓度为300μM时只引起[Ca²⁺]_i稍稍增加。

另一方面，新霉素的试验浓度为20μM时引起人的甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i很大增加。由新霉素得到的响应幅度与由最大有效浓度的细胞外Ca²⁺得到的是相等的。

实施例9：在非洲蟾蜍属卵母细胞上的分子筛选

用人的甲状旁腺细胞的mRNA注入的卵母细胞表达Ca²⁺受体，并且应随各种细胞外无机二价和三价阳离子而迁移细胞内Ca²⁺。人们用这种筛选法试验直接对Ca²⁺受体的作用。表达Ca²⁺受体的卵母细胞还对如下筛选时完整甲状旁腺细胞上的几种活化分子有响应。浓度为135μM时，Hexacyclen引起细胞内Ca²⁺的迁移。新霉素（100μM）和NPS382（5mM）也是有效的。这就提供相当有力的证据说明这些分子在Ca²⁺受体上起作用，或者在与其功能密切相关的一些其他蛋白质上起作用。

例如，我们已能够由测量⁴⁵Ca²⁺迁移来探测卵母细胞中Ca²⁺受体的表达。在这些实验中，用牛的甲状旁腺mRNA或水注入卵母细胞，并在72小时后与血清或10mM新霉素接触。在接受刺激之前，卵母细胞吸收⁴⁵Ca²⁺。用血清刺激20分钟导致细胞内⁴⁵Ca²⁺释放增加45%（与用缓冲液典型刺激相比）。用10mM新霉素刺激20分钟导致⁴⁵Ca²⁺释放增加76%。该试验在克隆Ca²⁺受体的应用方面是足够灵敏的，并且具有的优点是比Cl^-流活化的电生理测量有更高的通过量。

在另外的实施例中，人体破骨细胞瘤组织是由骨的活体解剖组织得到的。使用由这种组织分离出的mRNA注入的卵母细胞用30mM Ca²⁺刺激。对照没有响应，而用破骨细胞瘤mRNA注入的12个卵母细胞中有8个适当响应（图34）。这些实验提供第一个证据，即事实上一般破骨细胞对细胞外Ca²⁺的Ca²⁺响应被编码。该结果还表明，破骨细胞Ca²⁺受体可通过非洲蟾蜍属卵母细胞中的表达克隆。

实施例10：在老鼠破骨细胞上的分子筛选

然而，甲状旁腺细胞和破骨细胞对细胞外Ca²⁺的不同灵敏度表明，它们的Ca²⁺受体是不同的。当甲状旁腺细胞相应于细胞外Ca²⁺浓度为0.5-3mM时，破骨细胞只是细胞外Ca²⁺的水平增加超过5mM时才有响应。对于破骨细胞来说，这种相当高Ca²⁺浓度仍然是生理性的;当它们再吸收骨时，细胞外Ca²⁺的局部浓度可能高达30mM。

用破骨细胞筛选分子按如下步骤实施。由新生鼠的长骨得到了破骨细胞。用萤光法指示剂indo-1测量单细胞中[Ca²⁺]_i。精胺、亚精胺、新霉素和戊脉安已试验过，其中没有一个引起了破骨细胞中[Ca²⁺]_i的任何很大的增加（虽然探测出很小的响应）。

浓度为1mM的亚精胺引起[Ca²⁺]_i很小的增加（是最大的细胞外Ca²⁺浓度所引起的约10%）。无论新霉素（10mM）还是精胺（10或20mM）都没有引起老鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i的增加。新霉素（10mM）没有阻断在后续加入25mM细胞外Ca²⁺所引起的[Ca²⁺]_i增加。然而用精胺（20mM）予处理确实抑制了对细胞外Ca²⁺的响应。戊脉安没有引起可探测到[Ca²⁺]_i的增加，但它确实阻断对细胞外Ca²⁺的响应。

破骨细胞与甲状旁腺细胞之间的比较表明，后者上的活性分子在破骨细胞中是相当无效的。这就证明，以特定Ca²⁺受体为目标，但又不影响其他Ca²⁺-敏细胞上的那些类型受体的药物是容易研制的。同样地，也可研制在二种或二种以上这种Ca²⁺受体上具有活性的药物。

其他Ca²⁺受体实施例

下面的实施例证明，正如分子配位体有亚型受体一样，似乎确实也有可能受药物不同影响的Ca²⁺受体亚型。甲状旁腺细胞Ca²⁺受体感受到约1.5mM细胞外Ca²⁺的水平，而破骨细胞上Ca²⁺受体在约10mM的水平响应（图22）。新霉素或精胺，活化其甲状旁腺细胞Ca²⁺受体，它们不影响C-细胞或破骨细胞上的Ca²⁺受体（图21和23），这些数据是药理上不同亚类Ca²⁺受体的第一证据，并且这些数据被用来设计和研制对特定类型Ca²⁺受体选择性地起作用的药物。的确，引导分子的试验证明这类细胞特异性作用。例如，NPS-449引起破骨细胞中[Ca²⁺]_i的增加，NPS-449对甲状旁腺细胞中Ca²⁺没有影响。相反地，NPS 447它活化甲状旁腺细胞Ca²⁺受体，只有在10倍高浓度才能有效地活化破骨细胞Ca²⁺受体。最后，agatoxin489尽管在活化C-细胞Ca²⁺受体（EC₅₀＝150μM）方面不是很强，但它是甲状旁腺细胞Ca²⁺受体（EC₅₀＝3μM）很强的活化剂。目前正在研制的引导分子会选择性地影响体内特殊类型Ca²⁺-敏感细胞的活性。

在治疗上必定不希望特异性差的药物。因此，抑制破骨细胞活性和刺激降钙素分泌是抑制骨吸收的两种不同的方法。瞄准这两种细胞上Ca²⁺受体的药物也许是很有效的骨质疏松治疗方案。因为PTH还涉及调节骨代谢，对甲状旁腺细胞Ca²⁺受体起作用的药物在治疗和/或预防骨质疏松方面可能也是有用的。

下面列出某些试验分子的结果。表6列出模拟钙分子的对比活性。牛的甲状旁腺细胞和C-细胞（rMT6-23细胞）载带fura-2，载带indo-1鼠破骨细胞，并且所指定分子迁移细胞内Ca²⁺的效能由绘制的累积浓度-响应曲线决定。试验浓度为1mM时，列为“非活性”的分子没有改变[Ca²⁺]_i。

表6

EC₅₀(μ M)

化合物  甲状旁腺细胞  破骨细胞  C-细胞

NPS568(EE)  0.78  200  >300

NPS568(LE)  30  -  -

NPS467(EE)  2  >100  -

NPS467(LE)  >30  -  -

NPS017  6  无活性  150

NPS447  9  150  -

NPS456^*15 200 >100

NPS015  22  -  无活性

NPS109  40  >300  5

NPS449  无活性  150  -

NPS468^*30 250 -

精胺  150  无活性  无活性

新霉素  40  无活性  无活性

＊消旋混合物，“无活性”定义为浓度为1-5mM时没有引起细胞溶质Ca²⁺的增加;EE是早洗脱的，LE是后洗脱的。

实施例11：甲状旁腺Ca²⁺受体的引导分子

用聚胺和芳烷基胺进行的结构-活性研究导致结构上与NPS456相似的分子的试验。NPS456是一种甲状旁腺细胞Ca²⁺受体的强活化剂。这种分子是值得注意的，因为它只有一个正电荷，然而它比许多多碱基分子强得多。用PMA简单（2分钟）预处理能使NPS456的浓度-响应曲线向右移动。这表明NPS456通过由细胞外Ca²⁺的相同机制起作用。NPS456引起表达甲状旁腺细胞Ca²⁺受体的非洲蟾蜍属卵母细胞中细胞内Ca²⁺迁移，这证明对Ca²⁺受体直接起作用（图33）。因此，NPS456含手征性碳，因而有两种同分异构体存在。曾合成这两种同分异构体，并对活性作了研究。R-同分异构体，NPS447，比S-同分异构体NPS448，强12倍（图28）。这是Ca²⁺受体可以以立体特异性方式识别有机分子的第一证据。

因为NPS447是一种对甲状旁腺细胞Ca²⁺受体具有选择性强影响的一种结构简单分子，所以围绕这种引导分子所进行的结构-活性研究都是简单的。这些研究的目的就是按照各种特性对有关分子排队，由这些特性可以挑选最后的研制候选者。这种努力已经揭示出一些对活性和效能有贡献的NPS447结构范围。例如，新化合物NPS459是NPS447的类似物，该分子较小（MW＜240），但效力几乎与母体分子一样强，而其他几种类似物相对来说则无活性。将这种类似物设计中最有意义的分子可放入体内实验，对PTH分泌和血清Ca²⁺水平的影响（参见实施例15、16、17、18和23）。

新化合物NPS467是一种甚至比NPS447更小的分子，然而在引起甲状旁腺细胞中的细胞内Ca²⁺迁移方面，前者比后者强约3倍。类似于NPS456，NPS467是一种消旋混合物。可以预料，NPS467折解成其对映体得到一种比消旋混合物效能甚至更大的同分异构体（参见实施例16）。在引起甲状旁腺细胞中细胞内Ca²⁺迁移方面，NPS551是另一种和NPS467一样强的新化合物。NPS551是一种消旋混合物，可以预料，NPS551折解成其对映体，会得到一种比消旋混合物更强的同分异构体。对与NPS447、NPS467、NPS551和NPS568相关分子的结构-活性作进一步研究，可预料会得到一些纯的同分异构体，其效能比它们的消旋物形式的这些分子要更大些。

NPS456得到的结果（图33）表明，浓度为100μM时引起Cl^-流的波动增加。NPS456是在表达甲状旁腺细胞Ca²⁺受体的非洲蟾蜍属卵母细胞上最强的活化分子。用新霉素和NPS456在这种表达系统中得到的结果证明这些分子直接对Ca²⁺受体起作用。

实施例12：破骨细胞Ca²⁺受体的引导分子

用于说明细胞外Ca²⁺对破骨细胞作用机制的策略与被证明在甲状旁腺细胞中有效的策略是相似的。第一个试验研究了La³⁺对载带萤光法指示剂indo-1的单个老鼠破骨细胞中[Ca²⁺]_i的影响。如上所述，三价阳离子如La³⁺是不渗透的，并阻断Ca²⁺流入。低的La³⁺微摩尔浓度部分抑制对细胞外Ca²⁺诱导的[Ca²⁺]_i增加（图29）。La³⁺阻止[Ca²⁺]_i增加的行为提供了细胞外Ca²⁺迁移的证据。这些实验结果类似于甲状旁腺细胞中得到的结果，并且表明细胞外Ca²⁺通过类似的机制调节这两类细胞中的[Ca²⁺]_i。

另一系列试验表明，细胞外Mn²⁺引起没有细胞外Ca²⁺时仍持续（图30B）的瞬时[Ca²⁺]_i增加（图30（a））。这些结果同样是细胞外Ca²⁺迁移的征兆。尽管Mn²⁺可能进入一些分子，但不可能在破骨细胞中这样进行，因为Mn²⁺使indo-1萤光猝灭。因此。如果Mn²⁺从细胞内进入，应观察到萤光信号的降低而不是增加。

用许多二价和三价阳离得到的结果与破骨细胞表面上有Ca²⁺受体是完全一致的，这与细胞内Ca²⁺迁移和细胞外Ca²⁺通过对电压不敏感通道流入相关。结果展现了在人的破骨细胞中Ca²⁺为受体蛋白质编码的遗传物质的证据。由于细胞内Ca²⁺迁移而瞬时增加的[Ca²⁺]_i，足以抑制体外破骨细胞的骨吸收。因此，如同甲状旁腺细胞一样，Ca²⁺受体的活化作用似乎是抑制破骨细胞活性的可行方法。

目前，NPS449是这种受体上模拟钙药物的引导分子。它是一个小分子（MW＜425），EC₅₀为200μM时它迁移老鼠破骨细胞中的细胞内Ca²⁺（图31A和31B）。尽管NPS449的效能是相当低，但它的结构简单，只有一个正电荷，预料它具有所要求的药效学和药物动力学的特性。

曾研究NPS449抑制体外骨吸收的能力。曾用扫描电子显微镜形态分析牛皮层骨的薄切片的斑点形成来研究其能力。老鼠破骨细胞在有或没有各种浓度NPS449的情况下在骨薄切片中培育24小时。IC₅₀为10μM，NPS449引起与浓度相关的骨吸收抑制作用。预期的结果提供了第一证据。在这个新位点起作用的分子可以抑制破骨细胞的骨吸收。用化学合成方法可得到更强的NPS449类似物，并用本文叙述的方法进行试验和分析。

实施例13。C-细胞Ca²⁺受体引导分子

C-细胞Ca²⁺受体的活化作用刺激降钙素分泌，而降钙素在破骨细胞上起抑制骨吸收的作用。选择性地影响C-细胞的模拟钙药物在治疗骨质疏松方面是有用的。

细胞内Ca²⁺的迁移作用可用作Ca²⁺受体活性的功能指数。由于可得到表达C-细胞表现型的已培养的细胞系（例如，老鼠髓甲状腺癌细胞，rMTC6-23细胞），因而有利于在C-细胞中的筛选工作。初始研究选择了三种芳烷基胺分子。两种是自然存在的（agatoxin489和agatoxin505），另外（NPS 019）是合成的agatoxin类似物。发现agatoxin 505的IC₅₀为3μM时阻断细胞外Ca²⁺诱导[Ca²⁺]_i增加，其抑制作用是由于在这些细胞中存在的L-型电压敏感Ca²⁺通道阻断的结果。相反地，发现agatoxin 489的EC₅₀为150μM时迁移rMTC细胞中的细胞内Ca²⁺。这是第一个发现活化C-细胞Ca²⁺受体的有机分子。其合成的类似物（NPS 019）甚至是更强的，并且以EC₅₀为5μM迁移细胞内Ca²⁺。有意义的是，NPS 019与agatoxin 489的唯一结构差别是羟基存在与否。结构上的这种细微差别深深地影响分子的效能，这一事实表明在Ca²⁺受体上有结构特异的结合位点。同样，这就鼓励了这种观点，即可以研制很强、选择性很好的Ca²⁺受体活化剂。

NPS 019是一个小分子（MW＜500），是研制C-细胞Ca²⁺受体的模拟钙的引导分子，可以试验它在体外刺激降钙素分泌的能力。接着体内试验决定这种分子刺激降钙素分泌和抑制骨吸收的能力。这些体内研究工作是用老鼠进行的。这些研究工作得到的结果预料是积极的，这些结果提供了第一证据，说明在新的受体上起作用的小有机分子可能刺激降钙素的分泌和抑制骨吸收。

实施例14  甲状旁腺细胞上NPS  021的溶解钙活性

对于看作是模拟钙的一种化合物来说，它应该阻断细胞外Ca²⁺或模拟钙化合物对细胞外Ca²⁺敏感细胞的作用。模拟钙化合物的一个例子是NPS021，它的结构于图1中。在载带fura-2的牛的甲状旁腺细胞中，NPS021阻断由细胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。NPS021阻断这种响应的IC₅₀是约200μM并且浓度约500μM时，细胞外引起的[Ca²⁺]_i增加消失。在低[Ca²⁺]（0.5mM）时，NPS021明显地本身不引起[Ca²⁺]_i的任何改变（图37）。

实施例15：NPS467降低血清离子化钙

对于体内低钙血活性来说，试验了显示活化体外牛甲状腺细胞Ca²⁺受体的化合物。在接受试验物质或对照载体之前，雄性Spraque-Dawly鼠（200克）保持低钙饮食一个星期，在腹膜内注入NPS467后三小时从尾部静脉采血。使用Ciba-Corning 634 Analyzer按照该仪器提供的说明书测量全部血液或血清中的离子Ca²⁺。利用本技术领域所熟知的技术测量血清总钙、白蛋白和磷酸盐。

NPS467引起血清或全部血液钙的剂量依赖性降低（图38）。这时血液Ca²⁺降低与血液总钙水平成比例降低是平行的。血清白蛋白或磷酸盐水平在所研究的任何剂量下都没有变化。初步研究工作中，NPS467以降低血液Ca²⁺的有效剂量引起PTH循环水平的剂量依赖性降低（图39）。三小时内NPS467的低钙血作用最大，在24小时后又回到对照水平（图40）。

在以正常的，补足了钙的饮食喂的老鼠中，NPS467（EE同分异构体，参见实施例16）在降低血清离子Ca²⁺方面是有效的。NPS467单次剂量（EE同分异构，10mg/Kg i.p.）引起血清离子Ca²⁺水平迅速降低，1小时时最大（22%，从对照水平降低）并且最高到6小时都仍降低到或接近这个水平。

实施例16：NPS467以立体特异方式降低血清离子钙

NPS467是消旋混合物。在手征性柱上将NPS467析解成两个对映体。如按引起甲状旁腺细胞中[Ca²⁺]_i增加的对映体能力检测，在活化体外牛甲状旁腺细胞的Ca²⁺受体方面，EE-同分异构体（“早洗脱”参见实施例21）比LE-同分异构体（“后洗脱”）强约100倍（图41）。同样地，将新的化合物NPS568同样折解成其对映体，在牛的甲状旁腺细胞中引起细胞内Ca²⁺迁移方面，EE-同分异构体比LE-同分异构体强40倍。（参见表6，supra）。

按照实施例15研究了NPS467的同分异构体对血清Ca²⁺的影响。与体外的结果一致，在体内降低血清Ca²⁺方面，EE-同分异构体或NPS467证明是比LE-同分异构体强（图42，每种化合物的试验浓度为5mg/Kg体重）。

实施例17：NPS467降低体内继发性副甲状腺机能亢进模型中的血清离子钙

广泛采用的由慢性肾损坏造成的继发性副甲状腺机能亢进的动物模型是肾切除5/6的老鼠。接受这种外科学术的动物开始是低钙血，并且为保持血清Ca²⁺的水平，甲状旁腺补尝性增生，循环的PTH水平升高。雄性Sprague-Dawley老鼠（250克）接受5/6肾切除，并让其恢复2星期。在此期间它们血钙正常（由于血清PTH水平升高）。在继发性副甲状腺机能亢进的动物模型中，服用NPS467（EE同分异构体，10mg/Kg i.p.）引起血清离子Ca²⁺水平快速（2小时内）降到对照的83%。这表明，这类化合物有效地抑制患有继发性副甲状腺机能亢进和甲状旁腺增生病人的PTH分泌。

实施例18：NPS467不能在甲状旁腺切除的动物中降低血清离子钙水平

为了确定NPS467在上面作用引起低钙血响应的初级目标组织，用外科切除方法除去老鼠中的甲状旁腺。接受完全切除甲状旁腺的动物成为低钙血，它们主要依靠每日规定摄取的钙保持血清Ca²⁺的体内平衡。甲状旁腺切除的动物的血清离子Ca²⁺水平为0.92mM，在绝食6小时后逐渐降到0.76mM。在6小时里，服用单剂量的NPS 467 EE（10mg/Kg i.p.）对血清离子Ca²⁺水平没有引起任何改变。这些结果证明，NPS467的低钙血作用需要完整的甲状旁腺。这些数据还证明，NPS467 EE可以把体内的甲状旁腺作为目标。这些结果和下述看法是一致的，即NPS467 EE在体内的甲状旁腺细胞Ca²⁺受体上起作用。以抑制PTH的分泌，因而引起血清离子Ca²⁺水平降低。

实施例19：NPS467在人的甲状旁腺中增加细胞内钙

由原发性副甲状腺机能亢进病人经外科手术得到的甲状旁腺而制备分离的甲状旁腺细胞。使这些细胞载带fura-2，并按上述方法测定[Ca²⁺]_i。NPS467 EE和NPS568 EE这两者都引起浓度依赖性[Ca²⁺]_i增加。NPS467 EE和NPS568的EC'₅₀分别是20μM和3μM。这两种化合物都能增加人的生理组织中的[Ca²⁺]_i，因此希望能在原发性副甲状腺机能亢进病人中降低血清PTH和Ca²⁺水平。

实施例20：NPS467在甲状旁腺细胞钙受体上的作用机制

分离的牛甲状旁腺细胞用于进一步揭示NPS467在受体水平上的作用机制。在0.5mM细胞外Ca²⁺存在下，NPS467EE引起快速瞬时[Ca²⁺]_i增加，该增加在1μM La³⁺存在下持续，并且用PMA预处理（100nM，2分钟）可部分地抑制。因此，NPS467（EE同分异构体，30μM）引起用甲状旁腺细胞mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-的传异的快速增加。所有这些结果都是与NPS467对Ca²⁺受体的作用一致的。但是，当甲状旁腺细胞悬浮于无Ca²⁺的缓冲液中时，则细胞质Ca²⁺对NPS467的响应被消除。这表明，NPS467本身不能引起细胞内Ca²⁺的迁移。然而，在有少量细胞外Ca²⁺时，它确实引起甲状旁腺细胞和卵母细胞中的响应。这表明，NPS467需要部分占有结合Ca²⁺的位点来引起响应。为了对这种假设进行试验，将甲状旁腺细胞悬浮于无Ca²⁺缓冲液中，并与次最大浓度的新霉素接触。使用新霉素是因为它在几乎所有方面都可模拟细胞外Ca²⁺在表达甲状旁腺细胞Ca²⁺受体的甲状旁腺细胞和非洲蟾蜍类卵母细胞上的作用。在这些条件下，加10μM新霉素本身并不引起[Ca²⁺]_i增加。但是，现在再加NPS467 EE（30μM）引起[Ca²⁺]_i瞬时增加，因为没有任何的细胞外Ca²⁺，这种[Ca²⁺]_i瞬时增加一定是来自于细胞内Ca²⁺的迁移。当无Ca²⁺缓冲液中的细胞与30μM NPS467接触时，则[Ca²⁺]_i没有任何增加。当有细胞外Ca²⁺（0.5mM）时，则NPS467的这个浓度在增加[Ca²⁺]方面是最有效的。但是，现在再加10μM新霉素则引起瞬时的[Ca²⁺]_i增加。估计是，新霉素结合的位点与细胞外Ca²⁺的相同，并且在功能上可以取代细胞外Ca²⁺。使用次最大浓度，它本身不引起任何响应，但达到Ca²⁺结合位点的部分占据，并且使Ca²⁺受体被NPS467活化。

所进行的另外研究工作进一步确定了NPS467的作用机制。将这些细胞再悬浮于无Ca²⁺的缓冲液中以保证观察不到因细胞外Ca²⁺迁移造成的[Ca²⁺]_i增加。然而，在这些试验中，使用了新霉素的最大的有效浓度（100μM）。没有细胞外Ca²⁺时，100μM新霉素引起快速瞬时[Ca²⁺]_i增加。再加30μM NPS467 EE不引起[Ca²⁺]_i增加。在相反的试验中，在100μM新霉素之前加30μM NPS467 EE。正如所预料的，NPS467 EE不引起[Ca²⁺]_i任何增加。而且，它不影响由随后加入的100μM新霉素引起的[Ca²⁺]_i增加。由NPS467和新霉素的最大有效浓度得到的结果表明这两种化合物不是在相同的位点上起作用。确切地说，假定在Ca²⁺受体上有两个分离的位点就可以充分地解释这些结果，细胞外Ca²⁺和新霉素与其中一个位点结合，NPS467和结构上相关的化合物（如NPS568）与其中的另一个位点结合。与前个位点结合的配位体导致Ca²⁺受体的充分活化，而与后个位点结合的配位体，当结合细胞外钙的位点占据到目前有点不太确定的程度时，则才可能出现和/或在功能上是相关的。结合到细胞外Ca²⁺结合位点的配位体可能与NPS467的在先闭塞的结合位点接触。很明显，NPS467结合位点是一种变构位点，它随在结合细胞外Ca²⁺的位点结合的配位体而提高受体的活化作用。

其数据证明甲状旁腺细胞Ca²⁺受体具有至少两个不同的有机配位体的位点。一个位点结合生理学配位体、细胞外Ca²⁺和类似于新霉素的某些有机聚阳离子。在这个位点的结合导致Ca²⁺受体的充分活化、[Ca²⁺]_i增加和抑制PTH分泌。NPS467在Ca²⁺受体上在先确定了未认识的结合位点。在这个位点的结合，当部分占住结合细胞外Ca²⁺的位点时，才可能出现和/或导致Ca²⁺受体的完全活化作用。在两个位点中任一位点起作用的配位体，在抑制体内血清Ca²⁺水平方面都是有效的。

实施例21：NPS467的制备

在250ml圆底烧瓶中，混合10.0克（100mM）3'-甲氧基乙酰苯和13.5克（100mM）3-苯丙基胺，并用125mM（35.5克）异丙醇钛（Ⅳ）处理。其反应混合物于氮气下在室温搅拌30分钟。此后用2分钟滴加在100ml乙醇中的6.3克（100mM）氰基硼氢化钠。在氮气下于室温搅拌反应16小时。此后，将反应混合物转移到装有1.5升乙醚和0.5升水的2升分离漏斗中。将相平衡然后除去醚相。余下的水相用4份每份为1升醚充分提取。洗液合并，在无水碳酸钾上干燥，还原成清沏、光亮的浅黄色油（amberoil）。

在二氧化硅上用氯仿-甲醇-异丙基胺（100∶5∶1）对这种物料进行TLC分析，其分析结果表明产品的Rf为0.65，有微量Rf为0.99（3'-甲氧基乙酰苯）和Rf为0.0（3-苯丙基胺）的两种原料。

用氯仿-甲醇-异丙基胺梯度（99∶1∶0.1）到（90∶10∶0.1）通过二氧化硅色谱分离其反应混合物，得到13.66克已纯化的NPS467。将这种物料溶于含0.1%二乙基胺的己烷-异丙醇（99∶1）中，得到浓度为50mg/ml的溶液。将4ml这种溶液（200mg，最大达到分离）经过Chiralcel  OD（25×2cm），使用0.7%异丙基胺、0.07%己烷中的二乙基胺、以100ml/分进行色谱分离，于260nm测定光密度，这样实现手征性折解。在这些条件下（注入100mg物料），于～26分钟从该柱开始出现早洗脱的同分异构体（NPS  467  EE），晚洗脱的同分异构体（NPS  467  LE）于～34分钟开始出现。这些条件下实现基线折解。通过将3克游离碱溶于100ml乙醇中，并用含10摩尔等当量HCl的100ml水处理，将每种光学异构体（游离碱）转化成相应的盐酸盐。该溶液冻干得到白色的固体。

实施例22：NPS568的制备

用实施例21叙述的方法制备NPS568，但用等当量的3-（2-氯苯基）丙胺代替3-苯丙基胺。研究发现，在用NaCNBH₃/EtOH处理之前，让3'-甲氧基乙酰苯、3-（2-氯苯基）丙基胺和异丙醇钛混合物搅拌5小时，得到的产率大得多（98%）。

实施例23：口服时NPS467降低血清离子化钙

试验前给老鼠（雄性、Spraque-Dawly，250-300克）喂标准鼠食，并禁食过夜，将NPS467（EE同分异构体）悬浮于玉米油中，通过管饲针以单次口服给药。三小时后，由尾部静脉采血样，并检验离子Ca²⁺水平。图44表明，口服时NPS467 EE引起剂量依赖性的血清离子Ca²⁺水平降低。

其他具体实施方案在下述权利要求中。

Claims (97)

1、一种药物组合物，其中包括一种分子，它通过引起细胞中[Ca²⁺]₁的增加而模拟细胞外Ca²⁺的活性，或者阻断由细胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]₁增加，所述分子的EC₅₀小于或等于5μM，其中所述分子不是鱼精蛋白。

2、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞中[Ca²⁺]_i增加是瞬时的，时间少于30秒。

3、根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述[Ca²⁺]_i增加是快速的，于30秒内发生。

4、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子引起[Ca²⁺]_i持续增加，其时间大于30秒钟。

5、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子进一步引起肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加。

6、根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加于60秒内发生。

7、根据权利要求6所述的药物组合物，其中用蛋白激酶C活化剂预处理所述细胞不到10分钟而降低所述的瞬时增加。

8、根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述的蛋白激酶C活化剂选自于由佛波醇豆蔻酸醋酸酯、瑞香和（一）-吲哚内酰胺组成的组中。

9、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的分子抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激的环状AMP的形成。

10、根据权利要求2所述的药物组合物，其中用10mM氟化钠预处理所述细胞10分钟而减少[Ca²⁺]_i瞬时增加。

11、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的细胞是甲状旁腺细胞，所述分子抑制从所述细胞分泌甲状旁腺激素。

12、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子引起在用下述一种细胞的mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-传导的增加：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

13、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子近移细胞内Ca²⁺以引起所述[Ca²⁺]_i的增加。

14、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的细胞是C-细胞或破骨细胞，所述分子抑制体内骨吸收。

15、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞是C-细胞，所述分子刺激体外或体内降钙素的分泌。

16、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子是在Ca²⁺受体上的EC₅₀或IC₅₀为小于或等于5μM，的模拟钙或溶解钙。

17、根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分子在一种或多种细胞，但不是所有细胞上的EC₅₀小于或等于5μM，其细胞选自于由下述细胞组成的组中：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

18、根据权利要求1或16或17所述的药物组合物，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于1μM。

19、根据权利要求1或16或17所述的药物组合物，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于100nM。

20、根据权利要求1或16或17所述的药物组合物，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于10nM。

21、根据权利要求1或16所述的药物组合物，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于1nM。

22、根据权利要求1或16或17所述的药物组合物，其中所述分子在生理学PH条件下带正电荷。

23、根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述分子选自于由支链或环状的聚胺、带正电荷的聚氨基酸和芳烷基胺组成的组中。

24、根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述支链聚胺具有下述化学式：

其中K是0-10的整数，

每个j是相同的或不相同的，并且是2-20的整数，

每个R_i是相同的或不相同的，并且选自于由氢和-（CH₂）_j-NH₂组成的组中，其中j定义如前，以及其中至少一个R_i不是氢。

25、根据权利要求1、16或17所述的药物组合物，其中所述分子具有如下化学式：

其中每个X选自于下述的基团（独立地）：H、CH₃、CH₃O、CH₃CH₂O、Br、Cl、F、CF₃、CHF₂、CH₂F、CF₃O、CH₃S、OH、CH₂OH、CONH₂、CN-、NO₂和CH₃CH₂;Ar是疏水本体;

每个R独立地选自于下述的基团：氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2.3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫基二氢吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;

Y选自于由CH、氮和未饱和的碳组成的组中;

Z选自于由氧、氮、硫、

组成的组中

式中每个n独立地是1-4，每个m独立地是0-5;

其中所述的分子或者是模拟钙或者是溶解钙。

26、根据权利要求25所述的药物组合物，所述疏水本体选自于由下述基团组成的组中：苯基、2-、3-或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、苯甲基和苯氧基。

27、一种包含具有下述化学式分子的药物组合物：

其中每个X独立地选自于由下述的基团组成的组中：H、CH₃、CH₃O、CH₃CH₂O、Br、Cl、F、CF₃、CHF₂、CH₂F、CF₃O、CH₃S、OH、CH₂OH、CONH₂、CN、NO₂和CH₃CH₂;Ar是一个疏水的本体;

每个R独立地选自于由下述的基团组成的组中：氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2.3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫基二氢吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;

Y选自于由CH、氮和不饱和的碳组成的组中;

Z选自于由氧、氮、硫、

组成的组中

式中每个n独立地是1-4，

每个m独立地是0-5;

其中所述的分子不是NPS447或NPS449。

28、根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的分子是NPS467。

29、根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述的分子是NPS459、NPS467、NPS551、或NPS568。

30、根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述的分子是R-二苯基丙基-α-苯乙基胺衍生物。

31、根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的分子是R-二苯基丙基-α-苯乙基胺衍生物。

32、根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述的分子具有下述化学式：

33、根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述的分子具有下述化学式：

34、根据权利要求32所述的药物组合物，其中每个X独立地选自于由Cl、F、CF₃、CH₃和CH₃O组成的组中。

35、根据权利要求33所述的药物组合物，其中每个X独立地选自于由Cl、F、CF₃、CH₃和CH₃O组成的组中。

36、一种治疗患有以在一种细胞或多种细胞中，或血液或血浆中不正常[Ca²⁺]或[Ca²⁺]_i为特征的疾病的病人的方法，其中包括给所述病人服用在治疗上有效量分子的步骤，该分子通过在细胞中引起[Ca²⁺]增加模拟细胞外Ca²⁺的活性，或者阻断由细胞外Ca²⁺引起的[Ca²⁺]_i增加。

37、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子的EC₅₀小于或等于5μM。

38、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子不是鱼精蛋白。

39、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子在Ca²⁺受体上以模拟钙或溶解钙形成相互作用。

40、根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞中[Ca²⁺]_i增加是瞬时的，其时间少于30秒。

41、根据权利要求36或40所述的方法，其中所述[Ca²⁺]_i增加是快速的，在30秒内发生。

42、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子引起[Ca²⁺]_i持续增加，其时间大于30秒。

43、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子进一步引起肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加。

44、根据权利要求43所述的方法，其中所述肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加于不到60秒时间内发生。

45、根据权利要求40所述的方法，其中所述瞬时增加由于用蛋白激霉C的活化剂预处理所述细胞而降低。

46、根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白激霉C的活化剂选自于由佛波醇豆蔻酸醋酸酯、瑞香和（一）-吲哚内酰胺V组成的组中。

47、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激的环形AMP的形成。

48、根据权利要求40所述的方法，其中所述[Ca²⁺]_i的瞬时增加由于用10mM氟化钠预处理所述细胞达10分钟而降低。

49、根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞是甲状旁腺细胞，所述分子抑制由所述细胞分泌甲状旁腺激素。

50、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子引起在由下述细胞的mRNA注入的非洲蟾蜍属卵母细胞中Cl^-传导的增加：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

51、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子迁移细胞中的Ca²⁺，引起所述[Ca²⁺]_i增加。

52、根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞是C-细胞或破骨细胞，所述分子抑制体内骨吸收。

53、根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞是C-细胞，所述分子刺激体外或体内的降钙素分泌。

54、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子是在Ca²⁺受体上的EC₅₀或IC₅₀小于或等于5μM的模拟钙或溶解钙。

55、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子在一种或多种细胞，但不是在由下述细胞组成的组中的所有细胞上的EC₅₀小于或等于5μM，所述细胞为：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

56、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于1μM。

57、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于100nM。

58、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于10nM。

59、根据权利要求38、54或55所述的方法，其中所述分子的EC₅₀或IC₅₀小于或等于1nM。

60、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子在生理学PH条件下带正电荷。

61、根据权利要求60所述的方法，其中所述分子选自于由支链或环形聚烷基胺、带正电荷的聚氨基酸和芳基胺组成的组中。

62、根据权利要求61所述的方法，其中所述支链聚胺具有下述化学式：

式中，K是1-10的整数，

每个j是相同的或不相同的，并且是2-20的整数，

每个R是相同的或不相同的，并且R是选自于由氢和-（CH₂）_j-NH₂组成的组中，式中j如上定义，其中至少一个Rj不是氢。

63、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子具有下述化学式：

式中每个X独立地选自于由下述的基团组成的组中：H、CH₃、CH₃O、CH₃CH₂O、Br、Cl、F、CF₃、CHF₂、CH₂F、CF₃O、CH₃S、OH、CH₂OH、CONH₂、CN、NO₂和CH₃CH₂;

Ar是一个疏水的本体;

每个R独立地选自于下述的基团组成的组中：氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2，3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫基二氢吲哚基、2-、3-或4-哌啶基;

Y选自于由CH、氮和不饱和的碳组成的组中;

Z选自于由氧、氮、硫、

组成的组中

式中每个n独立地是1-4，

每个m独立地是0-5;

其中所述的分子是模拟钙或溶解钙。

64、根据权利要求63所述的方法，其中所述疏水本体选自于由下述基团组成的组中：苯基、2-、3-或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、苯甲基和苯氧基。

65、根据权利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子具有下述化学式：

式中每个X独立地选自于由下述的基团组成的组中：H、CH₃、CH₃O、CH₃CH₂O、Br、Cl、F、CF₃、CHF₂、CH₂F、CF₃O、CH₃S、OH、CH₂OH、CONH₂、CN、NO₂和CH₃CH₂;

Ar是一个疏水的本体;

每个R独立地选自于下述的基团组成的组中：氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2.3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫基二氢吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;

Y选自于由CH、氮和不饱和的碳组成的组中;

Z选自于由氧、氮、硫、

组成的组中

式中每个n独立地是1-4，

每个m独立地是0-5;

其中所述的分子不是NPS447或NPS449。

66、根据权利要求65所述的方法，其中所述分子是NPS467或NPS019。

67、根据权利要求63所述的方法，其中所述分子是NPS467或NPS019或NPS456。

68、根据权利要求63所述的方法，其中所述分子是R-二苯丙基-α-苯乙胺衍生物。

69、根据权利要求65所述的方法，其中所述分子是R-二苯丙基-α-苯乙胺衍生物。

70、根据权利要求68所述的方法，其中所述分子具有下述化学式：

71、根据权利要求69所述的方法，其中所述分子具有下述化学式：

72、根据权利要求70所述的方法，其中每个X独立地选自于Cl、F、CF₃、CH₃和CH₃O组成的组中。

73、根据权利要求71所述的方法，其中每个X独立地选自于Cl、F、CF₃、CH₃和CH₃O组成的组中。

74、根据权利要求36所述的方法，其中所述病人患有以一种或多种离子或物质的不正常水平为特征的疾病，它们的水平是由一种或多种Ca²⁺受体调节或影响的。

75、根据权利要求74所述的方法，其中所述分子在由下述细胞组成的组中所选择的细胞的Ca²⁺受体上具有活性，这些细胞是：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、肾小球肾细胞、近管肾细胞、角化细胞、类卵泡甲状腺细胞和胎盘滋养层。

76、根据权利要求36所述的方法，其中所述病人的疾病选自于由下述疾病组成的组中：原发性和继发性副甲状腺机能亢进、佩吉特病、高钙血癌、骨质疏松和高血压。

77、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子仅在一种或多种Ca²⁺受体，而不是在所有所述Ca²⁺受体上具有活性。

78、根据权利要求75所述的方法，其中所述分子降低所述病人血清中甲状旁腺激素的水平。

79、根据权利要求78所述的方法，其中所述甲状旁腺激素的水平降低到正常个体中存在的水平。

80、根据权利要求78所述的方法，其中所述水平降低到足以引起血浆Ca²⁺降低的程度。

81、根据权利要求78所述的方法，其中提供所述分子的量足以使所述病人产生相当的治疗效果。

82、根据权利要求36所述的方法，其中所述分子阻断由细胞外[Ca²⁺]引起的该细胞中的[Ca²⁺]_i增加。

83、一种诊断病人疾病或病况的方法，其中包括测定所述病人体内一种或多种Ca²⁺受体的数量和/或位置的步骤，并且将所述的数量和/或位置与正常病人所观察到的进行比较，以此作为所述疾病或病况存在的指示。

84、根据权利要求83所述的方法，其中所述方法是免疫测定法，该法用Ca²⁺受体的抗体确定所述Ca²⁺受体的数量或位置。

85、根据权利要求83所述的方法，其中所述免疫测定法包括提供与Ca²⁺受体结合的已标记的模拟钙或溶解钙分子。

86、根据权利要求83所述的方法，其中所述疾病是癌。

87、根据权利要求86所述的方法，其中所述癌是甲状旁腺中异位瘤。

88、根据权利要求83所述的方法，其中所述病况是以骨中破骨细胞增加数目或活性表征的。

89、一种治疗骨质疏松、副甲状腺机能亢进或高血压的方法，其中包括服用治疗上有效量的一种分子的步骤，该分子因引起细胞中[Ca²⁺]_i增加而模拟细胞外Ca²⁺的活性，或者阻断[Ca²⁺]_i增加（由细胞外Ca²⁺引起的）。

90、一种确定作为治疗分子的有用分子的方法，其中包括筛选可能有用分子的步骤，这种有用分子具有模拟细胞中细胞外Ca²⁺的活性，或阻断[Ca²⁺]_i增加（由细胞外Ca²⁺引起的）的能力，该方法还包括测定所述分子的EC₅₀是否小于或等于5μM的步骤。

91、一种重组Ca²⁺受体。

92、一种包含重组Ca²⁺受体的细胞。

93、一种确定有用模拟钙分子的方法，其中包括确定一种分子的步骤，该分子在第一Ca²⁺受体而不是在第二Ca²⁺受体上模拟Ca²⁺的一种或一种以上的活性。

94、一种确定有用溶解钙分子的方法，其中包括确定一种分子的步骤，该分子在第一Ca²⁺受体而不是在第二Ca²⁺受体上阻断Ca²⁺的一种或一种以上的活性。

95、根据权利要求93或94所述的方法，其中所述方法包括在所述确定步骤中提供一种重组Ca²⁺受体。

96、已纯化的编码Ca²⁺受体的核酸。

97、分子NPS459、NPS467、NPS544、NPS551和NPS568。

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