JPH09281109A - カルシウムレセプター活性化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

カルシウムレセプター活性化合物のスクリーニング方法

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JPH09281109A JP8232165A JP23216596A JPH09281109A JP H09281109 A JPH09281109 A JP H09281109A JP 8232165 A JP8232165 A JP 8232165A JP 23216596 A JP23216596 A JP 23216596A JP H09281109 A JPH09281109 A JP H09281109A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 カルシウムレセプター活性化合物をスクリー
ニング方法を提供すること。 【解決手段】 機能的カルシウムレセプターを発現する
組換え細胞を用いてカルシウムレセプター活性に影響を
及ぼしうる化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ） 前記化合物を前記細胞に提供し；そして ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターの１つま
たはそれ以上の活性に影響を及ぼす能力を測定する；の
各工程を含み、前記組換え細胞は前記機能的カルシウム
レセプターを発現する外来性核酸を含むことを特徴とす
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、細胞上で細胞外
のカルシウムイオンに類似する方法で作用し得る新規な
カルシウム様（ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃ）分子の設
計、開発、組成物および利用、細胞上で細胞外カルシウ
ムイオンの活性を妨害するカルシウム拮抗分子（ｃａｌ
ｃｉｌｙｔｉｃ）、およびそれらの製造方法および同定
に関する。
【０００２】
【従来の技術】以下の記載は本発明に関する開示の要約
である。ここに記載した開示のいずれも、本発明の先行
技術であることを認めるものではなく、また具体的また
は言外に引用された刊行物は本発明の先行文献であるこ
とを認めるものではない。
【０００３】体内のある種の細胞は化学的信号に応答す
るばかりでなく、細胞外カルシウムイオン（Ｃａ2+）の
ようなイオンに対しても応答する。細胞外Ｃａ2+濃度
（以下、［Ｃａ2+］という）における変化はこれらの細
胞の機能的応答を変化させる。このような特定の細胞の
１種は上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）を分泌する上皮小体
細胞である。ＰＴＨは、血中および細胞外液中のＣａ2+
恒常性を制御する重要な内分泌因子である。ＰＴＨは、
骨および腎臓細胞に作用して、血中のＣａ2+濃度を増大
させる。［Ｃａ2+］の増大は、ついで、ＰＴＨ分泌を抑
制する負のフィードバック信号として働く。［Ｃａ2+］
およびＰＴＨ分泌の相互関係は体内のＣａ2+恒常性を維
持する重要な機構をなしている。
【０００４】細胞外Ｃａ2+は上皮小体細胞に直接作用
し、ＰＴＨ分泌を制御する。［Ｃａ2+］中の変化を感知
する上皮小体細胞表面蛋白質の存在が示唆されていた。
この蛋白質は細胞外Ｃａ2+のための受容体（「Ｃａ2+受
容体」）であり、［Ｃａ2+］の変化を感知し、機能的細
胞応答を開始させるものと考えられる。例えば、細胞外
Ｃａ2+受容体および細胞外Ｃａ2+の制御における、細胞
外Ｃａ2+および細胞機能の役割についてはネメスら、１
１セル・カルシウム３１９、１９９０に概説されてい
る：小胞周縁および上皮小体細胞中のＣａ2+受容体の役
割は、ネメスら、１１セル・カルシウム３２３、１９９
０中で討論されている。骨の破骨細胞上のＣａ2+受容体
の役割はザイジ、１０バイオサイエンス・リポート４９
３、１９９０中で討論されている。
【０００５】体内の他の細胞、具体的には、骨中の破骨
細胞、腎臓中の糸球体近接および近位小管細胞、外皮の
ケラチノサイト、甲状腺の小胞周縁細胞、胎盤中の栄養
膜細胞は、［Ｃａ2+］の変化を感知する能力を有してい
る。細胞表面Ｃａ2+受容体はこれらの細胞上にも存在
し、［Ｃａ2+］の変化に対する応答を開始または可能に
する能力をこれらの細胞にも与えている。
【０００６】上皮小体細胞、破骨細胞、小胞周縁細胞
（Ｃ−細胞）、ケラチノサイト、糸球体近接細胞および
栄養膜細胞において、［Ｃａ2+］の増大は細胞内遊離Ｃ
ａ2+濃度（「［Ｃａ2+］i」）の増大を生ぜしめる。こ
の増大は、細胞外Ｃａ2+の流入によってか、または細胞
内小管からのＣａ2+の移動によって生じ得る。［Ｃ
ａ2+］iの変化は、ｆｕｒａ−２またはｉｎｄｏ−１の
ような蛍光定量指示剤を用いて、容易に観測または定量
される（モルキュラー・プローブス、ユージーン、Ｏ
Ｒ）。［Ｃａ2+］iの測定は、Ｃａ2+受容体のアゴニス
トまたはアンタゴニストとして働く分子の能力を評価す
るための測定法を提供する。
【０００７】上皮小体細胞において、細胞外Ｃａ2+の濃
度の増大は、［Ｃａ2+］iの急速なかつ一時的な増大を
生ぜしめ、つぎに、低いがなお持続的な［Ｃａ2+］iの
増大が続く。［Ｃａ2+］iの一時的な増大は細胞内Ｃａ
2+の移動から誘導されるが、一方、低い持続的な増大は
細胞外Ｃａ2+の流入によってもたらされる。細胞内Ｃａ
2+の移動の後、イノシトール−１，４，５−三リン酸
（ＩＰ3）およびジアシルグリセロールの生成が増大
し、この２個の生化学的指示剤は種々の他の細胞中の細
胞内Ｃａ2+の受容体−依存的移動に関連している。
【０００８】Ｃａ2+に加えて、種々の他の２価および３
価のカチオン、例えば、Ｍｇ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｌａ
2+およびＧｄ2+もまた、上皮小体細胞中の細胞内Ｃａ2+
の移動を生ぜしめる。Ｍｇ2+およびＬａ2+もまたＩＰ3
の生成を増大させる；すべてのこれらの無機化学的カチ
オンはＰＴＨの分泌を抑制する。上皮小体細胞上の仮定
的Ｃａ2+受容体は、従って相手を選ばない。なぜなら、
種々の細胞外の２価または３価のカチオンを感知するか
らである。
【０００９】インビトロの細胞外Ｃａ2+に似た種々の化
合物の性質が、ネメスら、（スペルミンおよびスペルミ
ジン）「健常および疾患におけるカルシウム−結合蛋白
質」、１９８７年、アカデミック・プレス、インコーポ
レーテッド、３３−３５頁：ブラウンら、（例えば、ネ
オマイシン）１２８「エンドクリノロジー」、３０４
７、１９９１年；チャンら、（ジルチアゼムおよびその
誘導体、ＴＡ−３０９０）、５ジャーナル・オブ・ボー
ン・アンド・ミネラル・リサーチ、５８１、１９９０
年；およびザイジら、（ベラパミル）１６７バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション、８０７、１９９０年で検討されている。
【００１０】ブラウンら、６ジャーナル・ボーン・アン
ド・ミネラル・リサーチ、１１、１９９１年は、上皮小
体細胞に対するＣａ2+イオンの効果に関する現在の理論
を検討しており、下記のような、受容体様機構および受
容体−非依存的機構の両方によって、結果を説明し得る
と提案している。
【００１１】多価カチオン（例えば、２価および３価の
カチオン）は上皮小体機能に種々の作用、例えば、上皮
小体ホルモン（ＰＴＨ）分泌およびｃＡＭＰ蓄積の阻
害、イノシトールリン酸の蓄積の刺激および細胞質ゾル
（サイトゾル）の（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）カルシウム濃
度の上昇など、を及ぼす。これらの作用は「受容体様」
機構によって伝達されると考えられる。２価および３価
のカチオンによるアゴニスト−刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害
は、例えば、百日咳トキシンとプレインキュベーション
の後は阻止される。すなわち、推定的多量カチオン受容
体は、阻害的グアニンヌクレオチド制御（Ｇ）蛋白質、
Ｇiによってアデニル酸シクラーゼの阻害につながるも
のと考えられる。
【００１２】本発明者らは、最近、多価カチオン抗生物
質、ネオマイシン、が上皮小体機能の数種の性質におい
て、２価および３価のカチオンと似た作用をすることを
知った。これらの作用がこの試剤に特異的であるのか、
または多価カチオンのさらに普遍化した作用を示すのか
を知るために、塩基性の非常に高いペプチド、ポリアル
ギニンおよびポリリジンおよびプロタミンの分散雄牛上
皮小体細胞中で同じパラメーターに対する作用を試験し
た。結果は、上皮小体細胞が、種々のポリカチオンおよ
び多価カチオンに、もしかすると同様の生化学的経路を
経て応答することを示している。これらの結果を、最近
主張されている、他の系でのポリカチオンによるＧ蛋白
質の「受容体−非依存的」調節に関連して検討してい
る。
【００１３】Ｃａ2+受容体は他のＧ蛋白質−結合受容体
［例えば、糖蛋白質］に類似するものと見なされていた
が、他の細胞型についての最近の研究では、ポリカチオ
ンが他のまたは追加的機構によって細胞の機能を調整し
得る可能性が出てきた。乳房細胞において、例えば、マ
ストパラン、ハチ毒からのペプチド、４８／８０、合成
ポリカチオンおよびポリリジンを含む、種々の両親媒性
カチオンは、百日咳毒−感作機構によって分泌を増強さ
れ、Ｇ−蛋白質とのかかわりを示唆している。標準的な
細胞表面受容体にこれらの様々な試剤を伝達するものは
ない。さらに、同じこれらの化合物が、溶液中または人
工的なリン脂質小胞中で直接、精製Ｇ−蛋白質を活性化
することが知られている。これらの知見に基づいて、両
親媒性カチオンはＧ−蛋白質を活性化し、ついで、乳房
細胞分泌を「受容体−非依存的」機構によって活性化す
ると提案されている。
【００１４】ポリカチオンは、また酸性リン脂質と強く
相互反応することが示されている。種々の長さの鎖状ポ
リリジン（２０−１０００個のアミノ酸）は人工的なリ
ン脂質小胞と０．５ｎＭ〜１．５μＭの範囲の解離定数
で結合している。結合親和性は直接ポリリジン鎖の長さ
に関係し、１０００個のアミノ酸のポリマーはＫd ０．
５ｎＭであり、それより短いポリマーはより高いＫd 値
を有し、リジンは有意な程度に相互作用をしない。活性
と鎖長の相関関係は上皮小体機能に対するポリリジン
10.200、ポリリジン3800、およびリジンの効果について
観察される相関関係に類似している。
【００１５】ポリカチオンの生化学的膜への結合はそれ
らの生化学的作用をいくつか生じさせることができる。
ある種の型の細胞中に、ポリカチオンを含む種々の細孔
形成剤によって誘発された血漿膜の透過可能性が、ホス
ファチジルセリン様構造とのそれらの相互作用によって
伝達されると主張されている。さらに、両親媒性カチオ
ンによる精製Ｇ−蛋白質の「受容体−非依存的」活性化
は、これらの蛋白質がリン脂質小胞に組み込まれたとき
強化される。
【００１６】カルシウムイオンはまた、ミリモル濃度の
範囲で膜構造中に注目すべき変化を生じさせる。ある種
の場合に、カルシウムは、膜脂質とポリカチオンの相互
作用と拮抗、または増強のいずれもなし得る。これらの
考察は、上皮小体細胞上の多価のカチオンおよびポリカ
チオンの両方の作用が、標準的な細胞表面Ｇ−蛋白質−
結合受容体を必要としない受容体−非依存的機構を含む
可能性を提起するものである。しかしながら、このまた
は他の型の細胞によるＣａ2+感作についての分子的原理
を解明するにはさらなる研究が要求されている［引用文
献省略］。
【００１７】ショーバックおよびチャン（６（補追１）
ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサー
チ、１９９１年、Ｓ１３５）およびラッケら、（６（補
追１）ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・
リサーチ、１９９１年、Ｓ１１８）はＣａ2+受容体また
はＣａ2+センサーが上皮小体細胞中に存在することを示
す言うべき実験を開示している。このような細胞から分
離されたメッセンジャーＲＮＡは、卵母細胞中に発現さ
れ得、卵母細胞にＣａ2+受容体蛋白質の存在によって説
明され得る表現型を与えさせ得る。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、Ｃ
ａ2+受容体蛋白質が、体内のＣａ2+代謝に関与するある
特殊化した細胞を、細胞外Ｃａ2+の濃度の変化を感知さ
せ、応答され得ることを示した。これらの受容体はある
一般的な特徴を有しながら、選択的に種々の薬理学的試
剤によって影響され得る。下記に詳細に説明するよう
に、ある種の分子が上皮小体細胞、破骨細胞およびＣ−
細胞のＣａ2+受容体に選択的作用をもつことが確認され
た。
【００１９】Ｃａ2+受容体は、細胞外Ｃａ2+の作用に、
類似する（「カルシウム様物質（ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔ
ｉｃｓ）」）か、または拮抗する（「カルシウム拮抗物
質（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃｓ）」）新規な種類の分子の
ための別個の分子標的を構成する。この受容体は細胞表
面に存在し、細胞外Ｃａ2+に対して低い親和性を有する
（みかけのＫｄは、一般に約０．５ｍＭより大であ
る）。この受容体は、クーパー、ブルームおよびロス、
バイオロジカル・ベイシス・オブ・ニューロファーマコ
ロジー、第４章によって定義された、遊離また結合エフ
ェクター機構を含み得る。すなわち、この受容体は、細
胞内Ｃａ2+受容体、例えば、カルモデュリンおよびトロ
ポニン類とは異なる。カルシウム様物質とは、例えば、
Ｃａ2+受容体に選択的に作用し、上皮小体細胞または破
骨細胞の機能を直接的または間接的に抑制し、Ｃ−細胞
の機能を刺激するものである。本発明のカルシウム様物
質およびカルシウム拮抗物質は、上皮小体亢進症、骨粗
しょう症および他のＣａ2+関連疾患の新しい治療を可能
にするものである。この治療は、［Ｃａ2+］の変化を感
知し、応答するこれら３種および他の種類の細胞のそれ
ぞれのＣａ2+受容体を標的にするものである。
【００２０】本発明は、上皮小体細胞中のＣａ2+受容体
蛋白質を最初に示したものであり、Ｃ−細胞および破骨
細胞などの他の細胞中のＣａ2+受容体とを薬理学的に最
初に差別化したものである。本発明はまた、これらのＣ
ａ2+受容体に効果を有する分子を、同定可能にし、Ｃａ
2+に活性である有効なカルシウム様物質またはカルシウ
ム拮抗物質の発見、開発、設計、修飾および／または構
築における主導的分子として用い得る方法を開示する最
初のものである。このカルシウム様物質およびカルシウ
ム拮抗物質は、例えば、ホルモン、酵素または成長因子
などのポリペプチド、１種またはそれ以上のＣａ2+受容
体に活性であることによって制御されまたは影響され
る、それらの出現および／または放出などの１種または
それ以上の成分の正常でない濃度を特徴とする種々の疾
病状態の処置に有効である。さらに、種々の型の細胞に
おける種々のＣａ2+受容体の同定および種々の主導的分
子に対する特定受容体に対する特定の応答は、当該Ｃａ
2+受容体における作用によって、影響される特定の疾患
の処置に活性な特定分子の設計および構築を可能にする
ものである。例えば上皮小体ホルモン分泌の異常度は、
他のＣａ2+制御ホルモンなどの分泌の程度に影響を与え
ることなく、この特定分子によって影響され得る。
【００２１】この主導的分子の同定は、活性分子の発見
のための効率の高いスクリーニング法、および有効な薬
剤候補を設計するための組織的なデータベースを、先行
技術が欠いていたため妨げられていた。これらの障害は
上皮小体細胞Ｃａ2+受容体および機能的関連受容体をク
ローニングすることによって、また、今や、このように
クローニングされたＣａ2+受容体および機能的関連受容
体を活性化するある主導的分子の構造的特徴を組織的に
試験することによって取り除かれた。Ｃａ2+受容体のク
ローニングはまた、天然生成物または分子ライブラリー
および合成分子の高効率スクリーニングに適当な形質転
換セルラインの開発を可能にする。これは、下記に論じ
る構造的−活性研究とともに、新規なカルシウム様物質
およびカルシウム拮抗物質を開発するのに必要な技術を
提供するものである。
【００２２】本発明はこのような操作を可能にするもの
である。例えば、ひと上皮小体細胞Ｃａ2+受容体ｃＤＮ
Ａは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞
における機能的発現についてスクリーニングすることに
よってクローン化され得、またＣａ2+受容体に活性にお
ける活性に必要な有機分子の構造的特徴は選択された天
然生成物または他の分子ライブラリーの試験およびその
後の構造的活性試験によって決定される。
【００２３】すなわち、第一の態様は、本発明は細胞中
の［Ｃａ2+］iの増大を生じさせることによって、細胞
外Ｃａ2+の活性に類似するか、または細胞外Ｃａ2+によ
って誘発される［Ｃａ2+］iの増大を妨害するかのいず
れかである分子を含む医薬的組成物を特徴とする。分子
は５μｍより小さいか、それに等しいＥＤ50を有し、プ
ロタミンではない。
【００２４】「類似する」とは、分子が、細胞外Ｃａ2+
応答可能細胞に対して、細胞外Ｃａ2+の１種またはそれ
以上の特定の作用を有することをいう。この述語は、細
胞外Ｃａ2+の生物学的機能のすべてが類似していること
を要求するものではなく、このような機能の少なくとも
１種が類似していればよい。さらに、分子が細胞外Ｃａ
2+受容体が結合している受容体の同じ部位に結合する必
要もない（例えば、下記の実施例２０中の新規化合物Ｎ
ＰＳ４６７およびその作用参照）。「妨害する」とは、
Ｃａ2+のこのような作用の１種が分子によって減じる
か、または妨げられることをいう。ＥＤ50は下記の試験
法によって測定され、その際、類似作用が測定され、最
大類似効果の半分だけ類似している分子の濃度がＥＤ50
である。逆に、カルシウム拮抗物質のＩＣ50は最大活性
の半分だけ妨害する量である。好ましくは、この試験は
［Ｃａ2+］i増大を測定し、下記の方法によって、Ｃａ
2+受容体に特異的であること、すなわち、それらの均等
物であることを確認するものである。
【００２５】好ましい具体例において、ここに記載の生
物検定法は、細胞中の［Ｃａ2+］iの増大が一時的であ
り、１分より短い時間持続し、［Ｃａ2+］iの増大が急
速であり、３０秒以内に発生し；分子がまた、（ａ）
［Ｃａ2+］iの持続的な増大（３０秒より長く）を生じ
させ、（ｂ）イノシトール−１，４，５−三リン酸およ
び／またはジアシルグリセロール濃度の増大を、例え
ば、６０秒内に、生じさせ、（ｃ）ドーパミン−または
イソプレテレノール−刺激サイクリックＡＭＰ形成を阻
害する。さらに、［Ｃａ2+］iの一時的な増大は、１０
分間、１０ｍＭフッ化ナトリウムで細胞を前処理するこ
とによって阻止されるか、または一時的な増大は、プロ
テインキナーゼＣ、例えばホルボル・ミリスタート・ア
セタート（ＰＭＡ）、メゼレインまたは（−）インドラ
クタムＶなどの活性化剤で簡単な前処理（１０分間より
短い）によって減少させることができる。
【００２６】上皮小体細胞において、上記の試験法のす
べてにおいて、活性である分子は、特に本発明において
有効である。それらの分子の作用が当該細胞のＣａ2+受
容体に対して特異的であるからである。これは、特に上
記のＰＭＡ前処理については真実である。
【００２７】さらに、好ましい具体例において、細胞が
上皮小体細胞であり、分子が細胞からの上皮小体ホルモ
ン分泌を阻害するものである；分子は上皮小体細胞、骨
破骨細胞、糸球体近接腎臓細胞、近位小管腎臓細胞、ケ
ラチノサイト、小胞周辺甲状腺または胎盤中の栄養膜細
胞からのｍＲＮＡで注入されたアフリカツメガエル卵母
細胞中のＣｌ- コンダクタンスの増大を誘発する。
【００２８】別の好ましい具体例において、分子が細胞
内Ｃａ2+の移動を生じさせ、［Ｃａ2+］iの増大を起こ
させる；細胞がＣ−細胞または破骨細胞であり、分子は
インビボでの骨吸収を阻害する；細胞が破骨細胞であ
り、分子がインビトロで骨吸収を阻害する；または細胞
がＣ−細胞であり、インビトロまたはインビボでのカル
シトニン分泌を刺激する；最も好ましくは、分子が、Ｃ
ａ2+受容体の５μＭ以下、さらに好ましくは１μＭでの
ＥＣ50またはＩＣ50が１００ｎモル、１０ｎモルまたは
１ｎモル以上である。このような低いＥＣ50またはＩＣ
50は、治療または診断のためにインビボまたはインビト
ロで用いられる分子がより低い濃度であることを可能に
するから有利である。このような低いＥＣ50およびＩＣ
50の分子の発見は同じく強力かつ効果的な分子の設計お
よび合成を可能にする。
【００２９】「カルシウム様」分子とは、細胞外Ｃａ2+
の１種またはそれ以上の活性を有し、好ましくは、Ｃａ
2+受容体におけるＣａ2+の活性に類似していることをい
う。例えば、上皮小体細胞に関して用いられる場合は、
上皮小体細胞で試験したとき、インビトロで、当業者に
周知の技術によって測定された下記の１種またはそれ以
上、好ましくは全ての特徴を有している分子である。
【００３０】１．分子が、１μＭのＬａ3+またはＧｄ3+
による阻害に対して無反応性である［Ｃａ2+］iにおい
て急速（ピークまでの時間＜５秒）かつ一時的な増大を
生じさせる。［Ｃａ2+］iの増大は細胞外Ｃａ2+の不存
在下で持続するが、（細胞外Ｃａ2+の不存在下）イオノ
マイシンでの前処理によって阻止される： ２．細胞外Ｃａ2+によって誘発される［Ｃａ2+］iの増
大は、ジヒドロピリジン類によって阻害されない。
【００３１】３．分子によって生じる［Ｃａ2+］iの増
大は１０分間、フッ化ナトリウム１０μＭでの前処理に
よって阻止される： ４．分子によって生じる［Ｃａ2+］iの一時的な増大
は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤、例え
ばホルボル・ミリスタート・アセタート（ＰＭＡ）、メ
ゼレインまたは（−）インドラクタムＶなどでの前処理
によって減少させることができる。
【００３２】プロテイン・キナーゼＣ活性化剤の総体的
効果は、最大応答に影響を与えることなく、分子の濃度
−応答曲線を右にずらすことである： ５．分子は、イノシトール−１，４，５−三リン酸およ
び／またはジアシリルグリセロールの生成の急速な（＜
５秒）増大を生ぜしめる： ６．分子は、ドーパミン−またはイソプロテレノール−
刺激サイクリックＡＭＰ形成を阻害する： ７．分子は、ＰＴＨ分泌を阻害する： ８．百日咳トキシン（１００ｎｇ／ｍｌ、＞４時間）で
の前処理は、サイクリックＡＭＰ形成における分子の阻
害効果を妨害するが、［Ｃａ2+］i、イノシトール−
１，４，５−三リン酸またはジアシリルグリセロールの
増大およびＰＴＨ分泌の減少に影響を与えない： ９．分子は、雄牛またはひと上皮小体細胞からのポリ
（Ａ）+ に富むｍＲＮＡで注入されたアフリカツメガエ
ル卵母細胞中のＣｌ- コンダクタンスの増大を誘発する
が、水またはラット脳または肝臓ｍＲＮＡで注入された
アフリカツメガエル卵母細胞では影響を与えない： １０．同様に、上皮小体細胞からのクローン化受容体を
用いて、受容体をコード化する特定のｃＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡ分子で導入されたアフリカツメガエル卵母細胞の
応答を誘発する。
【００３３】「カルシウム拮抗」分子とは、好ましく
は、Ｃａ2+受容体に拮抗剤として作用することによっ
て、細胞外Ｃａ2+−感作細胞の細胞外Ｃａ2+の１種また
はそれ以上の活性を妨害することを意味する。例えば、
上皮小体細胞に関して用いる場合、インビトロで上皮小
体細胞を試験した場合、分子は当業者に周知の技術で測
定された下記の特徴の１種またはそれ以上、好ましくは
すべてを有する： １．分子は、部分的または完全のいずれかで、増大した
細胞外Ｃａ2+濃度の能力を下記のものを妨げる： ａ）［Ｃａ2+］の増大、 ｂ）細胞内Ｃａ2+の移動、 ｃ）イノシトール−１，４，５−三リン酸の生成の増
大、 ｄ）ドーパミン−またはイソプロテレノール−刺激サイ
クリックＡＭＰ形成の減少、 ｅ）ＰＴＨ分泌の阻害： ２．低［Ｃａ2+］iで、すなわち、０．５ｍＭで、分
子、それ自体は［Ｃａ2+］iを変化させない： ３．分子は、細胞外Ｃａ2+またはカルシウム拮抗化合物
によって誘発される、雄牛またはひと上皮小体細胞から
のポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡで導入されたアフリカツメガ
エル卵母細胞中のＣｌ- コンダクタンスの増大を妨げる
が、水またはラット脳または肝臓ｍＲＮＡで導入された
アフリカツメガエル卵母細胞では妨げない： ４．同様に、上皮小体細胞からのクローン化受容体を用
いて、Ｃａ2+受容体をコード化する特定のｃＤＮＡまた
はｍＲＮＡ分子で導入されたアフリカツメガエル卵母細
胞の応答を妨げる。
【００３４】他の型の細胞のＣａ2+受容体における有効
なカルシウム様物質およびカルシウム拮抗物質の平行的
定義は、下記の実施例から明白である。
【００３５】Ｃａ2+受容体はある種の無機ポリカチオン
およびポリカチオン有機分子を感知し、応答し得る。例
えば、上皮小体細胞は、これらの有機ポリカチオンの添
加と細胞外Ｃａ2+濃度の増大を区別することができな
い。おそらく、これらの有機分子がＣａ2+受容体に細胞
外Ｃａ2+のように作用するからである。本発明のカルシ
ウム様物質は、Ｃａ2+受容体の特別良好なアゴニストで
あり、選択された細胞の機能、例えば、上皮小体細胞か
らのＰＴＨの分泌を変化させる薬剤として用いることが
できる。Ｃａ2+とは異なり、これらの分子の多くは、す
べてではないが、１種またはそれ以上のＣａ2+受容体に
作用し、すなわち、具体的に１種のＣａ2+受容体を標的
とする能力を有する。
【００３６】これらの分子は、例えば上皮小体亢進症、
骨粗しょう症、バジット病、高血圧、腎臓病および癌な
ど、［Ｃａ2+］iおよびＣａ2+が役割を担う種々の疾患
の処置に有効なさらに新規な治療の開発のための主導的
構造を有する。
【００３７】カルシウム様物質およびカルシウム拮抗物
質は、患者に投与することによって、患者の細胞外遊離
Ｃａ2+の濃度を制御し、上述の群から選択される細胞に
対する細胞外Ｃａ2+効果に似せるのに有効であるような
医薬組成物として処方され得る。本発明前に、Ｃａ2+受
容体の操作または制御における異常によって生じる疾患
または正常なＣａ2+受容体を有するが当該Ｃａ2+受容体
を活性化または不活性化することによって処置され得な
い動物の疾患の処置に有効である。Ｃａ2+受容体に作用
するこのような分子は知られていなかった。
【００３８】さらに、他の好ましい具体例において、上
皮小体細胞、骨の破骨細胞、糸球体近接腎臓細胞、近位
小管腎臓細胞、ケラチノサイト、小胞周縁細胞（Ｃ−細
胞）、および胎盤栄養膜細胞からなる群から選ばれる、
すべてではないが、１種またはそれ以上の細胞に、５μ
Ｍ以下のＥＤ50を有する。
【００３９】本発明で特に有用である分子の作用の明確
化は、特定のインビトロまたはインビボの治療および診
断および別のカルシウム様物質またはカルシウム拮抗物
質の発見を可能にする。
【００４０】好ましい具体例において、この分子は、生
理学的ｐＨが陽性に荷電しており、分枝状または環状ポ
リアミン、陽性荷電ポリアミノ酸およびアリールアルキ
ルアミンからなる群から選ばれる。例えば、分枝状ポリ
アミンは、式：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−（ＮＲi−（Ｃ
Ｈ2）j）k−ＮＨ2（式中、ｋは１〜１０の整数であり、
各ｊは、同一または異なって、２〜１０の整数であり、
各Ｒiは、同一または異なって、水素および−（ＣＨ2）
j−ＮＨ2からなる群から選ばれ、ただし、ｊは上記の意
味であり、少なくとも１個のＲiは水素でない）を有す
る。
【００４１】別の具体例において、分子は、式
【化３】 ［式中、Ｘはそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ3Ｏ、
ＣＨ3ＣＨ2Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ3、ＣＨＦ2、ＣＨ
2Ｆ、ＣＦ3Ｏ、ＣＨ2Ｓ、ＯＨ、ＣＨ2ＯＨ、ＣＯＮ
Ｈ2、ＣＮ、ＮＯ2およびＣＨ3ＣＨ2からなる群から選択
され；Ａｒは疎水性物質であり；Ｒはそれぞれ独立して
水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチ
ル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シ
クロヘプチル、シクロオクチル、インデニル、インダニ
ル、ジヒドロインドリル、チオジヒドロインドリル、２
−、３−または４−ピペリジ（ニ）ルからなる群から選
択され；ＹはＣＨ、窒素および不飽和炭素からなる群か
ら選択され：Ｚは酸素、窒素、硫黄、
【化４】 （式中、ｎはそれぞれ独立して１から４まで、およびｍ
はそれぞれ独立して０から５までである）からなる群か
ら選択される）で示される。最も好ましくは、分子は、
カルシウム様またはカルシウム拮抗物質のいずれかであ
る。
【００４２】好ましい具体例において、疎水性物質は、
フェニル、２−、３−または４−ピリジル、１−または
２−ナフチル、１−または２−キノリニル、２−または
３−インドリル、ベンジルおよびフェノキシからなる群
から選択される；分子は、Ｒ−ジフェニルプロピル−α
−フェネチルアミン誘導体、および分子が、式：
【化５】 （Ｘは、好ましくは、それぞれ独立してＣｌ、Ｆ、ＣＦ
3、ＣＨ3およびＣＨ3Ｏからなる群から選択される）で
ある。
【００４３】本発明の好ましい態様において、式：
【化６】 ［式中、ａｌｋは、１から６個の炭素原子からなる直鎖
または分枝鎖アルキレンであり；Ｒ1は、１から３個の
炭素原子からなる低級アルキルまたは１から７個のハロ
ゲン原子で置換された１から３個の炭素原子からなる低
級ハロアルキルであり；Ｒ2およびＲ3は、独立して炭素
環状アリールまたはシクロアルキル基から選択され、単
環または二環のいずれかであり、所望により、独立し
て、１から３個の炭素原子からなる低級アルキル、１か
ら７個のハロゲン原子で置換された１から３個の炭素原
子からなる低級ハロアルキル、１から３個の炭素原子か
らなる低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ア
ルキルアミノ、アミド、１から３個の炭素原子からなる
低級アルキルアミド、シアノ、ヒドロキシ、２から４個
の炭素原子からなるアシル、１から３個の炭素原子から
なる低級ヒドロキシアルキルまたは１から３個の炭素原
子からなる低級チオアルキルから選択される、１から５
個の置換基で置換されていてもよい５−または６−員環
である］で示される新規フェニル−α−フェネチルアミ
ン同族体および誘導体を提供する。好ましい炭素環状ア
リール基は、１個または２個の環をもち、少なくともそ
のうちの１つが芳香族特性をもち、フェニルのような炭
素環状アリール基およびナフチルのような２環式炭素環
状アリール基を含む。上記の式から明らかなように、そ
こに含まれる化合物は、ラセミ体混合物としておよび種
々の立体異性体として存在し得る。特に好ましいのはＲ
−フェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体であ
り、それは血清中イオン化カルシウム低下の促進活性を
示すと信じられている。
【００４４】好ましい化合物はａｌｋがｎ−プロピレン
であるものを含む。Ｒ1がメチルである化合物もまた好
ましい。Ｒ2およびＲ3が所望により置換されていてもよ
いフェニルである化合物もまた好ましい。
【００４５】特に好ましい化合物は、Ｒ2が一置換、さ
らに好ましくはメタ−置換フェニルであるものを含む。
特に好ましいＲ3基は、非置換または一置換、好ましく
はオルト−置換フェニルを含む。Ｒ2の好ましい置換基
は、ハロゲン、ハロアルキル、好ましくはトリハロメチ
ルおよびアルコキシ、好ましくはメトキシを含む。Ｒ3
の好ましい置換基はハロゲンを含む。
【００４６】２番目に関連のある態様において、本発明
は、１種またはそれ以上の細胞または血液中または血漿
中または細胞外体液中の正常でない［Ｃａ2+］または
［Ｃａ2+］iにより特徴付けられる疾患または症状であ
る患者を処置するための方法を特徴とする。この方法
は、患者に治療的有効量の、細胞内の［Ｃａ2+］iの上
昇により生起される細胞外Ｃａ2+の活性に類似するか、
または細胞外Ｃａ2+により誘導される［Ｃａ2+］iの増
加を妨害するのいずれかである１種またはそれ以上の分
子を投与する工程を含む。
【００４７】「正常でない」とは、患者が一般の集団と
比較して異なったＣａ2+代謝産物をもち、それは血中ま
たは細胞外体液中の１種またはそれ以上の蛋白質（例え
ばホルモン類）、または細胞外および／または細胞内Ｃ
ａ2+の濃度に影響を及ぼす他の分子により影響を受けて
いる。すなわち、本疾患は、上皮小体機能亢進症、骨粗
鬆症およびミネラル関連疾患等（例えば、“ハリソンズ
・プリンシパルズ・オブ・インターナル・メディシン”
のような標準的医学書に記載）を含む。このような疾患
は、本発明において、１個またはそれ以上のＣａ2+の効
果に類似するまたは妨害し、それによって、直接または
間接的に患者の体内の蛋白質または他の分子の濃度に影
響を与える分子により処置される。
【００４８】「治療的有効量」とは、患者の疾患または
症状の１種またはそれ以上の症状をある程度まで軽減す
る量を意味する。さらに、「治療的有効量」とは、疾患
または状態に関連するまたは原因となる生理学的または
生化学的パラメーターを、部分的または完全に正常に戻
す量を意味する。一般に、分子の約１ｎｍｏｌから１μ
ｍｏｌの間の量であり、そのＥＣ50および患者の年齢、
体重および疾患に依存する。
【００４９】好ましい具体例において、分子は５μＭよ
り小さいか、それに等しいＥＣ50を有し、プロタミンで
はなく；最も好ましくは、Ｃａ2+受容体にカルシウム様
またはカルシウム拮抗物質として相互作用する。最も好
ましくは、分子は上記の１つから選択される。
【００５０】他の好ましい具体例において、患者は、１
個またはそれ以上の成分の異常な濃度を特徴とする疾患
に罹患し、その濃度は１個またはそれ以上のＣａ2+受容
体の活性により制御されまたは影響を受け、分子は上皮
小体細胞、骨中の破骨細胞、腎臓中の糸球体近接細胞、
腎臓中の近位小管細胞、ケラチノサイト、甲状腺の小胞
周縁細胞および胎盤中の栄養膜からなる群から選択され
た細胞のＣａ2+受容体に活性である。
【００５１】更に他の好ましい具体例において、分子
は、患者の血漿中の上皮小体ホルモンの濃度を、例えば
正常の個人で見られる濃度までか、または血漿Ｃａ2+の
減少の原因となるのに充分な程度まで減少させ；この分
子は患者に治療的に適当な効果をもつのに十分な程度ま
で提供される。
【００５２】第３の態様において、本発明は、患者の１
個またはそれ以上のＣａ2+受容体の数および／または位
置（および／または機能的完全性）の同定、およびその
疾患または症状としての指数数および／または位置（お
よび／または機能的完全性）と健常者で観察されるもの
との比較による患者の疾患または病気の診断の方法を特
徴とする。
【００５３】好ましい具体例において、本方法は、Ｃａ
2+受容体に対する抗体をＣａ2+受容体の数および／また
は位置および／または機能的完全性を測定するのに使用
する免疫測定法であり、または測定法は、Ｃａ2+受容体
に結合する標識カルシウム様またはカルシウム拮抗分子
の提供を含み；診断される疾患は癌、例えば上皮小体異
所性癌、または骨の破骨細胞中の数が上記の正常レベル
であることまたは骨の破骨細胞での活性の程度の増大を
特徴とする症状である。
【００５４】第４の態様において、本発明は、治療的分
子として有用な分子を同定するための方法を特徴とす
る。本方法は、細胞内で細胞外Ｃａ2+の活性に類似した
能力をもつか、または細胞外Ｃａ2+により誘導される
［Ｃａ2+］iの増加を妨害する能力のいずれかに潜在的
に有効な分子のスクリーニング、および分子が５μＭよ
り小さいかそれに等しいＥＣ50またはＩＣ50を有するか
否かの測定を含む。
【００５５】他の態様において、本発明は組み換えＣａ
2+受容体、組み換えＣａ2+受容体を含む細胞、Ｃａ2+受
容体をコード化する精製核酸、生物学的活性および分子
ＮＰＳ０１９の使用、ＮＰＳ４５９、ＮＰＳ４６７、Ｎ
ＰＳ５５１およびＮＰＳ５６８（図４４−６３参照）を
材料とする新規化合物または組成物および、例えば組み
換えＣａ2+受容体の使用による、最初のＣａ2+受容体で
あるが２番目ではない受容体でＣａ2+の１個またはそれ
以上の活性に類似または妨害する分子を同定することに
よる有用なカルシウム様またはカルシウム拮抗分子の同
定方法を特徴とする。
【００５６】「組み換え体」とは、組み換えＤＮＡ技術
により製造される、天然に存在するＣａ2+受容体からそ
の位置、純度または構造のいずれかにより区別されるよ
うな任意のＣａ2+受容体を含むという意味である。一般
に、このような受容体は通常天然に観察されるのと異な
った量で細胞に存在する。
【００５７】「精製」とは、抗体または核酸が天然に存
在する抗体または核酸と区別され、天然に見い出される
抗体または核酸から分離され、例えばベクター系におい
て、組み換えＣａ2+受容体発現に使用されることを意味
する。好ましくは、抗体または核酸は標準技術により均
質調製物として提供される。
【００５８】このようなクローン化受容体は、所望の細
胞中で発現され得、構造決定のために単離され結晶化さ
れ得る。このような構造は、Ｃａ2+受容体に結合できる
本発明の有用な分子の設計を可能にする。さらに、この
ような受容体の同等物が、他の細胞、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム性ライブラリーのクローンのために、最初のクロー
ンをブローブとして使用してクローン化され得る。
【００５９】クローン化受容体のための抗体は単離で
き、本発明の治療剤として、またはＣａ2+−関連疾病ま
たは症状の診断のためのＣａ2+受容体の数および／また
は位置および／または機能的完全性を測定するための診
断用手段として使用できる。このような抗体はカルシウ
ム様またはカルシウム拮抗物質として静脈内投与するこ
とによりまたイン・ビボで使用できる。
【００６０】すなわち、一般に、本発明は、上皮小体細
胞、骨中の破骨細胞、腎臓中の糸球体近接細胞、腎臓中
の近位小管細胞、ケラチノサイト、甲状腺の小胞周縁細
胞および胎盤中の栄養膜細胞からなる群から選択され
た、全てではないが１個またはそれ以上の細胞のＣａ2+
受容体において選択的アゴニストまたはアンタゴニスト
のいずれかとして作用することができるカルシウム様ま
たはカルシウム拮抗物質を特徴とする。このような組成
物は、医薬組成物を提供するために当分野の技術者に公
知の任意の薬理学的に許容可能な担体を含み得る。
【００６１】本発明は、また、疾病状体の治療法とし
て、標準技術、例えばアンチセンスおよび関連技術（例
えば、リボザイム類）による患者のＣａ2+受容体の数の
調整を特徴とする。
【００６２】本発明は、以下に明らかにするように、カ
ルシウム様物質及び／又はカルシウム拮抗物質を検出す
る検出法を用いてＣａ2+レセプターの活性に影響を及ぼ
す分子を確認する方法を提供する。さらに検出法又は抗
体又は以下に記載される他の技術の使用により転写又は
翻訳レベルでＣａ2+レセプターの発現を減少又は増加す
るのに効果があると見られる分子を治療用途用に定義で
きる。
【００６３】本発明の他の特徴及び利点は、その好まし
い実施態様の以下の記載から及び請求の範囲から明らか
であろう。
【００６４】
【発明の実施の形態】カルシウム様及びカルシウム拮抗分子 本発明の有用なカルシウム様及びカルシウム拮抗分子は
一般的に上記される。これらの分子は、Ｃａ2+レセプタ
ーでのＣａ2+の活性を模倣し又は拮抗する分子を明らか
にするスクリーニング方法を用い容易に確認できる。そ
のような方法の例を、以下に提供する。これらの例は本
発明を限定するものではなく、単に当業者により容易に
用いられ、又は適用される方法を示すものである。
【００６５】一般にカルシウム様及びカルシウム拮抗分
子は、以下に記載されたもの（導出分子と呼ばれる）に
ならって修飾される分子をスクリーニングすることによ
り確認される。以下に見ることができるように、種々の
Ｃａ2+レセプターに有用な幾つかの特異的カルシウム様
物質及びカルシウム拮抗物質がある。誘導分子は標準的
方法により容易に計画され、当業者に知られた多くのプ
ロトコールの一つで試験する。多くの分子を、本発明に
最も有用なものを確定するために容易にスクリーンしう
る。
【００６６】他の系でＣａ2+の作用を模倣し又は拮抗す
る有機カチオン分子はＣａ2+レセプターへの活性につい
ての必要な構造を含む。他の有用な分子の理論的設計
は、カルシウム様又はカルシウム拮抗であることが知ら
れた分子の研究及びその既知分子の構造を修飾すること
を含む。例えばポリアミンは、スペルミンが幾つかのイ
ンビトロ系でＣａ2+の活用を模倣するので、潜在的にカ
ルシウム様である。結果はスペルミンが実際細胞外二及
び三価カチオンにより惹起されたものを連想させる［Ｃ
ａ2+］及びＰＴＨ分泌に変化を起こすことを示す（以下
参照）。以下に概略述べる実験は、従って、スペルミン
により得られたこの現象学が細胞外Ｃａ2+により用いら
れる同じ機構を含むことを示すことを目ざしている。こ
れを行うため、Ｃａ2+レセプターの活性化を特徴づける
種々の生理的及び生化学的パラメーターへのスペルミン
の影響を評価した。同様の効果を有するこれらの分子
は、本発明に有効であり、スペルミンと同様の構造を有
する分子を選択又は製造することによって発現できる。
一度、他の有用な分子が発見されると、本選択方法は容
易に繰り返すことができる。
【００６７】明瞭さのゆえに、以下に上皮小体細胞Ｃａ
2+レセプターに活性であるか、又は［Ｃａ2+］の変化に
対する細胞応答のアゴニスト又は拮抗体として作用する
有用な分子を確認するための特別な一連のスクリーニン
グプロトコールを提供する。同等の検定を、他のＣａ2+
レセプターに活性な、そうでないにせよ［Ｃａ2+］によ
り調節される細胞機能を模倣し又は拮抗する、分子につ
いて用いることができる。これらの検定は、本発明のカ
ルシウム状分子を見出すのに有用である方法の例とな
る。同等の方法は、細胞外Ｃａ2+の作用に最も拮抗する
分子をスクリーニングすることによりカルシウム拮抗分
子を見出すのに用いることができる。インビトロ検定
を、標準的技術によりこれらのカルシウム様物質及びカ
ルシウム拮抗物質の選択性、可飽和性（ｓａｔｕｒａｂ
ｉｌｉｔｙ）及び可逆性を特徴づけるのに用いることが
できる。
【００６８】スクリーニング方法 一般にフラ−２を与えた上皮小体細胞は０．５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2を含む緩衝液にまず懸濁する。試験物質をキュ
ベットに少量（５−１５μｌ）加え、蛍光シグナルの如
何なる変化にも注意する。試験物質の濃度の累積増加
を、いくらかの予め定めた濃度に達するか、又は蛍光の
変化が見られるまで、キュベット中で行う。蛍光の変化
が見られなければ、分子は不活性と考えられ、さらに試
験は行わない。例えばポリアミン型分子による最初の研
究では、分子は５又は１０ｍＭの高い濃度で試験した。
より有効な分子が今や知られているので（以下参照）、
天井濃度を低くする。例えば、新しい分子は５００μＭ
までの濃度又はそれ以下で試験する。この濃度で蛍光に
変化が認められなければ、その分子は不活性と考えるこ
とができる。
【００６９】［Ｃａ2+］に増加を生ずる分子は付加的試
験に付す。カルシウム様分子としてその考察に重要な分
子の二つの本質的特徴は、細胞内Ｃａ2+の可動化とＰＫ
Ｃアクチベーターへの感受性である。ＰＭＡ−感性方法
で細胞内Ｃａ2+の可動化を起こしている分子がカルシウ
ム様分子であること、そしてＰＴＨ分泌を阻害すること
を常に見出した。必要なら、付加的試験を、この考えを
強固にするために実施した。典型的には、カルシウム様
又はカルシウム拮抗活性（上記参照）についての全ての
種々の試験は行わない。むしろ、分子がＰＭＡ−感性方
法で細胞内Ｃａ2+の可動化を起こしたならば、それはヒ
ト上皮小体細胞でのスクリーニングに昇格する。例えば
［Ｃａ2+］iの測定は、ＥＣ50を決定するために、又、
一次又は二次上皮小体亢進に対し外科手術を受けている
患者から得たヒト上皮小体細胞でのＰＴＨ分泌を阻止す
る分子の能力を測定するために行う。ＥＣ50又はＩＣ50
が低ければ低いほど、カルシウム様物質又はカルシウム
拮抗物質としての分子はより有効である。
【００７０】フラ−２による［Ｃａ2+］の測定は、活性
について新しい有機分子をスクリーニングする非常に速
やかな方法を提供する。単一の午後に、１０−１５分子
を試験し、それらの細胞内Ｃａ2+を可動化する（又はし
ない）能力を評価することができる。ＰＭＡによる減少
に対する［Ｃａ2+］iの観察された如何なる増加の感受
性も評価できる。さらに、単一細胞調製品は［Ｃａ2+］
i、サイクリックＡＭＰレベル、ＩＰ及びＰＴＨ分泌に
ついてデータを提供できる。典型的な方法は、細胞にフ
ラ−２を与え、次いで細胞懸濁液を二つに分けることで
ある。ほとんどの細胞は［Ｃａ2+］iを測定するのに用
いられ、残りは分子とインキュベートしてサイクリック
ＡＭＰ及びＰＴＨ分泌に関するそれらの影響を評価す
る。サイクリックＡＭＰ及びＰＴＨについての放射免疫
検定の感受性の理由で、両変数は、０．３ｍｌ細胞懸濁
液（約５００，０００細胞）を含む単一インキュベーシ
ョン管で測定できる。イノシトールリン酸エステルの測
定は、スクリーニングの時間つぶしの局面である。しか
しながら、塩化物（どちらかといえばギ酸塩）で溶出さ
れるイオン交換カラムは、（約３０時間を要する）回転
減圧蒸発を必要としないので、ＩＰ3形式をスクリーニ
ングする非常に迅速な方法を提供する。この方法は単一
の午後にほぼ１００試料の手続きを可能にする。［Ｃａ
2+］i、サイクリックＡＭＰ、ＩＰ3及びＰＴＨの測定に
より評価されるように興味を起こさせるこれらの分子
は、次いで種々のイノシトールリン酸エステルの形成を
試験し、ＨＰＬＣによりそれらの異性形を評価すること
による、より厳格な分析に付す。
【００７１】これらのプロトコールで検出される興味あ
る分子は、次いで例えばラットＭＴＣ６−２３細胞系を
用い例えばカルシトニン−分泌Ｃ−細胞での［Ｃａ2+］
へのそれらの影響を試験することにより、特異性を評価
する。
【００７２】以下は、これらのスクリーニング方法に有
用な方法の例示である。種々の試験カルシウム様又はカ
ルシウム拮抗分子についての典型的結果の例を図７−４
２に与える。
【００７３】上皮小体細胞調製 上皮小体腺を、地元の畜殺場で新たに屠殺した仔ウシ
（１２−１５週令）から得て、（ｍＭ）：ＮａＣｌ、１
２６：ＫＣｌ、４：ＭｇＣｌ2、１：Ｎａ−ＨＥＰＥ
Ｓ、２０：ｐＨ７．４；グルコース、５．６及び可変量
のＣａＣｌ2、例えば１．２５ｍＭを含む氷冷上皮小体
細胞緩衝液（ＰＣＢ）中で実験室に移した。一次又は、
尿毒症上皮小体亢進（ＨＰＴ）のため上皮小体組織の外
科手術除去を受けている患者から得たヒト上皮小体腺を
ウシ組織と同様に処理した。腺は過剰の脂肪と結合組織
を取り除き、次いで鋭利なはさみで２−３ｍｍの適当な
さいころに刻んだ。次いで分離した細胞をパーコル緩衝
液中で遠心分離により精製した。得られる上皮小体細胞
調製品は相対比顕微鏡及びスーダンブラックＢ染色によ
り評価される限り実質的に赤血球、脂肪細胞及び毛細管
組織が無かった。分離し、精製した上皮小体細胞は５な
いし２０細胞を含む小さな固りとして存在した。トリパ
ンブルー又はエチジウムブロミドの除外により示される
ように、細胞生存度は通常通り９５％であった。
【００７４】細胞はこの時点で実験目的に用いることが
できるが、生理的反応（ＰＴＨ分泌の抑制可能性及び
［Ｃａ2+］iの休止レベル）は、細胞を一夜培養後、よ
り良好である。一次培養も、イノシトールリン酸エステ
ル代謝の測定を含む研究に必要なように、細胞は同位体
平衡に近い同位元素により標識化できる（以下参照）。
パーコル勾配による精製後、細胞を５０ｕｇ／ｍｌスト
レプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、５ｕｇ／
ｍｌゲンタマイシンを補足したハムＦ１２−ダルベッコ
修飾イーグルス培地（ＧＩＢＣＯ）とＩＴＳ+ の１：１
混合物で数回洗浄した。ＩＴＳ+ はインスリン、トラン
スフェリン、セレン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
−リノレン酸を含むプレミックス溶液（コラボラティブ
・リサーチ、ベッドフォード、ＭＡ）である。次いで細
胞をプラスチックフラスコ（７５又は１５０ｃｍ2 ；フ
ァルコン）に移し、５％ＣＯ2の湿った雰囲気中３７℃
でインキュベートした。血清は、その存在が細胞をプラ
スチックに付着させ、増殖、脱分化を受けさせるので、
一夜培養に加えない。上の条件下で培養した細胞は傾斜
することによりフラスコから容易に除去され、新たに調
製した細胞と同じ生存度を示す。
【００７５】サイトゾルＣａ2+の測定 精製上皮小体細胞を１μＭフラ−２−アセトキシメチル
エステルを含む１．２５ｍＭ ＣａＣｌ2−２％ＢＳＡ
−ＰＣＢに再び懸濁し、３７℃で２０分間インキュベー
トした。次いで細胞をペレット化し、エステルを欠いた
同じ緩衝液に再び懸濁し、さらに１５分間３７℃でイン
キュベートした。続いて細胞を０．５ｍＭ ＣａＣｌ2
及び０．５％ＢＳＡを含むＰＣＢで２回洗浄し、室温
（約２０℃）で保持した。使用直前に、細胞を予め温め
た０．５ｍＭ ＣａＣｌ2−ＰＣＢで５倍に希釈し、
０．１％の最終ＢＳＡ濃度を得た。蛍光記録に用いたキ
ュベット中の細胞の濃度は、１−２×１０6 ／ｍｌであ
った。
【００７６】インディケーターを与えた細胞の蛍光を、
それぞれ３４０及び５１０ｎｍの励起及び放射波長を用
いる、サーモスタットキュベットホルダー及び磁気攪拌
器を備えた分光蛍光計（バイオメディカル・インストル
メンティション・グループ、ユニバーシティー・オブ・
ペンシルバニア、フィラデルフィア、ＰＡ）で、３７℃
にて測定した。本蛍光はサイトゾルＣａ2+のレベルを示
す。蛍光シグナルは、最大蛍光（Ｆｍａｘ）を得るため
ジギトニン（５０ｕｇ／ｍｌ、最終）を、最小蛍光（Ｆ
ｍｉｎ）を得るためＥＧＴＡ（１０ｍＭ、ｐＨ８．３、
最終）を、そして２２４ｎＭの解離定数を用い較正し
た。色素の漏れは温度に依存し、キュベット中細胞を加
温後、初めの２分以内に最も起きる。色素漏れはその後
きわめてわずかしか増加しない。色素漏れの較正を正す
ために、細胞をキュベットに置き、３７℃で２−３分間
攪拌した。次いで細胞懸濁液を取り、細胞をペレット化
し、上清をきれいなキュベットにもどした。次いで上清
を上記のようにジギトニン及びＥＧＴＡで処理し、色素
漏れの評価として得た。それは、典型的には全Ｃａ2+依
存蛍光シグナルの１０−１５％である。本評価は明白な
Ｆｍｉｎから引いた。
【００７７】ＰＴＨ分泌の測定 ほとんどの実験で、フラ−２を与えた細胞をＰＴＨ分泌
の研究に用いた。フラ−２を与えている上皮小体細胞
は、細胞外Ｃａ2+に対するそれらの分泌反応を変更しな
い。細胞を０．５ｍＭ ＣａＣｌ2及び０．１％ＢＳＡ
を含むＰＣＢに懸濁した。インキュベーションは、小量
のＣａＣｌ2及び／又は有機ポリカチオンを存在させ、
又はさせることなく、０．３ｍｌの細胞懸濁液を含むプ
ラスチック試験管（ファルコン２０５８）中で実施し
た。３７℃で種々の時間（典型的には３０分）インキュ
ベーション後、試験管を氷上に置き、細胞を２℃でペレ
ット化した。上清の試料を酢酸でｐＨ４．５とし、−７
０℃で保存した。このプロトコールはウシ及びヒト両上
皮小体細胞に用いた。
【００７８】ウシ細胞について、試料上清中のＰＴＨの
量は、１／４５，０００の最終希釈で、ＧＷ−１抗体又
はその等価を用いる均一放射免疫検定により測定した。
125Ｉ−ＰＴＨ（６５−８４：インクスター、スティル
ウォーター、ＭＮ）をトレーサーとして用い、分画をデ
キストラン−活性炭により分離した。試料及びデータ減
少の計数は、バッカード・コブラ５００５ガンマ・カウ
ンターで実施した ヒト細胞については、ＧＷ−１抗体がヒトＰＴＨをほと
んど認識しないので、無傷の及びＮ末端ヒトＰＴＨを認
識する、商業的に入手しうる放射免疫検定キット（ＩＮ
Ｓ−ＰＴＨ：ニッコールス・インスティテュート、ロス
・アンゼルス、ＣＡ）を用いた。
【００７９】サイクリックＡＭＰの測定 細胞を、ＰＴＨ分泌研究用に上記のようにインキュベー
トし、インキュベーションの終わりに０．１５ｍｌの試
料を採り、０．８５ｍｌの熱（７０℃）湯に移し、この
温度で５−１０分間加熱した。次いで試験管を数回、凍
結、解凍し、細胞残骸を遠心分離により沈降させた。上
清の部分をアセチル化し、サイクリックＡＭＰ濃度を放
射免疫検定により測定した。
【００８０】イノシトールリン酸エステル形成の測定 上皮小体細胞を４μＣｉ／ｍｌ 3Ｈ−ｍｙｏ−イノシト
ールと２０−２４時間インキュベートすることにより膜
リン脂質を標識化した。次いで細胞を洗浄し、０．５ｍ
ＭＣａＣｌ2及び０．１％ＢＳＡを含むＰＣＢに再び懸
濁した。インキュベーションは、種々の濃度の有機ポリ
カチオンの不存在又は存在で、異なる時間、ミクロフュ
ーグ管で行った。反応は１ｍｌクロロホルム／メタノー
ル／１２Ｎ ＨＣｌ（２００：１００：１；ｖ／ｖ／
ｖ）の添加により停止した。次いでフィチン酸水解物
（２００μｌ：２５μｇリン酸エステル／試験管）水を
加えた。試験管を遠心分離し、６００μｌの水性相を１
０ｍｌ水に希釈した。
【００８１】イノシトールリン酸エステルを、ＡＧ１−
Ｘ８を塩化物又はギ酸塩形で用いるイオン交換クロマト
グラフィにより分離した。ＩＰ3レベルのみを測定する
場合、塩化物形を用い、一方、ギ酸塩形は主なイノシト
ールリン酸エステル（ＩＰ3、ＩＰ2及びＩＰ1）を解明
するのに用いた。ＩＰ3だけの測定には、希釈試料を塩
化物−形カラムに適用し、カラムを１０ｍｌ ３０ｍＭ
ＨＣｌで、次いで６ｍｌ ９０ｍＭ ＨＣｌで洗浄
し、ＩＰ3を３ｍｌ ５００ｍＭ ＨＣｌで溶出した。
最終溶出物を希釈し、計数した。全ての主要イノシトー
ルリン酸エステルの測定には、希釈試料をギ酸塩−形カ
ラムに適用し、ギ酸塩緩衝液の濃度を増すことにより、
ＩＰ1、ＩＰ2及びＩＰ3を次々に溶出した。ギ酸塩形カ
ラムからの溶出試料は、回転減圧蒸発し、残渣をカクテ
ルにとり、計数した。
【００８２】ＩＰ3の同異形はＨＰＬＣにより評価し
た。反応は１ｍｌ ０．４５Ｍ過塩素酸の添加により停
止させ、氷上で１０分間保った。次いで遠心分離し、上
清をＮａＨＣＯ3でｐＨ７−８に調整した。次いで抽出
物をパーティシルＳＡＸアニオン交換カラムに適用し、
ギ酸アンモニウムの直線公配によって溶出した。次いで
種々の分画をダウエックスにより脱塩し、バッカード・
トリカーブ１５００ＬＳＣで液体シンチレーションカウ
ンターにかける前に回転減圧蒸発に付した。
【００８３】全てのイノシトールリン酸エステル分離法
について有機ポリカチオンが分離により妨害されるかど
うかを測定するために信ずべき標準を用いる適当なコン
トロールを使用した。
【００８４】もしそうである場合は、イノシトールリン
酸エステル分離前に試料をカチオン交換樹脂で処理し
て、害を及ぼす分子を除去した。
【００８５】Ｃ−細胞中のサイトゾルＣａ2+の測定 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣＮｏ．１６０７）から得たラット骨髄甲状腺癌（ｒ
ＭＴＣ６−２３）から誘導した腫瘍Ｃ−細胞を、ダルベ
ッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）プラス１５％ウマ血
清中、抗体の不存在で単層として培養した。［Ｃａ2+］
iの測定用に、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ／０．０５％
トリプシンにより収集し、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ2及
び０．５％ＢＳＡを含むＰＣＢで２回洗浄し、上皮小体
細胞に上記したようにフラー２を与えた。［Ｃａ2+］i
の測定は、上記したように色素漏れに対する適当な訂正
により行った。
【００８６】ラット破骨細胞での［Ｃａ2+］iの測定 破骨細胞は、無菌条件を用いる、１−２日令のスプラギ
ュ−ドゥリィラットから得た。ラットの子供は首をはね
て犠牲にし、後足を取り除き、大腿部は軟組織を速やか
に除き、予め加温したＦ−１２／ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥ
Ｍは１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン−ス
トレプトマイシン−ゲンタマイシン；１００Ｕ／ｍｌ−
１００ｕｇ／ｍｌ−１００ｕｇ／ｍｌ）を含む）に置い
た。二匹の子供からの骨は縦にカットし、１ｍｌ培養培
地に置いた。骨細胞は、プラスチックピペットによる骨
断片のおだやかな粉砕により得、培養培地で希釈した。
骨断片を沈殿させて、等しい部分（約１ｍｌ）の培地
を、２５ｍｍガラスカバーグラスを有する６ウェル培養
プレートに移した。細胞を、湿った５％ＣＯ2−空気雰
囲気で１時間、３７℃で澄ませる。次いでカバーグラス
を新しい培体で３回洗浄して非付着細胞を除去した。破
骨細胞中の［Ｃａ2+］iの測定は、非付着細胞を除去し
て６−８時間内に実施した。
【００８７】カバーグラスに付着した細胞は、血清を欠
き、代わりに０．５％ＢＳＡを含むＦ−１２／ＤＭＥＭ
中、５μＭインド−１アセトキシメチルエステル／０．
０１％プルロニックＦ２８との３７℃、３０分間インキ
ュベーションによりインドール１を与えた。続いてカバ
ーグラスを、微量蛍光定量法を装備したニコン・ダイア
ホト倒立顕微鏡の台上に設置した過融解室に移す前に、
洗浄し、エステルを欠いたＦ−１２／ＤＭＥＭ中、３７
℃でさらに１５分間インキュベートした。破骨細胞は、
それらの大きな形状及び多重核の存在から容易に確認し
た。（３４０ｎｍでの励起により発した）細胞は、試験
物質を存在させ又はさせることなく、１ｍｌ／分で緩衝
後（典型的には０．１％ＢＳＡ及び１ｍＭ Ｃａ2+を含
むＰＣＢ）と過融解した。３４０ｎｍでの励起により発
した蛍光は、顕微鏡のビデオポートを経て４４０ｎｍ二
色鏡に送り、４９５及び４０５ｎｍでの蛍光強度を光電
子倍増管により収集した。光電子倍増管からの産生を増
幅し、デジタル化し８０３８６ＰＣに記憶する。蛍光強
度の比は［Ｃａ2+］iを評価するのに用いた。
【００８８】卵母細胞発現 付加的研究において、ウシ又はヒト上皮小体細胞からの
ｍＲＮＡを注射したクセノプス卵母細胞をスクリーニン
グプロトコールに用い、Ｃｌ- コンダクタンスを［Ｃａ
2+］iの増加をモニターする間接手段として測定した。
以下はネオマイシンの効果を試験する実施例である。
【００８９】卵母細胞は、ヒト上皮小体組織（二次ＨＰ
Ｔの例からの上皮小体腺）からのポリ（Ａ）+ −強化ｍ
ＲＮＡを注射した。３日後、卵母細胞を、ネオマイシン
に対するそれらの反応について試験した。ネオマイシン
Ｂは薬物フリー生理食塩水との過融解を止めたＣｌ- コ
ンダクタンスの振動増幅を誘引した（図２６参照）。ネ
オマイシンＢに対する反応は１００μＭと１０ｍＭの間
の濃度で観察した。ネオマイシンＢにより誘引された反
応が上皮小体ｍＲＮＡの注射による偶発であったことを
確かめるため、水注射卵母細胞中、電流についてネオマ
イシンＢの効果を測定した。試験した５つの卵母細胞の
各々でネオマイシンＢ（１０ｍＭ）は電流に何らの変化
も生じなかった。約４０％の卵母細胞が、カルバコール
に反応することが知られており、効果は内因性ムスカリ
ンレセプターにより伝達された。試験した５つの卵母細
胞中、１つはカルバコールに対する反応で内への電流を
示し、これは図２６の下部図形に示される。即ち、［Ｃ
ａ2+］i及びＣｌ- コンダクタンスの増加に結合したム
スカリンレセプターを発現する細胞中、ネオマイシンＢ
は、反応を誘引しない。このことは、ネオマイシンＢに
対する反応が上皮小体細胞ｍＲＮＡにより暗号化された
特異的蛋白の発現に依存することを示す。無傷の細胞で
は、ネオマイシンＢはＣａ2+レセプターに直接作用し、
上皮小体細胞機能を変えることを非常に強く示唆する。
【００９０】最も重要な分子からの薬物設計 幾つかの有機分子は、本明細書に示されるように、Ｃａ
2+レセプターで作用することにより細胞外Ｃａ2+の作用
を模倣又は拮抗する。しかしながら、試験した分子は、
薬物候補として必ずしも適当でないが、それらは、仮説
の基礎となるＣａ2+レセプターに基づく治療が正しいこ
とを示すのに役立つ。これらの分子は、それらがＣａ2+
レセプターに作用させることができ、従って本発明に有
用な分子を選択しうる構造的特徴を決定するのに用いる
ことができる。
【００９１】そのような一つの分析分注の例は以下の通
りである。本例は、以下の実施例で詳細に述べるが、本
明細書で議論された最も重要な分子から本発明の有用な
分子を設計するのに用いることができる理論的根拠を示
すためにここで用いる。当業者は、実施例で明らかにさ
れた分析段階を、又、最も望ましいカルシウム様物質又
はカルシウム拮抗物質が明らかにされるまで、同様の分
析を他の量も重要な分子に行うことができることを認識
するであろう。
【００９２】他の例も以下に提供する。存在するデータ
をまとめると、有用な最も重要な分子は、好ましくは１
又はそれ以上の位置に置換される、そして所望により分
枝状または直鎖状の置換又は非置換アルキル基を有しう
る芳香基を有することであろうことを示す。加えて、望
ましいＣａ2+レセプターに対するより高い親和性を確実
にする正しい立体特異性の分子を選択することが重要で
ある。従ってこれらのデータは当業者に以下に多くの記
載されるように本発明の最高の望ましい分子を見出すた
めに誘導されうる適当な最も重要な分子を教示する。
【００９３】構造的に異なるけれども、試験される分子
は研究されうる一般的特徴を有しうる。本実施例におい
て、実効正電荷と細胞内Ｃａ2+を可動化する可能性との
相関を試験した。プロタミン（＋２１：ＥＣ50＝４０ｎ
Ｍ）は、上皮小体細胞での［Ｃａ2+］iの可動化を起こ
すのに、スペルミン（＋４；ＥＣ50＝１５０μＭ）より
も有効であったネオマイシンＢ（＋６；ＥＣ50＝２０μ
Ｍヒト上皮小体細胞中、及び４０μＭウシ上皮小体細胞
中）よりもさらに有効であった。これらの結果は、正電
荷のみが可能性を決定するのかどうか、又はＣａ2+レセ
プター上の活性に寄与する他の構造的特徴があるのかど
うかという疑問を生ずる。このことは、最初にそれがＣ
ａ2+レセプターが有効且つ特異的な治療用分子を目標に
できるという観点に大きく影響するということを決定す
るのが重要である。従って、ネオマイシンＢ及びスペル
ミンに関連する種々の他の有機ポリカチオンは分子の実
効正電荷と細胞内Ｃａ2+を可動化するその可能性との間
の関係を決定する研究ができる。
【００９４】研究した最初の系列の分子はアミノグリコ
シドであった。その分子はウシ上皮小体細胞で研究し、
それらの細胞内Ｃａ2+の可動化についてのＥＣ50を測定
した。アミノグリコシドについては、サイトゾルＣａ2+
過渡電流を惹起する能力の位置順は、ネオマイシンＢ
（ＥＣ50＝２０又は４０μＭ）＞ゲンタマイシン（１５
０μＭ）＞ベカナマイシン（２００μＭ）＞ストレプト
マイシン（６００μＭ）であった。カナマイシンとリン
コマイシンは、５００μＭの濃度で試験したとき、効果
がなかった。これらのアミノグリコシドのｐＨ７．３で
の実効正電荷は、ネオマイシンＢ（＋６）＞ゲンタマイ
シン（＋５）＝ベカマイシン（＋５）＞カナマイシン
（平均＋４．５）＞ストレプトマイシン（＋３）＞リン
コマイシン（＋１）である。次いでアミノグリコシド系
列内で、実効正電荷間にある関係があるがこれは絶対的
ではなく、ストレプトマイシンよりも有効であると予想
されたカナマイシンは活性がない。
【００９５】様々なポリアミンをテストすることによ
り、実効陽性電荷と有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）の間の付
加的かつより著しい矛盾が明らかになった。これらポリ
アミンの構造的分類を試みた：（１）直鎖状、（２）分
枝状、および（３）環状。テストしたポリアミンの構造
を図１−６に与える。直鎖状ポリアミンの中では、スペ
ルミン（＋４：ＥＣ50＝１５０μＭ）はペンタエチレン
ヘキサミン（＋６：ＥＣ50＝５００μＭ）およびテトラ
エチレンペンタミン（＋５：ＥＣ50＝２．５μＭ）より
も、たとえ後者の分子の方がより大きい実効陽性電荷を
有しているとしても、強力である。
【００９６】我々は、様々な数の二級および一級アミノ
基を持ち、従って実効陽性電荷が変化する幾つかの分枝
状ポリアミンを合成した。これら２分子、ＮＰＳ３８１
およびＮＰＳ３８２でウシ上皮小体細胞における［Ｃａ
2+］iの効果を試験した。ＮＰＳ３８２（＋８：ＥＣ50
＝５０μＭ）は、たとえそれが２つのより少ない陽性電
荷を含有するとしても、ＮＰＳ３８１（＋１０：ＥＣ50
＝１００μＭ）の約２倍の有効性であった。
【００９７】陽性電荷と有効性の間の同様の矛盾が環状
ポリアミンでの実験において表された。例えば、ヘキサ
サイクレン（＋６：ＥＣ50＝２０μＭ）は、ＮＰＳ３８
３（＋８：ＥＣ50＝１５０μＭ）よりも強力であった。
これらのポリアミンで得られた結果は、陽性電荷が有効
性に貢献する単独の因子ではないことを示している。
【００９８】更なる研究により、上皮小体細胞Ｃａ2+レ
セプターの活性を分け与える分子の構造的特徴に洞察が
与えられた。構造的に重要な特徴の１つに、（陽性電荷
を帯びる）窒素間の分子間距離がある。それ故に、スペ
ルミンはトリエチレンテトラミン（ＥＣ50＝８ｍＭ）の
５０倍も強力にウシ上皮小体細胞における［Ｃａ2+］i
の増加を引き起こすが、両分子は＋４の実効陽性電荷を
帯びている。これら２つのポリアミン間の構造上の相違
は、窒素を引き離しているメチレンの数だけであり、ス
ペルミンでは、それは３−４−３であるのに対して、ト
リエチレンテトラミンでは、２−２−２である。この窒
素間の間隔をあける外観上の少しの変化は、有効性に対
して深い関係を持ち、分子内の窒素のコンホーメーショ
ン関係が重大であることを示唆している。これを支持す
るのは、ヘキササイクレンおよびペンタエチレンヘキサ
ミンで得られた結果である。前者の分子は、単に後者の
環状類似体であり、全窒素間に同数のメチレンを含有し
ているが、環構造の存在は、有効性を２５倍に増加す
る。これらの結果は、それ自体の陽性電荷がＣａ2+レセ
プターにおける有機分子の活性を決定する重大な因子で
はないことを示している。
【００９９】他の一連の実験より、Ｃａ2+レセプターの
活性決定における芳香族基の重要性が明らかにする。そ
の結果は、クモ、アルギオープ・ロバータ（Ａｒｇｉｏ
ｐｅｌｏｂａｔａ）の毒から単離された２種のアリルア
ルキルアミンで得られた。これらの分子、アルギオトキ
シン（ａｌｇｉｏｔｏｘｉｎ）６３６およびアルギオト
キシン６５９は、異なる芳香族基に結合した同一のポリ
カチオン部分を有する（図３０）。アルギオトキシン６
５９は、１００ないし３００μＭの濃度でテストした時
に、ウシ上皮小体細胞における［Ｃａ2+］iの瞬間の増
加を引き起こした。反対に、アルギオトキシン６３６
は、同様の濃度でテストしても、効果無しであった（図
３０）。これらの２種のアリルアルキルアミン間の構造
上の相違は、分子の芳香族部分のみであり：アルギオト
キシン６５９は、４−ヒドロキシインドール部分を含ん
でいるのに対し、アルギオトキシン６３６は、２，４−
ジヒドロキシフェニル基を含んでいる。これら２種のア
リルアルキルアミンの実効陽性電荷は、同じであり（＋
４）、そのため、これらの異なる有効性は、異なる芳香
族基から生じるに違いない。このことは、実効陽性電荷
のみが、有効性を決定するのではないことを示してい
る。しかしながら、これらを見い出したことにより実際
に重要となるのは、芳香族基がＣａ2+レセプターを活性
化する分子の能力に非常に貢献するという発見である。
【０１００】アルガトキシン４８９（ＮＰＳ０１７）お
よびアルガトキシン５０５（ＮＰＳ０１５）のいずれも
上皮小体細胞における細胞間Ｃａ2+の流動化を引き起こ
し、それぞれＥＣ50、６と２２μＭを有している。これ
らの分子の構造上の相違は、インドール部分のヒドロキ
シ基のみである（図１−６）。このことは、分子の芳香
族領域上の置換が有効性に影響を与え得ることを示して
いる。これは、研究に付しているリード分子が、芳香族
部分が置換されているような分子を含んでいるであろう
ことを示している。
【０１０１】ここに記載したリード分子とは系統的に異
なる構造的特徴は、（１）実効陽性電荷、（２）窒素を
引き離しているメチレン数、および（３）例えば、メチ
レン間隔および実効陽性電荷における変化を伴う、およ
び伴わないポリアミンの環状のものを含んでいる。加え
て、構造および芳香族基の位置における系統的変化を、
例えば、スズメバチおよびクモの毒から単離された様々
なアリルアルキルアミンにおいて、試験することが出
来；商業的に入手可能な芳香族部分をアルギオトキシン
ポリアミン部分と結合させることにより、合成分子を調
製することが出来る。アルギオトキシンポリアミン部分
は、カルボン酸を含有しているいずれかの芳香族部分と
容易に結合することが出来る。従って、フェニル酢酸お
よび安息香酸のヒドロキシおよびメトキシ誘導体、同じ
くヒドロキシインドール酢酸系を系統的にスクリーニン
グするのは簡単である。ヘテロ芳香族機能性を有する類
似体を調製し、活性を評価することも出来る。
【０１０２】該分子間の有効性および効力の比較によ
り、一定の陽性電荷で、芳香族基の最適な構造および位
置が明らかになるであろう。
【０１０３】有効性を増加すると思われるポリアミンモ
ティーフでの構造的多様性の１つは、直鎖状親分子の環
状のものが存在することである。バドムンチアミンＡ
（ＢｕｄｍｕｎｃｈｉａｍｉｎｅＡ）は、植物アルビジ
ア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａａｍａｒａ）から単離され
たものであり、スペルミンの環状誘導体である（図１−
６）。バドムンチアミンＡをウシ上皮小体細胞に加える
と、細胞外Ｃａ2+の不在に固執し、ＰＭＡでの前処理に
より鈍化した［Ｃａ2+］iの迅速かつ瞬間の増加を引き
起こした。従って、それは、恐らく、Ｃａ2+レセプター
に作用することにより、上皮小体細胞における細胞間Ｃ
ａ2+の流動化を引き起こす。それは殆ど、スペルミン
（ＥＣ50約２００μＭ）と等しい効力をもっているが、
スペルミンよりも１つ低い陽性電荷（＋３）を帯びてい
る。
【０１０４】バドムンチアミンＡより得られた結果は、
構造活性研究の予言力および天然物をテストすることに
より得られる新規構造情報を表すものである。それ故
に、構造情報に基づき合理的に選択される天然物のスク
リーニングは、容易に行われ、例えば、分子を、ナプラ
ラート（Ｎａｐｒａｌｅｒｔ）などの適切なデータベー
スを用いる非常に確立された化学分離的原則に基づき、
選択することが出来る。例えば、ピセコロビウムなどの
アルビジアに関連するパピリオノイド豆果（ｐａｐｉｌ
ｉｏｎｏｉｄ ｌｅｇｕｍｅｓ）から誘導される大環状
ポリアミンアルカノイドおよび他の植物から誘導される
分子をスクリーニングすることが出来る。
【０１０５】図４４−６３は、本発明に対して有用な分
子を決定するためにスクリーニングされる一連の分子の
第二例を与えるものである。これらの分子は、一般にフ
ェンジリンから誘導されるものであり、テストして、そ
れらのそれぞれのＥＣ50を測定した。更に、関連分子、
ＮＰＳ４４７およびＮＰＳ４４８などをテストすること
により、分子構造の立体特異的効果を明らかにする。テ
ストしてデータが得られた殆どの活性化合物は、新規化
合物であり、ＮＰＳ４６７およびＮＰＳ５６８と呼称
し、５μＭ以下のＥＣ50値を持つ。当業者はこの一連の
分子を精密に調べることにより、本発明においてテスト
され得る他の適切な誘導体を測定することが出来る。
【０１０６】これらの例は、本発明において有用な一般
的設定およびスクリーニング方法を示しており、付加的
化合物および天然物ライブラリーを当該技術に望ましく
スクリーニングし、本発明の他の有用なリード分子また
は新規分子を決定することが出来る。
【０１０７】上記のように、カルシウム様物質として有
用な分子の例は、分枝状または環状ポリアミン、陽性に
荷電したポリアミノ酸、およびアリルアルキルアミンを
含んでいる。加えて、他の陽性に荷電した有機分子は、
天然に生じる分子およびそれらの類似体を含んでおり、
有用なカルシウム様物質である。これらの天然に生じる
分子およびそれらの類似体は、好ましくは陽性電荷対質
量比率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ｍａ
ｓｓ ｒａｔｉｏ）を有しており、ここに例示した分子
に対するこれらの比率と相関している。（例としては、
海洋哺乳類、節足動物毒、陸生植物および細菌類や菌類
から得られる発酵ブロスから単離された物質がある。）
カルシウム様物質として有用な天然に生じる分子および
類似体の好ましい１群では、陽性電荷：分子量（ダルト
ンで）の比率、約１：４０から１：２００、好ましくは
約１：４０から１：１００で有することが予期される。
該分子の更に詳しい実施例は以下に与える。
【０１０８】ポリアミン 本発明におけるカルシウム様物質として有用なポリアミ
ンは、分枝状または環状のいずれかであり得る。分枝状
または環状ポリアミンは、潜在的にそれらの直鎖状類似
体よりも高いカルシウム様活性を有している。即ち、分
枝状または環状ポリアミンは、生理学的ｐＨで同様の効
果的電荷を持つそれらの対応する線状ポリアミンよりも
低いＥＣ50を持つ傾向がある（表１参照）。
【０１０９】
【表１】 分子 実効（＋） 電荷 ＥＣ50（μＭ） ネオマイシン ＋６ ２０または４０ ヘキササイクレン ＋６ ２０ ＮＰＳ３８２ ＋８ ５０ ＮＰＳ３８１ ＋１０ １００ ＮＰＳ３８３ ＋８ １５０ ゲンタマイシン ＋５ １５０ スペルミン ＋４ １５０ ベカナマイシン ＋５ ２００ アルギオトキシン−６５９ ＋４ ３００ ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ） ＋６ ５００ ストレプトマイシン ＋３ ６００ スペルミジン ＋３ ２０００ テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ） ＋５ ２５００ １，１２−ジアミノドデカン（ＤＡＤＤ） ＋２ ３０００ トリエチレントラミン（ＴＥＴＡ） ＋４ ８０００
【０１１０】本明細書で使用した“分枝状ポリアミン”
とは、短いアルキル橋架け、またはアミノ結合（ａｍｉ
ｎｏ ｌｉｎｋａｇｅｓ）により一緒に連結したアルキ
ル基から成り、また鎖が枝分かれする点を有している鎖
状分子のことである。これらの“分枝点”は、炭素原子
または窒素原子のいずれか、好ましくは窒素原子の所に
位置することが出来る。窒素原子分枝点は、代表的には
三級アミンであるが、四級であることもある。分枝状ポ
リアミンは、１ないし２０の分枝点、好ましくは１ない
し１０の分枝点を有することもある。
【０１１１】一般に、分枝状ポリアミンにおけるアルキ
ル橋架けおよびアルキル分枝は、長さ１から５０の炭素
原子であり、好ましくは２から６の炭素原子である。ア
ルキル分枝は、１つまたはそれ以上のヘテロ原子（窒
素、酸素または硫黄）により中断されるか、またはフル
オロ、クロロ、ブロモまたはヨードを含むハロ：ヒドロ
キシ：ニトロ：アシロキシ（Ｒ′ＣＯＯ−）、アシルア
ミド（Ｒ′ＣＯＮＨ−）、またはアルコキシ（−Ｏ
Ｒ′）で、式中Ｒ′は１から４の炭素原子を含有し得る
ものなどの官能基で置換されることもある。アルキル分
枝は、アミノまたはグアニドなどの生理学的ｐＨで陽性
に荷電される基で置換される場合もある。これらの官能
置換基は、分子の活性、配達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、ま
たは生物学的利用能を増加する溶解度等の生理特性を与
えたり変化したりすることもある。
【０１１２】分枝状ポリアミンは、３つまたはそれ以上
の鎖および分枝末端点を有することもある。これらの末
端点は、メチル基またはアミノ基であり、好ましくはア
ミノ基であり得る。
【０１１３】好ましい分子の１群は、式： Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−（ＮＲi−（ＣＨ2）j）k−ＮＨ2 （式中、ｋは１から１０の整数であり、ｊはそれぞれ同
じかまたは異なり、２から２０の整数であり、Ｒiはそ
れぞれ同じかまたは異なり、水素と−（ＣＨ2）j−ＮＨ
2でｊは上記で定義したものから成る群から選択され、
少なくとも一つのＲiは水素ではない）を有する分枝ポ
リアミンの群である。
【０１１４】本発明の特に好ましい分枝状ポリアミン
は、分子Ｎ1，Ｎ1，Ｎ5，Ｎ10，Ｎ14，Ｎ14−ヘキサキ
ス−（３−アミノプロピル）スペルミンおよびＮ1，
Ｎ1，Ｎ5，Ｎ14，Ｎ14−テトラキス−（３−アミノプロ
ピル）スペルミンで、それぞれ、図１−６におけるＮＰ
Ｓ３８１およびＮＰＳ３８２のことである。
【０１１５】本明細書で使用した“環状ポリアミン”と
は、２つまたはそれ以上のヘテロ原子（窒素、酸素また
は硫黄）を含有する複素環で、その内、少なくとも２つ
は窒素原子であるもののことである。複素環は、一般に
周囲に約６から約２０原子、好ましくは、周囲に約１０
から約１８原子である。窒素ヘテロ原子は、２ないし１
０の炭素原子で隔てられている。複素環は、窒素部位で
アミノアルキルまたはアミノアリル基（ＮＨ2Ｒ−）で
置換されることもあり、式中Ｒは、アミノアリルまたは
２ないし６炭素原子の低級アルキルである。
【０１１６】本発明の特に好ましい環状ポリアミンは、
図１−６にヘキササイクレン（１，４，７，１０，１
３，１６−ヘキサアザ−シクロオクタデカンおよびＮＰ
Ｓ３８３として示している。
【０１１７】ポリアミノ酸 本発明において有用なポリアミノ酸は、生理学的ｐＨで
２つまたはそれ以上の陽性に荷電したアミノ酸残基を含
有しても良い。これらの陽性に荷電したアミノ酸は、ヒ
スチジン、リジンおよびアルギニンを含んでいる。これ
らのポリペプチドは、長さにして２から８００アミノ酸
の範囲内で変化する場合があり、より好ましくは長さに
して２０から３００アミノ酸である。これらのポリペプ
チドは、アミノ酸残基の単一の繰り返しから成ることが
あり、天然タンパク質または酵素の変種を有することも
ある。
【０１１８】ポリアミノ酸から成るアミノ酸残基は、２
０の天然アミノ酸または他の代わりとなる残基のいくつ
かである場合がある。代わりとなる残基は、例えば、式
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）nＣＯＯＨでｎは２から６であるω−ア
ミノ酸を含んでいる。これらは、サルコシン、ｔ−ブチ
ルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイ
シン、ノルロイシン、フェニルグリシン、シトルリン、
メチオニンスルホキシド、シクロヘキシルアラニン、お
よびヒドロキシプロリンである場合、中性で、非極性ア
ミノ酸である。オルニチンは、代わりとなる陽性に荷電
したアミノ酸残基である。本発明のポリアミノ酸は、知
られている方法により化学的に誘導されることもある。
【０１１９】本発明の特に好ましいポリアミノ酸は、ポ
リアルギニン、ポリリジンおよびポリ（アルギニニルチ
ロシン）を含み、２０−３００残基を有する。他の好ま
しいポリアミノ酸は、プロタミンまたはプロタミン類似
体である。
【０１２０】アリルアルキルアミン 本明細書で使用した“アリルアルキルアミン”とは、節
足動物の毒から誘導される陽性電荷毒素の分類のことで
ある。本発明の好ましいアリルアルキルアミンは、フィ
ルアンソトキシン−４３３、アルギオトキシン−６３６
およびアルギオトキシン−６５９、アガトキシン５０
５、アガトキシン４８９を含んでおり、これらの構造
は、図１−６に示しており、他の合成分子は、ＮＰＳ０
１９などのこれらの天然物の構造に合わせた。
【０１２１】付加的組成物 本発明の組成物は、少なくとも１種のカルシウム様物質
またはカルシウム拮抗物質を含有するだけでなく、ある
種の付加的組成物も含むことがある。これらの付加的組
成物は、本発明での施用において、例えば、細胞外Ｃａ
2+のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニング
するために有用であり得る、ターゲット組成物、標識お
よび他の機能性を含んでいる。
【０１２２】例えば、免疫グロブリンまたはその部分、
または上皮小体細胞に特異的な配位子またはＣａ2+レセ
プターをターゲット特異的組成物として用いることが出
来る。免疫グロブリンは、ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体であっても良く、抗体全体またはこれら抗
体の免疫学的に反応性のフラグメント、Ｆab,、Ｆabま
たは（Ｆab,）2などから成ることもある。レセプター特
異的配位子を使用することも出来る。
【０１２３】本発明の組成物は、標識として挙動する分
子またはイオンで誘導化された組成物を含有する場合も
ある。非常に様々な標識性部分を使用することが出来、
放射性同位体、発色団、および蛍光標識を含んでいる。
特に放射性同位体で標識すると、イン・ビボでの検出が
容易に出来る。放射性同位体をポルフィリン系における
カチオンとして配位により結合させることもある。有用
なカチオンは、テクネチウム、ガリウムおよびインジウ
ムを含むものである。組成物において、陽性に荷電した
分子は、標識と連結または結合させることが出来る。
【０１２４】合成方法 ポリアミンの合成および修飾戦略には、機能化された分
子を作成するために選択的に除去され得る様々なアミン
保護基（フタルイミド、ＢＯＣ、ＣＢＺ、ベンジルおよ
びニトリル）の使用を伴う。包含される合成方法は、ア
ルギオピン６３６と６５９およびクモ毒から誘導された
他のアリルアルキルアミンを作成するのに使用された方
法に合わせる。
【０１２５】２−４メチレンの鎖伸長は、対応するＮ−
（ブロモアルキル）フタルイミドでのアルキル化により
典型的に行った。ブロモアルキルフタルイミドに対する
アミンの１：１．２混合物をセライト上の５０％ＫＦの
存在下、アセトニトリル中で還流した。鎖伸長もまた、
得られたアミンのアクリロニトリルまたはエチルアクリ
レートでのアルキル化により行った。反応の進行は、Ｔ
ＬＣとジクロロメタン、メタノール、およびイソプロピ
ルアミンの組み合わせを用いるシリカゲルで精製された
中間体により追跡した。最終産物をカチオン交換（ＨＥ
ＭＡ−ＳＢ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（ヴィダックＣ−１
８）により精製した。純度と構造確認は、Ｈ1 −および
13Ｃ−ＮＭＲと高分解能マススペクトロメトリー（Ｅ
Ｉ、ＣＩおよび／またはＦＡＢ）で行った。
【０１２６】ＢＯＣ保護基を触媒量のジメチルアミノピ
リジンの存在下、ジクロロメタン中でアミン（１°また
は２°）をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートで処理
して付加した。ベンジル保護基は、２種の方法：（１）
１°アミンとベンズアルデヒドとの縮合、続いて水素化
ホウ素ナトリウム反応、または（２）ＫＦの存在下、２
°アミンのベンジルブロミドでのアルキル化のうち１方
法を適用した。アミド結合および環化はアミン（１°ま
たは２°）と得られた酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルとの反応により典型的に行った。これは（環
化の場合）、希釈条件下で、“アミノ酸”をジシクロヘ
キシルカルボジイミドで処理して直接的に行った。
【０１２７】フタルイミド機能性の脱保護は、メタノー
ルを還流しながら、ヒドラジンで還元することにより行
った。ＢＯＣ機能性の脱保護は、無水ＴＦＡ中で行っ
た。ベンジル、ニトリル、およびＣＢＺ保護機能性の脱
保護は、５５ｐｓｉ水素下で、炭素中水酸化パラジウム
の触媒量の存在下、氷酢酸中で還元することにより行っ
た。ニトリル機能性を（ベンジルおよびＣＢＺ基の存在
下）水素下で、スポンジ状ラネー・ニッケルの存在下で
選択的に還元した。
【０１２８】詳細には、分枝状ポリアミンは、代表的に
は式ＮＨ2−（ＣＨ2）n−ＮＨ2の簡単なジアミノアルカ
ン、またはスペルミイミドまたはスペルミンなどの簡単
なポリアミンから調製される。２つの（末端の）一級ア
ミンの１つをＢＯＣ（ｔ−ブチロキシカルボニル）、フ
タルイミド、ベンジル、２−エチルニトリル（アミンお
よびアクリロニトリルのミカエル縮合製造生成物（Ｍｉ
ｃｈａｅｌ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ））またはアミドなどの保護
基で保護または“マスク”する。典型的な反応はジ−ｔ
−ブチル−ジカルボネート（無水ＢＯＣ）での処理によ
るＢＯＣ保護基の付加である：
【化７】 一保護生成物を非保護および二保護生成物から簡単なク
ロマトグラフ的または蒸留技術より分離する。
【０１２９】その後、一保護生成物において残っている
遊離のアミンをアルキル化剤（またはアシル化剤）で選
択的にアルキル化（またはアシル化）する。確実に一ア
ルキル化（ｍｏｎｏ−ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）するため
に、遊離のアミンをベンズアルデヒドとの縮合、続いて
水素化ホウ素ナトリウム還元により部分的に保護して、
Ｎ−ベンジル誘導体を形成する：
【化８】 その後、Ｎ−ベンジル誘導体をアルキル化剤と反応させ
る。典型的なアルキル化剤は、Ｎ−（ブロモアルキル）
フタルイミドであり、それは以下のように反応する：
【化９】 例えば、Ｎ−（ブロモブチル）フタルイミドを用いて、
４メチレン単位で鎖を伸長または枝分かれさせる。代替
法として、アクリルニトリルとの反応、続いてシアノ基
の還元は、３−メチレンおよびアミノ基により鎖を伸長
するであろう。
【０１３０】生じた鎖伸長分子の保護基をその後、選択
的に切断して、新しい遊離のアミンを得ることが出来
る。例えば、トリフルオロ酢酸を使用して、ＢＯＣ基を
除去し：触媒的水素化を用いてニトリル機能性を還元
し、ベンジル基を除去し；ヒドラジンを用いて以下のよ
うにフタルイミド基を以下のように除去する：
【化１０】 新しい遊離アミンは、更に上記のようにアルキル化（ま
たはアシル化）されて、ポリアミンの長さを増加するこ
ともある。この工程を所望の鎖の長さおよび分枝の数が
得られるまで繰り返す。最終段階で、生成物を脱保護
し、結果として所望のポリアミンを生じる。しかしなが
ら、脱保護前に更なる修飾が保護末端で以下の方法によ
りもたらされる場合があり：例えば、ＢＯＣ脱保護前
に、ポリアミンを３，４−ジメトキシフェニル酢酸のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアシル化し、二
保護ポリアミンを得る：
【化１１】 これは、最終的にアリルポリアミンを得ることになる。
ＢＯＣ基をその後選択的にトリフルオロ酢酸で除去し
て、上記のように伸長され得る他のアミノ末端にさらす
ことが出来る。
【０１３１】ある種の分枝状ポリアミンは、上記で形成
したポリアミンにおける遊離の一級および二級アミンを
同時にアルキル化またはアシル化することにより得られ
ることもある。例えば、スペルミンを過剰のアクリロニ
トリルで処理し、続いて触媒的還元すると、以下を得
る：
【化１２】 環状ポリアミンをヘキササイクレン（アルドリッチ・ケ
ミカル）などの出発物質で始めて、上記のように調製す
る場合がある。
【０１３２】本発明の領域内のポリアミノ酸は、当業者
に知られている組換え技術により作成しても良く、また
は当業者に知られている標準的な固相法を用いて合成す
ることもある。固相合成は、ペプチドのカルボキシ末端
からα−アミノ保護アミノ酸を用いて、開始される。Ｂ
ＯＣ保護基は、他の保護基が安定であるとしても、すべ
てのアミノ基に対して用いることが出来る。例えば、Ｂ
ＯＣ−ｌｙｓ−ＯＨを、エステル化してクロロメチル化
ポリスチレン樹脂支持体にすることが出来る。ポリスチ
レン樹脂支持体は、好ましくはスチレンの共重合体であ
り、ポリスチレン重合体を完全にある種の有機溶媒に溶
解させる架橋剤として約０．５ないし２％ジビニルベン
ゼンを有している。スチュワート等、固相ペプチド合成
（１９６９年）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・カンパニー、サ
ンフランシスコ；およびメリフィールド、ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（１９６
３年）、８５巻、２１４９−２１５４頁、参照。ペプチ
ド合成のこれらおよび他の方法は、Ｕ．Ｓ．特許第３，
８６２，９２５号；第３，８４２，０６７号、第３，９
７２，８５９号；および第４，１０５，６０２号も例示
されている。
【０１３３】ポリペプチド合成は、マニュアル技術を用
いるか、または例えば、アブライド・バイオシステム・
４０３Ａ・ペプチド・シンセサイザー（フォスター・シ
ィー、カリフォルニア）またはバイオサーチ・ＳＡＭＩ
Ｉオートマティック・ペプチド・シンセサイザー（バイ
オサーチ・インコーポレイテッド、サン・ラファエル、
カリフォルニア）を用いて自動的に行うこともあり、製
造会社により提供された使用マニュアルにおいて与えら
れた使用説明に従う。
【０１３４】本発明のアリルアルキルアミンは、知られ
ている技術で単離された天然物であり、またはジャシー
ズ等、テトラヘドロン・レター（１９８８年）、２９
巻、６２２３−６２２６頁、およびネイソン等、テトラ
ヘドロン・レター（１９８９年）、３０巻、２３３７−
２３４０頁に記載のように合成される。
【０１３５】フェンジリン（または図４４−６３に示し
たフェンジリン類似体）調製のための１つの一般的なプ
ロトコールは、以下の通りである。磁気攪拌棒とゴム隔
膜を備えた１０ｍｌ丸底フラスコ内で、２ｍｌエタノー
ル中１．０ミリモル３．３′−ビスフェニルプロピルア
ミン（または一級アルキルアミン）を１．１ミリモルの
フェノールと１．０ミリモルのアセトフェノン（または
置換アセトフェノン）で処理した。これに、２．０ミリ
モルＭｇＳＯ4と１．０ミリモルＮａＣＮＢＨ3を加え
た。これを窒素雰囲気下、室温（約２０℃）で２４時間
攪拌した。反応物を５０ｍｌエーテルに注ぎ込み、１Ｎ
ＮａＯＨで３回、ブリンで１回洗浄した。エーテル層を
無水Ｋ2ＣＯ3で乾燥し、真空下で還元した。生成物をそ
の後、カラムクロマトグラフィーまたはＣＨ2Ｃｌ2−メ
タノール−イソプロピルアミン（典型的には、塩化メチ
レン中３％メタノールおよび０．１％イソプロピルアミ
ン）の結合したシリカ固定相を組み込んだＨＰＬＣによ
り生成した。
【０１３６】フェンジリンまたはフェンジリン類似体
（図４４−６３に表したようなもの）を調製するのに好
ましい方法は、チタン（ＩＶ）イソプロポキシドを使用
するものであり、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケ
ミストリー、５５巻、２５５２頁（１９９０年）に記載
の方法を一部修飾したものである。ＮＰＳ５４４の合成
には、チタンテトラクロリド（テトラヘドロン・レタ
ー、３１巻、５５４７頁（１９９０年）に記載の方法）
をチタン（ＩＶ）イソプロポキシドの代わりに使用し
た。反応スキームを図７０ａに表した。図７０ａにおい
て、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、炭化水素基を表している。
一実施態様に従うと、４ｍｌバイアル中で、アミン
（１）１ミリモル（代表的には、一般アミン）とケトン
またはアルデヒド（２）（一般には、アセトフェノン）
１ミリモルを混合し、その後、１．２５ミリモルのチタ
ン（ＩＶ）イソプロポキシド（３）で処理し、時折攪拌
しながら、室温で３０分間置いておく。代替法として、
二級アミンを（１）の代わりに用いることもある。注
意：幾つかの反応は、重い沈殿または固体を生じるであ
ろうが、（それらの融点まで）加温／加熱して反応の過
程にわたり数回攪拌／混合させる。反応混合物を１ミリ
モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（４）を含有する
１ｍｌエタノールで処理し、生じた混合物をその後、室
温で時折攪拌しながら約１６時間置いておく。その後、
約５００μｌの水を加えて、反応を止める。反応混合物
をその後、総容量約４ｍｌまで、エチルエーテルで希釈
し、その後遠心分離する。上部の有機相を除去し、ロー
トベーパー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で還元する。生じた
生成物（６）を、ＨＰＬＣ（ジクロロメタン：メタノー
ル：イソプロピルアミンでシリカを用いる順相、または
アセトニトリルまたはメタノールと共に０．１％ＴＦＡ
でＣ−１８を用いる逆相）により精製する前に、シリカ
の短いカラムのクロマトグラフィー（または代わりとし
てシリカの分取ＴＬＣを用いることによる）で、ジクロ
ロメタン：メタノール：イソプロピルアミン（典型的に
は、９５：５：０．１）の組み合わせを用いて、部分的
に精製する。
【０１３７】適切または望まれるならば、実施例２１に
記載のような方法を用いてキラル分割を行っても良い。
【０１３８】処方および投与 本明細書に示したように、本発明の分子は：細胞外Ｃａ
2+の１つまたはそれ以上の効果を模倣または拮抗し；
（ｂ）細胞外遊離Ｃａ2+レベルに個々に影響を与え：
（ｃ）上皮小体機能亢進症、エステロプロシスおよび高
血圧などの疾患を治療するために用いられ得る。該分子
は、一般に上皮小体細胞での効果を有することが示され
ているのに対し、これらは、骨溶骨細胞、傍糸球体の腎
臓細胞、隣接する腎細管細胞、ケラチン生成細胞、小胞
周縁の甲状腺細胞、胎盤性トロホプラストを含む他の細
胞でのＣａ2+レセプターを調節することもある。
【０１３９】これらの分子は、典型的にヒト患者の治療
に用いられるであろうが、他の霊長類、豚、畜牛および
飼鳥類などの農場動物、馬、犬およびネコなどのスポー
ツ動物などの他の定温動物種において同様のまたは同一
の疾患の治療に使用することも可能である。
【０１４０】治療的および／または診断的施用におい
て、本発明の分子は、全身および局所または集中投与を
含む様々な投与方法で処方され得る。技術および処方
は、一般に、レミントンズ・ファーマシューティカル・
サイエンシィズ、マック・パブリッシング・カンパニ
ー、イーストン、ペンシルバニアに見い出され得る。
【０１４１】全身投与には、経口投与が好ましい。代替
法として、例えば、筋肉内、静脈内、腹膜内、および皮
下注射を用いることもある。注射では、本発明の分子を
液体溶液状、好ましくは、ハンク溶液またはリンガー溶
液などの生理学的に融和性の緩衝液中で処方される。加
えて、該分子を固形で処方し、使用する前に直ちに再溶
解または懸濁させることもある。凍結乾燥形も含まれ
る。
【０１４２】経粘膜的または経皮的方法により、全身投
与しても良く、または該分子を経口的に投与することも
出来る。経粘膜的または経皮的投与のためには、浸透さ
せるべき隔壁に適切な浸透剤を処方に用いる。このよう
な浸透剤は、一般に当業者には知られており、例えば、
経粘膜的投与のための胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体
を含む。加えて、洗剤を用いて浸透を容易にすることも
ある。経粘膜的投与は、例えば鼻に散布するもの、また
は座薬であることもある。経口投与のためには、該分子
をカプセル、錠剤、および強壮剤など、適宜の経口投与
形で処方される。
【０１４３】局所投与のためには、本発明の分子を、一
般に当業者には知られているものとして軟膏、膏薬、ゲ
ルまたはクリームで処方される。
【０１４４】以下の実施例に示したように、本発明の様
々な化合物の投与されるべき量は、標準的手法により決
定することが出来る。一般に、処置される動物のｋｇに
対し約１および５０ｍｇ／ｋｇの間である。
【０１４５】組換えＣａ2+レセプター 天然物スクリーニングは、伝統的には多様な治療的分子
の開発に対し、手掛かりとなる構造を与えてきた。しか
しながら、Ｃａ2+レセプターでの活性に対する天然物ラ
イブラリーまたは他の分子ライブラリーの高処理量スク
リーニング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｐｕｔ ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ）は、以前可能ではなかった。これを可能す
るには、Ｃａ2+レセプターｃＤＮＡをクローン化し、そ
の後、高処理量スクリーニングに安定なトランスフェク
ションした細胞系を作るのが最善である。レセプターの
構造を用いて、付加的に配位子結合部位の分子の結合構
造の洞察を得ることが出来、このような情報を使用し
て、上記で論議したように合理的薬剤デザイン計画を拡
大することが出来る。限定された構造活性研究および選
択された天然物分子の試験は、合理的天然物スクリーニ
ングおよび薬剤デザインを導くに必要な最初の構造デー
タベースを与えるものであろう。
【０１４６】ウシおよびヒト上皮小体細胞Ｃａ2+レセプ
ターｃＤＮＡは、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細
胞における機能発現によりクローン化することが出来
る。内生のＣａ2+活性化Ｃｌ- チャンネルを通る電流を
測定することにより、ツメガエル卵母細胞における細胞
間Ｃａ2+の増加を間接的に追跡することが可能である。
このシグナル形質導入経路より与えられた応答の増幅
は、ｍＲＮＡにより暗号化されるレセプタータンパク質
の検出を非常に低レベルで可能にする。このことは、レ
セプター特異性ｃＤＮＡクローンの検出を、高緩和性配
位子、特異的抗血清またはタンパク質もしくは核酸配列
情報の必要がなくても可能にするものである。該方法の
実施例は以下である。
【０１４７】成体の雌キセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）はキセノプスＩ（アン・アーバ
ー、ＭＩ）から得られ、常法に従い維持された。卵巣の
丸い突出部を低体温法的に麻酔したヒキガエルから摘出
した。卵母細胞の房を修飾バース塩水（ＭＢＳ）に移し
た。個々の卵母細胞を２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（シグ
マ、１Ａ型）を含有するＭＢＳ中で２１℃で２時間イン
キュベートすることによって得、Ｖ−ＶＩ段階の卵母細
胞を注入するために選択した。
【０１４８】ガラスキャピラリー管（直径１ｍｍ）を引
っ張って細い先端にし、手で折って、先端の直径を約１
５μＭにする。ｍＲＮＡの小滴（ジエチルピロカーボネ
ート（ＤＥＰＣ）−処理水中１ｎｇ／ｎｌ）をパラフィ
ルムに置き、キャピラリー管で吸い上げた。その後、そ
のキャピラリー管をビコスプリッツァー（ｐｉｃｏｓｐ
ｒｉｔｚｅｒ）（ＷＰＩ・インストルメンツ）につな
げ、空気−パルスした（ａｉｒ−ｐｕｌｓｅｄ）小滴の
容量を調節してｍＲＮＡ５０ｎｇ（典型的には５０ｎ
ｌ）を出した。ナイロンストッキングを当てて底を固定
した３５ｍｍ培養皿を用いて、ｍＲＮＡを動物極に注入
する間中、卵母細胞を動かないようにした。注入した卵
母細胞をＭＢＳ、１００ｕｇ／ｍｌペニシリンおよび１
００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含有する３５ｍｍ培
養皿に置き、１８℃で３日間インキュベートした。
【０１４９】インキュベートに続いて、卵母細胞を１０
０μｌプラスチックチャンバーに置き、流速０．５ｍｌ
／分で蠕動ポンプを用いてＭＢＳに注いだ。試験分子ま
たは非有機ポリカチオンを、別の緩衝液に管を迅速に移
すことにより加えた。記録し、電流を通す電極を、１−
３モームの抵抗で引っ張られ、３ＭＫＣｌで満たされた
薄壁キャピラリー管から組み立てた。卵母細胞に（動物
極において）顕微鏡観察下で両方の電極を突き刺し、保
持電位（−７０ないし−８０ｍＶ）に合わせ、保持電位
を維持するために通した電流を測定するために用いられ
るアクソン・インストルメンツ・アキソクランプ２Ａ電
圧−クランプ増幅器につなげた。電流は、直接ストリッ
プ・チャート記録機に記録した。
【０１５０】ｍＲＮＡ調製のために、子牛または二次Ｈ
ＰＴ患者から上皮小体を外科的に除去して組織を得た。
精製した細胞を調製する必要は無い；腺全体をツメガエ
ル卵母細胞におけるＣａ2+レセプターの発現を支配する
ｍＲＮＡを調製するのに用いた。細胞のＲＮＡ全体を均
一化した腺を酸グアニジニウムチオシアネート／フェノ
ール抽出することにより調製した。オリゴーｄＴセルロ
ースクロマトグラフィーを用いて、標準方法によりポリ
（Ａ）+ ｍＲＮＡを選択した。ｍＲＮＡの画分の大きさ
を揃えるために、グリセロール勾配の遠心分離を使用し
た。ｍＲＮＡを２０ｍＶ水酸化メチル水銀で変性させ、
ベックマンＴＬＳ５５管内で調製した直線１５−３０％
グリセロール勾配上に乗せた（濃度１ｍｇ／ｍｌで５０
−１００ｕｇ）。続いて、３４，０００ｒｐｍで１６時
間遠心分離にかけ、０．３ｍｌ勾配画分を集めて、５ｍ
Ｍベータ−メルカプトエタノールを含有する等容量の水
で希釈した。ｍＲＮＡをその後、２回のメタノール沈殿
により回収した。所望ならば、ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）+
５０−１００ｕｇ）を１．２％アガロース／６．０Ｍ尿
素分離ゲルで、ＲＮＡサイズマーカーの範囲に沿って分
離することもある。続いて、エチジウムブロマイド染色
によりｍＲＮＡを視覚化し、ＲＮＡを１．５−２．０ｋ
ｂサイズ段階で含有するゲル切片を削り取った。ｍＲＮ
ＡをＲＮＡイド結合細胞間質（ＲＮＡｉｄ ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（供給者の標準的なプロトコール
に従う：ストラタジーン・インコーポレイテッド）を用
いてアガロースゲル切片から回収し、回収したｍＲＮＡ
画分はＤＥＰＣ処理水中に溶出した。
【０１５１】回収したｍＲＮＡ量をＵＶ吸収測定により
計った。各画分内に含まれるｍＲＮＡのサイズ範囲は、
各試料の少量（０．５ｕｇ）を用いるホルムアルデヒド
／アガロースゲル電気泳動により測定された。ｍＲＮＡ
のインテグリティー（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をイン・ビ
トロで各試料を翻訳することにより評価した。網状赤血
球溶解物（商業的に入手出来るキット；ＢＲＬ）を用い
て各ｍＲＮＡ画分の０．０５−０．５ｕｇを翻訳した。
生じた35Ｓ−標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。無傷のｍＲＮＡは、完全なサイズ範囲のタン
パク質合成を支配することが出来、個々のｍＲＮＡ画分
のサイズにおおよそ対応していた。
【０１５２】ｃＤＮＡライブラリーをガブラーとホフマ
ンの技術を改良したものに従い、ベクターλＺＡＰＩＩ
において構築した。卵母細胞アッセーにおいて最適な応
答を与える画分由来のＲＮＡを出発物質として用いた。
第一鎖ｃＤＮＡ合成は、オリゴーｄＴ／ＮｏｔＩプライ
マー−リンカーで活性化（ｐｒｉｍｅｄ）された。第二
鎖合成は、ＲＮアーゼＨ／ＤＮＡポリメラーゼＩ自己プ
ライミング法（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｍｅｔｈｏ
ｄ）により行った。二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼおよびＴ４リガーゼでｃＤＮＡに連結したＥｃｏ
ＲＩアダプター平滑末端で鈍化（ｂｌｕｎｔｅｄ）し
た。リンカーを切断するＮｏｔＩ消化に続いて、ｃＤＮ
Ａの全長をセファクリル５００ＨＡの排除（ｅｘｃｌｕ
ｓｉｏｎ）クロマトグラフィーによりサイズ選択した。
第一鎖ｃＤＮＡをα−32Ｐ−ｄＡＴＰで放射性標識し、
合成および回収段階の全てを続いて放射活性を組み込ん
で追跡した。大きさで分類したカラムから回収したｃＤ
ＮＡの全長をＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化されたλＺＡＰ
ＩＩ手に連結（ｌｅｇａｔｅ）した。連結混合物（ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ）を商業的に入手可能な高効率パ
ッケージング抽出物（ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ）（ストラクタ
ジーン・インコーポレイテッド）で試験パッケージ（ｐ
ａｃｋａｇｅ）し、適切な宿主株（ＸＬ１−ブルー）に
置いた。組換ファージの割合は、ライブラリーがＩＰＴ
ＧとＸ−ｇａｌ上に置かれている場合、青色プラークに
対する白色プラークの比率で測定した。
【０１５３】挿入物サイズの平均を無作為に選択した１
０個のクローンから測定した。ファージＤＮＡ“ミニー
プレップス（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）”をＥｃｏＲＩと
ＮｏｔＩで消化して挿入物を放出させ、アガロースゲル
電気泳動によりサイズを測定した。ライブラリーは、＞
９０％組換えファージから成っており、挿入物のサイズ
は、１．５から４．２ｋｂの範囲であった。組換連結
（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を大規
模にパッケージし、８００，０００個の一次クローンを
産した。パッケージング混合物を滴定し、１５ｃｍプレ
ート当たり５０，０００プラークで覆った。５０，００
０クローンの各プールをＳＭ緩衝液中で溶出し、個々に
保存した。
【０１５４】クローンプールのそれぞれのプレート溶解
物の保存品を小規模のファージＤＮＡ調製に用いた。フ
ァージ粒子をポリエチレングリコール沈殿により濃縮
し、ファージＤＮＡをプロテナーゼＫ消化、続いてフェ
ノール：クロロホルム抽出により精製した。ＤＮＡの２
０ミクログラムをＮｏｔＩで消化し、鋳型としてイン・
ビトロでのセンス鎖ＲＮＡの転写に用いた。イン・ビト
ロ転写は標準プロトコールに従い、総反応容量５０μｌ
中Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび５′キャップ類似体ｍ
7ＧｐｐｐＧを利用する。ＤＮアーゼＩ／プロテナーゼ
Ｋ消化およびフェノール／クロロホルム抽出に続き、Ｒ
ＮＡをエタノール沈殿により濃縮して、卵母細胞注入に
用いた。
【０１５５】卵母細胞に、それぞれ５０，０００の独立
クローンからなる１６ライブラリーサブプール由来の合
成ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）それぞれを注入した。３〜４日
間インキュベーションした後、卵母細胞のＣａ2+依存性
Ｃｌ−電流の誘導に対する１０ｍＭのネオマイシンの能
力を評価した。６と名付けたプールは、陽性信号を示
し、従って機能的カルシウム受容体をコード化するｃＤ
ＮＡクローンを含む。プール６の複合性を減少、すなわ
ちこのプール中に含まれるカルシウム受容体クローンの
精製を行うために、プール６ファージをプレート当たり
〜２０，０００プラークで再び平板培養し、１２プレー
トを回収した。ＤＮＡはそれぞれのこれらのサブプール
から製造され、ｃＲＮＡが合成された。再び卵母細胞に
ｃＲＮＡを注入し、３〜４日後、Ｃａ2+依存性Ｃｌ−電
流の誘導に対する１０ｍＭのネオマイシンの能力を評価
した。サブプール６−３は陽性でこのプールは、プール
当たり約５，０００クローンに複合性を減少する、さら
なる一連の平板培養の対象とした。プールは再びｃＲＮ
Ａの製造および卵母細胞中への注入により測定した。サ
ブプール６−３．４は陽性であった。プール６−３．４
の陽性クローンのさらなる精製を促進するために、この
プールからのファージＤＮＡをヘルパーファージ、Ｅｘ
Ａｓｓｉｓｔで重感染させることによりプラスミドＤＮ
Ａとして救済した。救済したプラスミドの細菌株ＤＨ５
ａｌｐｈａＦ’への形質転換により、アンピシリンプレ
ート上で形質転換細菌コロニーが得られた。これらはそ
れぞれ９００クローンのプールとして回収した。プラス
ミドＤＮＡを次にそれぞれのサブプールから製造し、通
常の方法でｃＲＮＡ合成および評価をした。サブプール
６−３．４．４が陽性であった。プラスミドサブプール
６−３．４．４を含む細菌をそれぞれ〜５０クローンの
サブプールで連続して平板培養した。この方法の繰返し
により機能的カルシウム受容体をコード化する単一クロ
ーンが得られることが期待される。
【０１５６】最初の実験は、水またはウシ上皮小体由来
ポリ（Ａ）+ −に富むｍＲＮＡ（５０ｎｇ）を注入され
たアフリカツメガエル卵母細胞を使用した。３日後、卵
母細胞の、細胞外２または３価カチオン濃度の増加に応
答する細胞内Ｃａ2+増加の能力を評価した。卵母細胞に
記録および通電用電極棒を刺し、［Ｃａ2+］iを間接的
に内因性Ｃａ2+−活性化Ｃｌ- チャンネルを通る電流を
測定することにより評価した。ウシ（またはひと、図３
２）上皮小体由来のポリ（Ａ）+ −に富むｍＲＮＡを注
入された卵母細胞中では、細胞外Ｃａ2+の濃度が０．７
から３、５または１０ｍＭへの増加が、次に高い基底コ
ンダクタンスの付近で振動するＣｌ-コンダクタンスの
急速および一時的増加を生じさせた。細胞外Ｍｇ2+の１
から１０ｍＭへの濃度の増加は、同様にＣｌ-コンダク
タンスの振動的増加を引き起こした。Ｃｌ-コンダクタ
ンスの細胞外Ｍｇ2+に対する応答は細胞外Ｃａ2+濃度が
＜１μＭに減少した場合に持続した（図３１）。
【０１５７】一時的な３価カチオンＧｄ3+（６００μ
Ｍ）はまたＣｌ- コンダクタンスの振動的増加を生じさ
せた（図３１）。振動性であり、細胞外Ｃａ2+の見かけ
上不存在下で持続するＣｌ- コンダクタンスのこのよう
な増加は、卵母細胞に他のＣａ2+−流動受容体の発現さ
れ、適当な配位子で促進されることが認められた（例え
ばサブスタンスＫ、図３１）。これらの例中、Ｃｌ- コ
ンダクタンスの増加は細胞内Ｃａ2+の流動化を反映す
る。これらの最初の研究は同様に細胞外多価カチオン
が、細胞内Ｃａ2+を、上皮小体細胞ｍＲＮＡ−注入卵母
細胞中で流動させることを示す。
【０１５８】水を注入された卵母細胞は、細胞外Ｃａ2+
（１０ｍＭ）またはＭｇ2+（２０または３０ｍＭ）にさ
らした場合Ｃｌ- 電流の変化は示さなかった。一連の実
験の中で、卵母細胞はサブスタンスＫ受容体をコード化
するｍＲＮＡを注入された。これらの卵母細胞中、細胞
外Ｍｇ2+（２０ｍＭ）は電流を引き起こさないが、細胞
はサブスタンスＫの添加に活発に応答した（図３１）。
これらの実験は、卵母細胞の細胞外Ｃａ2+またはＭｇ2+
に対する内因性の感受性がないことを示唆する。
【０１５９】同様の実験をひと上皮小体（第２期ＨＰＴ
由来の過形成組織）から製造したポリ（Ａ）+−に富む
ｍＲＮＡを注入した卵母細胞を用いても行った。これら
の卵母細胞では、細胞外Ｃａ2+濃度の増加は振動してい
るＣｌ- コンダクタンスの可逆的増加を生じさせた（図
３２）。３００μＭ Ｌａ3+の添加も同様にＣｌ- コン
ダクタンスの振動的増加の原因となった。細胞外Ｍｇ2+
の１から１０ｍＭへの増加が、細胞外Ｃａ2+不存在下で
持続するＣｌ- コンダクタンスの増加を引き起こした。
付加実験は、細胞外Ｃａ2+に対する反応が濃度依存性で
あることを示唆する。したがって、３個のｍＲＮＡ−注
入卵母細胞中、Ｃｌ- コンダクタンスは最大１１１±２
ｎＡまで３ｍＭの、および２３３±１０１ｎＡまで１０
ｍＭの細胞外Ｃａ2+で増加した。
【０１６０】アフリカツメガエル卵母細胞で得られた結
果は、通常非反応性細胞中で、細胞外Ｃａ2+の感受性を
与えることができる蛋白質をコード化する、上皮小体細
胞中のｍＲＮＡ（類）の存在を証明する。さらに、細胞
外Ｍｇ2+の、細胞外Ｃａ2+不存在下でＣｌ- 電流の振動
性増加を引き起こす能力は、Ｃｌ- 電流が、細胞外Ｃａ
2+の流入よりむしろ細胞内Ｃａ2+の流動に依存すること
を証明する。Ｌａ3+で得られた結果も同様に、発現蛋白
質が、細胞内Ｃａ2+の流動に関連していることを示す。
まとめると、これらのデータは発現蛋白質はチャンネル
というよりもむしろ細胞表面受容体として働く。これら
の研究は、上皮小体細胞上のＣａ2+受容体蛋白質に存在
の注目せずにはいられない証拠を提供し、Ｃａ2+受容体
ｃＤＮＡの分子クローニングを成し遂げるためアフリカ
ツメガエル卵母細胞系を使用することの可能性を示す。
【０１６１】他の一連の研究で、水酸化水銀メチルで変
成させた上皮小体細胞のｍＲＮＡは、グリセロール勾配
による遠心分離でサイズ分画した。画分を回収した。そ
れぞれの群をアフリカツメガエルの卵母細胞系に注入
し、３日間のインキュベーションの後、卵母細胞をＣａ
2+受容体の発現に対して評価した。画分４−６を注入さ
れた卵母細胞が、細胞外Ｃａ2+に反応したＣｌ- コンダ
クタンスの最大で最も調和した増加を示した。これらの
結果は、Ｃａ2+受容体がサイズ２．５−３．５ｋｂのｍ
ＲＮＡによりコード化されていることを示す。これは、
形質転換ベクターｃＤＮＡライブラリーから合成された
ＲＮＡの直接発明を用いた方法が、可能性があることを
示唆する。この種のサイズ分画実験が行われ、異なった
３種の分画実験でそれぞれ同様の結果が得られた。
【０１６２】前記の実験で得られ、特徴付けられたｍＲ
ＮＡ画分は卵母細胞に注入することにより測定できる。
それぞれのｍＲＮＡ画分で、１０−２０個の卵母細胞に
５０ｎｇのＲＮＡが、濃度１ｎｇ／ｎｌ水溶液として注
入される。注入された卵母細胞は１８℃に４８−７２時
間維持され、その後Ｃｌ- 電流測定を用いたＣａ2+受容
体の発現を測定する。注入した卵母細胞のそれぞれの群
で、受容体発現に対する陽性の数、および測定したＣａ
2+−依存性Ｃｌ- 電流の大きさを測定する。陰性対象と
して、卵母細胞にラット肝臓ポリ（Ａ）+ −に富むｍＲ
ＮＡ、酵母ＲＮＡまたは水を注入する。
【０１６３】２．５−３．５ｋｂの範囲のｍＲＮＡは受
容体をコード化することが予想される。大きいサイズの
ｍＲＮＡは、卵母細胞への注入に先立つ上皮小体ｍＲＮ
Ａのハイブリッド除去を基本にしたクローニング研究に
必要であり得る。この方法の成功は完全な長さのｃＤＮ
Ａクローンの産生に依存しない。もし受容体発現がｍＲ
ＮＡの単一サイズの画分で得られない場合、卵母細胞に
サイズ混合画分を注入し、機能的受容体を上昇させる組
み合わせを決定する。もし、多重サブユニットが機能的
受容体の形成のために必要であることが明らかなった場
合、ハイブリッド除去発現クローニング法が使用され
る。この研究で、クローンは、特異的ｍＲＮＡ種を全ｍ
ＲＮＡ集団から枯渇させるその能力を基本にして選択さ
れる。単一サブユニットをコード化するクローンは、活
性多重サブユニット複合体形成の阻止能力により同定す
る。徹底的なスクリーニングにより、必要なサブユニッ
トの全てをコード化するクローンの同定が可能になる。
【０１６４】この研究は、機能的受容体複合体を形成す
るために必要な個々のサブユニットをコード化するクロ
ーンの単離を可能にする。クローンのプール由来の合成
ＲＮＡは、アフリカツメガエル卵母細胞にＣａ2+受容体
の発現を誘導する能力により、基本ｍＲＮＡ画分の測定
に使用したのと同様の技術で評価する。本来、それぞれ
１００，０００個の初期クローンを表す１０個のプール
が試験される。陽性反応を示すクローンのプールは低い
（一般的に４〜１０倍）配合性でふるい分け、再び陽性
プールを小分けし、ふるい分ける。ライブラリー細分画
におけるこの方法は、個々の陽性クローンが同定される
まで続ける。卵母細胞発現測定の陰性対象として、アン
チセンス転写物が、陽性反応を誘導するこれらの鋳型Ｄ
ＮＡのＴ７転写により産生される。アンチセンス転写物
は標準受容体を発現できず、合成ＲＮＡの注入により発
生する任意の非特異的陽性信号を制御する。他の重大な
ことは、卵母細胞中の合成ＲＮＡが、未確認の機構によ
り時々「有毒」に翻訳され得るという事実である。この
可能性を制御するために、陰性反応を与える合成ＲＮＡ
を、上皮小体細胞ｍＲＮＡと共に種々の希釈で共注入
し、それらがＣａ2+受容体の発現の非特異的妨害をする
かどうか測定する。
【０１６５】Ｃａ2+受容体をコード化する個々のクロー
ンが同定された場合、挿入ｃＤＮＡはλベクターから切
除され、合成ＲＮＡの大きいスケールでの合成に使用さ
れる。この単一ＲＮＡ種の卵母細胞注入は、発現受容体
の特徴の厳密な測定を可能にする。
【０１６６】もしＣａ2+受容体をコード化するｍＲＮＡ
のサイズが接続転写によるクローニングおよび発現に大
きすぎる場合、またはたとえ多重サブユニットが含まれ
ても、スクリーニングしたクローンのプールのハイブリ
ッド除去技術が使用される。ｃＤＮＡ挿入ＤＮＡは、サ
イズ選択上皮小体細胞ｃＤＮＡライブラリーからのクロ
ーンのプールから製造される。このＤＮＡは上皮小体細
胞ｍＲＮＡへ、ＤＮＡ／ＲＮＡ２重体の形成が可能な条
件下でハイブリダイズされる。非アニール化、ハイブリ
ッド除去ＲＮＡは回収され、卵母細胞注入へ使用され
る。Ｃａ2+受容体ｍＲＮＡを示す配列を含むクローンの
プール由来のＤＮＡはこの全上皮小体細胞ｍＲＮＡ集団
由来のｍＲＮＡから除去され、この受容体の発現は卵母
細胞注入により減少しまたはなくなる。細分画の方法
は、クローンのプールの複合性の減少により生じ、それ
ぞれの工程で、全上皮小体ｍＲＮＡ集団からＣａ2+受容
体コード化ｍＲＮＡを除去したクローン化ＤＮＡを測定
する。ハイブリッド除去測定の間の内部制御の使用は、
ハイブリッド除去ＲＮＡは無傷であり卵母細胞への形質
転換に用いられることを確実とする。
【０１６７】ひと上皮小体細胞はアデニレートサイクラ
ーゼに結合したベータ−アドレナリン様受容体を発現す
る。この受容体は卵母細胞中で発現でき、そこでそれは
内因性アデニレートサイクラーゼのアゴニスト−誘導活
性化を担う。Ｃａ2+受容体クローンのハイブリッド除去
スクリーニングの間、ハイブリッド除去ｍＲＮＡを注入
された卵母細胞はイソプロテレノール−誘導アデニレー
トサイクラーゼ活性化として測定される。この測定にお
ける陽性反応は、Ｃａ2+受容体反応の任意の観察される
阻害が特異的であり、全ｍＲＮＡ集団の一般的な阻害に
よるものではないという示唆に役立つ。
【０１６８】ハイブリッド除去スクリーニンク法によ
り、完全蛋白質コード化領域を含まないクローンの単離
ができる。このスクリーニング法により単離された陽性
クローンは、蛋白質コード化能力を測定するために順番
に配列する。ひと上皮小体ＲＮＡのノーザンブロット分
析は、特異的クローンに対応する完全ｍＲＮＡのサイズ
の測定を可能にする。もし陽性クローンが完全な長さと
思われない場合、クローン化ｃＤＮＡは、完全ｃＤＮＡ
のための上皮小体ｃＤＮＡライブラリーをふるい分ける
ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。
【０１６９】種々の細胞系で、内因性機能性受容体のた
めの連結外因性発現受容体が可能である。これらの細胞
系の多く（例えばＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＧ１１
５、ＣＨＯ、ＨＥＫ、２９３およびＣＯＳ７）が内因性
Ｃａ2+受容体を欠いていることを確認するために試験で
きる。外部のＣａ2+への反応を欠いたこれらの系は、ク
ローン化Ｃａ2+受容体を発現する安定した形質導入細胞
の確立に使用できる。
【０１７０】発現クローニングにより同定されたＣａ2+
受容体ｃＤＮＡクローンの配列分析は、受容体蛋白質を
コード化する開放読み取り枠の範囲を決める。ｃＤＮＡ
のコード化領域は、真核発現ベクターｐＭＳＧの多重ク
ローニング部位にサブクローン化される。このベクター
はマウス乳房癌ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーターによ
り引き離された高レベルの転写を可能にし、広範囲の哺
乳類細胞で活性である。本ベクターは、ＳＶ４０初期プ
ロモーターの制御下にあるミコフェノール酸に対する耐
性のために、ｇｐｔ遺伝子、および細菌の選択および成
長に必要な配列を含む。大量の発現ベクター／受容体ｃ
ＤＮＡプラスミド構築物は成長させ、エシェリキア・コ
リから精製される。
【０１７１】真核細胞系へのプラスミドＤＮＡの形質導
入の最も効果的な方法は、与えられる細胞系により変化
する。Ｃａ2+受容体発現構築物は適当な技術、Ｃａ2+リ
ン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質導入、リポフェ
クションまたはエレクトロポレイションのいずれかによ
り培養細胞へ挿入される。形質導入工程に続き、細胞を
抗生物質Ｇ４１８の存在下で、ネオマイシン耐性遺伝子
を発現する細胞を選択するために生育させる。Ｇ４１８
耐性形質導入体のコロニーはサブクローン化され、独立
細胞系として確立される。Ｇ４１８耐性細胞中のＣａ2+
受容体蛋白質の発現は、数種の方法により評価される。
サザンブロットおよびスロットブロット分析により、受
容体ｃＤＮＡの存在およびコピー数を確認する。ノーザ
ンブロット分析は、受容体ｍＲＮＡがプラスミド構築物
から複写されたものであるという証明に使用される。受
容体蛋白質の機能的発現は外部投与Ｃａ2+受容体アゴニ
ストに反応する細胞内Ｃａ2+の流動化の測定により決定
される。
【０１７２】Ｃａ2+受容体のクローニングは、本新規受
容体の構造的および機能的研究の両方を可能にする。組
み換えて産生された受容体は構造研究のために結晶化さ
れ得る。本受容体を発現する安定形質導入細胞系は、天
然産物または他の化合物ライブラリーの高処理量スクリ
ーニングに使用できる。必須の効果および特異性をもつ
分子は（放射活性的または蛍光的に）標識できる。試験
分子／抽出物のこのような標識分子を表す能力は、スク
リーニング用の高処理量測定の基本を形成する。
【０１７３】他のカルシウム受容体を発現する適当な細
胞または組織があるとすれば、これらの受容体は上皮小
体細胞カルシウム受容体の製造として上記したのと類似
の方法でクローン化し得る。例えば、ひと破骨細胞腫組
織由来のｍＲＮＡは破骨細胞カルシウム受容体をコード
化する。したがって、ひと破骨細胞受容体のクローンを
単離するためには、上記のように、破骨細胞腫組織由来
のｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡライブラリーの製造および
測定／分画化サブプールのみが必要である。さらに、薬
剤スクリーニングのために好ましい受容体は、ひと起源
のものである。ある種のカルシウム受容体をコード化す
るクローンは、対応するひとｃＤＮＡクローンを当分野
の技術者には既知の交差ハイブリダイゼーションで得る
ために使用し得る。さらに、上皮小体細胞または他の細
胞Ｃａ2+受容体のクローンは他の同種の細胞のＣａ2+−
感受性蛋白質、コード化する遺伝子の単離およびこれら
の蛋白質の発現を可能にする。これは多くの方法で成し
遂げられる。Ｃａ2+受容体ｃＤＮＡをハイブリダイゼー
ションプローブとして使用したひとゲノム性ＤＮＡのサ
ザンブロット分析は、ゲノムをコード化する多くの関連
する配列を示唆する；種々の配列のハイブリダイゼーシ
ョンは、関係する配列間の相違割合を示唆する。これは
関係する受容体蛋白質をコード化する遺伝子の有効な数
についての情報を提供する。Ｃａ2+受容体ｃＤＮＡをプ
ローブとするノーザンブロット分析は、種々の同じまた
は関係する転写物が種々の組織に存在するかどうか決定
する。もし、上皮小体細胞Ｃａ2+受容体に関係する転写
物相同体が検出されれば、これらのｍＲＮＡのクローン
を、適当なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングまた
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のいずれかにより
得るのは、比較的簡単な事柄である。このようにして得
た新規受容体クローンは、卵母細胞中または形質導入細
胞系中の発現により機能的に評価される。細胞特異的Ｃ
ａ2+受容体を発現する形質導入細胞は、例えば卵母細胞
または傍糸球体細胞のＣａ2+−感受性機構に特異的に働
く分子に高処理量スクリーニングを提供し得る。
【０１７４】別法として、カルシウム受容体は、真核細
胞での発現によりクローン化できる。例えば、ｃＤＮＡ
ライブラリーが上皮小体ｍＲＮＡから製造され、真核発
現ベクター、ｐＣＤＮＡ１にクローン化できる。このラ
イブラリーからのサブプールは、ＣＯＳ７またはＨＥＫ
２９３細胞のような真核細胞へ形質導入でき、相対的に
高いレベルのコード化されたｃＤＮＡ配列の一時的な発
現がおこる。機能的カルシウム受容体クローンを形質導
入した細胞はカルシウム受容体を発現し、それは次にカ
ルシウム、ネオマイシンまたは他のカルシウム様化合物
により活性化できる。もし、細胞に最初に［Ｃａ2+］i
として蛍光指示薬を導入していれば、カルシウム受容体
の活性化により蛍光が増加する。したがって、カルシウ
ム受容体を含むライブラリーサブプールは、真核細胞へ
の形質導入に加えて、蛍光のカルシウムまたはカルシウ
ム様物質特異的増加の能力により同定される。この蛍光
は蛍光測定器または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ
Ｓ）を用いて測定できる。
【０１７５】別法として、Ｃａ2+受容体を、受容体に対
して産生したモノクローナル抗体を用いてクローン化で
きる。モノクローナル抗体は、特異的蛋白質の免疫親和
性精製において強力な道具を提供する。一度精製すれ
ば、限られたアミノ酸配列データを興味の対象の蛋白質
から得、完全ｃＤＮＡのクローンをふるい分けるための
オリゴヌクレオチド配列プローブを設計するのに使用さ
れる。
【０１７６】ハイブリドーマの製造のために、全ウシ上
皮小体細胞が免疫源として使用される。精製した分散さ
せた細胞が得られ、確立法にしたがって、生存細胞調製
品を適当なマウス種に腹腔内注入する。標準工程は免疫
する計画およびハイブリドーマの製造に従う。２段階ス
クリーニング法は、Ｃａ2+受容体を認識するモノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために使
用される。最初のふるい分けは、上皮小体細胞表面抗体
を認識するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マの同定に使用される。免疫化学的技術は、次に上皮小
体細胞の表面に結合したマウス抗体の存在のハイブリド
ーマ上清によるふるい分けに使用される。このふるい分
けは上皮小体組織の確定部位または初期培養の分散細胞
で行い得る。この測定技術は文献により確立されてい
る。
【０１７７】このふるい分けは、種々の細胞表面決定基
へのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同
定し、Ｃａ2+受容体に特異的なモノクローナル抗体はこ
れらの中の小さなサブセットを構成するだけであること
が予想される。Ｃａ2+受容体に結合するモノクローナル
抗体を同定するために、最初のふるい分け試験で陽性で
あったハイブリドーマ上清は培養上皮小体細胞のＣａ2+
アゴニストに対する反応の阻害能力を測定する。受容体
の細胞外領域に結合するある抗体は、配位子結合を阻害
または活性化すること、あるいは受容体活性化を妨害し
または影響を与えることが予期される。
【０１７８】両方のふるい分けで陽性であるモノクロー
ナル抗体は、ウェスタンブロット法、免疫沈降および免
疫組織化学により特徴付けされる。認識する抗原の大き
さおよびその組織分布の決定が可能となる。適当なモノ
クローナル抗体は、次にＣａ2+受容体蛋白質の、標準法
に従った免疫親和性クロマトグラフィーによる精製に使
用される。限られたアミノ酸配列決定に充分な蛋白質の
量が得られる。変性オリゴヌクレオチドプローブが次に
蛋白質配列情報を基にして設計される。これらのプロー
ブは、次に、Ｃａ2+受容体の完全長クローンのための上
皮小体ｃＤＮＡライブラリーのふるい分けに使用され
る。得られたクローンは、ＤＮＡ配列決定および卵母細
胞系および培養哺乳類細胞系での機能的発現により特徴
付けされる。
【０１７９】あるいは、抗体は、発現ライブラリー、例
えばλｇｔＩＩのｃＤＮＡライブラリーまたはその相等
物のふるい分け、これらの抗原的反応性蛋白質を発現す
るクローンの決定に使用される。
【０１８０】ファージ表示ライブラリーが、モノクロー
ナル抗体に代わってカルシウム受容体のクローンおよび
分析に使用されることは、当分野の技術者にはまた認め
られるであろう。これらのライブラリーで、抗体可変領
域またはランダムペプチドはファージ発現ベクターに、
抗体領域またはペプチドがファージ粒子の表面に表れる
ようにショットガンクローン化される。抗体領域または
ペプチドを示し、カルシウム受容体に高特異的結合であ
るファージは、これらの受容体を示す細胞（例えば上皮
小体細胞、Ｃ−細胞、破骨細胞等）に結合する。このよ
うなファージの多くが、これらの細胞に結合できるこれ
らのファージのみを選択するこれらの細胞型に対してふ
るい分けできる（カルシウム受容体に結合するファージ
を含む）。この方法中、ライブラリーの複合性は非常に
軽減できる。次に、モノクローナル抗体に対する上記の
ふるい分けは、カルシウム受容体結合抗体またはペプチ
ド領域を示す単離ファージに使用でき、これらのファー
ジは構造的同定およびクローニングの目的でカルシウム
受容体を単離するのに使用できる。このようなファージ
表示ライブラリーは市販されている（例えば、ストラタ
サイト、またはケンブリッジ・アンチボディー・テクノ
ロジー・リミテッド）。このようなカルシウム受容体−
結合特性をもつ組み換えファージは、種々のカルシウム
受容体分析においてモノクローナル抗体の代わりにまた
使用できる。このようなファージは、カルシウム受容体
におけるひとの治療の発展において構造的模範となるカ
ルシウム受容体に機能的結合できる有機化合物を同定す
る高処理量競合結合ふるい分けにもまた使用できる。
【０１８１】他の別法として、放射性配位子の受容体へ
の親和性交差架橋が受容体蛋白の単離に、１ レセプタ
ー バイオケミカル・メソドロジー、１６１、１９８４
にピリッヒおよびチュッツが記載しているように、使用
できる。放射性配位子の共有結合は、非特異的結合を除
去するためのさらなる洗浄を可能にする。例えば、細胞
内Ｃａ2+とＥＣ50が約１００ｎＭまたはそれ以下で流動
する高飽和性分子、例えば適当なアルギニンおよびチロ
シンのコポリマー（分子量＝２２Ｋ；アルギニン チロ
シン比＝４：１）は、 125Ｉでヨウ素化し、架橋する。
プロタミン類は、そのより小さなサイズのため、交差架
橋研究に好ましく、ドッタビオ−マーチンおよびラベ
ル、８７ アナリティカル・バイオケミストリー、５６
２、１９７８に記載されているように還元的アルキル化
され得る。
【０１８２】非特異的標識は、非標識多価カチオンとよ
び２価および３価カチオンの存在下交差架橋により最小
に保つ。これらの分子が高濃度の場合、標識と細胞表面
の非特異的相互作用は減少する。
【０１８３】使用 初期上皮小体機能亢進症（ＨＰＴ）は高カルシウム血症
および循環ＰＴＨのレベルの増加により特徴付けられ
る。ＨＰＴの主要な欠陥のうちの一つは上皮小体細胞
の、細胞外Ｃａ2+による負のフィードバック制御に対す
る感受性の減少であると思われる。したがって、初期Ｈ
ＰＴ患者由来の組織では、細胞外Ｃａ2+に対する「定
点」が右にずれ、そのため通常より高い細胞外Ｃａ2+濃
度がＰＴＨ分泌を抑制するために必要である。さらに、
初期ＨＰＴでは、細胞外Ｃａ2+濃度がたとえ高くても、
ＰＴＨ分泌抑制はしばしば部分的のみである。第２期
（尿毒症の）ＨＰＴでは、たとえＣａ2+が抑制するＰＴ
Ｈ分泌が通常の割合であっても、細胞外Ｃａ2+に対する
定点が同様に上昇していることが観察される。ＰＴＨ分
泌の変化は、［Ｃａ2+］iの変化に平行である：細胞外
Ｃａ2+−誘導［Ｃａ2+］i増加の定点は右にずれ、この
ような増加の度合は減少する。さらに、モノクローナル
抗体による組織の染色は、Ｃａ2+受容体が腺腫様および
過形成上皮小体細胞で減少していることを表す。
【０１８４】Ｃａ2+受容体は薬理学的介入のための不連
続の分子本体を構成する。細胞外Ｃａ2+の作用が類似ま
たは反対である分子は、初期および第２期ＨＰＴ両方の
長期管理に有益である。このような分子は、高カルシウ
ム血症状態単独では成し遂げ得ないＰＴＨ分泌抑制に必
要な付加刺激を提供する。細胞外Ｃａ2+より大きい効果
のこのような分子は、腺腫様組織で特に厄介であるＰＴ
Ｈ分泌の明白な非抑制可能因子を征服し得る。別にまた
は付加的に、このような分子は、ウシおよびひと腺腫症
上皮小体組織で長期の高カルシウム血症がｐｒｅｐｒｏ
ＰＴＨｍＲＮＡのレベルの抑制を示すように、ＰＴＨの
合成を抑制し得る。長期高カルシウム血症はまた上皮小
体細胞のイン・ビトロでの増殖をまた抑制し、したがっ
てカルシウム様物質は、第２期ＨＰＴで特殊的な上皮小
体細胞過形成の制限にもまた効果的であり得る。
【０１８５】他の体細胞は、直接細胞外Ｃａ2+濃度の物
理的変化に反応できる。甲状腺内小胞周辺細胞（Ｃ−細
胞）からのカルシトニン分泌は、細胞外Ｃａ2+の濃度の
変化により調節される。腎臓傍糸球体細胞からのレニン
分泌は、ＰＴＨ分泌のように、細胞外Ｃａ2+の濃度の増
加により抑制される。細胞外Ｃａ2+は、これらの細胞の
細胞内Ｃａ2+流動を生じさせる。単離破骨細胞は、細胞
内Ｃａ2+流動からある程度生じた［Ｃａ2+］iの増加に
対応する細胞外Ｃａ2+の濃度を増加させる反応をする。
破骨細胞での［Ｃａ2+］iの増加は、上皮小体細胞にお
けるＰＴＨ分泌と類似の機能的反応（骨の吸収による除
去）を阻害する。したがって、Ｃａ2+は、その細胞内信
号としての偏在的役割に加えて、ある特異的細胞の反応
を制御する細胞外信号としてまた機能するという示唆を
する充分な徴候がある。本発明の分子は、これらの細胞
での崩壊したＣａ2+反応に関連する疾病の処置に使用で
きる。
【０１８６】上皮小体細胞および他の細胞のＣａ2+受容
体のクローニングは、直接評価すべき他の細胞中の相同
蛋白質の存在を可能にする。構造的に相同なＣａ2+受容
体蛋白質の群は、このように得ることができる。このよ
うな受容体は、これらの細胞がどのようにこれらの細胞
が細胞外Ｃａ2+を検出するかの理解を可能にし、本明細
書に述べたＨＰＴ、骨粗鬆症および高血圧の処置に有効
な治療の活性部位としての機構の評価および他の骨およ
び鉱物関連疾患の新規療法を可能にする。
【０１８７】他の使用は上記した。例えば、組み換えＣ
ａ2+受容体蛋白質は療法に使用され、標準法、例えばこ
の蛋白質をコード化する核酸の形質導入により導入され
る。さらに、このような蛋白質は本発明のカルシウム様
分子の測定に有用である。
【０１８８】下記の実施例は、範囲を限定することなく
本発明を説明する。
【０１８９】
【実施例】本明細書に記載の研究で、種々の有機分子が
上皮小体細胞において細胞内Ｃａ2+を流動させることお
よびＰＴＨ分泌を抑制することが分かった。これらの分
子は構造的には多様であるが、多くが生理学的ｐＨで正
味の陽電荷をもつ。有機化合物のカチオン性の性質は有
用な役割を担うが、活性決定における唯一の因子ではな
い。
【０１９０】実施例１：ウシ上皮小体細胞におけるカル
シウム様分子のスクリーニング 分離したウシ上皮小体細胞をバーコール勾配で精製し、
一晩血清非存在培地で培養した。細胞を連続してｆｕｒ
ａ−２と共に導入し、遊離細胞内Ｃａ2+濃度を蛍光的に
測定した。［Ｃａ2+］iの変化はＣａ2+受容体に活性な
分子のふるい分けに使用した。カルシウム様とみなすた
め、分子は細胞外Ｃａ2+の増加による通常の効果を示
し、Ｃａ2+受容体の活性化により誘因されることが必要
であった。 １）分子は、細胞外Ｃａ2+の非存在下持続する［Ｃ
ａ2+］iの増加を引き出さねばならない（細胞内Ｃａ2+
の流動の証明）： ２）分子は、百日咳毒素により阻止されるイソプロテレ
ノール−刺激されたサイクリックＡＭＰ形成減少を生じ
させなければならない： ３）分子は濃度と同等の範囲で、［Ｃａ2+］i増加を生
じさせるＰＴＨ分泌を阻害しなければならない：および ４）Ｃａ2+およびＰＴＨ分泌に対する分子の濃度反応曲
線はフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の
ようなＰＫＣ活性化剤で右に移動しなければならない。
【０１９１】分子のいくつかの構造的に異なる群を試験
した：ポリアミン類、アミノグリコシド抗生物質、プロ
タミンおよびリジンまたはアルギニンポリマー類。これ
らの分子の構造は図１−６に描く。図１−６に含まれる
ものは、その分子の正味の陽電荷、ウシ上皮小体細胞の
細胞内Ｃａ2+流動の誘導に対するＥＣ50である。
【０１９２】一般に、分子の正味の陽電荷が大きければ
大きいほど、その細胞内Ｃａ2+流動を生じさせる有効性
は高い。しかしながら、この見かけの規制に対するいく
つかの著しい例外が、下記のように発見された。
【０１９３】図から見られるように、スペルミン、ネオ
マイシンＢおよびプロタミンはｆｕｒａ−２−導入ウシ
上皮小体細胞において［Ｃａ2+］iの急速で一時的な増
加を誘導する（図１１、１２、１７）。しかしながら、
それらは、ひと上皮小体細胞ではなるが（図２５）、ウ
シ上皮小体細胞では充分な［Ｃａ2+］iの定常増加を生
じさせない（図１１、１７）。この点で、それらは、ウ
シ細胞における細胞外Ｍｇ2+により誘導され、細胞外Ｃ
ａ2+の流入を伴わない細胞内Ｃａ2+の流動化を生じさせ
る細胞質ゾルのＣａ2+反応に似ている（図１７ｂ）。ス
ペルミン、ネオマイシンＢまたはプロタミンにより誘導
された［Ｃａ2+］iの一時的な増加は、低濃度（１μ
Ｍ）のＬａ3+またはＧｄ3+で阻止されない（図１７ｆ、
ｇ）。多価カチオン分子により誘導された細胞質ゾルの
Ｃａ2+過渡現象は細胞外Ｃａ2+の不存在下で持続した
が、Ｃａ2+の細胞蓄積がイノマイシンによる前処置で枯
渇した場合阻止された（図１２：１７ｈ、ｉ）。これら
のすべての分子は、したがって上皮小体細胞で細胞内Ｃ
ａ2+流動を生じさせる。
【０１９４】多価分子は細胞内Ｃａ2+の、細胞外Ｃａ2+
により使用されるのと同じプールを流動化することを加
えて示唆した。したがって、細胞外Ｃａ2+の濃度の増加
は、スペルミンにより誘導された［Ｃａ2+］iの一時的
な増加を進歩的に阻害する（図１１）。逆に、スペルミ
ンまたはネオマイシンＢの最大に有効な濃度は（図７）
過渡現象を阻止するが、細胞外Ｃａ2+により誘導された
［Ｃａ2+］iの定常増加ではない。
【０１９５】重要には、スペルミン、ネオマイシンＢお
よびプロタミンはＰＴＨ分泌を細胞外Ｃａ2+と同程度阻
害した。これらの分泌における阻害効果は、細胞内Ｃａ
2+の流動化を生じさせる濃度で得られた（図１３、１
４、１９）。これらの発見は、細胞外Ｃａ2+によるＰＴ
Ｈ分泌の抑制に寄与した機構の理解に関連する。種々の
無機多価カチオンがすべて分泌を阻害するため、細胞外
Ｃａ2+のみが依然として持続した、［Ｃａ2+］iの定常
増加を生じさせ、このような［Ｃａ2+］iの増加は分泌
の制御に重大に含まれることはできない。細胞外Ｃａ2+
流入よりむしろ細胞内Ｃａ2+の流動が、ＰＴＨ分泌抑制
に関連する本質的な機構である。これは分子がＰＴＨに
影響がある場合、影響される充分な機構を定義するた
め、重要である；分子刺激選択的細胞外Ｃａ2+流入は、
ＰＴＨ分泌抑制には比較的効果がない。比較して、単に
Ｃａ2+流動を生じさせる分子は、ＰＴＨ分泌抑制におい
て細胞外Ｃａ2+と全く同程度に有効である。
【０１９６】細胞外Ｃａ2+により誘導される細胞内Ｃａ
2+流動化のように、多価カチオン分子により誘導される
ものはＰＭＡにより抑制された。スペルミンで誘導され
る細胞質ゾルＣａ2+過渡現象のＰＭＡによる優先的阻害
効果を示す代用的な実験は、図２０に示す。ＡＴＰによ
り誘導された細胞質ゾルＣａ2+過渡現象は、ＡＴＰのほ
とんど最大濃度を使用した場合でさえ、効果がなかっ
た。多価カチオンにより誘導された細胞質ゾルＣａ2+過
渡現象におけるＰＭＡの効果はその細胞外Ｃａ2+に対す
る反応への影響と平行であった：両方の場合、濃度反応
曲線が右へ移動した（図２１）。ＰＭＡの［Ｃａ2+］i
における抑制的効果は、高濃度の有機多価カチオンで征
服された分泌における効力を高める効果に付随した（図
２２）。
【０１９７】多価カチオン分子により誘導された細胞内
Ｃａ2+の流動は、イノシトールリン酸の形成の増加と関
連があった。例えば、プロタミンはＩＰ1レベルの増加
に付随したＩＰ3の形成の急速（３０秒以内）増加を生
じさせた。これらの両方の効果は、細胞外プロタミンの
濃度に依存した（図２３）。さらに、ＰＭＡによる前処
理は、多価カチオン分子により誘導されるイノシトール
リン酸の形成を鈍らせた。スペルミンで得られた代表的
な結果は図２４に示す。
【０１９８】スペルミン、ネオマイシンＢおよびプロタ
ミンは、イソプロテレノール−誘導サイクリックＡＭＰ
増加を抑制した。分子細胞外Ｃａ2+のサイクリックＡＭ
Ｐ形成に対する阻害効果のように、多価カチオン分子に
より誘導されるそれは、百日咳毒素との前処置により阻
止された（表２）。
【０１９９】
【表２】 サイクリックＡＭＰ（制御％） 対照 ＋ＰＴｘ ０．５ｍＭＣａ2+ １００ １０６±８ ２．０ｍＭＣａ2+ １９±４ ９４±２ ０．５ｍＭＣａ2+＋２００μＭスペルミン ２３±５ ９３±６ ０．５ｍＭＣａ2+＋３０μＭネオマイシンＢ ２８±７ ８７±６ ０．５ｍＭＣａ2+＋２μｇ／ｍｌプロタミン ２０±７ ８９±９
【０２００】百日咳毒素（ＰＴｘ）は、細胞外Ｃａ2+お
よびサイクリックＡＭＰ形成における多価カチオンの阻
害効果を阻止する。ウシ上皮小体細胞は、１６時間１０
０ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素存在下または非存在下で培養
した。細胞を次に洗浄し、１５分間、指示量の細胞外Ｃ
ａ2+または多価カチオン分子存在下または非存在下で１
０μＭのイソプロテレノールと共にインキュベーション
した。全サイクリックＡＭＰ（細胞＋上清）はＲＩＡに
より測定し、結果は０．５ｍＭＣａ2+（１１２±１７ｐ
ｍｏｌ／１０6 細胞）で得られたレベルの割合で示す。
それぞれの値は３回の実験の平均±ＳＥＭである。
【０２０１】ひと上皮小体細胞では、細胞外Ｍｇ2+が、
持続する、定常［Ｃａ2+］i増加を急速一過性増加に加
えて誘導した（図１６）。ウシ上皮小体細胞が細胞外Ｃ
ａ2+に反応するように、ひと上皮小体細胞におけるＭｇ
2+誘導［Ｃａ2+］i定常増加は、電圧非感受性チャンネ
ルを経由したＣａ2+の流入による結果である（図１６
ａ）。このひと上皮小体細胞での［Ｃａ2+］i定常増加
におけるＭｇ2+の効果は、腺腫様および過形成組織の両
方で見られた。
【０２０２】ネオマイシンＢおよびスペルミンで、腺腫
様組織から調製したひと上皮小体細胞における［Ｃ
ａ2+］iの効果を試験した。ネオマイシンＢにおける代
表的な結果は図２５に示す。ネオマイシンＢは、ひと上
皮小体細胞で［Ｃａ2+］iの過渡現象だけでなく、加え
て定常増加を生じさせた（図２５ａ）。したがって、ひ
と細胞では、細胞外Ｃａ2+、Ｍｇ2+またはネオマイシン
Ｂにより誘導される［Ｃａ2+］iの変化の様子は非常に
類似である。
【０２０３】ネオマイシンＢにより誘導される細胞質ゾ
ルＣａ2+過渡現象は、Ｌａ3+（１μＭ）の存在下および
細胞外Ｃａ2+の非存在下で持続した。ネオマイシンＢ
は、したがって、ひと上皮小体細胞における細胞内Ｃａ
2+流動を生じさせる。ネオマイシンＢは細胞内Ｃａ2+の
流動を生じさせる濃度でひと上皮小体細胞のＰＴＨ分泌
を阻害した（図１９）。しかしながら、ひとおよびウシ
上皮小体細胞のネオマイシンＢに対する反応においてあ
る違いが存在した。細胞内Ｃａ2+流動に対するネオマイ
シンＢのＥＣ50は、ウシ上皮小体細胞では４０μＭおよ
びひとのでは２０μＭであり（図１９および２１参
照）、一方スペルミンの有効性はひとおよびウシ上皮小
体細胞で類似であった（ＥＣ50＝１５０μＭ）。したが
って、ウシ細胞では分子の活性化試験のふるい分け研究
に使用できるが、ひと上皮小体を用いた追跡研究を行う
ことが重要である。
【０２０４】Ｃ−細胞における多価カチオン分子の効果
を評価するために、ラット脊髄の甲状腺腫瘍（γＭＴＣ
６−２３細胞）由来の腫瘍性細胞を使用した。スペルミ
ン（１０ｍＭ）およびネオマイシンＢ（５ｍＭ）の両方
とも、これらの細胞で基底［Ｃａ2+］iに効果はなかっ
た。両方の分子のいずれも、細胞外Ｃａ2+の連続添加に
おける反応に効果はなかった。ネオマイシンＢの効果を
欠いたことを報告する代表的な結果を図２７に示す。ネ
オマイシンＢ（１ｍＭ）またはスペルミン（１または５
ｍＭ）は、破骨細胞で［Ｃａ2+］iのいかなる増加の誘
導に失敗した（図２９）。記録が示すように、細胞外Ｃ
ａ2+の連続した濃度の増加にある効果があるように見え
るが、これは一貫した発見ではない。他の２番目の細胞
で、スペルミン（５μＭ）は再び基底［Ｃａ2+］iに影
響がなく、細胞外Ｃａ2+誘導［Ｃａ2+］i増加の僅かな
阻害（約１５％）を生じさせた。３番目の細胞で、ネオ
マイシンＢは基底［Ｃａ2+］iに影響がなく、細胞外Ｃ
ａ2+誘導［Ｃａ2+］i増加に影響はなかった。これらの
研究から発展した相対的な状況は、スペルミンおよびネ
オマイシンＢが、破骨細胞の細胞質ゾルＣａ2+のレベル
の基底または刺激レベルにおいて効果がないことであ
る。
【０２０５】Ｃ−細胞または破骨細胞に対する多価カチ
オンのＣａ2+−感受性機構の影響の欠損は、上皮小体細
胞Ｃａ2+受容体に特異的に働く、あるいは［Ｃａ2+］i
に対する上皮小体の正常な反応の１個またはそれ以上の
機能を変える新規先駆物資の発見または設計の能力を証
明する。
【０２０６】種々の他の分子のスクリーニングは下記に
詳述し、結果を表１に要約する。
【０２０７】実施例２ ポリアミンのスクリーニング 直鎖ポリアミン（スペルミン、スペルミジン、ＴＥＴ
Ａ、ＴＥＰＡおよびＰＥＨＡ）および２つのそれらの誘
導体（ＮＰＳ３８１およびＮＰＳ３８２）を実施例１と
同様にスクリーニングする。これらの分子はすべてウシ
上皮小体細胞中の細胞間Ｃａ2+を可動化させることが判
明した。それらの効力のオーダーは以下の通りであり、
そのネット正電荷を括弧内に示す。
【０２０８】
【表３】 分 子 ＥＣ50（μＭ） ＮＰＳ ３８２（＋８） ５０ ＮＰＳ ３８１（＋１０） １００ スペルミン （＋４） １５０ ＰＥＨＡ （＋６） ５００ スペルミジン （＋３） ２０００ ＴＥＰＡ （＋５） ２５００ ＴＥＴＡ （＋４） ８０００
【０２０９】プトレッシン（＋２）およびカダベリン
（＋２）は２ｍＭで不活性である。
【０２１０】別の直鎖ポリアミン、ＤＡＤＤは他のポリ
アミンとやや異なる挙動を示し、実施例７に記載する。
【０２１１】実施例３ ２つの環式ポリアミン、ヘキササイクレンおよびＮＰＳ
３８３を実施例１と同様にスクリーニングする。ヘキサ
サイクレン（＋６、ＥＣ50＝２０μＭ）はＮＰＳ３８３
（＋８、ＥＣ50＝１５０μＭ）よりも７倍より有効であ
る。この正反対の結果は、Ｃａ2+レセプター活性の構造
的特徴としてのネット正電荷のみに基づくようである。
【０２１２】実施例４ アミノグリコシド抗生物質スクリーニング ６つの抗生物質を実施例１と同様にスクリーニングす
る。細胞間Ｃａ2+の可動化につき得られたＥＣ50（効力
のランクオーダー）は以下のとおりである。
【０２１３】
【表４】 抗生物質 ＥＣ50（μＭ） ネオマイシン （＋６） １０ ゲンタマイシン （＋５） １５０ ベカナマイシン （＋５） ２００ ストレプトマインシ（＋３） ６００
【０２１４】カナマイシン（＋４．５）およびリンコマ
イシン（＋１）は濃度５００μＭで有効ではなかった。
アミノグリコシド系内では、ネット正電荷と効力の間で
相関関係がある。しかし、ネオマイシンは正電荷が等し
いかまたはより大きな種々のポリアミン（ＮＰＳ３８
１、ＮＰＳ３８２、ＮＰＳ３８３、ＰＥＨＡ）よりも著
しくより有効である。
【０２１５】実施例５ ペプチドおよびポリアミノ酸のスクリーニング プロタミンおよびペプチド長さを変化させたリシンまた
はアルギニンのポリマーを、実施例１と同様にスクリー
ニングして、それらの細胞間Ｃａ2+可動化能力を調べ
た。細胞間Ｃａ2+の可動化につき得られたＥＣ50（効力
のランクオーダー）は以下のとおりである。
【０２１６】
【表５】 ペプチド（ＭＷ／ＫＤ） ＥＣ50（ｍＭ） ｐｏｌｙＡｒｇ （１００） ４ ｐｏｌｙＡｒｇ （４０） １５ ｐｏｌｙＬｙｓ （２７） ３０ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ （４．８） ７５ ｐｏｌｙＡｒｇＴｙｒ（２２） ２００ ｐｏｌｙＬｙｓ （１４） １０００ ｐｏｌｙＬｙｓ （３．８） ３０００
【０２１７】これらポリマーのネット正電荷はＭｗの増
加につれて増加した。すなわち、ポリアミノ酸のこの系
列のうち、アミノグリコシドについては、ネット正電荷
と効力の間に直接的な相関関係がある。プロタミンはネ
ット正電荷＋２１を有する実質的にｐｏｌｙＡｒｇであ
る。
【０２１８】実施例６ アリルアルキルアミンのスクリーニング 毒液およびクモから得られたアリルアルキルアミン毒物
の部類から選択された分子を実施例１のようにスクリー
ニングする。
【０２１９】フィルアントトキシン−４３３（＋３）は
濃度５００μＭで有効ではない。これは、以下に記載の
アルギオトキシンと類似の構造である。
【０２２０】アルギオトキシン−６３６（４００μＭ）
は［Ｃａ2+］iの増加を惹起しないが、細胞間Ｃａ2+の
その後の添加に対するサイトゾルＣａ2+応答には有効で
ある。これは、Ｃａ2+レセプターを活性化する分子すべ
てに共通の特徴であり、種々の細胞間２価カチオンにつ
いて見られる。これに関し、実施例７で詳細に考察す
る。
【０２２１】アルギオトキシン−６３６に対し、アルギ
オトキシン−６５９は［Ｃａ2+］iの増加を惹起し、Ｅ
Ｃ50３００μＭを示す。アルギオトキシン−６５９はジ
ヒドロキシフェニル基よりもむしろヒドロキシル化イン
ドールを有する点で、アルギオトキシン−６３６と相異
する。これは、２つのこれら分子の唯一の構造上の相異
である。すなわち、効力の相異は芳香族基の特性におい
て存在し、正電荷を担持するポリアミン鎖においてでは
ない。
【０２２２】実施例７ Ｃａ2+通路遮断剤のスクリーニング Ｃａ2+通路遮断剤、すなわち細胞外Ｃａ2+の電圧感受性
Ｃａ2+通路を介する流入を遮断する。これらの分子を実
施例１のようにスクリーニングする。３つの構造的分類
のＣａ2+通路遮断剤が存在する（１）ジヒドロピリジン
（２）フェニルアルキルアミン（３）ベンゾチアジピ
ン。
【０２２３】テストしたジヒドロピリジン（ニフェジピ
ン、ニトレンジピン、ＢＡＹ Ｋ８６４４および（−）
２０２−７９１および（＋）２０２−７９１）は、１μ
Ｍでテストした場合に細胞外Ｃａ2+によって誘発される
［Ｃａ2+］iの増加または基本的な［Ｃａ2+］iに対する
効果を、全く示さない。従来の研究が示すように、上皮
小体細胞は電圧感受性Ｃａ2+通路を欠いているが、Ｃａ
2+レセプターによって規制される電圧非感受性Ｃａ2+通
路を有している。
【０２２４】調べたフェニルアルキルアミンは、ベラパ
ミル、Ｄ−６００（ベラパミルのメトキシ誘導体）、Ｔ
ＭＢ−８、およびＴＭＢ−８の周族体、ＮＰＳ３８４で
ある。最初の３つの分子を濃度１００μＭでテストす
る。フェニルアルキルアミンは調べた他の分子とは異な
る挙動を示す。これらは、低濃度の細胞外Ｃａ2+（０．
５ｍＭ）含有緩衝剤中に浸した細胞に添加しても［Ｃａ
2+］iの変化を全く示さない。しかし、ベラパミル、Ｄ
−６００およびＴＭＢ−８は、細胞外２価カチオンによ
って惹起された細胞間Ｃａ2+の可動化を可能にさせ、ま
たこれらは付加的に細胞外Ｃａ2+の流入を遮断する。中
間的なレベルの細胞外Ｃａ2+（１〜１．５ｍＭ）では、
これら分子は誘発はわずかであるが、細胞間Ｃａ2+の可
動化から生じる［Ｃａ2+］iの増加は強力である。
【０２２５】フェニルアルキルアミンはネオマイシンの
ような有機ポリカチオンとは異なった作用を示す。デー
タの示唆するところによれば、ベラパミル、Ｄ−６００
およびＴＭＢ−８はＣａ2+レセプターにおいて部分的な
アゴニストであり、これは、調べた他の部分的が完全な
アゴニストであることと対照的である。
【０２２６】部分的ＮＰＳ３８４（濃度３００μＭ）は
［Ｃａ2+］iの増加を誘発しないが、細胞外Ｃａ2+の流
入を遮断する。高濃度でのテストは細胞間Ｃａ2+の可動
化を引き起こす当該分子の能力を示す。
【０２２７】流入を遮断するこれら分子の能力は興味深
いが、意外ではなく、一方、細胞間Ｃａ2+可動化から生
じる重要な［Ｃａ2+］iの一時的な増加を誘発すること
が、これら分子の能力である。上皮小体細胞における
［Ｃａ2+］iの測定による相当な数の実験の示すよう
に、一時的な［Ｃａ2+］iの増加は、ほぼ不変的に細胞
間Ｃａ2+の可動化に起因し、そのためＣａ2+レセプター
の活性化を示す。
【０２２８】調べたベンゾチアジピン、ジルチアゼムは
全ての点でベラパミルに類似し、またＤ−６００もまた
１００μＭで有効である。
【０２２９】注意すべきは、フェニルアルキルアミンを
除き、前記でテストした活性分子はすべて［Ｃａ2+］i
の増加を誘発し、これは、最大有効濃度の細胞外Ｃａ2+
により誘発されるものと同様に、最大である。これは、
かかる分子が細胞外２価カチオンと同様な効力を有する
ことを示す。またこれは、部分的なアゴニストとしての
み作用するようであるフェニルアルキルアミンの活性と
対照的である。
【０２３０】フェニルアルキルアミンのうち、興味深い
構造−活性関係を示すものがある。ＴＭＢ−８およびＮ
ＰＳ３８４のような分子の異なる効力は重要である。Ｔ
ＭＢ−８は［Ｃａ2+］iの一時的な増加を１００μＭで
可能にし、一方ＮＰＳ３８４は３００μＭでもさえもか
かる増加させないが、これら分子は同じネット正電荷を
担持する。以下に、ネット正電荷とは無関係なある種の
他の構造的特徴がより大きな効力をＴＭＢ−８に付与す
ることを説明する。
【０２３１】実施例８ ヒト上皮小体細胞に対する分子スクリーニング スペルミンおよびネオマイシンを、外科手術により取り
出した上皮小体から得る実施例１のように調製したヒト
上皮小体細胞における［Ｃａ2+］iの効果について、テ
ストする。ヒト上皮小体細胞において、スペルミンは、
濃度３００μＭでテストすると［Ｃａ2+］iのわずかな
増加のみを引き起こすことが判明した。
【０２３２】他方、ネオマイシンは、濃度２０μＭでテ
ストするとヒト上皮小体細胞において［Ｃａ2+］iの大
きな増加を誘発する。ネオマイシンにより惹起された応
答の最大は、最大有効濃度の細胞外Ｃａ2+により誘発さ
れるものと同様である。
【０２３３】実施例９ キセノプス・オーシテス（Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｏｏｃｙｔ
ｅｓ）についての分子スクリーニング オーシテスは、ヒト上皮小体細胞からのｍＲＮＡを注入
すると、Ｃａ2+レセプターを発現させ、また種々の細胞
外無機２または３価カチオンに応答する細胞間Ｃａ2+を
可動化させる。このスクリーニングを用いると、Ｃａ2+
レセプターに対する直接的な作用をテストすることがで
きる。Ｃａ2+レセプターを発現させるオーシテスは、ま
た以下のようにスクリーニングすると、無傷の上皮小体
細胞についての数種の分子活性に応答する。ヘキササイ
クレンは濃度１３５μＭで細胞間Ｃａ2+の可動化を引き
起こす。ネオマイシン（１００μＭ）およびＮＰＳ３８
２（５μＭ）も有効である。これは、かなり強制的な形
跡であり、かかる分子がＣａ2+レセプターまたはその機
能と緊密に関係する数種の他のタンパクに対し作用する
ことを示す。
【０２３４】たとえば、本発明者らは45Ｃａ2+可動化の
測定によってオーシテスのＣａ2+レセプターの発現を検
知することができる。これらの実験において、オーシテ
スは、ウシ上皮小体ｍＲＮＡまたは水を注入し、７２時
間後、血清または１０ｍＭネオマイシンへさらす。刺激
前に、オーシテスに45Ｃａ2+を注入する。２０分間の血
清による刺激は、細胞間［Ｃａ2+］i放出をもたらし、
これは、緩衝剤による疑似抗原投与に比し４５％の増加
を示す。２０分間のネオマイシン１０ｍＭの抗原投与
は、［Ｃａ2+］i放出の７６％の増加をもたらす。当該
分析はＣａ2+レセプターのクローニングの使用に十分に
感受性を示し、Ｃａ2+活性化Ｃｌ電流の電気生理学的測
定よりも非常に大きな利点を有する。
【０２３５】別の実験では、ヒト破骨細細胞腫組織を、
骨生死鑑定組織から得た。オーシテスにこの細胞から単
離したｍＲＮＡを注入し、Ｃａ2+３０ｍＭを抗原投与す
る。対照は応答しない一方、破骨細細胞腫組織ｍＲＮＡ
を注入した１２のオーシテスのうち８は明白に応答する
（図４２）。これらの実験によれば、破骨細胞の細胞外
Ｃａ2+に対するＣａ2+応答は、事実遺伝学的にコード付
けされる。またこの結果によれば、破骨細胞Ｃａ2+レセ
プターはキセノプス・オーシテスにおける発現によって
クローニングすることができる。
【０２３６】実施例１０ ラット破骨細胞に対する分子スクリーニング 一方、細胞外Ｃａ2+に対する上皮小体細胞および破骨細
胞の種々の感受性の示唆するところによれば、それらの
Ｃａ2+レセプターは異なっている。上皮小体細胞は０．
５〜３ｍＭの間の濃度の細胞外Ｃａ2+に応答するが、破
骨細胞外は細胞外Ｃａ2+のレベルが５ｍＭを越えたとき
にのみ応答する。このかなり高いＣａ2+濃度は、それに
も拘わらず破骨細胞に対し生理学的である。なぜなら、
それらが破骨細胞に吸収されるからであり、局部的な細
胞外Ｃａ2+濃度は３０ｍＭもの高レベルに達しうる。
【０２３７】破骨細胞を用いる分子スクリーニングは以
下のようになされる。破骨細胞を新生児ラットの長い骨
から得る。［Ｃａ2+］iを単一の細胞においてフルオロ
メトリック・インジケーター・インド−１を用い測定す
る。スペルミン、スペルミジン、ネオマイシンおよびベ
ラパミルをテストしたが、これらは、破骨細胞において
大きな［Ｃａ2+］i増加を引き起こさない（わずか応答
は検知される）。
【０２３８】濃度１ｍＭでは、スペルミジンはわずかな
［Ｃａ2+］i増加を引き起こす（細胞外Ｃａ2+の最大濃
度で惹起される約１０％の増加）。ネオマイシン（１０
ｍＭ）またはスペルミン（１０または２０ｍＭ）はラッ
ト破骨細胞において［Ｃａ2+］i増加を引き起こさな
い。ネオマイシン（１０ｍＭ）は、２５ｍＭの細胞外Ｃ
ａ2+のその後の添加により惹起された［Ｃａ2+］i濃度
の増加を遮断しない。一方、スペルミン（２０ｍＭ）で
の予備処理は細胞外Ｃａ2+に対する応答を弱めた。ベラ
パミル（１００μＭ）は検知可能な［Ｃａ2+］i増加を
引き起こさないが、細胞外Ｃａ2+に対する応答を遮断す
る。
【０２３９】破骨細胞と上皮小体細胞の間の比較は、後
者に対するかかる分子の活性が破骨細胞において比較的
有効ではないことが示される。これは、他のＣａ2+感受
細胞上に存在するかかるレセプタータイプに影響を与え
ることなく特異的なＣａ2+レセプターを標的とする薬剤
を容易に開発できることを証明する。同様に、２または
それ以上のかかるＣａ2+レセプターにおいて活性な薬剤
も同様に開発することができる。
【０２４０】他のＣａ2+レセプターの実施例 以下の実験は、まさに分子リガンドのレセプター・サブ
タイプが存在するように、薬剤によって区別的に影響を
受けうるＣａ2+レセプターのサブタイプが存在すること
を証明する。上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターは細胞外Ｃ
ａ2+約１．５ｍＭのレベルで感受性を示す一方、破骨細
胞上のＣａ2+レセプターは約１０ｍＭのレベルに応答す
る（図２８）。上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターを活性化
するネオマイシンまたはスペルミンは、Ｃ−細胞または
破骨細胞上のＣａ2+レセプターに影響を与えない（図２
７および２９）。これらのデータは、Ｃａ2+レセプター
の薬学的に区別可能なサブタイプ存在についてのはじめ
ての証拠を構成し、またこれらのデータは特異的なタイ
プのＣａ2+レセプターに対し選択的に作用する薬剤の設
計および開発に使用することができる。事実、リード分
子のテストはかかる細胞特異的効果を証明する。たとえ
ば、ＮＰＳ４４９は、破骨細胞において［Ｃａ2+］iの
増加を惹起するが、破骨細胞において［Ｃａ2+］iに対
する効果はない。逆に、ＮＰＳ４４７は、上皮小体細胞
Ｃａ2+レセプターを活性化するが、１０倍もの高濃度で
のみ破骨細胞Ｃａ2+レセプターを活性化するのに有効で
ある。最後に、アガトキシン４８９は、Ｃ細胞Ｃａ2+レ
セプターの活性化には非常に有効とはいえないが（ＥＣ
50＝１５０μＭ）、上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターの活
性化剤として非常に有効である（ＥＣ50＝３μＭ）。現
在開発中のリード分子は、イン・ビボにおいてＣａ2+感
受性細胞の特異的なタイプの活性に選択的に影響を与え
る。
【０２４１】特異性が劣る薬剤は、必然的に治療的には
好ましくない。すなわち、破骨細胞活性の抑制およびカ
ルシトニン分泌の刺激は、骨再吸収の抑制のための２つ
の異なる方法である。これら両細胞のＣａ2+レセプター
を標的とする薬剤は、オステオポローシスに非常に有効
である。ＰＴＨはまた骨代謝の規制を包含するため、上
皮小体細胞Ｃａ2+レセプターに作用する薬剤は、またオ
ステオポローシスの治療および／または予防に有用であ
る。
【０２４２】数種のテスト分子の結果を以下に示す。表
６では、カルシウム様物質分子の比較テストを示す。ウ
シ上皮小体細胞およびＣ細胞（ｒＭＴ６−２３細胞）に
フラ−２を充填し、ラット破骨細胞にはインド−１を充
填したもので、表示した細胞間Ｃａ2+の可動化のための
分子の効力は、累積濃度−応答曲線の作成により決定す
る。
【０２４３】
【表６】 ＥＣ50（μＭ） 化合物 上皮小体 破骨細胞 Ｃ細胞 ＮＰＳ ５６８（ＥＥ） ０．７８ ２００ ＞３００ ＮＰＳ ５６８（ＬＥ） ３０ − − ＮＰＳ ４６７（ＥＥ） ２ ＞１００ − ＮＰＳ ４６７（ＬＥ） ＞３０ − − ＮＰＳ ０１７ ６ 不活性 １５０ ＮＰＳ ４４７ ９ １５０ − ＮＰＳ ４５６＊ １５ ２００ ＞１００ ＮＰＳ ０１５ ２２ − 不活性 ＮＰＳ １０９ ４０ ＞３００ ５ ＮＰＳ ４４９ 不活性 １５０ − ＮＰＳ ４６８＊ ３０ ２５０ − スペルミン １５０ 不活性 不活性ネオマイシン ４０ 不活性 不活性 注）＊：ラセミ混合物 不活性：濃度１〜５ｍＭにて細胞質ゾルＣａ2+の増加を全く引き起こさない ものと定義。 ＥＥ ：早期の溶出。 ＬＥ ：遅れた溶出。
【０２４４】実施例１１ 上皮小体Ｃａ2+レセプターのリード分子 ポリアミンおよびアリルアルキルアミンを用いる構造活
性の研究は、ＮＰＳ４５６に構造的類似の分子のテスト
につながる。ＮＰＳ４５６は上皮小体細胞Ｃａ2+レセプ
ターの有効なアクチベータである。この分子は、ただ１
つののみの正電荷を有するが多数のポリベーシック分子
よりもより有効であるので、特徴的である。短時間（２
分間）の、ＰＭＡによる予備処理はＮＰＳ４５６の濃度
応答曲線を右手に移行させる。これは、ＮＰＳ４５６が
細胞外Ｃａ2+により使用されるのと同じメカニズムを介
し作用することを示す。ＮＰＳ４５６は、上皮小体細胞
Ｃａ2+レセプター発現するキセノプス・オーシテスにお
ける細胞間Ｃａ2+の可動化を誘発し、これは、当該Ｃａ
2+レセプターに対する直接的な作用を証明する（図４
１）。加えてＮＰＳ４５６キラル炭素を含むため、２つ
の異性体形が存在する。両異性体を合成し、活性を調べ
た。Ｒ−異性体、ＮＰＳ４４７は、Ｓ−異性体、ＮＰＳ
４４８よりも１２倍より有効である（図３４）。これ
は、Ｃａ2+レセプターが有機分子を立体特異的な方法で
認識できる第１の証明である。
【０２４５】ＮＰＳ４４７は、構造的に単純な分子であ
るとともに上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターに対し選択的
で有効な作用を示すため、このリード分子に関する構造
活性の研究は単純である。これらの研究の目的は、そこ
から最終の開発候補を選択可能な種々の特性を有する関
連分子の配列を形成することである。この努力はすでに
活性および効力に貢献するＮＰＳ４４７の構造領域のい
くつかを開示する。たとえば、新規な化合物ＮＰＳ４５
９は小型（分子量＜２４０）であるがほぼペアレント分
子と同等な効力を有するＮＰＳ４４７の類似体である。
一方、幾つかの他の類似体は比較的不活性である。この
類似体プロジェクトから最も興味ある分子はイン・ビボ
中に入れてＰＴＨ分泌および血清Ｃａ2+レベルに対する
効果をテストする（実施例１５，１６，１７，１８，２
３参照）。
【０２４６】新規化合物ＮＰＳ４６７はＮＰＳ４４７よ
りもやや小型の分子であるが、前者は、上皮小体細胞に
おける細胞間Ｃａ2+の可動化を引き起こす点で、後者よ
りも約３倍より有効である。ＮＰＳ４５６と同様に、Ｎ
ＰＳ４６７はラセミ混合物である。ＮＰＳ４６７のその
鏡像体への分割がラセミ混合物よりもより大きな効力の
異性体を提供することは、予期されないことである（実
施例１６参照）。ＮＰＳ５５１は、上皮小体細胞におい
て細胞間Ｃａ2+の可動化を引き起こす点でＮＰＳ４６７
と同様な効力を示す、別の新規化合物である。ＮＰＳ５
５１はラセミ混合物で、ＮＰＳ５５１の分割がその鏡像
体への分割がラセミ混合物よりもより有効であることを
もたらすことは、予期されないことである。さらに、Ｎ
ＰＳ４４７、４６７、ＮＰＳ５５１、５６８に関連する
分子についての構造活性の研究は、それらのラセミ形の
分子よりもより有効である純粋な異性体を製造するもの
と、期待される。
【０２４７】ＮＰＳ４５６を用い得られた結果（図４
１）が示すように、それは濃度１００μＭでＣｌ- 電流
の振幅増加を誘発する。ＮＰＳ４５６は上皮小体細胞Ｃ
ａ2+レセプターを発現するキセノプス・オーシテスに対
する最も有効な分子アクチベータである。ネオマイシン
およびＮＰＳ４５６を用いるこの発現システムで得た結
果は、これらの分子がＣａ2+レセプターに対し直接作用
することを、証明する。
【０２４８】実施例１２ 破骨細胞Ｃａ2+レセプターリード分子 破骨細胞に対する細胞外Ｃａ2+の作用メカニズムを解明
すべく用いた方策は上皮小体細胞の有効性を証明するの
と同じである。第１実験はフルオリメトリック・インジ
ケータ・インド−１を充填した単一のラット破骨細胞に
おいて［Ｃａ2+］iに対するＬａ3+の作用を調べる。前
記のごとく、Ｌａ3+のように３価カチオンは一時的でＣ
ａ2+流入を遮断する。低マイクロモル濃度のＬａ3+は部
分的に［Ｃａ2+］iについての細胞外Ｃａ2+誘発増加を
抑制する（図３５）。［Ｃａ2+］iについてのＬａ3+抗
増加の証明は、細胞間Ｃａ2+の可動化の証拠を提供す
る。上皮小体細胞において得られたものと類似の実験の
結果は、同様なメカニズムを細胞外Ｃａ2+により用い、
両細胞タイプにおいて［Ｃａ2+］iを規制することを、
示唆する。
【０２４９】別の系列の実験は、細胞外Ｃａ2+の不存在
下に永続的な（図３７）細胞外Ｍｎ2+が［Ｃａ2+］iに
ついての一時的な増加（図３６参照）を誘発すること
を、示す。これらの結果は、細胞間Ｃａ2+の可動化を示
唆するものと同様である。Ｍｎ2+は、ある種の細胞内に
侵入できるが、破骨細胞におけるかかる挙動とは似てい
ない。なぜなら、Ｍｎ2+はインド−１蛍光を停止させる
からである。すなわち、Ｍｎ2+が細胞間に侵入すると、
減少、すなわち蛍光の増加は観察されない。
【０２５０】種々の２価または３価のカチオンの使用に
より得られた結果は、全て、細胞間Ｃａ2+の可動化およ
び細胞外Ｃａ2+の電圧感受性通路を介する流入とつなが
る破骨細胞の表面上のＣａ2+レセプターの存在と一致す
る。結果は、Ｃａ2+レセプタータンパクをコード付けす
るヒト破骨細胞における遺伝物質の証拠を示す（以下参
照）。細胞間Ｃａ2+の可動化を起因とする［Ｃａ2+］i
一時的な増加は、イン・ビトロにおいて破骨細胞の骨吸
収を抑制するのに充分である。すなわち、上皮小体細胞
を用いる場合のように、Ｃａ2+レセプターの活性化は破
骨細胞の活性を抑制する可変的な手段のようである。
【０２５１】ＮＰＳ４４９は現時点このレセプターのカ
ルシウム様薬剤のリード分子である。これは、小さな分
子（Ｍｗ＜４２５）で、細胞間Ｃａ2+をラット破骨細胞
においてＥＣ50２００μＭで可動化させる（図３８およ
び３９）。ＮＰＳ４４９の効力は比較的小さく、単純な
構造でただ１つの正電荷を有し、所望の薬理学および動
的薬理学特性を有するようである。
【０２５２】ＮＰＳ４４９をイン・ビトロにおいて骨吸
収を抑止するその能力について実験する。これは、走査
電子顕微鏡を用い、ウシ皮質骨の剥片のピット形成につ
いての生物形態分析により行う。ラット破骨細胞を２４
時間、骨剥片中にて、種々の濃度のＮＰＳ４４９の存在
または不存在下にインキュベートする。ＮＰＳ４４９Ｉ
Ｃ50１０μＭで骨吸収の濃度依存抑制を引き起こす。こ
の新規なサイトにおいて作用する分子は破骨細胞の骨吸
収を抑制できるというはじめての証明が、予期せぬ結果
として得る。ＮＰＳ４４９のより有効な類似体を合成化
学を用いて得、本明細書に記載の方法でテスト、分析す
る。
【０２５３】実施例１３ Ｃ細胞Ｃａ2+レセプター・リード分子 Ｃ細胞Ｃａ2+レセプターの活性化は、破骨細胞に作用し
て骨吸収を抑制するカルシトニンの分泌を刺激する。選
択的にＣ細胞に影響を与えるカルシウム様薬剤オステオ
ポロシスの治療に有用である。
【０２５４】細胞間Ｃａ2+の可動化をＣａ2+レセプター
活性の機能指数として用いる。Ｃ細胞のスクリーニング
作業は、Ｃ細胞表現型を発現する培養セルラインの利用
により促進することができる（たとえば、ラット延髄乾
酪癌細胞、ｒＭＴＣ ６−２３細胞）。３つのアルキル
アミン分子は初期の実験で選択される。天然のものは２
つ（アガトキシン４８９およびアガトキシン５０５）あ
り、他のもの（ＮＰＳ０１９）は合成類似体である。ア
ガトキシン５０５は、ＩＣ50＝３μＭで［Ｃａ2+］iに
ついてのＣａ2+誘発増加を抑制することが判明した。抑
制作用は、かかる細胞中に存在するＬタイプ電圧感受性
Ｃａ2+通過の遮断に起因する。これに対し、アガトキシ
ン４８９は、ｒＭＴＣ細胞における細胞間Ｃａ2+を可動
化させることが、判明した（ＥＣ50＝１５０μＭ）。こ
れは、Ｃ細胞Ｃａ2+レセプターを活性化することが判明
した、初めて開示される有機分子である。合成類似体、
ＮＰＳ０１９は、より有効で、細胞間Ｃａ2+を可動化さ
せる（ＥＣ50＝５μＭ）（図４０）。ＮＰＳ０１９とア
ガトキシン４８９の間の構造的な相異がヒドロキシ基を
有すか否かであるのみであることは、重要である。これ
は、Ｃａ2+レセプターの非常に有効で選択的なアクチベ
ータを開発できることを支持している。
【０２５５】ＮＰＳ０１９は小さな分子（Ｍｗ＜５０
０）であり、これは、Ｃ細胞Ｃａ2+レセプターのカルシ
ウム様物質の開発用のリード分子であり、イン・ビトロ
でカルシオニンを刺激するその能力をテストすることが
できる。その後、イン・ビボのテストはカルシオニン分
泌を刺激し骨吸収を抑制するこの分子の能力を決定す
る。これらイン・ビボの研究はラットで行う。これらの
研究で得られた結果は、予期せぬことで、これは、新規
なレセプターに作用する小さな有機分子がカルシオニン
分泌を刺激し骨吸収を抑制することを示すはじめての証
拠を提供する。
【０２５６】実施例１４ 上皮小体細胞に対するＮＰＳ０２１のカルシウム拮抗活
性 カルシウム拮抗であると思われる化合物について、細胞
外Ｃａ2+感受性細胞に対する細胞外Ｃａ2+の作用または
カルシウム拮抗化合物の作用を遮断せねばならない。カ
ルシウム拮抗化合物の具体例はＮＰＳ０２１で、その構
造を図１−６に示す。フラ−２を充填したウシ上皮小体
細胞において、細胞外Ｃａ2+により惹起されるＮＰＳ０
２１は［Ｃａ2+］iの増加を遮断する。この応答遮断の
ためのＮＰＳ０２１のＩＣ50は約２００μＭであって、
濃度約５００μＭで、細胞外Ｃａ2+により惹起された
［Ｃａ2+］iの増加は停止する。重要には、ＮＰＳ０２
１は、低［Ｃａ2+］（０．５ｍＭ、図６４）でテストす
ると、それ自体いずれの変化も引き起こさない。
【０２５７】実施例１５ ＮＰＳ４６７低下血清イオン化カルシウム イン・ビトロにおいてウシ上皮小体細胞Ｃａ2+レセプタ
ーを活性化することが証明された化合物を、イン・ビボ
において低カルシウム血症活性をテストした。雄性スプ
ラーグ・ドゥーリイ・ラット（２００ｇ）を、対照とし
てテスト物質または担体を与える前に、１週間、低カル
シウムの餌を与え続けた。血液を、ＮＰＳ４６７の腹腔
内投与ののち３時間後に尾静脈から採取した。全血液ま
たは血清中のイオン化Ｃａ2+を、チバ−コーニング６３
４アナライザーを用い、当該装置に付属の説明書に従
い、測定する。血清全カルシウム、アルブミンおよびホ
スフェートを常法で測定する。
【０２５８】ＮＰＳ４６７は、血清または全血液Ｃａ2+
の用量依存減少をもたらす（図６５）。この時点での血
液Ｃａ2+の減少は、血液全カルシウムレベルの比例的な
減少当該平行関係にある。調べた用量のいずれにおいて
も、血清アルブミンまたはホスフェートレベルの変化は
全くなかった。予備的な研究では、血中Ｃａ2+低下有効
用量でのＮＰＳ４６７は、ＰＴＨの循環レベルでの用量
依存減少をもたらす（図６６）。ＮＰＳ４６７の低カル
シウム血症効果は、３時間以内に最大となり、２４時間
後に対照レベルに戻る（図６７）。
【０２５９】ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体、実施例１６）
もまた、正常、カルシウム反復餌で維持したラットにお
いて血清イオン化Ｃａ2+の低下に有効である。ＮＰＳ４
６７（ＥＥ異性体、１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の単一用量
は、イオン化Ｃａ2+の血清レベルの急速な減少をもたら
す。かかるレベルは、１時間で最大となり（対照レベル
から２２％の減少）、６時間までこのレベル付近に抑制
される。
【０２６０】実施例１６ 立体特異的方法によるＮＰＳ４６７低下血清イオン化カ
ルシウム ＮＰＳ４６７はラセミ混合物である。その２つの鏡像体
へのＮＰＳ４６７の分割は、キラルカラムでの分割によ
り行った。ＥＥ異性体（早期溶出、実施例２１）は、Ｌ
Ｅ異性体（遅れた溶出）よりも約１００倍も有効であ
り、上皮小体細胞の［Ｃａ2+］i増加を誘発する当該鏡
像体の能力によって評価されるように（図６８）、イン
・ビトロにおいてウシ上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターを
活性化する。同様に、新規化合物ＮＰＳ５６８のその鏡
像体への類似の分割は、ＩＥ異性体よりも約４０倍有効
であり、細胞間Ｃａ2+の可動化をウシ上皮小体細胞にお
いてもたらす（前記表６参照）。
【０２６１】ＮＰＳ４６７異性体を実施例１５のように
血清Ｃａ2+に対する効果につき試験した。イン・ビボに
おける血清Ｃａ2+の低下に関しＬＥ異性体よりも有効で
あることが証明されたＥＥ異性体またはＮＰＳ４６７は
イン・ビトロの結果と一致する（図６９、各化合物は濃
度５ｍｇ／体重１ｋｇでテストする）。
【０２６２】実施例１７ ２次上皮小体こう進疾のビボ・モデルにおけるＮＰＳ４
６７低下血清イオン化カルシウム 広範に受け入れられ使用されている、慢性腎不全から生
じた２次上皮小体こう進疾の動物モデルは、５／６腎切
除のラットである。かかる手術を施した動物は、まず低
カルシウム血症にさせて血清Ｃａ2+レベルを維持する
と、上皮小体の代償性の過形成および循環ＰＴＨのレベ
ル向上が生じる。雄性スブラーグ・ドゥーリイ・ラット
（２５０ｇ）を５／６腎切除し、２週間回復させる。こ
の時点で、標準的なカルシウム血症である（血清ＰＴＨ
の上昇レベルによる）。ＮＰＳ４６７の投与は（ＥＥ異
性体、１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、２次上皮小体こう進疾
の動物モデルにおいて血清イオン化Ｃａ2+レベルの対照
の８３％への、急速な（２時間以内）低下をもたらす。
これは、以下のことを示唆する：この種の化合物は２次
上皮小体こう進疾および増殖性上皮小体を有する患者に
おいてＰＴＨ分泌を有効に抑制する。
【０２６３】実施例１８ 上皮小体切除動物における低下血清イオン化カルシウム
・レベルに対するＮＰＳ４６７フェイルス（Ｆａｉｌ
ｓ） 低カルシウム血症応答を引き起こすようにＮＰＳ４６７
が作用する一次標的組織を決定するため、ラットにおけ
る上皮小体を外科的に取り出す。上皮小体全体を切除し
た動物を低カルシウム血症にさせ、カルシウム餌に大き
く依存させて、血清Ｃａ2+ホメホスタシス状態に維持す
る。上皮小体削除動物は、６時間の絶食後、０．９２ｍ
Ｍレベルの血清イオン化Ｃａ2+を有し、これは０．７６
ｍＭに徐々に低下する。ＮＰＳ４６７ＥＥの単一用量の
投与（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）はいずれの変化も、
血清イオン化Ｃａ2+レベルにおいて、６時間の期間にわ
たり与えなかった。これらの結果は、無傷の上皮小体が
ＮＰＳ４６７ＥＥの低カルシウム血症効果に必要である
ことを証明する。データは付加的にＮＰＳ４６７はイン
ビボにおいて上皮小体を標的にすることができることを
証明する。結果は以下の見解に一致する：ＮＰＳ４６７
ＥＥはインビボにおいて上皮小体細胞Ｃａ2+レセプター
に対し作用してＰＴＨの分泌を抑制し、これによりイオ
ン化Ｃａ2+の血清レベルを低下させる。
【０２６４】実施例１９ ヒト上皮小体におけるＮＰＳ４６７増加細胞間カルシウ
ム 解離上皮小体細胞を、一次上皮小体こう進疾を有する患
者から外科手術で得た上皮小体アデノーマから調製す
る。細胞に、フラ−２を充填し、［Ｃａ2+］iを前記よ
う測定した。ＮＰＳ４６７ＥＥおよびＮＰＳ５６８ＥＥ
の両者は［Ｃａ2+］iの濃度依存増加をもたらす。ＮＰ
Ｓ４６７ＥＥおよびＮＰＳ５６８ＥＥのＥＣ50は各々２
０および３μＭである。これら両者の化合物は病理学的
ヒト組織において［Ｃａ2+］iを増加させることがで
き、一次上皮小体こう進疾の患者においてＰＴＨおよび
Ｃａ2+の血清レベルを減少させるようである。
【０２６５】実施例２０ 上皮小体細胞カルシウムレセプターにおけるＮＰＳ４６
７の作用メカニズム 解離ウシ上皮小体作用を用いて、レセプターレベルにお
けるＮＰＳ４６７の作用メカニズムをさらに調べた。
０．５ｍＭ細胞外Ｃａ2+の存在下に、ＮＰＳ４６７ＥＥ
は急速で一次的な［Ｃａ2+］iの増加をもたらす。この
増加は１μＭのＬａ3+の存在下に維持され、ＰＭＡでの
予備処理で部分的に抑制される（１００ｎＭ×２分）。
さらに、ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体、３０μＭ）は上皮
小体細胞ｍＲＮＡを注入したキセノプス・オーシテスに
おけるＣｌ- 導電率の急速な増加を引き起こす。すべて
のこれらの結果はＣａ2+レセプターに対するＮＰＳ４６
７の作用と一致する。しかし、ＮＰＳ４６７に対する細
胞ゾルＣａ2+の応答は、上皮小体細胞がＣａ2+非含有緩
衝剤中に懸濁すれば停止する。これは、ＮＰＳ４６７が
それ自体では細胞間Ｃａ2+の可動化を引き起こせないこ
とを示唆する。これは、部分的なＣａ2+結合部位の支配
がＮＰＳ４６７が応答を惹起させるのに必要であること
を示唆する。この仮説をテストするため、上皮小体細胞
をＣａ2+非含有緩衝剤に懸濁し、亜最大濃度のネオマイ
シンにさらす。ネオマイシンは以下の理由により用い
る：これは、ほぼすべての点において、上皮小体細胞お
よびキセノプス・オーシテス（上皮小体細胞Ｃａ2+レセ
プターを発現）に対する細胞外Ｃａ2+の効果に類似する
からである。ネオマイシン１０μＭの添加はそれ自体で
は、これらの条件下に［Ｃａ2+］iの増加を引き起こさ
ない。しかし、ＮＰＳ４６７ＥＥ（３０μＭ）のその後
の添加は［Ｃａ2+］iの一次的な増加を惹起するが、こ
れは、細胞外Ｃａ2+が存在しないため、細胞間Ｃａ2+の
可動化から生じなければならない。Ｃａ2+非含有緩衝剤
に浸した細胞は３０μＭ ＮＰＳ４６７にさらすと、
［Ｃａ2+］iの増加はない。ＮＰＳ４６７の濃度は細胞
外Ｃａ2+０．５ｍＭが存在すれば［Ｃａ2+］iの増加に
最大限有効である。しかし、ネオマイシン１０μＭのそ
の後の添加は一次的な［Ｃａ2+］iの増加を誘発する。
恐らく、ネオマイシンは同じ部位に細胞外Ｃａ2+として
結合し、そのため機能的に置換される。亜最大濃度（こ
れ自体応答を引き起こさない）を用い、部分的なＣａ2+
結合部位の支配を達成し、ＮＰＳ４６７によるＣａ2+レ
セプターの活性化を可能にする。
【０２６６】ＮＰＳ４６７の作用メカニズムを付加的に
定義する付加的な研究を行う。細胞を一旦再度カルシウ
ム非含有緩衝剤に懸濁して、いずれか観察された［Ｃａ
2+］iの増加が細胞間Ｃａ2+の可動化に起因することを
保証する。これらの実験では、しかし、ネオマイシンの
最大有効濃度１００μＭを用いた。細胞外Ｃａ2+の不存
在下に、１００μＭのネオマイシンは急速で一次的な
［Ｃａ2+］iの増加を誘発する。３０μＭ ＮＰＳ４６
７ＥＥのその後の添加は［Ｃａ2+］iの増加を引き起こ
させない。逆の実験では、３０μＭ ＮＰＳ４６７ＥＥ
を１００μＭネオマイシンの前に添加する。予想どお
り、ＮＰＳ４６７ＥＥはいずれの［Ｃａ2+］iの増加を
引き起こさない。しかし、それは、１００μＭネオマイ
シンのその後の添加により誘発された［Ｃａ2+］iの増
加に影響を与えない。ＮＰＳ４６７の最大有効濃度で得
られたこれらの結果は、これら２つの化合物が同じ部位
において作用しないことを示唆する。むしろ、その結果
は、２つの別々のＣａ2+レセプター上の部位、すなわち
細胞外Ｃａ2+およびネオマイシンが結合するものおよび
ＮＰＳ４６７および構造関連化合物（ＮＰＳ５６８な
ど）を仮定すれば、充分に説明する。前者の部位に結合
するリガンドはＣａ2+レセプターの完全な活性化をもた
らすことができる一方、後者の部位に結合するリガンド
は細胞外Ｃａ2+結合性部位がある程度ではあるが限定さ
れない程度に支配される場合のみ生じるかそして／また
は機能的に適当なものとできる。細胞外Ｃａ2+結合性部
位に結合するリガンドは、予めふさいだＮＰＳ４６７の
結合部位にさらすことができる。ＮＰＳ４６７結合部位
は細胞外Ｃａ2+結合性部位において結合するリガンドに
応答してレセプター活性化を増大させるアロステリック
部位のようである。
【０２６７】データは上皮小体細胞Ｃａ2+レセプターが
少なくとも２つの明確な部位において有機リガンドを有
することを証明する。一方の部位は生理学的なリガン
ド、細胞外Ｃａ2+、およびある種の有機ポリカチオン、
たとえばネオマイシンが結合する。この部位の結合は完
全なＣａ2+レセプターの活性化、［Ｃａ2+］iの増加お
よびＰＴＨ分泌の抑制をもたらす。ＮＰＳ４６７は、予
め認識していないＣａ2+レセプター上の結合部位を規定
する。この部位への結合は細胞外Ｃａ2+結合性部位が部
分的に支配される場合にのみ生じるかそして／またはＣ
ａ2+レセプターの完全な活性化をもたらす。いずれかの
部位において作用するリガンドはインビボにおいて血清
Ｃａ2+レベルを抑制するのに有効である。
【０２６８】実施例２１ ＮＰＳ４６７の製造 ２５０ｍｌの丸底フラスコ中に、３′−メトキシ・アセ
トフェノン１０．０ｇ（１００ミリモル）および３−フ
ェニル−プロピルアミン１３．５ｇ（１００ミリモル）
を混合し、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド１２５ミリ
モル（３５．５ｇ）で処理する。反応混合物を３０分
間、室温にて窒素雰囲気下で攪はんする。その後、エタ
ノール１００ｍｌ中ナトリウム・シアノポロヒドリン
６．３ｇ（１００ミリモル）を２分間にわたり滴下す
る。反応を室温にて窒素下に、１６時間攪拌する。その
後、反応混合物をエチルエーテル１．５リットルおよび
水０．５リットルを含む２リットルの分岐ろうとへ移
す。相を平衡状態にさせ、エーテル相を取り出す。残り
の水相をエーテル１リットルづつ４回処理して完全に抽
出する。洗液を合し、無水炭酸カリウム上で乾燥し、透
明で明るいこはく色の油を得る。
【０２６９】この物質のＴＬＣ分析（シリカ上、クロロ
ホルム−メタノール−イソプロピルアミン＝１００：
５：１を使用）は、Ｒｆ０．６５の生成物を示し、２つ
の出発物質はＲｆ０．９９（３′−メトキシ・アセトフ
ェノン）およびＲｆ０．０（３−フェニルプロピルアミ
ン）を示す。
【０２７０】反応混合物を、シリカ（４８×４．６ｃ
ｍ）を介し、クロロホルム−メタノール−イソプロピル
アミン（９９：１：０．１〜９０：１０：０．１）の傾
斜溶出を用いてクロマトグラフィにかけ、精製したＮＰ
Ｓ４６７（１３．６６ｇ）を得る。この物質を０．１％
ジエチルアミン含有ヘキサン−イソプロパノール（９
９：１）に溶解して、濃度５０ｍｇ／ｍｌの溶液を得
る。キラル分解を、この溶液４ｍｌ（２００ｍｇ、分離
達成へ最大）のクロマトグラフィにより、キラルセル
（Ｃｈｉｒａｌ Ｃｅｌｌ）ＯＤ（２５×２ｃｍ）を介
し、ヘキサン中０．７％イソプロピルアミンおよび０．
０７％ジエチルアミンを用い、１００ｍｌ／分にて、２
６０ｎｍの光学密度をモニターしながら達成する。これ
らの条件下では（物質１００ｍｇの注入）、早期溶出異
性体（ＮＰＳ４６７ＥＥ）は〜２６分でカラムから現れ
はじめ、遅れた溶出異性体（ＮＰＳ４６７ＬＥ）は〜３
４分で現れはじめる。ベースライン分解はこれらの条件
で達成される。各光学異性体（遊離塩基）を対応するヒ
ドロクロライド塩へ、遊離塩基３ｇをエタノール１００
ｍｌ中へ溶解し１０モル当量のＨＣｌ含有水１００ｍｌ
で処理して、変換させる。この溶液の凍結乾燥により白
色の固体を得る。
【０２７１】実施例２２ ＮＰＳ５６８の製造 ＮＰＳ５６８を、実施例２１記載の方法で製造する。た
だし、３−フェニルプロピルアミンに代えて、当量の３
−（２−クロロフェニル）プロピルアミンを用いる。
３′−メトキシ・アセトフェノン、３−（２−クロロフ
ェニル）プロピルアミンおよびチタン（ＩＶ）イソプロ
ポキシドの混合物を５時間攪はんし、次いでＮａＣＮＢ
Ｈ3／ＥｔＯＨで処理すると、著しく高い収率をもたら
すことが判明した（９８％）。
【０２７２】実施例２３ 経口投与の場合のＮＰＳ４６７低下血清イオン化カルシ
ウム ラット（雄、スプラーグ・ドウリー、２５０〜３００
ｇ）は、標準ラットカウ（ｃｈｏｗ）で、実験前に一夜
絶食させる。ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体）をトウモロコ
シ油に懸濁し、栄養補給ニードルを介し、単一の経口用
量として投与する。３時間ののち、血液試料を尾静脈か
ら採取し、イオン化Ｃａ2+レベルについて評価する。図
７１は、経口投与した場合のイオン化Ｃａ2+の血清レベ
ルについての用量依存減少を引き起こすＮＰＳ４６７Ｅ
Ｅを示す。
【０２７３】他の具体例も以下の請求の範囲に含まれ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図２】 図２は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図３】 図３は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図４】 図４は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図５】 図５は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図６】 図６は本発明において有用な代表分子を描
く。
【図７】 図７は、キン−２−又はフラ−２−を与えた
ウシ上皮小体細胞の細胞外Ｃａ2+により誘導される［Ｃ
ａ2+］iの増加を示すグラフ表現である。開始［Ｃ
ａ2+］は０．５ｍＭ（ＣａＣｌ2使用）で、矢印の各々
で０．５ｍＭ増加で増加した。
【図８】 図８は、ウシ上皮体細胞での［Ｃａ2+］iの
可動化を示すグラフ表現である。開始［Ｃａ2+］は０．
５ｍＭで、示されるようにＥＧＴＡの添加により＜１μ
Ｍまで減少した。（ａ）細胞外Ｍｇ2+（８ｍＭ、最終）
は細胞外Ｃａ2+の不存在で［Ｃａ2+］iの増加を惹起す
る。（ｂ）イノマイシン（１μＭ）による前処理はＭｇ
2+への反応をブロックする。（ｃ）５μＭ分子１７９９
（ミトコンドリア脱共役剤）による前処理は、Ｍｇ2+へ
の反応に効果がない。
【図９】 図９は、［Ｃａ2+］iの定常状態増加への低
濃度のＧｄ3+の選択的阻止効果、及び高温度のＧｄ3+が
［Ｃａ2+］iの一時的増加を惹起することを示すグラフ
表現である。上部パネル：コントロール。細胞外Ｃａ2+
の開始濃度は０．５ｍＭで、矢じり形の各々で０．５ｍ
Ｍ増加した。中央パネル：Ｇｄ3+（５μＭ）は定常状態
でブロックするが、細胞外Ｃａ2+により惹起される［Ｃ
ａ2+］iの一時間増加をブロックしない。下部パネル：
Ｇｄ3+（５０μＭ）は［Ｃａ2+］iの一時的増加を惹起
し、細胞外Ｃａ2+への一時的及び持続反応を終わらせ
る。中央及び下部パネルにおいて、ちょうど十分なＥＧ
ＴＡを加えて選択的にＧｄ3+をキレートした。Ｃａ2+流
入のブロックを除き［Ｃａ2+］iは急速に上昇する。
【図１０】 図１０は、［Ｃａ2+］i、ＩＰ3形成及びＰ
ＴＨ分泌へのＰＭＡの効果は細胞外Ｃａ2+の濃度を増す
ことにより阻止されることを示すグラフ表現である。各
変数について、細胞外Ｃａ2+についての濃度−反応曲線
で右へのシフトがある。又、濃度−反応曲線が［Ｃ
ａ2+］が直線状に増加するとＳ字状に変化することにも
注意されたい。
【図１１】 図１１はスペルミンにより惹起される［Ｃ
ａ2+］iの増加が［Ｃａ2+］を増すことにより徐々に弱
まることを示すグラフ表現である。スペルミン（２００
μＭ）は矢じり形で示される時間に添加した。本及び以
下の図面において、図形に付されている数字は、ｎＭで
の［Ｃａ2+］iである。
【図１２】 図１２は、スペルミンがウシ上皮小体細胞
の細胞内Ｃａ2+を可動化することを示すグラフ表現であ
る。示されるように（左図形）、スペルミン（２００μ
Ｍ）の添加前にＥＧＴＡを加えて［Ｃａ2+］を＜１μＭ
に減じた。イオノマイシン（１μＭ）による前処理はス
ペルミンへの反応をブロックする（右図形）。
【図１３】 図１３は、スペルミンが細胞外Ｃａ2+と同
様に［Ｃａ2+］iを増加しウシ上皮小体細胞でのＰＴＨ
分泌を阻害することを示すグラフ表現である。スペルミ
ン用量−濃度反応曲線についてのデータ点は２つの実験
の平均である。
【図１４】 図１４は、スペルミンが細胞外Ｃａ2+と同
様に［Ｃａ2+］iを増加しウシ上皮小体細胞でのＰＴＨ
分泌を阻害することを示すグラフ表現である。スペルミ
ン用量−濃度反応曲線についてのデータ点は２つの実験
の平均である。
【図１５】 図１５は、細胞外Ｃａ2+への反応に対す
る、及び上皮小細胞のＡＴＰγＳへの反応に対するＰＭ
Ａの対照的に示す効果を示すグラフ表現である。左パネ
ル：サイクリックＡＭＰ形成の細胞外Ｃａ2+−誘発阻止
についての濃度−反応曲線はＰＭＡ（１００ｎＭ）によ
り右にシフトする。中央パネル：ＰＭＡは、ＡＴＰγＳ
の［Ｃａ2+］iを増加する能力に影響を及ぼさない。Ａ
ＴＰγＳに対する濃度−反応曲線が、対数濃度の関数と
して、細胞外二価カチオンと対照的に古典的Ｓ字状動き
を示すことにも注意されたい。
【図１６】 図１６は、細胞外Ｍｇ2+により引き出され
るヒト上皮小体細胞の細胞内Ｃａ2+の可動化を示すグラ
フ表現である。細胞はアデノーマから得て、０．５ｍＭ
細胞外Ｃａ2+を含む緩衝液中に入れた。（ａ）細胞外Ｍ
ｇ2+（１０ｍＭ、最終）により惹起される［Ｃａ2+］i
の一時的及び維持続増加は、持続増加がニモジピン（１
μＭ）により影響されないがＬａ3+（１μＭ）により減
少し、Ｌａ3+を低濃度のＥＧＴＡにより選択的にキレー
ト化すると速やかに元にもどることを示す。（ｂ）Ｌａ
3+（１μＭ）は、維持続増加をブロックするが細胞外Ｍ
ｇ2+により惹起される［Ｃａ2+］iの一時的増加をブロ
ックしない。（ｃ）細胞外Ｍｇ2+により惹起されるサイ
トゾルＣａ2+一過性は細胞外Ｃａ2+の不存在で持続す
る。
【図１７】 図１７は、ウシ上皮小体細胞中、ネオマイ
シン又はプロタミンにより引き出される細胞内Ｃａ2+の
可動化を示すグラフ表現である。全ての図形で、開始
［Ｃａ2+］及び［Ｍｇ2+］はそれぞれ０．５及び１ｍＭ
であった。図形（ａ）及び（ｂ）において、Ｃａ2+及び
Ｍｇ2+濃度は、それぞれ０．５及び１ｍＭから２及び８
ｍＭに増加した。他の図形において、（ｃ）ないし
（ｉ）は、ネオマイシンＢ（３０μＭ）又はプロタミン
（１ｕｇ／ｍｌ）を示すように加えた。Ｌａ3+（１μ
Ｍ）、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）又はイオマイシン（１００ｎ
Ｍ）を示すように加えた。各図形は、少なくとも３つの
異なる細胞調製品を用いる５又はそれ以上の試験で見ら
れるパターンの代表である。バー＝１分。
【図１８】 図１８は、ネオマイシンＢが一過性をブロ
ックするが細胞外Ｃａ2+により惹起される［Ｃａ2+］i
の定常状態増加をブロックしないことを示すグラフ表現
である。左コントロール：［Ｃａ2+］は開始が０．５ｍ
ＭでネオマイシンＢ（３０μＭ）の添加前に各用いた矢
じり形で０．５ｍＭ増加にて増した。右：ネオマイシン
Ｂ（３０μＭ）を［Ｃａ2+］前に加えた。バー＝１分。
【図１９】 図１９は、ネオマイシンＢ又はプロタミン
が［Ｃａ2+］iの増加を誘引する濃度でＰＴＨ分泌を阻
害することを示すグラフ表現である。細胞は示される濃
度の有機ポリカチオンと３０分間インキュベートした。
中空の印：コントロールは０．５（円）又は２ｍＭ（ひ
し形）の細胞外Ｃａ2+の存在でＰＴＨ分泌に反応する。
［Ｃａ2+］iの値はひし形印である。ウシ細胞をプロタ
ミンによる実験に用い、ヒト（アデノーマ）上皮小体細
胞をネオマイシンＢによる実験に用いた。各点は３回の
実験の平均±ＳＥＭである。
【図２０】 図２０は、スペルミンにより惹起されるサ
イトゾルＣａ2+一過性へのＰＭＡの選択的阻害効果を示
すグラフ表現である。開始［Ｃａ2+］は０．５ｍＭであ
った：スペルミン（２００μＭ）又はＡＴＰ（５０μ
Ｍ）は示されるように加えた。バー＝１分。
【図２１】 図２１は、ＰＭＡが［Ｃａ2+］iの細胞外
Ｃａ2+−及びネオマイシンＢ−誘発増加についての濃度
−反応曲線を右にシフトすることを示すグラフ表現であ
る。細胞は、［Ｃａ2+］増加前、又は示されるようにネ
オマイシンＢを添加する前に１分間ＰＭＡで前処理し
た。各点は３ないし５回実験の平均±ＳＥＭである。
【図２２】 図２２は、ＰＭＡがＰＴＨ分泌の細胞外Ｃ
ａ2+−及びスペルミン−誘発阻害についての濃度−反応
曲線を右にシフトすることを示すグラフ表現である。細
胞は、１００ｎＭ ＰＭＡの存在下（黒ぬり円）又は不
存在下（中空円）に３０分間示された［Ｃａ2+］及びス
ペルミンとインキュベートした。各点は、３回の実験の
平均±ＳＥＭである。
【図２３】 図２３は、プロタミンがイノシトールリン
酸エステルの形成を増幅することを示すグラフ表現であ
る。上皮小体細胞は４ｕＣｉ／ｍｌ 3Ｈ−ｍｙｏ−イノ
シトールを含む培養培地中、一夜インキュベートし、洗
浄し、示される濃度のプロタミンと３７℃でインキュベ
ートした。３０秒後、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＣｌの
添加により反応を停止させ、ＩＰ1（円）及びＩＰ3（三
角形）をアニオン交換クロマトグラフィにより分離し
た。
【図２４】 図２４は、ＰＭＡが細胞外Ｃａ2+又はスペ
ルミンにより引き出されるＩＰ1の形成を減ずることを
示すグラフ表現である。 3Ｈ−ｍｙｏ−イノシトール−
標識細胞は、反応を停止し、アニオン交換クロマトグラ
フィによりＩＰ1を分離する前に、３０秒間示された
［Ｃａ2+］又はスペルミンに暴露した。ハッチ（ｈａｔ
ｃｈｅｄ）カラム：細胞は［Ｃａ2+］増加又はスペルミ
ン添加前、５分間ＰＭＡ（１００ｎＭ）で前処理した。
各値は、それぞれ３回実施した２つの実験の平均であ
る。
【図２５】 図２５は、ヒト（アデノーマ）上皮小体細
胞でのネオマイシンＢにより惹起される［Ｃａ2+］iの
一時的及び持続増加を示すグラフ表現である。［Ｃ
ａ2+］は０．５ｍＭであった。（ａ）ネオマイシンＢ
（１０μＭ）により惹起される［Ｃａ2+］iの持続増加
はＬａ3+により減じた。（ｂ）ネオマイシンＢにより引
き出される［Ｃａ2+］iの一時的増加はＬａ3+により影
響されなかった。（ｃ）［Ｃａ2+］iの一時的増加は細
胞外Ｃａ2+の不存在で持続した。
【図２６】 図２６は、ネオマイシンＢがＣａ2+レセプ
ターを発現するクセノプス卵母細胞で振動増幅Ｃｌ- コ
ンダクタンスを誘引することを示すグラフ表現である。
卵母細胞から上部図形、ヒト（増殖性）上皮小体細胞ポ
リ（Ａ）+ −ｍＲＮＡ注射後３日。卵母細胞から下部図
形、水注射。ネオマイシンＢは５つの水注射卵母細胞で
反応を惹起せず、カルバコールは示されるように反応を
惹起した。両図形で、保有電位は−７６ｍＶであった。
【図２７】 図２７は、ネオマイシンＢがＣ−細胞で基
本又は誘引増加に影響しないことを示すグラフ表現であ
る。コントロール、左図形：フラー２−を与えたｒＭＴ
Ｃ６−２３細胞は、［Ｃａ2+］を３ｍＭに増加する前
に、１ｍＭＣａ2+を含む緩衝液にまず浸漬した。右図
形：５ｍＭネオマイシンＢによる前処理。
【図２８】 図２８は、細胞外Ｃａ2+がラット破骨細胞
で［Ｃａ2+］iの増加を誘引することを示すグラフ表現
である。インド−１を与え、示された［Ｃａ2+］を含む
緩衝液で示された時間（バー）過融解した単一ラット破
骨細胞でのミクロ蛍光定量。正常緩衝液は、バーの間で
過融解し、１ｍＭ Ｃａ2+を含有した。
【図２９】 図２９は、スペルミン又はネオマイシンＢ
がラット破骨細胞で［Ｃａ2+］iの増加を誘引しないこ
とを示すグラフ表現である。インド−１−を与えた破骨
細胞は示された濃度のスペルミン又はネオマイシンＢ
（中空バー）のみで又は２０ｍＭ Ｃａ2+と共に（黒ぬ
りバー）過融解した。
【図３０】 図３０は、ウシ上皮小体細胞での［Ｃ
ａ2+］iへのアルギオトキシン（図でアルギオピンとし
て示す、構造も図１−６に示す）６５９及びアルギオト
キシン６３６の特異的効果を示すグラフ表現である。開
始［Ｃａ2+］は０．５ｍＭで、示されたところで（右図
形）１．５ｍＭに増加した。示されたところでアルギオ
トキシン６５９（３μＭ）又はアルギオトキシン６３６
（４００μＭ）を加えた。
【図３１】 図３１は、細胞外Ｍｇ2+又はＧｄ3+がウシ
上皮小体細胞ポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡを注射したクセノ
プス卵母細胞でのＣｌ- コンダクタンスを振動増幅する
ことを示すグラフ表現である。図形（ａ）において、細
胞外Ｃａ2+の濃度は＜１μＭで、図形（ｂ）では０．７
ｍＭであった。図形（ｃ）は、物質Ｋとの過融解は反応
を誘引するけれども、細胞外Ｍｇ2+は、物質Ｋレセプタ
ーに対し、ｍＲＮＡだけを注射した卵母細胞で反応を惹
起しないことを示す。保有電位は−７０ないし−８０ｍ
Ｖであった。
【図３２】 図３２は、細胞外Ｃａ2+が、ヒト（増殖
性）上皮小体細胞ポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡを注射したク
セノプス卵母細胞でのＣｌ- コンダクタンスの振動増幅
を惹起することを示すグラフ表現である。卵母細胞は、
５０ｎｇポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡの注射後３日に細胞外
Ｃａ2+に対する反応性を試験した。保有電位は−８０ｍ
Ｖであった。
【図３３】 図３３は、ブドムンキアミンにより惹起さ
れたウシ上皮小体細胞での細胞内Ｃａ2+の可動化を示す
グラフ表現である。ブドムンキアミン（３００μＭ、構
造も示す）を示したところに加えた。
【図３４】 図３４は、上皮小体細胞の細胞内Ｃａ2+を
可動化する能力が立体特異性であることを示すグラフ表
現である。フラ−２を与えたウシ上皮小体細胞は、示さ
れた濃度の各分子の添加前に、０．５ｍＭ細胞外Ｃａ2+
を含む緩衝液にまず懸濁させた。
【図３５】 図３５は、破骨細胞の［Ｃａ2+］iへのＬ
ａ3+の影響を示すグラフ表現である。インド−１を与え
た単一ラット破骨細胞からの代表図形を示す。低濃度
で、Ｌａ3+は、細胞外Ｃａ2+により惹起された［Ｃ
ａ2+］iの増加を部分的にブロックする。
【図３６】 図３６は、ラット破骨細胞での細胞外Ｍｎ
2+により惹起された細胞内Ｃａ2+の可動化を示すグラフ
表現である。細胞外Ｍｎ2+は、細胞外Ｃａ2+の不存在で
持続する（図３７）［Ｃａ2+］iの濃度依存増加を誘引
する（図３６）。
【図３７】 図３７は、ラット破骨細胞での細胞外Ｍｎ
2+により惹起された細胞内Ｃａ2+の可動化を示すグラフ
表現である。細胞外Ｍｎ2+は、細胞外Ｃａ2+の不存在で
持続する（図３７）［Ｃａ2+］iの濃度依存増加を誘引
する（図３６）。
【図３８】 図３８は、ＮＰＳ４４９（図６５参照）と
名付けられた分子により惹起されたラット破骨細胞での
［Ｃａ2+］iの可動化を示すグラフ表現である。インド
−１を与えた分離ラット破骨細胞は、１ｍＭ細胞外Ｃａ
Ｃｌ2の存在（図３８）又は不存在（図３９）で、示さ
れた濃度のＮＰＳ４４９と過融解した。
【図３９】 図３９は、ＮＰＳ４４９（図６５参照）と
名付けられた分子により惹起されたラット破骨細胞での
［Ｃａ2+］iの可動化を示すグラフ表現である。インド
−１を与えた分離ラット破骨細胞は、１ｍＭ細胞外Ｃａ
Ｃｌ2の存在（図３８）又は不存在（図３９）で、示さ
れた濃度のＮＰＳ４４９と過融解した。
【図４０】 図４０は、ＮＰＳ０１９（図１−６参照）
により誘引されたＣ−細胞での細胞内Ｃａ2+の可動化を
示すグラフ表現である。ｒＭＴＣ６−２３細胞はフラ−
２を与え、０．５ｍＭ［Ｃａ2+］を含む緩衝液に浸漬し
た。示されたところで、ＮＰＳ０１９を１０μＭの最終
濃度まで加えた。代表的図形は、ＮＰＳ０１９により惹
起された［Ｃａ2+］iの一時的増加がＬａ3+による阻害
に抵抗性であり（中央図形）、細胞外Ｃａ2+の不存在で
持続する（右図形）ことを示す。
【図４１】 図４１は、ＮＰＳ４５６（図４４−６３）
がウシ上皮小体細胞ポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡを注射して
いたクセノプス卵母細胞でのＣｌ- 流の振動増幅を誘引
することを示すグラフ表現である。
【図４２】 図４２は、細胞外Ｃａ2+が、ヒト破骨細胞
ｍＲＮＡを注射していたクセノプス卵母細胞でのＣｌ-
流の振動増幅を誘引することを示すグラフ表現である。
卵母細胞は、５０ｎｇの全ポリ（Ａ）+ ｍＲＮＡの注射
後、３日に細胞外Ｃａ2+の反応性を試験した。
【図４３】 図４３は、上皮小体細胞Ｃａ2+レセプター
が２．５−３．５ｋｂの大きさの範囲でｍＲＮＡにより
暗号化されることを示すグラフ表現である。ウシ上皮小
体細胞ポリ（Ａ）+ −ｍＲＮＡは変性グリセロール勾配
でサイズ分画し、１０分画にプールした。各分画を別々
にクセノプス卵母細胞に注射した（５０ｎｇ／分画）。
３日後、卵母細胞は、Ｃｌ- コンダクタンスの振動増幅
による細胞外Ｃａ2+への応答能力について試験した。
【図４４】 図４４は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図４５】 図４５は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図４６】 図４６は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図４７】 図４７は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図４８】 図４８は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図４９】 図４９は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５０】 図５０は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５１】 図５１は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５２】 図５２は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５３】 図５３は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５４】 図５４は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５５】 図５５は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５６】 図５６は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５７】 図５７は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５８】 図５８は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図５９】 図５９は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図６０】 図６０は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図６１】 図６１は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図６２】 図６２は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図６３】 図６３は、本発明の有用な分子を見出すた
めに製造されスクリーンされた分子の族を示す、ジフェ
ニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分
子の化学構造を示す。
【図６４】 図６４は、ＮＰＳ０２１がウシ上皮小体細
胞での［Ｃａ2+］iへの細胞外Ｃａ2+の効果をブロック
するカルシウム拮抗化合物であることを示すグラフ表現
である。細胞は、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む緩衝液
に浸漬し、示されるところで［Ｃａ2+］を最終２ｍＭま
で増加した（左図形）。ＮＰＳ０２１（２００μＭ）の
添加は［Ｃａ2+］に変化を起こさなかったが、細胞外Ｃ
ａ2+により惹起された［Ｃａ2+］iの増加を阻止した
（右図形）。
【図６５】 図６５は、ＮＰＳ４６７に対するインビボ
Ｃａ2+反応を示すグラフである。
【図６６】 図６６は、ＮＰＳ４６７に対するインビボ
ＰＴＨ反応を示すグラフである。
【図６７】 図６７は、２５ｍｇ／ｋｇＮＰＳ４６７に
対するインビボＣａ2+反応を示すグラフである。
【図６８】 図６８はＮＰＳ４６７の異なる鏡像体に対
するインビボＣａ2+反応を示すグラフである。
【図６９】 図６９はＮＰＳ４６７の異なる鏡像体に対
するインビボＣａ2+反応を示すグラフである。
【図７０】 図７０ａは、図４４−６３に記載されたフ
ェンジリン又はフェンジリン類似体又は誘導体の製造の
ための反応式を描く。図７０ｂは、ＮＰＳ４６７の合成
のための反応式を描く。
【図７１】 図７１は、ＮＰＳ４６７が、経口投与する
と、血清イオン化カルシウムを低下することを示す用量
反応曲線を描く。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｃ 211/27 8828−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 211/29 211/29 8828−4Ｈ 211/30 211/30 7457−4Ｈ 217/54 217/54 Ｃ０７Ｄ 209/14 Ｃ０７Ｄ 209/14 209/18 209/18 211/90 211/90 413/04 ２１１ 413/04 ２１１ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (71)出願人 596099583 420 Ｃｈｉｐｅｔａ Ｗａｙ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ 84108, Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍ ｅｒｉｃａ (72)発明者 ヴァン・ウェイジネン、ブラッドフォー ド・シー アメリカ合衆国84102ユタ州、ソルト・レ イク・シティ、ナンバー507、イースト・ 300・サウス1070番 (72)発明者 バランドリン、マニュエル・エフ アメリカ合衆国84121ユタ州、ソルト・レ イク・シティ、サウス・1585・イースト 5787番

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 機能的カルシウムレセプターを発現する
    組換え細胞を用いてカルシウムレセプター活性に影響を
    及ぼしうる化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ） 前記化合物を前記細胞に提供し；そして ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターの１つま
    たはそれ以上の活性に影響を及ぼす能力を測定する；の
    各工程を含み、前記組換え細胞は前記機能的カルシウム
    レセプターを発現する外来性核酸を含むことを特徴とす
    る方法。
  2. 【請求項２】 前記化合物が細胞内カルシウムを移動さ
    せる能力を測定することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 細胞内Ｃａ2+の迅速かつ一過性の増加を
    測定することを含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該方法が、細胞外Ｃａ2+の流入が阻害さ
    れている条件下で実施される、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 機能的カルシウムレセプターを発現する
    組換え細胞を用いてカルシウムレセプターにおける細胞
    外Ｃａ2+の活性を模倣しうる化合物をスクリーニングす
    る方法であって、 ａ） 前記化合物を前記細胞に提供し；そして ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターにおける
    細胞外Ｃａ2+の活性を模倣する能力を測定する；の各工
    程を含み、前記組換え細胞は前記機能的カルシウムレセ
    プターを発現する外来性核酸を含むことを特徴とする方
    法。
  6. 【請求項６】 機能的カルシウムレセプターを発現する
    組換え細胞を用いてカルシウムレセプターにおける細胞
    外Ｃａ2+の活性を阻害しうる化合物をスクリーニングす
    る方法であって、 ａ） 前記化合物を前記細胞に提供し；そして ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターにおける
    細胞外Ｃａ2+の活性を阻害する能力を測定する；の各工
    程を含み、前記組換え細胞は前記機能的カルシウムレセ
    プターを発現する外来性核酸を含むことを特徴とする方
    法。
  7. 【請求項７】 第１の細胞タイプにおけるカルシウムレ
    セプターの活性に影響を及ぼすことができるが、第２の
    細胞タイプにおけるカルシウムレセプターの活性に影響
    を及ぼすことができない化合物をスクリーニングする方
    法であって、 ａ） 前記化合物を前記第１の細胞タイプおよび前記第
    ２の細胞タイプに提供し； ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターの１つま
    たはそれ以上の活性に影響を及ぼす能力を測定し；そし
    て ｃ） 前記第１の細胞タイプにおける前記カルシウムレ
    セプターの活性に影響を及ぼすことができるが、前記第
    ２の細胞タイプにおける前記カルシウムレセプターの活
    性に影響を及ぼすことができない化合物を選択する；の
    各工程を含む方法。
  8. 【請求項８】 第１のカルシウムレセプターの活性に影
    響を及ぼすことができるが、第２のカルシウムレセプタ
    ーの活性に影響を及ぼすことができない化合物をスクリ
    ーニングする方法であって、 ａ） 前記化合物を前記第１のカルシウムレセプターを
    含む第１の細胞タイプおよび前記第２のカルシウムレセ
    プターを含む第２の細胞タイプに提供し； ｂ） 前記化合物が前記第１および第２のカルシウムレ
    セプターの１つまたはそれ以上の活性に影響を及ぼす能
    力を測定し；そして ｃ） 前記第１のカルシウムレセプターの活性に影響を
    及ぼすことができるが、前記第２のカルシウムレセプタ
    ーの活性に影響を及ぼすことができない化合物を選択す
    る；の各工程を含む方法。
  9. 【請求項９】 前記第１の細胞タイプおよび前記第２の
    細胞タイプが、前記第１の細胞タイプと前記第２の細胞
    タイプとが互いに異なるように、上皮小体細胞、破骨細
    胞、腎傍糸球体細胞、近位尿細管細胞、ケラチノサイ
    ト、甲状腺傍濾胞細胞および胎盤栄養芽細胞からなる群
    より選択される、請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記外来性核酸が、ベクターの一部で
    ある組換え核酸として提供される、請求項１−８のいず
    れかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 カルシウムレセプターの活性に影響を
    及ぼしうる化合物を同定する方法であって、 ａ） 前記化合物をカルシウムレセプターを含む細胞に
    提供し；そして ｂ） 前記化合物が前記カルシウムレセプターの細胞内
    Ｃａ2+を移動させる能力に影響を及ぼす能力を測定す
    る；の各工程を含み、前記化合物が芳香族基を含むこと
    を特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 前記芳香族基が、フェニル、２−、３
    −、もしくは４−ピリジル、１−もしくは２−ナフチ
    ル、１−もしくは２−キノリニル、２−もしくは３−イ
    ンドリル、ベンジル、およびフェノキシからなる群より
    選択される部分を含む、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記方法が、細胞内Ｃａ2+の迅速かつ
    一過性の増加を測定する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記方法が、細胞外Ｃａ2+の流入が阻
    害されている条件下で実施される、請求項１２記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 前記方法が、前記カルシウムレセプタ
    ーにおける細胞外Ｃａ2+の活性を模倣する前記化合物の
    能力を測定する、請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記方法が、前記カルシウムレセプタ
    ーにおける細胞外Ｃａ2+の活性を阻害する前記化合物の
    能力を測定する、請求項１２記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記化合物がベラパミルまたはＤ−６
    ００ではない、請求項１１−１６のいずれかに記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 前記化合物が、化学式： 【化１】 ［式中、それぞれのＸは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ3
    Ｏ、ＣＨ3ＣＨ2Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ3、ＣＨＦ2、
    ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3Ｏ、ＣＨ3Ｓ、ＯＨ、ＣＨ2ＯＨ、ＣＯＮ
    Ｈ2、ＣＮ、ＮＯ2、およびＣＨ3ＣＨ2からなる群より選
    択され；それぞれのＡｒは、独立して、フェニル、２
    −、３−、もしくは４−ピリジル、１−もしくは２−ナ
    フチル、１−もしくは２−キノリニル、２−もしくは３
    −インドリル、ベンジルおよびフェノキシからなる群よ
    り選択され；それぞれのＲは、独立して、水素、メチ
    ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
    チル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチ
    ル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒト
    ロインドリル、チオジヒドロインドリル、および２−、
    ３−、もしくは４−ピペリジルからなる群より選択さ
    れ；Ｙは、ＣＨ、窒素、および不飽和炭素からなる群よ
    り選択され；そしてＺは、酸素、窒素、イオウ、 【化２】 （ここで、ｎは１−４であり、それぞれのｍは独立して
    ０−５である）からなる群より選択され；ただし、前記
    化合物は、フェニル、２−、３−もしくは４−ピリジ
    ル、１−もしくは２−ナフチル、１−もしくは２−キノ
    リニル、２−もしくは３−インドリル、ベンジルおよび
    フェノキシからなる群より選択される少なくとも１つの
    Ａｒを含む］を有する化合物またはその薬学的に許容さ
    れる塩もしくは複合体である、請求項１２記載の方法。
  19. 【請求項１９】 さらに、前記化合物が第２の細胞タイ
    プにおける細胞外Ｃａ2+の１つまたはそれ以上の活性に
    影響を及ぼす能力を測定する工程を含む、請求項１１−
    １８のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記化合物がフェニル部分を含む、請
    求項１１−１９のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記化合物がさらに第２のフェニル部
    分を含む、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 機能的カルシウムレセプターを発現す
    る外来性核酸を含む組換え細胞。
  23. 【請求項２３】 前記外来性核酸がベクター中に存在す
    る、請求項２２に記載の細胞。
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