ES2256370T3 - Moleculas activas para el receptor de calcio. - Google Patents

Moleculas activas para el receptor de calcio.

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ES2256370T3
ES2256370T3 ES02016612T ES02016612T ES2256370T3 ES 2256370 T3 ES2256370 T3 ES 2256370T3 ES 02016612 T ES02016612 T ES 02016612T ES 02016612 T ES02016612 T ES 02016612T ES 2256370 T3 ES2256370 T3 ES 2256370T3
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ES
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compound
parathyroid
extracellular
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ES02016612T
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English (en)
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Edward F. Nemeth
Bradford C. Van Wagenen
Manuel F. Balandrin
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Original Assignee
NPS Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Compuesto que presenta la fórmula (1): en el que: Alq es un alquileno lineal o ramificado de desde 1 hasta 6 átomos de carbono; R1 es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono o haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituidos con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno; R2 y R3 son grupos arilo o cicloalquilo carbocíclicos seleccionados independientemente, monocíclicos o bicíclicos, que presentan anillos de 5 ó 6 miembros opcionalmente sustituidos con de 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre alquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono, haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituidos con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno, alcoxi inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, halógeno, nitro, amino, alquilamino, amido, alquilamido inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, ciano, hidroxilo, acilo de 2 a 4 átomos de carbono, hidroxialquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, o tioalquilo inferior de 1 a3 átomos de carbono y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, siempre que cuando R2 es 4-aminofenilo, R1 es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono y Alq es metileno, entonces R3 es distinto de ciclohexilo o ciclopentilo no sustituidos; además siempre que cuando R2 y R3 son fenilo no sustituido y Alq es -(CH2)2-, entonces R1 es distinto de metilo, etilo, n-propilo o isopropilo; además siempre que cuando R1 es n-propilo y R2 y R3 son fenilo no sustituido, entonces Alq es distinto de (-CH2-) o (- CH2CH2CH2-); además siempre que cuando R1 es etilo y R2 y R3 son fenilo no sustituido, entonces Alq es distinto de (-CH2-); además siempre que el compuesto no sea N-1-feniletil-1- fenilisopropilamina; para su utilización en terapia.

Description

Moléculas activas para el receptor de calcio.
Campo de la invención
Esta invención se refiere al diseño, desarrollo, composición y utilización de moléculas calcimiméticas nuevas que pueden actuar de una manera análoga a los iones calcio extracelulares en las células, a moléculas calciolíticas que bloquean la actividad de los iones calcio extracelulares en las células, y a procedimientos para su utilización e identificación.
Antecedentes de la invención
La siguiente descripción proporciona un resumen de la información relevante para la presente invención. No es una admisión de que cualquier información proporcionada en la presente memoria es técnica anterior para la invención reivindicada actualmente, ni que ninguna de las publicaciones citadas específica o implícitamente son técnica anterior para esa invención.
Ciertas células en el organismo responden no sólo a señales químicas, sino también a iones tales como iones calcio (Ca^{2+}) extracelulares. Los cambios en la concentración de Ca^{2+} extracelular (referido en la presente memoria como "[Ca^{2+}]") alteran las respuestas funcionales de estas células. Una célula especializada de este tipo es la célula paratiroidea que secreta la hormona paratiroidea (PTH). PTH es el principal factor endocrino que regula la homeostasis del Ca^{2+}en la sangre y los fluidos extracelulares.
PTH, mediante su acción sobre el hueso y las células renales, aumenta el nivel de Ca^{2+} en la sangre. Este aumento en la [Ca^{2+}] actúa entonces como una señal de retroalimentación negativa, disminuyendo la secreción de PTH. La relación recíproca entre [Ca^{2+}] y la secreción de PTH forma el mecanismo esencial que mantiene la homeostasis de Ca^{2+} corporal.
El Ca^{2+} extracelular actúa directamente sobre la célula paratiroidea para regular la secreción de PTH. Se ha sugerido la existencia de una proteína de superficie de la célula paratiroidea que detecta cambios en [Ca^{2+}]. Esta proteína actúa como un receptor para el Ca^{2+} extracelular ("el receptor de Ca^{2+}") y se sugiere que detecta cambios en [Ca^{2+}] e inicia una respuesta celular funcional, la secreción de PTH. Por ejemplo, el papel de los receptores de Ca^{2+} y Ca^{2+} extracelular en la regulación de la función de Ca^{2+} intracelular y de la célula se revisa en Nemeth et al., 11 Cell Calcium 319, 1990; el papel de los receptores de Ca^{2+} en las células parafoliculares y paratiroideas se trata en Nemeth, 11 Cell Calcium 323, 1990; y el papel de los receptores de Ca^{2+} sobre los osteoclastos de hueso se trata por Zaidi, 10 Bioscience Reports 493, 1990.
Otras células en el organismo, específicamente los osteoclastos en hueso, las células yuxtaglomerulares y del túbulo proximal en el riñón, los queratinocitos en la epidermis, las células parafoliculares en la tiroides y los trofoblastos en la placenta, presentan la capacidad para detectar cambios en [Ca^{2+}]. Se ha sugerido que los receptores de Ca^{2+} de la superficie celular pueden también estar presentes en estas células, confiriéndoles la capacidad para detectar e iniciar o permitir una respuesta a los cambios en [Ca^{2+}].
En las células paratiroideas, osteoclastos, células parafoliculares (células C), queratinocitos, células yuxtaglomerulares y trofoblastos, un aumento en [Ca^{2+}] provoca un aumento en la concentración de Ca^{2+} libre intracelular
("[Ca^{2+}]_{i}"). Tal aumento puede estar producido por un flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular o por la movilización de Ca^{2+} desde orgánulos intracelulares. Los cambios en [Ca^{2+}]_{i} se monitorizan y cuantifican fácilmente utilizando indicadores fluorimétricos tales como fura-2 o indo-1 (Molecular Probes, Eugene, OR). La medición de [Ca^{2+}]_{i} proporciona un ensayo para evaluar la capacidad de las moléculas para actuar como agonistas o antagonistas en el receptor de Ca^{2+}.
En las células paratiroideas, los aumentos en la concentración de Ca^{2+} extracelular provocan aumentos rápidos y transitorios en [Ca^{2+}]_{i}, que van seguidos por aumentos inferiores todavía sostenidos en [Ca^{2+}]_{i}. Los aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} surgen de la movilización de Ca^{2+} intracelular, mientras que los aumentos inferiores, sostenidos resultan del flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular. La movilización de Ca^{2+} intracelular se acompaña de un aumento de la formación de inositol-1,4,5-trifosfato (IP_{3}) y diacilglicerol, dos indicadores bioquímicos que se asocian con la movilización dependiente del receptor de Ca^{2+} intracelular en otras células diversas.
Además de Ca^{2+}, otros cationes di y trivalentes diversos, tales como Mg^{2+}, Sir^{2+}, Ba^{2+}, La^{3+} y Gd^{3+} también producen la movilización de Ca^{2+} intracelular en las células paratiroideas. Mg^{2+} y La^{3+} también aumentan la formación de IP_{3}; todos estos cationes inorgánicos disminuyen la secreción de PTH. Por tanto, el receptor postulado de Ca^{2+} en la célula paratiroidea es promiscuo porque detecta una variedad de cationes extracelulares di y trivalentes.
La capacidad de varios compuestos para imitar al Ca^{2+} extracelular in vitro se trata en Nemeth et al., (espermina y espermidina) en "Calcium-Binding Proteins in Health and Disease", 1987, Academic Press, Inc., págs. 33-35; Brown et al., (por ejemplo, neomicina) 128 Endocrinology 3047, 1991; Chen et al., (diltiazem y su análogo, TA-3090) 5 J. Bone and Mineral Res. 581, 1990; y Zaidi et al., (verapamilo) 167 Biochem Biophys Res Comm 807, 1990.
Brown et al., 6 J. Bone and Mineral Res. 11, 1991, tratan las teorías existentes con respecto a los efectos de los iones Ca^{2+} sobre las células paratiroideas, y proponen que los resultados pueden explicarse tanto mediante un mecanismo de tipo receptor como un mecanismo independiente de receptor, tal como sigue:
Los cationes polivalentes [por ejemplo, cationes divalentes y trivalentes] ejercen una variedad de efectos sobre la función paratiroidea, tal como una inhibición de la secreción de la hormona paratiroidea (PTH) y de la acumulación de AMPc, estimulación de la acumulación de inositol fosfatos, y aumento de la concentración de calcio citosólico. Se pensaba que estas acciones estaban mediadas a través de un mecanismo de "tipo receptor". La inhibición de la acumulación de AMPc estimulada por agonista mediante cationes divalentes y trivalentes, por ejemplo, se bloquea tras la preincubación con toxina de la tos ferina. Por tanto, el supuesto receptor de catión polivalente puede acoplarse a la inhibición de adenilato ciclasa mediante la proteína (G) reguladora del nucleótido guanina inhibidora, G_{i}.
Se ha demostrado recientemente que el antibiótico policatiónico, neomicina, imita las acciones de los cationes di y trivalentes en varios aspectos de la función paratiroidea. Para determinar si estas acciones eran específicas de este agente o representaban una acción más generalizada de los policationes, se probaron los efectos de los péptidos altamente básicos, poliarginina y polilisina, así como protamina con los mismos parámetros en células paratiroideas bovinas dispersas. Los resultados demuestran que la célula paratiroidea responde a una variedad de policationes así como a cationes polivalentes, potencialmente a través de rutas bioquímicas similares. Estos resultados se tratan en cuanto a la modulación recientemente publicada, "independiente de receptor" de proteínas G mediante policationes en otros sistemas.
Se ha supuesto que el receptor de Ca^{2+} es análogo a los demás receptores acoplados a proteínas G [por ejemplo, una glucoproteína], pero estudios recientes con otros tipos celulares han planteado la posibilidad de que los policationes pueden modular la función celular mediante mecanismos alternativos o adicionales. En los mastocitos, por ejemplo, una variedad de cationes anfipáticos, incluyendo mastoparán, un péptido procedente del veneno de avispa, 48/80, un policatión sintético, y polilisina, aumentan la secreción mediante un mecanismo sensible a la toxina de la tos ferina, lo que sugiere la participación de una proteína G. No se ha identificado un receptor de la superficie celular clásico que podría mediar en las acciones de estos diversos agentes. Además, estos mismos compuestos han demostrado activar directamente proteínas G purificadas en disolución o en vesículas de fosfolípidos artificiales. Basándose en estas observaciones, se ha propuesto que los cationes anfipáticos activan proteínas G y, a su vez, la secreción de mastocitos mediante un mecanismo "independiente de receptor".
Los policationes también han demostrado interaccionar fuertemente con fosfolípidos ácidos. Las polilisinas de longitudes de cadena variables (20 a 1.000 aminoácidos) se unen a vesículas de fosfolípidos artificiales con constantes de disociación en el intervalo de 0,5 nM a 1,5 \muM. La afinidad de unión se relaciona directamente con la longitud de la cadena de polilisina, presentando los polímeros de 1.000 aminoácidos una K_{d} de 0,5 nM, presentando los polímeros más cortos valores de K_{d} superiores, y no interaccionando la lisina en un grado significativo. La relación entre la potencia y la longitud de la cadena es similar a lo observado para los efectos de polilisina_{10.200}, polilisina_{3800}, y lisina sobre la función paratiroidea.
Es posible que la unión de policationes a biomembranas produzca algunas de sus acciones biológicas. Se ha postulado que la permeabilización de la membrana plasmática inducida en algunos tipos celulares por una variedad de agentes formadores de poro, incluyendo policationes, está mediada por su interacción con una estructura de tipo fosfatidilserina. Además, la activación "independiente de receptor" de proteínas G purificadas mediante cationes anfipáticos se potencia cuando estas proteínas se incorporan en vesículas de fosfolípidos.
Los iones calcio, en el intervalo de concentración milimolar, también producen cambios notables en la estructura de la membrana. En algunos casos, el calcio puede o bien antagonizar o bien potenciar la interacción de policationes con los lípidos de membrana. Estas consideraciones plantean la posibilidad de que las acciones tanto de los cationes polivalentes como de los policationes sobre las células paratiroideas podrían suponer un mecanismo independiente de receptor que no requiere la presencia de un receptor acoplado a proteína G, de superficie celular clásico. Sin embargo, se requieren estudios adicionales para dilucidar la base molecular para la detección de Ca^{2+}por éste y otros tipos celulares. [Se omiten las citas].
Shoback y Chen (6 (Suplemento 1), J. Bone and Mineral Res. 1991, S135) y Racke et al (6 (Suplemento 1), J. Bone and Mineral Res. 1991, S118) describen experimentos que se dice que indican que un receptor de Ca^{2+} o un detector de Ca^{2+} está presente en las células paratiroideas. El ARN mensajero aislado de tales células puede expresarse en ovocitos y hacer que se doten estos ovocitos de un fenotipo que podría explicarse por la presencia de una proteína receptora de Ca^{2+}.
Sumario de la invención
El solicitante ha demostrado que las proteínas receptoras de Ca^{2+} permiten que ciertas células especializadas implicadas en el metabolismo del Ca^{2+} corporal detecten y respondan a cambios en la concentración de Ca^{2+} extracelular. Aunque estos receptores comparten ciertas características generales, pueden afectarse selectivamente por diferentes agentes farmacológicos. Tal como se detalla más adelante, se identifican ciertas moléculas con actividad selectiva sobre los receptores de Ca^{2+} en las células paratiroideas, osteoclastos y células C.
Los receptores de Ca^{2+} constituyen dianas moleculares diferenciadas para una nueva clase de moléculas que imitan ("calcimiméticos") o antagonizan ("calciolíticos") las acciones del Ca^{2+} extracelular. Tales receptores están presentes en las superficies celulares y presentan una baja afinidad por Ca^{2+} extracelular (K_{4} aparente generalmente superior a aproximadamente 0,5 mM). Tales receptores pueden incluir un mecanismo de efector unido o libre, tal como se define por Cooper, Bloom y Roth, "The Biochemical Basis of Neuropharmacology", cap. 4. Por tanto, tales receptores son diferentes de los receptores de Ca^{2+} intracelular, por ejemplo, calmodulina y las troponinas. Los calcimiméticos, por ejemplo, actúan sobre los receptores de Ca^{2+} de manera selectiva para disminuir directa o indirectamente la función de las células paratiroideas u osteoclastos o para estimular la función de las células C. Los calcimiméticos y calciolíticos de esta invención permiten nuevos tratamientos para el hiperparatiroidismo, osteoporosis y otras enfermedades relacionadas con Ca^{2+}. Esta solicitud se refiere a receptores de Ca^{2+} de selección de diana en cada uno de estos tres tipos celulares y otros tipos celulares, que detectan y responden a cambios en [Ca^{2+}].
El solicitante es el primero en demostrar una proteína receptora de Ca^{2+} en las células paratiroideas y en diferenciar farmacológicamente tales receptores de Ca^{2+} en otras células, tales como células C y osteoclastos. El solicitante es también el primero en describir procedimientos mediante los cuales las moléculas activas en estos receptores de Ca^{2+} pueden identificarse y utilizarse como moléculas líder en el descubrimiento, desarrollo, diseño, modificación y/o construcción de calcimiméticos o calciolíticos útiles, que son activos en los receptores de Ca^{2+}. Tales calcimiméticos o calciolíticos son útiles en el tratamiento de diversos estados patológicos caracterizados por niveles anómalos de uno o más componentes, por ejemplo, polipéptidos tales como hormonas, enzimas o factores de crecimiento, cuya expresión y/o secreción está regulada o afectada por la actividad en uno o más receptores de Ca^{2+}. Además, la identificación de diferentes receptores de Ca^{2+} en diferentes tipos celulares, y la respuesta específica de tales receptores a diferentes moléculas líder permiten el diseño y la construcción de moléculas específicas activas en el tratamiento de enfermedades específicas que pueden afectarse mediante la acción en tales receptores de Ca^{2+} específicos. Por ejemplo, los niveles anómalos de secreción de hormona paratiroidea pueden afectarse por tales moléculas específicas sin afectar el nivel de secreción de otras hormonas reguladas por Ca^{2+} y similares.
La identificación de tales moléculas líder estuvo impedida por la carencia anterior de un sistema de selección de alto rendimiento para descubrir moléculas activas, y la ausencia de una base de datos estructural con la que diseñar candidatos farmacológicos eficaces. Estas barreras se han eliminado ahora clonando el receptor de Ca^{2+} de las células paratiroideas y receptores relacionados funcionalmente, y examinando sistemáticamente las características estructurales de ciertas moléculas líder que activan tales receptores de Ca^{2+} y receptores relacionados funcionalmente clonados. La clonación del receptor de Ca^{2+} también permite el desarrollo de líneas celulares transfectadas adecuadas para la selección de alto rendimiento de bibliotecas de moléculas o productos naturales y moléculas sintéticas. Esto, junto con los estudios de estructura-actividad tratados más adelante, proporciona la tecnología necesaria para desarrollar nuevos calcimiméticos y calciolíticos.
El solicitante facilita tales procedimientos en esta solicitud. Por ejemplo, puede clonarse el ADNc del receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas humanas mediante selección para determinar la expresión funcional en ovocitos de Xenopus y pueden determinarse las características estructurales de moléculas orgánicas necesarias para la actividad en el receptor de Ca^{2+} a través de las pruebas de productos naturales seleccionados u otras bibliotecas de moléculas y posteriores estudios de estructura-actividad.
La solicitud describe composiciones farmacéuticas que incluyen una molécula que o bien imita la actividad del Ca^{2+} extracelular provocando un aumento en [Ca^{2+}]_{i} en una célula, o bien bloquea un aumento en [Ca^{2+}]_{i} provocado por Ca^{2+} extracelular. La molécula presenta una CE_{50} inferior o igual a 5 \muM, y no es protamina.
Por "imitar" se quiere decir que la molécula presenta una o más de las acciones específicas del Ca^{2+} extracelular en una célula que responde a Ca^{2+} extracelular. El término no requiere que se imiten todas las funciones biológicas del Ca^{2+} extracelular, sino que en su lugar se imite al menos una de tales funciones. Además, no se requiere que la molécula se una al mismo sitio en el receptor al que lo hace el receptor de Ca^{2+} extracelular (véase por ejemplo, el compuesto nuevo NPS 467 y su acción en el ejemplo 20 de más adelante). Por "bloquear" se quiere decir que se reduce o evita una de tales acciones de Ca^{2+} por la molécula. La CE_{50} puede determinarse en ensayos tal como se describe a continuación, en los que se mide la actividad imitada y la concentración de la molécula que imita la mitad del máximo efecto de imitación es la CE_{50}. Por el contrario, la CI_{50} de un calciolítico es aquella cantidad que bloquea la mitad de la actividad máxima. Preferentemente, tales ensayos miden aumentos de [Ca^{2+}]_{i} y se confirman que son específicos para un receptor de Ca^{2+} mediante los procedimientos descritos más adelante, o su equivalente.
Los bioensayos descritos en la presente memoria demuestran que un aumento en [Ca^{2+}]_{i} en una célula es un aumento transitorio que tiene una duración inferior a un minuto, y el aumento en [Ca^{2+}]_{i} es rápido, produciéndose en un plazo de treinta segundos; y la molécula también (a) provoca un aumento sostenido (superior a treinta segundos) en [Ca^{2+}]_{i}, (b) provoca un aumento en los niveles de inositol-1,4,5-trifosfato y/o diacilglicerol, por ejemplo, en un plazo inferior a 60 segundos, y (C) inhibe la formación de AMP cíclico estimulada por dopamina o isoprotenerol. Además, el aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} se suprime mediante pretratamiento de la célula durante diez minutos con fluoruro de sodio 10 mM, o se disminuye el aumento transitorio por el breve pretratamiento (no más de diez minutos) de la célula con un activador de la proteína cinasa C, por ejemplo, miristato-acetato de forbol (PMA), mezereína o (-)indolactama V.
En una célula paratiroidea, aquellas moléculas que son activas en todos los ensayos descritos anteriormente son particularmente útiles en esta invención puesto que son específicas en sus acciones frente a un receptor de Ca^{2+} de tal célula. Esto es particularmente cierto para el efecto de pretratamiento con PMA descrito anteriormente.
Preferentemente, la célula es una célula paratiroidea, y la molécula inhibe la secreción de la hormona paratiroidea desde la célula; y la molécula provoca un aumento en la conductancia de Cl^{-} en un ovocito de Xenopus al que se inyecta ARNm de una célula paratiroidea, osteoclasto de hueso, célula renal yuxtaglomerular, célula renal del túbulo proximal, queratinocito, célula tiroidea parafolicular o trofoblasto placentario.
Preferentemente, la molécula provoca la movilización de Ca^{2+} intracelular para producir un aumento en [Ca^{2+}]_{i}; la célula es una célula C o un osteoclasto y la molécula inhibe la resorción ósea in vivo; la célula es un osteoclasto y la molécula inhibe la resorción ósea in vitro; la célula es una célula C y la molécula estimula la secreción de calcitonina in vitro o in vivo; y lo más preferentemente, la molécula es un calcimimético o bien un calciolítico que presenta una CE_{50} o una CI_{50} en un receptor de Ca^{2+} inferior o igual a 5 \muM, e incluso más preferentemente inferior o igual a 1 \muM, 100 nmolar, 10 nmolar o 1 nmolar. Tales CE_{50} o una CI_{50} inferiores son ventajosas puesto que permiten concentraciones inferiores de moléculas que van a utilizarse in vivo o in vitro para tratamiento o diagnóstico. El descubrimiento de moléculas con tales CE_{50} o una CI_{50} bajas permite el diseño y la síntesis de moléculas potentes y eficaces de manera similar.
Por molécula "calcimimética" se quiere decir cualquier molécula que presenta una o más actividades del Ca^{2+} extracelular, y preferentemente imita la actividad de Ca^{2+} en un receptor de Ca^{2+}. Por ejemplo, cuando se utiliza en referencia a una célula paratiroidea es una molécula, que cuando se prueba en células paratiroideas, in vitro, posee una o más, y preferentemente todas las siguientes características, según se mide mediante técnicas bien conocidas para los expertos en la materia:
1.
La molécula produce un aumento rápido (tiempo hasta el máximo < 5 seg.) y transitorio en [Ca^{2+}]_{i} que no responde a la inhibición por La^{3+} o Gd^{3+} 1 \muM. El aumento en [Ca^{2+}]_{i} persiste en ausencia de Ca^{2+} extracelular pero se suprime por pretratamiento con ionomicina (en ausencia de Ca^{2+} extracelular);
2.
El aumento en [Ca^{2+}]_{i} provocado por el Ca^{2+} extracelular no se inhibe por dihidropiridinas.
3.
El aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} producido por la molécula se suprime por pretratamiento durante 10 min. con fluoruro de sodio 10 mM;
4.
El aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} producido por la molécula disminuye por pretratamiento con un activador de la proteína cinasa C (PKC), tal como miristato-acetato de forbol (PMA), mezereína o (-)-indolactama V. El efecto global del activador de la proteína cinasa C es desplazar la curva de concentración-respuesta de la molécula a la derecha sin afectar a la respuesta máxima.
5.
La molécula produce un aumento rápido (< 30 seg.) en la formación de inositol-1,4,5-trifosfato y/o diacilglicerol;
6.
La molécula inhibe la formación de AMP cíclico estimulada por dopamina o isoprotenerol;
7.
La molécula inhibe la secreción de PTH;
8.
El pretratamiento con toxina de la tos ferina (100 ng/ml durante > 4 h) bloquea el efecto inhibidor de la molécula sobre la formación de AMP cíclico pero no afecta a los aumentos en [Ca^{2+}]_{i}, inositol-1,4,5-trifosfato o diacilglicerol, ni disminuye la secreción de PTH;
9.
La molécula provoca aumentos en la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les ha inyectado ARNm enriquecido con poli(A)^{+} procedente de células paratiroideas bovinas o humanas pero no tiene efecto en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó agua o ARNm de cerebro o hígado de rata; y
10.
De manera similar, utilizando un receptor clonado de células paratiroideas, la molécula provocará una respuesta en los ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó ADNc específico o ARNm que codifica para el receptor.
Por molécula "calciolítica" se quiere decir cualquier molécula que bloquee una o más de las actividades del Ca^{2+} extracelular en una célula que detecta Ca^{2+} extracelular, actuando preferentemente como un antagonista en el receptor de Ca^{2+}. Por ejemplo, cuando se utiliza en referencia con una célula paratiroidea, es una molécula que, cuando se prueba en células paratiroideas in vitro, posee una o más, y preferentemente la totalidad de las siguientes características, según se mide mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia:
1.
La molécula bloquea, parcial o completamente, la capacidad de concentraciones aumentadas de Ca^{2+} extracelular para:
a)
aumentar [Ca^{2+}]_{i},
b)
movilizar Ca^{2+} intracelular,
c)
aumentar la formación de inositol-1,4,5-trifosfato,
d)
disminuir la formación de AMP cíclico estimulada por dopamina o isoprotenerol, y
e)
inhibir la secreción de PTH;
2.
A baja [Ca^{2+}], es decir 0,5 mM, la molécula por sí misma no cambia [Ca^{2+}]_{i},
3.
La molécula bloquea los aumentos en la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó poli(A)^{+}-ARNm procedente de células paratiroideas bovinas o humanas provocados por Ca^{2+} extracelular o compuestos calcimiméticos pero no en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó agua o ARNm de cerebro o hígado de rata;
4.
De manera similar, utilizando un receptor clonado de las células paratiroideas, la molécula bloqueará una respuesta en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó ADNc específico o ARNm que codifica para el receptor de Ca^{2+}, provocada por Ca^{2+} extracelular o un compuesto calcimimético.
Las definiciones paralelas de calcimiméticos y calciolíticos útiles en los receptores de Ca^{2+} en otros tipos celulares son evidentes a partir de los ejemplos facilitados más adelante.
El receptor de Ca^{2+} también puede detectar y responder a ciertas moléculas de policationes inorgánicas y de policationes orgánicos. Por ejemplo, la célula paratiroidea no puede distinguir aumentos en la concentración de Ca^{2+} extracelular a partir de la adición de estos policationes orgánicos, supuestamente debido a que estas moléculas orgánicas actúan justo como el Ca^{2+} extracelular en el receptor de Ca^{2+}. Las moléculas calcimiméticas de esta invención son agonistas particularmente buenos del receptor de Ca^{2+} y pueden utilizarse como fármacos que alteran funciones celulares seleccionadas, por ejemplo, la secreción de PTH desde las células paratiroideas. A diferencia del Ca^{2+}, la mayoría de estas moléculas actúan en uno o más, pero no en todos los receptores de Ca^{2+} y, por tanto, proporcionan una capacidad para seleccionar como diana de manera específica un receptor de Ca^{2+}.
Estas moléculas también proporcionan estructuras líder para el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos adicionales eficaces en el tratamiento de diversas enfermedades en las que [Ca^{2+}]_{i} y [Ca^{2+}] desempeñan un papel, tales como hiperparatiroidismo, osteoporosis, enfermedad de Paget, hipertensión, enfermedad renal y cáncer.
Los calcimiméticos y calciolíticos pueden formularse como composiciones farmacéuticas que son útiles para regular el nivel de Ca^{2+} libre extracelular en un paciente y para imitar el efecto de Ca^{2+} extracelular en una célula seleccionada de entre el grupo descrito anteriormente, administrando al paciente tal composición farmacéutica. Antes de esta invención, el solicitante no era consciente de ninguna de estas moléculas que actúan sobre el receptor de Ca^{2+} útiles en el tratamiento de enfermedades producidas por irregularidad en la operación o regulación de un receptor de Ca^{2+} o enfermedades en un animal que presenta receptores de Ca^{2+} normales pero que pueden tratarse activando o desactivando tales receptores de Ca^{2+}.
Preferentemente, la molécula tiene una CE_{50} inferior o igual a 5 \muM en una o más pero no en todas las células seleccionadas de entre el grupo constituido por células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares (células C) y trofoblastos placentarios.
Es la especificidad de acción de tales moléculas la que es particularmente ventajosa en esta invención ya que permite un tratamiento y diagnóstico in vitro y específico y el descubrimiento de moléculas calcimiméticas o calciolíticas adicionales.
Según un aspecto preferido de la presente invención, se proporcionan nuevos análogos y derivados de fenil-\alpha-fenetilamina que tienen la fórmula (1):
1
en la que alq es alquileno de cadena lineal o ramificada de desde 1 hasta 6 átomos de carbono; R_{1} es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono o haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituido con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno; R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de entre grupos arilo o cicloalquilo carbocíclicos, monocíclicos o bicíclicos, que presentan anillos de 5 ó 6 miembros opcionalmente sustituidos con de 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre alquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono, haloalquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono sustituido con de 1 a 7 átomos de halógeno, alcoxilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono, halógeno, nitro, amino, alquilamino, amido, alquilamido inferior de 1 a 3 átomos de carbono, ciano, hidroxilo, acilo de 2 a 4 átomos de carbono, hidroxialquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono o tioalquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos siempre que cuando R_{2} es 4-aminofenilo, R_{1} es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono y Alq es metileno, entonces R_{3} es distinto de ciclohexilo o ciclopentilo no sustituidos; además siempre que cuando R_{2} y R_{3} son fenilo no sustituido y Alq es -(CH_{2})_{2}-, entonces R_{1} es distinto de metilo, etilo, n-propilo o isopropilo; además siempre que cuando R_{1} es n-propilo y R_{2} y R_{3} son fenol no sustituido, entonces Alq es distinto de (-CH_{2}-) o (-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}); además siempre que cuando R_{1} es etilo, y R_{2} y R_{3} son fenilo no sustituido entonces Alq es distinto de (-CH_{2}-); además siempre que el compuesto no sea N-1-feniletil-1-fenilisopropilamina. Grupos arilo carbocíclicos adecuados son grupos que presentan uno o dos anillos, al menos uno de los cuales presentando un carácter aromático e incluyen grupos arilo carbocíclicos tales como fenilo y grupos arilo carbocíclicos bicíclicos tales como naftilo. Tal como es evidente a partir de la fórmula anterior, los compuestos englobados en ella pueden existir como mezclas racémicas y como estereoisómeros individuales. Se prefieren especialmente derivados de R-fenilpropil-\alpha-fenetilamina que se cree que muestran una actividad mejorada en la disminución del calcio ionizado en suero.
Los compuestos preferidos incluyen aquéllos en los que alq es n-propileno. También se prefieren los compuestos en los que R_{1} es metilo. También se prefieren aquellos compuestos en los que R_{2} y R_{3} son fenilo opcionalmente sustituido.
Los compuestos especialmente preferidos incluyen aquéllos en los que R_{2}, es fenilo monosustituido, más preferentemente meta-sustituido. Los grupos R_{3} especialmente preferidos incluyen fenilo no sustituido o monosustituido, especialmente orto-sustituido. Los sustituyentes preferidos para R_{2} incluyen halógeno, haloalquilo, preferentemente trihalometilo, y alcoxilo, preferentemente metoxilo. Los sustituyentes preferidos para R_{3} incluyen halógeno.
Los compuestos preferidos producen un aumento en la concentración de Ca^{2+} libre intracelular con una CE_{50} inferior o igual a 5 \muM utilizando un ensayo que mide la concentración de Ca^{2+} libre intracelular en células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2.
En un aspecto relacionado, la presente invención se refiere a aquellos compuestos reivindicados en la reivindicación 17.
En un aspecto relacionado adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (1) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto relacionado, la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (1) sin la condición o una composición farmacéutica según se describió anteriormente sin la condición para la preparación de un medicamento para modular la movilización de Ca^{2+} intracelular en tejido de hueso, riñón, epidermis, tiroides, paratiroides o placenta, tejido que incluye una o más de las células seleccionadas de entre el grupo constituido por: células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios. Preferentemente, la utilización se refiere a modular la movilización de Ca^{2+} intracelular en el tejido de hueso, riñón, epidermis, tiroides o paratiroides.
En otro aspecto relacionado, la invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula (1) sin la condición o una composición farmacéutica según se describió anteriormente sin la condición para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad caracterizada por un nivel anómalo de iones calcio, PTH, inositol trifosfato, calcitonina o diacilglicerol.
En otro aspecto relacionado, la invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula (1) sin la condición o una composición farmacéutica según se describió anteriormente sin la condición para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que presenta una concentración anómala de Ca^{2+} extracelular o una concentración de Ca^{2+} libre intracelular en una o más células seleccionadas de entre el grupo constituido por: células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios.
Todavía en otro aspecto relacionado, la invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula (1) sin la condición o una composición farmacéutica según se describió anteriormente sin la condición para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hiperparatiroidismo primario o secundario, enfermedad de Paget, hipercalcemia asociada a cáncer, osteoporosis, hipertensión, para reducir el nivel de PTH en la sangre, y para reducir el nivel de Ca^{2+} en la sangre.
Por "anómalo" se quiere decir que el paciente, comparado con la población general, presenta un metabolismo de Ca^{2+} diferente que se afecta por una o más proteínas (por ejemplo, hormonas) en la sangre o los fluidos corporales extracelulares, u otras moléculas que afectan el nivel de Ca^{2+} extracelular y/o intracelular. Por tanto, las enfermedades incluyen hiperparatiroidismo, osteoporosis y otros trastornos óseos y relacionados con los minerales, y similares (tal como se describen, por ejemplo, en libros de texto médicos habituales, tales como "Harrison's Principles of Internal Medicine"). Tales enfermedades se tratan en esta invención mediante moléculas que imitan o bloquean uno o más de los efectos del Ca^{2+} y así afectan directa o indirectamente a los niveles de las proteínas u otras moléculas en el organismo del paciente.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere decir una cantidad que alivia en cierto grado uno o más síntomas de la enfermedad o estado en el paciente. Adicionalmente, por "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere decir una cantidad que devuelve al valor normal, parcial o completamente, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o que causan la enfermedad o estado. Generalmente, es una cantidad entre aproximadamente 1 mmol y 1 \mumol de la molécula, dependiente de su CE_{50} y de la edad, tamaño y enfermedad asociados con el paciente.
Preferentemente, la molécula tiene una CE_{50} inferior o igual a 5 \muM, y no es protamina; y lo más preferentemente interacciona en un receptor de Ca^{2+} un calcimimético o calciolítico.
En ciertas formas de realización, el paciente presenta una enfermedad caracterizada por un nivel anómalo de uno o más componentes, cuyo nivel está regulado o afectado por la actividad de uno o más receptores de Ca^{2+}, y la molécula es activa en un receptor de Ca^{2+} de una célula seleccionada de entre el grupo constituido por células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios.
Preferentemente, la molécula reduce el nivel de hormona paratiroidea en el suero de un paciente, por ejemplo, hasta el nivel presente en un individuo normal, o hasta un grado suficiente para producir una disminución en el Ca^{2+} plasmático; y la molécula se proporciona en una cantidad suficiente para presentar un efecto terapéuticamente relevante en el paciente.
Por tanto, en general, la invención caracteriza moléculas calcimiméticas o calciolíticas que pueden actuar como agonistas o antagonistas selectivos respectivamente en un receptor de Ca^{2+} de una o más pero no todas las células seleccionadas de entre el grupo constituido por células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios. Tal composición puede incluir cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable conocido para los expertos en la materia para proporcionar una composición farmacéutica.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la misma, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción de las formas de realización preferidas
En primer lugar, se describirán brevemente los dibujos.
Dibujos
La figura 1 ilustra moléculas calcimiméticas y calciolíticas.
La figura 2 es una representación gráfica que muestra aumentos en [Ca^{2+}]_{i} inducidos por Ca^{2+} extracelular en células paratiroideas bovinas cargadas con quin-2 o fura-2. La [Ca^{2+}] inicial fue de 0,5 mM (utilizando CaCl_{2}) y, en cada una de las flechas, se aumentó en incrementos de 0,5 mM.
La figura 3 es una representación gráfica que muestra la movilización de [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas. La [Ca^{2+}] inicial fue de 0,5 mM y se disminuyó hasta < 1 \muM mediante la adición de EGTA tal como se indica. (a) Mg^{2+} extracelular (8 mM, final) provoca un aumento en [Ca^{2+}]_{i} en ausencia de Ca^{2+} extracelular. (b) El pretratamiento con ionomicina (1 \muM) bloquea la respuesta a Mg^{2+}. (c) El pretratamiento con la molécula 1799 (un desacoplador mitocondrial) 5 \muM no tiene efecto sobre la respuesta a Mg^{2+}.
La figura 4 es una representación gráfica que muestra los efectos inhibidores preferenciales de una baja concentración de Gd^{3+} sobre los aumentos en el equilibrio en [Ca^{2+}]_{i} y que una alta concentración de Gd^{3+} provoca un aumento transitorio en [Ca]_{i}. Panel superior: control. La concentración inicial de Ca^{2+} extracelular fue de 0,5 mM y se aumentó en 0,5 mM en cada una de la puntas de flecha. Panel intermedio: Gd^{3+} (5 \muM) bloquea los aumentos en el equilibrio pero no los transitorios en [Ca^{2+}]_{i} provocados por Ca^{2+} extracelular. Panel inferior: Gd^{3+} (50 \muM) provoca un aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} y suprime tanto las respuestas transitorias como sostenidas a Ca^{2+} extracelular. En los paneles intermedio e inferior, sólo se añade el EGTA suficiente para quelar preferentemente Gd^{3+}: se elimina el bloqueo del flujo de entrada de Ca^{2+} y [Ca^{2+}]_{i} aumenta inmediatamente.
La figura 5 es una representación gráfica que muestra que los efectos de PMA sobre [Ca^{2+}]_{i}, la formación de IP_{3} y la secreción de PTH se superan mediante concentraciones crecientes de Ca^{2+} extracelular. Para cada variable, hay un desplazamiento a la derecha en la curva de concentración-respuesta para Ca^{2+} extracelular. Obsérvese también que las curvas de concentración-respuesta varían sigmoidalmente según aumenta [Ca^{2+}] linealmente.
La figura 6 es una representación gráfica que muestra que los aumentos de [Ca^{2+}]_{i} provocados por espermina disminuyen progresivamente al aumentar [Ca^{2+}]. Se añadió espermina (200 \muM) en el momento mostrado por las puntas de las flechas. En esta y todas las figuras posteriores, los números que acompañan los trazos son [Ca^{2+}]_{i} en nM.
La figura 7 es una representación gráfica que muestra que la espermina moviliza Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas bovinas. Se añadió EGTA para reducir [Ca^{2+}] hasta < 1 \muM antes de la adición de espermina (200 \muM) tal como se indica (trazo izquierdo). El pretratamiento con ionomicina (1 \muM) bloquea la respuesta a espermina (trazo derecho).
Las figuras 8A y B son representaciones gráficas que muestran que la espermina aumenta [Ca^{2+}]_{i} e inhibe la secreción de PTH en células paratiroideas bovinas de manera similar a Ca^{2+} extracelular. Los puntos de datos para las curvas de dosis de espermina-concentración-respuesta son las medias de dos experimentos.
La figura 9 es una representación gráfica que muestra los efectos de contraste de PMA sobre las respuestas a Ca^{2+} extracelular y sobre las respuestas a ATP\gammaS en células paratiroideas bovinas. Panel izquierdo: la curva de concentración-respuesta para la inhibición inducida por Ca^{2+} extracelular de la formación de AMP cíclico se desplaza a la derecha por PMA (100 nM). Panel intermedio: PMA no afecta a la capacidad de ATP\gammaS para aumentar [Ca^{2+}]_{i}. Obsérvese también que la curva de concentración-respuesta para ATP\gammaS muestra el comportamiento sigmoidal clásico como una función de la concentración logarítmica, a diferencia de los cationes divalentes extracelulares.
La figura 10 es una representación gráfica que muestra la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas humanas provocada por Mg^{2+} extracelular. Las células se obtuvieron de un adenoma y se sumergieron en un baño en tampón que contiene Ca^{2+} extracelular 0,5 mM. (a) Los aumentos transitorios y sostenidos en [Ca^{2+}]_{i} provocados por Mg^{2+} extracelular (10 mM, final) muestran que los aumentos sostenidos no están afectados por nimodipino (1 \muM) pero disminuyen por La^{3+} (1 \muM) y retornan inmediatamente cuando se quela selectivamente La^{3+} mediante una concentración baja de EGTA. (b) La^{3+} (1 \muM) bloquea el aumento sostenido pero no el transitorio en [Ca^{2+}]_{i} provocado por Mg^{2+}. (c) Los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por Mg^{2+} extracelular persisten en ausencia de Ca^{2+} extracelular.
La figura 11 es una representación gráfica que muestra la movilización de Ca^{2+} intracelular provocada por neomicina o protamina en células paratiroideas bovinas. En todos los trazos, [Ca^{2+}] y [Mg^{2+}] iniciales fueron de 0,5 y 1 mM, respectivamente. En el trazo (a) y (b), las concentraciones de Ca^{2+} y Mg^{2+} se aumentaron hasta 2 y 8 mM, desde 0,5 y 1 mM, respectivamente. En los otros trazos, (c) a (i), se añadieron neomicina B (30 \muM) o protamina (1 \mug/ml) tal como se indica. Se añadieron La^{3+} (1 \muM), EGTA (1 \muM) o ionomicina (100 nM) tal como se indica. Cada trazo es representativo del patrón observado en 5 o más ensayos utilizando 3 preparaciones celulares diferentes. Barra = 1 min.
La figura 12 es una representación gráfica que muestra que la neomicina B bloquea los aumentos transitorios pero no bloquea los aumentos en el equilibrio en [Ca^{2+}], provocados por Ca^{2+} extracelular. Control izquierdo: [Ca^{2+}] fue inicialmente de 0,5 mM y se aumentó en incrementos de 0,5 mM en cada una de las puntas de flecha en blanco antes de la adición de neomicina B (30 \muM). Derecha: se añadió neomicina B (30 \muM) antes de [Ca^{2+}]. Barra = 1 min.
La figura 13 es una representación gráfica que muestra que neomicina B o protamina inhiben la secreción de PTH a concentraciones que provocan aumentos en [Ca^{2+}]_{i}. Las células se incubaron con las concentraciones indicadas de policatión orgánico durante 30 min. en presencia de Ca^{2+} extracelular 0,5 mM. Símbolos en blanco: respuestas control para la secreción de PTH en presencia de Ca^{2+} extracelular 0,5 (círculos) o 2 mM (rombos). Los valores para [Ca^{2+}]_{i} son los símbolos de rombos. Se utilizaron células bovinas en los experimentos con protamina y se utilizaron células paratiroideas humanas (adenoma) en los experimentos con neomicina B. Cada punto es la media \pm EEM de 3 experimentos.
La figura 14 es una representación gráfica que muestra los efectos inhibidores preferenciales de PMA sobre los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por espermina. La [Ca^{2+}] inicial fue de 0,5 mM; se añadieron espermina (200 \muM) o ATP (50 \muM) tal como se indica. Barra = 1 min.
La figura 15 es una representación gráfica que muestra que PMA desplaza a la derecha las curvas de concentración-respuesta para aumentos en [Ca^{2+}]_{i} inducidos por Ca^{2+} extracelular y neomicina B. Las células se pretrataron con PMA durante 1 min. antes de aumentar [Ca^{2+}] o antes de añadir neomicina B tal como se indica. Cada punto es la media \pm EEM de 3 a 5 experimentos.
La figura 16 es una representación gráfica que muestra que PMA desplaza a la derecha las curvas de concentración respuesta para la inhibición inducida por Ca^{2+} extracelular y espermina de la secreción de PTH. Las células se incubaron con la [Ca^{2+}] indicada y espermina durante 30 min. en presencia (círculos rellenos) o ausencia (círculos en blanco) de PMA 100 nM. Cada punto es la media \pm EEM de 3 experimentos.
La figura 17 es una representación gráfica que muestra que la protamina aumenta la formación de inositol fosfatos. Se incubaron células paratiroideas durante la noche en medios de cultivo que contenían 4 \muCi/ml de ^{3}H-mioinositol, se lavaron e incubaron con la concentración indicada de protamina a 37º: Tras 30 seg., se terminó la reacción mediante la adición de CHCl_{3}:MeOH:HCl e IP_{1} (círculos) e IP_{3} (triángulos) separados mediante cromatografía de intercambio aniónico. Cada punto es la media de 2 experimentos, cada uno realizado por triplicado.
La figura 18 es una representación gráfica que muestra que PMA disminuye la formación de IP_{1} provocada por Ca^{2+} extracelular o espermina. Se expusieron las células marcadas con ^{3}H-mioinositol a la [Ca^{2+}] indicada o espermina durante 30 seg. antes de terminar la reacción y determinar IP_{1} mediante cromatografía de intercambio aniónico. Columnas sombreadas: las células se pretrataron con PMA (100 nM) durante 5 min. antes de aumentar la [Ca^{2+}] o añadir espermina. Cada valor es la media de 2 experimentos, cada uno realizado por triplicado.
La figura 19 es una representación gráfica que muestra los aumentos transitorios y sostenidos en [Ca^{2+}]_{i} provocados por neomicina B en células paratiroideas humanas (adenoma). [Ca^{2+}] fue de 0,5 mM. (a) El aumento sostenido en [Ca^{2+}]_{i} provocado por neomicina B (10 \muM) disminuyó por La^{3+}. (b) El aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} provocado por neomicina B no se vio afectado por La^{3+}. (c) Los aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} persistieron en ausencia de Ca^{2+} extracelular.
La figura 20 es una representación gráfica que muestra que neomicina B provoca aumentos oscilatorios de la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus que expresan el receptor de Ca^{2+}. El trazo superior es de un ovocito tres días después de la inyección de poli(A)^{+}-ARNm de célula paratiroidea humana (hiperplásica). El trazo inferior es de un ovocito inyectado con agua. La neomicina B fracasó en provocar una respuesta en cinco ovocitos a los que se les inyectó agua y el carbacol provocó una respuesta en uno, que se muestra. En ambos trazos, el potencial de mantenimiento fue de -76 mV.
La figura 21 es una representación gráfica que muestra que la neomicina B fracasa en afectar a los aumentos basales o provocados en células C. Control, trazo izquierdo: células rMTC 6-23 cargadas con Fura-2 se sumergieron inicialmente en un baño en tampón que contenía Ca^{2+} 1 mM antes de aumentar la [Ca^{2+}] hasta 3 mM: Trazo derecho: pretratamiento con neomicina B 5 mM.
La figura 22 es una representación gráfica que muestra que Ca^{2+} extracelular provoca aumentos en [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata. Registro microfluorimétrico en un único osteoclasto de rata cargado con indo-1 y superfundido durante los tiempos indicados (barras) con tampón que contenía la [Ca^{2+}] indicada. El tampón normal, superfundido entre las barras, contenía Ca^{2+} 1 mM.
La figura 23 es una representación gráfica que muestra que la espermina o la neomicina B fracasaron en provocar aumentos en [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata. Se superfundió un osteoclasto cargado con indo-1 con la concentración indicada de espermina o neomicina B (barras en blanco) solas o junto con Ca^{2+} 20 mM (barras rellenas).
La figura 24 es una representación gráfica que muestra los efectos diferenciales de la argiotoxina (mostrado como argiopina en la figura, también se muestran las estructuras en la figura 1) 659 y la argiotoxina 636 sobre [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas. La [Ca^{2+}] inicial fue de 0,5 mM y se aumentó hasta 1,5 mM cuando se indica (trazo derecho). Cuando se indica, se añadió argiotoxina 659 (300 \muM) o argiotoxina 636 (400 \muM).
La figura 25 es una representación gráfica que muestra que Mg^{2+} o Gd^{3+} extracelulares provocan aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó poli(A)^{+}-ARNm de células paratiroideas bovinas. En el trazo (a), la concentración de Ca^{2+} extracelular fue < 1 \muM y en el trazo (b), de 0,7 mM. El trazo (c) muestra que el Mg^{2+} extracelular fracasa en provocar una respuesta en un ovocito al que sólo se le inyectó ARNm para el receptor de la sustancia K, aunque la superfusión con sustancia K provoca una respuesta. El potencial de mantenimiento fue de -70 a -80 mV.
La figura 26 es una representación gráfica que muestra que el Ca^{2+} extracelular provoca aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó poli(A)^{+}-ARNm de tejido paratiroideo humano (hiperplásico). El ovocito se probó para determinar su capacidad de respuesta a Ca^{2+} extracelular tres días después de la inyección de 50 ng de poli(A)^{+}-ARNm. El potencial de mantenimiento fue de -80 mV.
La figura 27 es una representación gráfica que muestra la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas bovinas provocada por budmunchiamina. Se añadió budmunchiamina (300 \muM, estructura también mostrada) cuando se indica.
La figura 28 es una representación gráfica que muestra que la capacidad para movilizar Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas es estereoespecífica. Se suspendieron inicialmente células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2 en tampón que contenía Ca^{2+} extracelular 0,5 mM antes de la adición de la concentración indicada de cada molécula.
La figura 29 es una representación gráfica que muestra los efectos de La^{3+} sobre [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos. Se muestra un trazo representativo de un único osteoclasto de rata cargado con indo-1. A concentraciones bajas, La^{3+} bloquea parcialmente los aumentos en [Ca^{2+}]_{i} provocados por Ca^{2+} extracelular.
Las figuras 30A y B son representaciones gráficas que muestran la movilización de Ca^{2+} intracelular provocada por Mn^{2+} extracelular en osteoclastos de rata. El Mn^{2+} extracelular provoca aumentos dependientes de la concentración en [Ca^{2+}]_{i} (figura 30A) que persisten en ausencia de Ca^{2+} extracelular (figura 30B).
Las figuras 31A y 31B son representaciones gráficas que muestran la movilización de [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata provocada por una molécula denominada NPS 449 (véase la figura 38). Se superfundieron osteoclastos de rata aislados cargados con indo-1 con las concentraciones indicadas de NPS 449 en presencia (figura 31A) o ausencia (figura 31B) de CaCl_{2} extracelular 1 mM.
La figura 32 es una representación gráfica que muestra la movilización de Ca^{2+} intracelular en células C provocada por NPS 019 (véase la figura 1). Se cargaron células rMTC 6-23 con fura-2 y se sumergieron en un baño en tampón que contenía [Ca^{2+}] 0,5 mM. Cuando se indica, se añadió NPS 019 hasta una concentración final de 10 \muM. Los trazos representativos muestran que el aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} provocado por NPS 019 no responde a la inhibición por La^{3+} (trazo intermedio) y persiste en ausencia de Ca^{2+} extracelular (trazo derecho).
La figura 33 es una representación gráfica que muestra que NPS 456 (figura 36) provoca aumentos oscilatorios en la corriente de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les había inyectado poli(A)^{+}-ARNm de células paratiroideas bovinas.
La figura 34 es una representación gráfica que muestra que Ca^{2+} extracelular provoca aumentos oscilatorios en la corriente de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les había inyectado ARNm de osteoclastos humanos. Se probó el ovocito para determinar la capacidad de respuesta a Ca^{2+} extracelular tres días después de la inyección de 50 ng de poli(A)^{+}-ARNm total.
La figura 35 es una representación gráfica que muestra que el receptor de Ca^{2+} de la célula paratiroidea está codificado por ARNm en un intervalo de tamaño de 2,5 a 3,5 kb. El poli(A)^{+}-ARNm de células paratiroideas bovinas se fraccionó por tamaños en gradientes de glicerol desnaturalizantes y se reunió en diez fracciones. Cada fracción se inyectó (50 ng/fracción) por separado en ovocitos de Xenopus. Después de tres días, se examinaron los ovocitos para determinar su capacidad para responder a Ca^{2+} extracelular con aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-}.
La figura 36 muestra las estructuras químicas de las moléculas derivadas de difenilpropil-\alpha-fenetilamina que ilustran una familia de moléculas que se preparan y seleccionan para encontrar las moléculas útiles de la invención.
La figura 37 es una representación gráfica que muestra que NPS 021 es un compuesto calciolítico que bloquea los efectos del Ca^{2+} extracelular sobre [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas. Las células se sumergieron inicialmente en un baño en tampón que contenía CaCl_{2} 0,5 mM y, cuando se indica, se aumentó la [Ca^{2+}] hasta una final de 2 mM (trazo izquierdo). La adición de NPS 021 (200 \muM) no produjo cambios en [Ca^{2+}]_{i} pero inhibió el aumento en [Ca^{2+}]_{i} producido por Ca^{2+} extracelular (trazo derecho).
La figura 38 es una gráfica que muestra la respuesta de Ca^{2+} in vivo a NPS 467.
La figura 39 es una gráfica que muestra la respuesta de PTH in vivo a NPS 467.
La figura 40 es una gráfica que muestra la respuesta de Ca^{2+} in vivo a NPS 467 25 mg/kg.
Las figuras 41 y 42 son gráficas que muestran las respuestas de Ca^{2+} in vivo a diferentes enantiómeros de NPS 467.
La figura 43a representa un esquema de reacción para la preparación de fendilina o análogos o derivados de fendilina representados en la figura 36. La figura 43b representa un esquema de reacción para la síntesis de NPS 467.
La figura 44 representa una curva de dosis-respuesta que muestra que NPS 467 disminuye el calcio ionizado en suero cuando se administra por vía oral.
Moléculas calcimiméticas y calciolíticas
Las moléculas calcimiméticas y calciolíticas útiles en la invención se describieron de manera general anteriormente. Estas moléculas pueden identificarse fácilmente utilizando procedimientos de selección para definir moléculas que imitan o antagonizan la actividad de Ca^{2+} en los receptores de Ca^{2+}. Ejemplos de tales procedimientos se facilitan a continuación. Estos ejemplos no son limitantes en la invención sino que meramente ilustran procedimientos que se utilizan fácilmente o se adaptan por los expertos en la materia.
Generalmente, las moléculas calcimiméticas y calciolíticas se identifican seleccionando moléculas que se modelan tras las descritas a continuación (denominadas moléculas líder). Tal como puede observarse a continuación, existen varios calcimiméticos y calciolíticos específicos útiles en diversos receptores de Ca^{2+}. Las moléculas de derivados se diseñan fácilmente mediante procedimientos habituales y se prueban en uno de los muchos protocolos conocidos por los expertos en la materia. Pueden seleccionarse muchas moléculas fácilmente para identificar las más útiles en esta invención.
Las moléculas catiónicas orgánicas que imitan o antagonizan las acciones de Ca^{2+} en otros sistemas contienen la estructura requerida para la actividad en un receptor de Ca^{2+}. El diseño racional de otras moléculas útiles supone el estudio de una molécula que se sabe que es calcimimética o calciolítica y luego la modificación de la estructura de la molécula conocida. Por ejemplo, las poliaminas son potencialmente calcimiméticas ya que la espermina imita la acción de Ca^{2+} en varios sistemas in vitro. Los resultados muestran que la espermina no produce, de hecho, cambios en [Ca^{2+}]_{i} y la secreción de PTH reminiscentes de los provocados por cationes di y trivalentes extracelulares (véase a continuación). Los experimentos expuestos a continuación se dirigen, por tanto, a demostrar que esta fenomenología, obtenida con espermina, supone los mismos mecanismos utilizados por Ca^{2+} extracelular. Para hacer esto, se evaluaron los efectos de espermina sobre una variedad de parámetros fisiológicos y bioquímicos que caracterizan la activación del receptor de Ca^{2+}. Aquellas moléculas que presentan efectos similares son útiles en esta invención y pueden descubrirse seleccionando o preparando moléculas que tienen una estructura similar a la espermina. Una vez que se descubre otra molécula útil, este proceso de selección puede repetirse fácilmente.
Para mayor claridad, se proporciona a continuación una serie específica de protocolos de selección para identificar tales moléculas útiles que son activas en un receptor de Ca^{2+} de una célula paratiroidea, o que actúan como agonistas o antagonistas de la respuesta celular a cambios en [Ca^{2+}]. Pueden utilizarse ensayos equivalentes para moléculas activas en otros receptores de Ca^{2+}, o que de otra forma imitan o antagonizan funciones celulares reguladas por [Ca^{2+}]. Estos ensayos ponen ejemplos de los procedimientos que son útiles para encontrar moléculas calcimiméticas de esta invención. Pueden utilizarse procedimientos equivalentes para encontrar moléculas calciolíticas seleccionando aquellas moléculas más antagonistas a las acciones de Ca^{2+} extracelular. Pueden utilizarse ensayos in vitro para caracterizar la selectividad, saturabilidad y reversibilidad de estos calcimiméticos y calciolíticos mediante técnicas habituales.
Procedimiento de selección
Generalmente, se suspendieron inicialmente células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2 en tampón que contenía CaCl_{2} 0,5 mM. Se añadió la sustancia de prueba a la cubeta en un pequeño volumen (5 a 15 \mul) y se observó cualquier cambio en la señal de fluorescencia. Se realizaron aumentos acumulativos en la concentración de la sustancia de prueba en la cubeta hasta que se alcanzó cierta concentración predeterminada o se observaron cambios en la fluorescencia. Si no se observaron cambios en la fluorescencia, la molécula se consideró inactiva y no se realizaron pruebas adicionales. En estudios iniciales, por ejemplo, con moléculas de tipo poliamina, se probaron las moléculas a concentraciones de hasta 5 ó 10 mM. Como ahora se conocen moléculas más potentes (véase a continuación), se disminuye la concentración límite. Por ejemplo, se prueban nuevas moléculas a concentraciones de hasta 500 \muM o menos. Si no se observan cambios en la fluorescencia a esta concentración, la molécula puede considerarse inactiva.
Las moléculas que producen aumentos en [Ca^{2+}]_{i} se someten a pruebas adicionales. Las dos características esenciales de la molécula importantes para su consideración como molécula calcimimética son la movilización de Ca^{2+} intracelular y la sensibilidad a los activadores de PKC. Las moléculas que producen la movilización de Ca^{2+} intracelular de una manera sensible a PMA se ha descubierto que son invariablemente moléculas calcimiméticas y que inhiben la secreción de PTH. Pueden realizarse, si se necesitan, pruebas adicionales para dar solidez a esta creencia. Normalmente, no se realizan todas las pruebas diversas para determinar la actividad calcimimética o calciolítica (véase anteriormente). En su lugar, si una molécula produce la movilización de Ca^{2+} intracelular de una manera sensible a PMA, se avanza a selección en células paratiroideas humanas. Por ejemplo, se realizan mediciones de [Ca^{2+}]_{i} para determinar la CE_{50}, y para medir la capacidad de la molécula para inhibir la secreción de PTH en células paratiroideas humanas que se han obtenido de pacientes sometidos a cirugía por hiperparatiroidismo primario o secundario. Cuanto menor es la CE_{50} o la CI_{50}, más potente es la molécula como calcimimético o calciolítico.
La medición de [Ca^{2+}]_{i} con fura-2 proporciona un medio muy rápido de seleccionar nuevas moléculas orgánicas para determinar su actividad. En una única tarde, pueden examinarse 10 a 15 moléculas y evaluarse su capacidad para movilizar Ca^{2+} intracelular (o no). También puede evaluarse la sensibilidad de cualquier aumento observado en [Ca^{2+}]_{i} hasta la disminución por PMA. Además, una única preparación celular puede proporcionar datos sobre [Ca^{2+}]_{i}, niveles de AMP cíclico, IP_{3} y secreción de PTH. Un procedimiento habitual es cargar células con fura-2 y luego dividir la suspensión celular en dos; la mayor parte de las células se utilizan para la medición de [Ca^{2+}]_{i} y el resto se incuban con moléculas para evaluar sus efectos sobre AMP cíclico y la secreción de PTH. Debido a la sensibilidad de los radioinmunoensayos para AMP cíclico y PTH, pueden determinarse ambas variables en un único tubo de incubación que contiene 0,3 ml de suspensión celular (aproximadamente 500.000 células). Las mediciones de inositol fosfatos son un aspecto de la selección que lleva tiempo. Sin embargo, las columna de intercambio iónico eluidas con cloruro (en lugar de formiato) proporcionan medios muy rápidos de selección para la formación de IP_{3} puesto que no se requiere evaporación rotatoria (que lleva aproximadamente 30 h). El procedimiento permite el procesamiento de casi 100 muestras en una única tarde. Aquellas moléculas que demuestran ser interesantes, evaluadas mediante mediciones de [Ca^{2+}]_{i}, AMP cíclico, IP_{3} y PTH se someten entonces a análisis más rigurosos examinando la formación de diversos inositol fosfatos y evaluando su forma isomérica mediante HPLC.
Las moléculas interesantes detectadas en estos protocolos se evalúan entonces para determinar la especificidad, por ejemplo, examinando sus efectos sobre [Ca^{2+}]_{i} en células C que secretan calcitonina utilizando, por ejemplo, la línea celular MTC 6-23 de rata.
Lo siguiente es ilustrativo de los procedimientos útiles en los procesos de selección. Ejemplos de resultados típicos para diversas moléculas calcimiméticas y calciolíticas de prueba se facilitan en las figuras 2 a 34.
Preparación de células paratiroideas
Se obtuvieron glándulas paratiroideas a partir de terneros recién sacrificados (de 12 a 15 semanas de edad) en un matadero local y se transportaron al laboratorio en tampón de células paratiroideas (PCB) enfriado con hielo que contenía (mM): NaCl, 126; KCl, 4; MgCl_{2}, 1; Na-HEPES, 20; pH 7,4; glucosa, 5,6 y cantidades variables de CaCl_{2}, por ejemplo, 1,25 mM. Se trataron de manera similar al tejido bovino glándulas paratiroideas humanas, obtenidas de pacientes sometidos a la extirpación quirúrgica de tejido paratiroideo por hiperparatiroidismo (HPT) primario o urémico. Se recortó de las glándulas el exceso de grasa y tejido conjuntivo y luego se cortaron con unas tijeras finas en cubos aproximados de 2 a 3 mm. Se prepararon células paratiroideas disociadas mediante digestión con colagenasa. Las células disociadas se purificaron entonces mediante centrifugación en tampón Percoll. La preparación de células paratiroideas resultante carecía esencialmente de glóbulos rojos, adipocitos y tejido capilar, tal como se evaluó mediante microscopía de contraste de fases y tinción con Sudán negro B. Las células paratiroideas disociadas y purificadas estaban presentes como pequeñas agrupaciones que contenían de 5 a 20 células. La viabilidad celular, tal como se clasifica mediante exclusión de azul tripano o bromuro de etidio, fue rutinariamente del 95%.
Aunque estas células pueden utilizarse para fines experimentales en este punto, las respuestas fisiológicas (capacidad de supresión de la secreción de PTH y niveles en reposo de [Ca^{2+}]_{i}) son mejores tras cultivar las células durante la noche. El cultivo primario también presenta la ventaja de que las células pueden marcarse con isótopos hasta cerca del equilibrio isotópico, ya que es necesario para estudios que implican mediciones del metabolismo del inositol fosfato (véase a continuación). Tras la purificación en gradientes de Percoll, las células se lavaron varias veces en una mezcla 1:1 de medio F12 de Ham-de Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO) complementado con estreptomicina 50 \mug/ml, penicilina 100 U/ml, gentamicina 5 \mug/ml e ITS^{+}. ITS^{+} es una disolución premezclada que contiene insulina, transferrina, selenio y albúmina de suero bovino (BSA)-ácido linolénico (Collaborative Research, Bedford, MA). Las células se transfieren entonces a matraces de plástico (75 o 150 cm^{2}; Falcon) y se incubaron a 37ºC en una atmósfera húmeda de CO_{2} al 5%. No se añade suero a estos cultivos durante la noche, puesto que su presencia permite que las células se unan al plástico, experimenten proliferación y se desdiferencien. Las células cultivadas en las condiciones anteriores se retiraron fácilmente de los matraces mediante decantación, y mostraron la misma viabilidad que las células recién preparadas.
Medición de Ca^{2+} citosólico
Se resuspendieron las células paratiroideas purificadas en CaCl_{2} 1,25 mM-2% de BSA-PCB que contenía acetoximetil éster de fura-2 1 \muM y se incubaron a 37ºC durante 20 minutos. Las células se sedimentaron entonces, se resuspendieron en el mismo tampón que carecía del éster, y se incubaron 15 min. adicionales a 37ºC. Las células se lavaron posteriormente dos veces con PCB que contenía CaCl_{2} 0,5 mM y 0,5% de BSA y se mantuvieron a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC). Inmediatamente antes de su uso, las células se diluyeron cinco veces con CaCl_{2} 0,5 mM-PCB precalentado para obtener una concentración final de BSA del 0,1%. La concentración de células en la cubeta utilizada para el registro de la fluorescencia fue de 1 a 2 x 10^{6}/ml.
Se midió la fluorescencia de las células cargadas con indicador a 37ºC en un espectrofluorímetro (Biomedical Instrumentation Group, University of Pennsylvania, Filadelfia, PA) equipado con un soporte de cubeta termostatizado y un agitador magnético, utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 510 nm, respectivamente. Esta fluorescencia indica el nivel de Ca^{2+} citosólico. Se calibraron las señales de fluorescencia utilizando digitonina (50 \mug/ml, final) para obtener la fluorescencia máxima (F_{max}), y EGTA (10 mM, pH 8,3, final) para obtener la fluorescencia mínima (F_{min}) y una constante de disociación de 224 nM. El escape del colorante depende de la temperatura y la mayor parte se produce en el plazo de los 2 primeros min. tras el calentamiento de las células en la cubeta; a partir de entonces el escape del colorante aumenta sólo de manera muy lenta. Para corregir la calibración para el escape de disolvente, las células se colocaron en la cubeta y se agitaron a 37ºC durante 2 a 3 min. Se retiró entonces la suspensión celular, se sedimentaron las células, y se devolvió el sobrenadante a una cubeta limpia. El sobrenadante se trató entonces con digitonina y EGTA como anteriormente para obtener una estimación del escape del colorante, que es normalmente de 10 a 15% de la señal de fluorescencia dependiente de Ca^{2+} total. Esta estimación se restó de la F_{min}
aparente.
Medición de la secreción de PTH
En la mayoría de los experimentos, se utilizaron células cargadas con fura-2 en los estudios de secreción de PTH. Cargar las células paratiroideas con fura-2 no cambia su respuesta secretora a Ca^{2+} extracelular. Las células se suspendieron en PCB que contenía CaCl_{2} 0,5 mM y 0,1% de BSA. Se realizaron incubaciones en tubos de plástico (Falcon 2058) que contenían 0,3 ml de la suspensión celular con o sin pequeños volúmenes de CaCl_{2} y/o policationes orgánicos. Tras la incubación a 37ºC durante tiempos diversos (normalmente de 30 min), los tubos se pusieron en hielo y se sedimentaron las células a 2ºC. Se llevaron muestras del sobrenadante a pH 4,5 con ácido acético y se almacenaron a -70ºC. Se utilizó este protocolo tanto para células paratiroideas bovinas como humanas.
Para células bovinas, se determinó la cantidad de PTH en los sobrenadantes de las muestras mediante un radioinmunoensayo homólogo utilizando el anticuerpo GW-1 o su equivalente a una dilución final de 1/45.000. Se utilizó ^{125}I-PTH (65-84; INCSTAR, Stillwater, MN) como trazador y se separaron fracciones mediante carbón activado por dextrano. Se realizaron el recuento de las muestras y la reducción de datos en un contador gamma Packard Cobra 5005.
Para células humanas, se utilizó un kit de radioinmunoensayo disponible comercialmente (INS-PTH; Nichols Institute; Los Ángeles, CA) que reconoce PTH humana intacta y N-terminal ya que el anticuerpo GW-1 reconoce mal a la PTH humana.
Medición de AMP cíclico
Se incubaron las células como anteriormente para los estudios de secreción de PTH y al final de la incubación, se tomó una muestra de 0,15 ml y se transfirió a 0,85 ml de agua caliente (70ºC) y se calentó a esta temperatura durante 5 a 10 min. Los tubos se congelaron y descongelaron posteriormente varias veces y se sedimentó el residuo celular mediante centrifugación. Se acetilaron partes del sobrenadante y se determinaron las concentraciones de AMP cíclico mediante radioinmunoensayo.
Medición de la formación de inositol fosfato
Se marcaron los fosfolípidos de membrana incubando células paratiroideas con ^{3}H-mioinositol 4 \muCi/ml durante 20 a 24 h. Entonces se lavaron las células y se resuspendieron en PCB que contenía CaCl_{2} 0,5 mM y 0,1% de BSA. Las incubaciones se realizaron en tubos de microcentrífuga Microfuge en ausencia o presencia de diversas concentraciones de policatión orgánico para diferentes tiempos. Las reacciones se terminaron mediante la adición de 1 ml de cloroformo/metanol/HCl 12 N (200:100:1; v/v/v). Al hidrolizado de ácido fítico (200 \mul; 25 \mug de fosfato/tubo) se le añadió entonces agua. Los tubos se centrifugaron y se diluyeron 600 \mul de la fase acuosa en 10 ml de agua.
Se separaron los inositol fosfatos mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando AG1-X8 en forma de cloruro o de formiato. Cuando sólo van a determinarse los niveles de IP_{3}, se utilizó la forma de cloruro, mientras que se utilizó la forma de formiato para resolver los principales inositol fosfatos (IP_{3}, IP_{2} e IP_{1}). Para la determinación de sólo IP_{3}, la muestra diluida se aplicó a la columna de la forma de cloruro y se lavó la columna con 10 ml de HCl 30 mM seguido por 6 ml de HCl 90 mM y se eluyó el IP_{3} con 3 ml de HCl 500 mM. El último eluato se diluyó y contó. Para la determinación de todos los principales inositol fosfatos, la muestra diluida se aplicó a la columna de la forma de formiato y eluyeron secuencialmente IP_{1}, IP_{2} e IP_{3} mediante concentraciones crecientes de tampón formiato. Las muestras eluidas de las columnas de formiato se evaporaron por rotación, los residuos se llevaron a combinación y se contaron.
Las formas isoméricas de IP_{3} se evaluaron mediante HPLC. Las reacciones se terminaron mediante la adición de 1 ml de ácido perclórico 0,45 M y se almacenaron en hielo durante 10 min. Tras la centrifugación, se ajustó el sobrenadante a pH 7 a 8 con NaHCO_{3}. El extracto se aplicó entonces a una columna de intercambio aniónico Partisil SAX y se eluyeron con un gradiente lineal de formiato de amonio. Las diversas fracciones se desalaron entonces con Dowex seguido por evaporación rotatoria antes del recuento por centelleo líquido en un Packard Tricarb 1500 LSC.
Para todos los procedimientos de separación de inositol fosfato, se utilizaron los controles apropiados utilizando patrones auténticos para determinar si los policationes orgánicos interfirieron en la separación. Si es así, las muestras se trataron con resina de intercambio catiónico para eliminar la molécula culpable antes de la separación de los inositol fosfatos.
Medición de Ca^{2+} citosólico en células C
Se cultivaron células C neoplásicas derivadas de un carcinoma medular de tiroides de rata (rMTC 6-23) obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (nº ATCC 1607) como monocapas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más 15% de suero de caballo en ausencia de antibióticos. Para las mediciones de [Ca^{2+}]_{i}, las células se recogieron con un 0,02% de EDTA/0,05% de tripsina, se lavaron con PCB que contenía CaCl_{2} 1,25 mM y 0,5% de BSA, y se cargaron con fura-2 como se describió anteriormente para las células paratiroideas. Las mediciones de [Ca^{2+}]_{i} se realizaron tal como se describió anteriormente con correcciones apropiadas para el escape de colorante.
Medición de [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata
Se obtuvieron osteoclastos de ratas Sprague-Dawley de 1 a 2 días utilizando condiciones asépticas. Las crías de rata se sacrificaron por decapitación, se extirparon las patas traseras y los fémures se liberaron rápidamente de tejido blando y se colocaron en medios F-12/DMEM precalentados (DMEM conteniendo 10% de suero bovino fetal y antibióticos (penicilina-estreptomicina-gentamicina; 100 U/ml-100 \mug/ml-100 \mug/ml)): Los huesos de dos crías se cortaron longitudinalmente y se colocaron en 1 ml de medio de cultivo. Se obtuvieron células óseas mediante trituración suave de los fragmentos de hueso con una pipeta de plástico y se diluyeron con medio de cultivo. Se permitió que los fragmentos de hueso sedimentaran y se transfirieron porciones iguales (de aproximadamente 1 ml) de medio a una placa de cultivo de 6 pocillos que contenía cubreobjetos de vidrio de 25 mm. Se permitió que las células sedimentaran durante 1 h a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2}-aire. Entonces los cubreobjetos se lavaron tres veces con medio nuevo para eliminar las células no adherentes. Se realizaron mediciones de [Ca^{2+}]_{i} en los osteoclastos en un plazo de 6 a 8 h desde la eliminación de las células no adherentes.
Las células unidas al cubreobjetos se cargaron con indo-1 mediante incubación con acetoximetil éster de indo-1 5 \muM/0,01% de Pluronic F28 durante 30 min. a 37ºC en F-12/DMEM que carece de suero y que contiene en su lugar 0,05% de BSA. Los cubreobjetos se lavaron posteriormente e incubaron 15 min. adicionales a 37ºC en F-12/DMEM que carece de éster antes de transferirse a una cámara de superfusión montada en una fase de un microscopio invertido Nikon Diaphot equipado para microfluorimetría. Los osteoclastos se identificaron fácilmente por su gran tamaño y presencia de múltiples núcleos. Las células se superfundieron con tampón (normalmente PCB que contiene un 0,1% de BSA y Ca^{2+} 1 mM) a 1 ml/min con o sin la sustancia de prueba. La fluorescencia emitida por excitación a 340 nm se dirigió a través del puerto de vídeo del microscopio sobre un espejo dicroico 440 nm y se recogió la intensidad de fluorescencia a 495 y 405 nm mediante tubos fotomultiplicadores. Se amplificaron las salidas de los tubos fotomultiplicadores, se digitalizaron y se almacenaron en un PC 80386. Se utilizaron las razones de la intensidad de fluorescencia para estimar [Ca^{2+}]_{i}.
Expresión en ovocitos
En estudios adicionales, se utilizaron ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó ARNm de células paratiroideas bovinas o humanas en protocolos de selección, y se midió la conductancia de Cl^{-} como un medio indirecto de monitorizar aumentos en [Ca^{2+}]_{i}. Lo que sigue es un ejemplo para probar el efecto de la neomicina.
Se inyectaron ovocitos con ARNm enriquecido con poli(A)^{+} de tejido paratiroideo humano (glándulas hiperplásicas de un caso de HPT secundario). Después de 3 días, se probaron los ovocitos para determinar su respuesta a la neomicina. La neomicina provocó aumentos fluctuantes en la conductancia de Cl^{-} que cesaron con la superfusión con solución salina libre de fármacos (véase la figura 20). Se observaron respuestas a la neomicina B a concentraciones de entre 100 \muM y 10 mM. Para garantizar que la respuesta provocada por la neomicina B se supeditaba a la inyección de ARNm paratiroideo, se determinó el efecto de la neomicina B sobre corrientes en ovocitos a los que se inyectó agua. En cada uno de los cinco ovocitos examinados, la neomicina B (10 mM) fracasó en producir cualquier cambio en la corriente. Se sabe que aproximadamente el 40% de los ovocitos responden a carbacol, un efecto mediado por un receptor muscarínico endógeno. En cinco ovocitos examinados, uno mostró corrientes interiores en respuesta al carbacol, y esto se demuestra en el trazo inferior de la figura 20. Por tanto, en las células que expresan un receptor muscarínico acoplado a aumentos en [Ca^{2+}]_{i}, y en la conductancia de Cl^{-}, la neomicina fracasa en provocar una respuesta. Esto demuestra que la respuesta a la neomicina B depende de la expresión de una proteína específica codificada por el ARNm de célula paratiroidea. Esto sugiere de manera bastante convincente que en las células intactas, la neomicina B actúa directamente en el receptor de Ca^{2+} para alterar la función de la célula paratiroidea.
Diseño de fármacos a partir de moléculas líder
Ciertas moléculas orgánicas imitan o antagonizan la acción del Ca^{2+} extracelular actuando en el receptor de Ca^{2+} tal como se demuestra en la presente memoria. Sin embargo, las moléculas probadas no son necesariamente adecuadas como candidatos de fármacos, pero sirven para demostrar que la hipótesis que subyace en los tratamientos basados en el receptor de Ca^{2+} es correcta. Estas moléculas pueden utilizarse para determinar características estructurales que les permiten actuar en el receptor de Ca^{2+}, y por tanto, seleccionar las moléculas útiles en esta invención.
Sigue un ejemplo de uno de tales procedimientos analíticos: este ejemplo se detalla en los ejemplos de más adelante, pero se utiliza aquí para demostrar el fundamento que puede utilizarse para diseñar moléculas útiles de esta invención a partir de las moléculas líder tratadas en la presente memoria. Los expertos en la materia reconocerán las etapas analíticas definidas en el ejemplo y que pueden llevarse a cabo análisis análogos en otras moléculas líder hasta que se defina el calcimimético o calciolítico más deseado.
Más adelante también se proporcionan otros ejemplos. Juntos, los datos presentados demuestran que las moléculas líder útiles tendrán grupos aromáticos que se sustituyen preferentemente en una o más posiciones, y tal como se desee pueden presentar grupos alquilo sustituidos o no sustituidos ramificados o lineales. Además, es importante seleccionar moléculas de estereoespecificidad correcta para garantizar una mayor afinidad por el receptor de Ca^{2+} deseado. Por tanto, estos datos indican a los expertos en la materia moléculas líder apropiadas que pueden derivatizarse para hallar moléculas óptimas deseadas de esta invención, tal como se describe más adelante.
Aunque diversas estructuralmente, las moléculas que se prueban pueden presentar características comunes que pueden estudiarse. En este ejemplo, se probó la correlación entre la carga positiva neta y la potencia en la movilización del Ca^{2+} intracelular. La protamina (+21; CE_{50} = 40 nM) fue más eficaz que la neomicina B (+6; CE_{50} = 20 \muM en células paratiroideas humanas y 40 \muM en células paratiroideas bovinas) que fue más eficaz que la espermina (+4; CE_{50}-150 \muM) a la hora de producir la movilización de [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas. Estos resultados han planteado la cuestión de si la carga positiva sola determina la potencia, o si existen otras características estructurales que contribuyan a la actividad en el receptor de Ca^{2+}. Esto es importante de determinar al principio porque tiene un gran impacto sobre la visión de que el receptor de Ca^{2+} puede seleccionarse como diana con moléculas terapéuticas específicas y eficaces. Por tanto, pueden estudiarse una variedad de otros policationes orgánicos relacionados con neomicina B y espermina para determinar la relación entre la carga positiva neta de una molécula y su potencia para movilizar el Ca^{2+} intracelular.
La primera serie de moléculas estudiadas fueron los aminoglucósidos. Las moléculas se examinaron en células paratiroideas bovinas y se determinó sus CE_{50} para la movilización de Ca^{2+} intracelular. Para los aminoglucósidos, el orden de rango de potencia para provocar aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico fue neomicina B (CE_{50} = 20 ó 40 \muM) > gentamicina (150 \muM) > bekanamicina (200 \muM) > estreptomicina (600 \muM). La kanamicina y la lincomicina no presentaron efecto cuando se probaron a una concentración de 500 \muM. La carga positiva neta en estos aminoglucósidos a pH 7,3 es neomicina B (+6) > gentamicina (+5) = bekanamicina (+5) > kanamicina (promedio de +4,5) > estreptomicina (+3) > lincomicina (+1). Entonces, dentro de la serie de aminoglucósidos, existe alguna correlación entre la carga positiva neta pero no es absoluta, y la kanamicina, que se predeciría que es más potente que la estreptomicina, no tiene actividad.
La prueba de diversas poliaminas reveló discrepancias adicionales y más marcadas entre la carga positiva neta y la potencia. Se examinaron tres clases estructurales de poliaminas: (1) de cadena lineal, (2) de cadena ramificada, y (3) cíclicas. En la figura 1 se proporcionan las estructuras de las poliaminas probadas. Entre las poliaminas de cadena lineal, la espermina (+4; CE_{50} = 150 \muM) fue más potente que la pentaetilenhexamina (+6; CE_{50} = 500 \muM) y la tetraetilenpentamina (+5; CE_{50} = 2,5 \muM) aun cuando las últimas moléculas tienen una carga positiva neta
superior.
Se sintetizaron algunas poliaminas de cadena ramificada que tienen números diferentes de grupos amino secundarios y primarios y por tanto varían en la carga positiva neta. Se examinaron dos de estas moléculas, NPS 381 y NPS 382, para determinar los efectos en [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas. NPS 382 (+8; CE_{50} = 50 \muM) fue aproximadamente dos veces más potente que NPS 381 (+10; CE_{50} = 100 \muM) aun cuando contiene dos cargas positivas menos.
Se observó una discrepancia similar entre la carga positiva y la potencia en experimentos con poliaminas cíclicas. Por ejemplo, el hexacicleno (+6; CE_{50} = 20 \muM) fue más potente que NPS 383 (+8; CE_{50} = 150 \muM). Los resultados obtenidos con estas poliaminas demuestran que la carga positiva no es el único factor que contribuye a la potencia.
Estudios adicionales proporcionaron discernimiento en las características estructurales de las moléculas que confieren actividad en el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas. Una de las características estructuralmente importantes es la distancia intramolecular entre los nitrógenos (que portan la carga positiva). Así, la espermina es 50 veces más potente que la trietilentetramina (CE_{50} = 8 mM) en provocar aumentos en [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas aunque ambas moléculas portan una carga positiva neta de +4. La única diferencia en la estructura entre estas dos poliaminas es el número de metilenos que separa los nitrógenos: en la espermina es 3-4-3 mientras en la trietilentetramina es 2-2-2. Este cambio aparentemente sin importancia en el espaciado entre nitrógenos tiene profundas implicaciones para la potencia y sugiere que las relaciones conformacionales de los nitrógenos dentro de la molécula son críticas. Los resultados obtenidos con hexacicleno y pentaetilenhexamina apoyan esto. La primera molécula es simplemente el análogo cíclico de la última y contiene el mismo número de metilenos entre todos los nitrógenos, aunque la presencia de la estructura en anillo aumenta la potencia 25 veces. Estos resultados indican que la carga positiva per se no es un factor crítico determinante de la actividad de una molécula orgánica en un receptor de Ca^{2+}.
Otra serie de experimentos revela la importancia de grupos aromáticos en la determinación de la actividad en el receptor de Ca^{2+}. Se obtuvieron los resultados con dos arilalquilaminas aisladas a partir del veneno de la araña Argiope lobata. Estas moléculas, argiotoxina 636 y argiotoxina 659, tienen partes policatiónicas idénticas unidas a diferentes grupos aromáticos (figura 24). La argiotoxina 659 provocó aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas cuando se probó a concentraciones de 100 a 300 \muM. Por el contrario, la argiotoxina 636 no tuvo efectos cuando se probó a concentraciones similares (figura 24). La única diferencia en estructura entre estas dos arilalquilaminas está en la parte aromática de las moléculas: la argiotoxina 659 contiene un resto de 4-hidroxi-indol mientras que la argiotoxina 636 contiene un grupo 2,4-dihidroxifenilo. La carga positiva neta en estas dos arilalquilaminas es la misma (+4), así sus diferentes potencias deben resultar de los grupos aromáticos diferentes. Esto demuestra que la carga positiva neta sola no determina la potencia. Sin embargo, la importancia real de estos hallazgos es el descubrimiento de que los grupos aromáticos contribuyen de manera significativa a la capacidad de las moléculas para activar el receptor de Ca^{2+}.
La agatoxina 489 (NPS 017) y la agatoxina 505 (NPS 015) producen ambas la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas con CE_{50} de 6 y 22 \muM, respectivamente. La única diferencia en la estructura de estas moléculas es el grupo hidroxilo en el resto indol (figura 1). Esto demuestra que las sustituciones en la región aromática de la molécula pueden influir en la potencia. Esto indica que las moléculas líder adicionales que deben estudiarse incluirán aquellas moléculas que tienen restos aromáticos sustituidos.
Las características estructurales que deben variarse sistemáticamente en las moléculas líder descritas en la presente memoria incluyen (1) la carga positiva neta, (2) el número de metilenos que separan los nitrógenos, y (3) las versiones cíclicas de, por ejemplo, poliaminas, con y sin cambios en el espaciado de los metilenos y la carga positiva neta. Además pueden examinarse variaciones sistemáticas en la estructura y localización de los grupos aromáticos, por ejemplo, en una variedad de arilalquilaminas aisladas a partir de venenos de avispas y arañas; y pueden prepararse moléculas sintéticas mediante el acoplamiento de restos aromáticos comercialmente disponibles al resto poliamina de argiotoxina. El resto poliamina de argiotoxina puede acoplarse fácilmente a cualquier resto aromático que contenga un ácido carboxílico. Por tanto, es simple el seleccionar sistemáticamente los derivados de hidroxilo y de metoxilo del ácido fenilacético y del ácido benzoico así como la serie del ácido hidroxi-indolacético. También pueden prepararse análogos que contengan funcionalidades heteroaromáticas y evaluarse para determinar la actividad.
Las comparaciones de la potencia y eficacia entre tales moléculas revelarán la estructura óptima y la localización del grupo aromático a una carga positiva constante.
Una de las variaciones estructurales en el motivo de poliamina que parece aumentar la potencia es la presencia de la versión cíclica de la molécula original de cadena lineal. La bundmunchiamina A, aislada a partir de la planta Albizia amara, es un derivado cíclico de espermina (figura 1). La adición de bundmunchiamina A a células paratiroideas bovinas provocó un aumento rápido y transitorio en [Ca^{2+}] que persistió en la ausencia de Ca^{2+} extracelular y se suavizó mediante pretratamiento con PMA. Por tanto, produce la movilización de Ca^{2+} intracelular en las células paratiroideas, actuando probablemente sobre el receptor de Ca^{2+}. Es aproximadamente equipolente con la espermina (CE_{50} aproximadamente 200 \muM) aunque porta una carga positiva menos (+3) que la espermina.
Los resultados obtenidos con bundmunchiamina A demuestran el poder predictivo de los estudios de estructura-actividad y la nueva información estructural que va a obtenerse mediante la prueba de productos naturales. Por tanto, la selección de productos naturales, seleccionados racionalmente partiendo de la base de información estructural, puede llevarse a cabo fácilmente por ejemplo, pueden seleccionarse moléculas partiendo de la base de principios quimiotaxonómicos bien establecidos utilizando bases de datos apropiadas, tales como Napralert. Por ejemplo, pueden seleccionarse alcaloides de poliaminas macrocíclicas derivados a partir de legumbres papilionoideas relacionadas con Albizia, tales como Pithecolobium y otras moléculas derivadas de plantas.
La figura 36 proporciona un segundo ejemplo de una serie de moléculas que se seleccionaron para determinar moléculas útiles de esta invención. Generalmente, estas moléculas se derivaron a partir de fendilina y se probaron para determinar sus CE_{50} respectivas. Además, la prueba de moléculas relacionadas, tales como NPS 447 y NPS 448 revela efectos estereoespecíficos de la estructura molecular. Los compuestos más activos probados hasta la fecha son los compuestos nuevos designados NPS 467 y NPS 568 que presentan valores de CE_{50} inferiores a 5 \muM. Los expertos en la materia, mediante la revisión de esta serie de moléculas, pueden determinar otros derivados adecuados que pueden probarse en la invención.
Estos ejemplos demuestran el diseño general y el proceso de selección útiles en esta invención, e indican que pueden seleccionarse bibliotecas de compuestos adicionales y de productos naturales tal como desean los expertos en la materia para determinar otras moléculas líder útiles o moléculas nuevas de esta invención.
Ejemplos de moléculas útiles como calcimiméticos incluyen poliaminas cíclicas o ramificadas, poliaminoácidos cargados positivamente, y arilalquilaminas. Además, son calcimiméticos útiles otras moléculas orgánicas cargadas positivamente, incluyendo moléculas que se producen naturalmente y sus análogos. Preferentemente, estas moléculas que se producen naturalmente y sus análogos tienen razones de la carga positiva con respecto a la masa que se correlacionan con las razones de las moléculas puestas como ejemplo en la presente memoria. (Ejemplos incluyen material aislado de animales marinos, venenos de artrópodos, plantas terrestres y caldos de fermentación derivados a partir de bacterias y hongos). Se considera que un grupo de moléculas que se producen naturalmente y análogos preferidos útiles como calcimiméticos tendrán una razón de cargas positivas-peso molecular (en dalton) de desde aproximadamente 1:40 hasta 1:200, preferentemente de desde aproximadamente 1:40 hasta 1:100. A continuación se proporcionan ejemplos más específicos de tales moléculas.
Poliaminas
Las poliaminas útiles como calcimiméticos pueden ser ramificadas o cíclicas. Potencialmente, las poliaminas ramificadas o cíclicas tienen una actividad calcimimética más elevada que sus análogos de cadena lineal. Es decir, las poliaminas cíclicas o ramificadas tienden a presentar una CE_{50} inferior que sus poliaminas lineales correspondientes con la misma carga efectiva a pH fisiológico. (véase la tabla 1).
TABLA 1
Molécula Carga (+) neta CE_{50} (\muM)
Neomicina +6 20 ó 40
Hexacicleno +6 20
NPS 382 +8 50
NPS 381 +10 100
NPS 383 +8 150
Gentamicina +5 150
Espermina +4 150
Bekanamicina +5 200
Argiotoxina-659 +4 300
Pentaetilenhexamina (PEHA) +6 500
TABLA 1 (continuación)
Molécula Carga (+) neta CE_{50} (\muM)
Estreptomicina +3 600
Espermidina +3 2.000
Tetraetilenpentamina (TEPA) +5 2.500
1,12-diaminodocecano (DADD) +2 3.000
Trietilentramina (TETA) +4 8.000
"Poliaminas ramificadas" tal como se utilizan en la presente memoria se refiere a una molécula de cadena que está constituida por puentes alquilo cortos o grupos alquilo unidos mediante enlaces amino, y que contiene también puntos en los que la cadena se ramifica. Estos "puntos de ramificación" pueden localizarse en un átomo de carbono o en un átomo de nitrógeno, preferentemente en un átomo de nitrógeno. Normalmente, un punto de ramificación de átomo de nitrógeno es una amina terciaria pero también puede ser cuaternaria. Una poliamina ramificada puede presentar de 1 a 20 puntos de ramificación, preferentemente de 1 a 10 puntos de ramificación.
Generalmente, los puentes alquilo y las ramificaciones alquilo en una poliamina ramificada son de desde 1 hasta 50 átomos de carbono en longitud, preferentemente de desde 2 hasta 6 átomos de carbono. Las ramificaciones alquilo también pueden interrumpirse por uno o más heteroátomos (nitrógeno, oxígeno o azufre) o sustituirse con grupos funcionales tales como: halógeno, incluyendo flúor, cloro, bromo, o yodo; hidroxilo; nitro; aciloxilo (R'COO-), acilamido (R'CONH-), o alcoxilo (-OR'), en los que R' puede contener de desde 1 hasta 4 átomos de carbono. Las ramificaciones alquilo también pueden sustituirse con grupos que están cargados positivamente a pH fisiológico, tales como amino o guanido. Estos sustituyentes funcionales pueden añadir o cambiar propiedades físicas tales como la solubilidad para aumentar la actividad, la administración o la biodisponibilidad de las moléculas.
Las poliaminas ramificadas pueden presentar tres o más puntos de terminación de cadena o ramificación. Estos puntos de terminación pueden ser grupos metilo o grupos amino, preferentemente grupos amino.
Un grupo de moléculas es el grupo de poliaminas ramificadas que presentan la fórmula:
H_{2}N-(CH_{2})_{j}-(NR_{i}-(CH_{2})_{j})_{k}-NH_{2}
en la k es un número entero de desde 1 hasta 10, cada j es igual o diferente y es un número entero de desde 2 hasta 20, y cada R_{i} es igual o diferente y se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno y (CH_{2})_{j}-NH_{2} en el que j es tal como se definió anteriormente, y al menos un R_{i} no es hidrógeno.
Poliaminas ramificadas de ejemplo son las moléculas N^{1},N^{1},N^{5},N^{10},N^{14},N^{14}-hexakis-(3-aminopropil)-espermina y N^{1},N^{1},N^{5},N^{14},N^{14}-tratrakis-(3-aminopropil)-espermina denominadas como NPS 381 y UPS 382, respectivamente en la figura 1.
"Poliaminas cíclicas" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a heterociclos que contienen dos o más heteroátomos (nitrógeno, oxígeno o azufre), al menos dos de los cuales son átomos de nitrógeno. Generalmente los heterociclos son de desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 átomos en circunferencia, preferentemente de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos en circunferencia. Los heteroátomos de nitrógeno están separados por de 2 a 10 átomos de carbono. Los heterociclos también pueden sustituirse en los sitios de nitrógenos con grupos aminoalquilo o aminoarilo (NH_{2}R-), en los que R es aminoarilo o un alquilo inferior de 2 a 6 átomos de carbono.
Poliaminas cíclicas de ejemplo se muestran en la figura 1, tales como hexacicleno (1, 4, 7, 10, 13, 16-hexaazaciclooctadecano) y NPS 383.
Poliaminoácidos
Los poliaminoácidos pueden contener dos o más residuos de aminoácidos cargados positivamente a pH fisiológico. Estos aminoácidos cargados positivamente incluyen histidina, lisina y arginina. Estos polipéptidos variarán en longitud de desde 2 hasta 800 aminoácidos en longitud, más preferentemente de desde 20 hasta 300 amino ácidos en longitud. Estos polipéptidos pueden estar constituidos por un único residuo de aminoácido que se repite, o puede presentar la variedad de una proteína o enzima que se produce naturalmente.
Los residuos de aminoácido que comprenden los poliaminoácidos pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos que se producen naturalmente, u otros residuos alternativos. Residuos alternativos, incluyen, por ejemplo, los \omega-aminoácidos de la fórmula H_{2}N(CH_{2})_{n}cooh, en la que n es de desde 2 hasta 6. Estos son aminoácidos neutros, no polares, como la sarcosina, t-butilalanina, t-butilglicina, N-metilisoleucina, norleucina, fenilglicina, citrulina, sulfóxido de metionina, ciclohexilalanina e hidroxiprolina. La ornitina es un residuo de aminoácido cargado positivamente alternativo. Los poliaminoácidos de esta invención también pueden derivatizarse químicamente mediante procedimientos conocidos.
Poliaminoácidos de ejemplo incluyen poliarginina, polilisina, y poli(arginiltirosina), que presentan 20 a 300 residuos. Otro poliaminoácido preferido es la protamina, o un análogo de la protamina.
Arilalquilaminas
"Arilalquilaminas" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una clase de toxinas cargadas positivamente derivadas a partir de venenos de artrópodos. Las arilalquilaminas preferidas de esta invención incluyen filantotoxina-433, argiotoxina-636 y argiotoxina-659, agatoxina 505, agatoxina 489, cuyas estructuras se muestran en la figura 1, y otras moléculas sintéticas modeladas tras estos productos naturales, tales como NPS 019.
Componentes adicionales
Las composiciones de esta invención incluyen no sólo al menos un calcimimético o calciolítico, sino que también pueden incluir ciertos componentes adicionales. Estos componentes adicionales incluyen componentes de selección de diana, marcadores, y otras funcionalidades que pueden ser útiles en las aplicaciones de la presente memoria, por ejemplo, para la selección de agonistas o antagonistas de Ca^{2+} extracelular.
Por ejemplo, puede utilizarse una inmunoglobulina o una parte de la misma, o un ligando específico para células paratiroideas o un receptor de Ca^{2+} como un componente específico de diana. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal y puede comprender anticuerpos completos o fragmentos inmunológicamente reactivos de estos anticuerpos tales como F_{ab'}, F_{ab'} o (F_{ab'})_{2}. También pueden utilizarse ligandos específicos de receptor.
Las composiciones de esta invención también pueden contener componentes derivatizados con una molécula o un ión que actúa como un marcador. Puede utilizarse una gran variedad de restos marcadores, incluyendo radioisótopos, cromóforos y marcadores fluorescentes. En particular el marcaje con radioisótopos puede detectarse fácilmente in vivo. Los radioisótopos pueden acoplarse mediante coordinación como cationes en el sistema de porfirina. Los cationes útiles incluyen tecnecio, galio, e indio. En las composiciones, la molécula cargada positivamente puede unirse a o asociarse con un marcador.
Métodos de síntesis
Las estrategias para la síntesis y la modificación de poliaminas implican el uso de una variedad de grupos protectores de aminas (ftalimido, BOC, CBZ, bencilo, y nitrilo) que pueden eliminarse de manera selectiva para construir moléculas funcionalizadas. Los métodos sintéticos implicados se modelan a la manera de los utilizados para construir argiopinas 636 y 659 y otras arilalquilaminas derivadas a partir de venenos de araña.
Normalmente, se llevaron a cabo extensiones de cadena de 2-4 metilenos mediante alquilación con la N-(bro-
moalquil)ftalimida correspondiente. Se sometió a reflujo en acetonitrilo una mezcla 1:1,2 de amina con respecto a la bromoalquilftalimida en la presencia de KF al 50% sobre celita. También se llevaron a cabo extensiones de cadena mediante alquilación de una amina dada con acrilonitrilo o acrilato de etilo. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante CCF y se purificaron los productos intermedios sobre gel de sílice utilizando combinaciones de diclorometano, metanol e isopropilamina. Se purificaron productos finales mediante intercambio catiónico (HEMA-SB) y RP-HPLC (Vydac C-18). Se llevó a cabo la verificación de la pureza y la estructura mediante RMN de ^{1}H y ^{13}C y espectrometría de masas de alta resolución (EI, CI y/o FAB).
Se añadieron los grupos protectores BOC mediante el tratamiento de una amina (1^{aria} o 2^{aria}) con dicarbonato de di-terc-butilo en diclorometano en la presencia de una cantidad catalítica de dimetilaminopiridina. Se aplicaron grupos protectores bencilo de una de estas dos maneras: (1) condensación de una amina 1^{aria} con benzaldehído seguida de reducción con borohidruro de sodio o (2) alquilación de una amina 2^{aria} con bromuro de bencilo en la presencia de KF. Los enlaces amida y las ciclaciones se llevaron a cabo normalmente mediante la reacción de una amina (1^{aria} o 2^{aria}) con el éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido dado. Esto se llevó a cabo directamente (en el caso de las ciclaciones) mediante el tratamiento del "aminoácido" con diciclohexilcarbodiimida en condiciones de dilución.
Las desprotecciones de la funcionalidad ftalimido se llevaron a cabo mediante la reducción con hidrazina en metanol a reflujo. Las desprotecciones de la funcionalidad BOC se llevaron a cabo en TFA anhidra. La desprotección de las funcionalidades protectoras bencilo, nitrilo y CBZ se llevó a cabo mediante reducción en ácido acético glacial a 55 psi de hidrógeno en la presencia de una cantidad catalítica de hidróxido de paladio sobre carbono. Se redujeron de manera selectiva las funcionalidades nitrilo (en la presencia de grupos CBZ y bencilo) en hidrógeno en la presencia de níquel Raney en esponja.
Específicamente, se prepararon poliaminas ramificadas normalmente a partir de diaminoalcanos simples de fórmula NH_{2}-(CH_{2})_{n}-NH_{2}, o poliaminas simples tales como espermidina o espermina. Se protege o "enmascara" una de las dos aminas primarias (terminales) con un grupo protector tal como BOC (t-butiloxicarbonilo), ftalimido, bencilo, 2-etilnitrilo (el producto de producción por condensación de Michael de una amina y acrilonitrilo), o amida. Una reacción típica es la adición de un grupo protector BOC mediante el tratamiento con dicarbonato de di-t-butilo (anhídrido de BOC):
2 
\vskip1.000000\baselineskip
El producto monoprotegido se separa de los productos diprotegidos y sin proteger mediante simples técnicas cromatográficas o de destilación.
Entonces la amina libre restante en el producto monoprotegido se alquila (se acila) de manera selectiva con un agente alquilante (o acilante). Para garantizar la monoalquilación, la amina libre se protege parcialmente mediante condensación con benzaldehído seguida de la reducción con borohidruro de sodio para formar el derivado de N-bencilo:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Entonces el derivado de N-bencilo se hace reaccionar con el agente alquilante. Un agente alquilante típico es una N-(bromoalquil)ftalimida, que reacciona tal como sigue:
4 
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Por ejemplo, se utiliza N-(bromobutil)ftalimida para extender o ramificar la cadena con cuatro unidades metileno. De manera alternativa, la reacción con acrilonitrilo seguida de la reducción del grupo ciano extenderá la cadena mediante tres metilenos y un grupo amino.
Entonces pueden separarse de manera selectiva los grupos protectores de la molécula resultante de cadena extendida para producir una nueva amina libre. Por ejemplo, se utiliza ácido trifluoroacético para eliminar un grupo BOC; se utiliza hidrogenación catalítica para reducir una funcionalidad nitrilo y eliminar un grupo bencilo; y se utiliza hidrazina para eliminar grupos ftalimido tal como sigue:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
La nueva amina libre puede alquilarse (o acilarse) adicionalmente como anteriormente para aumentar la longitud de la poliamina. Se repite este proceso hasta que se obtiene la longitud de cadena y el número de ramificaciones deseados. En la etapa final, la desprotección del producto da como resultado la poliamina deseada. Sin embargo, pueden efectuarse modificaciones adicionales en el extremo protegido antes de la desprotección, de la siguiente manera:
\newpage
Por ejemplo, antes de la desprotección de BOC, se acila la poliamina con el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3,4-dimetoxifenilacético para producir una poliamina desprotegida:
6
En último término, ésta producirá una aril poliamina. Entonces puede eliminarse de manera selectiva el grupo BOC con ácido trifluoroacético para exponer el otro extremo amino-terminal que puede extenderse como anteriormente.
Pueden formarse ciertas aminas ramificadas alquilando o acilando simultáneamente las aminas primarias y secundarias libres en una poliamina formada como anteriormente. Por ejemplo, el tratamiento de espermina con un exceso de acrilonitrilo seguido de reducción catalítica produce lo siguiente:
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Pueden prepararse poliaminas cíclicas como anteriormente empezando con materiales de partida tales como hexacicleno (Aldrich Chem.).
Puede prepararse el poliaminoácido mediante técnicas recombinantes conocidas en la técnica, o pueden sintetizarse utilizando técnicas en fase sólida habituales conocidas en la técnica. Se comienza la síntesis en fase sólida a partir del extremo carboxi-terminal del péptido utilizando un aminoácido protegido en \alpha-amino. Pueden utilizarse grupos protectores BOC para todos los grupos amino aunque estén disponibles otros grupos protectores. Por ejemplo, puede esterificarse BOC-lys-OH a soportes de resina de poliestireno clorometilado. Preferentemente el soporte de resina de poliestireno es un copolímero de estireno con aproximadamente del 0,5 al 2% de divinilbenceno como agente de reticulación que hace que el polímero de poliestireno sea completamente insoluble en ciertos disolventes orgánicos. Véase Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969), W.H. Freeman Co., San Francisco; y Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149-2154. También se muestran como ejemplo estos y otros métodos de síntesis peptídica en las patentes US nº 3.862.925; nº 3.842.067; nº 3.972.859; y nº 4.105.602.
La síntesis polipeptídica puede utilizar técnicas manuales o automáticas empleando, por ejemplo un sintetizador peptídico 403A de Applied Biosystems (Foster City, California) o un sintetizador peptídico automático SAMII de Biosearch (Biosearch, Inc., San Rafael, California), siguiendo las instrucciones proporcionadas en el manual de instrucciones aportado por el fabricante.
Las arilalquilaminas son productos naturales aislados mediante técnicas conocidas, o sintetizados tal como se describe en Jasys et al., Tetrahedron Lett. (1988) 29: 6223-6226, y Nason et al., Tetrahedron Lett. (1989). 30: 2337-2340.
Un protocolo general para la preparación de fendilina (o análogos de fendilina mostrados en la figura 36) es tal como sigue. En un matraz de fondo redondo de 10 ml equipado con una barra de agitación magnética y un septo de goma, 1,0 mol de 3,3'-bisfenilpropilamina (o alquilamina primaria) en 2 ml de etanol se trató con 1,1 moles de fenol y 1,0 mol de acetofenona (o acetofenona sustituida). A esto se añadieron 2,0 moles de MgSO_{4} y 1,0 mol de NaCNBH_{3}. Esto se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC) durante 24 horas. Se vertió la reacción en 50 ml de éter y se lavó 3 veces con NaOH 1 N y una vez con salmuera. Se secó la fase de éter con K_{2}CO_{3} y se redujo a vacío. Entonces se purificó el producto mediante cromatografía en columna o HPLC incorporando una fase estacionaria de sílice con combinaciones de CH_{2}Cl_{2}-metanol-isopropilamina (normalmente 3% de metanol y 0,1% de isopropilamina en cloruro de metileno).
Un procedimiento preferido para preparar fendilina o análogos de fendilina (tales como los representados en la figura 36) utiliza isopropóxido de titanio (IV) y se modificó a partir de procedimientos descritos en J. Org. Chem. 55: 2552 (1990). Para la síntesis de NPS 544, se utilizó tetracloruro de titanio (procedimiento descrito en Tetrahedron Letters 31: 5547 (1990)) en lugar de isopropóxido de titanio (IV). El esquema de reacción se representa en la figura 43a. En la figura 43a R, R' y R'' representan grupos hidrocarbonados. Según una forma de realización, en un vial de 4 ml, se mezclan 1 mmol de amina (1) (normalmente una amina primaria) y 1 mmol de acetona o aldehído (2) (generalmente acetofenona), se tratan entonces con 1,25 mmoles de isopropóxido de titanio (IV) (3) y se deja reposar con agitación ocasional a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. De manera alternativa, puede utilizarse una amina secundaria en lugar de (1). Nota: algunas reacciones darán precipitados o sólidos pesados que se templan/calientan (hasta su punto de ebullición) para permitir la agitación/el mezclado varias veces durante el transcurso de la reacción. Se trata la mezcla de reacción con 1 ml de etanol que contiene 1 mmol de cianoborohidruro (4) de sodio y entonces la mezcla resultante se deja reposar a temperatura ambiente con agitación ocasional durante aproximadamente 16 horas. Tras este tiempo la reacción se extingue mediante la adición de aproximadamente 500 \mul de agua. Entonces se diluye la mezcla de reacción hasta aproximadamente un volumen total de 4 ml con etil éter y entonces se centrifuga. Se elimina la fase orgánica superior y se reduce en un rotavapor. Se purifica parcialmente el producto (6) resultante mediante cromatografía a través de una columna corta de sílice (o utilizando de manera alternativa una CCF preparativa sobre sílice) utilizando una combinación de diclorometano:metanol:isopropilamina (normalmente 95:5:0,1), antes de la purificación mediante HPLC (en fase normal utilizando sílice con diclorometano:metanol:isopropilamina o en fase invertida, C-18 con TFA al 0,1% con acetonitrilo o metanol).
Si fuera apropiado o deseado, puede llevarse a cabo una resolución quiral utilizando procedimientos tales como los descritos en el ejemplo 21.
Formulación y administración
Tal como se ha demostrado en la presente memoria, las moléculas de la invención pueden utilizarse para: (a) imitar o antagonizar uno o más de los efectos de Ca^{2+} extracelular; (b) afectar al nivel de Ca^{2+} libre extracelular en un individuo; y (c) tratar enfermedades tales como hiperparatiroidismo, osteoporosis e hipertensión. Aunque generalmente se ha mostrado que las moléculas presentan un efecto sobre las células paratiroideas, también pueden modular los receptores de Ca^{2+} en otras células, que incluyen osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios.
Aunque estas moléculas se utilizarán habitualmente en tratamiento para pacientes humanos, también pueden utilizarse para tratar enfermedades similares o idénticas en otras especies de animales de sangre caliente, tales como otros primates, animales de granja, tales como cerdos, ganado y aves de corral; y animales para deportes y mascotas, tales como caballos, perros y gatos.
En aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, las moléculas de la invención pueden formularse para una variedad de modos de aplicación, que incluyen administración sistemática y tópica o localizada. Pueden encontrarse generalmente técnicas y formulaciones en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Para la administración sistemática se prefiere la administración oral. Alternativamente, puede utilizarse la inyección, por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, se formulan las moléculas de la invención en disoluciones líquidas, preferentemente en tampones compatibles fisiológicamente, tales como la solución de Hank o la solución de Ringer. Adicionalmente, pueden formularse las moléculas en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de su utilización. También se incluyen formas liofilizadas.
La administración sistemática también puede ser mediante medios transmucosos o transdérmicos, o las moléculas pueden administrarse por vía oral. Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, se utilizan penetrantes apropiados para que se penetre la barrera en la formulación. Se conocen generalmente tales penetrantes en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración por vía transmucosa, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Adicionalmente, pueden utilizarse detergentes para facilitar la permeación. La administración por vía transmucosa puede ser a través de aerosoles nasales, por ejemplo, o utilizando supositorios. Para la administración oral, se formulan las moléculas en formas de administración oral convencionales, tales como cápsulas, comprimidos y tónicos.
Para la administración tópica, se formulan las moléculas de la invención en ungüentos, pomadas, geles o cremas, tal como se conoce generalmente en la técnica.
Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, pueden determinarse las cantidades de diversos compuestos de la presente invención, que han de administrarse, mediante un procedimiento convencional. Generalmente es una cantidad de entre 1 y 50 mg/kg del animal que va a tratarse.
Receptores de Ca^{2+} recombinantes
La selección de productos naturales ha proporcionado tradicionalmente las estructuras líder para el desarrollo de diversas moléculas terapéuticas. Sin embargo, no ha sido posible previamente la selección de alto rendimiento de bibliotecas de productos naturales o bibliotecas de otras moléculas para determinar la actividad en el receptor de Ca^{2+}. Para lograr esta capacidad, lo mejor es clonar el ADNc del receptor de Ca^{2+} y luego crear líneas celulares transfectadas adecuadas para la selección de alto rendimiento. Puede utilizarse adicionalmente la estructura del receptor para llegar a comprender bien la geometría molecular del (de los) sitio(s) de unión de ligandos, y puede utilizarse tal información para aumentar un programa de diseño de fármacos racional, tal como se trató anteriormente. Los estudios de estructura-actividad limitados y las pruebas de moléculas de producto natural seleccionadas proporcionarán la base de datos estructurales inicial necesaria para guiar la selección racional de productos naturales y el diseño del fármaco.
Puede clonarse el ADNc del receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas bovinas y humanas mediante la expresión funcional en ovocitos de Xenopus. Es posible monitorizar un aumento en Ca^{2+} intracelular en ovocitos de Xenopus indirectamente midiendo la corriente a través del canal de Cl^{-} activado por Ca^{2+} endógeno. La amplificación de la respuesta proporcionada mediante esta ruta de transducción de señales permite la detección de proteínas receptoras codificadas por ARNm a niveles muy bajos. Esto permite la detección de clones de ADNc específico de receptor sin la necesidad de ligandos de alta afinidad, antisueros específicos o información de secuencia de proteína o de ácido nucleico. Sigue un ejemplo de un procedimiento tal.
Se obtuvieron Xenopus laevis hembra adultas a partir de Xenopus I (Ann Arbor, MI) y se mantuvieron según procedimientos convencionales. Se extirparon lóbulos de ovario a partir de sapos anestesiados de manera hipotérmica. Se transfirieron agrupaciones de ovocitos a solución salina de Barth (MBS) modificada. Se obtuvieron ovocitos individuales mediante incubación en MBS que contiene colagenasa 2 mg/ml (Sigma, tipo 1A) durante 2 h a 21ºC y se seleccionaron ovocitos de estadio V-VI para la inyección.
Se estiraron tubos capilares de vidrio (de 1 mm de diámetro) hasta una punta fina y se rompieron manualmente para lograr un diámetro de punta de aproximadamente 15 \muM. Se colocó una gotita de ARNm (1 ng/nl en agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC)) sobre parafina y se arrastró al interior del tubo capilar mediante succión. Se conectó entonces el tubo capilar a un Picospritzer (WPI Instruments) y se ajustó el volumen de las gotitas impulsadas por aire para administrar 50 ng de ARNm (habitualmente 50 nl). Se utilizó una placa de cultivo de 35 mm con un parche de medias de poliamida fijado a la parte inferior para asegurar los ovocitos durante la inyección de ARNm en el polo vegetal. Se colocaron los ovocitos inyectados en una placa de cultivo de 35 mm que contiene MBS, penicilina 100 \mug/ml y estreptomicina 100 U/ml y se incubaron a 18ºC durante 3 días.
Tras la incubación, se colocó un ovocito en una cámara de plástico de 100 \mul y se superfusionó con MBS a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min utilizando una bomba peristáltica. Se añadieron moléculas de prueba o policationes inorgánicos pasando rápidamente los tubos al interior de diferentes tampones. Se construyeron electrodos de registro y de paso de corriente a partir de tubos capilares de pared fina sometidos a una resistencia de 1-3 Mohm y se llenaron con KCl 3 M. Se atravesaron (en el polo animal) los ovocitos con ambos electrodos bajo observación microscópica y se conectaron a un amplificador de estabilización de tensión de 2 A de Axon Instruments Axoclamp que se utilizó para ajustar el potencial de mantenimiento (de -70 a -80 mV) y para medir las corrientes que se hicieron pasar para mantener el potencial de mantenimiento. Se registraron las corrientes directamente sobre un registrador de papel continuo.
Para la preparación del ARNm, se obtuvo tejido a partir de terneros o pacientes con HPT secundario sometidos a extirpación quirúrgica de las glándulas paratiroideas. No se necesita preparar células purificadas; se utilizaron trozos enteros de glándula para preparar ARNm que dirige la expresión del receptor de Ca^{2+} en ovocitos de Xenopus. Se preparó el ARN celular total mediante extracción con tiocianato de guanidinio ácido/fenol de glándulas homogeneizadas. Se utilizó cromatografía con oligo dT-celulosa para seleccionar poli(A)^{+}-ARNm mediante procedimientos convencionales. Para el fraccionamiento por tamaños del ARNm, se utilizó centrifugación a través de gradientes de glicerol. Se desnaturalizó el ARNm con hidróxido metilmercúrico 20 mM y se cargó (50 a 100 \mug en una concentración de 1 mg/ml) en un gradiente lineal de glicerol al 15 a 30% preparado en tubos Beckman TLS55. Tras la centrifugación a 34.000 rpm durante 16 horas, se recogieron fracciones de gradiente de 0,3 ml y se diluyeron en un volumen igual de agua que contiene beta-mercaptoetanol 5 mM. Se recuperó entonces el ARNm mediante dos ciclos de precipitación con etanol. Si se desea, puede separarse el ARNm (50 a 100 \mug de poli(A)^{+}) sobre un gel preparativo de agarosa al 1,2%/urea 6,0 M, junto con un intervalo de marcadores de tamaño de ARN. Tras la visualización de ARNm mediante tinción con bromuro de etidio, se escindieron cortes de gel que contienen ARN en etapas de 1,5 a 2,0 kb de tamaño. Se recupera el ARNm a partir de los cortes de gel de agarosa utilizando matriz de unión RNAid (según el protocolo convencional del proveedor; Stratagen, Inc.) y se recuperaron fracciones de ARNm eluidas en agua tratada con DEPC.
Se cuantificaron las cantidades de ARNm recuperado mediante medición de la absorbancia en UV. Se determinó el intervalo de tamaño del ARNm contenido dentro de cada fracción mediante electroforesis en formaldehído/gel de agarosa utilizando una cantidad pequeña (0,5 \mug) de cada muestra. Se evaluó la integridad del ARNm mediante traducción in vitro de cada muestra. Se utilizaron lisados de reticulocitos (kits comercialmente disponibles; BRL) para traducir 0,05 a 0,5 \mug de cada fracción de ARNm. Se analizaron las proteínas marcadas con ^{35}S resultantes mediante SDS-PAGE. El ARNm intacto pudo dirigir la síntesis de proteínas de un intervalo de tamaño completo, que corresponde aproximadamente a los tamaños de las fracciones de ARNm individuales.
Se construyó una biblioteca de ADNc en el vector X ZAPII, siguiendo las modificaciones de la técnica de Gubler y Hoffman. Se utilizó como material de partida el ARN de la(s) fracción(ones) que dan la mejor respuesta en el ensayo con ovocitos. Se cebaron las síntesis de ADNc de primera hebra con un cebador-ligador oligo-dT/NotI. La síntesis de segunda hebra fue mediante el procedimiento de autocebamiento con ARNasa H/ADN polimerasa I. Se obtuvieron extremos romos del ADNc bicatenario con ADN polimerasa de T4 y se ligaron con extremos romos adaptadores de EcoRI al ADNc con T4 ligasa. Tras la digestión con NotI para escindir el ligador, se seleccionó por tamaños el ADNc de longitud completa mediante cromatografía de exclusión sobre Sephacryl 500 HA. Se radiomarcó el ADNc de primera hebra con \alpha-^{32}P-dATP y toda la síntesis y las etapas de recuperación se monitorizaron siguiendo la incorporación de radioactividad. Se ligó el ADNc de longitud completa a partir de la columna de exclusión por tamaños a brazos de \lambda ZAPII digeridos con EcoRI/NotI. Se empaquetó para la prueba la mezcla de ligamiento con extracto de empaquetamiento de alta eficacia comercialmente disponible (Stratagene, Inc.) y se sembraron en placas de cultivo sobre la cepa de huésped adecuada (XL1-blue). Se determinó el porcentaje de fago recombinante mediante la razón de placas blancas con respecto a azules cuando la biblioteca se sembró en placas de cultivo sobre IPTG y X-gal.
Se determinó el tamaño de inserto medio a partir de diez clones seleccionados aleatoriamente. Se digirieron "minipreparaciones" de ADN de fago con EcoRI y NotI para liberar el inserto y se determinó el tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. La biblioteca estaba constituida por > 90% de fago recombinante, y el tamaño de inserto osciló desde 1,5 hasta 4,2 kb. Se empaquetó el ligamiento recombinante a gran escala para generar 800.000 clones primarios. Se tituló la mezcla de empaquetamiento y se sembró en placas de cultivo a 50.000 placas por placa de cultivo de 15 cm. Se eluyó cada combinación de 50.000 clones en tampón SM y se almacenaron individualmente.
Se utilizaron reservas de lisado en placa de cultivo de cada una de las combinaciones de clones para la preparación de ADN de fago a pequeña escala. Se concentran las partículas de fago mediante precipitación con polietilenglicol y se purifica el ADN de fago mediante digestión con proteinasa K seguida de extracción con fenol: cloroformo. Se digieren 20 microgramos de ADN con NotI y se utiliza como molde para la transcripción in vitro de ARN de cadena codificante. La transcripción in vitro es según los protocolos convencionales, utilizando ARN polimerasa de T7 y análogo de caperuza en 5' m^{7}GpppG en un volumen de reacción total de 50 \mul. Tras la digestión con ADNasa I/proteinasa K y extracción con fenol/cloroformo, se concentra el ARN mediante precipitación con etanol y se utiliza para la inyección en ovocitos.
A los ovocitos se les inyectó ARNm sintético (ARNc) a partir de cada una de las 16 subcombinaciones de biblioteca que constituyen 50.000 clones independientes cada una. Después de la incubación durante 3 a 4 días, se sometieron a ensayo los ovocitos para determinar la capacidad de neomicina 10 mM de provocar una corriente de Cl^{-} dependiente de Ca^{2+}. Una combinación designada como 6 dio una señal positiva y por tanto contiene un clon de ADNc que codifica para un receptor de calcio funcional. Con el fin de disminuir la complejidad de la combinación 6 y así avanzar hacia la purificación del clon de receptor de calcio contenido en esta combinación, se volvió a sembrar en placa de cultivo el fago de combinación 6 a 20.000 placas por placa de cultivo y se recogieron 12 placas de cultivo. Se preparó ADN a partir de cada una de estas subcombinaciones y se sintetizó ARNc. De nuevo, a los ovocitos se les inyectó ARNc y se sometieron a ensayo 3 a 4 días más tarde para determinar la capacidad de neomicina 10 mM de provocar una corriente de Cl^{-} dependiente de Ca^{2+}. Una subcombinación 6-3 fue positiva y se sometió esta combinación a una tanda adicional de sembrado en placa de cultivo reduciendo la complejidad de las combinaciones a aproximadamente 5.000 clones por combinación. Se sometieron a ensayo de nuevo las combinaciones mediante preparación de ARNc e inyección en ovocitos. Una subcombinación 6-3.4 fue positiva. Con el fin de acelerar la purificación adicional del clon positivo en la combinación 6-3.4, se rescató el ADN de fago a partir de esta combinación como ADN de plásmido mediante superinfección con el fago cooperador, ExAssist. La transfección de plásmidos rescatados en la cepa bacteriana DH5alfaF' dio como resultado colonias bacterianas transformadas sobre placas de cultivo de ampicilina. Éstas se recogieron en combinación de 900 clones cada una. Entonces se preparó ADN de plásmido a partir de cada subcombinación y se sintetizó ARNc y se sometió a ensayo de la manera habitual. La subcombinación 6-3.4.4 fue positiva. Posteriormente se sembraron en placa de cultivo bacterias que contienen la subcombinación 6-3.4.4 de plásmido en subcombinaciones de 50 clones cada una. Se espera que la continuación de este proceso dé como resultado un clon individual que codifica para un receptor de calcio funcional.
Los experimentos iniciales utilizaron ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó agua o ARNm enriquecido con poli(A)^{+} (50 ng) a partir de células tiroideas bovinas. Después de tres días, se examinaron los ovocitos para determinar su capacidad para aumentar Ca^{2+} intracelular en respuesta a aumentos en la concentración de cationes extracelulares di y trivalentes. Se atravesaron los ovocitos con electrodos de registro y de paso de corriente y se evaluó [Ca^{2+}]_{i} indirectamente midiendo corrientes a través de canal de Cl^{-} activado por Ca^{2+} endógeno. En ovocitos a los que se les inyectó ARNm enriquecido con poli(A)^{+} de células paratiroideas bovinas (o humanas, figura 26), el aumento de la concentración de Ca^{2+} extracelular desde 0,7 hasta 3, 5 ó 10 mM produjo un aumento rápido y transitorio en la conductancia de Cl^{-}, que osciló luego alrededor de una conductancia basal más elevada. El aumento de la concentración de Mg^{2+} extracelular desde 1 hasta 10 mM provocó asimismo aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-}. La respuesta de conductancia de Cl^{-} a Mg^{2+} extracelular persistió cuando la concentración de Ca^{2+} extracelular se redujo a < 1 \muM (figura 25).
El catión trivalente impermeabilizante Gd^{3+} (600) \muM también produjo aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-} (figura 25). Tales aumentos en la conductancia de Cl^{-} que oscilan y persisten en la ausencia nominal de Ca^{2+} extracelular se observan cuando se ha permitido que los ovocitos expresen otros receptores que movilizan Ca^{2+} y se estimulan con el ligando apropiado (por ejemplo, sustancia K, figura 25). En estos casos, el aumento en la conductancia de Cl^{-} refleja la movilización de Ca^{2+} intracelular. Estos estudios iniciales muestran asimismo que los policationes extracelulares movilizan Ca^{2+} intracelular en ovocitos a los que se les inyectó ARNm de células paratiroideas.
Los ovocitos a los que se les inyectó agua no mostraron ningún cambio en la corriente de Cl^{-} cuando se expusieron a Ca^{2+} extracelular (10 mM) o Mg^{2+} (20 ó 30 mM). En una serie de experimentos, se les inyectó a los ovocitos el ARNm que codifica para el receptor de la sustancia K. En estos ovocitos, el Mg^{2+} extracelular (20 mM) no provocó ninguna corriente pero las células respondieron vigorosamente a la adición de sustancia K (figura 25). Estos experimentos indican que no hay sensibilidad endógena del ovocito a Ca^{2+} o Mg^{2+} extracelular.
Se realizaron experimentos similares utilizando ovocitos a los que se les inyectó ARNm enriquecido con poli(A)^{+}
preparado a partir de glándulas paratiroideas humanas (tejido hiperplásico procedente de un caso de HPT secundario). En estos ovocitos, el aumento de la concentración de Ca^{2+} extracelular produjo un aumento reversible en la conductancia de Cl^{-} que osciló (figura 26). La adición de La^{3+} 300 \muM produjo asimismo aumentos oscilatorios en la conductancia de Cl^{-}. El aumento de la concentración de Mg^{2+} extracelular desde 1 hasta 10 mM provocó aumentos en la conductancia de Cl^{-} que persistieron en ausencia de Ca^{2+} extracelular. Experimentos adicionales sugieren que la respuesta a Ca^{2+} extracelular es dependiente de la concentración. Por tanto, en tres ovocitos a los que se les inyectó ARNm, la conductancia de Cl^{-} aumentó hasta un máximo de 111 \pm 22 nA a 3 mM y 233 \pm 101 nA a 10 mM de Ca^{2+} extracelular.
Los resultados obtenidos en ovocitos de Xenopus demuestra la presencia de ARNm en células paratiroideas que codifica(n) para una(s) proteína(s) que pueden conferir, en células que no responden normalmente, sensibilidad a Ca^{2+} extracelular. Además, la capacidad del Mg^{2} extracelular para provocar aumentos oscilatorios en la corriente de Cl^{-} en ausencia de Ca^{2+} extracelular demuestra que la corriente de Cl^{-} depende de la movilización de Ca^{2+} intracelular en lugar del flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular. Los resultados obtenidos con La^{3+} muestran asimismo que la(s) proteína(s) expresada(s) se relaciona(n) con la movilización de Ca^{2+} intracelular. Juntos, estos datos muestran que la(s) proteína(s) expresada(s) actúa(n) como un receptor de la superficie celular en lugar de como un canal. Estos estudios proporcionan la evidencia convincente de la existencia de una proteína receptora de Ca^{2+} en la superficie de las células paratiroideas y demuestran la viabilidad de utilizar el sistema de ovocito de Xenopus para conseguir la clonación molecular del ADNc del receptor de Ca^{2+}.
En otra serie de experimentos, el ARNm de células paratiroideas, desnaturalizado con hidróxido metilmercúrico, se fraccionó por tamaños mediante centrifugación a través de un gradiente de glicerol. Se recogieron diez fracciones. Cada grupo se inyectó en ovocitos de Xenopus y tras un periodo de incubación de tres días, se sometieron a ensayo los ovocitos para la expresión del receptor de Ca^{2+}. Aquellos ovocitos a los que se les inyectaron las fracciones 4 a 6 mostraron los mayores y más constantes aumentos en la conductancia de Cl^{-} en respuesta a Ca^{2+} extracelular (figura 35). Estos resultados indican que el receptor de Ca^{2+} está codificado por ARNm en un intervalo de tamaño de 2,5 a 3,5 kb. Esto indica que es factible una estrategia utilizando la expresión directa de ARN sintetizado a partir de una biblioteca de ADNc de vector de transcripción. Se realizaron experimentos de fraccionamiento por tamaños de esta clase y en cada uno de tres experimentos de fraccionamiento diferentes se obtuvieron los mismos resultados.
Las fracciones de ARNm obtenidas y caracterizadas en los experimentos precedentes pueden someterse a ensayo mediante inyección en ovocitos. Para cada fracción de ARNm, se les inyectó a 10 a 20 ovocitos 50 ng de ARN a una concentración de 1 ng/nl en agua. Se mantuvieron los ovocitos inyectados a 18ºC durante 48 a 72 h tras haberse evaluado para determinar la expresión del receptor de Ca^{2+} utilizando mediciones de la corriente de Cl^{-}. Para cada grupo de ovocitos inyectados, se determina el número positivo para la expresión del receptor, así como la magnitud de la corriente de Cl^{-} dependiente de Ca^{2+} medida. Como controles negativos, se les inyecta a ovocitos ARNm enriquecido con poli(A)^{+} de hígado de rata, ARN de levadura o agua.
Se espera que un ARNm en el intervalo de 2,5 a 3,5 kb codificará para el receptor. El ARNm de un tamaño superior puede necesitarse un enfoque de clonación basado en una reducción de híbridos de ARNm paratiroideo antes de la inyección de los ovocitos. Esta estrategia no depende de la generación de clones de ADNc de longitud completa para tener éxito. Si no se obtiene la expresión del receptor con una fracción de tamaño único de ARNm, se les inyecta a los ovocitos fracciones de tamaños mixtos para determinar una combinación que sí que dé lugar a un receptor funcional. Si parece que son necesarias múltiples subunidades para la formación de un receptor funcional, se utiliza la estrategia de clonación por expresión con reducción de híbridos. En este enfoque, los clones se seleccionan basándose en su capacidad para reducir una especie de ARNm específica de la población de ARNm total. Se identifica un clon que codifica para una única subunidad para evitar la formación del complejo de múltiples subunidades activo. Mediante la selección exhaustiva, es posible identificar clones que codifican para todas las subunidades necesarias.
Este enfoque permite el aislamiento de clones que codifican para las subunidades individuales requeridas para formar un complejo de receptor funcional. Se somete a ensayo ARN sintético procedente de combinaciones de clones para determinar su capacidad para inducir la expresión del receptor de Ca^{2+} en ovocitos de Xenopus mediante las mismas técnicas utilizadas para analizar las fracciones de ARNm originales. Originalmente, se examinan 10 combinaciones que representan 100.000 clones primarios cada una. Las combinaciones de clones que muestran una respuesta positiva se seleccionan a menos complejidad (normalmente de 4 a 10 veces) y de nuevo se subdividen y seleccionan adicionalmente las combinaciones positivas. Este proceso de subfraccionamiento de bibliotecas se sigue hasta que se identifican los clones positivos individuales. Como control negativo para el ensayo de expresión en ovocitos, se generan transcritos antisentido mediante transcripción con T7 de aquellos moldes de ADN que inducen una respuesta positiva. Los transcritos antisentido no pueden dar lugar a un auténtico receptor, y esto controlará cualquier señal positiva no específica que surja de la inyección de ARN sintético. Otra preocupación es que el ARN sintético puede ocasionalmente "envenenar" la traducción en los ovocitos inyectados, mediante un mecanismo no definido. Para controlar esta posibilidad, los ARN sintéticos que dan lugar a una respuesta negativa se coinyectan a diversas diluciones con ARNm de células paratiroideas, para determinar si están interfiriendo de manera no específica en la expresión del receptor de Ca^{2+}.
Cuando se identifica un clon individual que codifica para el receptor de Ca^{2+}, el inserto de ADNc puede escindirse del vector \lambda y utilizarse para la producción a gran escala de ARN sintético. La inyección en el ovocito de esta especie de ARN sencillo permite la evaluación rigurosa de las características del receptor expresado.
Si el tamaño del ARNm que codifica para el receptor de Ca^{2+} es demasiado grande para su clonación mediante transcripción directa y expresión, o si están implicadas múltiples subunidades, se utiliza una técnica de reducción de híbridos de combinaciones de selección de clones. Se preparará el ADN del inserto de ADNc a partir de combinaciones de clones de la biblioteca de ADNc de células paratiroideas seleccionada por tamaño. Este ADN se hibrida con ARNm de células paratiroideas en condiciones que permiten la formación de dúplex de ADN/ARN. El ARN no hibridado, con reducción de híbridos se recupera y utiliza para la inyección en ovocitos. El ADN procedente de combinaciones de clones que contienen secuencias que representan el ARNm del receptor de Ca^{2+} se reduce a partir de este ARNm de la población de ARNm de células paratiroideas total, y se reduce la expresión del receptor o está ausente con la inyección en los ovocitos. Se sigue un proceso de subfraccionamiento en las combinaciones de clones de complejidad decreciente, sometiendo a ensayo en cada etapa para determinar el ADN clonado que reduce el ARNm que codifica para el receptor de Ca^{2+} de la población de ARNm de células paratiroideas total. La utilización de un control interno durante los ensayos de reducción de híbridos garantiza que el ARN con reducción de híbridos está intacto y puede traducirse en el ovocito.
Las células paratiroideas humanas expresan un receptor beta-adrenérgico acoplado a adenilato ciclasa. Este receptor puede expresarse en ovocitos, en los que puede dar la activación inducida por un agonista de la adenilato ciclasa endógena. Durante la selección con reducción de híbridos para los clones del receptor de Ca^{2+}, se someten a ensayo los ovocitos a los que se les inyectó ARNm con reducción de híbridos para determinar la activación de adenilato ciclasa inducida por isoprotenerol. Una respuesta positiva en este ensayo sirve para indicar que cualquier inhibición observada de la respuesta del receptor de Ca^{2+} es específica y no se debe a una inhibición general de la población de ARNm total.
La estrategia de selección con reducción de híbridos puede dar como resultado el aislamiento de clones que no contienen una región codificante de proteína completa. Los clones positivos aislados mediante esta estrategia de selección se secuencian para determinar su capacidad codificante de proteína. El análisis de inmunotransferencia de tipo Northern del ARN de la glándula paratiroidea humana permite la determinación del tamaño del ARNm completo correspondiente a clones específicos. Si los clones positivos no parecen ser de longitud completa, el ADNc clonado se utilizará como sonda de hibridación para seleccionar una biblioteca de ADNc de glándula paratiroidea para ADNc completos.
Una variedad de líneas celulares pueden acoplar receptores expresados de manera exógena a respuestas funcionales endógenas. Varias de estas líneas celulares (por ejemplo, NIH-3T3, HeLa, NG115, CHO, HEK, 293 y COS7) pueden probarse para confirmar que carecen de un receptor de Ca^{2+} endógeno. Aquellas líneas que carecen de una respuesta a Ca^{2+} externo pueden utilizarse para establecer líneas celulares transfectadas de manera estable que expresan el receptor de Ca^{2+} clonado.
El análisis de la secuencia de los clones de ADNc de receptor de Ca^{2+} identificados mediante la clonación por expresión delinearán el marco de lectura abierto que codifica para la proteína receptora. La región codificante del ADNc se subclonará en múltiples sitios de clonación del vector de expresión eucariota pMSG. Este vector permite la transcripción de alto nivel dirigida por el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) y es activo en una amplia variedad de células de mamífero. El vector también contiene un gen gpt para la resistencia a ácido micofenólico que está bajo el control del promotor temprano SV40, y las secuencias necesarias para la selección y crecimiento en bacterias. Se cultivarán grandes cantidades del constructo de vector de expresión/plásmido de ADNc del receptor y se purificará a partir de E. coli.
El procedimiento más eficaz para la transfección de líneas celulares eucariotas con ADN de plásmido varía con el tipo celular dado. El constructo de expresión del receptor de Ca^{2+} se introducirá en células cultivadas mediante la técnica apropiada, ya sea con precipitación con fosfato de Ca^{2+}, transfección con DEAE-dextrano, lipofección o eletroporación. Tras el procedimiento de transfección, las células se cultivan en presencia del antibiótico G418 para seleccionar las células que expresan el gen de resistencia a la neomicina. Se subclonarán las colonias de transfectantes resistentes a G418 y se establecerán como líneas celulares individuales. La expresión de la proteína receptora de Ca^{2+} en células resistentes a G418 se evaluará mediante varios procedimientos. La inmunotransferencia de tipo Southern y el análisis de transferencia en ranura confirmarán la presencia y el número de copias de la secuencia de ADNc del receptor. Se utilizará el análisis de inmunotransferencia de tipo Northern para demostrar que se está transcribiendo el ARNm del receptor a partir del constructo de plásmido. La expresión funcional de la proteína receptora se determinará midiendo la movilización de Ca^{2+} intracelular en respuesta a agonistas del receptor de Ca^{2+} aplicados externamente.
La clonación del receptor de Ca^{2+} permite tanto estudios estructurales como funcionales de este nuevo receptor. El receptor producido de manera recombinante puede cristalizarse para estudios estructurales. Las líneas celulares transfectadas de manera estable pueden utilizarse para la selección de alto rendimiento de bibliotecas de productos naturales u otros compuestos. Las moléculas de la potencia y especificidad requeridas pueden marcarse (radiactivamente o con fluorescencia). La capacidad de las moléculas/extractos de prueba para desplazar tal molécula marcada formará la base de un ensayo de alto rendimiento para selección.
Dadas las células o tejidos o apropiados que expresan otros receptores de calcio, estos receptores pueden clonarse de manera análoga a la descrita anteriormente para el receptor de calcio de células paratiroideas. Por ejemplo, ARNm procedente de tejido de osteoclastoma humano codifica para el receptor de calcio de osteoclastos (figura 34). Por tanto, para aislar un clon para el receptor de osteoclastos humano, sólo se necesita aislar ARNm a partir de tejido de osteoclastoma, preparar una biblioteca de ADNc y someter a ensayo/fraccionar subcombinaciones tal como se describió anteriormente. Además, los receptores preferidos para la selección de fármacos son de origen humano. Puede utilizarse un clon que codifica para un receptor de calcio de una especie para obtener el correspondiente clon de ADNc humano mediante hibridación cruzada tal como se conoce bien por los expertos en la materia. Además, el clon de la célula paratiroidea u otro receptor celular de Ca^{2+} permite el aislamiento de genes que codifican para proteínas que detectan Ca^{2} similares en otras células, y la expresión de esas proteínas. Esto se consigue mediante una variedad de enfoques. Los análisis de inmunotransferencia de tipo Southern de ADN genómico humano, utilizando el ADNc del receptor de Ca^{2+} como sonda de hibridación, dará una indicación del número de secuencias relacionadas codificadas en el genoma; la hibridación a rigurosidad variable dará una indicación del grado de divergencia entre las secuencias relacionadas. Esto proporcionará información sobre el número potencial de genes que codifican para las proteínas receptoras relacionadas. El análisis de inmunotransferencia de tipo Northern con ADNc del receptor de Ca^{2+} como sonda determinará si están presentes el mismo o transcritos relacionados en diversos tejidos. Si se detectan transcritos relacionados homólogos al receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas, es una cuestión relativamente simple obtener clones de estos ARNm, ya sea seleccionando las bibliotecas de ADNc apropiadas o mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa. Los clones de los nuevos receptores así obtenidos pueden evaluarse funcionalmente mediante expresión, o bien en ovocitos o bien en líneas celulares transfectadas. Las líneas celulares transfectadas que expresan un receptor de Ca^{2+} específico de las células pueden proporcionar entonces medios de selección de alto rendimiento para moléculas que actúan específicamente sobre el mecanismo de detección de Ca^{2+} de, por ejemplo, osteoclastos o células yuxtaglomerulares.
En un procedimiento alternativo, el receptor de calcio puede clonarse mediante expresión en células eucariotas. Por ejemplo, puede prepararse una biblioteca de ADNc a partir de ARNm paratiroideo y clonarse en el vector de expresión eucariota, pCDNA1. Las subcombinaciones de esta biblioteca pueden transfectarse en células eucariotas tales como COS7 o HEK293 dando como resultado una expresión transitoria de relativamente alto nivel de secuencias de ADNc codificadas. Las células transfectadas con un clon de receptor de calcio funcional expresarán el receptor de calcio que puede luego activarse por calcio, neomicina u otros compuestos calcimiméticos. Si las células se cargan en primer lugar con un indicador fluorimétrico para [Ca^{2+}]_{i}, la activación del receptor de calcio da como resultado un aumento de la fluorescencia. Por tanto, estas subcombinaciones de biblioteca que contienen el receptor de calcio se identifican por su capacidad, con la transfección en células eucariotas, para inducir un aumento específico de calcimimético o calcio en la fluorescencia. Esta fluorescencia puede detectarse utilizando o bien un fluorímetro o bien un separador de células activadas con fluorescencia (FACS).
En un procedimiento alternativo, el receptor de Ca^{2+} puede clonarse mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal generado frente al receptor. Los anticuerpos monoclonales proporcionan potentes herramientas para la purificación por inmunoafinidad de proteínas específicas. Una vez purificada, pueden obtenerse datos limitados de la secuencia de aminoácidos a partir de la proteína de interés y utilizarse para diseñar sondas de secuencia de oligonucleótido para seleccionar los clones de la secuencia de ADNc completa.
Para la producción de hibridomas, se utilizan células de glándula paratiroidea bovina completa como el inmunógeno. Se obtienen células dispersas, purificadas y se inyectan las preparaciones celulares vivas por vía intraperitoneal en la cepa de ratón apropiada, según los procedimientos establecidos. Se siguen protocolos habituales para los programas de inmunización y para la producción de hibridomas. Se utiliza un procedimiento de selección de dos etapas para identificar los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor de Ca^{2+}. La selección inicial identificará aquellos anticuerpos monoclonales que reconocen los antígenos de superficie de las células paratiroideas. Se utilizan entonces técnicas inmunohistoquímicas para seleccionar los sobrenadantes de los hibridomas para determinar la presencia de anticuerpos de ratón que se unen a la superficie de células paratiroideas. Esta selección puede realizarse en secciones fijas de tejido de la glándula paratiroidea o en células dispersas en cultivo primario. Las técnicas para este ensayo están bien establecidas en la bibliografía.
Esta selección identificará los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales frente una variedad de determinantes de la superficie celular, y se esperaría que los anticuerpos monoclonales específicos para el receptor de Ca^{2+} sólo comprendieran un pequeño subconjunto de éstos. Para identificar los anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de Ca^{2+}, los sobrenadantes que se prueban como positivos en la selección inicial se someten a ensayo para determinar su capacidad para bloquear la respuesta de células paratiroideas cultivadas a agonistas del receptor de Ca^{2+}. Se espera que algunos anticuerpos que se unen al dominio extracelular del receptor inhiban o activen la unión de ligandos o que interfieran de otro modo en o afecten la activación del receptor.
Los anticuerpos monoclonales positivos en ambas selecciones se caracterizan a través de inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Esto permite la determinación del tamaño del antígeno que se reconoce y su distribución tisular. El anticuerpo monoclonal apropiado se utiliza entonces para la purificación de la proteína receptora de Ca^{2+} mediante cromatografía de inmunoafinidad, siguiendo técnicas habituales. Se obtienen cantidades suficientes de proteína para permitir la determinación limitada de la secuencia de aminoácidos. Entonces se diseñan sondas de oligonucleótidos degenerados basándose en la información sobre la secuencia peptídica. Estas sondas se utilizan entonces para seleccionar bibliotecas de ADNc de glándula paratiroidea para clones de longitud total del receptor de Ca^{2+}. Los clones obtenidos se caracterizan mediante secuenciación de ADN y mediante expresión funcional en el sistema de ovocito y en las líneas celulares de mamífero cultivadas.
Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse para seleccionar bibliotecas de expresión, por ejemplo, bibliotecas de ADNc en \lambdagt11 o su equivalente, para determinar aquellos clones que expresan la proteína reactiva de manera antigénica. Tales clones pueden secuenciarse entonces para determinar si codifican para una proteína que podría ser un receptor de Ca^{2+}.
También se apreciará por los expertos en la materia que pueden utilizarse bibliotecas de despliegue en fago ("phage display") para clonar y analizar los receptores de calcio en lugar de los anticuerpos monoclonales. En estas bibliotecas, las regiones variables de los anticuerpos o péptidos aleatorios se clonan al azar en vectores de expresión de fago de tal manera que las regiones de anticuerpo o los péptidos se despliegan en la superficie de la partícula de fago. El fago que despliega regiones de anticuerpo o péptidos que pueden dar una alta unión específica a receptores de calcio se unirá a células que despliegan estos receptores (por ejemplo, células paratiroideas, células C, osteoclastos, etc.). Pueden cribarse millones de tales fagos frente a estos tipos celulares seleccionando sólo aquellos fagos que pueden unirse a estas células (lo que incluye aquellos fagos que se unen a receptores de calcio). De esta manera, la complejidad de la biblioteca puede reducirse en gran parte. Posteriormente, pueden utilizarse las selecciones descritas anteriormente para los anticuerpos monoclonales, para aislar fagos que despliegan regiones de péptido o anticuerpo de unión al receptor, y estos fagos pueden utilizarse para aislar el receptor de calcio para fines de identificación estructural y clonación. Los kits para preparar tales bibliotecas de despliegue en fago están disponibles comercialmente (por ejemplo, Stratacyte, o Cambridge Antibody Technology Limited). El fago recombinante anclado con tales propiedades de unión al receptor de calcio también puede utilizarse en lugar de los anticuerpos monoclonales en los diversos análisis de los receptores de calcio. Tales fagos también pueden utilizarse en selecciones de competencia de unión de alto rendimiento para identificar compuestos orgánicos que pueden dar la unión funcional a los receptores de calcio que puede servir como guías estructurales para el desarrollo de compuestos terapéuticos humanos que actúan en el receptor de calcio.
En otra alternativa, puede utilizarse la reticulación de afinidad de radioligandos a sus receptores para aislar la proteína receptora, según se describe por Pilch & Czech, 1 Receptor Biochem. Methodol. 161, 1984. La unión covalente de un radioligando permite el lavado extenso para eliminar la unión no específica. Por ejemplo, se yoda una molécula de alta afinidad, por ejemplo, un copolímero aleatorio de arginina y tirosina (PM = 22 K; razón arg-tyr = 4:1) que moviliza Ca^{2+} intracelular con una CE_{50} de aproximadamente 100 nM o menos, con ^{125}I y se reticula. En estudios de reticulación pueden ser preferibles las protaminas, debido a su tamaño mucho más pequeño, y pueden alquilarse de manera reductora tal como describió Dottavio-Martin & Ravel, 87 Analyt. Biochem. 562, 1978.
Se mantiene el marcado no específico en un mínimo mediante reticulación en presencia de policationes y cationes di y trivalentes no marcados. A altas concentraciones de estas moléculas, podrían reducirse las interacciones no específicas del marcador con la superficie celular.
Utilizaciones
El hiperparatiroidismo (HPT) primario se caracteriza por hipercalcemia y niveles elevados de PTH circulante. Uno de los principales defectos en HPT parecer ser una disminución de la sensibilidad de las células paratiroideas para la regulación de retroalimentación negativa mediante Ca^{2+} extracelular. Por tanto, en el tejido de pacientes con HPT, el "punto de referencia" para el Ca^{2+} extracelular se desplaza a la derecha de modo que se requieren concentraciones de Ca^{2+} extracelular superiores a la normal para disminuir la secreción de PTH. Además, en HPT primario, incluso altas concentraciones de Ca^{2+} extracelular a menudo disminuyen la secreción de PTH sólo parcialmente. En HPT secundario (urémico), se observa un aumento similar en el punto de referencia de Ca^{2+} extracelular incluso cuando el grado al que Ca^{2+} suprime la secreción de PTH es normal. Los cambios en la secreción de PTH van en paralelo con cambios en [Ca^{2+}]_{i}: el punto de referencia para los aumentos inducidos por Ca^{2+} extracelular en [Ca^{2+}]_{i} se desplaza a la derecha y la magnitud de tales aumentos se reduce. Además, la tinción de tejido con un anticuerpo monoclonal que parece reconocer el receptor de Ca^{2+} disminuye en células paratiroideas adenomatosas e hiperplásicas.
El receptor de Ca^{2+} constituye una entidad molecular diferenciada para la intervención farmacológica. Las moléculas que imitan o antagonizan la acción de Ca^{2+} extracelular son beneficiosas en el manejo a largo plazo tanto de HPT primario como secundario. Tales moléculas proporcionan el ímpetu añadido requerido para suprimir la secreción de PTH que el estado hipercalcémico solo no puede conseguir. Tales moléculas con eficacia superior al Ca^{2+} extracelular pueden superar la componente no supresible aparente de la secreción de PTH que es particularmente problemática en tejido adenomatoso. Alternativa o adicionalmente, tales moléculas pueden disminuir la síntesis de PTH, ya que la hipercalcemia prolongada ha demostrado disminuir los niveles de ARNm preproPTH en tejido paratiroideo adenomatoso humano y bovino. La hipercalcemia prolongada también disminuye la proliferación de células paratiroideas in vitro, de modo que los calcimiméticos también pueden ser eficaces en limitar la hiperplasia de las células paratiroideas característica de HPT secundaria.
Otras células en el organismo pueden responder directamente a cambios fisiológicos en la concentración de Ca^{2+} extracelular. La secreción de calcitonina desde las células parafoliculares en la tiroides (células C) está regulada por cambios en la concentración de Ca^{2+} extracelular. La secreción de renina desde las células yuxtaglomerulares en el riñón, como la secreción de PTH, disminuye por el aumento de las concentraciones de Ca^{2+} extracelular. El Ca^{2+} extracelular produce la movilización de Ca^{2+} intracelular en estas células. Los osteoclastos aislados responden a aumentos en la concentración de Ca^{2+} extracelular con correspondientes aumentos en [Ca^{2+}]_{i}, que surge parcialmente de la movilización de Ca^{2+} intracelular. Los aumentos de [Ca^{2+}]_{i} en los osteoclastos se asocian con una inhibición de las respuestas funcionales (resorción ósea) análoga a la secreción de PTH en las células paratiroideas. Por tanto, existen suficientes indicaciones para sugerir que el Ca^{2+}, además de su papel ubicuo como señal intracelular, también funciona como una señal extracelular para regular las respuestas de ciertas células especializadas. Las moléculas de esta invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con las respuestas de Ca^{2+} perturbadas en estas células.
La clonación del receptor de Ca^{2+} en células paratiroideas y otras células permitirá que se evalúe directamente la presencia de proteínas homólogas en otras células. Por tanto, puede obtenerse una familia de proteínas receptoras de Ca^{2+} estructuralmente homólogas. Tales receptores permitirán la compresión de cómo estas células detectan Ca^{2+} extracelular y permiten la evaluación del (de los) mecanismo(s) como un sitio de acción para los compuestos terapéuticos descritos en la presente memoria, eficaces en el tratamiento de HPT, osteoporosis e hipertensión y tratamientos nuevos para otras enfermedades óseas y relacionadas con los minerales.
Se tratan anteriormente otras utilizaciones. Por ejemplo, las proteínas receptoras de Ca^{2+} recombinantes pueden utilizarse en tratamiento e introducirse mediante procedimientos habituales, por ejemplo, mediante transfección de un ácido nucleico que codifica para esa proteína. Además, tal proteína es útil en ensayos para moléculas calcimiméticas de esta invención.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no limitan su alcance.
Ejemplos
En los estudios descritos en la presente memoria, se descubrió que una variedad de moléculas orgánicas movilizaban Ca^{2+} intracelular y disminuían la secreción de PTH en células paratiroideas. Estas moléculas son estructuralmente diversas pero la mayoría presenta una carga positiva neta a pH fisiológico. La naturaleza catiónica de las moléculas orgánicas desempeña un importante papel pero no es el único factor determinante de la actividad.
Ejemplo de referencia 1
Selección de moléculas calcimiméticas en células paratiroideas bovinas
Se purificaron células paratiroideas bovinas disociadas en gradientes de Percoll y se cultivaron durante la noche en un medio libre de suero. Posteriormente, las células se cargaron con fura-2 y la concentración de Ca^{2+} intracelular libre se midió fluorimétricamente. Los cambios en [Ca^{2+}] se utilizaron para seleccionar moléculas activas en el receptor de Ca^{2+}. Para ser considerada como calcimimética, se requiere que una molécula muestre los efectos normales producidos por el aumento de Ca^{2+} extracelular y desencadenados por la activación del receptor de Ca^{2+}. Es decir,
1) La molécula debe provocar un aumento en [Ca^{2+}]_{i} que persiste en ausencia de Ca^{2+} (demostrando la movilización de Ca^{2+} intracelular);
2) La molécula debe producir un descenso en la formación de AMP cíclico estimulada por isoproterenol, que está bloqueada por la toxina de la tos ferina;
3) La molécula debe inhibir la secreción de PTH en el mismo intervalo de concentraciones que producen el aumento de [Ca^{2+}]_{i}; y
4) Las curvas de concentración-respuesta para la movilización de Ca^{2+} y la secreción de PTH por la molécula deben desplazarse a la derecha por un activador de PKC, tal como miristato-acetato de forbol (PMA).
Se probaron varias clases de moléculas estructuralmente diferentes: poliaminas, antibióticos de aminoglucósido, protamina y polímeros de lisina o arginina. Las estructuras de estas moléculas se representan en la figura 1. Se incluyen en la figura 1 la carga positiva neta de las moléculas y sus CE_{50} para provocar la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas bovinas.
Generalmente, cuanto mayor es la carga positiva neta en la molécula, mayor es su fuerza para producir la movilización de Ca^{2+} intracelular. Sin embargo, se han descubierto algunas excepciones sorprendentes a esta regla aparente, tal como se trata a continuación.
Tal como puede observarse a partir de las figuras, la espermina, la neomicina B y la protamina provocan aumentos rápidos y transitorios de [Ca^{2+}] en células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2 (figuras 6, 7,11). Sin embargo, no produjeron aumentos sostenidos y en el equilibrio de [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas bovinas (figuras 6, 11), aunque sí lo hicieron en células paratiroideas humanas (figura 19). A este respecto, se parecen a la respuesta de Ca^{2+} citosólico provocada por Mg^{2+} extracelular, lo que produce la movilización de Ca^{2+} intracelular sin el acompañamiento de un flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular en células bovinas (figura 11b). Los aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} provocados por espermina, neomicina B o protamina no se bloquearon por concentraciones bajas (1 \muM) de La^{3+} o Gd^{3+} (figura 11f, g). Los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por los policationes moleculares, persistieron en ausencia de Ca^{2+} extracelular, pero se bloquearon cuando las reservas celulares de Ca^{2+} se agotaron por pretratamiento con ionomicina (figuras 7; 11h, i). Por lo tanto, todas estas moléculas producen la movilización de Ca^{2+} en células paratiroideas.
Se demostró además que los policationes moleculares movilizaban la misma combinación de Ca^{2+} intracelular que la usada por Ca^{2+} extracelular. Por tanto, el aumento de la concentración de Ca^{2+} extracelular inhibió progresivamente los aumentos transitorios de [Ca^{2+}]_{i} provocados por la espermina (figura 6). A la inversa, una concentración de máxima eficacia de espermina o neomicina B (figura 12) bloquearon los aumentos transitorios, pero no en equilibrio, de [Ca^{2+}]_{i}
provocados por Ca^{2+} extracelular.
Significativamente, la espermina, la neomicina B y la protamina inhibieron la secreción de PTH al mismo grado que el Ca^{2+} extracelular. Estos efectos inhibidores sobre la secreción se obtuvieron a concentraciones que produjeron la movilización de Ca^{2+} intracelular (figuras 8, 13). Estos hallazgos son relevantes para entender los mecanismos que contribuyen a la regulación de la secreción de PTH por el Ca^{2+} extracelular. Debido a que toda una variedad de policationes inorgánicos inhiben la secreción, pero sólo Ca^{2+} extracelular produce aumentos sostenidos y en equilibrio de [Ca^{2+}]_{i}, tales aumentos en [Ca^{2+}]_{i} no pueden estar implicados de manera importante en la regulación de la secreción. La movilización de Ca^{2+} intracelular, más que el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular, es el mecanismo esencial asociado a la inhibición de la secreción de PTH. Esto es importante porque define el mecanismo suficiente que se afectará si una molécula afecta a la secreción de PTH; las moléculas que estimulan selectivamente el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular serán relativamente ineficaces en suprimir la secreción de PTH. En comparación, las moléculas que solamente producen la movilización de Ca^{2+} intracelular deberían ser igualmente eficaces que el Ca^{2+} extracelular en suprimir la secreción de PTH.
Al igual que la movilización de Ca^{2+} intracelular provocada por Ca^{2+} extracelular, la provocada por policationes moleculares disminuyó por PMA. Un experimento representativo que muestra los efectos inhibidores preferentes del PMA sobre aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por espermina se muestra en la figura 14. Los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por ATP no se vieron afectados, aun cuando se utilizó una concentración inferior a la máxima de ATP. El efecto de PMA sobre los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por policationes moleculares eran paralelos a su efecto sobre las respuestas al Ca^{2+} extracelular; en ambos casos, había un desplazamiento a la derecha de la curva de concentración-respuesta (figura 15). Los efectos de disminución del PMA sobre [Ca^{2+}]_{i} estaban acompañados por efectos potenciadores sobre la secreción que se superaron a altas concentraciones de policationes orgánicos (figura 16).
La movilización de Ca^{2+} intracelular provocada por policationes moleculares estaba asociada a aumentos en la formación de inositol fosfatos. Por ejemplo, la protamina produjo un aumento rápido (en un plazo de 30 s) en la formación de IP_{3} que estaba acompañada por un aumento en los niveles de IP_{1}. Ambos efectos eran dependientes de la concentración de protamina extracelular (figura 17). Además, el pretratamiento con PMA suavizó la formación de inositol fosfatos provocada por policationes moleculares. En la figura 18 se presentan los resultados representativos obtenidos con espermina.
La espermina, la neomicina B y la protamina disminuyeron los aumentos de AMP cíclico inducidos por isoproterenol. Al igual que los efectos inhibidores del Ca^{2+} extracelular sobre la formación de AMP cíclico, los producidos por policationes moleculares se bloquearon mediante pretratamiento con la toxina de la tos ferina (Tabla 2).
TABLA 2
AMP cíclico (% de control)
control +PTx
Ca^{2+} 0,5 mM 100 106 \pm 8
Ca^{2+} 2,0 mM 19 \pm 4 94 \pm 2
Ca^{2+} 0,5 mM, espermina 200 \muM 23 \pm 5 93 \pm 6
Ca^{2+} 0,5 mM, neomicina B 30 \muM 28 \pm 8 87 \pm 6
Ca^{2+} 0,5 mM, protamina 2 \mug/ml 20 \pm 4 89 \pm 9
\begin{minipage}[t]{155mm}La toxina de la tos ferina (PTx) bloquea los efectos inhibidores del Ca^{2+} extracelular y de los policationes moleculares sobre la formación de AMP cíclico. Las células paratiroideas bovinas se cultivaron durante 16 h con o sin toxina de la tos ferina 100 ng/ml. A continuación, las células se lavaron e incubaron durante 15 min. con isoproterenol 10 \mu M con o sin las concentraciones indicadas de Ca^{2+} extracelular o policationes moleculares. El AMP cíclico total (células + sobrenadante) se determinó mediante RIA y los resultados se expresaron como un porcentaje de los niveles obtenidos en Ca^{2+} 0,5 mM (112 \pm 17 pmoles/10^{6} células). Cada valor es la media \pm EEM de tres experimentos.\end{minipage}
En células paratiroideas humanas, el Mg^{2+} extracelular provocó un aumento sostenido y en el equilibrio de [Ca^{2+}]_{i} además de un aumento rápido y transitorio (figura 10). Igual que en las células paratiroideas bovinas que responden a Ca^{2+} extracelular, el aumento en el equilibrio de [Ca^{2+}]_{i} provocado por Mg^{2+} en células paratiroideas humanas resulta del flujo de entrada de Ca^{2+} a través de canales insensibles a la tensión (figura 10a). Este efecto de Mg^{2+} sobre [Ca^{2+}]_{i} en el equilibrio en células paratiroideas humanas se observa en tejidos adenomatosos e hiperplásicos.
La neomicina B y la espermina se probaron para determinar los efectos sobre [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas humanas preparadas a partir de tejido adenomatoso. Los resultados representativos se muestran en la figura 19. La neomicina B no sólo produjo un estado transitorio sino adicionalmente un aumento en el equilibrio de [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas humanas (figura 19a). Por tanto, en células humanas, la pauta de cambio en [Ca^{2+}]_{i} provocada por Ca^{2+}, Mg^{2+} extracelular o neomicina B es muy similar.
Los aumentos transitorios de Ca^{2+} citosólico provocados por neomicina B persistieron en presencia de La^{3+} (1 \muM) y en ausencia de Ca^{2+} extracelular. Por tanto, la neomicina B provoca la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas humanas. La neomicina B inhibe la secreción de PTH desde células paratiroideas humanas a concentraciones que producen la movilización de Ca^{2+} intracelular (figura 13).Sin embargo, hubo algunas diferencias en las respuestas de células paratiroideas humanas y bovinas a la neomicina B. La CE_{50} de neomicina B para la movilización de Ca^{2+} intracelular fue de 40 \muM en células paratiroideas bovinas y 20 \muM en las humanas (véanse las figuras 13 y 15), mientras que la potencia de espermina fue similar en células paratiroideas bovinas y humanas (CE_{50} = 150 \muM), Por tanto, aunque las células bovinas pueden usarse para estudios iniciales para seleccionar moléculas de prueba para determinar su actividad, es importante realizar estudios de seguimiento usando células paratiroideas humanas.
Para evaluar los efectos de policationes moleculares sobre células C, se utiliza una línea celular neoplásica, derivada de un carcinoma medular de tiroides de rata (células rMTC 6-23). Tanto espermina (10 mM) como la neomicina B (5 mM) no tuvieron ningún efecto sobre la [Ca^{2+}]_{i} elemental en estas células. Ninguna de las dos moléculas tampoco afectó a la respuesta a la adición posterior de Ca^{2+} extracelular. En la figura 21 se muestran los resultados representativos que documentan la falta de efecto de la neomicina B. La neomicina B (1 mM) o la espermina (1 ó 5 mM) fracasaron en provocar algún aumento de [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos (figura 23). En el trazo mostrado, parecía haber cierta potenciación de la respuesta a un aumento posterior de la concentración de Ca^{2+} extracelular, aunque esto no era un hallazgo constante. En otras dos células, la espermina (5 mM) de nuevo no tuvo ningún efecto sobre [Ca^{2+}]_{i} basal y produjo una pequeña inhibición (aproximadamente del 15%) del aumento de [Ca^{2+}]_{i} inducido por Ca^{2+} extracelular. En una tercera célula, la neomicina B (5 mM) no tuvo ningún efecto sobre [Ca^{2+}]_{i} basal y no afectó a los aumentos de [Ca^{2+}]_{i} provocados por Ca^{2+} extracelular. La visión de conjunto que se desarrolla a partir de estos estudios es que la espermina y la neomicina B no presentan ningún efecto sobre los niveles basales o estimulados de Ca^{2+} citosólico en osteoclastos.
El fracaso de los policationes moleculares en afectar a los mecanismos de detección de Ca^{2+} de las células C o de los osteoclastos demuestra la capacidad para descubrir o diseñar nuevas moléculas líder que actúan específicamente sobre el receptor de Ca^{2+} de las células paratiroideas o, de otro modo, modular una o más funciones de la respuesta normal de la célula paratiroidea a [Ca^{2+}].
A continuación, se describe en detalle la selección de varias otras moléculas y los resultados se resumen en la tabla 1.
Ejemplo de referencia 2
Selección de poliamina
Se seleccionaron poliaminas de cadena lineal (espermina, espermidina, TETA, TEPA y PEHA) y dos derivados de las mismas (NPS 381 y NPS 382) según el ejemplo 1. Se descubrió que todas estas moléculas movilizaban Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas bovinas. Su orden de potencia es el siguiente, con la carga positiva neta citada entre paréntesis:
TABLA 3
Molécula CE_{50} (en \muM)
NPS 382 (+8) 50
NPS 381 (+10) 100
espermina (+4) 150
PEHA (+6) 500
espermidina (+3) 2.000
TEPA (+5) 2.500
TETA(+4) 8.000
Putrescina (+2) y cadaverina (+2) eran inactivas a una concentración de 2 mM.
Otra poliamina de cadena lineal, DADD, se comportó de manera algo diferente de las otras poliaminas y se describe en el ejemplo 7.
Ejemplo de referencia 3
Selección de poliaminas cíclicas
Dos poliaminas cíclicas, hexacicleno y NPS 383, se seleccionaron como en el ejemplo 1. Hexacicleno (+6, CE_{50} = 20 \muM) es 7 veces más potente que NPS 383 (+8, CE_{50} = 150 \muM). Se debería esperar lo contrario basándose únicamente en la carga positiva neta como la característica estructural para determinar la actividad del receptor de Ca^{2+}.
Ejemplo de referencia 4
Selección de antibiótico de aminoglucósido
Se seleccionaron seis antibióticos como en el ejemplo 1. Las CE_{50} para la movilización de Ca^{2+} en orden de potencia son:
TABLA 4
Antibiótico CE_{50} (en \muM)
Neomicina (+6) 10
Gentamicina (+5) 150
Bekanamicina (+5) 200
Estreptomicina (+3) 600
Kanamicina (+4,5) y lincomicina (+1) no tuvieron efecto a una concentración de 500 \muM. Dentro de la serie de aminoglucósidos, hay una correlación entre la carga positiva neta y la potencia. Sin embargo, la neomicina es considerablemente más potente que varias poliaminas (NPS 381, NPS 382, NPS 383, PEHA) que presentan una carga positiva igual o mayor.
Ejemplo de referencia 5
Selección de péptidos y poliaminoácidos
Se seleccionaron protamina y polímeros de lisina o arginina que varían en longitud del péptido por su capacidad para movilizar Ca^{2+} intracelular como en el ejemplo 1. Las CE_{50} resultantes para la movilización de Ca^{2+} intracelular, en orden de rangos de potencia son:
TABLA 5
Péptido (PM en KD) CE_{50} (en mM)
poliArg (100) 4
poliArg (40) 15
poliLys (27) 30
protamina (4,8) 75
poliArgTyr (22) 200
poliLys (14) 1.000
poliLys (3,8) 3.000
La carga positiva neta de estos polímeros aumenta al aumentar el PM. Así, con respecto a los aminoglucósidos, hay una correlación directa entre carga neta y potencia en esta serie de poliaminoácidos. La protamina es esencialmente poliArg con una carga positiva neta de +21.
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Ejemplo de referencia 6
Selección de arilalquilamina
Se seleccionaron moléculas seleccionadas a partir de la clase de toxinas de arilalquilamina derivada de los venenos de avispas y arañas, tal como en el ejemplo 1.
La filantotoxina-433 (+3) no presentó efecto a una concentración de 500 \muM. Es similar en estructura a las argiotoxinas que se describen más adelante.
La argiotoxina-636 (400 \muM) no provocó aumentos en [Ca^{2+}]_{i} pero potenció las respuestas de Ca^{2+} citosólico a la adición posterior de Ca^{2+} extracelular. Esta es una característica común para todas las moléculas que activan el receptor de Ca^{2+} y también se observa con una variedad de cationes divalentes extracelulares. Esto se considera en más detalle en el ejemplo 7.
A diferencia de la argiotoxina-636, la argiotoxina-659 provocó aumentos en [Ca^{2+}]_{i} con una CE_{50} de 300 \muM. La argiotoxina-659 difiere de la argiotoxina-636 en que presenta un resto indol hidroxilado en vez de un grupo dihidroxifenilo. Esta es la única diferencia en la estructura de estas dos moléculas. Así, la diferencia en potencia se encuentra en la naturaleza del grupo aromático, no en la cadena de poliamina que porta la carga positiva.
Ejemplo de referencia 7
Selección de bloqueantes del canal de Ca^{2+}
Se seleccionaron bloqueantes del canal de Ca^{2+}, es decir, aquellas moléculas que bloquean el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular a través de canales de Ca^{2+} sensibles a la tensión, tal como en el ejemplo 1. Existen tres clases estructurales de bloqueantes del canal de Ca^{2+}: (1) dihidropiridinas, (2) fenilalquilaminas, y (3) benzotiazepinas.
Ninguna de las dihidropiridinas probadas (nifedipino, nitrendipino, BAY K 8644, y (-) 202-791 y (+) 202-791) presentó ningún efecto sobre [Ca^{2+}]_{i} basal ni aumentos en [Ca^{2+}]_{i} provocados por Ca^{2+} extracelular cuando se probaron a 1 \muM. Estudios previos mostraron que las células paratiroideas carecen de canales de Ca^{2+} sensibles a la tensión, pero sí que presentan canales de Ca^{2+} no sensibles a la tensión, que están regulados por el receptor de Ca^{2+}.
Las fenilalquilaminas examinadas fueron verapamilo, D-600 (un derivado de metoxilo de verapamilo), TMB-8 y un análogo de TMB-8, NPS 384. Se probaron las primeras tres moléculas a una concentración de 100 \muM. Las fenilalquilaminas se comportaron de manera diferente a otras moléculas examinadas. No provocaron ningún cambio en [Ca^{2+}]_{i} cuando se añadieron a células sumergidas en un baño en tampón que contiene una concentración baja de Ca^{2+} extracelular (0,5 mM). Sin embargo, verapamilo, D-600 y TMB-8 potenciaron la movilización de Ca^{2+} intracelular provocada por cationes divalentes extracelulares y bloquearon adicionalmente el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular. A niveles intermedios de Ca^{2+} extracelular (1 a 1,5 mM), estas moléculas pudieron provocar un aumento pequeño pero robusto en [Ca^{2+}]_{i} que surgió a partir de la movilización de Ca^{2+} intracelular.
Las fenilalquilaminas actúan de manera diferente a los policationes orgánicos, tales como la neomicina. Los datos sugieren que verapamilo, D-600 y TMB-8 son agonistas parciales en el receptor de Ca^{2+}, a diferencia de otras moléculas examinadas que eran agonistas totales.
La molécula NPS 384, en una concentración de 300 \muM, no provocó un aumento en [Ca^{2+}]_{i} pero bloqueó el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular. Las pruebas a concentraciones superiores pueden revelar una capacidad de esta molécula para producir la movilización de Ca^{2+} intracelular.
Mientras que la capacidad de estas moléculas para bloquear el flujo de entrada es interesante y no inesperada completamente, es la capacidad de estas moléculas para provocar aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} (que surgen a partir de la movilización de Ca^{2+} intracelular) la que es importante. La experiencia considerable con mediciones de [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas demuestra que aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} resultan casi invariablemente de la movilización de Ca^{2+} intracelular y por lo tanto refleja la activación del receptor de Ca^{2+}.
La benzotiazepina examinada, diltiazem, fue similar en todos los sentidos a verapamilo y D-600 y también fue eficaz a 100 \muM.
Debería mencionarse que, con la excepción de las fenilalquilaminas, todas las moléculas activas probadas anteriormente provocan un aumento en [Ca^{2+}]_{i} que son de magnitud similar al que provoca una concentración de máxima eficacia de Ca^{2+} extracelular. Esto demuestra que estas moléculas son igualmente eficaces que los cationes divalentes extracelulares. Esto contrasta con la actividad de las fenilalquilaminas, que parece que actúan solamente como agonistas parciales.
Entre las fenilalquilaminas, surgen algunas relaciones de estructura-actividad interesantes. Significativas son las diferentes potencias de moléculas tales como TMB-8 y NPS 384. THB-8 potenció aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} a 100 \muM, mientras que NPS 384 fracasó en hacer lo mismo, incluso a 300 \muM, aunque estas moléculas portan la misma carga positiva neta. Se deduce que alguna otra característica estructural, no relacionada con la carga neta, confiere una potencia superior a TMB-8.
Ejemplo 8 Selección de moléculas en células paratiroideas humanas
Se probaron espermina y neomicina para determinar los efectos sobre [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas humanas obtenidas a partir de glándulas extirpadas mediante cirugía y preparadas como en el ejemplo 1. En células paratiroideas humanas, se descubrió que la espermina produce solamente un aumento pequeño en [Ca^{2+}]_{i}, cuando se probó en una concentración de 300 \muM.
Por otro lado, la neomicina provocó un aumento grande en [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas humanas cuando se probó en una concentración de 20 \muM. La magnitud de la respuesta provocada por neomicina fue igual que la provocada por una concentración de máxima eficacia de Ca^{2+} extracelular.
Ejemplo 9 Selección de moléculas en ovocitos de Xenopus
Los ovocitos a los que se les inyectó ARNm procedente de células paratiroideas humanas expresan el receptor de Ca^{2+} y movilizan Ca^{2+} intracelular en respuesta a una variedad de cationes extracelulares inorgánicos di y trivalentes. Utilizar esta selección nos permite probar para determinar una acción directamente sobre el receptor de Ca^{2+}. Los ovocitos que expresan el receptor de Ca^{2+} también respondieron a varias moléculas activas sobre células paratiroideas intactas cuando se seleccionaron tal como sigue. Hexacicleno produjo la movilización de Ca^{2+} intracelular en una concentración de 135 \muM. Neomicina (100 \muM) y NPS 382 (5 mM) también fueron eficaces. Esto ofrece una evidencia bastante convincente que muestra que estas moléculas actúan sobre el receptor de Ca^{2+} o sobre alguna otra proteína íntimamente asociada con su función.
Por ejemplo, también se ha podido detectar la expresión del receptor de Ca^{2+} en ovocitos midiendo la movilización de ^{45}Ca^{2+}. En estos experimentos, se les inyectó a los ovocitos ARNm paratiroideo bovino o agua y, después de 72 horas se expusieron a suero o a neomicina 10 mM. Antes de estimularse, se cargaron los ovocitos con ^{45}Ca^{2+}. La estimulación con suero durante 20 min. dio como resultado la liberación de ^{45}Ca^{2+} intracelular que representa un aumento del 45% comparado con exposición simulada con tampón. La exposición con neomicina 10 mM durante 20 min. dio como resultado un aumento del 76% en la liberación de ^{45}Ca^{2+}. El ensayo es suficientemente sensible para su utilización en la clonación del receptor de Ca^{2+}, y presenta la ventaja de un rendimiento más elevado que la medición electrofisiológica de la corriente de Cl^{-} activada por Ca^{2+}.
En otro ejemplo, se obtuvo tejido de osteoclastoma humano a partir de tejido de biopsia de hueso. Se expusieron ovocitos a los que se les inyectó ARNm aislado a partir de este tejido a Ca^{2+} 30 mM. Los controles no respondieron mientras que 8 de 12 ovocitos a los que se les inyectó ARNm de osteoclastoma respondieron apropiadamente (figura 34). Estos experimentos proporcionaron la primera evidencia de que la respuesta de Ca^{2+} de osteoclastos a Ca^{2+} extracelular de hecho está codificada genéticamente. Estos resultados también indican que el receptor de Ca^{2+} de osteoclastos puede clonarse mediante expresión en ovocitos de Xenopus.
Ejemplo 10 Selección de moléculas en osteoclastos de rata
Sin embargo, las sensibilidades diferentes de las células paratiroideas y los osteoclastos al Ca^{2+} extracelular sugieren que sus receptores de Ca^{2+} son diferentes. Mientras que las células paratiroideas responden a concentraciones de Ca^{2+} extracelular entre 0,5 y 3 mM, los osteoclastos responden solamente si el nivel de Ca^{2+} extracelular aumenta por encima de 5 mM. No obstante, esta concentración bastante elevada de Ca^{2+} es fisiológica para los osteoclastos; puesto que ellos reabsorben hueso, la concentración local de Ca^{2+} extracelular puede alcanzar niveles de hasta 30 mM.
Se realizó la selección de moléculas con osteoclastos tal como sigue. Se obtuvieron osteoclastos a partir de huesos largos de ratas neonatales. Se midió [Ca^{2+}]_{i} en células individuales utilizando el indicador fluorimétrico indo-1. Se probaron espermina, espermidina, neomicina y verapamilo, y ninguno de éstos produjo ningún aumento grande de [Ca^{2+}]_{i} en los osteoclastos (aunque se detectaron pequeñas respuestas).
En una concentración de 1 mM, la espermidina produjo un aumento pequeño de [Ca^{2+}]_{i} (aproximadamente un 10% del provocado por una concentración máxima de Ca^{2+} extracelular). Ni la neomicina (10 mM) ni la espermina (10 ó 20 mM) produjeron aumentos de [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata. La neomicina (10 mM) no bloqueó el aumento de [Ca^{2+}]_{i} provocado por la adición posterior de Ca^{2+} extracelular 25 mM. Sin embargo, el pretratamiento con espermina (20 mM) disminuyó la respuesta a Ca^{2+} extracelular. Verapamilo (100 \muM) no produjo ningún aumento detectable de [Ca^{2+}]_{i} pero bloqueó la respuesta a Ca^{2+} extracelular.
Las comparaciones entre osteoclastos y células paratiroideas muestran que las moléculas activas sobre las últimas son relativamente ineficaces en los osteoclastos. Esto demuestra que se desarrollan fácilmente fármacos que tienen como diana un receptor de Ca^{2+} específico sin afectar a aquellos tipos de receptores presentes en otras células que detectan Ca^{2+}. Similarmente, también pueden desarrollarse fármacos activos en dos o más de tales receptores de
Ca^{2+}.
Otros ejemplos de receptor de CA^{2+}
Los ejemplos siguientes demuestran que, igual que existen subtipos de receptores de ligandos moleculares, también parece que existen subtipos de receptores de Ca^{2+} que pueden estar afectados diferencialmente por fármacos. El receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas detecta niveles de Ca^{2+} extracelular de aproximadamente 1,5 mM mientras que el receptor de Ca^{2+} en el osteoclasto responde a niveles de aproximadamente 10 mM (figura 22). Neomicina o espermina, que activan el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas no afectan a los receptores de Ca^{2+} en las células C o en los osteoclastos (figuras 21 y 23). Estos datos constituyen la primera evidencia de subtipos distintos farmacológicamente de receptores de Ca^{2+} y estos datos están usándose para diseñar y desarrollar fármacos que actúen selectivamente sobre un tipo particular de receptor de Ca^{2+}. De hecho, las pruebas de moléculas líder demuestran tales efectos específicos de células. Por ejemplo, NPS 449, que provoca aumentos en [Ca^{2+}]_{i} en los osteoclastos no presenta efecto sobre [Ca^{2+}]_{i} en las células paratiroideas. A la inversa, NPS 447, que activa el receptor de Ca^{2+} en la célula paratiroidea es eficaz activando el receptor de Ca^{2+} del osteoclasto solamente a concentraciones 10 veces superiores. Finalmente, agatoxina 489, aunque no es muy potente en la activación del receptor de Ca^{2+} de células C (CE_{50} = 150 \muM), es un activador bastante potente del receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas (CE_{50} = 3 \muM). Las moléculas líder actualmente en desarrollo afectarán selectivamente a la actividad de un tipo específico de célula que detecta Ca^{2+} in vivo.
Fármacos con menos especificidad podrían no ser necesariamente no deseables terapéuticamente. Así, reducir la actividad del osteoclasto y estimular la secreción de calcitonina son dos enfoques diferentes para inhibir la resorción ósea. Los fármacos que tienen como diana los receptores de Ca^{2+} en ambas de estas células podrían ser tratamientos muy eficaces para la osteoporosis. Ya que la PTH también está implicada en regular el metabolismo óseo, los fármacos que actúan sobre el receptor de Ca^{2+} de la célula paratiroidea también pueden ser útiles en el tratamiento y/o prevención de la osteoporosis.
Se muestran más adelante los resultados de algunas moléculas de prueba. En la tabla 6, se muestra la actividad comparativa de las moléculas calcimiméticas. Se cargaron células paratiroideas bovinas y células C (células rMT 6-23) con fura-2 y osteoclastos de rata, con indo-1, y se determinó la potencia de las moléculas indicadas para movilizar Ca^{2+} intracelular construyendo curvas acumulativas de concentración-respuesta. Las moléculas enumeradas como "inactivas" no alteraron la [Ca^{2+}]_{i}; cuando se probaron en una concentración de 1 mM.
TABLA 6
CE_{50} (\mum)
Compuesto Paratiroides Osteoclasto Célula C
NPS 568 (EE) 0,78 200 > 300
NPS 568 (LE) 30 - -
NPS 467 (EE) 2 > 100 -
NPS 467 (LE) > 30 - -
NPS 017 6 inactivo 150
NPS 447 9 150 -
NPS 456* 15 200 > 100
NPS 015 22 - inactivo
NPS 109 40 > 300 5
NPS 449 inactivo 150 -
NPS 468* 30 250 -
espermina 150 inactivo inactivo
neomicina 40 inactivo inactivo
* \begin{minipage}[t]{155mm} mezcla racémica; "inactivo" se define como que no produce ningún aumento en Ca^{2+} citosólico a una concentración de 1 a 5 mM; EE es de elución temprana; LE es de elución tardía. \end{minipage}
Ejemplo 11 Moléculas líder para receptores de Ca^{2+} de paratiroides
Estudios de estructura-actividad utilizando poliaminas y arilalquilaminas condujeron a pruebas de moléculas estructuralmente afines a NPS 456. NPS 456 es un activador potente del receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas. Esta molécula es notable porque contiene solamente una carga positiva, sin embargo es mucho más potente que muchas moléculas polibásicas. El pretratamiento breve (2 minutos) con PMA desplaza a la derecha la curva concentración-respuesta para NPS 456. Esto indica que NPS 456 actúa a través del mismo mecanismo utilizado por el Ca^{2+} extracelular. NPS 456 provoca la movilización de Ca^{2+} intracelular en ovocitos de Xenopus que expresan el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas, lo cual demuestra una acción directa sobre el receptor de Ca^{2+} (figura 33). Además, NPS 456 contiene un carbono quiral, y por lo tanto existe en dos formas isoméricas. Ambos isómeros se han sintetizado y examinado para determinar su actividad. El isómero R, NPS 447, es 12 veces más potente que el isómero S, NPS 448 (figura 28). Esta es la primera demostración de que un receptor de Ca^{2+} puede reconocer una molécula orgánica de una manera estereoespecífica.
Ya que NPS 447 es una molécula simple estructuralmente con efectos selectivos y potentes sobre el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas, los estudios de estructura-actividad alrededor de esta molécula líder son simples. El objetivo de estos estudios es generar una serie de moléculas relacionadas con varias características a partir de las cuales pueda seleccionarse el candidato de desarrollo final. Este esfuerzo ya ha revelado algunos de los dominios estructurales de NPS 447 que contribuyen a la actividad y a la potencia. Por ejemplo, el compuesto nuevo NPS 459 es un análogo de NPS 447 que es más pequeño (PM < 240), sin embargo casi tan potente como la molécula original, mientras que otros análogos diversos son relativamente inactivos. Las moléculas más interesantes de este proyecto análogo pueden introducirse en pruebas in vivo para determinar los efectos sobre la secreción de PTH y los niveles de Ca^{2+} en suero (véanse los ejemplos 15, 16, 17, 18 y 23).
El compuesto nuevo NPS 467 es una molécula incluso más pequeña que NPS 447, sin embargo la primera es aproximadamente 3 veces más potente que la última a la hora de producir la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas. Al igual que NPS 456, NPS 467 es una mezcla racémica. Se anticipa que la resolución de NPS 467 en sus enantiómeros proporciona un isómero de potencia incluso superior que la mezcla racémica (véase el ejemplo 16). NPS 551 es otro compuesto nuevo tan potente como NPS 467 a la hora de producir la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas. NPS 551 es una mezcla racémica y se anticipa que la resolución de NPS 551 en sus enantiómeros dará como resultado un isómero que es más potente que la mezcla racémica. Se espera que estudios de estructura-actividad adicionales en moléculas relacionadas con NPS 447, NPS 467, NPS 551 y NPS 568 produzcan isómeros puros con potencia superior a estas moléculas en sus formas de racemato.
Los resultados obtenidos con NPS 456 (figura 33) muestran que provoca aumentos oscilatorios en la corriente de Cl^{-} a concentraciones de 100 \muM. NPB 456 es la molécula más potente activada en ovocitos de Xenopus que expresan el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas. Estos resultados obtenidos en este sistema de expresión con neomicina y NPS 456 demuestran que estas moléculas actúan directamente sobre el receptor de Ca^{2+}.
Ejemplo de referencia 12
Moléculas líder para el receptor de Ca^{2+} de osteoclastos
La estrategia utilizada para elucidar el mecanismo de acción del Ca^{2+} extracelular sobre el osteoclasto fue similar a la que demostró ser eficaz en células paratiroideas. Los primeros experimentos examinaron los efectos de La^{3+} sobre [Ca^{2+}]_{i} en osteoclastos de rata individuales cargados con el indicador fluorimétrico indo-1. Tal como se describió anteriormente, los cationes trivalentes como La^{3+} son impermeantes y bloquean el flujo de entrada de Ca^{2+}. Concentraciones micromolares bajas de La^{3+} disminuyeron parcialmente los aumentos de [Ca^{2+}]_{i} inducidos por Ca^{2+} extracelular (figura 29). La demostración de un aumento resistente a La^{3+} en [Ca^{2+}]_{i} proporciona evidencia de la movilización de Ca^{2+} intracelular. Los resultados de estos experimentos van en paralelo a aquéllos obtenidos en células paratiroideas y sugieren que se utilizan mecanismos similares por el Ca^{2+} extracelular para regular [Ca^{2+}]_{i} en ambos tipos de células.
Otra serie de experimentos mostraron que Mn^{2+} extracelular provocó aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i} (figura 30(a)) que persistieron en ausencia de Ca^{2+} extracelular (figura 30B). Estos resultados son asimismo indicativos de la movilización de Ca^{2+} intracelular. Aunque Mn^{2+} pueda entrar en algunas células, es poco probable que haga lo mismo en el osteoclasto porque Mn^{2+} extingue la fluorescencia de indo-1. Así, si Mn^{2+} penetrara intracelularmente, se observaría una disminución, no un aumento, en la señal de fluorescencia.
Los resultados obtenidos con una variedad de cationes di o trivalentes concuerdan todos con la presencia de un receptor de Ca^{2+} en la superficie del osteoclasto que se acopla con la movilización de Ca^{2+} intracelular y el flujo de entrada de Ca^{2+} extracelular a través de canales no sensibles a la tensión. Los resultados muestran evidencia de material genético en osteoclastos humanos que codifica para una proteína receptora de Ca^{2+} (véase más adelante). Los aumentos transitorios en [Ca^{2+}]_{i}, que resultan de la movilización de Ca^{2+} intracelular, son suficientes para inhibir la resorción ósea osteoclástica in vitro. Así, tal como con la célula paratiroidea, la activación del receptor de Ca^{2+} parece ser un medio viable para inhibir la actividad de los osteoclastos.
NPS 449 es actualmente la molécula líder para fármacos calcimiméticos de este receptor. Es una molécula pequeña (PM < 425) y moviliza Ca^{2+} intracelular en osteoclastos de rata con una CE_{50} de 200 \muM (figuras 31A y 31B). Aunque la potencia de NPS 449 es relativamente baja, tiene una estructura simple con solamente una carga positiva y se espera que presente las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas deseadas.
NPS 449 se examinó para determinar su capacidad para inhibir la resorción ósea in vitro. Esto se hizo mediante análisis morfométrico de la formación de fosos sobre cortes delgados de hueso cortical bovino utilizando microscopía electrónica de barrido. Se incubaron los osteoclastos de rata durante 24 horas en cortes de hueso en presencia o ausencia de concentraciones diversas de NPS 449. NPS 449 produjo una inhibición de la resorción ósea dependiente de la concentración con una CI_{50} de 10 \muM. Los resultados anticipados proporcionan la primera demostración de que moléculas que actúan en este sitio nuevo pueden inhibir la resorción ósea osteoclástica. Se generarán análogos de MPS 449 más potentes utilizando química sintética y se probarán y someterán a ensayo utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria.
Ejemplo de referencia 13
Moléculas líder para el receptor de Ca^{2+} de células C
La activación del receptor de Ca^{2+} de células C estimula la secreción de calcitonina, que actúa luego sobre los osteoclastos para inhibir la resorción ósea. Los fármacos calcimiméticos que afectan selectivamente a células C son útiles en el tratamiento de la osteoporosis.
Se utiliza la movilización de Ca^{2+} intracelular como un índice funcional de actividad de receptor de Ca^{2+}. Se facilita el esfuerzo de selección en células C mediante la disponibilidad de líneas celulares cultivadas que expresan el fenotipo de célula C (por ejemplo, células de carcinoma medular de tiroides de rata; células rMTC 6-23). Se seleccionaron tres moléculas de arilalquilamina para el estudio inicial. Dos se producen de manera natural (agatoxina 489 y agatoxina 505) y la otra (NPS 019) es un análogo de agatoxina sintético. Se encontró que la agatoxina 505 bloquea los aumentos en [Ca^{2+}]_{i} inducidos por Ca^{2+} extracelular, con una CI_{50} de 3 \muM. El efecto inhibidor resultó de un bloqueo del canal de Ca^{2+} sensible a la tensión de tipo L presente en estas células. Por el contrario, se encontró que la agatoxina 489 moviliza Ca^{2+} intracelular en células rMTC con una CE_{50} de 150 \muM. Esta fue la primera molécula orgánica descubierta que se encontró que activaba el receptor de Ca^{2+} de células C. El análogo sintético, NPS 019, fue incluso más potente y movilizó Ca^{2+} intracelular con una CE_{50} de 5 \muM (figura 32). Es significativo que la única diferencia estructural entre NPS 019 y agatoxina 489 es la presencia o ausencia de un grupo hidroxilo. El hecho de que tales diferencias sutiles en la estructura afecten profundamente a la potencia de las moléculas indica un sitio de unión específico estructuralmente en el receptor de Ca^{2+}. Esto, a su vez, fomenta la idea de que pueden desarrollarse activadores muy potentes y selectivos de los receptores de Ca^{2+}.
NPS 019, que es una molécula pequeña (PM < 500), es una molécula líder para el desarrollo de calcimiméticos del receptor de Ca^{2+} de células C y puede probarse para determinar su capacidad para estimular la secreción de calcitonina in vitro. Pruebas posteriores in vivo determinarán luego la capacidad de esta molécula para estimular la secreción de calcitonina e inhibir la resorción ósea. Estos estudios in vivo se realizarán en ratas. Los resultados obtenidos en estos estudios, que se anticipa que sean positivos, proporcionarán la primera evidencia que muestra que una molécula orgánica pequeña que actúa sobre un receptor nuevo puede estimular la secreción de calcitonina y disminuir la resorción ósea.
Ejemplo de referencia 14
Actividad calciolítica de NPS 021 sobre células paratiroideas
Para que un compuesto se considere un calciolítico, debe bloquear los efectos del Ca^{2+} extracelular o de un compuesto calcimimético en una célula que detecta Ca^{2+} extracelular. Un ejemplo de un compuesto calciolítico es NPS 021, cuya estructura se proporciona en la figura 1. En células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2, NPS 021 bloquea los aumentos en [Ca^{2+}]_{i} provocados por Ca^{2+} extracelular. La CI_{50} de NPS 021 para bloquear esta respuesta es de aproximadamente 200 \muM y, a concentraciones de aproximadamente 500 \muM, se suprime el aumento en [Ca^{2+}]_{i} provocado por Ca^{2+} extracelular. Significativamente, NPS 021 no causa por sí mismo ningún cambio en [Ca^{2+}]_{i} cuando se prueba a baja [Ca^{2+}] (0,5 mM; figura 37).
Ejemplo 15 NPS 497 disminuye el calcio ionizado en suero
Se probaron in vitro los compuestos que se ha demostrado que activan el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas bovinas para determinar su actividad hipocalcémica in vivo. Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho (200 g) con una dieta baja en calcio durante una semana antes de recibir la sustancia de prueba o el vehículo como control. Se extrajo sangre de la vena de la cola tres horas después de la administración intraperitoneal de NPS 467. Se midió el Ca^{2+} ionizado en sangre entera o suero con un analizador Ciba-Corning 634 según las instrucciones proporcionadas con el instrumento. Se midieron calcio total, albúmina y fosfato en suero mediante técnicas bien conocidas en la técnica.
NPS 467 produjo una reducción dependiente de la dosis en el Ca^{2+} en suero y sangre completa (figura 38). El descenso de Ca^{2+} en sangre en este momento fue análogo a un descenso proporcional en los niveles de calcio total en sangre. No hubo cambio en los niveles de albúmina o fosfato en suero en ninguna de las dosis examinadas. En estudios preliminares, NPS 467, en dosis eficaces en la disminución de Ca^{2+} en sangre, produjo una reducción dependiente de la dosis en los niveles circulantes de PTH (figura 39). El efecto hipocalcémico de NPS 467 fue máximo en un plazo de tres horas y volvió a los niveles de control después de 24 horas (figura 40).
NPS 467 (el isómero EE; véase el ejemplo 16) también fue eficaz disminuyendo el Ca^{2+} ionizado en suero en ratas mantenidas con una dieta normal repleta de calcio. Una dosis única de NPS 467 (isómero EE, 10 mg/kg i.p.) produjo un descenso rápido en los niveles en suero de Ca^{2+} ionizado, que eran máximos mediante una disminución de 1 hora (22%) a partir del nivel de control y permanecieron reducidos a o cerca de este nivel durante hasta 6 horas.
Ejemplo 16 NPS 467 disminuye el calcio ionizado en suero de una manera estereoespecífica
NPS 467 es una mezcla racémica. Se logró la resolución de NPS 467 en sus dos enantiómeros mediante separación en una columna quiral. El isómero EE (para "elución temprana", véase el ejemplo 21) fue aproximadamente 100 veces más potente que el isómero LE (para "elución tardía") activando el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas bovinas in vitro tal como se evaluó por la capacidad de los enantiómeros de provocar aumentos en la [Ca^{2+}]_{i} en células paratiroideas (figura 41). Asimismo, la resolución similar del compuesto nuevo NPS 568 en sus enantiómeros mostró que el isómero EE era 40 veces más potente que el isómero LE produciendo la movilización de Ca^{2+} intracelular en células paratiroideas bovinas (véase la tabla 6, anteriormente).
Se examinaron los isómeros de NPS 467 para determinar los efectos sobre el Ca^{2+} en suero tal como en el ejemplo 15. En concordancia con los resultados in vitro, el isómero EE o NPS 467 demostró ser más potente que el isómero LE disminuyendo el Ca^{2+} en suero in vivo (figura 42; se probó cada compuesto a una concentración de 5 mg/kg de peso corporal).
Ejemplo 17 NPS 467 disminuye el calcio ionizado en suero en un modelo in vivo de hiperparatiroidismo secundario
Un modelo animal aceptado y ampliamente utilizado de hiperparatiroidismo secundario que surge a partir de insuficiencia renal crónica es la rata sometida a nefrectomía 5/6. Los animales que reciben tal cirugía se vuelven hipocalcémicos inicialmente y, para mantener los niveles de Ca^{2+} en suero, existe una hiperplasia compensatoria de las glándulas paratiroideas y niveles elevados de PTH circulante. Ratas Sprague-Dawley macho (250 g) recibieron nefrectomía 5/6 y se les permitió recuperarse durante 2 semanas. En este momento fueron normocalcémicas (debido a niveles elevados de PTH en suero). La administración de NPS 467 (isómero EE; 10 mg/kg i.p.) produjo un descenso rápido (en un plazo de 2 horas) en los niveles de Ca^{2+} ionizado en suero hasta un 83% de los controles en un modelo animal de hiperparatiroidismo secundario. Esto sugiere que compuestos de esta clase disminuirán eficazmente la secreción de PTH en pacientes con hiperparatiroidismo secundario y en glándulas paratiroideas hiper-
plásicas.
Ejemplo 18 NPS 467 no disminuye los niveles de calcio ionizado en suero en animales sometidos a paratiroidectomía
Para determinar el tejido diana primario sobre el que actúa NPS 467 para producir una respuesta hipocalcémica, se extirparon quirúrgicamente las glándulas paratiroideas en ratas. Los animales que reciben una paratiroidectomía total se vuelven hipocalcémicos y dependen en gran medida del calcio en la dieta para mantener la homeostasis de Ca^{2+} en suero. Los animales sometidos a paratiroidectomía tenían niveles de Ca^{2+} ionizado en suero de 0,92 mM, que descendieron gradualmente hasta 0,76 mM después de 6 horas de ayuno. La administración de una dosis única de NPS 467 EE (10 mg/kg i.p.) no produjo ningún cambio en los niveles de Ca^{2+} ionizado en suero durante un periodo de 6 horas. Estos resultados demuestran que se requieren glándulas paratiroideas intactas para los efectos hipocalcémicos de NPS 467 EE. Los datos demuestran adicionalmente que NPS 467 EE puede tener como diana las glándulas paratiroideas in vivo. Los resultados concuerdan con la idea de que NPS 467 EE actúa sobre el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas in vivo para disminuir la secreción de PTH y de ese modo hacer que desciendan los niveles en suero de Ca^{2+} ionizado.
Ejemplo 19 NPS 467 aumenta el calcio intracelular en glándulas paratiroideas humanas
Se prepararon células paratiroideas disociadas a partir de un adenoma paratiroideo obtenido mediante cirugía a partir de un paciente con hiperparatiroidismo primario. Se cargaron las células con fura-2 y se midió [Ca^{2+}]_{i} tal como se describió anteriormente. Tanto NPS 467 EE como NPS 568 EE produjeron un aumento dependiente de la concentración en [Ca^{2+}]_{i}. Las CE_{50} para NPS 467 EE y NPS 568 EE fueron de 20 y 3 \muM, respectivamente. Estos dos compuestos pueden así aumentar [Ca^{2+}]_{i} en tejido humano patológico y se esperaría así que disminuyeran los niveles en suero de PTH y Ca^{2+} en pacientes con hiperparatiroidismo primario.
Ejemplo 20 Mecanismo de acción de NPS 467 en el receptor de calcio de células paratiroideas
Se utilizaron células paratiroideas bovinas disociadas para explorar adicionalmente el mecanismo de acción de NPS 467 a nivel del receptor. En presencia de Ca^{2+} extracelular 0,5 mM, NPS 467 EE produjo un aumento rápido y transitorio en [Ca^{2+}]_{i} que persistió en presencia de La^{3+} 1 \muM y que disminuyó parcialmente mediante pretratamiento con PMA (100 nM durante 2 min.). Además, NPS 467 (isómero EE, 30 \muM) produjo un aumento rápido en la conductancia de Cl^{-} en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó ARNm de célula paratiroidea. Todos estos resultados concuerdan con una acción de NPS 467 sobre el receptor de Ca^{2+}. Sin embargo, se suprimió la respuesta de Ca^{2+} citosólico a NPS 467 cuando se suspendieron las células paratiroideas en tampón libre de Ca^{2+}. Esto sugiere que NPS 467 no puede, por sí mismo, producir la movilización de Ca^{2+} intracelular. Sin embargo, provoca respuestas en células paratiroideas y en ovocitos si está presente una cantidad pequeña de Ca^{2+} extracelular. Esto sugiere que se requiere la ocupación parcial del sitio de unión de Ca^{2+} para que NPS 467 provoque una respuesta. Para probar esta hipótesis, se suspendieron células paratiroideas en tampón libre de Ca^{2+} y se expusieron a una concentración inferior a la máxima de neomicina. Se utilizó neomicina porque imita, en casi todos los sentidos, los efectos del Ca^{2+} extracelular sobre células paratiroideas y sobre ovocitos de Xenopus que expresan el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas. La adición de neomicina 10 \muM no produjo por sí misma un aumento en [Ca^{2+}]_{i} en estas condiciones. Sin embargo, la adición posterior de NPS 467 EE (30 \muM) ahora provocó un aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i} que, puesto que no había Ca^{2+} extracelular presente, puede haber provenido de la movilización de Ca^{2+} intracelular. Cuando se expusieron las células sumergidas en un baño en tampón libre de Ca^{2+} a NPS 467 30 \muM no hubo aumento en [Ca^{2+}]_{i}. Esta concentración de NPS 467 es de máxima eficacia aumentando [Ca^{2+}]_{i} si está presente Ca^{2+} extracelular (0,5 mM). Sin embargo, la adición posterior de neomicina 10 \muM ahora provocó un aumento transitorio en [Ca^{2+}]_{i}. Presumiblemente, la neomicina se une al mismo sitio que el Ca^{2+} extracelular y puede sustituirlo funcionalmente. Utilizando una concentración inferior a la máxima, que no produce ninguna respuesta por sí misma, se logra la ocupación parcial del sitio de unión de Ca^{2+} y se permite la activación del receptor de Ca^{2+} por NPS 467.
Se realizaron estudios adicionales para definir adicionalmente el mecanismo de acción de NPS 467. Se suspendieron las células una vez más en tampón libre de Ca^{2+} para asegurar que ningún aumento observado en [Ca^{2+}]_{i} resultaba de la movilización de Ca^{2+} intracelular. En estos experimentos, sin embargo, se utilizó una concentración de máxima eficacia (100 \muM) de neomicina. En ausencia de Ca^{2+} extracelular, la neomicina 100 \muM provocó un aumento rápido y transitorio en [Ca^{2+}]_{i}. La adición posterior de NPS 467 EE 30 \muM no produjo un aumento en [Ca^{2+}]_{i}. En el experimento contrario, se añadió NPS 467 EE 30 \muM antes de neomicina 100 \muM. Tal como se esperaba, no produjo ningún aumento en [Ca^{2+}]_{i}. Sin embargo, no afectó al aumento en [Ca^{2+}]_{i} provocado por la adición posterior de neomicina 100 \muM. Estos resultados, obtenidos con concentraciones de máxima eficacia de NPS 467 y neomicina, sugieren que estos dos compuestos no actúan en el mismo sitio. En su lugar, se pueden explicar suficientemente los resultados postulando dos sitios separados en el receptor de Ca^{2+}, uno al que se une el Ca^{2+} extracelular y la neomicina, y otro al que se une NPS 467 y compuestos relacionados estructuralmente (tal como NPS 568). La unión de ligandos al primer sitio puede dar como resultado la activación plena del receptor de Ca^{2+} mientras que la unión de ligandos al último sitio solamente puede producirse y/o ser relevante funcionalmente si el sitio de unión de Ca^{2+} extracelular está ocupado en algún grado no definido todavía. Es posible que la unión de ligandos al sitio de unión de Ca^{2+} extracelular exponga un sitio de unión ocluido previamente para NPS 467. Parece que el sitio de unión de NPS 467 es un sitio alostérico que aumenta la activación del receptor en respuesta a la unión de ligandos al sitio de unión de Ca^{2+} extracelular.
Los datos demuestran que el receptor de Ca^{2+} de células paratiroideas tiene al menos dos sitios distintos para ligandos orgánicos. Un sitio se une al ligando fisiológico, Ca^{2+} extracelular, y a ciertos policationes orgánicos tales como la neomicina. La unión a este sitio da como resultado la activación plena del receptor de Ca^{2+}, un aumento en [Ca^{2+}]_{i} y la inhibición de la secreción de PTH. NPS 467 define un sitio de unión previamente no reconocido en el receptor de Ca^{2+}. La unión a este sitio solamente puede producirse y/o dar como resultado la activación plena del receptor de Ca^{2+} si el sitio de unión de Ca^{2+} extracelular está ocupado parcialmente. Los ligandos que actúan en cualquier sitio son eficaces suprimiendo los niveles de Ca^{2+} en suero in vivo.
Ejemplo 21 Preparación de NPS 467
En un matraz de fondo redondo de 250 ml, se mezclaron 10,0 g (100 mmoles) de 3'-metoxiacetofenona y 13,5 g (100 mmoles) de 3-fenilpropilamina y se trataron con 125 mmoles (35,5 g) de isopropóxido de titanio (IV). Se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de este tiempo se añadieron gota a gota 6,3 g (100 mmoles) de cianoborohidruro de sodio en 100 ml de etanol en el transcurso de 2 minutos. Se agitó la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. Después de este tiempo se transfirió la mezcla de reacción a un embudo de decantación de 2 L con 1,5 L de etil éter y 0,5 L de agua. Se equilibraron las fases y se eliminó la fase etérea. La fase acuosa restante se extrajo minuciosamente con cuatro porciones de 1 L de éter. Se combinaron los lavados, se secaron sobre carbonato de potasio anhidro y se redujeron a un aceite transparente ámbar claro.
El análisis por CCF de este material sobre sílice utilizando cloroformo-metanol-isopropilamina (100:5:1) mostró producto a Rf 0,65 con trazas de dos materiales de partida a Rf 0,99 (3'-metoxiacetofenona) y Rf 0,0 (3-fenilpropilamina).
Se cromatografió la mezcla de reacción a través de sílice (48 x 4,6 cm) utilizando un gradiente de cloroformo-metanol-isopropilamina (99:1:0,1) a (90:10:0.1) que produjo 13,66 g de NPS 467 purificado. Se disolvió este material en hexano-isopropanol (99:1) que contiene dietilamina al 0,1% para producir una disolución con una concentración de 50 mg/ml. Se realizó la resolución quiral mediante cromatografía de 4 ml de esta disolución (200 mg, máximo para lograr la separación) a través de ChiralCel OD (25 x 2 cm) utilizando isopropilamina al 0,7%, dietilamina al 0,07% en hexano a 100 ml/min, monitorizando la densidad óptica a 260 nm. En estas condiciones (con inyecciones de 100 mg de material) el isómero de elución temprana (NPS 467 EE) comenzó a salir de la columna a los 26 minutos, el isómero de elución tardía (NPS 467 LE) comenzó a salir a los 34 minutos. Se realizó la resolución de la línea base en estas condiciones. Se convirtió cada isómero óptico (base libre) en la sal de clorhidrato correspondiente disolviendo 3 g de la base libre en 100 ml de etanol y tratándolo con 100 ml de agua que contiene 10 equivalentes molares de HCl. La liofilización de esta disolución produjo un sólido blanco.
Ejemplo 22 Preparación de NPS 568
Se preparó NPS 568 utilizando los procedimientos descritos en el ejemplo 21 sustituyendo una cantidad equivalente de 3-(2-clorofenil)propilamina por 3 fenilpropilamina. Se comprobó que permitiendo que la mezcla de 3'-metoxiacetofenona, 3-(2-clorofenil)propilamina e isopropóxido de titanio (IV) se agitara durante 5 horas antes del tratamiento con NaCNH_{3}/EtOH dio como resultado un rendimiento significativamente superior (98%).
Ejemplo 23 NPS 467 disminuye el calcio ionizado en suero si se administra por vía oral
Se alimentaron ratas (macho, Sprague-Dawley, 250 a 300 g) con comida habitual para ratas y se hicieron ayunar durante la noche anterior al experimento. Se suspendió NPS 467 (isómero EE) en aceite de maíz y se administró como una dosis única oral a través de una aguja de sonda nasogástrica. Tres horas más tarde se extrajo una muestra de sangre de la vena de la cola y se sometió a ensayo para determinar los niveles de Ca^{2+} ionizado. La figura 44 muestra que NPS 467 EE produjo una reducción dependiente de la dosis en los niveles en suero de Ca^{2+} ionizado si se administraba por vía oral.
Otras formas de realización están comprendidas en las siguientes reivindicaciones.

Claims (29)

1. Compuesto que presenta la fórmula (1):
8
en el que:
Alq es un alquileno lineal o ramificado de desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
R_{1} es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono o haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituidos con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno;
R_{2} y R_{3} son grupos arilo o cicloalquilo carbocíclicos seleccionados independientemente, monocíclicos o bicíclicos, que presentan anillos de 5 ó 6 miembros opcionalmente sustituidos con de 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre alquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono, haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituidos con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno, alcoxi inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, halógeno, nitro, amino, alquilamino, amido, alquilamido inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, ciano, hidroxilo, acilo de 2 a 4 átomos de carbono, hidroxialquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, o tioalquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,
siempre que cuando R_{2} es 4-aminofenilo, R_{1} es alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono y Alq es metileno, entonces R_{3} es distinto de ciclohexilo o ciclopentilo no sustituidos;
además siempre que cuando R_{2} y R_{3} son fenilo no sustituido y Alq es -(CH_{2})_{2}-, entonces R_{1} es distinto de metilo, etilo, n-propilo o isopropilo;
además siempre que cuando R_{1} es n-propilo y R_{2} y R_{3} son fenilo no sustituido, entonces Alq es distinto de (-CH_{2}-) o (-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-);
además siempre que cuando R_{1} es etilo y R_{2} y R_{3} son fenilo no sustituido, entonces Alq es distinto de (-CH_{2}-);
además siempre que el compuesto no sea N-1-feniletil-1-fenilisopropilamina;
para su utilización en terapia.
2. Compuesto para su utilización en terapia según la reivindicación 1, en el que Alq es n-propileno.
3. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{1} es un alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono.
4. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{1} es metilo.
5. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Alq es n-propileno, R_{1} es metilo y R_{2} y R_{3} son independientemente arilo carbocíclico, monocíclico o bicíclico, que presenta anillos de 5 ó 6 miembros opcionalmente sustituidos con de 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre alquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, haloalquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono sustituido con desde 1 hasta 7 átomos de halógeno, alcoxilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, halógeno, nitro, amino, alquilamino, amido, alquilamido inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, ciano, hidroxilo, acilo de 2 a 4 átomos de carbono, hidroxialquilo inferior de desde 1 hasta 3 átomos de carbono, o tioalquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono.
6. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de entre fenilo, naftilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
7. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de entre fenilo, naftilo y ciclohexilo.
8. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} y R_{3} son fenilo independientemente.
9. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} es fenilo monosustituido.
10. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} es fenilo meta-sustituido.
11. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{3} es fenilo no sustituido o monosustituido.
12. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{3} es fenilo orto-sustituido.
13. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} está sustituido opcionalmente con halógeno, haloalquilo, preferentemente con trihalometilo, y alcoxilo, preferentemente metoxilo.
14. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{3} está sustituido opcionalmente con halógeno.
15. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es un derivado de R-fenilpropil-\alpha-fenetilamina.
16. Compuesto para su utilización en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores sin condiciones, en el que dicho compuesto produce un incremento de la concentración de Ca^{2+} libre intracelular con una CE_{50} inferior o igual a 5 \muM, utilizando un ensayo que mide la concentración de Ca^{2+} libre intracelular en células paratiroideas bovinas cargadas con fura-2.
17. Compuesto seleccionado de entre:
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9 
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10 
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11 
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12 
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13 
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14 
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15 
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16 
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17 
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18 
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19 
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20 
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21 
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18. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
19. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para modular la movilización de Ca^{2+} intracelular en tejido de hueso, riñón, epidermis, tiroides, paratiroides o placenta, incluyendo dicho tejido una o más de las células seleccionadas de entre el grupo constituido por: células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales del túbulo proximal, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios.
20. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para modular la movilización de Ca^{2+} intracelular en tejido de hueso, riñón, epidermis, tiroides o paratiroides.
21. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad caracterizada por un nivel anómalo de iones calcio, PTH, inositol trifosfato, calcitonina o diacilglicerol.
22. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que presenta una concentración anómala de Ca^{2+} extracelular o de Ca^{2+} libre intracelular en una o más de las células seleccionadas de entre el grupo constituido por: células paratiroideas, osteoclastos de hueso, células renales yuxtaglomerulares, células renales tubulares proximales, queratinocitos, células tiroideas parafoliculares y trofoblastos placentarios.
23. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hiperparatiroidismo primario o secundario.
24. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Paget.
25. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hipercalcemia asociada al cáncer.
26. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la osteoporosis.
27. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.
28. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18 para la preparación de un medicamento para reducir el nivel de PTH en la sangre.
29. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, sin condiciones, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para reducir el nivel de Ca^{2+} en la sangre.
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