JPH06510531A - カルシウム受容体活性化分子 - Google Patents

カルシウム受容体活性化分子

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JPH06510531A JP5504650A JP50465092A JPH06510531A JP H06510531 A JPH06510531 A JP H06510531A JP 5504650 A JP5504650 A JP 5504650A JP 50465092 A JP50465092 A JP 50465092A JP H06510531 A JPH06510531 A JP H06510531A
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ヴァン・ウェイジネン、ブラッドフォード・シー
バランドリン、マニュエル・エフ
デルマー，エリック・ジー
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エヌピーエス・ファーマシウティカルズ・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシウム受容体活性化分子 関連出願 この出願は、ネメスらのカルシウム受容体活性化分子と題する一部継続出願であ り、１９９２年２月１１日出願された。この出願は、１９９１年８月２３日出願 のカルシウム受容体活性化剤と題する米国特許出願番号０７／７４９．４５１号 の一部継続出願である。この両方の出願の図面を含めてすべてをここに引用して 本明細書の記載とする。
発明の関連分野 この発明は、細胞上で細胞外のカルシウムイオンに類似する方法で作用し得る新 規なカルシウム様（ｃａｌｃｉｍｉａ＋ｅｔｉｃ）分子の設計、開発、組成物お よび利用、細胞上で細胞外カルシウムイオンの活性を妨害するカルシウム拮抗分 子（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）　、およびそれらの製造方法および同定に関する。
発明の背景 以下の記載は本発明に関する開示の要約である。ここに記載した開示のいずれも 、本発明の先行技術であることを認めるものではなく、また具体的または言外に 引用された刊行物は本発明の先行文献であることを認めるものではない。
体内のある種の細胞は化学的信号に応答するばかりでなく、細胞外カルシウムイ オン（Ｃａ２つのようなイオンに対しても応答する。細胞外Ｃａ”濃度（以下、 ［Ｃａ　”］という）における変化はこれらの細胞の機能的応答を変化させる。
このような特定の細胞の１種は上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）を分泌する上皮小体 細胞である。ＰＴＨは、血中および細胞外液中のＣａ”恒常性を制御する重要な 内分泌因子である。ＰＴＨは、骨および腎臓細胞に作用して、血中のＣａ”″濃 度を増大させる。［Ｃａ”］の増大は、ついで、ＰＴＨ分泌を抑制する負のフィ ードバック信号として働く。［Ｃａ　”３およびＰＴＨ分泌の相互関係は体内の Ｃａ”恒常性を維持する重要な機構をなしている。
細胞外Ｃａ”は上皮小体細胞に直接作用し、ＰＴＨ分泌を制御する。［Ｃａ　” ］中の変化を感知する上皮小体細胞表面蛋白質の存在が示唆されていた。この蛋 白質は細胞外Ｃａ”のための受容体（ｒＣａ”受容体」）であり、［Ｃａ”］の 変化を感知し、機能的細胞応答を開始させるものと考えられる。例えば、細胞外 Ｃａ２４受容体および細胞外Ｃａ２＋の制御における、細胞外Ｃａ”および細胞 機能の役割についてはネメスら、１１セル・カルシウム３１９．１９９０に概説 されている；小胞周縁および上皮小体細胞中のＣａ”受容体の役割は、ネメスら 、１１セル・カルシウム３２３．１９９０中で討論されている。骨の破骨細胞上 のＣａ２゛受容体の役割はザイジ、１０バイオサイエンス・リポート４９３．１ ９９０中で討論されている。
体内の他の細胞、具体的には、骨中の破骨細胞、腎臓中の糸球体近接および近位 小管細胞、外皮のケラナノサイト、甲状腺の小胞周縁細胞、胎盤中の栄養膜細胞 は、［Ｃａ”］の変化を感知する能力を有している。細胞表面Ｃａ”受容体はこ れらの細胞上にも存在し、［Ｃａ　”］の変化に対する応答を開始または可能に する能力をこれらの細胞にも与えている。
上皮小体細胞、破骨細胞、小胞周縁細胞（Ｃ−細胞）、ケラナノサイト、糸球体 近接細胞および栄養膜細胞において、［Ｃａ”］の増大は細胞内遊離Ｃａ”濃度 （ｒ　［Ｃａ”］　１Ｊ　）の増大を生せしめる。この増大は、細胞外Ｃａ”の 流入によってか、または細胞内小管からのＣａ”の移動によって生じ得る。［Ｃ ａ　２４］答の変化は、ｆｕｒａ−２または１ｎｄｏ−１のような蛍光定量指示 剤を用いて、容易に観測または定量される（モルキュラー・ブローブス、ニージ ーン、ＯＲ）。［Ｃａｍ’］１の測定は、Ｃａ２４受容体のアゴニストまたはア ンタゴニストとして働く分子の能力を評価するための測定法を提供する。
上皮小体細胞において、細胞外Ｃａ”＋の濃度の増大は、［Ｃａ”］＋の急速な かつ一時的な増大を生ぜしめ、つぎに、低いがなお持続的な［Ｃａ”］＋の増大 が続く。［Ｃａ”］＋の一時的な増大は細胞内Ｃａ”″の移動から誘導されるが 、一方、低い持続的な増大は細胞外Ｃａ”の流入によってもたらされる。細胞内 Ｃａ２＋の移動の後、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）およびジ アンルグリセロールの生成が増大し、この２個の生化学的指示剤は種々の他の細 胞中の細胞内Ｃａ”の受容体−依存的移動に関連している。
Ｃａ２＋に加えて、種々の他の２価および３価のカチオン、例えば、Ｍｇ”、５ ｒ１４、Ｂａ”、Ｌａ”およびＧｄ”もまた、上皮小体細胞中の細胞内Ｃａ”の 移動を生ぜしめる。ＭｇトおよびＬａ”もまたＩＰ、の生成を増大させる；すべ てのこれらの無機化学的カチオンはＦＴＨの分泌を抑制する。上皮小体細胞上の 仮定的Ｃａ”受容体は、従って相手を選ばない。なぜなら、種々の細胞外の２価 または３価のカチオンを感知するからである。
インビトロの細胞外Ｃａ”に似た種々の化合物の性質が、ネメスら、（スペルミ ンおよびスペルミジン）「健常および疾患におけるカルシウム−結合蛋白質」、 １９８７年、アカデミツク・プレス、インコーホレーテッド、３３−３５頁ニブ ラウンら、（例えば、ネオマイシン）１２８ｒエンドクリノロジー」、３０４７ ．１９９１年：チャンら、（ジルチアゼムおよびその誘導体、ＴＡ−３０９０） 、５ジヤーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ、５８１．１９９ ０年：およびザイジら、（ベラパミル）１６７バイオケミカル・アンド・バイオ フィジカル・リサーチ・コミュニケーション、８０７．１９９０年で検討されて いる。
ブラウンら、６ジヤーナル・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ、１１．１９ ９１年は、上皮小体細胞に対するＣａ”イオンの効果に関する現在の理論を検討 しており、下記のような、受容体様機構および受容体−非依存的機構の両方によ って、結果を説明し得ると提案している：多価カチオン（例えば、２価および３ 価のカチオン）は上皮小体機能に種々の作用、例えば、上皮小体ホルモン（ＰＴ Ｈ）分泌およびｃＡＭＰ蓄積の阻害、イノシトールリン酸の蓄積の刺激および細 胞質ゾル（サイドシル）の（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）カルシウム濃度の上昇など、 を及ぼす。これらの作用は「受容体様」機構によって伝達されると考えられる。
２価および３価のカチオンによるアゴニスト−刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害は、例え ば、百日咳トキンンとブレインキュベーションの後は阻止される。すなわち、推 定的多価カチオン受容体は、阻害的グアニンヌクレオチド制御（Ｇ）蛋白質、Ｇ 、によってアデニル酸シクラーゼの阻害につながるものと考えられる。
本発明者らは、最近、多価カチオン抗生物質、ネオマイシン、が上皮小体機能の 数種の性質において、２価および３価のカチオンと似た作用をすることを知った 。これらの作用がこの試剤に特異的であるのか、または多価カチオンのさらに普 遍化した作用を示すのかを知るために、塩基性の非常に高いペプチド、ポリアル ギニンおよびポリリジンおよびプロタミンの分散雄牛上皮小体細胞中で同じパラ メーターに対する作用を試験した。結果は、上皮小体細胞が、種々のポリカチオ ンおよび多価カチオンに、もしかすると同様の生化学的経路を経て応答すること を示している。これらの結果を、最近主張されている、他の系でのポリカチオン によるＧ蛋白質の「受容体−非依存的」調節に関連して検討している。
＊＊＊ Ｃａ”受容体は他のＧ蛋白質−結合受容体［例えば、糖蛋白質］に類似するもの と見なされていたが、他の細胞型についての最近の研究では、ポリカチオンが他 のまたは追加的機構によって細胞の機能を調整し得る可能性が出てきた。乳房細 胞において、例えば、マストパラン、ハチ毒からのペプチド、４８／８０、合成 ポリカチオンおよびポリリジンを含む、種々の両親媒性カチオンは、百日咳毒− 感作機構によって分泌を増強され、Ｇ−蛋白質とのかかわりを示唆している。
標準的な細胞表面受容体にこれらの様々な試剤を伝達するものはない。さらに、 同じこれらの化合物が、溶液中または人工的なリン脂質小胞中で直接、精製Ｇ− 蛋白質を活性化することが知られている。これらの知見に基づいて、両親媒性カ チオンはＧ−蛋白質を活性化し、ついで、乳房細胞分泌を「受容体−非依存的」 機構によって活性化すると提案されている。
ポリカチオンは、また酸性リン脂質と強く相互反応することが示されている。
種々の長さの鎖状ポリリジン（２０−１０００個のアミノ酸）は人工的なリン脂 質小胞と０．５ｎＭ〜１．５μＭの範囲の解離定数で結合している。結合親和性 は直接ポリリジン鏑の長さに関係し、１０００個のアミノ酸のポリマーはに、０ ．５ｎＭであり、それより短いポリマーはより高いに６値を有し、リジンは有意 な程度に相互作用をしない。活性と鎖長の相関関係は上皮小体機能に対するポリ リジン、。、　２００、ポリリジン３．。。、およびリジンの効果について観察 される相関関係に類似している。
ポリカチオンの生化学的膜への結合はそれらの生化学的作用をいくつか生じさせ ることができる。ある種の型の細胞中に、ポリカチオンを含む種々の細孔形成剤 によって誘発された血漿膜の透過可能性が、ホスファチジルセリン様構造とのそ れらの相互作用によりて伝達されると主張されている。さらに、両親媒性カチオ ンによる精製Ｇ−蛋白質の「受容体−非依存的」活性化は、これらの蛋白質がリ ン脂質小胞に組み込まれたとき強化される。
カルシウムイオンはまた、ミリモル濃度の範囲で膜構造中に注目すべき変化を生 じさせる。ある種の場合に、カルシウムは、膜脂質とポリカチオンの相互作用と 拮抗、または増強のいずれもなし得る。これらの考察は、上皮小体細胞上の多価 のカチオンおよびポリカチオンの両方の作用が、標準的な細胞表面Ｇ−蛋白質− 結合受容体を必要としない受容体−非依存的機構を含む可能性を提起するもので ある。しかしながら、このまたは他の型の細胞によるＣａ”感作についての分子 的原理を解明するにはさらなる研究が要求されている［引用文献省略］。
ショーパックおよびチャン（６（補追１）ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ ミネラル・リサーチ、１９９１年、５１３５）およびラッテら、（６（補追１） ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ、１９９１年、５ｌ１ ８）はＣａ２＋受容体またはＣａ”センサーが上皮小体細胞中に存在することを 示す言うべき実験を開示している。このような細胞から分離されたメツセンジャ ーＲＮＡは、卵母細胞中に発現され得、卵母細胞にＣａ”受容体蛋白質の存在に よって説明され得る表現型を与えさせ得る。
発明の概要 本発明者らは、今回、Ｃａ”“受容体蛋白質が、体内のＣａ”代謝に関与するあ る特殊化した細胞を、細胞外Ｃａ２４の濃度の変化を感知させ、応答させ得るこ とを示した。これらの受容体はある一般的な特徴を有しながら、選択的に種々の 薬理学的試剤によって影響され得る。下記に詳細に説明するように、ある種の分 子が上皮小体細胞、破骨細胞およびＣ−細胞のＣａ”受容体に選択的作用をもつ ことが確認された。
Ｃａ”受容体は、細胞外Ｃａ”の作用に、類似する（「カルシウム様物質（ｃａ ｌｃｉｕｍｉｍｅｔｉｃｓ）　Ｊ　）か、または拮抗する（「カルシウム拮抗物 質（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃｓ）」）新規な種類の分子のための別個の分子標的を 構成する。この受容体は細胞表面に存在し、細胞外Ｃａ”に対して低い親和性を 有する（みかけのに６は、一般に約０．５ｍＭより大である）。この受容体は、 クーパー、ブルームおよびロス、バイオロジカル・ベインス・オブ・ニューロフ ァーマコロジー、第４章によって定義された、遊離また結合エフェクター機構を 含み得る。すなわち、この受容体は、細胞内Ｃａ””受容体、例えば、カルモデ ユリンおよびトロボニン類とは異なる。カルシウム様物質とは、例えば、Ｃａ” “受容体に選択的に作用し、上皮小体細胞または破骨細胞の機能を直接的または 間接的に抑制し、Ｃ−細胞の機能を刺激するものである。本発明のカルシウム様 物質およびカルシウム拮抗物質は、上皮小体亢進症、骨粗しよう症および他のＣ ａ”＋関連疾患の新しい治療を可能にするものである。この治療は、［Ｃａ　” ］の変化を感知し、応答するこれら３種および他の種類の細胞のそれぞれのＣａ ”受容体を標的にするものである。
本発明は、上皮小体細胞中のＣａ”受容体蛋白質を最初に示したものであり、Ｃ −細胞および破骨細胞などの他の細胞中のＣａ”受容体とを薬理学的に最初に差 別化したものである。本発明はまた、これらのＣａ”受容体に効果を有する分子 を、同定可能にし、Ｃａ２４に活性である有効なカルシウム様物質またはカルシ ウム拮抗物質の発見、開発、設計、修飾および／または構築における主導的分子 として用い得る方法を開示する最初のものである。このカルシウム様物質および カルシウム拮抗物質は、例えば、ホルモン、酵素または成長因子などのポリペプ チド、１種またはそれ以上のＣａ”受容体に活性であることによって制御されま たは影響される、それらの出現および／または放出などの１種またはそれ以上の 成分の正常でない濃度を特徴とする種々の疾病状態の処置に有効である。さらに 、種々の型の細胞における種々のＣａ２４受容体の同定および種々の主導的分子 に対する特定受容体に対する特定の応答は、当該Ｃａ”″受容体における作用に よって、影響される特定の疾患の処置に活性な特定分子の設計および構築を可能 にするものである。例えば上皮小体ホルモン分泌の異常度は、他のＣａ２＋制御 ホルモンなどの分泌の程度に影響を与えることなく、この特定分子によって影響 され得る。
この主導的分子の同定は、活性分子の発見のための効率の高いスクリーニング法 、および有効な薬剤候補を設計するための組織的なデータベースを、先行技術が 欠いていたため妨げられていた。これらの障害は上皮小体細胞Ｃａ”受容体およ び機能的関連受容体をクローニングすることによって、また、今や、このように クローニングされたＣａ２＋受容体および機能的関連受容体を活性化するある主 導的分子の構造的特徴を組織的に試験することによって取り除かれた。Ｃａ”受 容体のクローニングはまた、天然生成物または分子ライブラリーおよび合成分子 の高効率スクリーニングに適当な形質転換セルラインの開発を可能にする。これ は、下記に論じる構造的−活性研究とともに、新規なカルシウム様物質およびカ ルシウム拮抗物質を開発するのに必要な技術を提供するものである。
本発明はこのような操作を可能にするものである。例えば、ひと上皮小体細胞Ｃ ａ”受容体ｃＤＮＡは、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけ る機能的発現についてスクリーニングすることによってクローン化され得、また Ｃａ２゛受容体に活性における活性に必要な有機分子の構造的特徴は選択された 天然生成物または他の分子ライブラリーの試験およびその後の構造的活性試験に よって決定される。
すなわち、第一の態様は、本発明は細胞中の［Ｃａ”］＋の増大を生じさせるこ とによって、細胞外Ｃａ”の活性に類似するか、または細胞外Ｃａ”＋によって 誘発される［Ｃａ　”］、の増大を妨害するかのいずれかである分子を含む医薬 的組成物を特徴とする。分子は５μｍより小さいか、それに等しいＥ　Ｄ　ｓ。
を有し、プロタミンではない。
「類似する」とは、分子が、細胞外Ｃａ　”応答可能細胞に対して、細胞外Ｃａ ２゛の１種またはそれ以上の特定の作用を有することをいう。この述語は、細胞 外Ｃａ２”の生物学的機能のすべてが類似していることを要求するものではなく 、このような機能の少なくとも１種が類似していればよい。さらに、分子が細胞 外Ｃａ２″受容体が結合している受容体の同じ部位に結合する必要もない（例え ば、下記の実施例２０中の新規化合物ＮＰＳ４６７およびその作用参照）。「妨 害する」とは、Ｃａ”のこのような作用の１種が分子によって減じるか、または 妨げられることをいう。ＥＤ、。は下記の試験法によって測定され、その際、類 似作用が測定され、最大類似効果の半分だけ類似している分子の濃度がＥＤ、。
である。逆に、カルシウム拮抗物質のＩＣｓ。は最大活性の半分だけ妨害する量 である。好ましくは、この試験は［Ｃａ”］＋増大を測定し、下記の方法によっ て、Ｃａ”受容体に特異的であること、すなわち、それらの均等物であることを 確認するものである。
好ましい具体例において、ここに記載の生物検定法は、細胞中の［Ｃａ”］＋の 増大が一時的であり、１分より短い時間持続し、［Ｃａ　”］Ｉの増大が急速で あり、３０秒以内に発生し；分子がまた、（ａ）［Ｃａ２４］＋の持続的な増大 （３０秒より長く）を生じさせ、（ｂ）イノシトール−１，４，５−三リン酸お よび／またはジアンルグリセロール濃度の増大を、例えば、６０秒内に、生じさ せ、（Ｃ）ドーパミン−またはイソブレテレノール−刺激サイクリックＡＭＰ形 成を阻害する。
さらに、［Ｃａ”］　Ｉの一時的な増大は、１０分間、１０ｍＭフッ化ナトリウ ムで細胞を前処理することによって阻止されるか、または一時的な増大は、プロ ティンキナーゼＣ１例えばホルボル・ミリスタート・アセタート（ＰＭＡ）　、 メゼレインまたは（−）インドラクタムＶなどの活性化剤で簡単な前処理（１０ 分間より短い）によって減少させることができる。
上皮小体細胞において、上記の試験法のすべてにおいて、活性である分子は、特 に本発明において有効である。それらの分子の作用が当該細胞のＣａ”受容体に 対して特異的であるからでる。これは、特に上記のＰＭＡ前処理については真実 である。
さらに、好ましい具体例において、細胞が上皮小体細胞であり、分子が細胞から の上皮小体ホルモン分泌を阻害するものである：分子は上皮小体細胞、骨破骨細 胞、糸球体近接腎臓細胞、近位小管腎臓細胞、ケラナノサイト、小胞周辺甲状腺 または胎盤中の栄養膜細胞からのｍＲＮＡで注入されたアフリカッメガエル卵母 細胞中の０１−コンダクタンスの増大を誘発する。
別の好ましい具体例において、分子が細胞内Ｃａ”″の移動を生じさせ、［Ｃａ ２゛］、の増大を起こさせる：細胞がＣ−細胞または破骨細胞であり、分子はイ ンビボでの骨吸収を阻害する：細胞が破骨細胞であり、分子がインビトロで骨吸 収を阻害する：または細胞がＣ−細胞であり、インビトロまたはインビボでのカ ルシトニン分泌を刺激する。最も好ましくは、分子が、Ｃａ”受容体の５μＭ以 下、さらに好ましくは１μＭでのＥＣ，。またはＩＣ，。が１００ｎモル、１０ ｎモルまたは１ｎモル以上である。このような低いＥＣ，。またはＩＣ，。は、 治療または診断のためにインビボまたはインビトロで用いられる分子がより低い 濃度であることを可能にするから有利である。このような低いＥＣ６゜およびＩ Ｃ，。の分子の発見は同じく強力かつ効果的な分子の設計および合成を可能にす る。
「カルシウム様」分子とは、細胞外Ｃａ”の１種またはそれ以上の活性を有し、 好ましくは、Ｃａ２＋受容体におけるＣ　ａ　”の活性に類似していることをい う。例えば、上皮小体細胞に関して用いられる場合は、上皮小体細胞で試験した とき、インビトロで、当業者に周知の技術によって測定された下記の１種または それ以上、好ましくは全ての特徴を有している分子である・１、分子が、１μＭ のＬａ３′″またはＧｄ”による阻害に対して無反応性である［Ｃａ”］、にお いて急速（ピークまでの時間〈５秒）かつ一時的な増大を生じさせる。［Ｃａ２ ７］　、の増大は細胞外Ｃａ”の不存在下で持続するが、（細胞外Ｃａ”の不存 在下）イオノマイシンでの前処理によって阻止される；２、細胞外Ｃａ”によっ て誘発される［Ｃａ２４］＋の増大は、ジヒドロピリジン類によって阻害されな い。
３、分子によって生じる［Ｃａ”］＋の増大は１０分間、フッ化ナトリウム１０ μＭでの前処理によって阻止される：４、分子によって生じる［Ｃａ”］　＋の 一時的な増大は、プロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤、例えばホルボル ・ミリスタート・アセタート（ＰＭＡ）、メゼレインまたは（−）インドラクタ ムＶなどでの前処理によって減少させることができる。
プロティン・キナーゼＣ活性化剤の総体的効果は、最大応答に影響を与えること なく、分子の濃度一応答曲線を右にずらすことである：５、分子は、イノシトー ル−１，４，５−三リン酸および／またはシアシリルグリセロールの生成の急速 な（〈５秒）増大を生ぜしめる；６、分子は、ドーパミン−またはイソプロテレ ノール−刺激サイクリックＡＭＰ形成を阻害する； ７、分子は、ＰＴＨ分泌を阻害する。
８、百日咳トキシン（１００ｎｇ／ｍｌ、〉４時間）での前処理は、サイク１ル ックＡＭＰ形成における分子の阻害効果を妨害するが、［Ｃａ　”］　＋、イノ シトール−１゜４．５−三リン酸またはシアシリルグリセロールの増大およびＰ ＴＨ分泌の減少に影響を与えない； ９゜分子は、雄牛またはひと上皮小体細胞からのポリ（Ａ）４に富むｍＲＮＡで 注入されたアフリカッメガエル卵母細胞中のＣＩ−コンダクタンスの増大を誘発 するが、水またはラット脳または肝臓ｍ　Ｒｒ’Ｊ　Ａで注入されたアフリカッ メガエル卵母細胞では影響を与えない：　。
１０、同様に、上皮小体細胞からのクローン化受容体を用いて、受容体をコード 化する特定のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子で導入されたアフリカッメガエル卵母 細胞の応答を誘発する。
「カルシウム拮抗」分子とは、好ましくは、Ｃａ”″受容体に拮抗剤として作用 することによって、細胞外Ｃａ”−感作細胞の細胞外Ｃａ”の１種また（よそれ 以上の活性を妨害することを意味する。例えば、上皮小体細胞に関して用Ｌ）る 場合、インビトロで上皮小体細胞を試験した場合、分子は当業者に周知の技術で 測定された下記の特徴の１種またはそれ以上、好ましくはすべてを有する：１、 分子は、部分的または完全のいずれかで、増大した細胞外Ｃａ　”１１度の能力 を下記のものを妨げる。
ａ）［Ｃａ２４１の増大、 ｂ）細胞内Ｃａ２′″の移動、 Ｃ）イノシトール−１，４，５−三リン酸の生成の増大、ｄ）ドーパミン−また はイソプロテレノール−刺激サイクｌルックＡＭＰ形成の減少、 ｅ）ＰＴＨ分泌の阻害； ２、低［Ｃａ”］＋で、すなわち、Ｑ、５ｍＭで、分子、それ自体は［Ｃａ　” ］　＋を変化させない： ３、分子は、細胞外Ｃａ”“またはカルシウム拮抗化合物によって誘発される、 雄牛またはひと上皮小体細胞からのポリ（Ａ）”−ｍＲＮＡで導入されたアフリ カッメガエル卵母細胞中のＣＩ−コンダクタンスの増大を妨げるが、水またはラ ット脳または肝臓ｍＲＮＡで導入されたアフリカッメガエル卵母細胞では妨げな い４、同様に、上皮小体細胞からのクローン化受容体を用いて、Ｃａ”受容体を コード化する特定のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子で導入されたアフリカッメガエ ル卵母細胞の応答を妨げる。
他の型の細胞のＣａ”受容体における有効なカルシウム様物質およびカルシウム 拮抗物質の平行的定義は、下記の実施例から明白である。
Ｃａ２４受容体はある種の無機ポリカチオンおよびポリカチオン有機分子を感知 し、応答し得る。例えば、上皮小体細胞は、これらの有機ポリカチオンの添加と 細胞外Ｃａ２４濃度の増大を区別することができない。おそらく、これらの有機 分子がＣａ”受容体に細胞外Ｃａ”＋のように作用するからである。本発明のカ ルシウム様物質は、Ｃａ”＋受容体の特別良好なアゴニストであり、選択された 細胞の機能、例えば、上皮小体細胞からのＰＴＨの分泌を変化させる薬剤として 用いることができる。Ｃａ”とは異なり、これらの分子の多くは、すべてではな いが、１種またはそれ以上のＣａ”″′受容体に作用し、すなわち、具体的に１ 種のＣａ”受容体を標的とする能力を有する。
これらの分子は、例えば上皮小体亢進症、骨粗しよう症、パレット病、高血圧、 腎臓病および癌など、［Ｃａ”］　ＩおよびＣａ”が役割を担う種々の疾患の処 置に有効なさらに新規な治療の開発のための主導的構造を有する。
カルシウム様物質およびカルシウム拮抗物質は、患者に投与することによって、 患者の細胞外遊離Ｃａ　”の濃度を制御し、上述の群から選択される細胞に対す る細胞外Ｃａ”効果に似せるのに有効であるような医薬組成物として処方され得 る。
本発明前に、Ｃａ１受容体の操作または制御における異常によって生じる疾患ま たは正常なＣａ”受容体を有するが当該Ｃａ”＋受容体を活性化または不活性化 することによって処置され得ない動物の疾患の処置に有効である、Ｃａ”受容体 に作用するこのような分子は知られていなかった。
さらに、他の好ましい具体例において、上皮小体細胞、骨の破骨細胞、糸球体近 接腎臓細胞、近位小管腎臓細胞、ケラナノサイト、小胞周縁細胞（Ｃ−細胞）、 および胎盤栄養膜細胞からなる群から選ばれる、すべてではないが、１種または それ以上の細胞に、５μＭ以下のＥＤ、６を有する。
本発明で特に有用である分子の作用の明確化は、特定のインビトロまたはインビ ボの治療および診断および別のカルシウム様物質またはカルシウム拮抗物質の発 見を可能にする。
好ましい具体例において、この分子は、生理学的ｐＨが陽性に荷電しており、分 枝状または環状ポリアミン、陽性荷電ポリアミノ酸およびアリールアルキルアミ ンからなる群から選ばれる。例えば、分枝状ポリアミンは、式：Ｈ，Ｎ−（ＣＨ り　Ｉ　（ＮＲ１（ＣＨｚ）＋）　ｋ　ＮＨｚ　（式中、ｋは１〜１０の整数で あり、各ｊは、同一または異なって、２〜１０の整数であり、各Ｒ１は、同一ま たは異なって、水素および−（ＣＨ２）　ｌ　ＮＲ２からなる群から選ばれ、た だし、ｊは上記の意味であり、少なくとも１個のＲ，は水素でない）を有する。
別の具体例において、分子は、式 〔式中、Ｘはそれぞれ独立して、Ｈ，ＣＨ３、ＣＨ３０、ＣＨ，ＣＨ２Ｏ，Ｂｒ ５ＣＬ　Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＦ３０、ＣＨ３Ｓ、０ＨＳＣＨ２ ０ＨＳＣ０ＮＨ２、ＣＮ、Ｎｏ２およびＣＨ３ＣＨｔからなる群から選択され； Ａｒは疎水性物質であり：Ｒはそれぞれ独立して水素、メチル、エチル、プロピ ル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シ クロへブチル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒドロインドリル 、チオジヒドロインドリル、２−１３−または４−ピペリジ（ニ）ルからなる群 から選択され；ＹはＣＨ１窒素および不飽和炭素からなる群から選択され：２は 酸素、窒素、硫黄、（式中、ｎはそれぞれ独立して１から４まで、およびｍはそ れぞれ独立して０から５までである） からなる群から選択される〕 で示される。最も好ましくは、分子は、カルシウム様またはカルシウム拮抗物質 のいずれかである。
好ましい具体例において、疎水性物質は、フェニル、２−１３−または４−ピリ ジル、１−または２−ナフチル、１−または２−キノリニル、２−または３−イ ンドリル、ベンジルおよびフェノキシからなる群から選択される；分子は、Ｒ− ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体、および分子が、式：（Ｘは 、好ましくは、それぞれ独立してＣＬ　Ｆ、ＣＦ３、ＣＨ３およびＣＨ３０から なる群から選択される） である。
本発明の好ましい態様において、式。
〔式中、ａｒｋは、１から６個の炭素原子からなる直鎖または分枝鎖アルキレン であり、Ｒ１は、１から３個の炭素原子からなる低級アルキルまたは１から７個 のハロゲン原子て置換された１から３個の炭素原子からなる低級／％ロアルキル であり、Ｒ２およびＲ３は、独立して炭素環状アリールまたはシクロアルキル基 から選択され、単環または二環のいずれかであり、所望により、独立して、１か ら３個の炭素原子からなる低級アルキル、１から７個のハロゲン原子で置換され た１から３個の炭素原子からなる低級ハロアルキル、１から３個の炭素原子から なる低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アルキルアミ人アミド、１か ら３個の炭素原子からなる低級アルキルアミド、シアノ、ヒドロキシ、２から４ 個の炭素原子からなるアンル、１から３個の炭素原子からなる低級ヒドロキシア ルキルまたは１から３個の炭素原子からなる低級チオアルキルから選択される、 １から５個の置換基で置換されていてもよい５−または６−員環である〕て示さ れる新規フェニル−α−フェネチルアミン同族体および誘導体を提供する。
好ましい炭素環状アリール基は、１個または２個の環をもち、少なくともそのう ちの１つが芳香族特性をもち、フェニルのような炭素環状アリール基およびナフ チルのような２環式炭素環状アリール基を含む。上記の式から明らかなように、 そこに含まれる化合物は、ラセミ体混合物としておよび個々の立体異性体として 導体であり、それは血清中イオン化カルシウム低下の促進活性を示すと信じられ ている。
好ましい化合物はａｌｋがｎ−プロピレンであるものを含む。Ｒ，がメチルであ る化合物もまた好ましい。Ｒ２およびＲ３が所望により置換されていてもよいフ ェニルである化合物もまた好ましい。
特に好ましい化合物は、Ｒ２が一置換、さらに好ましくはメター置換フェニルで あるものを含む。特に好ましいＲ３基は、非置換または一置換、好ましくはオル ト−置換フェニルを含む。Ｒ２の好ましい置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、 好ましくはトリハロメチルおよびアルコキシ、好ましくはメトキシを含む。Ｒ３ の好ましい置換基はハロゲンを含む。
２番目に関連のある態様において、本発明は、１種またはそれ以上の細胞または 血液中または血漿中または細胞外体液中の正常でない［Ｃａ２“］または［Ｃａ ２４］、により特徴付けられる疾患または症状である患者を処置するための方法 を特徴とする。この方法は、患者に治療的有効量の、細胞内の［Ｃａ”］　、の 上昇により生起される細胞外Ｃａ”の活性に類似するか、または細胞外Ｃａ”″ により誘導される［Ｃａ　２′″］ｌの増加を妨害するのいすでかである１種ま たはそれ以上の分子を投与する工程を含む。
「正常でない」とは、患者が一般の集団と比較して異なったＣａ”″代謝産物を もち、それは血中または細胞外体液中の１種またはそれ以上の蛋白質（例えばホ ルモン類）、または細胞外および／または細胞内Ｃａ２＋の濃度に影響を及ぼす 他の分子により影響を受けている。すなわち、本疾患は、上皮小体機能亢進症、 骨粗麩症およびミネラル関連疾患等（例えば、“ハリソンズ・プリンシバルズ・ オブ・インターナル・メディングのような標準的医学書に記載）を含む。このよ うな疾患は、本発明において、１個またはそれ以上のＣａ”の効果に類似するま たは妨害し、それによって、直接または間接的に患者の体内の蛋白質または他の 分子の濃度に影響を与える分子により処置される。
「治療的有効量」とは、患者の疾患または症状の１種またはそれ以上の症状をあ る程度まで軽減する量を意味する。さらに、「治療的有効量」とは、疾患または 状態に関連するまたは原因となる生理学的または生化学的パラメーターを、部分 的または完全に正常に戻す量を意味する。一般に、分子の約ｌ　ｒｕ＋＋ｏｌか らｌ　ｇａｏｌの間の量であり、そのＥ　Ｃｓ。および患者の年令、体重および 疾患に依存する。
好ましい具体例において、分子は５μＭより小さいか、それに等しいＥＣ，。を 有し、プロタミンではなく；最も好ましくは、Ｃａ”受容体にカルシウム様また はカルシウム拮抗物質として相互作用する。最も好ましくは、分子は上記の１つ から選択される。
他の好ましい具体例において、患者は、１個またはそれ以上の成分の異常な濃度 を特徴とする疾患に罹患し、その濃度は１個またはそれ以上のＣａ２４受容体の 活性により制御されまたは影響を受け、分子は上皮小体細胞、骨中の破骨細胞、 腎臓中の糸球体近接細胞、腎臓中の近位小管細胞、ケラナノサイト、甲状腺の小 胞周縁細胞および胎盤中の栄養膜からなる群から選択された細胞のＣａ”受容体 に活性である。
更に他の好ましい具体例において、分子は、患者の血漿中の上皮小体ホルモンの 濃度を、例えば正常の個人で見られる濃度までか、または血漿Ｃａ”の減少の原 因となるのに充分な程度まで減少させ：この分子は患者に治療的に適当な効果を もつのに十分な程度まで提供される。
第３の態様において、本発明は、患者の１個またはそれ以上のＣａ　”″受容体 の数および／または位置（および／または機能的完全性）の同定、およびその疾 患または症状としての指数数および／または位置（および／または機能的完全性 ）と健常者で観察されるものとの比較による患者の疾患または病気の診断の方法 を特徴とする。
好ましい具体例において、本方法は、Ｃａ２４受容体に対する抗体をＣａ”受容 体の数および／または位置および／または機能的完全性を測定するのに使用する 免疫測定法であり、または測定法は、Ｃａ２４受容体に結合する標識カルシウム 様またはカルシウム拮抗分子の提供を含み；診断される疾患は癌、例えば上皮小 体ホルモン、または骨の破骨細胞中の数が上記の正常レベルであることまたは骨 の破骨細胞での活性の程度の増大を特徴とする症状である。
第４の態様において、本発明は、治療的分子として有用な分子を同定するための 方法を特徴とする。本方法は、細胞内で細胞外Ｃａ”＋の活性に類似した能力を もつか、または細胞外Ｃａ”により誘導される［Ｃａ”］、の増加を妨害する能 力のいずれかに潜在的に有効な分子のスクリーニング、および分子が５１１Ｍよ り小さいかそれに等しいＥｃｓｅまたはＩＣ，ｏを有するか否かの測定を含む。
他の態様において、本発明は組み換えＣａ”″″受容体、組み換えＣａ”受容体 を含む細胞、Ｃａ”受容体をコード化する精製核酸、生物学的活性および分子Ｎ ＦＳ０１９の使用、ＮＰＳ４５９、ＮＰＳ４６７、ＮＰＳ５５１およびＮＰＳ５ ６８（Ｆｉｇ。３６参照）を材料とする新規化合物または組成物および、例えば 組み換えＣａ２４受容体の使用による、最初のＣａ”受容体であるが２番目では ない受容体でＣａ”の１個またはそれ以上の活性に類似または妨害する分子を同 定することによる有用なカルシウム様またはカルシウム拮抗分子の同定方法を特 徴とする。
「組み換え体」とは、組み換えＤＮＡ技術により製造される、天然に存在するＣ ａ”受容体からその位置、純度または構造のいずれかにより区別されるような任 意のＣａ”受容体を含むという意味である。一般に、このような受容体は通常天 然に観察されるのと異なった量で細胞に存在する。
「精製」とは、抗体または核酸が天然に存在する抗体または核酸と区別され、天 然に見い出される抗体または核酸から分離され、例えばベクター系において、組 み換えＣａ２＋受容体発現に使用されることを意味する。好ましくは、抗体また は核酸は標準技術により均質調製物として提供される。
このようなりローン化受容体は、所望の細胞中で発現され得、構造決定のために 単離され結晶化され得る。このような構造は、Ｃａ２＋受容体に結合できる本発 明の有用な分子の設計を可能にする。さらに、このような受容体の同等物が、他 の細胞、ｃＤＮＡまたはゲノム性ライブラリーのクローンのために、最初のクロ ーンをプローブとして使用してクローン化され得る。
クローン化受容体のための抗体は単離でき、本発明の治療剤として、またはＣａ ２４−関連疾病または症状の診断のためのＣａ”受容体の数および／または位置 および／または機能的完全性を測定するための診断用手段として使用できる。こ のような抗体はカルシウム様またはカルシウム拮抗物質として静脈内投与するこ とによりまたイン・ビボで使用できる。
すなわち、一般に、本発明は、上皮小体細胞、骨中の破骨細胞、腎臓中の糸球体 近接細胞、腎臓中の近位小管細胞、ケラナノサイト、甲状腺の小胞周縁細胞およ び胎盤中の栄養腫細胞からなる群から選択された、全てではないが１個またはそ れ以上の細胞のＣａ２４受容体において選択的アゴニストまたはアンタゴニスト のいずれかとして作用することができるカルシウム様またはカルシウム拮抗物質 を特徴とする。このような組成物は、医薬組成物を提供するために当分針の技術 者に公知の任意の薬理学的に許容可能な担体を含み得る。
本発明は、また、疾病状体の治療法として、標準技術、例えばアンチセンスおよ び関連技術（例えば、リボザイムＱ）による患者のＣａ”″受容体の数の調整を 特徴とする。
本発明は、以下に明らかにするように、カルシウム様物質及び／又はカルシウム 拮抗物質を検出する検出法を用いてＣａ”レセプターの活性に影響を及ぼす分子 を確認する方法を提供する。さらに検出法又は抗体又は以下に記載される他の技 術の使用により転写又は翻訳レベルでＣａ”レセプターの発現を減少又は増加す るのに効果があると見られる分子を治療用途用に定義できる。
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施態様の以下の記載から及び請求 の範囲から明らかであろう。
好ましい実施態様の記載 図面をまず簡単に説明する。
図面 図１は本発明において有用な代表分子を描く。
図２は、キン−２−又はフラー２−を与えたウシ上皮小体細胞の細胞外Ｃａ”に より誘導される［Ｃａ”］＋（’）増加を示すグラフ表現である。開始［Ｃａ” “］は０゜５ｍＭ　（ＣａＣ１ｚ使用）で、矢印の各々で０．５■Ｍ増加で増加 した。・図３は、ウシ上皮体細胞での［Ｃａ”］１の可動化を示すグラフ表現で ある。開始［Ｃａ”］は０．５■Ｍで、示されるようにＥＧＴＡの添加によりく １μＭまで減少した。（ａ）細胞外Ｍｇ”　（８＋ａＭ、最終）は細胞外Ｃａ” の不存在で［Ｃａ２４受容の増加を惹起する。（ｂ）イノマイシン（１μＭ）に よる前処理はＭｇ”への反応をブロックする。（Ｃ）５μＭ分子１７９９　（ミ トコンドリア脱共役剤ロニよる前処理は　Ｍｇ　Ｗ　’″への反応に効果がない 。
図４は、［Ｃａ”］＋の定常状態増加への低濃度のＧｄ’“の選択的阻止効果、 及び高濃度のＧｄ３”が［Ｃａ”］、の一時的増加を惹起することを示すグラフ 表現であるＯ上部パネル・コントロール。細胞外Ｃａ２　＊の開始濃度はＱ、５ ＋ｍＭで、矢じり形の各々でＱ、５ｍＭ増加した。中央パネル：Ｇｄ”　（５μ Ｍ）は定常状態でブロックするが、細胞外Ｃａ”により惹起される［Ｃａ”］　 ｌの一時間増加をプロ・ツクしな％ＮＯ下部パネル：Ｇｄ”　（５０μＭ）は［ Ｃａ”］＋の一時的増加を惹起し、細胞外Ｃａ”への一時的及び持続反応を終わ らせる。中央及び下部ノくネルにおいて、ちょうど十分なＥＧＴＡを加えて選択 的にＧｄ”をキレートした。Ｃａ２４流人のプロ・ツクを除き［Ｃａ”］＋は急 速に上昇する。
図５は、［Ｃａ”］、、■Ｐｓ形成及びＰＴＨ分泌へのＰＭＡの効果は細胞外Ｃ ａ”の濃度を増すことにより阻止されることを示すグラフ表現である。各変数に ついて、細胞外Ｃａ”についての濃度−反応曲線で右へのシフトがある。又、濃 度−反応曲線が［Ｃａ”］が直線状に増加するとＳ字状に変化することにも注意 されたい。
図６はスペルミンにより惹起される［Ｃａ”］、の増加が［Ｃａ”］を増すこと により徐々に弱まることを示すグラフ表現である。スペルミン（２００ｎＭ）は 矢じり形で示される時間に添加した。本及び以下の図面において、図形に付され ている数字は、ｎＭでの［Ｃａ”］、である。
図７は、スペルミンがウシ上皮小体細胞の細胞内Ｃａ”を可動化することを示す グラフ表現である。示されるように゛（左図形）、スペルミン（２００ｎＭ）の 添加前にＥＧＴＡを加えて［Ｃａ”］を〈ｌμＭに減じた。イオノマイシン（１ ｎＭ）による前処理はスペルミンへの反応をブロックする（右図形）。
図８及びＢは、スペルミンが細胞外Ｃａ”と同様に［Ｃａ”］＋を増加しウシ上 皮小体細胞でのＰＴＨ分泌を阻害することを示すグラフ表現である。スペルミン 用量−濃度反応曲線についてのデータ点は２つの実験の平均である。
図９は、細胞外Ｃ８２゛への反応に対する、及び上皮小細胞のＡＴＰγＳへの反 応に対するＰＭＡの対照的に示す効果を示すグラフ表現である。左パネル：サイ クリックＡＭＰ形成の細胞外Ｃａ”−誘発阻止についての濃度−反応曲線はＰＭ Ａ（１００ｎＭ）により右にシフトする。中央パネル　ＰＭＡは、ＡＴＰγＳの ［Ｃａ”］、を増加する能力に影響を及ぼさない。ＡＴＰγＳに対する濃度−反 応曲線が、対数濃度の関数として、細胞外二価カチオンと対照的に古典的Ｓ字状 動きを示すことにも注意されたい。
図１０は、細胞外Ｍｇ”により引き出されるヒト上皮小体細胞の細胞内Ｃａ”の 可動化を示すグラフ表現である。細胞はアデノーマから得て、Ｑ、５ｒｎＭ細胞 外Ｃａ”を含む緩衝液中に入れた。（ａ）細胞外Ｍｇ”　（１０ｍＭ、最終）に より惹起される［Ｃａ”］５の一時的及び維持続増加は、持続増加がニモジピン （１ｎＭ）により影響されないがＬａ”（ｌμＭ）により減少し、Ｌａ”を低濃 度のＥＧＴＡにより選択的にキレート化すると速やかに元にもどることを示す。
（ｂ）　Ｌａ”　（１ｎＭ）は、維持続増加をブロックするが細胞外Ｍｇトによ り惹起される［ｃａｚ”Ｌの一時的増加をブロックしない。（Ｃ）細胞外Ｍｇ” により惹起されるサイドシルＣａ”一過性は細胞外Ｃａ”の不存在で持続する。
図１１は、ウシ上皮小体細胞中、ネオマイシン又はプロタミンにより引き出され る細胞内Ｃａ”の可動化を示すグラフ表現である。全ての図形で、開始［Ｃａ” ］及び［Ｍｇ”″］はそれぞれ０．５及び１ｍＭであった。図形（ａ）及び（ｂ ）において、Ｃａ”“及びＭｇ”１１度は、それぞれ０．５及び１＋ｍＭから２ 及び８ｍＭに増加した。他の図形において、（Ｃ）ないしくｉ）は、ネオマイシ ンＢ（３０ＭＭ）又はプロタミン（ｌ　ｕｇ／ｍｌ）を示すように加えた。Ｌａ ”（１８Ｍ）、ＥＧＴＡ　（’１＋Ｍ）又はイオマイシン（１００ｎＭ）を示す ように加えた。各図形は、少なくとも３つの異なる細胞調製品を用いる５又はそ れ以上の試験で見られるパターンの代表である。バー−１分。
図１２は、ネオマイシンＢが一過性をブロックするが細胞外Ｃａ”により惹起さ れる［Ｃａ”］、の定常状態増加をブロックしないことを示すグラフ表現である 。
左コントロール：　［Ｃａ”］は開始が０．５ｍＭでネオマイシンＢ（３０ＭＭ ）の添加前に冬用いた矢じり形で１５ｍＭ増加にて増した。右：ネオマイシンＢ （３０ＭＭ）を［Ｃａ”］前に加えた。バー−１分。
図１３は、ネオマイシンＢ又はプロタミンが［Ｃａ”］、の増加を誘引する濃度 でＰＴＨ分泌を阻害することを示すグラフ表現である。細胞は示される濃度の有 機ポリカチオンと３０分間インキュベートした。中空の印：コントロールは０゜ ５（円）又は２ｍＭ（ひし形）の細胞外Ｃａ”の存在でＰＴＨ分泌に反応する。
［Ｃａ２４］ｌの値はひし形印である。ウシ細胞をプロタミンによる実験に用い 、ヒト（アデノーマ）上皮小体細胞をネオマイノンＢによる実験に用いた。各点 は３回の実験の平均±ＳＥＭである。
図１４は、スペルミンにより惹起されるサイドシルＣａ”一過性へのＰＭＡの選 択的阻害効果を示すグラフ表現である。開始［Ｃａ”］は０．５ａＭであった： スペルミン（２００ｎＭ）又はＡＴＰ　（５０ＭＭ）は示されるように加えた。
バー−１分。
図１５は、ＰＭＡが［Ｃａ”］、の細胞外Ｃａ”−及びネオマイシンＢ−誘発増 加についての濃度−反応曲線を右にシフトすることを示すグラフ表現である。細 胞は、［Ｃａ”］増加前、又は示されるようにネオマイシンＢを添加する前に１ 分間ＰＭＡで前処理した。各点は３ないし５回実験の平均±ＳＥＭである。
図１６は、ＰＭＡがＰＴＨ分泌の細胞外Ｃａ２４−及びスペルミン−誘発阻害に ついての濃度−反応曲線を右にシフトすることを示すグラフ表現である。細胞は 、１１００ｎ　ＰＭＡの存在下（黒ぬり円）又は不存在下（中空円）に３０分間 示された［Ｃａ”］及びスペルミンとインキュベートした。各点は、３回の実験 の平均±ＳＥＭである。
図１７は、プロタミンがイノシトールリン酸エステルの形成を増幅することを示 すグラフ表現である。上皮小体細胞は４ｕＣｉ／ｌ！ｌ　”Ｈ−ｍｙｏ−イノシ トールを含む培養培地中、−液インキユベートし、洗浄し、示される濃度のプロ タミンと３７℃でインキュベートした。３０秒後、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＨＣ Ｉの添加により反応を停止させ、ＩＰ、（円）及びＩＰ３（三角形）をアニオン 交換クロマトグラフィにより分離した。
図１８は、ＰＭＡが細胞外Ｃａ２′″又はスペルミンにより引き出されるＩＰ、 の形成を減することを示すグラフ表現である。３Ｈ−ｍｙｏ−イノシトール−標 識細胞は、反応を停止し、アニオン交換クロマトグラフィによりＩＰ、を分離す る前に、３０秒間示された［Ｃａ２“］又はスペルミンに暴露した。ハツチ（ｈ ａｔｃｈｅｄ）カラム細胞は［Ｃａ”］増加又はスペルミン添加前、５分間ＰＭ Ａ　（１００ｎＭ）で前処理した。各位は、それぞれ３回実施した２つの実験の 平均である。
図１９は、ヒト（アデノーマ）上皮小体細胞でのネオマイシンＢにより惹起され る［Ｃａ”］、の一時的及び持続増加を示すグラフ表現である。［Ｃａ”］は１ ５５ｍであった。（ａ）ネオマイシンＢ（１０ＭＭ）により惹起される［Ｃａ” ］、の持続増加はＬａ３４により減じた。（ｂ）ネオマイシンＢにより引き出さ れる［Ｃａ２゛］、の一時的増加はＬａ３４により影響されなかった。（ｃ）　 ［Ｃａ２４］、の一時的増加は細胞外Ｃａ２＋の不存在で持続した。
図２０は、ネオマイシンＢがＣａ”レセプターを発現するクセノブス卵母細胞で 振動増幅ＣＦコンダクタンスを誘引することを示すグラフ表現である。卵母細胞 から上部図形、ヒト（増殖性）上皮小体細胞ポリ（Ａ）”−ｍＲＮＡ注射後３日 。
卵母細胞から下部図形、水注射。ネオマイシンＢは５つの水注射卵母細胞で反応 を惹起せず、カルバコールは示されるように反応を惹起した。両図形で、保有電 位は一７６ｍＶであった。
図２１は、ネオマイシンＢがＣ−細胞で基本又は誘引増加に影響しないことを示 すグラフ表現である。コントロール、左図形：フラー２−を与えたｒＭＴＣ６− ２３細胞は、［Ｃａ”］を３３ｍに増加する前に、１前ＭＣａ”を含む緩衝液に まず浸漬した。右図形：５ｍＭネオマイシンＢによる前処理。
図２２は、細胞外Ｃａ”がラット破骨細胞で［Ｃａ”］、の増加を誘引すること を示すグラフ表現である。インド−１を与え、示された［Ｃａ”］を含む緩衝液 で示された時間（バー）過融解した単一ラット破骨細胞でのミクロ蛍光定量。正 常緩衝液は、バーの間で過融解し、ｌ＋ａＭ　Ｃａ”を含有した。
図２３は、スペルミン又はネオマイシンＢがラット破骨細胞で［Ｃａ”“］、の 増加を誘引しないことを示すグラフ表現である。インド−１−を与えた破骨細胞 は示された濃度のスペルミン又はネオマイシンＢ（中空バー）のみで又は２０５ ＭＣａ”と共に（黒ぬりバー）過融解した。
図２４は、ウシ上皮小体細胞での［Ｃａ”］、へのアルギオトキンン（図でアル ギオピンとして示す、構造も図１に示す）６５９及びアルギオトキシン６３６の 特異的効果を示すグラフ表現である。開始［Ｃａ”］は００．５ｍで、示された ところで（右図形）１．５ｍＭに増加した。示されたところでアルギオトキソン ６５９（３μＭ）又はアルキオトキンン６３６　（４００ｎＭ）を加えた。
図２５は、細胞外Ｍ　ｇ　２　’又はＧｄ”がウソ上皮小体細胞ポリ（Ａ）”− ｍＲＮＡを注射したクセノブス卵母細胞でのＣＦコンダクタンスを振動増幅する ことを示すグラフ表現である。図形（ａ）において、細胞外Ｃａ２“の濃度はく １ｎＭで、図形（ｂ）では０．７ｍＭてあった。図形（ｃ）は、物質にとの過融 解は反応を誘引するけれとも、細胞外Ｍｇ”は、物質にレセプターに対し、ｍＲ ＮＡだけを注射した卵母細胞で反応を惹起しないことを示す。保有電位は−７０ ないし一８ＱｓＶであった。
図２６は、細胞外Ｃａ”が、ヒト（増殖性）上皮小体組織ポリ（Ａ）’−＠ＲＮ Ａを注射したクセノブス卵母細胞でのＣＦコンダクタンスの振動増幅を惹起する ことを示すグラフ表現である。卵母細胞は、５０ｎｇポリ（Ａ）”−ｍＲＮＡの 注射後３日に細胞外Ｃａ２′″に対する反応性を試験した。保有電位は一８０１ Ｖであった。
図２７は、ブドムンキアミンにより惹起されたウシ上皮小体細胞での細胞内Ｃａ ２４の可動化を示すグラフ表現である。ブドムンキアミン（３００μＭ１構造も 示す）を示したところに加えた。
図２８は、上皮小体細胞の細胞内Ｃａ”を可動化する能力が立体特異性であるこ とを示すグラフ表現である。フラー２を与えたウシ上皮小体細胞は、示された濃 度の各分子の添加前に、０．５ｍＭ細胞外Ｃａ”“を含む緩衝液にまず懸濁させ た。
図２９は、破骨細胞の［Ｃａ”］、へのＬａ”の影響を示すグラフ表現である。
インド−１を与えた単一ラット破骨細胞からの代表図形を示す。低濃度で、Ｌａ ”は、細胞外Ｃａ”により惹起された［Ｃａ”］、の増加を部分的にブロックす る。
図３０ＡおよびＢは、ラット破骨細胞での細胞外Ｍｎ”＋により惹起された細胞 内Ｃａ”の可動化を示すグラフ表現である。細胞外Ｍ　ｎ　”　”は、細胞外Ｃ ａ”の不存在で持続する（図３０　Ｂ）　［Ｃａ２４１１の濃度依存増加を誘引 する（図３ＯＡ）。
図３１Ａ及び３１Ｂは、ＮＰＳ４４９　（図３８参照）と名付けられた分子によ り惹起されたラット破骨細胞での［Ｃａ”］、の可動化を示すグラフ表現である 。
インド−１を与えた分離ラット破骨細胞は、ｌ＋ｎＭ細胞外ＣａＣ１４の存在（ 図３１Ａ）又は不存在（図３１Ｂ）で、示された濃度のＮＰＳ４４９と過融解し た。
図３２は、ＮＦＳＯ１９（図１参照）により誘引されたＣ−細胞での細胞内Ｃａ 　２ａの可動化を示すグラフ表現である。ｒＭＴＣ６−２３細胞はフラー２を与 え、０．５ｍＭ　［Ｃａ”］を含む緩衝液に浸漬した。示されたところで、ＮＦ ＳＯ１９を１０μＭの最終濃度まで加えた。代表的図形は、ＮＦＳＯ１９により 惹起された［Ｃａ”］、の一時的増加がＬａ”による阻害に抵抗性であり（中央 図形）、細胞外Ｃａ”の不存在で持続する（右図形）ことを示す。
図３３は、ＮＰＳ４５６　（図３６）がウシ上皮小体細胞ポリ（Ａ）“−ｍＲＮ Ａを注射していたクセノブス卵母細胞での０１−流の振動増幅を誘引することを 示すグラフ表現である。
図３４は、細胞外Ｃａ”が、ヒト破骨細胞ｍＲＮＡを注射していたクセノブス卵 母細胞でのＣ１−流の振動増幅を誘引することを示すグラフ表現である。卵母細 胞は、５０ｎｇの全ポリ（Ａ）”ｍＲＮＡの注射後、３日に細胞外Ｃａ”の反応 性を試験した。
図３５は、上皮小体細胞Ｃａ”″レセプターが２．５−３．５ｋｂの大きさの範 囲でｍＲＮＡにより暗号化されることを示すグラフ表現である。ウシ上皮小体細 胞ポリ（Ａ）′″−ｍＲＮＡは変性グリセロール分配でサイズ分画し、１０分画 にプールした。各分画を別々にクセノブス卵母細胞に注射した（５０ｎｇ／分画 ）。３日後、卵母細胞は、ＣＩ−コンダクタンスの振動増幅による細胞外Ｃａ” への応答能力について試験した。
図３６は、本発明の有用な分子を見出すために製造されスクリーンされた分子の 族を示す、ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミンから誘導された分子の化 学構造を示す。
図３７は、ＮＰＳＯ２１がウシ上皮小体細胞での［Ｃａ”］＋への細胞外Ｃａ” ＋の効果をブロックするカルシウム拮抗化合物であることを示すグラフ表現であ る。
細胞は、０．５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む緩衝液に浸漬し、示されるところで［Ｃ ａ”］を最終２ｍＭまで増加した（左図形）、ＮＰＳＯ２１（２００μＭ）の添 加は［Ｃａ２４］に変化を起こさなかったが、細胞外Ｃａ”＋により惹起された ［Ｃａ”］、の増加を阻止した（右図形）。
図３８は、ＮＰＳ４６７に対するインビボＣａ”反応を示すグラフである。
図３９は、ＮＰＳ４６７に対するインビボＰＴＨ反応を示すグラフである。
図４０は、２５ｍｇ／ｋｇＮ　Ｐ　Ｓ　４６７に対するインビボＣａ”＋反応を 示すグラフである。
図４１及び４２はＮＰＳ４６７の異なる鏡像体に対するインビボＣａ”反応を示 すグラフである。
図４３ａは、図３６に記載されたフェンシリン又はフェンシリン類似体又は誘導 体の製造のための反応式を描く。図４３ｂは、ＮＰＳ４６７の合成のための反応 式を描く。
図４４は、ＮＰＳ４６７が、経口投与すると、血清イオン化カルシウムを低下す ることを示す用量反応曲線を描（。
カルシウム様及びカルシウム拮抗分子 本発明に有用なカルシウム様及びカルシウム拮抗分子は一般的に上記される。
これらの分子は、Ｃａ”レセプターでのＣａ”の活性を模倣し又は拮抗する分子 を明らかにするスクリーニング方法を用い容易に確認できる。そのような方法の 例を、以下に提供する。これらの例は本発明を限定するものではなく、単に当業 者により容易に用いられ、又は適用される方法を示すものである。
一般にカルシウム様及びカルシウム拮抗分子は、以下に記載されたもの（導出分 子と呼ばれる）にならって修飾される分子をスクリーニングすることにより確認 される。以下に見ることができるように、種々のＣａ”レセプターに有用な幾つ かの特異的カルシウム様物質及びカルシウム拮抗物質がある。誘導分子は標準的 方法により容易に計画され、当業者に知られた多くのプロトコールの一つで試験 する。多くの分子を、本発明に最も有用なものを確定するために容易にスクリー ンしつる。
他の系でＣａ”の作用を模倣し又は拮抗する有機カチオン分子はＣａ”レセプタ ーへの活性についての必要な構造を含む。他の有用な分子の理論的設計は、カル シウム様又はカル／ラム拮抗であることが知られた分子の研究及びその既知分子 の構造を修飾することを含む。例えばポリアミンは、スペルミンが幾つかのイン ビトロ系でＣａ”の活用を模倣するので、潜在的にカルシウム様である。結果は 、スペルミンが実際細胞外二及び三価カチオンにより惹起されたものを連想させ る［Ｃａ”］及びＰＴＨ分泌に変化を起こすことを示す（以下参照）。以下に概 略述べる実験は、従って、スペルミンにより得られたこの現象学が細胞外Ｃａ２ “により用いられる同じ機構を含むことを示すことを目ざしている。これを行う ため、Ｃａ２４レセプターの活性化を特徴づける種々の生理的及び生化学的パラ メーターへのスペルミンの影響を評価した。同様の効果を有するこれらの分子は 、本発明に有効であり、スペルミンと同様の構造を有する分子を選択又は製造す ることによって発現できる。一度、他の有用な分子が発見されると、本選択方法 は容易に繰り返すことができる。
明瞭さのゆえに、以下に上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプターに活性であるか、又は ［Ｃａ”］の変化に対する細胞応答のアゴニスト又は拮抗体として作用する有用 な分子を確認するための特別な一連のスクリーニングプロトコールを提供する。
同等の検定を、他のＣａ２＋レセプターに活性な、そうでないにせよ［Ｃａ！’ ］により調節される細胞機能を模倣し又は拮抗する、分子について用いることが できる。
これらの検定は、本発明のカルシウム状分子を見出すのに有用である方法の例と なる。同等の方法は、細胞外Ｃａ”の作用に最も拮抗する分子をスクリーニング することによりカルシウム拮抗分子を見出すのに用いることができる。インビト ロ検定を、標準的技術によりこれらのカルシウム様物質及びカルシウム拮抗物質 の選択性、可飽和性（ｓａｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）及び可逆性を特徴づけるのに 用いることが一般にフラー２を与えた上皮小体細胞は０．５ｍＭ　ＣａＣ１□を 含む緩衝液にまず懸濁する。試験物質をキュベツトに少量（５−１５μｍ）加え 、蛍光シグナルの如何なる変化にも注意する。試験物質の濃度の累積増加を、い くらかの予め定めた濃度に達するか、又は蛍光の変化が見られるまで、キュベツ ト中で行う。蛍光の変化が見られなければ、分子は不活性と考えられ、さらに試 験は行わない。例えばポリアミン型分子による最初の研究では、分子は５又は１ ０＋ａＭの高い濃度で試験した。より有効な分子が今や知られているので（以下 参照）、天井濃度を低（する。例えば、新しい分子は５００μＭまでの濃度又は それ以下で試験する。
この濃度で蛍光に変化が認められなければ、その分子は不活性と考えることがで きる。
［Ｃａ”］に増加を生ずる分子は付加的試験に付す。カルシウム様分子としてそ の考察に重要な分子の二つの本貫的特徴は、細胞内Ｃａ”の可動化とＰＫＣアク チベーターへの感受性である。ＰＭＡ−感性方法で細胞内Ｃａ”の可動化を起こ している分子がカルシウム様分子であること、そしてＰＴＨ分泌を阻害すること を常に見出した。必要なら、付加的試験を、この考えを強固にするために実施し た。典型的には、カルシウム様又はカルシウム拮抗活性（上記参照）についての 全ての種々の試験は行わない。むしろ、分子がＰＭＡ−感性方法で細胞内Ｃａ２ ′″の可動化を起こしたならば、それはヒト上皮小体細胞でのスクリーニングに 昇格する。例えば［Ｃａ”］、の測定は、ＥＣ５，を決定するために、又、−次 又は二次上皮小体亢進に対し外科手術を受けている患者から得たヒト上皮小体細 胞でのＰＴＨ分泌を阻止する分子の能力を測定するために行う。ＥＣ，。又はＩ Ｃ６゜が低ければ低いほど、カルシウム様物質又はカルシウム拮抗物質としての 分子はより有効である。
フラー２による［Ｃａ”］の測定は、活性について新しい有機分子をスクリーニ ングする非常に速やかな方法を提供する。単一の午後に、１０−１５分子を試験 し、それらの細胞内Ｃａ”を可動化する（又はしない）能力を評価することがで きる。ＰＭＡによる減少に対する［Ｃａ”］、の観察された如何なる増加の感受 性も評価できる。さらに、単一細胞調製品は［Ｃａ”］、、サイクリックＡＭＰ レベル、ＩＰ及びＰＴＨ分泌についてデータを提供できる。典型的な方法は、細 胞にフラー２を与え、次いで細胞懸濁液を二つにけることである。はとんどの細 胞は［Ｃａ２“］Ｉを測定するのに用いられ、残りは分子とインキュベートして サイクリックＡＭＰ及びＰＴＨ分泌に関するそれらの影響を評価する。サイクリ ックＡＭＰ及びＰＴＨについての放射免疫検定の感受性の理由で、両変数は、Ｑ 、３ｍｌ細胞せ濁液（約５００．０００細胞）を含む単一インキュベーション管 で測定できる。
イノシトールリン酸エステルの測定は、スクリーニングの時間つぶしの局面であ る。しかしながら、塩化物（どちらかといえばギ酸塩）で溶出されるイオン交換 カラムは、（約３０時間を要する）回転減圧蒸発を必要としないので、ＩＰ３形 式をスクリーニングする非常に迅速な方法を提供する。この方法は単一の午後に ほぼ１００試料の手続きを可能にする。［Ｃａ”］＋、サイクリックＡＭＰ、Ｉ Ｐ。
及びＰＴＨの測定により評価されるように興味を起こさせるこれらの分子は、次 いで種々のイノシトールリン酸エステルの形成を試験し、ＨＰＬＣによりそれら の異性形を評価することによる、より厳格な分析に付す。
これらのプロトコールで検出される興味ある分子は、次いで例えばラットＭＴＣ ６−２３細胞系を用い例えばカルシトニン−分泌Ｃ−細胞での［Ｃａ”］へのそ れらの影響を試験することにより、特異性を評価する。
以下は、これらのスクリーニング方法に有用な方法の例示である。種々の試験カ ルシウム様又はカルシウム拮抗分子についての典型的結果の例を図２−３４に与 える。
上皮小体細胞調製 上皮小体腺を、地元の畜殺場で新たに屠殺した仔ウシ（１２−１５週令）から得 て、（ｍＭ）：ＮａＣ１，１２６；ＫＣＩ、４　：　ＭｇＣ１ｚ、１　；Ｎａ− ＨＥＰＥＳ。
２０；ｐＨ７，４；グルコース、５．６及び可変量のＣａＣ１ｚ、例えば１．２ ５＋Ｍを含む氷冷上皮小体細胞緩衝液（ＰＣＢ）中で実験室に移した。−次又は 、尿毒症上皮小体亢進（ＨＰ　Ｔ）のため上皮小体組織の外科手術除去を受けて いる患者から得たヒト上皮小体腺をウシ組織と同様に処理した。腺は過剰の脂肪 と結合組織を取り除き、次いで鋭利なはさみで２−３ｍの適当なさいころに刻ん だ。次いで分離した細胞をバーコル緩衝液中で遠心分離により精製した。得られ る上皮小体細胞調製品は相対比顕微鏡及びスーダンブラックＢ染色により評価さ れる限り実質的に赤血球、脂肪細胞及び毛細管組織が無かった。分離し、精製し た上皮小体細胞は５ないし２０細胞を含む小さな固りとして存在した。トリパン ブルー又はエチジウムプロミドの除外により示されるように、細胞生存度は通常 通り９５％であった。
細胞はこの時点で実験目的に用いることができるが、生理的反応（ＰＴＨ分泌の 抑制可能性及び［Ｃａ”］：の休止レベル）は、細胞を一液培養後、より良好で ある。−次培養も、イノシトールリン酸エステル代謝の測定を含む研究に必要な 一コル分配による精製後、細胞を５０　ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ 　Ｕ／ｍｌペニンジン、５ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンを補足したハムＦ１２−ダ ルベツコ修飾イーグルス培地（ＧＩＢＣＯ）とＩＴＳ”の１ｚ１混合物で数回洗 浄した。ＩＴＳ”はインスリン、トランスフェリン、セレン及びウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）−リルン酸を含むプレミックス溶液（コラボラティブ・リサーチ 、ベッドフォード、ＭＡ）である。次いで細胞をプラスチックフラスコ（７５又 は１５０ｃｍ２；ファルコン）に移し、５％ＣＯ２の湿った雰囲気中３７℃でイ ンキュベートした。
血清は、その存在が細胞をプラスチックに付着させ、増殖、脱分化を受けさせる ので、−夜培養に加えない。上の条件下で培養した細胞は傾斜することによりフ ラスコから容易に除去され、新たに調製した細胞と同じ生存度を示す。
サイドシルＣａ２４の測定 精製上皮小体細胞を１μＭフラー２−アセトキシメチルエステルを含む１．２５ ｍＭ　ＣａＣｌ２−２％ＢＳＡ−ＰＣＢに再び懸濁し、３７℃で２０分間インキ ュベートした。次いで細胞をペレット化し、エステルを欠いた同じ緩衝液に再び 懸濁し、さらに１５分間３７℃でインキュベートした。続いて細胞を０．５ｍＭ ＣａＣｌ２及び０５％ＢＳＡを含むＰＣＢで２回洗浄し、室温（約２０℃）で保 持した。使用直前に、細胞を予め温めた０、５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ−ＰＣＢで５倍 に希釈し、０１％の最終ＢＳＡ濃度を得た。蛍光記録に用いたキュベツト中の細 胞の濃度は、１　２Ｘ１０’／ｍｌであった。
インディケータ−を与えた細胞の蛍光を、それぞれ３４０及び５１０ｎｆｆｌの 励起及び放射波長を用いる、サーモスタットキュベツトホルダー及び磁気撹拌器 を備えた分光蛍光計（バイオメディカル・インストルメンティノヨン・グループ 、ユニバーンティー・オブ・ペン７ルバニア、フィラデルフィア、ＰＡ）で、３ ７°Ｃにて測定した。本蛍光はサイドシルＣａ”のレベルを示す。蛍光シグナル は、最大蛍光（Ｆ　ｍａｘ）を得るためジギトニン（５０ｕｇ／ｍｌ、最終）を 、最小蛍光（Ｆｍｉｎ）を得るためＥＧＴＡ　（１０ｍＭ、ｐＨ８，３、最終） を、そして２２４ｎＭの解離定数を用い較正した。色素の漏れは温度に依存し、 キュベツト中細胞を加温後、初めの２分以内に最も起きる。色素漏れはその後き わめてわずかしか増加しない。
色素漏れの較正を正すために、細胞をキュベツトに置き、３７℃で２−３分間撹 拌した。次いで細胞懸濁液を取り、細胞をペレット化し、上清をきれいなキュベ ツトにもどした。次いで上清を上記のようにジギトニン及びＥＧＴＡで処理し、 色素漏れの評価として得た。それは、典型的には全Ｃａ”依存蛍光シグナルの１ ０−１５％である。本評価は明白なＦ　ｍｉｎから引いた。
ＰＴＨ分泌の測定 はとんどの実験で、フラー２を与えた細胞をＰＴＨ分泌の研究に用いた。フラー ２を与えている上皮小体細胞は、細胞外Ｃａ”“に対するそれらの分泌反応を変 更しない。細胞を０．５ｍＭ　ＣａＣ１４及び０．１％ＢＳＡを含むＰＣＢに懸 濁した。
インキュベーションは、小量のＣａＣ１４及び／又は有機ポリカチオンを存在さ せ、又はさせることなく、Ｑ、３ｍｌの細胞懸濁液を含むプラスチック試験管（ ファルコン２０５８）中で実施した。３７℃で種々の時間（典型的には３０分） インキュベーション後、試験管を氷上に百き、細胞を２℃でペレット化した。上 清の試料を酢酸でｐＨ４，５とし、−７０℃で保存した。このプロトコールはウ シ及びヒト両上皮小体細胞に用いた。
ウシ細胞について、試料上清中のＰＴＨの量は、１　／４５．０００の最終希釈 で、ＧＷ−１抗体又はその等価を用いる均一放射免疫検定により測定した。Ｉｔ ｓ（ｐＴＨ（６５−８４・インクスター、ステイルウォーター、ＭＮ）をトレー サーとして用い、分画をデキストラン−活性炭により分離した。試料及びデータ 減少の計数は、パラカード・コブラ５００５ガンマ・カウンターで実施した。
ヒト細胞については、ＧＷ−１抗体がヒトＰＴＨをほとんど認識しないので、無 傷の及びＮ末端ヒトＰＴＨを認識する、商業的に入手しつる放射免疫検定キット （ＩＮＳ−ＰＴＨ：ニッコールス・インスティテユート、ロス・アンゼルス、Ｃ Ａ）を用いた。
サイクリックＡＭＰの測定 細胞を、ＰＴＨ分泌研究用に上記のようにインキュベートし、インキュベーショ ンの終わりに０．１５ｍ１の試料を採り、０．８５ｍ１の熱（７０℃）湯に移し 、コノ温間で５−１０分間加熱した。次いで試験管を数回、凍結、解凍し、細胞 残骸を遠心分離により沈降させた。上清の部分をアセチル化し、サイクリックＡ ＭＰ濃度を放射免疫検定により測定した。
イノシトールリン酸エステル形成の測定上皮小体細胞を４μＣｉ／ｍｌ”Ｈ−ｍ ｙｏ−イノシトールと２０−２４時間インキュベートすることにより膜リン指貫 を標識化した。次いで細胞を洗浄し、０．５１ＭＣａＣｌ２及び０．１％ＢＳＡ を含むＰＣＢに再び懸濁した。インキュベーションは、種々の濃度の有機ポリカ チオンの不存在又は存在で、異なる時間、ミクロフユーグ管で行った。反応は１ ｍｌクロロホルム／メタノール／１２Ｎ　ＨＣＩ　（２００・１００　：　１　 ：ｖ／ｖ／ｖ）の添加により停止した。次いでフィチン酸氷解物（２００μｌ、 ２５μｇリン酸エステル／試験管）水を加えた。試験管を遠心分離し、６００μ ｌの水性相を１０＋ａｌ水に希釈した。
イノシトールリン酸エステルを、ＡＧＩ−Ｘ８を塩化物又はギ酸塩形で用いるイ オン交換クロマトグラフィにより分離した。ＩＰｓレベルのみを測定する場合、 塩化物形を用い、一方、ギ酸塩形は主なイノシトールリン酸エステル（ＩＰ３、 ＩＰｔ及びＩＰ＋）を解明するのに用いた。ＩＰ３だけの測定には、希釈試料を 塩化物−形カラムに適用し、カラムを１１０ｍ１３０ｎ　ＨＣＩで、次いで６ｍ １９Ｑ＋ｃＭ　ＨＣＩで洗浄し、ＩＰ３を３ｍｌ　５００ｍＭ　ＭＣＩで溶出し た。最終溶出物を希釈し、計数した。全ての主要イノシトールリン酸エステルの 測定には、希釈試料をギ酸塩−形カラムに適用し、ギ酸塩緩衝液の濃度を増すこ とにより、ＩＰ、、ＩＰ２及びＩＰ３を次々に溶出した。ギ酸塩形カラムからの 溶出試料は、回転減圧蒸発し、残渣をカクテルにとり、計数した。
ＩＰ３の同異形はＨＰＬＣにより評価した。反応は１ｍ１０．４５Ｍ過塩素酸の 添加により停止させ、氷上で１０分間保った。次いで遠心分離し、上清をＮａＨ Ｃ○、でｐＨ７−８に調整した。次いで抽出物をパーティシルＳＡＸアニオン交 換カラムに適用し、ギ酸アンモニウムの直線分配によって溶出した。次いで種々 の分画をダウエックスにより脱塩し、パラカード・トリカーブ１５００Ｌ　Ｓ　 Ｃで液体シンチレーションカウンターにかける前に回転減圧蒸発に付した。
全てのイノシトールリン酸エステル分離法について有機ポリカチオンが分離によ り妨害されるかどうかを測定するために信ずべき標準を用いる適当なコントロー ルを使用した。
もしそうである場合は、イノシトールリン酸エステル分離前に試料をカチオン交 換樹脂で処理して、害を及ぼす分子を除去した。
Ｃ−細胞中のサイドシルＣａ”＋の測定アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（ＡＴＣＣＮｏ、１６０７）から得たラット骨髄甲状腺癌（ｒＭＴＣ６ −２３）から誘導した腫瘍Ｃ−細胞を、ダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ ）プラス１５％ウマ血清中、熔体の不存在で単層として培養した。［Ｃａ”］： の測定用に、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ１０．０５％トリプシンにより収集し、 １．２５１Ｍ　ＣａＣ１！及び領５％ＢＳＡを含むＰＣＢで２回洗浄し、上皮小 体細胞に上記したようにフラー２を与えた。［Ｃａ”］。
の測定は、上記したように色素漏れに対する適当な訂正により行った。
ラット破骨細胞での［Ｃａ”］＋の測定破骨細胞は、無菌条件を用いる、１−２ 日令のスブラギュードゥリイラットから得た。ラットの子供は首をはねて犠牲に し、後足を取り除き、大腿部は軟組織を速やかに除き、予め加温したＦ−１２／ ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭは１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニンリシースト レブトマイシンーゲンタマイシン：１００　Ｕ／ｍ１−１００μｇ／ｍ１−１０ ０μｇ／ｍｌ）を含む）に置いた。二匹の子供からの骨は縦にカットし、１ｍｌ 培養培地に置いた。骨細胞は、プラスチックピペットによる骨断片のおだやかな 粉砕により得、培養培地で希釈した。骨断片を沈殿させて、等しい部分（約１＋ ｎｌ）の培地を、２５１＋１１１ガラスカバーグラスを有する６ウエル培養プレ ートに移した。細胞を、湿った５％ＣＯ２−空気雰囲気で１時間、３７℃で澄ま せる。次いでカバーグラスを新しい培体で３回洗浄して非付着細胞を除去した。
破骨細胞中の［Ｃａ”］、の測定は、非付着細胞を除去して６−８時間内に実施 した。
カバーグラスに付着した細胞は、血清を欠き、代わりに０．５％ＢＳＡを含むＦ −１２／ＤＭＥＭ中、５μＭインドー１アセトキシメチルエステル１０．０１％ プルロニックＦ２８との３７℃、３０分間インキュベーションによりインド−１ を与えた。続いてカバーグラスを、微量蛍光定量法を装備したニコン・ダイアホ ト倒立顕微鏡の台上に設置した過融解室に移す前に、洗浄し、エステルを欠いた Ｆ−１２／ＤＭＥＭ中、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。破骨細胞 は、それらの大きな形状及び多重核の存在から容易に確認した。（３４０止での 励起により発した）細胞は、試験物質を存在させ又はさせることな（、ｌ　ｍｌ ／分で緩衝液（典型的には０．１％ＢＳＡ及びｌ＋Ｍ　Ｃａ”を含むＰＣＢ）と 過融解した。３４０ｎｆｆｌでの励起により発した蛍光は、顕微鏡のビデオボー トを経て４４０止二色鏡に送り、４９５及び４０５ｎ１１での蛍光強度を光電子 倍増管により収集した。光電子倍増管からの産生を増幅し、デジタル化し８０３ ８６ＰＣに記憶する。蛍光強度の比は［Ｃａ−”］、を評価するのに用いた。
卵母細胞発現 付加的研究において、ウシ又はヒト上皮小体細胞からのｍＲＮＡを注射したクセ ノプス卵母細胞をスクリーニングプロトコールに用い、Ｃ１−コンダクタンスを ［Ｃａ”］、の増加をモニターする間接手段として測定した。以下はネオマイシ ンの効果を試験する実施例である。
卵母細胞は、ヒト上皮小体組織（二次ＨＰＴの例からの上皮小体腺）からのポリ （Ａ）４−強化ｍＲＮＡを注射した。３日後、卵母細胞を、ネオマイシンに対す るそれらの反応について試験した。ネオマイシンＢは薬物フリー生理食塩水との 過融解を止めた０１−コンダクタンスの振動増幅を誘引した（図２０参照）。ネ オマイシンＢに対する反応は１００μＭとｌＱｍＭの間の濃度で観察した。ネオ マイシンＢにより誘引された反応が上皮小体ｍＲＮＡの注射による偶発であった ことを確かめるため、水注射卵母細胞中、電流についてネオマイシンＢの効果を 測定した。試験した５つの卵母細胞の各々でネオマイノンＢ（１０ｍＭ）は電流 に何らの変化も生じなかった。約４０％の卵母細胞が、カルバコールに反応する ことが知られており、効果は内因性ムスカリンレセプターにより伝達された。試 験した５つの卵母細胞中、１つはカルバコールに対する反応で内への電流を示し 、これは図２０の下部図形に示される。即ち、［Ｃａ”］、及びＣＦコンダクタ ンスの増加に結合したムスカリンレセプターを発現する細胞中、ネオマイシンＢ は、反応を誘引しない。このことは、ネオマイシンＢに対する反応が上皮小体細 胞鵬ＲＮＡにより暗号化された特異的蛋白の発現に依存することを示す。無傷の 細胞では、ネオマイシンＢはＣａ”レセプターに直接作用し、上皮小体細胞機能 を変えることを非常に強く示唆する。
最も重要な分子からの薬物設計 幾つかの有機分子は、本明細書に示されるように、Ｃａ”レセプターで作用する ことにより細胞外Ｃａ”の作用を模倣又は拮抗する。しかしながら、試験した分 子は、薬物候補として必ずしも適当でないが、それらは、仮説の基礎となるＣａ ２″レセプターに基づく治療が正しいことを示すのに役立つ。これらの分子は、 それらがＣａ”レセプターに作用させることができ、従って本発明に有用な分子 を選択しうる構造的特徴を決定するのに用いることができる。
そのような一つの分析分法の例は以下の通りである。本例は、以下の実施例で詳 細に述べるが、本明細書で議論された最も重要な分子から本発明の有用な分子を 設計するのに用いることができる理論的根拠を示すためにここで用いる。当業者 は、実施例で明らかにされた分析段階を、又、最も望ましいカルシウム様物質又 はカルシウム拮抗物質が明らかにされるまで、同様の分析を他の最も重要な分子 に行うことができることを認識するであろう。
他の例も以下に提供する。存在するデータをまとめると、有用な最も重要な分子 は、好ましくは１又はそれ以上の位置に置換される、そして処理により分枝状ま たは直鎖状の置換又は非置換アルキル基を有しうる芳香基を有することであろう ことを示す。加えて、望ましいＣａ”レセプターに対するより高い親和性を確実 にする正しい立体特異性の分子を選択することが重要である。従ってこれらのデ ータは当業者に以下に多く記載されるように本発明の最高の望ましい分子を見出 すために誘導されつる適当な最も重要な分子を教示する。
構造的に異なるけれども、試験される分子は研究されつる一般的特徴を有しうる 。本実施例において、実効正電荷と細胞内Ｃａ２４を可動化する可能性との相関 を試験した。プロタミン（＋２１　：　ＥＣｓｏ＝４０ｎＭ）は、上皮小体細胞 での［Ｃａ２゛］、の可動化を起こすのに、スペルミン（＋４　；　ＥＣ５゜＝ １５０μＭ）よりも有効であったネオマイシンＢ　（＋６　；　ＥＣ，。＝２０ μＭヒト上皮小体細胞中、及び４０μＭウシ上皮小体細胞中）よりもさらに有効 であった。これらの結果は、正電荷のみが可能性を決定するのかどうか、又はＣ ａ”レセプター上の活性に寄与する他の構造的特徴があるのかどうかという疑問 を生ずる。このことは、最初にそれがＣａ”！レセプターが有効且つ特異的な治 療用分子を目標にできるという観点に太き（影響するということを決定するのが 重要である。従って、ネオマイシンＢ及びスペルミンに関連する種々の他の有機 ポリカチオンは分子の実効正電荷と細胞内Ｃａ”を可動化するその可能性との間 の関係を決定する研究ができる。
研究した最初の系列の分子はアミノグリコシドであった。その分子はウシ上皮小 体細胞で研究し、それらの細胞内Ｃａ”の可動化についてのＥＣ３゜を測定した 。
アミノグリコシドについては、サイドシルＣａ”過渡電流を惹起する能力の位置 順は、ネオマイノンＢ　（ＥＣｓｏ＝２０又は４０μＭ）＞ゲンタマイシン（１ ５０μＭ）＞ベカナマイシン（２００μＭ）＞ストレプトマイシン（６００μＭ ）であった。カナマイシンとリンコマイシンは、５００μＭの濃度で試験したと き、効果がなかった。これらのアミノグリコンドのｐＨ７，３での実効正電荷は 、ネオマイシンＢ　（＋６）　＞ゲンタマイシン（＋５）＝ベカマインン（＋５ ）＞カナマイシン（平均＋４５）〉ストレプトマイシン（＋３）＞リンコマイシ ン（＋１）である。次いでアミノグリコンド系列内で、実効正電荷間にある関係 があるがこれは絶対的ではなく、ストレプトマイシンよりも有効であると予想さ れたカナマイシンは活性がない。
様々なポリアミンをテストすることにより、実効陽性電荷と有効性（ｐｏｔｅｎ ｃｙ）の間の付加的かつより著しい矛盾が明らかになった。これらポリアミンの 構造的分類を試みた：（１）直鎖状、（２）分枝状、および（３）環状。テスト したポリアミンの構造を図１に与える。直鎮状ポリアミンの中では、スペルミン （＋４；ＥＣ５゜＝１５０ｇＭ）はペンタエチレンへキサミン（＋６　；　ＥＣ ｓ。＝５００１１Ｍ）およびテトラエチレンペンタミン（＋５　、ＥＣ，。＝２ ．５ｊＭ）よりも、たとえ後者の分子の方がより大きい実効陽性電荷を有してい るとしても、強力である。
我々は、様々な数の二級および両級アミノ基を持ち、従って実効陽性電荷が変化 する幾つかの分枝状ポリアミンを合成した。これら２分子、ＮＰＳ３８１および ＮＰＳ３８２でウシ上皮小体細胞における［Ｃａ”］、の効果を試験した。ＮＰ Ｓ３８２　（＋８　：ＥＣ，。＝５０μＭ）は、たとえそれが２つのより少ない 陽性電荷を含有するとしても、ＮＰＳ３８１　（＋１０　；ＥＣｓ。＝１００ａ Ｍ）の約２倍の有効性であった。
陽性電荷と有効性の間の同様の矛盾が環状ポリアミンでの実験において表された 。例えば、ヘキササイクレン（＋６　：　ＥＣｓｏ＝２０ｇＭ）は、ＮＦＳ３８ ３　（＋８、ＥＣ，。＝１５０μＭ）よりも強力であった。これらのポリアミン で得られた結果は、陽性電荷が有効性に貢献する単独の因子ではないことを示し ている。
更なる研究により、上皮小体細胞Ｃａ２＋レセプターの活性を分は与える分子の 構造的特徴に洞察が与えられた。構造的に重要な特徴の１つに、（陽性電荷を帯 びる）窒素間の分子間距離がある。それ故に、スペルミンはトリエチレンテトラ ミン（ＥＣｓｏ＝８ｍＭ）の５０倍も強力にウソ上皮小体細胞における［Ｃａ” ］、の増加を引き起こすが、両分子は＋４の実効陽性電荷を帯びている。これら ２つのポリアミン間の構造上の相違は、窒素を引き離しているメチレンの数だけ でありスペルミンでは、それは３−４−３であるのに対して、トリエチレンテト ラミンでは、２−２−２である。この窒素間の間隔をあける外観上の少しの変化 は、有効性に対して深い関係を持ち、分子内の窒素のコンホーメーション関係が 重大であることを示唆している。これを支持するのは、ヘキササイクレンおよび ペンタエチレンへキサミンで得られた結果である。前者の分子は、単に後者の環 状類似体であり、全窒素間に同数のメチレンを含有しているが、環構造の存在は 、有効性を２５倍に増加する。これらの結果は、それ自体の陽性電荷がＣａ”レ セプターにおける有機分子の活性を決定する重大な因子ではないことを示してい る。
他の一連の実験より、Ｃａ”レセプターの活性決定における芳香族基の重要性が 明らかにする。その結果は、クモ、アルギオーブ・ロバータ（Ａｒｇｉｏｐｅ　 １ｏｂａｔａ）の毒から単離された２種のアリルアルキルアミンで得られた。こ れらの分子、アルギオトキソン（ａｌｇｉｏｔｏｘｉｎ）　６３６およびアルギ オトキシン６５９は、異なる芳香族基に結合した同一のポリカチオン部分を有す る（図２４）。アルギオトキンン６５９は、１００ないし３００μＭの濃度でテ ストした時に、ウシ上皮小体細胞における［Ｃａ”］＋の瞬間の増加を引き起こ した。反対に、アルギオトキシン６３６は、同様の濃度でテストしても、効果無 しであった（図２４）。これらの２種のアリルアルキルアミン間の構造上の相違 は、分子の芳香族部分のみでありアルギオトキシン６５９は、４−ヒドロキシイ ンドール部分を含んでいるのに対し、アルギオトキンン６３６は、２．４−ジヒ ドロキシフェニル基を含んでいる。これら２種のアリルアルキルアミンの実効陽 性電荷は、同じであり（＋４）、そのため、これらの異なる有効性は、異なる芳 香族基から生じるに違いなＧ＼。このことは、実効陽性電荷のみが、有効性を決 定するのではないことを示してＬする。
しかしながら、これらを見い出したことにより実際に重要となるのは、芳香族基 がＣａ”レセプターを活性化する分子の能力に非常に貢献するという発見である 。
アルガトキンン４８９　（ＮＰＳＯ１７）およびアルガトキシン５０５（ＮＰＳ ０１５）のいずれも上皮小体細胞における細胞間Ｃａ”の流動化を引き起こし、 それぞれＥＣ５ｏ、６と２２ａＭを有している。これらの分子の構造上の相違は 、インドール部分のヒドロキシ基のみである（図１）。このことは、分子の芳香 族領域上の置換が有効性に影響を与え得ることを示している。これは、研究に付 しているリード分子が、芳香族部分が置換されているような分子を含んでいるで あろうことを示している。
ここに記載したリード分子とは系統的に異なる構造的特徴は、（１）実効陽性電 荷、（２）窒素を引き離しているメチレン数、および（３）例えば、メチレン間 隔および実効陽性電荷における変化を伴う、および伴わないポリアミンの環状の ものを含んでいる。加えて、構造および芳香族基の位置における系統的変化を、 例えば、スズメバチおよびクモの毒から単離された様々なアリルアルキルアミン において、試験することが出来：商業的に入手可能な芳香族部分をアルギオトキ シンポリアミン部分と結合させることにより、合成分子を調製することが出来る 。アルギオトキシンポリアミン部分は、カルボン酸を含有しているいずれかの芳 香族部分と容易に結合することが出来る。従って、フェニル酢酸および安息香酸 のヒドロキシおよびメトキシ誘導体、同じくヒドロキシインドール酢酸系を系統 的にスクリーニングするのは簡単である。ヘテロ芳香族機能性を有する類似体を 調製し、活性を評価することも出来る。
該分子間の有効性および効力の比較により、一定の陽性電荷で、芳香族基の最適 な構造および位置が明らかになるであろう。
有効性を増加すると思われるポリアミンモティーフでの構造的多様性の１つは、 直鎖状親分子の環状のものが存在することである。バドムンチアミンＡ　（Ｂｕ ｄＩｌｕｎｃｈｉａｍｉｎｅＡ　）は、植物アルビジア・アマラ（＾１ｂｉｚｉ ａ　ａｒａｍａ）から単離されたものであり、スペルミンの環状誘導体である（ 図１）。バドムンチアミンＡをウシ上皮小体細胞に加えると、細胞外Ｃａ”の不 在に固執し、ＰＭＡでの前処理により鈍化した［Ｃａ”］＋の迅速かつ瞬間の増 加を引き起こした。従って、それは、恐らく、Ｃａ２４レセプターに作用するこ とにより、上皮小体細胞における細胞間Ｃａ”の流動化を引き起こす。それは殆 ど、スペルミン（ＥＣｓｏ約２００４Ｍ）と等しい効力をもっているが、スペル ミンよりも１つ低い陽性電荷（＋３）を帯びている。
バドムンチアミンＡより得られた結果は、構造活性研究の予言力および天然物を テストすることにより得られる新規構造情報を表すものである。それ故に、構造 情報に基づき合理的に選択される天然物のスクリーニングは、容易に行われ、例 えば、分子を、ナブララート（Ｎａｐｒａｌｅｒｔ）などの適切なデータベース を用いる非常に確立された化学分類的原則に基づき、選択することが出来る。例 えば、ピセコロビウムなどのアルビジアに関連するパビリオノイド豆果（ｐａｐ ｉｌｉｏｎｏｉｄ　ｌｅｇｕ■ｅｓ）から誘導される大環状ポリアミンアルカノ イドおよび他の植物から誘導される分子をスクリーニングすることが出来る。
図３６は、本発明に対して有用な分子を決定するためにスクリーニングされる一 連の分子の第二例を与えるものである。これらの分子は、一般にフェンシリンか ら誘導されるものであり、テストして、それらのそれぞれのＥＣ，、を測定した 。
更に、関連分子、ＮＰＳ４４７およびＮＰＳ４４８などをテストすることにより 、分子構造の立体特異的効果を明らかにする。テストしてデータが得られた殆ど の活性化合物は、新規化合物であり、ＮＰＳ４６７およびＮＰＳ５６８と呼称し 、５＋Ｍ以下のＥＣ５ｏ値を持つ。当業者はこの一連の分子を精密に調べること により、本発明においてテストされ得る他の適切な誘導体を測定することが出来 る。
これらの例は、本発明において有用な一般的設定およびスクリーニング方法を示 しており、付加的化合物および天然物ライブラリーを当該技術に望ましくスクリ ーニングし、本発明の他の有用なリード分子または新規分子を決定することが出 来る。
上記のように、カルシウム様物質として有用な分子の例は、分枝状または環状ポ リアミン、陽性に荷電したポリアミノ酸、およびアリルアルキルアミンを含んで いる。加えて、他の陽性に荷電した有機分子は、天然に生じる分子およびそれら の類似体を含んでおり、有用なカルシウム様物質である。これらの天然に生じる 分子およびそれらの類似体は、好ましくは陽性電荷対質量比率（ｐｏｓｉｔｉｖ ｅ　ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ）を有しており、ここに例示し た分子に対するこれらの比率と相関している。（例としては、海洋哺乳類、節足 動物前、陸生植物および細菌類や菌類から得られる発酵ブロスから単離された物 質がある。）カルシウム様物質として有用な天然に生じる分子および類似体の好 ましい１群では、陽性電荷：分子量（ダルトンで）の比率、約１４０から１：２ ００、好ましくは約１＝４０から１１００で有することが予期される。該分子の 更に詳しい実施例は以下本発明におけるカルシウム様物質として有用なポリアミ ンは、分枝状または環状のいずれかであり得る。分枝状または環状ポリアミンは 、潜在的にそれらの直鎖状類似体よりも高いカルシウム様活性を有している。即 ち、分枝状または環状ポリアミンは、生理学的ｐＨで同様の効果的電荷を持つそ れらの対応する線状ポリアミンよりも低いＥＣ，。を持っ傾向がある（表１参照 ）。
分子　実効（＋） 電荷　ＥＣｓｏ（ＩＩＭ） ネオマイシン　＋６　２０または４０ ヘキササイクレン　＋６　２Ｏ ＮＰＳ３８２　＋８　５Ｏ ＮＰＳ３８１　＋１０　、’　１００ ＮＰＳ３８３　＋８　１５０ ゲンタマイシン　＋５　１５０ スペルミン　＋４　１５０ ベカナマイシン　＋５　２００ アルギオトキシンー６５９　＋４　３００ペンタエチレンへキサミン（ＰＥＨＡ ）　＋６　５００ストレプトマイシン　＋３　６００ スペルミジン　＋３　２０００ テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）　＋５　２５００１．１２−ジアミノド デカン（ＤＡＤＤ）　＋２　３０００トリエチレントラミン（ＴＥＴＡ）　＋４ 　８０００本明細書で使用した“分枝状ポリアミン”とは、短いアルキル橋架け 、またはアミン結合（ａｍｉｎｏ　ｌｉｎｋａｇｅｓ）により一緒に連結したア ルキル基から成り、また幀が枝分かれする点を有している鎖状分子のことである 。これらの“分枝点”は、炭素原子または窒素原子のいずれか、好ましくは窒素 原子の所に位置することが出来る。窒素原子分枝点は、代表的には三級アミンで あるが、四級であることもある。分枝状ポリアミンは、１ないし２０の分枝点、 好ましくは１ないし１０の分枝点を有することもある。
一般に、分枝状ポリアミンにおけるアルキル橋架けおよびアルキル分枝は、長さ １から５０の炭素原子であり、好ましくは２から６の炭素原子である。アルキル 分枝は、１つまたはそれ以上のへテロ原子（窒素、酸素または硫黄）によ中断さ れるか、またはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを含むハロ；ヒドロキシ ：ニトロ；アシロキシ（Ｒ’Ｃｏｏ−）　、アシルアミド（Ｒ’Ｃ０ＮＨ−）　 、またはアルコキシ（−ＯＲ’）で、式中Ｒ′は１から４の炭素原子を含有し得 るものなどの官能基で置換されることもある。アルキル分枝は、アミノまたはグ アニドなどの生理学的ｐＨで陽性に荷電される基で置換される場合もある。これ らの官能置換基は、分子の活性、配達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）　、または生物学的 利用能を増加する溶解度等の生理特性を与えたり変化したりすることもある。
分枝状ポリアミンは、３つまたはそれ以上の鎮および分枝末端点を有することも ある。これらの末端点は、メチル基またはアミノ基であり、好ましくはアミノ基 であり得る。
好ましい分子の１群は、式・ ＨｚＮ−（ＣＨ２）Ｉ　（ＮＲ９（ＣＨｚ）＋）ｋ　ＮＨｔ（式中、ｋは１から １０の整数であり、ｊはそれぞれ同じかまたは異なり、２から２０の整数であり 、Ｒ，はそれぞれ同じかまたは異なり、水素と−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨｌでｊは上 記で定義したものから成る群から選択され、少なくとも一つのＲ２は水素ではな い） を有する分枝ポリアミンの群である。
本発明の特に好ましい分枝状ポリアミンは、分子ＮＩ、　Ｎｌ、　ｐＪｓ、　Ｎ ＩＯ，ＮＩ４．　Ｎ＋４−へキサキス−（３−アミノプロピル）スペルミンおよ びＮＩ、　Ｎ１．　Ｎｓ、　Ｎ１４．　Ｎ１４−テトラキス−（３−アミノプロ ピル）スペルミンで、それぞれ、図１におけるＮＰＳ３８１およびＮＰＳ３８２ のことである。
本明細書で使用した“環状ポリアミン”とは、２つまたはそれ以上のへテロ原子 （窒素、酸素または硫黄）を含有する複素環で、その内、少なくとも２つは窒素 原子であるもののことである。複素環は、一般に周囲に約６から約２０原子、好 ましくは、周囲に約１０から約１８原子である。窒素へテロ原子は、２ないし１ ０の炭素原子で隔てられている。複素環は、窒素部位でアミノアルキルまたはア ミノアリル基（ＮＨｚＲ）で置換されることもあり、式中Ｒは、アミノアリルま たは２ないし６炭素原子の低級アルキルである。
本発明の特に好ましい環状ポリアミンは、図１にヘキササイクレン（１，４，７ ゜１０．１３．１６−ヘキサアザーシクロオクタゾカンおよびＮＦＳ３８３とし て示本発明において有用なポリアミノ酸は、生理学的ｐＨで２つまたはそれ以上 の陽性に荷電したアミノ酸残基を含有しても良い。これらの陽性に荷電したアミ ノ酸は、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンを含んでいる。これらのポリペプ チドは、長さにして２から８００アミノ酸の範囲内で変化する場合があり、より 好ましくは長さにして２０から３００アミノ酸である。これらのポリペプチドは 、アミノ酸残基の単一の繰り返しから成りことがあり、天然タンパク質または酵 素の変種を有することもある。
ポリアミノ酸から成るアミノ酸残基は、２０の天然アミノ酸または他の代わりと なる残基のいくつかである場合がある。代わりとなる残基は、例えば、弐Ｈ２Ｎ （ＣＨｔ八ＣへＯＨでｎは２から６であるω−アミノ酸を含んでいる。これらは 、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイ シン、ノルロイシン、フェニルグリシン、シトルリン、メチオニンスルホキシド 、シクロへキシルアラニン、およびヒドロキシプロリンである場合、中性で、非 極性アミノ酸である。オルニチンは、代わりとなる陽性に荷電したアミノ酸残基 である。本発明のポリアミノ酸は、知られている方法により化学的に誘導される こともある。
本発明の特に好ましいポリアミノ酸は、ポリアルギニン、ポリリジンおよびポリ （アルギニニルチロシン）を含み、２０−３００残基を有する。他の好ましいポ リアミノ酸は、プロタミンまたはプロタミン類似体である。
アリルアルキルアミン 本明細書で使用した“アリルアルキルアミゾとは、節足動物の毒から誘導される 陽性電荷毒素の分類のことである。本発明の好ましいアリルアルキルアミンは、 フィルアンソトキシンー４３３、アルギオトキシンー６３６およびアルギオトキ シンー６５９、アガトキシン５０５、アガトキシン４８９を含んでおり、これら の構造は、図１に示しており、他の合成分子は、ＮＦＳ０１９などのこれらの天 然物の構造に合わせた。
付加的組成物 本発明の組成物は、少なくとも１種のカルシウム様物質またはカルシウム拮抗物 質を含有するだけでなく、ある種の付加的組成物も含むことがある。これらの付 加的組成物は、本発明での施用において、例えば、細胞外Ｃａ”のアゴニストま たはアンタゴニストをスクリーニングするために有用であり得る、ターゲット組 成物、標識および他の機能性を含んでいる。
例えば、免疫グロブリンまたはその部分、または上皮小体細胞に特異的な配位子 またはＣａ”レセプターをターゲット特異的組成物として用いることが出来る。
免疫グロブリンは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であっても良く、 抗体全体またはこれら抗体の免疫学的に反応性のフラグメント、Ｆｌｂ、、Ｆ、 ｂまたは（Ｆ−ｂ、）ｚなどから成ることもある。レセプター特異的配位子を使 用することも出来る。
本発明の組成物は、標識として挙動する分子またはイオンで誘導化された組成物 を含有する場合もある。非常に様々な標識性部分を使用することが出来、放射性 同位体、発色団、および蛍光標識を含んでいる。特に放射性同位体で標識すると 、イン・ビボでの検出が容易に出来る。放射性同位体をポルフィリン系における カチオンとして配位により結合させることもある。有用なカチオンは、テクネチ ウム、ガリウムおよびインジウムを含むものである。組成物において、陽性に４ ・荷電した分子は、標識と連結または結合させることが出来る。
合成方法 ポリアミンの合成および修飾戦略には、機能化された分子を作成するために選択 的に除去され得る様々なアミン保護基（フタルイミド、ＢＯＣ，ＣＢＺ、ベンジ ルおよびニトリル）の使用を伴う。包含される合成方法は、アルギオピン６３６ と６５９およびクモ毒から誘導された他のアリルアルキルアミンを作成するのに 使用された方法に合わせる。
２−４メチレンの鎖伸長は、対応するＮ−（ブロモアルキル）フタルイミドでの アルキル化により典型的に行った。ブロモアルキルフタルイミドに対するアミン の１：１．２混合物をセライト上の５０％ＫＦの存在下、アセトニトリル中で還 流した。鎖伸長もまた、得られたアミンのアクリロニトリルまたはエチルアクリ レートでのアルキル化により行った。反応の進行は、ＴＬＣとジクロロメタン、 メタノール、およびイソプロピルアミンの組み合わせを用いるシリカゲルで精製 された中間体により追跡した。最終産物をカチオン交換（ＨＥＭＡ−８Ｂ）およ びＲＰ−ＨＰＬＣ（ヴイダックＣ−１８）により精製した。純度と構造確認は、 ）（＋−およびＩ３Ｃ−ＮＭＲと高分解能マススペクトロメトリー（Ｅｌ、ＣＩ および／またはＦＡＢ）で行った。
ＢＯＣ保護基を触媒量のジメチルアミノピリジンの存在下、ジクロロメタン中で アミン（１°または２°）をジーｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートで処理して付 加した。ベンジル保護基は、２種の方法：（１）１°アミンとベンズアルデヒド との縮合、続いて水素化ホウ素ナトリウム反応、または（２）ＫＦの存在下、２ °アミンのベンジルプロミドでのアルキル化のうち１方法を適用した。アミド結 合および環化はアミン（１°または２°）と得られた酸のＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステルとの反応により典型的に行った。これは（環化の場合）、希釈 条件下で、“アミノ酸”をジシクロへキシルカルボジイミドで処理して直接的に 行った。
フタルイミド機能性の脱保護は、メタノールを還流しながら、ヒドラジンで還元 することにより行った。ＢＯＣ機能性の脱保護は、無水ＴＦＡ中で行った。ベン ジル、ニトリル、およびＣＢＺ保護機能性の脱保護は、５５ｐｓｉ水素下で、炭 素中水酸化パラジウムの触媒量の存在下、氷酢酸中で還元することにより行った 。
ニトリル機能性を（ベンジルおよびＣＢＺ基の存在下）水素下で、スポンジ状ラ ネー・ニッケルの存在下で選択的に還元した。
詳細には、分校状ポリアミンは、代表的には式ＮＨ，（ＣＨり、−ＮＨｔの簡単 なジアミノアルカン、またはスペルミイミドまたはスペルミンなどの簡単なポリ アミンから調製される。２つの（末端の）−級アミンの１つをＢＯＣ（ｔ−ブチ ロキンカルボニル）、フタルイミド、ベンジル、２−エチルニトリル（アミンお よびアクリロニトリルのミカエル縮合製造生成物（ｌｉｃ１１１６１　（□ｎｄ ｅｎｓａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）　）またはアミド などの保護基で保護または“マスク”する。典型的な反応はジーｔ−プチルージ カルボネート（無水ＢＯＣ）での処理によるＢ−保護生成物を非保護および二保 護生成物から簡単なりロマトグラフ的または蒸留技術により分離する。
その後、−保護生成物において残っている遊離のアミンをアルキル化剤（または アシル化剤）で選択的にアルキル化（またはアシル化）する。確実に−アルキル 化（ｍｏｎｏ−ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）するために、遊離のアミンをベンズアル デヒドとの縮合、続いて水素化ホウ素ナトリウム還元により部分的に保護して、 Ｎ−ベンジル誘導体を形成する・ その後、Ｎ−ベンジル誘導体をアルキル化剤と反応させる。典型的なアルキル化 剤は、Ｎ−（ブロモアルキル）フタルイミドであり、それは以下のように反応す る・ 例えば、Ｎ−（ブロモブチル）フタルイミドを用いて、４メチレン単位で鎖を伸 長または枝分かれさせる。代替法として、アクリルニトリルとの反応、続いてシ アノ基の還元は、３メチレンおよびアミノ基により鎖を伸長するであろう。
生じた鎖伸長分子の保護基をその後、選択的に切断して、新しい遊離のアミンを 得ることが出来る。例えば、トリフルオロ酢酸を使用して、ＢＯＣ基を除去し、 触媒的水素化を用いてニトリル機能性を還元し、ベンジル基を除去し；ヒドラジ ンを用いて以下のようにフタルイミド基を以下のように除去する”７　新しい遊 離アミンは、更に上記のようにアルキル化（またはアシル化）されて、ポリアミ ンの長さを増加することもある。この工程を所望の鎖の長さおよび分枝の数が得 られるまで繰り返す。最終段階で、生成物を脱保護し、結果として所望のポリア ミンを生じる。しかしながら、脱保護前に更なる修飾が保護末端で以下の方法に よりもたらされる場合があり・例えば、ＢＯＣ脱保護前に、ポリアミンを３．４ −ジメトキシフェニル酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアシル化 し、二保護ポリアミンを得るこれは、最終的にアリルポリアミンを得ることにな る。ＢＯＣ基をその後選択的にトリフルオロ酢酸で除去して、上記のように伸長 され得る他のアミノ末端にさらすことが出来る。
ある種の分枝状ポリアミンは、上記で形成したポリアミンにおける遊離の一級お よび二級アミンを同時にアルキル化またはアシル化することにより得られること もある。例えば、スペルミンを過剰のアクリロニトリルで処理し、続いて触媒的 還元すると、以下を得る。
環状ポリアミンをヘキササイクレン（アルドリッチ・ケミカル）などの出発物質 で始めて、上記のように調製する場合がある。
本発明の領域内のポリアミノ酸は、当業者に知られている組換え技術により作成 しても良く、または当業者に知られている標準的な固相法を用いて合成すること もある。固相合或は、ペプチドのカルボキシ末端からα−アミノ保護アミノ酸を 用いて、開始される。ＢＯＣ保護基は、他の保護基が安定であるとしても、すべ てのアミノ基に対して用いることが出来る。例えば、ＢＯＣ−１ｙ　ｓ　−ＯＨ を、エステル化してクロロメチル化ポリスチレン樹脂支持体にすることが出来る 。ポリスチレン樹脂支持体は、好ましくはスチレンの共重合体であり、ポリスチ レン重合体を完全にある種の有機溶媒に溶解させる架橋剤として約０．５ないし ２％ジビニルベンゼンを有している。スチュワード等、固相ペプチド合成（１９ ６９年）　、Ｗ、　Ｈ，フリーマン・カンパニー、サンフラッジスコ：およびメ リフィールド、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ−（１ ９６３年）、８５巻、２１４９−２１５４頁、参照。ペプチド合成のこれらおよ び他の方法は、Ｕ、Ｓ、特許第３．８６２．９２５号：第３．８４２．０６７号 、第３．９７２．８５９号、および第４．１０５．６０２号にも例示されている 。
ポリペプチド合成は、マニュアル技術を用いるか、または例えば、アプライド・ バイオシステム・４０３Ａ・ペプチド・シンセサイザー（フォスター・シイ−、 カリフォルニア）またはバイオサーチ・ＳＡＭＩＩオートマチイック・ペプチド ・シンセサイザー（バイオサーチ・インコーホレイテッド、サン・ラフアニル、 カリフォルニア）　を用いて自動的に行うこともあり、製造会社により提供され た使用マニュアルにおいて与えられた使用説明に従う。
本発明のアリルアルキルアミンは、知られている技術で単離された天然物であり 、またはジャシーズ等、テトラヘドロン・レター（１９８８年）、２９巻、６２ ２３−６２２６頁、およびネイソン等、テトラヘドロン・レター（１９８９年） 、３０巻、２３３７−２３４０頁に記載のように合成される。
フェンシリン（または図３６に示したフェンシリン類似体）調製のための１つの 一般的なプロトコールは、以下の通りである。磁気撹拌棒とゴム隔膜を備えた１ ０１！１丸底フラスコ内で、２ｉ１エタノール中１．０ミリモル３，３°−ビス フェニルプロピルアミン（または−級アルキルアミン）を１．１ミリモルのフェ ノールと１．０ミリモルのアセトフェノン（または置換アセトフェノン）で処理 した。
これに、２．０ミリモルＭｇ　Ｓ　Ｏ＜と１．０ミリモルＮａＣＮＢＨ３を加え た。これを窒素雰囲気下、室温（約２０℃）で２４時間撹拌した。反応物を５Ｑ ＋１エーテルに注ぎ込み、１ＮＮａＯＨで３回、プリンで１回洗浄した。エーテ ル層を無水Ｋ。
ＣＯ３で乾燥し、真空下で還元した。生成物をその後、カラムクロマトグラフィ ーまたはＣＨ，Ｃ１，−メタノール−イソプロピルアミン（典型的には、塩化メ チレン中３％メタノールおよび０．１％イソプロピルアミン）の結合したシリカ 固定相を組み込んだＨＰＬＣにより生成した。
フェンシリンまたはフェンシリン類似体（図３６に表したようなもの）を調製す るのに好ましい方法は、チタン（ＩＶ）イソプロポキシドを使用するものであり 、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、５５巻、２５５２頁（１９ ９０年）に記載の方法を一部修飾したものである。ＮＰＳ５４４の合成には、チ タンテトラクロリド（テトラヘドロン・レター、３１巻、５５４７頁（１９９０ 年）に記載の方法）をチタン（ＩＶ）イソプロポキシドの代わりに使用した。反 応スキームを図４３ａに表した。図４３ａにおいて、ＲＳＲ’およびＲ”は、炭 化水素基を表している。一実施態様に従うと、４−１バイアル中で、アミン（１ ）１ミリモル（代表的には、−級アミン）とケトンまたはアルデヒド（２）（一 般には、アセトフェノン）１ミリモルを混合し、その後、１．２５ミリモルのチ タン（ＩＶ）イソプロポキシド（３）で処理し、時折撹拌しながら、室温で３０ 分間装いておく。代替法として、二級アミンを（１）の代わりに用いることもあ る。注意：幾つかの反応は、重い沈殿または固体を生じるであろうが、（それら の融点まで）加温／加熱して反応の過程にわたり数回撹拌／混合させる。反応混 合物を１ミリモルのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１）を含有する１ｍｌエタ ノールで処理し、生じた混合物をその後、室温で時折撹拌しながら約１６時間室 いておく。その後、約５００μの水を加えて、反応を止める。反応混合物をその 後、総容量約４ｍｌまで、エチルエーテルで希釈し、その後遠心分離する。上部 の有機相を除去し、ロートペーパー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で還元する。生じた 生成物（旦）を、ＨＰＬＣ（ジクロロメタン：メタノール：イソプロピルアミン でシリカを用いる順相、またはアセトニトリルまたはメタノールと共に０．１％ ＴＦＡでＣ−１８を用いる逆相）により精製する前に、シリカの短いカラムのク ロマトグラフィー（または代わりとしてソリ力の分取ＴＬＣを用いることによる ）で、ジクロロメタン：メタノール・イソプロピルアミン（典型的には、９５： ５・０．１）の組み合わせを用いて、部分的に精製する。
適切または望まれるならば、実施例２１に記載のような方法を用いてキラル分割 を行っても良い。
処方および投与 本明細書に示したように、本発明の分子は　細胞外Ｃａ”の１つまたはそれ以上 の効果を模倣または拮抗し：　（ｂ）細胞外遊離Ｃａ”レベルに個々に影響を与 え、（Ｃ）上皮小体機能亢進症、エステロブロンスおよび高血圧などの疾患を治 療するために用いられ得る。該分子は、一般に上皮小体細胞での効果を有するこ とが示されているのに対し、これらは、骨溶骨細胞、傍系球体の腎臓細胞、隣接 する腎細管細胞、ケラチン生成細胞、小胞周縁の甲状腺細胞、胎盤性トロホブラ ストを含む他の細胞でのＣａ”レセプターを調節することもある。
これらの分子は、典型的にヒト患者の治療に用いられるであろうが、他の霊長類 、豚、畜生および飼鳥類などの農場動物、馬、犬およびネコなどのスポーツ動物 などの他の定温動物種において同様のまたは同一の疾患の治療に使用することも 可能である。
治療的および／または診断的施用において、本発明の分子は、全身および局所ま たは集中投与を含む様々な投与方法で処方され得る。技術および処方は、一般に 、レミントソズ・ファーマシューティカル・サイエンシイズ、マッグ・パブリッ ンング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニアに見い出され得る。
全身投与には、経口投与が好ましい。代替法として、例えば、筋肉内、静脈内、 腹膜内、および皮下注射を用いることもある。注射では、本発明の分子を液体溶 液状、好ましくは、バンク溶液またはリンガ−溶液などの生理学的に融和性の緩 衝液中で処方される。加えて、該分子を固形で処方し、使用する前に直ちに再溶 解または懸濁させることもある。凍結乾燥形も含まれる。
経粘膜的または経皮的方法により、全身投与しても良く、または該分子を経口的 に投与することも出来る。経粘膜的または経皮的投与のためには、浸透させる可 き障壁に適切な浸透剤を処方に用いる。このような浸透剤は、一般に当業者には 知られており、例えば、経粘膜的投与のための胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体 を含む。加えて、洗剤を用いて浸透を容易にすることもある。経粘膜的投与は、 例えば鼻に散布するもの、または生薬であることもある。経口投与のためには、 該分子をカプセル、錠剤、および強壮剤など、適宜の経口投与形で処方される。
局所投与のためには、本発明の分子を、一般に当業者には知られているものとし て軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームで処方される。
以下の実施例に示したように、本発明の様々な化合物の投与されるべき量は、標 準的手法により決定することが出来る。一般に、処置される動物のｋｇに対し約 １および５００ｇ／ｋｇの間である。
天然物スクリーニングは、伝統的には多様な治療的分子の開発に対し、手掛かり となる構造を与えてきた。しかしながら、Ｃａ！４レセプターでの活性に対する 天然物ライブラリーまたは他の分子ライブラリーの高処理量スクリーニング（ｈ ｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、以前可能ではなかった 。これを可能にするには、Ｃａ”レセプターｃＤＮＡをクローン化し、その後、 高処理量スクリーニングに安定なトランスフェクションした細胞系を作るのが最 善である。レセプターの構造を用いて、付加的に配位子結合部位の分子の結合構 造の洞察を得ることが出来、このような情報を使用して、上記で論議したように 合理的薬剤デザイン計画を拡大することが出来る。限定された構造活性研究およ び選択された天然物分子の試験は、合理的天然物スクリーニングおよび薬剤デザ インを導くに必要な最初の構造データベースを与えるものであろう。
ウシおよびヒト上皮小体細胞Ｃａ２−レセプターｃＤＮＡは、ツメガエル（Ｘｅ ｎｏｐＵＳ）卵母細胞における機能発現によりクローン化することが出来る。内 生のＣａ２”活性化０１″チヤンネルを通る電流を測定することにより、ツメガ エル卵母細胞における細胞間Ｃａ”の増加を間接的に追跡することが可能である 。このシグナル形質導入経路により与えられた応答の増幅は、ｍＲＮＡにより暗 号化されるレセプタータンパク質の検出を非常に低レベルで可能にする。このこ とは、レセプター特異性ｃＤＮＡクローンの検出を、高親和性配位子、特異的抗 血清またはタンパク質もしくは核酸配列情報の必要がなくても可能にするもので ある。該方法の実施例は以下である。
成体の雌キセノブス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）はキセノブス Ｉ　（アン・アーバー、Ｍｌ）から得られ、常法に従い維持された。卵巣の丸い 突出部を低体温法的に麻酔したヒキカエルから摘出した。卵母細胞の房を修飾パ ース塩水（ＭＢＳ）に移した。個々の卵母細胞を２１ｆｉｇ／１ｌ１１コラゲナ ーゼ（シグマ、ＩＡ型）を含有するＭＢＳ中で２１℃で２時間インキュベートす ることによって得、Ｖ−Ｖ１段階の卵母細胞を注入するために選択した。
ガラスキャピラリー管（＠径１０ｍ）を引っ張りて細い先端にし、手で折って、 先端の直径を約１５μＭにする。ｍＲＮＡの小滴（ジエチルビロカーホネート（ ＤＥＰＣ）−処理水中ｌ　ｏｇ／ｎｌ）をパラフィルムに置き、キャピラリー管 で吸い上げた。その後、そのキャピラリー管をピコスプリッツァー（ｐｉｃｏｓ ｐｒｉｔｚｅｒ）（Ｗ　Ｐｌ・インストルメンツ）につなげ、空気−パルスした （ａｉｒ−ｐｕｌｓｅｄ）小滴の容量を調節してｍＲＮＡ画分ｎｇ　（典型的に は５０ｎｌ）を出した。ナイロンストッキングを当てて底を固定した３５關培養 皿を用いて、ｍＲＮＡを動物種に注入する間中、卵母細胞を動かないようにした 。注入した卵母細胞をＭＢＳ、１１００ｕ／■１ベニノリンおよび１００　Ｕ／ ｍｌストレプトマイシンを含有する３５ｍ＋ｓ培養皿に置き、１８℃で３日間イ ンキュベートした。
インキュベートに続いて、卵母細胞を１００μｌプラスチツクチヤンバーに置き 、流速０．５ｍｌ／分で螺動ポンプを用いてＭＢＳに注いだ。試験分子または非 有機ポリカチオンを、別の緩衝液に管を迅速に移すことにより加えた。記録し、 電流を通す電極を、１−３モームの抵抗で引っ張られ、３ＭＫＣｌで満たされた 薄壁キャピラリー管から組み立てた。卵母細胞に（動物種において）顕微鏡観察 下で両方の電極を突き刺し、保持電位（−７０ないし一８０ｆｆｌＶ）に合わせ 、保持電位を維持するために通した電流を測定するために用いられるアクソン・ インストルメンツ・アキツクランプ２Ａ電圧−クランプ増幅器につなげた。電流 は、直接ストリップ・チャート記録機に記録した。
ｍＲＮＡ調製のために、子牛または二次）（ＰＴ患者から上皮小体を外科的に除 去して組織を得た。精製した細胞を調製する必要は無い；腺全体をツメガエル卵 母細胞におけるＣａ”″レセプターの発現を支配するｍＲＮＡを調製するのに用 いた。細胞のＲＮＡ全体を均一化した腺を酸グアニジニウムチオシアネート／フ ェノール抽出することにより調製した。オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフ ィーを用いて、標準方法によりポリ（Ａ）”ｍＲＮＡを選択した。ｍＲＮＡの両 分の大きさを揃えるために、グリセロール勾配の遠心分離を使用した。ｍＲＮＡ を２ＱｍＭ水酸化メチル水銀で変性させ、ベックマンＴＬＳ５５管内で調製した 直線１５−３０％グリセロール勾配上に乗せた（濃度１ａｇ／＋ｅｌで５０５０ −１Ｏ０ｕ。続いて、３４．００　Ｏｒｐｍで１６時間遠心分離にかけ、Ｑ、３ ｍｌ勾配画分を集めて、５ｍ１ｉベーターメルカプトエタノールを含有する等容 量の水で希釈した。ｍＲＮＡをその後、２回のメタノール沈澱により回収した。
所望ならば、ｍＲＮＡ　（ポリ（Ａ）”５０　１０１００ｕを１．２％アガＯ− ス／６．０Ｍ尿素分離ゲルで、ＲＮＡサイズマーカーの範囲に沿って分離するこ ともある。続いて、エチジウムブロマイド染色によりｍＲＮＡを視覚化し、ＲＮ Ａを−１，５−２，Ｏｋｂサイズ段階で含有するゲル切片を削り取った。ｍＲＮ ＡをＲＮＡイド結合細胞間質（ＲＮＡｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘＸ供 給者の標準的なプロトコールに従う：ストラタジーン・インコーホレイテッド） を用いてアガロースゲル切片から回収し、回収したｍＲＮＡ画分はＤＥＰＣ処理 水中に溶出した。
回収したｍＲＮＡ量をＵＶ吸収測定により計った。各面分内に含まれるｍＲＮＡ のサイズ範囲は、各試料の少量（０，５ｕｇ）を用いるホルムアルデヒド／アガ ロースゲル電気泳動により測定された。ｍＲＮＡのインテグリテイ−（ｉｎｔｅ ｇｒｉｔｙ）をイン・ビトロで各試料を翻訳することにより評価した。網状赤血 球溶解物（商業的に入手出来るキット；ＢＲＬ）を用いて各ｍＲＮＡ画分の０． ０５−０．５ｕｇを翻訳した。生じた３５Ｓ−標識タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分析した。無傷のｍＲＮＡは、完全なサイズ範囲のタンパク質合成を支 配することが出来、個々のｍＲＮＡ画分のサイズにおおよそ対応していた。
ｃＤＮＡライブラリーをガブラーとホフマンの技術を改良したものに従い、ベク ターλＺＡＰ１１において構築した。卵母細胞アッセーにおいて最適な応答を与 える画分由来のＲＮＡを出発物質として用いた。第−鎖ｃＤＮＡ合或は、オリゴ −ｄＴ／ＮｏｔＩプライマー−リンカ−で活性化（ｐｒｉｍｅｄ）された。第二 鎖合成は、ＲＮアーゼＨ／ＤＮＡポリメラーゼ■自己プライミング法（ｓｅｌｆ −ｐｒｉｍｉｎｇ　ｒａｅｔｈｏｄ）により行った。二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮ ＡポリメラーゼおよびＴ４す００ＨＡの排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグ ラフィーによりサイズ選択した。第−鎖ｃＤＮＡをα−３２ｐ−ｄＡｒｐで放射 性標識し、合成および回収段階の全てを続いて放射活性を組み込んで追跡した。
大きさで分類したカラムから回収したＣた。連結混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍ １ｘ）を商業的に入手可能な高効率パッケージング抽出物（ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉ ｃｉｅｎｃｙ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ）　（ストラタジーン・イ ンコーホレイテッド）で試験パッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）　Ｌ／、適切な宿主 株（ＸＬＩ−ブルー）に置いた。組換ファージの割合は、ライブラリーがＩＰＴ ＧとＸ−ｇａｌ上に置かれている場合、青色プラークに対する白色プラークの比 率で測定した。
挿入物サイズの平均を無作為に選択した１０個のクローンから測定した。ファー ジＤＮＡ“ミニ−プレラプス（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）”を旦臼ＲＩとＮ虹■で 消化して挿入物を放出させ、アガロースゲル電気泳動によりサイズを測定した。
ライブラリーは、〉９０％組換ファージから成っており、挿入物のサイズは、１ ．５から４．２ｋｂの範囲であった。組換連結（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌｉ ｇａｔｉｏｎ）を大規模にパッケージし、ｓｏｏ、ｏｏｏ個の一次クローンを産 した。パッケージング混合物を滴定し、１５ｃｍプレート当たり５０，０００プ ラークで覆った。５０，０００クローンの各プールを３Ｍ緩衝液中で溶出し、個 々に保存した。
クローンブールのそれぞれのプレート溶解物の保存品を小規模のファージＤＮＡ 調製に用いた。ファージ粒子をポリエチレングリコール沈澱により濃縮し、ファ ージＤＮＡをプロトコールに消化、続いてフェノール：クロロホルム抽出により 精製した。ＤＮＡの２０ミクロダラムをＮｏｔ　Ｉで消化し、鋳型としてイン・ ビトロでのセンス鎖ＲＮＡの転写に用いた。イン・ビトロ転写は標準プロトコー ルに従い、総反応容量５０μｍ中Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび５″キヤツプ類 似ｍ’ＧｐｐｐＧを利用する。ＤＮアーゼＩ／ブロテナーゼに消化およびフェノ ール／クロロホルム抽出に続き、ＲＮＡをエタノール沈澱により濃縮して、卵母 細胞注入に用いた。
卵母細胞に、それぞれ５０，０００の独立クローンからなる１６ライブラリーサ ブブール由来の合成ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）れぞれを注入した。３〜４日間インキ ュベーションした後、卵母細胞のＣａ　１＋依存性ｃ１−電流の誘導に対する１ ０ｍＭのネオマイシンの能力を評価した。６と名付けたプールは、陽性信号を示 し、従って機能的カルシウム受容体をコード化するｃＤＮＡり占−ンを含む。プ ール６の複合性を減少、すなわちこのプール中に含まれるカルシウム受容体クロ ーンの精製を行うために、プール６フアージをプレート当たり〜２０，０００プ ラークで再び平板培養し、１２プレートを回収した。ＤＮＡはそれぞれのこれら のサブプールから製造され、ｃＲＮＡが合成された。再び卵母細胞にｃＲＮＡを 注入し、３〜４日後、Ｃａ”依存性ＣＩ−電流の誘導に対する１ｏａ１Ｍのネオ マイシンの能力を評価した。サブプール６−３は陽性でこのプールは、プール当 たり約５，０００クローンに複合性を減少する、さらなる一連の平板培養の対象 とした。プールは再びｃＲＮＡの製造および卵母細胞中への注入により測定した 。サブブール６−３．４は陽性であった。プール６−３．４の陽性クローンのさ らなる精製を促進するために、このプールからのファージＤＮＡをヘルパーファ ージ、ＥｘＡｓｓｉｓｔで重感染させることによりプラスミドＤＮＡとして救済 した。救済したプラスミドの細菌株ＤＦ１５ａｌｐｈａＦ’への形質転換により 、アンピシリンプレート上で形質転換細菌コロニーが得られた。これらはそれぞ れ９００クローンのプールとして回収した。プラスミドＤＮＡを次にそれぞれの サブプールから製造し、通常の方法でｃＲＮＡ合成および評価をした。サブブー ル６−３．４．４が陽性であった。プラスミドサブプール６−３．４．４を含む 細菌をそれぞれ〜５０クローンのサブプールで連続して平板培養した。この方法 の繰返しにより機能的カルシウム受容体をコード化する単一クローンが得られる ことが期待される。
最初の実験は、水またはウシ上皮小体由来ポリ（Ａ）−に富むｍＲＮＡ（５０ｎ ｇ）を注入されたアフリカッメガエル卵母細胞を使用した。３日後、卵母細胞の 、細胞外２または３価カチオン濃度の増加に応答する細胞内Ｃａ”“増加の能力 を評価性Ｃａ”−活性化ＣＩ−チャンネルを通る電流を測定することにより評価 した。
ウシ（またはひと、Ｆｉｇ、２６）上皮小体由来のポリ（Ａ）′″−に富むｍＲ ＮＡを注入された卵母細胞中では、細胞外Ｃａ”＋の濃度が０．７から３．５ま たはｌＯ履Ｍへの増加が、次に高い基底コンダクタンスの付近で振動するＣＩ− コンダクタンスの急速および一時的増加を生じさせた。細胞外Ｍｇトの１から１ ０−Ｍへの濃度の増加は、同様にＣＩ−コンダクタンスの振動的増加を引き起こ した。Ｃ１−コンダクタンスの細胞外Ｍ　ｇ２＋に対する応答は細胞外Ｃａ”濃 度が〈１＃Ｍに減少した場合に持続した（Ｆｉｇ、２５）。
一時的な３価カチオンＧｄ３４（６００μＭ）はまたＣＩ−コンダクタンスの振 動的増加を生じさせた（Ｆｉｇ、２５）。振動性であり、細胞外Ｃａ”の見かけ 土工存在下で持続するＣＦコンダクタンスのこのような増加は、卵母細胞に他の Ｃａ”−流動受容体の発現され、適当な配位子で促進されることが認められた（ 例えばサブスタンスＫＳＦｉｇ、２５）。これらの例中、ＣＩ−コンダクタンス の増加は細胞内Ｃａ”の流動化を反映する。これらの最初の研究は同様に細胞外 多価カチオンが、細胞内Ｃａ”を、上皮小体細胞ｍＲＮＡ−注入卵母細胞中で流 動させることを示す。
水を注入された卵母細胞は、細胞外Ｃａ”″（ＩＯＩＭ）またはＭｇ”（２Ｑま たは３０ｄ）にさらした場合Ｃ１−電流の変化は示さなかった。一連の実験の中 で、卵母細胞はサブスタンスに受容体をコード化するｍＲＮＡを注入された。こ れらの卵母細胞中、細胞外Ｍｇ”（２０℃Ｍ）は電流を引き起こさないが、細胞 はサブスタンスにの添加に活発に応答した（Ｆｉｇ、２５）。これらの実験は、 卵母細胞の細胞外Ｃａ”またはＭｇ”に対する内因性の感受性がないことを示唆 する。
同様の実験をひと上皮小体（第２期ＨＰＴ由来の過形成組織）から製造したポリ （Ａ）４−に冨むｍＲＮＡを注入した卵母細胞を用いても行った。これらの卵母 細胞では、細胞外Ｃａ”濃度の増加は振動しているＣ１−コンダクタンスの可逆 的増加を生じさせた（Ｆｉｇ、２６）。３００μＭＬａ”の添加も同様にＣ１− コンダクタンスの振動的増加の原因となった。細胞外Ｍｇ２″１の１から１０− への増加が、細胞外Ｃａ”不存在下で持続するＣＩ−コンダクタンスの増加を引 き起こした。
付加実験は、細胞外Ｃａ２４に対する反応が濃度依存性であることを示唆する。
したがって、３個のｍＲＮＡ−注入卵母細胞中、Ｃ１−コンダクタンスは最大１ １１±２ｎＡまで３１１ＩＭの、および２３３±１０１ｎＡまで１０−の細胞外 Ｃａ”で増加した。
アフリカッメガエル卵母細胞で得られた結果は、通常非反応性細胞中で、細胞外 Ｃａ”の感受性を与えることができる蛋白質をコード化する、上皮小体細胞中の ｍ　ＲＮ　Ａ　（＊）の存在を証明する。さらに、細胞外Ｍ　ｇ２“の、細胞外 Ｃａ”″不存在下で０１−電流の振動性増加を引き起こす能力は、Ｃ１−電流が 、細胞外Ｃａ”今の流入よりむしろ細胞内Ｃａ”の流動に依存することを証明す る。’Ｌａ”で得られた結果も同様に、発現蛋白質が、細胞内Ｃａ”の流動に関 連していることを示す。まとめると、これらのデータは発現蛋白質はチャンネル というよりもむしろ細胞表面受容体として働く。これらの研究は、上皮小体細胞 上のＣａ”“受容体蛋白質に存在の注目せずにはいられない証拠を提供し、Ｃａ ”＋受容体ｃＤＮＡの分子クローニングを成し遂げるためアフリカッメガエル卵 母細胞系を使用することの可能性を示す。
他の一連の研究で、水酸化水銀メチルで変成させた上皮小体細胞のｍＲＮＡは、 グリセロール勾配による遠心分離ででサイズ分画した。両分を回収した。それぞ れの群をアフリカッメガエルの卵母細胞系に注入し、３日間のインキュベーショ ンの後、卵母細胞をＣａ”受容体の発現に対して評価した。画分４−６を注入さ れた卵母細胞が、細胞外Ｃａ”に反応したＣヒコンダクタンスの最大で最も調和 した増加を示した。これらの結果は、Ｃａ”受容体がサイズ２．５−３．５ｋｂ のｍＲＮＡによりコード化されていることを示す。これは、形質転換ベクターｃ ＤＮＡライブラリーから合成されたＲＮＡの直接発現を用いた方法が、可能性が あることを示唆する。この種のサイズ分画実験が行われ、異なった３種の分画実 験でそれぞれ同様の結果が得られた。
前記の実験で得られ、特徴付けられたｒｎＲＮＡ画分は卵母細胞に注入すること により測定できる。それぞれのｍＲＮＡ画分で、１０−２０個の卵母細胞に５０ ｎｇのＲＮＡが、濃度１ｎｇ／ｎｌ水溶液として注入される。注入された卵母細 胞は１８℃に４８−７’２時間維持され、その後ＣＩ−電流測定を用いたＣａ” 受容体の発現を測定する。注入した卵母細胞のそれぞれの群で、受容体発現に対 する陽性の数、および測定したＣａ”−依存性Ｃ１−電流の大きさを測定する。
陰性対象として、卵母細胞にラット肝臓ポ１バＡ）４−に富むｍＲＮＡ５酵母Ｒ ＮＡまたは水を注入する。
２、５−３．５ｋｂの範囲のｍＲＮＡは受容体をコード化することが予想される 。
大きいサイズのｍＲＮＡは、卵母細胞への注入に先立つ上皮小体ｍＲＮＡのハイ ブリッド除去を基本にしたクローニング研究に必要であり得る。この方法の成功 は完全な長さのｃＤＮＡクローンの産生に依存しない。もし受容体発現がｍＲＮ Ａの単一サイズの画分て得られない場合、卵母細胞にサイズ混合画分を注入し、 機能的受容体を上昇させる組み合わせを決定する。もし、多重サブユニットが機 能的受容体の形成のために必要であることが明らかになった場合、ハイブリッド 除去発現クローニング法が使用される。この研究で、クローンは、特異的ｍＲＮ 八種へ全ｍＲＮＡ集団から枯渇させるその能力を基本にして選択される。単一サ ブユニットをコード化するクローンは、活性多重サブユニット複合体形成の阻止 能力により同定する。徹底的なスクリーニングにより、必要なサブユニットの全 てをコード化するクローンの同定が可能になる。
この研究は、機能的受容体複合体を形成するために必要な個々のサブユニットを コード化するクローンの単離を可能にする。クローンのプール由来の合成ＲＮＡ は、アフリカッメガエル卵母細胞にＣａ”受容体の発現を誘導する能力により、 基本ｍＲＮＡ画分の測定に使用したのと同様の技術で評価する。本来、それぞれ １００．０００個の初期クローンを表す１０個のプールが試験される。陽性反応 を示すクローンのプールは低い（一般的に４〜１０倍）配合性でふるい分け、再 び陽性プールを小分けし、ふるい分ける。ライブラリー細分画におけるこの方法 は、個々の陽性クローンが同定されるまで続ける。卵母細胞発現測定の陰性対象 として、アンチセンス転写物が、陽性反応を誘導するこれらの鋳型ＤＮＡのＴ７ 転写により産生される。アンチセンス転写物は標準受容体を発現できず、合成Ｒ ＮＡの注入により発生する任意の非特異的陽性信号を制御する。他の重大なこと は、卵母細胞中の合成ＲＮＡが、未確認の機構により時々「有毒」に翻訳され得 るという事実である。この可能性を制御するために、陰性反応を与える合成ＲＮ Ａを、上皮小体細胞ｍＲＮＡと共に種々の希釈で共注入し、それらがＣａ”受容 体の発現の非特異的妨害をするかどうか測定する。
Ｃａ”受容体をコード化する個々のクローンが同定された場合、挿入ｃＤＮＡは λベクターから切除され、合成ＲＮＡの大きいスケールでの合成に使用される。
この単−ＲＮＡ種の卵母細胞注入は、発現受容体の特徴の厳密な測定を可能にす る。
もしＣａ”受容体をコード化するｍＲＮＡのサイズが直接転写によるクローニン グおよび発現に大きすぎる場合、またはたとえ多重サブユニットが含まれても、 スクリーニングしたクローンのプールのハイブリッド除去技術が使用される。Ｃ ＤＮＡ挿入ＤＮＡは、サイズ選択上皮小体細胞ＣＤＮＡライブラリーからのクロ ーンのプールから製造される。このＤＮＡは上皮小体細胞ｍＲＮＡへ、ＤＮＡ／ ＲＮＡ２重体の形成が可能な条件下でハイブリダイズされる。非アニール化、ハ イブリッド除去ＲＮＡは回収され、卵母細胞注入へ使用される。Ｃａ”受容体ｍ ＲＮＡを示す配列を含むクローンのプール由来のＤＮＡはこの全上皮小体細胞ｍ ＲＮＡ集団由来のｍＲＮＡから除去され、この受容体の発現は卵母細胞注入によ り減少しまたはなくなる。細分面の方法は、クローンのプールの複合性の減少に より生じ、それぞれの工程で、全上皮小体ｍＲＮＡ集団からＣａ”受容体コード 化ｍＲＮＡを除去したクローン化ＤＮＡを測定する。ハイブリッド除去測定の間 の内部制御の使用は、ハイブリッド除去ＲＮＡは無傷であり卵母細胞への形質転 換に用いられることを確実とする。
ひと上皮小体細胞はアデニレートサイクラーゼに結合したベーターアドレナリン 様受容体を発現する。この受容体は卵母細胞中で発現でき、そこでそれは内因性 アデニレートサイクラーゼのアゴニスト−誘導活性化を担う。Ｃａ”″受容体ク ローンのハイブリッド除去スクリーニングの間、ハイブリッド除去ｍＲＮＡを注 入された卵母細胞はイソプロテレノール−誘導アデニレートサイクラーゼ活性化 として測定される。この測定における陽性反応は、Ｃａ”受容体反応の任意の観 察される阻害が特異的であり、全ｍＲＮＡ集団の一般的な阻害によるものではな いという示唆に役立つ。
ハイブリッド除去スクリーニング法により、完全蛋白質コード化領域を含まない クローンの単離ができる。このスクリーニング法により単離された陽性クローン は、蛋白質コード化能力を測定するために順番に配列する。ひと上皮小体ＲＮＡ のノーザンプロット分析は、特異的クローンに対応する完全ｍＲＮＡのサイズの 測定を可能にする。もし陽性クローンが完全な長さと思われない場合、クローン 化ｃＤＮＡは、完全ｃＤＮＡのための上皮小体ＣＤＮＡライブラリーをふるい分 ケるハイブリダイゼーションプローブとして使用する。
種々の細胞系で、内因性機能性受容体のための連結外因性発現受容体が可能であ る。これらの細胞系の多く（例えばＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＧ１１５、Ｃ ＨＯＳＨＥＫ、２９３およびＣＯ３７）が内因性Ｃａ！＋受容体を欠いているこ とを確認するために試験できる。外部のＣａ２＋への反応を欠いたこれらの系は 、クローン化Ｃａ”受容体を発現する安定した形質導入細胞の確立に使用できる 。
発現クローニングにより同定されたＣａ”受容体ｃＤＮＡクローンの配列分析は 、受容体蛋白質をコード化する開放読み取り枠の範囲を決める。ｃＤＮＡのコー ド化領域は、真核発現ベクターｐＭＳＧの多重クローニング部位にサブクローン 化される。このベクターはマウス乳房症ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーターによ り引き離された高レベルの転写を可能にし、広範囲の哺乳類細胞で活性である。
本ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるミコフェノール酸に対 する耐性のために、ｇｐｔ遺伝子、および細菌の選択および成長に必要な配列を 含む。大量の発現ベクター／受容体ｃＤＮＡプラスミド構築物は成育させ、エシ ェリキア・コリから精製される。
真核細胞系へのプラスミドＤＮＡの形質導入の最も効果的な方法は、与えられる 細胞系により変化する。Ｃａ”受容体発現構築物は適当な技術、Ｃａ２“リン酸 沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質導入、リポフェクヨンまたはエレクトロポレ イションのいずれかにより培養細胞へ挿入される。形質導入工程に続き、細胞を 抗生物質Ｇ４１８の存在下で、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞を選択す るために成育させる。Ｇ４１８耐性形質導入体のコロニーはサブクローン化され 、独立細胞系として確立される。Ｇ４１８耐性細胞中のＣａ”受容体蛋白質の発 現は、数種の方法により評価される。サザンプロットおよびスロットプロット分 析により、受容体ｃＤＮＡの存在およびコピー数を確認する。ノーザンプロット 分析は、受容体ｍＲＮＡがプラスミド構築物から複写されたものであるという証 明に使用される。受容体蛋白質の機能的発現は外部投与Ｃａ”受容体アゴニスト に反応する細胞内Ｃａ”の流動化の測定により決定される。
Ｃａ”受容体のクローニングは、本新規受容体の構造的および機能的研究の両方 を可能にする。組み換えて産生された受容体は構造研究のために結晶化され得る 。本受容体を発現する安定形質導入細胞系は、天然産物または他の化合物ライブ ラリーの高処理量スクリーニングに使用できる。必須の効果および特異性をもつ 分子は（放射活性的または蛍光的に）標識できる。試験分子／抽出物のこのよう な標識分子を表す能力は、スクリーニング用の高処理量測定の基本を形成する。
他のカルシウム受容体を発現する適当な細胞または組織があるとすれば、これら の受容体は上皮小体細胞カルシウム受容体の製造として上記したのと類似の方法 でクローン化し得る。例えば、ひと破骨細胞腫組織由来のｍＲＮＡは破骨細胞カ ルシウム受容体をコード化する。したがって、ひと破骨細胞受容体のクローンを 単離するためには、上記のように、破骨細胞腫組織由来のｍＲＮＡの単離、ＣＤ ＮＡライブラリーの製造および測定／分画化サブプールのみが必要である。さら に、薬剤スクリーニングのために好ましい受容体は、ひと起源のものである。
ある種のカルシウム受容体をコード化するクローンは、対応するひとｃＤＮＡク ローンを当分野の技術者には既知の交差ハイブリダイゼーシヨンで得るために使 用し得る。さらに、上皮小体細胞または他の細胞Ｃａ”＋受容体のクローンは他 の同種の細胞のＣａ　２４−感受性蛋白質、コード化する遺伝子の単離およびこ れらの蛋白質の発現を可能にする。これは多くの方法で成し遂げられる。Ｃａ” 受容体ｃＤＮＡをハイブリダイゼ−ションプローブとして使用したひとゲノム性 ＤＮＡのサザンブロソド分析は、ゲノムをコード化する多くの関連する配列を示 唆する；種々の配列のハイブリダイゼーシヨンは、関係する配列間の相違割合を 示唆する。これは関係する受容体蛋白質をコード化する遺伝子の有効な数につい ての情報を提供する。Ｃａ”受容体ｃＤＮＡをプローブとするノーザンプロット 分析は、種々の同じまたは関係する転写物が種々の組織に存在するかどうか決定 する。
もし、上皮小体細胞Ｃａ２＋受容体に関係する転写物相同体が検出されれば、こ れらのｍＲＮＡのクローンを、適当なＣＤＮＡライブラリーのスクリーニングま たはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のいずれかにより得るのは、比較的簡単 な事柄である。このようにして得た新規受容体クローンは、卵母細胞中または形 質導入細胞系中の発現により機能的に評価される。細胞特異的Ｃａ”受容体を発 現する形質導入細胞は、例えば卵母細胞または傍系球体細胞のＣａ２４−感受性 機構に特異的に働く分子に高処理量スクリーニングを提供し得る。
別法として、カルシウム受容体は、真核細胞での発現によりクローン化できる。
例えば、ＣＤＮＡライブラリーが上皮小体ｍＲＮＡから製造され、真核発現ベク ター、ｐＣＤＮＡｌにクローン化できる。このライブラリーからのサブプールは 、ＣＯ３７またはＨＥＫ２９３細胞のような真核細胞へ形質導入でき、相対的に 高いレベルのコード化されたｃＤＮＡ配列の一時的な発現がおこる。機能的カル シウム受容体クローンを形質導入した細胞はカルシウム受容体を発現し、それは 次にカルシウム、ネオマイシンまたは他のカルシウム様化合物により活性化でき る。
もし、細胞に最初に［Ｃａ！４］＋とじて蛍光指示薬を導入していれば、カルシ ウム受容体の活性化により蛍光が増加する。したがって、カルシウム受容体を含 むライブラリーサブプールは、真核細胞への形質導入に加えて、蛍光のカルシウ ムまたはカルシウム様物質特異的増加の能力により同定される。この蛍光は蛍光 測定器または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）を用いて測定できる。
別法として、Ｃａ”″受容体を、受容体に対して産生したモノクローナル抗体を 用いてクローン化できる。モノクローナル抗体は、特異的蛋白質の免疫親和性精 製において強力な道具を提供する。一度精製すれば、限られたアミノ酸配列デー タを興味の対象の蛋白質から得、完全ｃＤＮＡのクローンをふるい分けるための オリゴヌクレオチド配列プローブを設計するのに使用される。
ハイブリドーマの製造のために、全ウシ上皮小体細胞が免疫源として使用される 。精製した分散させた細胞が得られ、確立法にしたがって、生存細胞調製品を適 当なマウス種に腹腔内注入する。標準工程は免疫する計画およびハイブリドーマ の製造に従う。２段階スクリーニング法は、Ｃａ”受容体を認識するモノクロー ナル抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために使用される。最初のふるい 分けは、上皮小体細胞表面抗体を認識するモノクローナル抗体を分泌するハイブ リドーマの同定に使用される。免疫化学的技術は、次に上皮小体細胞の表面に結 合したマウス抗体の存在のハイブリドーマ上清によるふるい分けに使用される。
このふるい分けは上皮小体組織の確定部位または初期培養の分散細胞で行い得る 。
この測定技術は文献により確立されている。
このふるい分けは、種々の細胞表面決定基へのモノクローナル抗体を産生ずるハ イブリドーマを同定し、Ｃａ２４受容体に特異的なモノクローナル抗体はこれら の中の小さなサブセットを構成するだけであることが予想される。Ｃａ”＋受容 体に結合するモノクローナル抗体を同定するために、最初のふるい分は試験で陽 性であったハイブリドーマ上清は培養上皮小体細胞のＣａ”アゴニストに対する 反応の阻害能力を測定する。受容体の細胞外領域に結合するある抗体は、配位子 結合を阻害または活性化すること、あるいは受容体活性化を妨害しまたは影響を 与えることが予期される。
両方のふるい分けで陽性であるモノクローナル抗体は、ウェスタンプロット法、 免疫沈降および免疫組織化学により特徴付けされる。認識する抗原の大きさおよ びその組織分布の決定が可能となる。適当なモノクローナル抗体は、次にＣａ２ ４受容体蛋白質の、標準法に従った免疫親和性クロマトグラフィーによる精製に 使用される。限られたアミノ酸配列決定に充分な蛋白質の量が得られる。変性オ リゴヌクレオチドプローブが次に蛋白質配列情報を基にして設計される。これら のプローブは、次に、Ｃａ”受容体の完全長クローンのための上皮小体ｃＤＮＡ ライブラリーのふるい分けに使用される。得られたクローンは、ＤＮＡ配列決定 および卵母細胞系および培養哺乳類細胞系での機能的発現により特徴付けされる 。
あるいは、抗体は、発現ライブラリー、例えばλｇｔｌｌのｃＤＮＡライブラリ ーまたはその相等物のふるい分け、これらの抗原的反応性蛋白質を発現するクロ ーンの決定に使用される。
ファージ表示ライブラリーが、モノクローナル抗体に代わってカルシウム受容体 のクローンおよび分析に使用されることは、当分野の技術者にはまた認められる であろう。これらのライブラリーで、抗体可変領域またはランダムペプチドはフ ァージ発現ベクターに、抗体領域またはペプチドがファージ粒子の表面に表れる ようにショットガンクローン化される。抗体領域またはペプチドを示し、カルシ ウム受容体に高特異的結合であるファージは、これらの受容体を示す細胞（例え ば上皮小体細胞、Ｃ−細胞、破骨細胞等）に結合する。このようなファージの多 （が、これらの細胞に結合できるこれらのファージのみを選択するこれらの細胞 型に対してふるい分けできる（カルシウム受容体に結合するファージを含む）。
この方法中、ライブラリーの複合性は非常に軽減できる。次に、モノクローナル 抗体に対する上記のふるい分けは、カルシウム受容体結合抗体またはペプチド領 域を示す単離ファージに使用でき、これらのファージは構造的同定およびクロー ニングの目的でカルシウム受容体を単離するのに使用できる。このようなファー ジ表示ライブラリーは市販されている（例えば、ストラタサイト、またはケンブ リッジ・アンチボディー・チクノロノー・リミテッド）。このようなカルシウム 受容体−結合特性をもつ組み換えファージは、種々のカルシウム受容体分析にお いてモノクローナル抗体の代わりにまた使用できる。このようなファージは、カ ルシウム受容体におけるひとの治療の発展において構造的模範となるカルシウム 受容体に機能的結合できる有機化合物を同定する高処理量競合結合ふるい分けに もまた使用できる。
他の別法として、放射性配位子の受容体への親和性交差架橋が受容体蛋白の単離 に、１　レセプター　バイオケミカル・メソドロノー、１６Ｌ　１９８４にピリ ソヒおよびチェックか記載しているように、使用できる。放射性配位子の共有結 合は、非特異的結合を除去するためのさらなる洗浄を可能にする。例えば、細胞 内Ｃａ２４とＥＣ３゜が約１０１００ｎたはそれ以下で流動する高親和性分子、 例えば適当なアルギニンおよびチロシンのコポリマー（分子量＝２２に；アルギ ニンチロノン比＝４１）は、１２５Ｉでヨウ素化し、架橋する。プロタミン類は 、そのより小さなサイズのため、交差架橋研究に好ましく、ド・ツタビオ−マー チンおよびラベル、８７　アナリティカル・バイオケミストリー、５６２．１９ ７８に記載されているように還元的アルキル化され得る。
非特異的標識は、非標識多価カチオンおよび２価および３価カチオンの存在下交 差架橋により最小に保つ。これらの分子が高濃度の場合、標識と細胞表面の非特 異的相互作用は減少する。
使用 初期上皮小体機能亢進症（ＨＰＴ）は高カルシウム血症および循環ＰＴＨのレベ ルの増加により特徴付けられる。ＨＰＴの主要な欠陥のうちの一つは上皮小体細 胞の、細胞外Ｃａ”″による負のフィードバック制御に対する感受性の減少であ ると思われる。したがって、初期ＨＰＴ患者由来の組織では、細胞外Ｃａ”に対 する「定点」が右にずれ、そのため通常より高い細胞外Ｃａ２＋濃度がＰＴＨ分 泌を抑制するために必要である。さらに、初期ＨＰＴでは、細胞外Ｃａ”濃度が たとえ高くても、ＰＴＨ分泌抑制はしばしば部分的のみである。第２期（尿毒症 の）ＨＰＴでは、たとえＣａ”が抑制するＰＴＨ分泌が通常の割合であっても、 細胞外Ｃａ２４に対する定点が同様に上昇していることが観察される。ＰＴＨ分 泌の変化は、［Ｃａ”］＋の変化に平行である：細胞外Ｃａ２−誘導［Ｃａ　” ″］、増加の定点は右にずれ、このような増加の度合は減少する。さらに、モノ クローナル抗体による組織の染色は、Ｃａ２４受容対が腺腫様および過形成上皮 小体細胞で減少していることを表す。
Ｃａ”受容体は薬理学的介入のための不連続の分子本体を構成する。細胞外Ｃａ 　２４の作用が類似または反対である分子は、初期および第２期ＨＰＴ両方の長 期管理に有益である。このような分子は、高カルシウム血症状態単独では成し遂 げ得ないＰＴＨ分泌抑制に必要な付加刺激を提供する。細胞外Ｃａ”より大きい 効果のこのような分子は、腺腫様組織で特に厄介であるＰＴＨ分泌の明白な非抑 制可能因子を征服し得る。別にまたは付加的に、このような分子は、ウシおよび ひと腺腫症上皮小体組織で長期の高カルシウム血症がｐｒｅｐｒｏ　Ｐ　Ｔ　Ｈ ｍ　ＲＮ　Ａのレベルの抑制を示すように、ＰＴＨの合成を抑制し得る。長期高 カルシウム血症はまた上皮小体細胞のイン・ビトロでの増殖をまた抑制し、した がってカルシウム様物質は、第２期ＨＰＴで特徴的な上皮小体細胞過形成の制限 にもまた効果的であり得る。
他の体細胞は、直接細胞外Ｃａ”濃度の物理的変化に反応できる。甲状線内小胞 周辺細胞（Ｃ−細胞）からのカルシトニン分泌は、細胞外Ｃａ”の濃度の変化に より調節される。腎臓傍系球体細胞からのレニン分泌は、ＰＴＨ分泌のように、 細胞外Ｃａ２′″の濃度の増加により抑制される。細胞外Ｃａ”＋は、これらの 細胞の細胞内Ｃａ”流動を生じさせる。単離破骨細胞は、細胞内Ｃａ”“流動か らある程度生じた［Ｃａ”］１の増加に対応する細胞外Ｃａ”の濃度を増加させ る反応をする。破骨細胞での［Ｃａ”］＋の増加は、上皮小体細胞におけるＰＴ Ｈ分泌と類似の機能的反応（骨の吸収による除去）を阻害する。したがって、Ｃ ａ”は、その細胞内信号としての偏在的役割に加えて、ある特異的細胞の反応を 制御する細胞外信号としてまた機能するという示唆をする充分な徴候がある。本 発明の分子は、これらの細胞での崩壊したＣａ”反応に関連する疾病の処置に使 用できる。
上皮小体細胞および他の細胞のＣａ”受容体のクローニングは、直接評価すべき 他の細胞中の相同蛋白質の存在を可能にする。構造的に相同なＣａ”受容体蛋白 質の群は、このように得ることができる。このような受容体は、これらの細胞が どのようにこれらの細胞が細胞外Ｃａ”＋を検出するかの理解を可能にし、本明 細書に述べたＨＰＴ、骨粗上症および高血圧の処置に有効な治療の活性部位とし ての機構の評価および他の骨および鉱物関連疾患の新規療法を可能にする。
他の使用は上記した。例えば、組み換えＣａ”受容体蛋白質は療法に使用され、 標準法、例えばこの蛋白質をコード化する核酸の形質導入により導入される。さ らに、このような蛋白質は本発明のカルシウム受容体の測定に有用である。
下記の実施例は、範囲を限定することなく本発明を説明する。
実施例 本明細書に記載の研究で、種々の有機分子が上皮小体細胞において細胞内Ｃａ２ “を流動させることおよびＰＴＨ分泌を抑制することが分かった。これらの分子 は構造的には多様であるが、多くが生理学的ｐＨで正味の陽電荷をもつ。有機化 合物のカチオン性の性質は有用な役割を担うが、活性決定における唯一の因子で はない。
実施例１：ウシ上皮小体細胞におけるカルシウム様分子のスクリーニング分離し たウシ上皮小体細胞をパーコール勾配で精製し、−晩血清非存在培地で培養した 。細胞を連続してｆｕｒａ−２と共に導入し、遊離細胞内Ｃａ”濃度を蛍光的に 測定した。［Ｃａ”］＋の変化はＣａ”受容体に活性な分子のふるい分けに使用 した。カルシウム様とみなすため、分子は細胞外Ｃａ”の増加による通常の効果 を示し、Ｃａ”＋受容体の活性化により誘因されることが必要であった。
１）分子は、細胞外Ｃａ”″の非存在下持続する［Ｃａ　”］　Ｉの増加を引き 出さねばならない（細胞内Ｃａ”の流動の証明）。
２）分子は、百日咳毒素により阻止されるイソプロテレノール−刺激されたサイ クリックＡＭＰ形成減少を生じさせなければならない：３）分子は濃度と同等の 範囲で、［Ｃａ”］＋増加を生じさせるＰＴＨ分泌を阻害しなければならない： および ４）Ｃａ”およびＰＴＨ分泌に対する分子の濃度反応曲線はフォルボールミリス テートアセテート（ＰＭＡ）のようなＰＫＣ活性化剤で右に移動しなければなら ない。
分子のいくつかの構造的に異なる群を試験した　ポリアミン類、アミノグリコン ド抗生物質、プロタミンおよびリジンまたはアルギニンポリマー類。これらの分 子の構造は図１に描く。図１に含まれるものは、その分子の正味の陽電荷、ウシ 上皮小体細胞の細胞内Ｃａ”流動の誘導に対するＥＣ，、である。
一般に、分子の正味の陽電荷が大きければ大きいほど、その細胞内Ｃａ２４流動 を生じさせる有効性は高い。しかしながら、この見かけの規則に対するいくつか の著しい例外が、下記のように発見された。
図から見られるように、スペルミン、ネオマイシンＢおよびプロタミンはｆｕｒ ａ−２−導入ウシ上皮小体細胞において［Ｃａ”］＋の急速で一時的な増加を誘 導する（Ｆ　ｉ　ｇ、　５．７．１１）。しかしながら、それらは、ひと上皮小 体細胞ではなるが（Ｆ　ｉ　ｇ、　１９）、ウソ上皮小体細胞では充分な［Ｃａ ”］：の定定常角を生じさせない（Ｆ　ｉ　ｇ、　６．１１）。この点で、それ らは、ウソ細胞における細胞外Ｍｇ”により誘導され、細胞外Ｃａ”の流入を伴 わない細胞内Ｃａ”の流動化を生じさせる細胞質ゾルのＣａ”反応に似ている（ Ｆ　ｉ　ｇ、　１１　ｂ）。スペルミン、ネオマイシンＢまたはプロタミンによ り誘導された［Ｃａ”］＋の一時的な増加は、低濃度（１ｐＭ）のＬａ”または Ｇｄ”で阻止されない（Ｆｉｇ、１１ｆＳｇ）。
多価カチオン分子により誘導された細胞質ゾルのＣａ”過渡現象は細胞外Ｃａ” の不存在下で持続したが、Ｃａ”の細胞蓄積がイノマイシンによる前処理で枯渇 した場合阻止された（Ｆｉｇ、７　；　１ｌｈＳ　ｉ）。これらのすべての分子 は、したがって上皮小体細胞で細胞内Ｃａ２＋流動を生じさせる。
多価分子は細胞内Ｃａ２４の、細胞外Ｃａ”により使用されるのと同じプールを 流動化することを加えて示唆した。したがって、細胞外Ｃａ”の濃度の増加は、 スペルミンにより誘導された［Ｃａ”］＋の一時的な増加を進歩的に阻害する（ Ｆｉｇ、６）。逆に、スペルミンまたはネオマイシンＢの最大に有効な濃度は（ Ｆｉｇ、２）過渡現象を阻止するが、細胞外Ｃａ”により誘導された［Ｃａ”］ ＋の定常増加ではない。
重要には、スペルミン、ネオマイシンＢおよびプロタミンはＰＴＨ分泌を細胞外 Ｃａ”と同程度阻害した。これらの分泌における阻害効果は、細胞内Ｃａ”＋の 流動化を生じさせる濃度で得られた（Ｆ　ｉ　ｇ、　８．１３）。これらの発見 は、細胞外Ｃａ２＋によるＰＴＨ分泌の抑制に寄与した機構の理解に関連する。
種々の無機多価カチオンがすべて分泌を阻害するため、細胞外Ｃａ２４のみが依 然として持続した、［Ｃａ”］＋の定常増加を生じさせ、このような［Ｃａ　” ］、の増加は分泌の制御に重大に含まれることはできない。細胞外Ｃａ　２４流 入よりむしろ細胞内Ｃａ２４の流動が、ＰＴＨ分泌抑制に関連する本質的な機構 である。これは分子がＰＴＨに影響がある場合、影響される充分な機構を定義す るため、重要である１分子刺激選択的細胞外Ｃａ　”流入は、ＰＴＨ分泌抑制に は比較的効果がない。比較して、単にＣａ２４流動を生じさせる分子は、ＰＴＨ 分泌抑制において細胞外Ｃａ２′″と全く同程度に有効である。
細胞外Ｃａ”により誘導される細胞内Ｃａ”流動化のように、多価カチオン分子 により誘導されるものはＰＭＡにより抑制された。スペルミンで誘導される細胞 質ゾルＣａ”過渡現象のＰＭＡによる優先的阻害効果を示す代用的な実験は、Ｆ ｉｇ、１４に示す。ＡＴＰにより誘導された細胞質ゾルＣａ”過渡現象は、ＡＴ Ｐのほとんど最大濃度を使用した場合でさえ、効果がなかった。多価カチオンに より誘導された細胞質ゾルＣａ２＋過渡現象におけるＰＭＡの効果はその細胞外 Ｃａ”に対する反応への影響と平行であった：両方の場合、濃度反応曲線が右へ 移動した（Ｆ　ｉ　ｇ、　１５）。ＰＭＡの［Ｃａ”］＋における抑制的効果は 、高濃度の有機多価カチオンで征服された分泌における効力を高める効果に付随 した（Ｆｉｇ、１６）。
多価カチオン分子により誘導された細胞内Ｃａ”の流動は、イノシトールリン酸 の形成の増加と関連があった。例えば、プロタミンはＩＰ、レベルの増加に付随 したＩＰ、の形成の急速（３０秒以内）増加を生じさせた。これらの両方の効果 は、細胞外プロタミンの濃度に依存した（Ｆ　ｉ　ｇ、　１７）。さらに、ＰＭ Ａによる前処理は、多価カチオン分子により誘導されるイノシトールリン酸の形 成を鈍らせた。スペルミンで得られた代表的な結果はＦｉｇ、１８に示す。
スペルミン、ネオマイシンＢおよびプロタミンは、イソプロテレノール−誘導サ イクリックＡＭＰ増加を抑制した。分子細胞外Ｃａ”のサイクリックＡＭＰ形成 に対する阻害効果のように、多価カチオン分子により誘導されるそれは、百日咳 毒素との前処理により阻止された（表２）。
表２ サイクリックＡＭＰ（制御％） 対照　十ＰＴｘ Ｏ，５ｍＭＣａ”　１００　１０６±８２．０ｍＭＣａ”　１９±４　９４±２ ０．５ｍＭＣａ”＋２００ｇＭスペルミン　２３±５　９３±６Ｑ、　５ｍＭＣ ａ　”＋　３０ａＭネオマイ／ンＢ　２８±７　８７±６０．５ｍＭＣａ”＋２ ａｇ／ｍｌプロタミン　２０±７　８９±９百日咳毒素（ＰＴｘ）は、細胞外Ｃ ａ”およびサイクリックＡＭＰ形成における多価カチオンの阻害効果を阻止する 。ウシ上皮小体細胞は、１６時間１１００ｎ／ｍｌの百日咳毒素存在下または非 存在下で培養した。細胞を次に洗浄し、１５分間、指示量の細胞外Ｃａ”または 多価カチオン分子存在下または非存在下で１０μドのイソプロテレノールと共に インキュベーションした。全サイクリックＡＭＰＣｍ胞＋上？ｌｌ）＋ｉＲＩ　 Ａ＋、−ヨリ１１１１定シ、！果は０．５ｍＭＣａ”（１１２＋１７　ｐｍｏｌ ／　１０　’細胞）で得られたレベルの割合で示す。それぞれの値は３回の実験 の平均±ＳＥＭである。
急速一過性増加に加えて誘導した（Ｆ　ｉ　ｇ、１０）。ウシ上皮小体細胞が細 胞外Ｃａ２４に反応するように、ひと上皮小体細胞におけるＭｇ”Ｈ導［Ｃａ” ］＋定常増加は、電圧非感受性チャンネルを経由したＣａ”＋の流入による結果 である（Ｆｉｇ、１０ａ）。このひと上皮小体細胞での［ｃａ”Ｌ定常増加にお けるＭｇ”の効果は、腺腫様および過形成組織の両方で見られた。
ネオマイシンＢおよびスペルミンで、腺腫様組織から調製したひと上皮小体細胞 における［Ｃａ”］＋の効果を試験した。ネオマイシンＢにおける代表的な結果 はＦ　ｉ　ｇ、　１９に示す。ネオマイシンＢは、ひと上皮小体細胞で［Ｃａ” ］＋の過渡現象だけでなく、加えて定常増加を生じさせた（Ｆｉｇ、１９ａ）。
したがって、ひと細胞では、細胞外Ｃａ”、Ｍ　ｇ　２″ｌまたはネオマイシン Ｂにより誘導される［ｃａ”Ｌの変化の様子は非常に類似である。
ネオマイシンＢにより誘導される細胞質ゾルＣａ”過渡現象は、Ｌ　ａ　”（１ ｊＭ）の存在下および細胞外Ｃａ”″の非存在下で持続した。ネオマイシンＢは 、したがって、ひと上皮小体細胞における細胞内Ｃａ”流動を生じさせる。ネオ マイシンＢは細胞内Ｃａ”の流動を生じさせる濃度でひと上皮小体細胞のＰＴＨ 分泌を阻害した（Ｆｉｇ、１３）。しかしながら、ひとおよびウシ上皮小体細胞 のネオマイシンＢに対する反応においである違いが存在した。細胞内Ｃａ”流動 に対するネオマイシンＢのＥＣ，、は、ウシ上皮小体細胞では４０ＩＩＭおよび ひとのでは２０１Ｍであり（Ｆｉｇ、１３および１５参照）、一方スペルミンの 有効性はひとおよびウシ上皮小体細胞で類似であった（ＥＣ，。＝１５（１＋Ｍ ）。したがって、ウシ細胞では分子の活性化試験のふるい分は研究に使用できる が、ひと上皮小体を用いた追跡研究を行うことが重要である。
Ｃ−細胞における多価カチオン分子の効果を評価するために、ラットを髄の甲状 腺腫瘍（γＭＴＣ６−２３細胞）由来の腫瘍性細胞を使用した。スペルミン（Ｉ ＱｍＭ）およびネオマイノンＢ（５＋＋Ｍ）の両方とも、これらの細胞で基底［ Ｃａ”］　＋に効果はなかった。両方の分子のいずれも、細胞外Ｃａ”“の連続 添加における反応に効果はなかった。ネオマイノンＢの効果を欠いたことを報告 する代表的な結果をＦｉｇ、２１に示す。ネオマイシンＢ　（１ｍＭ）またはス ペルミン（１または５　ｍＭ）は、破骨細胞で［Ｃａ”］、のいかなる増加の誘 導に失敗した（Ｆｉｇ、２３）。記録が示すように、細胞外Ｃａ２＋の連続した 濃度の増加にある効果があるように見えるが、これは−貫した発見ではない。他 の２番目の細胞で、スペルミン（５μＭ）は再び基底［Ｃａ”］＋に影響がな（ 、細胞外Ｃａ”誘導［Ｃａ”］］増加の僅かな阻害（約１５％）を生じさせた。
３番目の細胞で、ネオマイノンＢは基底［Ｃａ２′″］１に影響がなく、細胞外 Ｃａ　”誘導［Ｃａ”］］増加に影響はなかった。これらの研究から発展した相 対的な状況は、スペルミンおよびネオマイシンＢが、破骨細胞の細胞質ゾルＣａ ２′″のレベルの基底または刺激レベルにおいて効果がないことである。
Ｃ−細胞または破骨細胞に対する多価カチオンのＣａ２“−感受性機構の影響の 欠損は、上皮小体細胞Ｃａ”受容体に特異的に働く、あるいは［Ｃａ”］１に対 する上皮小体の正常な反応の１個またはそれ以上の機能を変える新規先駆物質の 発見または設計の能力を証明する。
種々の他の分子のスクリーニングは下記に詳述し、結果を表１に要約する。
実施例２ 直鎖ポリアミン（スペルミン、スペルミジン、ＴＥＴＡ、ＴＥＰＡおよびＰＥＨ Ａ）および２つのそれらの誘導体（ＮＰＳ３８１およびＮＰＳ３８２）を実施例 １と同様にスクリーニングする。これらの分子はすべてウシ上皮小体細胞中の細 胞間Ｃａ２＋を可動化させることが判明した。それらの効力のオーダーは以下の 通りであり、そのネット正電荷を括弧内に示す。
ＮＰＳ　３８２　（＋８）　５Ｏ ＮＰＳ　３８１（＋１０）　１００ スペルミン　（＋４）　１５０ ＰＥＨＡ　（＋６）　５００ スペルミジン　（＋３）　２０００ ＴＥＰＡ　（＋５）　２５００ ＴＥＴＡ　（＋４）　８０００ ブトレソンン（＋２）およびカダベリン（＋２）は２ｍＭで不活性である。
別の直鎖ポリアミン、ＤＡＤＤは他のポリアミンとやや異なる挙動を示し、実施 例７に記載する。
実施例３ ２つの環式ポリアミン、ヘキササイクレンおよびＮＰＳ３８３を実施例１と同様 にスクリーニングする。ヘキササイクレン（＋６、ＥＣ，。＝２０μＭ）はＮＰ Ｓ３８３（＋８、ＥＣ５゜＝１５０μＭ）よりも７倍より有効である。この正反 対の結果は、Ｃａ、Ｆ＋レセプター活性の構造的特徴としてのネット正電荷のみ に基づく化につき得られたＥＣ５ｏ（効力のランクオーダー）は以下のとおりで ある。
ゲンタマイシン　（＋５）　１５０ ベカナマイシン　（＋５）　２００ ストレプトマイシン　（＋３）　６００カナマイシン（＋４．５）およびリンコ マイシン（＋１）は濃度５００μＭで有効ではなかった。アミノグリコシド系内 では、ネット正電荷と効力の間で相関関係がある。しかし、ネオマイシンは正電 荷が等しいかまたはより大きな種々のポリアミン（ＮＰＳ３８１、ＮＰＳ３８２ 、ＮＰＳ３８３、ＰＥＨＡ）よりも著しくより有効である。
実施例５ ペプチドおよびポリアミノ酸のスクリーニングプロタミンおよびペプチド長さを 変化させたりシンまたはアルギニンのポリマーを、実施例１と同様にスクリーニ ングして、それらの細胞間Ｃａ’十可動化能力を調べた。細胞間Ｃａ”＋の可動 化につき得られたＥＣ５ｏ（効力のランクオーダー）は以下のとおりである。
ｐｏｌｙＡｒｇ　（１００）　４ ｐｏｌｙＡｒｇ　（４０）　１５ ｐｏｌｙＬＹｓ　（２７）　３０ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　（４，８）　７５ｐｏｌｙＡｒｇＴｙｒ（２２）　２００ ｐｏｌｙＬｙｓ　（１４）　１０００ ｐｏｌｙＬｙｓ　（３，８）　３０００これらポリマーのネット正電荷はＭ冒の 増加につれて増加した。すなわち、ポリアミノ酸のこの系列のうち、アミノグリ コシドについては、ネット正電荷と効力の間に直接的な相関関係がある。プロタ ミンはネット正電荷＋２１を有する実質的にＰｏｌｙＡｒｇである。
毒液およびクモから得られたアリルアルキルアミン毒物の部類から選択された分 子を実施例１のようにスクリーニングする。
フィルアントトキシン−４３３（＋３）は濃度５００μＭで有効ではない。これ は、以下に記載のアルギオトキシンと類似の構造である。
アルギオトキノン−６３６（４００μＭ）は［Ｃａ”＋］ｉの増加を惹起しない が、細胞間Ｃａ”十のその後の添加に対するサイトツルＣａ２＋応答には有効で ある。これは、Ｃａ２＋レセプターを活性化する分子すべてに共通の特徴でり、 種々の細胞間２価カチオンについて見られる。これに関し、実施例７で詳細に考 察する。
アルギオトキシン〜６３６に対し、アルギオトキシンー６５９は［Ｃａ”＋］ｉ の増加を惹起し、ＥＣ５ａ３００μＭを示す。アルギオトキシンー６５９はジヒ ドロキシフェニル基よりもむしろヒドロキシル化インドールを有する点で、アル ギオトキシンー６３６と相異する。これは、これは、２つのこれら分子の唯一の 構造上の相異である。すなわち、効力の相異は芳香族基の特性において存在し、 正電荷を担持するポリアミン鎖においてではない。
Ｃａ２＋通路遮断剤、すなわち細胞外Ｃａ２＋の電圧感受性Ｃａ”十通路を介す る流入を遮断する、これらの分子を実施例１のようにスクリーニングする。３つ の構造的分類のＣａ２＋通路遮断剤が存在する（１）ジヒドロピリジン（２）フ ェニルアルキルアミン（３）ペンゾチアジピン。
テストしたジヒドロピリジンにフェジピン、ニトレンジピン、ＢＡＹ　Ｋ８６４ ４および（−）２０２−７９１および（＋）２０２−７９１）は、１μＭでテス トした場合に細胞外Ｃａ”十によって誘発される［Ｃａ”＋］ｉの増加または基 本的な［Ｃａ”＋］ｉに対する効果を、全く示さない。従来の研究が示すように 、上皮小体細胞は電圧感受性Ｃａ”十通路を欠いているが、Ｃａ”＋レセプター によって規制される電圧非感受性Ｃａ”十通路を有している。
調べたフェニルアルキルアミンは、ベラパミル、Ｄ−６００（ベラパミルのメト キシ誘導体）、ＴＭＢ−８、およびＴＭＢ−８の同族体、ＮＦＳ３８４である。
最初の３つの分子を濃度１００μＭでテストする。フェニルアルキルアミン調べ た他の分子とは異なる挙動を示す。これらは、低能度の細胞外Ｃａ”＋（０，５ ■Ｍ）含有緩衝剤中に浸した細胞に添加しても［Ｃａ２＋］ｉの変化を全く示さ ない。しかし、ベラパミル、Ｄ−６００およびＴＭＢ−３は、細胞外２価カチオ ンによって惹起された細胞間Ｃａ２＋の可動化を可能にさせ、またこれらは付加 的に細胞外Ｃａ’十の流入を遮断する。中間的なレベルの細胞外Ｃａ”＋（１〜 １．５ｍＭ）では、これら分子は誘発はわずかであるが、細胞間Ｃａ”十の可動 化から生じる［Ｃａ”＋］ｉの増加は強力である。
フェニルアルキルアミンはネオマイシンのような有機ポリカチオンとは異なった 作用を示す。データの示唆するところによれば、ベラパミル、Ｄ−６００および ＴＭＢ−８はＣａ”＋レセプターにおいて部分的なアゴニストであり、これは、 調べた他の部分的が完全なアゴニストであることと対照的である。
部分的ＮＰＳ３８４（濃度３００　μＭ）は［Ｃａ２＋］１（７）増加を誘発シ ナイカ、細胞外Ｃａ”十の流入を遮断する。高濃度でのテストは細胞間Ｃａ”十 の可動化を引き起こす当該分子の能力を示す。
流入を遮断するこれら分子の能力は興味深いが、意外ではなく、一方、細胞間Ｃ ａ２＋可動化から生じる重要な［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を誘発することが 、これら分子の能力である。上皮小体細胞における［Ｃａ２＋］ｉの測定による 相当な数の実験の示すように、一時的な［Ｃａ２＋］ｉの増加は、はぼ不変的に 細胞間Ｃａ”＋の可動化に起因し、そのためＣａｚ＋レセプターの活性化を示す 。
調べたペンゾチアジピン、ンルチアゼムは全ての点でベラパミルに類似し、また Ｄ−６００もまた１００μＭで有効である。
注意すべきは、フェニルアルキルアミンを除き、前記でテストした活性分子はす べて［Ｃａ”＋］ｉの増加を誘発し、これは、最大有効濃度の細胞外Ｃａ”十に より誘発されるものと同様に、最大である。これは、かかる分子が細胞外２価カ チオンと同様な効力を有することを示す。またこれは、部分的なアゴニストとし てのみ作用するようであるフェニルアルキルアミンの活性と対照的である。
フェニルアルキルアミンのうち、興味深い構造−活性関係を示すものがある。
ＴＭＢ−８およびＮＰＳ３８４のような分子の異なる効力は重要である。ＴＭＢ −８は［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を１００μＭで可能にし、一方ＮＦＳ３８ ４は３００μＭでもさえもかかる増加させないが、これら分子は同じネット正電 荷を担持する。以下に、ネット正電荷とは無関係なある種の他の構造的特徴がよ り大きな効力をＴＭＢ−８に付与することを説明する。
スペルミンおよびネオマイシンを、外科手術により取り出した上皮小体から得え 実施例１のように調製したヒト上皮小体細胞における［Ｃａ２＋］ｉの効果につ いて、テストする。ヒト上皮小体細胞において、スペルミンは、濃度３００μＭ でテストすると［Ｃａ２＋］１のわずかな増加のみを引き起こすことが判明した 。
他方、ネオマイシンは、濃度２０μＭでテストするとヒト上皮小体細胞において ［Ｃａ２＋］ｉの大きな増加を誘発する。ネオマイシンにより惹起された応答の 最大は、最大有効濃度の細胞外Ｃａ２＋により誘発されるものと同様である。
オー／ラスは、ヒト上皮小体細胞からのｍＲＮＡを注入すると、Ｃａ’＋レセプ ターを発現させ、また種々の細胞外無機２または３価カチオンに応答する細胞間 Ｃａ２＋を可動化させる。このスクリーニングを用いると、Ｃａ”＋レセプター に対する直接的な作用をテストすることができる。Ｃａ！＋レセプターを発現さ せるオーシテスは、また以下のようにスクリーニングすると、無傷の上皮小体細 胞についての数種の分子活性に応答する。ヘキササイクレンは濃度１３５μＭで 細胞間Ｃａ”十の可動化を引き起こす。ネオマイシン（１００μＭ）およびＮＦ Ｓ３８２（５ｍＭ）も有効である。これは、かなり強制的な形跡であり、かかる 分子がＣａ”＋レセプターまたはその機能と緊密に関係する数種の他のタンパク に対し作用することを示す。
たとえば、本発明者らは４５Ｃａｔ＋可動化の測定によってオーシテスのＣａ” ＋レセプターの発現を検知することができる。これらの実験において、オーシテ スは、ウシ上皮小体ｌｌＲＮＡまたは水を注入し、７２時間後、血清または１０ ｍＭネオマイシンへさらす。刺激前に、オーンテスに４５Ｃａ！＋を注入する。
２０分間の血清による刺激は、細胞間［Ｃａ”＋］ｉ放出をもたらし、これは、 緩衝剤による疑似抗原投与に比し４５％の増加を示す。２０分間のネオマイシン ｌＱｍＭの抗原投与は、［Ｃａ”＋］ｉ放出の７６％の増加をもたらす。当該分 析はＣａ”＋レセプターのクローニングの使用に十分に感受性を示し、Ｃａ”生 活性化Ｃ１電流の電気生理学的測定よりも非常に大きな利点を有する。
別の実験では、ヒト破骨細細胞腫組織を、骨生死鑑定組織から得た。オーシテス にこの細胞から単離したｍＲＮＡを注入し、Ｃａ２＋３　Ｑ＋ｓＭを抗原投与す る。対照は応答しない一方、破骨細細胞腫組織ｍＲＮＡを注入した１２のオーシ テスのうち８は明白に応答する（図３４）。これらの実験によれば、破骨細胞の 細胞外Ｃａｚ＋に対するＣａ！十応答は、事実遺伝学的にコード付けされる。ま たこの結果によれば、破骨細胞Ｃａ２＋レセプターはキセノブス・オーシテスに おける発現によってクローニングすることができる。
実施例１０ ラット破骨細胞に対する分子スクリーニング一方、細胞外Ｃａ”十に対する上皮 小体細胞および破骨細胞の種々の感受性の示唆するとことによれば、それらのＣ ａ”＋レセプターは異なっている。上皮小体細胞は０５〜３ｍＭの間の濃度の細 胞外Ｃａ”十に応答するが、破骨細胞外は細胞外Ｃａ２＋のレベルが５ｍＭを越 えたときにのみ応答する。このかなり高いＣａ”十濃度は、それにも拘わらす破 骨細胞に対し生理学的である。なぜなら、それらが破骨細胞に吸収されるからで あり、局部的な細胞外Ｃａｚ＋濃度は３０ｍＭもの高レベルに達しつる。
破骨細胞を用いる分子スクリーニングは以下のようになされる。破骨細胞を新生 児ラットの長い骨から得る。［Ｃａ”＋］ｉを単一の細胞においてフルオロメト リック・インジケーター・インド−１を用い測定する。スペルミン、スペルミジ ン、ネオマイシンおよびベラパミルをテストしたが、これらは、破骨細胞におい て大きな［Ｃａ”＋］ｉ増加を引き起こさない（わずか応答は検知される）。
濃度１ｍＭでは、スペルミジンはわずかな［Ｃａ”＋］ｉ増加を引き起こす（細 胞外Ｃａ”十の最大濃度で惹起される約１０％の増加）。ネオマイシン（１０ｍ Ｍ）またはスペルミン（１０または２０ｍＭ）はラット破骨細胞において［Ｃａ ”＋］ｉ増加を引き起こさない。ネオマイシン（１０ｍＭ）は、２５＋ｍＭの細 胞外Ｃａ”十のその後の添加により惹起された［Ｃａ２＋］ｉ濃度の増加を遮断 しない。一方、スペルミン（２〇−Ｍ）での予備処理は細胞外Ｃａ”十に対する 応答を弱めた。ベラパミル（１００μＭ）は検知可能な［Ｃａ２＋］ｉ増加を引 き起こさないが、細胞外Ｃａ”十に対する応答を遮断する。
破骨細胞と上皮小体細胞の間の比較は、後者に対するかかる分子の活性が破骨細 胞において比較的有効ではないことが示される。これは、他のＣａ”十感受細胞 上に存在するかかるレセプタータイプに影響を与えることなく特異的なＣａ”＋ レセプターを標的とする薬剤を容易に開発できることを証明する。同様に、２ま たはそれ以上のかかるＣａｚ＋レセプターにおいて活性な薬剤も同様に開発する こと以下の実験は、まさに分子リガンドのレセプター・サブタイプが存在するよ うに、薬剤によって区別的に影響を受けうるＣａ”＋レセプターのサブタイプが 存在することを証明する。上皮小体細胞Ｃａ２＋レセプターは細胞外Ｃａ２＋約 １．　５１１μＭのレベルで感受性を示す一方、破骨細胞上のＣａ”＋レセプタ ーは約ＩＱｍＭのレベルに応答する（図２２）。上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプタ ーを活性化するネオマイシンまたはスペルミンは、Ｃ細胞または破骨細胞上のＣ ａ”＋レセプターに影響を与えない（図２１および２３）。これらのデータは、 Ｃａ’＋レセプターの薬学的に区別可能なサブタイプ存在についてのはじめての 証拠を構成し、またこれらのデータは特異的なタイプのＣａ”＋レセプターに対 し選択的に作用する薬剤の設計および開発に使用することができる。事実、リー ド分子のテストはかかる細胞特異的効果を照明する。たとえば、ＮＰＳ４４９は 、破骨細胞において［Ｃａ”＋］ｉの増加を惹起するが、破骨細胞において［Ｃ ａ”＋］ｉに対する効果はない。逆に、ＮＰＳ４４７は、上皮小体細胞Ｃａ２＋ レセプターを活性化するが、１０倍もの高濃度でのみ破骨細胞Ｃａ”＋レセプタ ーを活性化するのに有効である。最後に、アガトキシン４８９は、Ｃ細胞Ｃａ２ ＋レセプターの活性化には非常に有効とはいえないが（ＥＣｓｏ＝１５０μＭ） 、上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプターの活性化剤として非常に有効である（Ｅ　Ｃ ，。＝３ｕＭ）。現在開発中のリード分子は、イン・ビボにおいてＣａ２＋感受 性細胞の特異的なタイプの活性に選択的に影響を与える。
特昇性が劣る薬剤は、必然的に治療的には望ましくない。すなわち、破骨細胞活 性の抑制およびカルシトニン分泌のの刺激は、骨再吸収の抑制のための２つの異 なる方法である。これら両細胞のＣａ”＋レセプターを標的とする薬剤は、オス テオポローシスに非常に有効である。ＰＴＨはまた骨代謝の規制を包含するため 、上皮小体細胞Ｃａｚ＋レセプターに作用する薬剤は、またオステオポローシス の治療および／または予防に有用である。
数種のテスト分子の結果を以下に示す。表６では、カルシウム様物質分子の比較 テストを示す。ウシ上皮小体細胞およびＣ細胞（ｒＭＴ６−２３細胞）にフラー ２を充填し、ラット破π細胞にはインド−１を充填したもので、表示した細胞間 Ｃａ２＋の可動化のための分子の効力は、累積濃度一応答曲線の作成により決定 する。
化合物　上皮小体　破骨細胞　Ｃ細胞 ＮＦ３５６ｇ（ＬＥ）　３０　−　− ＮＰＳ　４６７（ＥＥ）　２　＞１００　−ＮＰＳ　４６７（ＬＥ）　＞３０　 −　−ＮＰＳ　０１７　６　不活性　１５Ｏ ＮＰＳ４４７　９　１５０　− ＮＰＳ　４５６＊１５　２００　＞１００ＮＰＳ　０１５　２２　不活性 ＮＰＳ　１０９　４０　＞３００　５ ＮＰＳ　４４９　不活性　１５〇　− ＮＰＳ　４６８＊３０　２５０　− スペルミン　１５０　不活性　不活性 ネオマイシン　４０　不活性　不活性 性）＊ニラセミ混合物 不活性：濃度１〜５ｍＭにて細胞質ゾルＣａ’十の増加を全（引き起こさないも のと定義。
ＥＥ：早期の溶出。
ＬＥ：遅れた溶出。
ポリアミンおよびアリルアルキルアミンを用いる構造活性の研究は、ＮＦＳ４５ ６に構造的類似の分子のテストにつながる。ＮＰＳ４５６は上皮小体細胞Ｃａ” ＋レセプターの有効なアクチベータである。この分子は、ただ１つののみの正電 荷を有するが多数のポリへ一ノック分子よりもより有効であるので、特徴的であ る。短時間（２分間）の、ＰＭＡによる予備処理はＮＰＳ４５６の濃度応答曲線 を右手に移行させる。これは、ＮＰＳ４５６が細胞外Ｃａ”十により使用される のと同じメカニズムを介し作用することを示す。ＮＰＳ４５６は、上皮小体細胞 Ｃａ”＋レセプター発現するキセノプス・オーンテスにおける細胞間Ｃａ２＋の 可動化を誘発し、これは、当該Ｃａ’＋レセプターに対する直接的な作用を証明 する（図３３）。加えてＮＰＳ４５６キラル炭素を含むため、２つの異性体形が 存在する。
両異性体を合成し、活性を調べた。Ｒ−異性体、ＮＰＳ４４７は、Ｓ−異性体、 ＮＰＳ４４８よりも１２倍より有効である（図２８）。これは、Ｃａｚ＋レセプ ターが有機分子を立体特異的な方法で認識できる第１の証明である。
ＮＰＳ４４７は、構造的に単純な分子であるとともに上皮小体細胞Ｃａ”＋レセ プターに対し選択的で有効な作用を示すため、このリード分子に関する構造活性 の研究は単純である。これらの研究の目的は、そこから最終の開発候補を選択可 能な種々の特性を有する関連分子の配列を形成することである。この努力はすで に活性および効力に貢献するＮＰＳ４４７の構造領域のいくつかを開示する。た とえば、新規な化合物ＮＰＳ４５９は小型（分子量＜２４０）であるがほぼペア レント分子と同等な効力を有するＮＰＳ４４７の類似体である。一方、幾つかの 他の類似体は比較的不活性である。この類似体プロジェクトから最も興味ある分 子はイン・ビボ中に入れてＰＴＨ分泌および血清Ｃａ２＋レベルに対する効果を テストする（実施例１５．］、６．１７．１８．２３参照）。
新規化合物ＮＰＳ４６７はＮＰＳ４４７よりもやや小型の分子であるが、前者は 、上皮小体細胞における細胞間Ｃａ”十の可動化を引き起こす点で、後者よりも 約３倍より有効である。ＮＰＳ４５６と同様に、ＮＰＳ４６７はラセミ混合物で ある。ＮＰＳ４６７のその鏡像体への分割がラセミ混合物よりもより大きな効力 の異性体を提供することは、予期されないことである（実施例１６参照）。ＮＰ Ｓ５５１は、上皮小体細胞において細胞間Ｃａ”十の可動化を引き起こす点でＮ ＦＳ４６７と同様な効力を示す、別の新規化合物である。ＮＰＳ５５１はラセミ 混合物て、ＮＰＳ５５１の分割がその鏡像体への分割がラセミ混合物よりもより 有効であることをもたらすことは、予期されないことである。さらに、ＮＰＳ４ ４７．４６７、ＮＰＳ５５１．５６８に関連する分子についての構造活性の研究 は、それらのラセミ形の分子よりもより有効である純粋な異性体を製造するもの と、期待される。
ＮＰＳ４５６を用い得られた結果（図３３）が示すように、それは濃度１００μ ＭでＣ１−１ｉ流の振幅増加を誘発する。ＮＰＳ４５６は上皮小体細胞Ｃａ”＋ レセプターを発現するキセノブス・オーシテスに対する最も有効な分子アクチベ ータである。ネオマイシンおよびＮＦＳ４５６を用いるこの発現システムで得た 結果は、これらの分子がＣａ２＋レセプターに対し直接作用することを、証明す る。
破骨細胞に対する細胞外Ｃａ’十の作用メカニズムを解明すべく用いた方策は上 皮小体細胞の有効性を証明するのと同じである。第１実験はフルオリメトリック ・インジケータ・インド−１を充填した単一のラット破骨細胞において［Ｃａ” ＋］ｉに対するＬａ”＋の作用を調べる。前記のごとく、Ｌａ’＋のように３価 カチオンは一時的でＣａ２＋流入を遮断する。低マイクロモル濃度のＬａａ＋は 部分的に［Ｃａ２＋］ｉについての細胞外Ｃａ２＋誘発増加を抑制する（図２９ ）。［Ｃａ”＋］ｉについてのＬａｓ＋抗増加の証明は、細胞間Ｃａ２＋の可動 化の証拠を提供する。上皮小体細胞において得られたものと類似の実験の結果は 、同様なメカニズムを細胞外Ｃａ２＋により用い、両細胞タイプにおいて［Ｃａ ２＋］ｉを規制することを、示唆する。
別の系列の実験は、細胞外Ｃａ”＋の不存在下に永続的な（図３０Ｂ）細胞外Ｍ ｎ２＋が［Ｃａ２＋］ｉについての一時的な増加（図３０（ａ）参照）を誘発す ることを、示す。これらの結果は、細胞間Ｃａｚ＋の可動化を示唆するものと同 様である。Ｍｎ２＋は、ある種の細胞内に侵入できるが、破骨細胞におけるかか る挙動とは似ていない。なぜなら、Ｍｎ２＋はインド−１蛍光を停止させるから である。すなわち、Ｍｎ２＋が細胞間に侵入すると、減少、すなわち蛍光の増加 は観察されない。
種々の２価または３価のカチオンの使用により得られた結果は、全て、細胞間Ｃ ａ２＋の可動化および細胞外Ｃａ２＋の電圧感受性通路を介する流入とつながる 破骨細胞の表面上のＣａｚ＋レセプターの存在と一致する。結果は、Ｃａ”＋レ セプタータンパクをコード付けするヒト破骨細胞における遺伝物質の証拠を示す （以下参照）。細胞間Ｃａ２＋の可動化を起因とする［Ｃａ”＋］ｉ一時的な増 加は、イン・ビトロにおいて破骨細胞の骨吸収を抑制するのに充分である。すな わち、上皮小体細胞を用いる場合のように、Ｃａ”＋レセプターの活性化は破骨 細胞の活性を抑制する可変的な手段のようである。
ＮＰＳ４４９は現時点このレセプターのカルシウム様薬剤のリード分子である。
これは、小さな分子（’Ｍｙ＜４２５）で、細胞間Ｃａ２＋をラット破骨細胞に おいてＥＣ５゜２００ｇＭで可動化させる（図３１Ａおよび３１Ｂ）。ＮＰＳ４ ４９の効力は比較的小さく、単純な構造でただ１つの正電荷を有し、所望の薬理 学および動的薬理学特性を有するようである。
ＮＰＳ４４９をイン・ビトロにおいて骨吸収を抑止するその能力について実験す る。これは、捜査電子顕微鏡を用い、ウシ皮質骨の剥片のピット形成についての 生物形態分析により行う。ラット破骨細胞を２４時間、骨剥片中にて、種々の濃 度のＮＰＳ４４９の存在または不存在下にインキュベートする。ＮＦＳ４４９１ Ｃ，。１０μＭで骨吸収の濃度依存抑制を引き起こす。この新規なサイトにおい て作用する分子は破骨細胞の骨吸収を抑制できるというはじめての証明が、予期 せぬ結果として得る。ＮＰＳ４４９のより有効な類似体を合成化学を用いて得、 本明細書に記載の方法でテスト、分析する。
Ｃ細胞Ｃａ”＋レセプターの活性化は、破骨細胞に作用して骨吸収を抑制するカ ルシトニンの分泌を刺激する。選択的にＣ細胞に影響を与えるカルシウム様薬剤 オステオポロシスの治療に有用である。
細胞間Ｃａ２＋の可動化をＣａ２＋レセプター活性の機能指数として用いる。Ｃ 細胞のスクリーニング作業は、Ｃ細胞表現型を発現する培養セルラインの利用に より促進することができる（たとえば、ラット延髄乾酪癌細胞、ｒＭＴＣ６−２ ３細胞）。３つのアルキルアミン分子は初期の実験で選択される。天然のものは ２つ（アガトキンン４８９およびアガトキシン５０５）あり、他のもの（ＮＰＳ Ｏ１９）は合成類似体である。アガトキシン５０５は、ＩＣ，。＝３μＭで［Ｃ ａ”＋］ｉについてのＣａ”＋誘発増加を抑制することが判明した。抑制作用は 、かかる細胞中に存在するＬタイプ電圧感受性Ｃａ２＋通路の遮断に起因する。
これに対し、アガトキシン４８９は、ｒＭＴＣ細胞における細胞間Ｃａ２＋を可 動化させることが、判明した（ＥＣｓｏ”　１５０ｇＭ）。これは、Ｃ細胞Ｃａ ２＋レセプターを活性化することが判明した、初めて開示される有機分子である 。合成類似体、ＮＰＳＯ１９は、ｙより有効で、細胞間Ｃａ２＋を可動化させる （ＥＣｓｏ＝　５μＭＸ図３２）。ＮＦＳ０１９とアガトキシン４８９の間の構 造的な相異がヒドロキシ基を有すか否かであるのみであることは、重要である。
これは、Ｃａ”＋レセプターの非常に有効で選択的なアクチベータを開発できる ことを支持している。
ＮＰＳＯ１９は小さな分子（Ｍｙ＜　５００　）であり、これは、Ｃ細胞Ｃａ” ＋レセプターのカルシウム様物質の開発用のリード分子であり、イン・ビトロで カルシトニンを刺激するその能力をテストすることができる。その後、イン・ビ ポのテストはカルシオニン分泌を刺激し骨吸収を抑制するこの分子の能力を決定 する。
これらイン・ビボの研究はラットで行う。これらの研究で得られた結果は、予期 せぬことで、これは、新規なレセプターに作用する小さな有機分子がカルシオニ ン分泌を刺激し骨吸収を抑制することを示すはじめての証拠を提供する。
実施例１４ 上皮小体細胞に対するＮＰＳＯ２１のカルシウム拮抗活性カルシウム拮抗である と思われる化合物について、細胞外Ｃａ”十感受性細胞に対する細胞外Ｃａ”十 の作用またはカルシウム拮抗化合物の作用を遮断せねばならない。カルシウム拮 抗化合物の具体例はＮＰＳＯ２１で、その構造を図１に示す。
フラー２を充填したウシ上皮小体細胞において、細胞外Ｃａｚ＋により惹起され るＮＰＳ０２１は［Ｃａ２＋］ｉの増加を遮断する。この応答遮断のためのＮＰ ＳＯ２１のＩＣ５゜は約２００μＭであって、濃度的５００μＭで、細胞外Ｃａ ”十により惹起された［Ｃａ２＋］ｉの増加は停止する。重要には、ＮＰＳＯ２ １は、低［Ｃａ”＋］（０，５ｍＭ、図３７）でテストすると、それ自体いずれ の変化も引き起こさない。
イン・ビトロにおいてウシ上皮小体細胞Ｃａ’＋レセプターを活性化することが 証明された化合物を、イン・ビボにおいて低カルシウム血症活性をテストした。
雄性スプラーグ・ドウーリイ・ラット（２００ｇ）を、対照としてテスト物質ま たは担体を与える前に、１週間、低カルシウムの餌を与え続けた。血液を、ＮＰ Ｓ４６７の腹控内投与ののち３時間後に尾静脈から採取した。全血液または血清 中のイオン化Ｃａ２＋を、チバーコーニング６３４アナライザーを用い、当該装 置に付属の説明書に従い、測定する。血清全カルシウム、アルブミンおよびホス フェートを常法で測定する。
ＮＰＳ４６７は、血清または全血液Ｃａ”十の用量依存減少をもたらす（図３８ ）。
この時点での血液Ｃａ”十の減少は、血液全カルシウムレベルの比例的な減少当 該平行関係にある。調べた用量のいずれにおいても、血清アルブミンまたはホス フェートレベルの変化は全くなかった。予備的な研究では、血中Ｃａ”十低下有 効用量でのＮＰＳ４６７は、ＰＴＨの循環レベルでの用量依存減少をもたらす（ 図３９）。
ＮＰＳ４６７の低カルシウム血症効果は、３時間以内に最大となり、２４時間後 に対照レベルに戻る（図４０）。
ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体、実施例１６）もまた、正常、カルシウム反復餌で維 持したラットにおいて血清イオン化Ｃａ”十の低下に有効である。ＮＰＳ４６７ （ＥＥ異性体、１０富ｐ／ｋｇ腹控内）の単一用量は、イオン化Ｃａ”十の血清 レベルの急速な減少をもたらす。かかるレベルは、１時間で最大となり（対照レ ベルから２２％の減少）、６時間までこのレベル付近に抑制される。
実施例１６ 立体特異的方法によるＮＰＳ４６７低下血清イオン化カルシウムＮＰＳ４６７は ラセミ混合物である。その２つの鏡像体へのＮＰＳ４６７の分割は、キラルカラ ムでの分割により行った。ＥＥ異性体（早期溶出、実施例２１）は、ＬＥ異性体 （遅れた溶出）よりも約１００倍も有効であり、上皮小体細胞の［Ｃａ’＋］ｉ 増加を誘発する当該鏡像体の能力によって評価されるように（図４１）、イン・ ビトロにおいてウシ上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプターを活性化する。同様に、新 規化合物ＮＰＳ５６８のその鏡像体への類似の分割は、ＩＥ異性体よりも約４０ 倍有効であり、細胞間Ｃａ２＋の可動化をウシ上皮小体細胞においてもたらす（ 前記表６参照）。
ＮＰＳ４６７異性体を実施例１５のように血清Ｃａ２＋に対する効果につき試験 した。イン・ビボにおける血清Ｃａ２＋の低下に関しＬＥ異性体よりも有効であ ることが証明されたＥＥ異性体またはＮＰＳ４６７はイン・ビトロの結果と一致 する（図４２、各化合物は濃度５　＊ｑ／体重１ｋｇでテストする）。
実施例１７ ２次上皮小体こう進疾のビボ・モデルにおけるＮＰＳ４６７低下血清イオン化カ ルシウム 広範に受け入れられ使用されている、慢性腎不全から生じた２次上皮小体こう進 疾の動物モデルは、５／６腎切除のラットである。かかる手術を施した動物（ま 、まず低カルシウム血症にさせて血清Ｃａ”十レベルを維持すると、上皮小体の 代償性の過形成および循環ＰＴＨのレベル向上が生じる。雄性スブラーグ・ドウ ーリイ・ラット（２５０ｇ）を５／６腎切除し、２週間回復させる。この時点で 、標準的なカルシウム血症である（血清ＰＴＨの上昇レベルによる）。ＮＦＳ４ ６７の投与は（ＥＥ異性体、１０■ｖ／ｋｇ腹控内）、２次上皮小体こう進疾の 動物モデルにおいて血清イオン化Ｃａ”十レベルの対照の８３％への、急速な（ ２時間以内）低下をもたらす。これは、以下のことを示唆する：この種の化合物 は２次上皮小体こう進疾および増殖性上皮小体を有する患者においてＰＴＨ分泌 を有効に抑制する。
実施例１８ 呼映制！吋匹拡ｌ［却（工」左蛇ユ七／錯ａせｙ哩８４６７フエイルス（Ｆ　ａ ｓｓ） 低カルシウム血症応答を引き起こすようにＮＰＳ４６７が作用する一次標的組織 を決定するため、ラットにおける上皮小体を外科的に取り出す。上皮小体全体を 切除した動物を低カルシウム血症にさせ、カルシウム餌に大きく依存させて、血 清Ｃａ”＋ホメホスタシス状態に維持する。上皮小体削除動物は、６時間の絶食 後、０．９２ｍＭレベルの血清イオン化Ｃａ”十を有し、これは０．７６１Ｍ１ 二徐々に低下する。ＮＦＳ４６７ＥＨの単一用量の投与（Ｉ　Ｑｗｇ／ｋｇｉ、 　ｐ、）はし）ずれの変化も、血清イオン化Ｃａ”十レベルにおし）て、６時間 の期間（こわｔこり与えな力Ａつた。これらの結果は、無傷の上皮小体がＮＰＳ ４６７ＥＥの低カルシウム血症効果に必要であることを証明する。データは付加 的にＮＰＳ４６７１１インビボ（こおいて上皮小体を標的にすることができるこ とを証明する。結果（よ以下の見解に一致する：ＮＰＳ４６７ＥＥはインビボに おいて上皮小体細胞Ｃａ２＋レセプター１こ対し作用してＰＨＰの分泌を抑制し 、これによりイオン化Ｃａ”十の血清レベルを低下させる。
実施例１９ ヒト上皮小体におけるにおけるＮＰＳ４６７増加細胞間カルシウム解離上皮小体 細胞を、−次上皮小体こう進疾を有する患者から外科手術で得た上皮小体アデノ ーマから調製する。細胞に、フラー２を充填し、［Ｃａ”＋］ｉを前記よう測定 した。ＮＰＳ４６７ＥＥおよびＮＰＳ５６８ＥＥの両者は［Ｃａ”＋］ｉの濃度 依存増加をもたらす。ＮＰＳ４６７ＥＥおよびＮＰＳ５６８ＥＥのＥＣ０は各々 ２０および３μＭである。これら両者の化合物は病理学的ヒト組織において［Ｃ ａ”＋］ｉを増加させることができ、−次上皮小体こう進疾の患者においてＰＴ ＨおよびＣａ”＋の血清レベルを減少させるようである。
解離ウソ上皮小体作用を用いて、レセプターレベルにおけるＮＰＳ４６７の作用 メカニズムをさらに調べた。Ｑ、５ｍＭ細胞外Ｃａ”十の存在下に、ＮＰＳ４６ ７ＥＥは急速で一次的な［Ｃａ”＋］ｉの増加をもたらす。この増加は１μＭの Ｌａ３十の存在下に維持され、ＰＭＡでの予備処理で部分的に抑制される（１０ ０ｎＭｘ２分）。さらに、ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体、３０ｇＭ）は上皮小体細 胞ｍＲＮＡを注入したキセノブス・オーンテスにおけるＣ１−導電率の急速な増 加を引き起こす。
すべてのこれらの結果はＣａ２＋レセプターに対するＮＰＳ４６７の作用と一致 する。しかし、ＮＰＳ４６７に対する細胞ゾルＣａ２＋の応答は、上皮小体細胞 がＣａ２＋非含有緩衝剤中に懸濁すれば停止する。これは、ＮＰＳ４６７がそれ 自体では細胞間Ｃａ２＋の可動化を引き起こせないことを示唆する。これは、部 分的なＣａ２＋結合部位の支配がＮＰＳ４６７が応答を惹起させるのに必要であ ることを示唆する。この仮説をテストするため、上皮小体細胞をＣａ”十非含有 緩衝剤に懸濁し、亜最大濃度のネオマイシンにさらす。ネオマイシンは以下の理 由により用いる。これは、はぼすべての点において、上皮小体細胞およびキセノ ブス・オーシテス（上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプターを発現）に対する細胞外Ｃ ａ２＋の効果に類似するからである。ネオマイシン１０μＭの添加はそれ自体で は、これらの条件下１：［ｃａ”＋］１（７）増加を引き起コサナイ。シカシ、 ＮＰＳ４６７ＥＥ（３０ｇＭ）のその後の添加は［Ｃａ”＋］ｉの一次的な増加 を惹起するが、これは、細胞外Ｃａ”十が存在しないため、細胞間Ｃａ”十の可 動化から生じなければならない。Ｃａ”十非含有緩衝剤に浸した細胞は３０ｇＭ ＮＰＳ４６７にさらすと、［Ｃａ’＋］ｉの増加はない。ＮＦＳ４６７の濃度は 細胞外Ｃａ”＋〇、５鵬Ｍが存在すれば［Ｃａ”＋］ｉの増加に最大限有効であ る。しかし、ネオマイシン１０μＭのその後の添加は一次的な［Ｃａ”＋］ｉの 増加を誘発する。恐らく、ネオマイシンは同じ部位に細胞外Ｃａ２＋として結合 し、そのため機能的に置換される。亜最大濃度（これ自体応答を引き起こさない ）を用い、部分的なＣａ”子結合部位の支配を達成し、ＮＰＳ４６７によるＣａ ’＋レセプターの活性化を可能にする。
ＮＰＳ４６７の作用メカニズムを付加的に定義する付加的な研究を行う。細胞を 一旦再度カルシウム非含有緩衝剤に懸濁して、いずれか観察された［Ｃａ”＋］ ｉの増加が細胞間Ｃａ２＋の可動化に起因することを保証する。これらの実験で は、しかし、ネオマイシンの最大有効濃度１００μＭを用いた。細胞外Ｃａ”十 の不存在下に、１００μＭのネオマイシンは急速で一次的な［Ｃａ”＋］ｉの増 加を誘発する。３０ｇＭＮＰＳ４６７ＥＥのその後の添加は［Ｃａ”＋］ｉの増 加を引き起こさない。逆の実験では、３０ｇＭＮＰＳ４６７ＥＥを１００μＭネ オマイシンの前に添加する。予想どおり、ＮＦＳ４６７ＥＥはいずれの［Ｃａ” ＋］ｉの増加を引き起こさない。しかし、それは、１００μＭネオマイシンのそ の後の添加により誘発された［Ｃａ２＋］ｉの増加に影響を与えない。ＮＰＳ４ ６７の最大有効濃度で得られたこれらの結果は、これら２つの化合物が同じ部位 において作用しないことを示唆する。むしろ、その結果は、２つの別々のＣａ２ ＋レセプター上の部位、すなわち細胞外Ｃａ２＋およびネオマイシンが結合する ものおよびＮＰＳ４６７および構造関連化合物（ＮＦＳ５６８など）を仮定すれ ば、充分に説明する。前者の部位に結合するリガンドはＣａ”＋レセプターの完 全な活性化をもたらすことができる一方、後者の部位に結合するりガントは細胞 外Ｃａ２＋結合性部位がある程度ではあるが限定されない程度に支配される場合 のみ生じるかモして／または機能的に適当なものとできる。細胞外Ｃａ”子結合 性部位に結合するリガンドは、予めふさいだＮＰＳ４６７の結合部位にさらすこ とができる。ＮＰＳ４６７結合部位は細胞外Ｃａ２＋結合性部位において結合す るリガンドに応答してレセプター活性化を増大させるアロステリック部位のよう である。
データは上皮小体細胞Ｃａ”＋レセプターが少な（とも２つの明確な部位におい て有機リガンドを有することを証明する。一方の部位は生理学的なリガンド、細 胞外Ｃａ”＋、およびある種の有機ポリカチオン、たとえばネオマイシンが結合 する。この部位の結合は完全なＣａ”＋レセプターの活性化、［Ｃａ’＋］ｉの 増加およびＰＴＨ分泌の抑制をもたらす。ＮＰＳ４６７は、予め認識していない Ｃａ”＋レセプター上の結合部位を規定する。この部位への結合は細胞外Ｃａ” 子結合性部位が部分的に支配される場合にのみ生じるかそして／またはＣａ”＋ レセプターの完全な活性化をもたらす。いずれかの部位において作用するリガン ドはインビボにおいて血清Ｃａ”十レベルを抑制するのに有効である。
２５０＋ａｌの丸底フラスコ中に、３゛−メトキシ・アセトフェノン１０．０ｇ （１００ミリモル）および３−フェニル−プロピルアミン１３．５ｇ（１００ミ リモル）を混合し、チタン（ｒＶ’）イソプロポキシド１２５ミリモル（３５， ５ｇ）で処理する。反応混合物を３０分間、室温にて窒素雰囲気下で撹はんする 。その後、エタノール１００匝１中ナトリウム・ンアノボロヒドリン６．３ｇ（ １００ミリモル）を２分間にわたり滴下する。反応を室温にて窒素下に、１６時 間撹はんする。その後、反応混合物をエチルエーテル１．５リツトルおよび水０ ．５リットルを含む２リツトルの分岐ろうとへ移す。相を平衡状態にさせ、エー テル相を取り出す。残りの水相をエーテル１リツトルづつ４回処理して完全に抽 出する。洗液を合し、無水炭酸カリウム上で乾燥し、透明で明るいこはく色の油 を得る。
この物質のＴＬＣ分析（シリカ上、クロロホルム−メタノール−イソプロピルア ミ＝　１００：５：１を使用）は、Ｒｆｏ、６５の生成物を示し、２つの出発物 質はＲｆＯ，９９（３−メトキシ・アセトフェノン）およびＲｆｏ、０（３−フ ェニルプロピルアミン）を示す。
反応混合物を、シリカ（４８Ｘ　４．　６ｃｍ）を介し、クロロホルム−メタノ ール−イソプロピルアミン（９９：１：０．１〜９０：１０：０．１）の傾斜溶 出を用いてクロマトグラフィにかけ、精製したＮＰＳ４６７（１３，６６ｇ）を 得る。この物質を０゜１％ジエチルアミン含有ヘキサン−イソプロパツール（９ ９：１）に溶解して、濃度５０１１９／１１１１の溶液を得る。キラル分解を、 この溶液４＋１（２００＋ｑ、分離達成へ最大）のクロマトグラフィにより、キ ラルセル（ＣｈｉｒａｌＣｅｌｌ）ＯＤ（２５Ｘ　２ｃｍ）を介し、ヘキサン中 ０．７％イソプロピルアミンおよび０．０７％ジエチルアミンを用い、１００１ １１１／分にて、２６０ｒ＋＋ｓの光学密度をモニターしながら達成する。
これらの条件下では（物質１００ｍｐの注入）、早期溶出異性体（ＮＰＳ４６７ ＥＥ）は−２６分でカラムから現れはじめ、遅れた溶出異性体（ＮＰＳ４６７Ｌ Ｅ）は−３４分で現れはじめる。ベースライン分解はこれらの条件で達成される 。各光学異性体（遊離塩基）を対応するヒドロクロライド塩へ、遊離塩基３ｇを エタノール１００＋１中へ溶解し１０モル当量のＨＣＩ含有水１００＋１で処理 して、変換させる。
この溶液の凍結乾燥により白色の固体を得る。
ＮＰＳ５６８を、実施例２１記載の方法で製造する。ただし、３−フェニルプロ ピルアミンに代えて、当量の３−（２−クロロフェニル）プロピルアミンを用い る。
３゛−メトキシ・アセトフェノン、３−（２−クロロフェニル）プロピルアミン およびチタン（ＴＶ）イソプロポキシドの混合物を５時間撹はんし、次いでＮａ ＣＮＢＨ３／ＥｔＯＨで処理すると、著しく高い収率をもたらすことが判明した （９８％）。
実施例２３ 経口投与の場合のＮＰＳ４６７低下血清イオン化カルシウムラット（雄、スブラ ーグ・トウリー、２５０〜３００ｇ）は、標準ラットカラ（ｃｈｏｖ）で、実験 前に一夜絶食させる。ＮＰＳ４６７（ＥＥ異性体）をトウモロコシ油に懸濁し、 栄養補給ニードルを介し、単一の経口用量として投与する。３時間ののち、血液 試料を尾静脈から採取し、イオン化Ｃａ”十レベルについて評価する。
図４４は、経口投与した場合のイオン化Ｃａ”十の血清レベルについての用量依 存減少を引き起こすＮＰＳ４６７ＥＥを示す。
他の具体例も以下の請求の範囲に含まれる。
Ｆ／Ｇ、た （０＾００１ テトラエチレンペンタミン（↑５　ＥＣ５０・２５００７Ｊｌｌトリエチレンテ トラミン（＋４　ＥＣ５Ｏ−８００Ｑ４Ｊ！ｌ　ペンタエチレンへキサミンｔ＋ ａ　ＥＣ５ｇ・５０１１１ｐ１４１アルジオトキシン６３６４４ アルジオトキシン６５９　＋４ ＦＳ３８４ ＦＩＧ、　／ｅ ＦＩＧ、／ｆ。
細胞質ゾルＣａ２＋（ｎＭ） 時間（分） 時間（分） 圧、４゜ 圧４ｂ Ｆ／Ｇ、　４ｃ 特表平６−５１０５３１　（８１） 細胞外カルシウム　（ｍＭ） ＲＧ、み ＰＴＨ（ｎｇ／ｍｇ　細胞蛋白賀） 細胞質ゾル　Ｃａ　（ｎＭ） 細胞外カルシウム（ｍｌ） 細胞質ゾルＣａ２＋ｆｎＭｌ　細胞質ゾルｃ戸（ｎｉｌＥ）つ　１７カ ＡＴＰ 細胞質ゾルＣａ　（ｎＭ） ＰＴ）−１分泌 （対照に対するパーセント） ３Ｈ−ＩＦ５　（対照に対する％） ３旧ＰＨ（ｌｏ３ｃｐｍ　／　１０６細胞）特表十６−５１０５３１　（３６） 細胞質ゾルＣａ２＋　（ｎＭ　） 細胞質ゾルＣａ”（ｎＭ） （ａ、） 細胞質ゾルＣａ”（ｎＭ） 細胞質ゾルＣａ”（ｎＭ） １００μＭ　ＮＰＳ　４５６ 、九　、１戸 ｂＰＧ　ｍＲＮＡ画分活性のまとめ ｍＲＮＡ　画分 Ｆ／Ｇ、　３５゜ んＧ　３６ａ Ｆ／Ｇ　３６ｃ Ｆ／（５ヌ冠 ＭＰＳＲ ＭＰＳｇ ＮＦＳ　＃ Ｆ／Ｇ　３６ｏ。
＃／’５　ｇ ＩＰＳＲ ＮＰＳｅ ＰＳｌｔ ロ ロ 仲 愉 う　ロ 全　８ 免ヨだ −八　ε 云　シ イオン化カルシウム　（ｍＭ） ４６７に対するＰＴＨ応答 ４６７投与量（ｍｇ／ｋｇ） Ｆ／Ｇ　３９ イオン化カルシウム　（ｍＭ） ＦＩＧ　４／ ＮＰＳ４６７（μＭ） ＮＦＳのＤＥ対しＥ異性体□イオン化カルシウムに対する効果ＦＩＧ　４２゜ ＦＩＧ　４４ フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１　Ｋ　３１／４０ 　９４５４−４Ｃ３１／７８５　９４５４−４Ｃ ３７１０２８３１４−４Ｃ Ｃ０７Ｃ２１１１０３９２８０−４Ｈ Ｃ０７Ｄ　２０９／１８　９２８４−４Ｃ２９５１００Ａ　８２１７−４Ｃ ４１３１０４２１１７６０２−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１５１０６　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５／１２ ＧＯＩＮ　３３１５６６　８３１０−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、 ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＧＡ （ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）ＦＩ 、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ 、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ 、　ＮＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ （７２）発明者　ヴアン・ウエイジネン、ブラッドフォード・シー アメリカ合衆国８４１０２ユタ州、ソルト・レイク・シティ、ナンバー５０７、 イースト・３００・サウス１０７０番 （７２）発明者　バランドリン、マニュエル・エフアメリカ合衆国８４１２１ユ タ州、ソルト・レイク・シティ、サウス・１５８５・イースト５７８７番

Claims (102)

    【特許請求の範囲】
  1. １．細胞内［Ｃａ２＋］１の上昇を惹き起こすことによって細胞外Ｃａ２＋の活 性を発揮させるか、細胞外Ｃａ２＋によって惹き起こされた［Ｃａ２＋］１の上 昇を阻止する分子であって、５μＭを越えないＥＣ５０を有するもの（ただし、 当該分子はプロタミンではない。）を含む、医薬組成物。
  2. ２．細胞内［Ｃａ２＋］１の上昇が３０秒以下の一過性のものである、請求項１ 記載の組成物。
  3. ３．［Ｃａ２＋］１の上昇が３０秒以内に生ずる、迅速なものである、請求項１ または２記載の組成物。
  4. ４．分子が３０秒以上にわたる［Ｃａ２＋］１の持続的上昇を惹き起こすもので ある、請求項１記載の組成物。
  5. ５．分子がさらにイノシトール−１，４，５−トリホスフェートまたはジアシル グリセロールの上昇も惹き起こすものである、請求項１記載の組成物。
  6. ６．イノシトール−１，４，５−トリホスフェートまたはジアシルグリセロール の上昇が６０秒以内に生ずるものである、請求項５記載の組成物。
  7. ７．一過性の上昇が細胞を蛋白質キナーゼＣ活性化剤で１０分間以下前処理する ことにより減じられる、請求項２記載の組成物。
  8. ８．蛋白質キナーゼＣ活性化剤がホルボールミリステートアセテート、メゼレイ ンおよび（−）−インドラクタムＶから選ばれたものである、請求項７記載の組 成物。
  9. ９．分子がドーパミンまたはイソプロテレノール刺激サイクリックＡＭＰ形成を 阻止するものである、請求項１記載の組成物。
  10. １０．［Ｃａ２＋］１の一過性の上昇が細胞の１０ｍＭフッ化ナトリウムによる １０分間にわたる前処理により低下する、請求項２記載の組成物。
  11. １１．細胞が上皮小体細胞であり、分子が当該細胞からの上皮小体ホルモン分泌 を阻止するものである、請求項１記載の組成物。
  12. １２．分子が上皮小体細胞、破骨細胞、傍糸球体腎細胞、近位腎小管細胞、ケラ チノサイト、濾胞付随性甲状腺細胞および胎盤栄養膜から選ばれた細胞からのｍ ＲＮＡを注射したアフリカツメガエル卵母細胞におけるＣ１−コンダクタンスの 上昇を惹き起こすものである、請求項１記載の組成物。
  13. １３．分子が分子内Ｃａ２＋を移動させて［Ｃａ２＋］１の上昇を惹き起こすも のである、請求項１記載の組成物。
  14. １４．細胞がＣ細胞または破骨細胞であり、分子がインビボの骨吸収を阻止する ものである、請求項１記載の組成物。
  15. １５．細胞がＣ細胞であり、分子がインビトロまたはインビボのカルシトニン分 泌を刺激するものである、請求項１記載の組成物。
  16. １６．分子がＣａ２＋受容体において５μＭを超えないＥＣ５０またはＩＣ５０ を有するカルシウム様またはカルシウム拮抗的なものである、請求項１記載の組 成物。
  17. １７．分子が上皮小体細胞、破骨細胞、傍糸球体腎細胞、近位腎小管細胞、ケラ チノサイト、濾胞付随性甲状腺細胞および胎盤栄養膜から選ばれた細胞の１つま たはそれ以上であるがすべてではないものにおいて５μＭを越えないＥＣ５０を 有するものである、請求項１記載の組成物。
  18. １８．分子が１μＭを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものである、請 求項１、１６または１７記載の組成物。
  19. １９．分子が１００ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するもので ある、請求項１、１６または１７記載の組成物。
  20. ２０．分子が１０ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものであ る、請求項１、１６または１７記載の組成物。
  21. ２１．分子が１ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものである 、請求項１、１６または１７記載の組成物。
  22. ２２．分子が生理学的ｐＨにおいて＋に負荷している、請求項１、１６または１ ７記載の組成物。
  23. ２３．分子が枝分れまたは環状ポリアミン、＋に負荷しているポリアミノ酸およ びアリールアルキルアミンから選択されたものである、請求項２２記載の組成物 。
  24. ２４．枝分れポリアミンが式： Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｆ−（ＮＲ１−（ＣＨ２）ｊ）ｋ−ＮＨ２（式中、ｋは１〜 １０の整数、各ｊは同一かまたは異なって２〜２０の整数、各Ｒ１は同一かまた は異なって水素または−（ＣＨ２）ｊ−ＮＨ２（ｊは前記と同意義。 ）、少なくとも１つのＲｉは水素ではない。）を有するものである、請求項２３ 記載の組成物。
  25. ２５．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｘは（独立して）Ｈ，ＣＨ３，ＣＨ３Ｏ，ＣＨ３ＣＨ２Ｏ，Ｂｒ，Ｃ ｌ，Ｆ，ＣＦ３，ＣＨＦ２，ＣＨ２Ｆ，ＣＦ３Ｏ，ＣＨ３Ｓ，ＯＨ，ＣＨ２ＯＨ ，ＣＯＮＨ２，ＣＮ，ＮＯ２およびＣＨ３ＣＨ２から選ばれたものであり、Ａｒ は疎水性のものであり、各Ｒは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソ プロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘブ チル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒドロインドリル、チオジ ヒドロインドリル、２−，３−または４−ピペリジルおよび２−，３−または４ −ピペリジニルから選ばれたものであり、ＹはＣＨ、窒素および不飽和炭素から 選ばれたものであり、Ｚは酸素、窒素、硫黄および式：▲数式、化学式、表等が あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼および▲数式、化学式、表等があります▼（式中、各ｎは独立して１〜４ 、各ｍは独立して０〜５である。）を有するものから選ばれたものである。）を 有するものであり、当該分子はカルシウム様またはカルシウム拮抗的なものであ る、請求項１、１６または１７記載の組成物。
  26. ２６．疎水性基がフェニル、２−，３−または４−ピリジル、１−または２−ナ フチル、１−または２−キノリニル、２−または３−インドリル、ベンジルおよ びフェノキシから選ばれたものである、請求項２５記載の組成物。
  27. ２７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｘは（独立して）Ｈ，ＣＨ３，ＣＨ３Ｏ，ＣＨ３ＣＨ２Ｏ，Ｂｒ，Ｃ ｌ，Ｆ，ＣＦ３，ＣＨＦ２，ＣＨ２Ｆ，ＣＦ３Ｏ，ＣＨ３Ｓ，ＯＨ，ＣＨ２ＯＨ ，ＣＯＮＨ２，ＣＮ−，ＮＯ２およびＣＨ３ＣＨ２から選ばれたものであり、Ａ ｒは疎水性のものであり、各Ｒは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イ ソプロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘ ブチル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒドロインドリル、チオ ジヒドロインドリル、２−，３−または４−ピペリジルおよび２−，３−または ４−ピペリジニルから選ばれたものであり、ＹはＣＨ、窒素および不飽和炭素か ら選ばれたものであり、Ｚは酸素、窒素、硫黄および式：▲数式、化学式、表等 があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があ ります▼および▲数式、化学式、表等があります▼（式中、各ｎは独立して１〜 ４、各ｍは独立して０〜５である。）を有するものから選ばれたものである。） を有する分子であり、かつ当該分子がＮＰＳ４４７またはＮＰＳ４４９以外であ るものを含有する医薬組成物。
  28. ２８．分子がＮＰＳ４６７である、請求項２７記載の組成物。
  29. ２９．分子がＮＰＳ４５９、ＮＰＳ４６７、ＮＰＳ５５１またはＮＰＳ５６８で ある、請求項２５記載の組成物。
  30. ３０．分子がＲ−ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体である、請 求項２５記載の組成物。
  31. ３１．分子がＲ−ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体である、請 求項２７記載の組成物。
  32. ３２．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するものである、請求項３０記載の組成物。
  33. ３３．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するものである、請求項３１記載の組成物。
  34. ３４．各Ｘが独立してＣｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨ３およびＣＨ３Ｏから選ばれたも のである、請求項３２記載の組成物。
  35. ３５．各Ｘが独立してＣｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨ３およびＣＨ３Ｏから選ばれたも のである、請求項３３記載の組成物。
  36. ３６．一つまたはそれ以上の細胞若しくは血液または血漿中における異常［Ｃａ ２＋］または［Ｃａ２＋］ｉによって特徴づけられる疾病を有する患者を処置す るに当たり、当該患者に対し、細胞中における［Ｃａ２＋］ｉを上昇されること によって細胞外Ｃａ２＋活性を発揮するか、または細胞外Ｃａ２＋によってもた らされた［Ｃａ２＋］ｉの増加を阻止する分子の治療的に有効量を投与すること を特徴とする方法。
  37. ３７．分子が５μＭを越えないＥＤ５０を有するものである、請求項３６記載の 方法。
  38. ３８．分子がプロタミン以外のものである、請求項３６記載の方法。
  39. ３９．分子がＣａ２＋受容体においてカルシウム様またはカルシウム拮抗的に作 用するものである、請求項３６記載の方法。
  40. ４０．細胞における［Ｃａ２＋］ｉの上昇が３０秒を越えない、一過性のもので ある、請求項３６記載の方法。
  41. ４１．［Ｃａ２＋］ｉにおける上昇が３０秒以内に起こる、迅速なものである、 請求項３６または４０記載の方法。
  42. ４２．分子が３０秒以上にわたる［Ｃａ２＋］ｉにおける持続性上昇をもたらす ものである、請求項３６記載の方法。
  43. ４３．分子が更にイノシトール−１，４，５−トリホスフェートまたはジアシル グリセロールの上昇をもたらすものである、請求項３６記載の方法。
  44. ４４．イノシトール−１，４，５−トリホスフェートまたはジアシルグリセロー ルの上昇が６０秒よりも少ない時間内に生ずる、請求項４３記載の方法。
  45. ４５．一過性の上昇が細胞を蛋白質キナーゼＣ活性化剤による前処理によって減 じられる、請求項４０記載の方法。
  46. ４６．蛋白質キナーゼＣ活性化剤がホルボールミリステートアセテート、メゼラ インおよび（−）−イミドラクタムＶから選ばれたものである、請求項４５記載 の方法。
  47. ４７．分子がドーパミン−またはイソプロテレノール−刺激サイクリックＡＭＰ 形成を阻止するものである請求項３６記載の方法。
  48. ４８．［Ｃａ２＋］ｉの一過性上昇が細胞を１０ｍＭフッ化ナトリウムにより１ ０分間前処理することによって減じられる、請求項４０記載の方法。
  49. ４９．細胞が上皮小体細胞であり、分子が当該細胞からの上皮小体ホルモン分泌 を阻止するものである、請求項３６記載の方法。
  50. ５０．分子が上皮小体細胞、破骨細胞、傍糸球体腎細胞、近位腎小管細胞、ケラ チノサイト、濾胞付随性甲状腺細胞および胎盤栄養膜から選ばれた細胞からのｍ ＲＮＡを注射したアフリカツメガエル卵母細胞におけるＣ１−コンダクタンスの 上昇を惹き起こすものである、請求項３６記載の方法。
  51. ５１．分子が分子内Ｃａ２＋を移動させて［Ｃａ２＋］ｉの上異を惹き起こす、 請求項３６記載の方法。
  52. ５２．細胞がＣ細胞または破骨細胞であり、分子がインビボの骨吸収を阻止する ものである、請求項３６記載の方法。
  53. ５３．細胞がＣ細胞であり、分子がインビトロまたはインビボのカルシトニン分 泌を刺激するものである、請求項３６記載の方法。
  54. ５４．分子がＣａ２＋受容体において５μＭを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０ を有するカルシウム様またはカルシウム拮抗的なものである、請求項３６記載の 方法。
  55. ５５．分子が上皮小体細胞、破骨細胞、傍糸球体腎細胞、近位腎小管細胞、ケラ チノサイト、濾胞付随性甲状腺細胞および胎盤栄養膜から選ばれた細胞の１つま たはそれ以上であるがすべてではないものにおいて５μＭを越えないＥＣ５０を 有するものである、請求項３６記載の方法。
  56. ５６．分子が１μＭを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものである、請 求項３６、５４または５５記載の方法。
  57. ５７．分子が１００ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するもので ある、請求項３６、５４または５５記載の方法。
  58. ５８．分子が１０ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものであ る、請求項３６、５４または５５記載の方法。
  59. ５９．分子が１ナノモルを越えないＥＣ５０またはＩＣ５０を有するものである 、請求項３８、５４または５５記載の方法。
  60. ６０．分子が生理学的ｐＨにおいて＋に負荷している、請求項３６、５４または ５５記載の方法。
  61. ６１．分子が枝分れまたは環状ポリアミン、＋に負荷しているポリアミノ酸およ びアリールアミンから選択されたものである、請求項６０記載の方法。
  62. ６２．枝分れポリアミンが式： Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｊ−（ＮＲｉ−（ＣＨ２）ｉ）ｋ−ＮＨ２（式中、ｋは１〜 １０の整数、各ｊは同一かまたは異なって２〜２０の整数、各Ｒ１は同一かまた は異なって水素または−（ＣＨ２）ｉ−ＮＨ２（ｊは前記と同意義。 ）、少なくとも１つのＲｉは水素ではない。）を有するものである、請求項６１ 記載の方法。
  63. ６３．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｘは（独立して）Ｈ，ＣＨ３，ＣＨ３Ｏ，ＣＨ３ＣＨ２Ｏ，Ｂｒ，Ｃ ｌ，Ｆ，ＣＦ３，ＣＨＦ２，ＣＨ２Ｆ，ＣＦ３Ｏ，ＣＨ３Ｓ，ＯＨ，ＣＨ２ＯＨ ，ＣＯＮＨ２，ＣＮ，ＮＯ２およびＣＨ３ＣＨ２から選ばれたものであり、Ａｒ は疎水性のものであり、各Ｒは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソ プロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘブ チル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒドロインドリル、チオジ ヒドロインドリル、２−，３−または４−ピペリジルおよび２−，３−または４ −ピペリジニルから選ばれたものであり、ＹはＣＨ、窒素および不飽和炭素から 選ばれたものであり、Ｚは酸素、窒素、硫黄および式：▲数式、化学式、表等が あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼および▲数式、化学式、表等があります▼（式中、各ｎは独立して１〜４ 、各ｍは独立して０〜５である。）を有するものから選ばれたものである。）を 有するものであり、かつ当該分子はカルシウム様またはカルシウム拮抗的なもの である、請求項３６、５４または５５記載の方法。
  64. ６４．疎水性基がフェニル、２−，３−または４−ピリジル、１−または２−ナ フチル、１−または２−キノリニル、２−または３−インドリル、ベンジルおよ びフェノキシから選ばれたものである、請求項６３記載の方法。
  65. ６５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｘは（独立して）Ｈ，ＣＨ３，ＣＨ３Ｏ，ＣＨ３ＣＨ２Ｏ，Ｂｒ，Ｃ ｌ，Ｆ，ＣＦ３，ＣＨＦ２，ＣＨ２Ｆ，ＣＦ３Ｏ，ＣＨ３Ｓ，ＯＨ，ＣＨ２ＯＨ ，ＣＯＮＨ２，ＣＮ−，ＮＯ２およびＣＨ３ＣＨ２から選ばれたものであり、Ａ ｒは疎水性ものであり、各Ｒは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソ プロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘブ チル、シクロオクチル、インデニル、インダニル、ジヒドロインドリル、チオジ ヒドロインドリル、２−，３−または４−ピペリジルおよび２−，３−または４ −ピペリジニルから選ばれたものであり、ＹはＣＨ、窒素および不飽和炭素から 選ばれたものであり、Ｚは酸素、窒素、硫黄および式：▲数式、化学式、表等が あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼および▲数式、化学式、表等があります▼（式中、各ｎは独立して１〜４ 、各ｍは独立して０〜５である。）を有するものから選ばれたものである。）を 有する分子であり、かつ当該分子がＮＰＳ４４７またはＮＰＳ４４９以外である 、請求項３６、５４または５５記載の方法。
  66. ６６．分子がＮＰＳ４６７またはＮＰＳ０１９である、請求項６５記載の方法。
  67. ６７．分子がＮＰＳ４６７、ＮＰＳ０１９またはＮＰＳ４５６である、請求項６ ３記載の方法。
  68. ６８．分子がＲ−ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体である、請 求項６３記載の方法。
  69. ６９．分子がＲ−ジフェニルプロピル−α−フェネチルアミン誘導体である、請 求項６５記載の方法。
  70. ７０．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するものである、請求項６８記載の方法。
  71. ７１．分子が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するものである、請求項６９記載の方法。
  72. ７２．各Ｘが独立してＣｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨ３およびＣＨ３Ｏから選ばれたも のである、請求項７０記載の方法。
  73. ７３．各Ｘが独立してＣｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨ３およびＣＨ３Ｏから選ばれたも のである、請求項７１記載の方法。
  74. ７４．患者が一つまたはそれ以上のＣａ２＋受容体の活性によって調節されるか または影響されるレベルの一つまたはそれ以上のイオンまたは物質の異常レベル によって特徴づけられる疾病を有するものである、請求項３６記載の方法。
  75. ７５．分子が上皮小体細胞、破骨細胞、傍糸球体腎細胞、近位腎小管細胞、ケラ チノサイト、濾胞付随性甲状腺細胞および胎盤栄養膜から選ばれた細胞のＣａ２ ＋受容体に対して作用を有するものである、請求項７４記載の方法。
  76. ７６．患者が一次的および二次的上皮小体機能亢進症、パジェット病、悪性高カ ルシウム血症、骨粗しょう症および高血圧症から選ばれた疾病を有するものであ る、請求項３６記載の方法。
  77. ７７．分子がＣａ２＋受容体の一つまたはそれ以上においてのみ活性を示し、す べてのＣａ２＋受容体には活性を示すものではない、請求項７５記載の方法。
  78. ７８．分子が患者の血清中における上皮小体ホルモン濃度を低下させるものであ る、請求項３６記載の方法。
  79. ７９．上皮小体ホルモン濃度を正常人の濃度まで低下させるものである、請求項 ７８記載の方法。
  80. ８０．濃度が血漿Ｃａ２＋を減少させるに充分な程度まで低下するものである、 請求項７８記載の方法。
  81. ８１．分子が患者に対し治療的に適切な効果を発揮するに充分な量で与えられる 、請求項７８記載の方法。
  82. ８２．分子が細胞外［Ｃａ２＋］によって惹き起こされる細胞内［Ｃａ２＋］ｉ の増加を阻止するものである、請求項３６記載の方法。
  83. ８３．患者における一つまたはそれ以上のＣａ２＋受容体の数および／または場 所を同定し、これを正常患者において観察されるものと対比して疾病または状態 の存在の標識と理解することを特徴とする、患者の疾病または状態を診断する方 法。
  84. ８４．Ｃａ２＋受容体に体する抗体を使用してＣａ２＋受容体の数または場所を 同定するイムノアッセイである、請求項８３記載の方法。
  85. ８５．Ｃａ２＋受容体に結合する標識カルシウム様なまたはカルシウム拮抗的な 分子を提供することを特徴とする、請求項８３記載の方法。
  86. ８６．疾病が癌である、請求項８３記載の方法。
  87. ８７．癌が上皮小体における異所性腫瘍である、請求項８６記載の方法。
  88. ８８．状態が破骨細胞の数または活性の上昇によって特徴づけられる、請求項８ ３記載の方法。
  89. ８９．細胞内［Ｃａ２＋］ｉの上昇を惹き起こすことによって細胞外Ｃａ２＋の 活性を発揮させるか、（細胞外Ｃａ２＋によって惹き起こされた）［Ｃａ２＋］ ｉの上昇を阻止する分子の治療的有効量を投与することを特徴とする、骨粗しょ う症、上皮小体機能亢進症または高血圧症の処置方法。
  90. ９０．細胞における細胞外Ｃａ２＋の活性を発揮させるか、（細胞外Ｃａ２＋に よって惹き起こされた）［Ｃａ２＋］ｉの上昇を阻止する能力について潜在的に 有用な分子をスクリーニングし、当該分子が５μＭを越えないＥＣ５０を有する から否かを決定することを特徴とする、治療的分子として有用な分子を同定する 方法。
  91. ９１．組換Ｃａ２＋受容体。
  92. ９２．組換Ｃａ２＋受容体を含む細胞。
  93. ９３．第１のＣａ２＋受容体においてはＣａ２＋の一つまたはそれ以上の活性を 発揮し、第２のＣａ２＋受容体ではそうではない分子を同定することを特徴とす る、有用なカルシウム様的分子を同定する方法。
  94. ９４．第１のＣａ２＋受容体においてはＣａ２＋の一つまたはそれ以上の活性を 阻止し、第２のＣａ２＋受容体ではそうではない分子を同定することを特徴とす る、有用なカルシウム拮抗的分子を同定する方法。
  95. ９５．同定工程において有用な組換Ｃａ２＋受容体を提供することを含む、請求 項９３または９４記載の方法。
  96. ９６．Ｃａ２＋受容体をコードする精製された核酸。
  97. ９７．ＮＰＳ４５９、ＮＰＳ４６７、ＮＰＳ５４４、ＮＰＳ５５１およびＮＰＳ ５６８から選ばれた分子。
  98. ９８．分子がＮＰＳ４４７、ＮＰＳ４４８、ＮＰＳ４４９またはＮＰＳ４５６で ある、請求項２５記載の組成物。
  99. ９９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ａｌｋは炭素数１〜６の直鎖または分子鎖アルキレン、Ｒ１は炭素数１ 〜３の低級アルキルまたは１〜７のハロゲンで置換された炭素数１〜３の低級ハ ロアルキル、Ｒ２およびＲ３は独立して任意に炭素数１〜３の低級アルキル、１ 〜７のハロゲンで置換された炭素数１〜３の低級ハロアルキル、炭素数１〜３の 低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アミド、炭素数 １〜３の低級アルキルアミド、シアノ、ヒドロキシ、炭素数２〜４のアシルおよ び炭素数１〜３の低級チオアルキルから選ばれた１〜５の置換基で置換されてい ることもある、５〜６の環構成原子を有する、単環式または双環式アリールまた はシクロアルキル基である。）で示される化合物、およびその医薬的に許容され る塩および酸付加塩。
  100. １００．ａｌｋがｎ−プロピレンである、請求項９９記載の化合物。
  101. １０１．Ｒ１がメチルである、請求項１００記載の化合物。
  102. １０２．Ｒ２およびＲ３が独立して任意に置換されたフェニル基から選ばれたも のである、請求項１０１記載の化合物。
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