CN106243229A - 具有三螺旋结构的蛋白质物质及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
作为致力研究的结果，本发明人成功地发明了一种易纯化、在具有低分子量的同时保持有与天然存在的胶原相同的三螺旋结构的胶原基因构建体。具体地，由于CR‑D(信号肽)具有糖识别结构域，所以能通过亲和纯化进行一步纯化。通过用MBL的类胶原结构基因部分取代本发明的人胶原结构基因部分，能获得高纯度和大量的保持三螺旋结构并且热稳定的低分子量胶原。
Description
本发明是2009年12月22日申请的发明名称为“具有三螺旋结构的蛋白质物质及其制造方法”的第200980157245.2号发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有三螺旋结构的蛋白和生产这些蛋白的方法。更具体地，本发明涉及人类胶原类似物和它们的生产方法。本发明的一个目的是提供由对生物机体安全的并且可以轻易地纯化并获得的人类重组蛋白组成的胶原类似物，以及它们的生产方法。更具体地，本发明提供了用于生产由重组蛋白组成的胶原类似物的方法，该重组蛋白中引入的基因全部是人类的基因，其中通过稳定地将插入了包含人类胶原的重组蛋白的cDNA的哺乳动物表达载体转导到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中来实施该方法。
背景技术
近年来，再生医学中最重要的材料之一的实例是胶原。胶原是一种典型的蛋白，其分布于生物机体的几乎所有组织中(皮肤，骨骼，软骨，等等)，并且公知在生物机体中具有重要功能，如通过成为细胞的支架来维持生物学组织和器官的结构。而且，它具有调节细胞增殖、分化和迁移的各种生理学功能。由于这些事实，它正通过与细胞、生长因子等等一起用于组织工程医学中而受到再生医学领域的关注。迄今为止，胶原已经广泛用于医学领域，用作人造器官移植物(专利文献1)、持续性药物释放基质(专利文献2)、人造皮肤(专利文献3)和用于伤口的绷带基质以及用于伤口治疗的基质的生物相容材料的组分(专利文献4)。
生物机体的全部胶原的40％存在于皮肤中，皮肤/腱干重的70％或更多为胶原。因此，胶原在人造皮肤的开发中是很重要的。特别地，胶原用作生物材料用于修复生物体中的损伤。例如，已经报道了它用作涂覆材料用于皮肤损害如灼伤的位点的治愈和改善作用(非专利文献1和2)。这意味着其具有很大的希望应用于目前显著发展的再生医学领域。而且，它用作可用于细胞和器官的培养技术的材料(专利文献5和6)。另外，已经指出口服胶原(Ⅱ型胶原)等等可用于抑制类风湿性关节炎(非专利文献3)。而且，通过设计表达人类胶原(VII型胶原)的部分肽的基因，并引入低分子量胶原基因到表皮水疱症细胞中进行治疗的可能性也已经被报道过(非专利文献4)。
目前使用的很多胶原都来自非人哺乳动物物种如牛或猪。据报道当这些胶原被移植到人类中时，大约3％的患者出现过敏反应(非专利文献5和6)。而且，近年来，来自非人哺乳动物物种的胶原具有朊病毒或病原体的污染风险已经成为一个主要问题。因此，强烈需要一种用于生产低抗原性而且没有病原体污染的安全的人类胶原的系统。
为了避免这种问题，一些发明人已经发明了一种通过用插入了编码人胶原的cDNA的重组病毒感染昆虫细胞以生产具有与人体中相同的三螺旋结构的重组人胶原方法，而且已经申请了专利(专利文献7)。而且，也已发明了使用哺乳动物细胞或酵母细胞生产人胶原的方法(专利文献8)。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本特开2007-204881号公报
[专利文献2]日本特开2001-316282号公报
[专利文献3]日本特开2005-314号公报
[专利文献4]日本特开2007-160092号公报
[专利文献5]日本特开2002-142753号公报
[专利文献6]日本特再表2005-014774号公报
[专利文献7]日本特开8-23979号公报
[专利文献8]日本特表平7-501939号公报
[非专利文献]
[非专利文献1]Surg.Forum,10,303(1960)
[非专利文献2]J.Surg.Res.,10,485-491(1960)
[非专利文献3]Science,261,1727-1730(1993)
[非专利文献4]THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 275卷,第32期,8月第11期,24429-24435页,2000
[非专利文献5]J.Immunol.136:877-882,1986
[非专利文献6]Biomaterials 11:176-180,1990
发明内容
可见，胶原是一种可用作药物产品或用于活体供体移植或再生医学的生物材料的物质；但是，通常使用的胶原来自于非人哺乳动物物种如猪和牛的组织。胶原本来就是一种具有低免疫原性的蛋白，而且正被作为生物材料移植、包埋或注射到人体中。但是，尽管频率较低仍有报道说来自于非人哺乳动物物种的组织的胶原引起免疫反应，(J.Immunol.,136,877-882(1986)；Biomaterials,11,176-180(1990))。而且，由于牛的朊病毒污染的可能性，不可能使用源自牛的胶原。此外，目前用于胶原纯化和提取的哺乳动物，例如猪中，无法保证不含有未知的污染物(病原性病毒等等)如朊病毒污染，来自于非人哺乳动物的胶原应用于人类的同时，也引起了安全问题。另外，生物学来源的胶原的一个问题是，由于包含大量杂蛋白，纯化期间多步纯化变得必要，这样纯化方法变得复杂。
考虑到以上问题，人类来源的胶原作为直接应用于人类的生物材料是合乎需要的。可以从人类来源(如人的胎盘)纯化人类来源的胶原(美国专利5,002,071和5,428,022)。但是，使用人类来源的胶原时也存在几个问题：(1)由于该材料是人组织，该材料的供应有限；(2)不能完全消除具有病原性病毒如肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒(HIV)污染的可能性；(3)从胎盘收集的胶原种类是不均匀的而且品质不完全相同；和(4)从人类提取和纯化胶原存在伦理问题。由于获得的胶原中形成非特异性的桥接，导致纯化变得困难，因此还存在质量问题。
迄今，已经研究了使用基因工程技术生产胶原的方法，以消除病原体污染的风险并获得分离和纯化步骤简单的大量胶原(Biochem.Soc.,28,350-353(2000))。但是，胶原分子的分子量为100000或更多，而且非常大，用于引入到宿主细胞中的表达载体的制备非常复杂。另外，常规方法无法获得维持实际应用的生产水平低。此外，胶原是一种采用3条多肽链缔合的三螺旋结构的分子，而且这种结构是通过大量翻译后修饰而形成的(N.Engl.J.Med.,311,376-386(1984))，但是预计只有特定的细胞具有这种修饰能力。
众所周知为了使胶原形成三螺旋结构，胶原结构域中的脯氨酸必须是羟基化的。为了生产具有三螺旋结构的胶原，提供了一种通过在昆虫细胞中共表达人类胶原和脯氨酸羟化酶生产重组胶原的方法(日本特开2002-315580号公报)。但是，为了共表达脯氨酸羟化酶，必须共表达至少3个基因，即胶原与脯氨酸羟化酶的α亚单位和β亚单位，而且细胞的克隆变得非常复杂。
在此之前已经试验使用仓鼠胚胎细胞、小鼠成纤维细胞等等作为宿主生产人类来源的重组胶原(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84,764-768(1987)；J.Biol.Chem.,264,20683-20687(1989))。这些例子中获得的胶原的分子结构是正常的，但是混合了宿主细胞来源的胶原和外源基因来源的胶原。而且，在人纤维肉瘤细胞HT1080中表达Ⅱ型胶原的例子中(Biochem.J.,298,31-37(1994))，生产水平较低(每1L培养物0.5～1mg)，而且不能持续用于实际应用。而且，观察到与外源基因来源的Ⅱ型胶原相等含量的人纤维肉瘤细胞HT1080来源的Ⅳ型胶原。因此，必须从内源的Ⅳ型胶原分离外源基因来源的Ⅱ型胶原，而且在这点上它也是不实用的。因此，即使使用一种表达系统，检验精细的纯化条件成为必要，而且认为甚至在混合杂质的条件下，一种简单可操作的纯化方法也是必需的。
除了以上所述，有许多利用酵母(日本特表平07-501939号公报)、昆虫细胞(日本特开平08-23979号公报)、短芽孢杆菌(日本特开平11-178574号公报)和大肠杆菌(日本特开2002-325584号公报)表达人胶原的例子。然而，它们可能存在生产与那些天然存在的人胶原具有不同翻译后修饰的胶原的风险。如上所述，迄今指出的所有方法都不能持续的实际用作通过基因工程定性和定量地生产人胶原的方法。而且，至今还没有研究生产大量具有三螺旋结构的蛋白的方法，如设计具有低分子量的重组胶原。
鉴于上述情况，申请人已经通过应用基因工程技术获得非抗原性胶原，消除病原体污染的危险，并获得易于分离和纯化的胶原来研究了人I型胶原的生产(国际公开WO2006/106970)。尽管常规方法可以保证一定的生产水平，更需要形成多个三螺旋结构的系统。表达水平方面的改善也认为是必要的。
鉴于上述情况，完成了本发明。本发明的一个目的是提供安全的具有三螺旋结构的人类胶原类似物蛋白以及生产它们的方法。
本发明人进行了各种实验以解决上述问题，并且通过将构建体引入到宿主细胞中，成功地生成了具有三螺旋结构、且分子量小于天然存在的胶原、易于纯化的胶原类似物(微胶原)，所述构建体通过将人胶原凝集素的信号肽结构域基因与人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因融合到的胶原(作为具有三螺旋结构的蛋白质之一)基因的胶原结构域的氨基末端侧、将人胶原凝集素的颈结构域(neck domain)基因与人胶原凝集素的糖识别结构域基因融合到胶原基因的胶原结构域的羧基末端侧而生成。
具有三螺旋结构的已知蛋白的例子包括人甘露聚糖结合凝集素(MBL)与共凝集素。通过降低本发明的胶原类似物的分子量接近于这些蛋白的分子量(其至今是难以实现的)，成功生产了具有降低的分子量的三螺旋结构的胶原类似物蛋白。而且，这些胶原类似物蛋白显示具有三螺旋结构和热稳定性。
天然存在的人胶原具有较差的水溶性，而本发明的胶原类似物显示较高的水溶性，因为它们包含人胶原凝集素的富含水溶性半胱氨酸结构域、颈结构域和糖识别结构域。因此，相较于具有高分子量的天然存在的胶原，它们更易于处理。
本发明人通过添加高浓度的中性盐促进原纤维形成来沉淀胶原类似物，而且通过离心成功并容易地纯化了具有三螺旋结构的纤维性胶原类似物。
而且，本发明人利用糖识别结构域与甘露聚糖的结合，用甘露聚糖琼脂糖通过简单的一步纯化法成功地纯化了水溶性胶原类似物。
使用上述的不同纯化方法，本发明人成功地纯化了两种具有不同物理特性的胶原类似物：具有高物理强度的纤维性胶原类似物；和与甘露聚糖结合且具有高溶解度的水溶性胶原。当用作人类粘附细胞中的生物材料时，这些胶原类似物显示具有与天然存在的胶原相同程度的细胞粘附性和伸长特性。本发明的胶原类似物预期可用作来源于非人哺乳动物种类的常规使用的胶原的代替物，或用作用于人类的生物材料。
作为为解决上述问题而进行的各种实验的结果，本发明人发明了一种可以很容易地纯化、具有低分子量同时保持与天然存在的胶原相同的三螺旋结构的胶原的基因构建体。具体地说，由于CR-D(信号肽)具有糖识别结构域，因此能通过亲和纯化进行一步纯化。通过用MBL的类胶原结构基因部分取代本发明的人胶原结构基因部分，使得获得大量和高纯度的保持三螺旋结构的低分子量胶原变得可能。
更具体地说，通过利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为宿主，引入构建体，本发明人成功地生产了大量人胶原类似物，该构建体中本发明的胶原类似物基因包含于能高度表达外源基因的载体中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(1)已经用于生产药物而且被证实是安全的，并且(2)由于它们是哺乳动物细胞，而被认为具有与人类蛋白接近的糖链修饰及蛋白。
更具体地说，利用具有低表达水平的胶原(具有三螺旋结构的蛋白)的哺乳动物细胞作为宿主，通过最小化宿主来源的胶原和外源基因来源的胶原的混合，本发明人成功地开发了一种不需要复杂的纯化步骤的生产大量本发明的胶原类似物的方法。根据如上内容，完成了本发明。
具体地说，本发明提供了：
[1]具有三螺旋结构的重组蛋白，其包含由从氨基末端依次包含下列(i)到(v)的多核苷酸编码的蛋白：
(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；
(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；
(iii)人胶原的胶原结构域基因；
(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和
(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因；
[2][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原凝集素的信号肽结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的多核苷酸；
[3][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的多核苷酸；
[4][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原凝集素的颈结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的颈结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的多核苷酸；
[5][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原凝集素的糖识别结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的糖识别结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:7的多核苷酸；
[6][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原的胶原结构域基因包含至少一种或多种α-链人胶原的胶原结构域基因；
[7][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中人胶原的胶原结构域基因是包含α-链人胶原的人I型胶原的胶原结构域基因；
[8][6]或[7]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中α-链人胶原的胶原结构域基因是包含核苷酸序列SEQ ID NO:8的多核苷酸；
[9][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白；
[10][1]的具有三螺旋结构的重组蛋白，其中多核苷酸是包含核苷酸序列SEQ IDNO:3的多核苷酸；
[11]一种生产具有三螺旋结构的蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)将从氨基末端依次包含下列(i)到(v)的多核苷酸引入到载体中：
(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；
(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；
(iii)人胶原的胶原结构域基因；
(iv)人胶原凝集素的颈结构域(neck domain)基因；
(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因；
(b)使用该载体，通过基因引入转化宿主细胞；和
(c)培养或培育转化体，并从细胞或它的培养物上清液收集具有三螺旋结构的蛋白；
[12][11]的方法，其中人胶原凝集素的信号肽结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的多核苷酸；
[13][11]的方法，其中人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的多核苷酸；
[14][11]的方法，其中人胶原凝集素的颈结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的颈结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的多核苷酸；
[15][11]的方法，其中人胶原凝集素的糖识别结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的糖识别结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:7的多核苷酸；
[16][11]的方法，其中人胶原的胶原结构域基因包含至少一种或多种α-链人胶原的胶原结构域基因；
[17][11]的方法，其中人胶原的胶原结构域基因是包含α-链人胶原的人I型胶原的胶原结构域基因；
[18][16]或[17]的方法，其中α-链人胶原的胶原结构域基因是包含核苷酸序列SEQ ID NO:8的多核苷酸；
[19][11]的方法，其中步骤(a)中使用的载体是SEQ ID NO:2的pNC1；和
[20][11]的方法，其中步骤(a)中使用的载体是SEQ ID NO:9的pDC6/CF。
附图说明
图1显示了pNC1/I型微胶原构建体，各自的缩写如下所示。PCMV∶巨细胞病毒启动子；INRBG∶兔生长激素内含子；I型微胶原∶微胶原DNA；PABGH∶牛生长激素基因聚腺苷酸(polyA)添加信号；PdSV∶增强子缺失的猿猴病毒40启动子；NPT∶新霉素磷酸转移酶cDNA；PASV∶猿猴病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr∶大肠杆菌中的选择标记(氨苄青霉素抗性)。
图2显示了pDC6/CF_I型微胶原构建体，各自的缩写如下所示。PCMV5∶巨细胞病毒5启动子；I型微胶原∶微胶原DNA；PABGH∶牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV∶增强子缺失的猿猴病毒40启动子；cd180DHFR∶通过把从DHFR的核苷酸序列的5’末端开始的180个碱基范围内的密码子改变为哺乳动物中最不常使用的密码子，而产生的翻译弱化的DHFR基因；PASV:猿猴病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr∶大肠杆菌中的选择标记(氨苄青霉素抗性)。
图3是微胶原纯化的流程图。除非另有说明，所有的步骤都在4℃下进行。该图中，*1表示用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将细胞调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下、于37℃在T-75培养瓶(FALCON)中静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)的步骤，所述培养基添加有终浓度为 4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg G418SulfateCell Culture Tested(CALBIOCHEM)和1x HT补充液(GIBCO)。*2表示以1750×g离心1小时的步骤(EX-126,TOMY)。*3表示添加氯化钠(Wako)到上清液(1.4L)中以达到0.4M的步骤。*4表示在4℃下使用氢氧化钠(Wako)调节pH到7.4(F-51,HORIBA)的步骤。*5表示使用交叉流过滤(VIVAFLOW50；10,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩培养物上清液到它体积的1/20的步骤。*6表示用含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析 3天的步骤(Spectra/ProTM生物技术透析膜(Biotech Dialysis Membrane)；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,Inc)。*7表示分别添加氯化钙(Wako)和氯化钠(Wako)到20mM和2M的步骤。*8表示用MilliQ水(MILLIPORE)透析(Spectra/ProTM生物技术纤维素酯(CE)透析膜(BiotechCellulose Ester(CE)Dialysis Membrane)；25,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天的步骤。*9表示用4.5mL甘露聚糖琼脂糖凝胶(SIGMA)填充Econo-柱(Bio-RAD)，用45mL含有5mM EDTA的TBS(TBS粉末，Takara)(Dojindo)和含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤和平衡凝胶，以 1.0mL/min的流速通过循环装填上清液17.5小时，除去上清液，然后用10mL含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤，并用20mL含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脱微胶原的步骤。*10表示用0.4M氯化钠-0.1MTris-盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天的步骤。*11表示使用Amicon Ultra-15(10,000MWCO；MILLIPORE)，通过以1750×g超滤30分钟浓缩到1/10体积的步骤。
图4在图片中显示了从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原在还原条件下(添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1显示作为沉淀的纯化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖琼脂糖柱上纯化的水溶性微胶原。图片上标注了分子量和微胶原寡聚体。
图5在图片中显示了从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原在非还原条件下(未添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1显示作为沉淀的纯化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖琼脂糖柱上纯化的水溶性微胶原。图片上标注了分子量和微胶原寡聚体。
图6在图片中显示了从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原在非变性条件下(未添加2-巯基乙醇和SDS)的聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1显示作为沉淀的纯化的蛋白，泳道2是在甘露聚糖琼脂糖柱上纯化的水溶性微胶原。图片上标注了分子量和微胶原寡聚体。
图7在图片中显示了通过进行从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原在还原条件下(添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用兔抗-MBL(糖识别结构域(CRD))多克隆抗体进行蛋白质印迹(Western blotting)，并将化学荧光检测图片的明暗对比反转后获得的结果。泳道1显示作为沉淀的纯化后蛋白，泳道2是在甘露聚糖琼脂糖柱上纯化的水溶性微胶原。图片上标注了分子量和微胶原寡聚体。
图8在图片中显示了通过进行从培养物上清液纯化的蛋白然和水溶性微胶原在非还原条件下(未添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用兔抗-MBL(糖识别结构域(CRD))多克隆抗体进行蛋白质印迹，然后将化学荧光检测图片的明暗对比反转后获得的结果。泳道1显示作为沉淀的纯化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖琼脂糖柱上纯化的水溶性微胶原。图片上标注了分子量和微胶原寡聚体。
图9在图片中显示了在酸性条件下用胃蛋白酶消化的纯化的蛋白和天然存在的人I型去端肽胶原(atelocollagen)，在还原条件下(添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。图片上标注了微胶原，消化后保留的微胶原的胶原结构域和胃蛋白酶的条带位置。泳道1∶分子量标记；泳道2∶未用胃蛋白酶消化的纯化蛋白；泳道3∶用胃蛋白酶消化的纯化蛋白；泳道4∶未用胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽胶原；泳道5∶用胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽胶原；和泳道6∶单独添加的胃蛋白酶。
图10在图片中显示了通过在30℃到50℃的温度范围中对纯化蛋白进行热处理、在胶原没有消化的条件下使用高度浓缩的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的组合进行酶处理、在还原条件下(添加2-巯基乙醇)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的热稳定性分析的结果。图片上标注了微胶原，消化后保留的微胶原的胶原结构域，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的条带位置。泳道1是分子量标记，泳道2是未进行酶处理的纯化蛋白，泳道3～15是在30℃到50℃的温度范围内经受热处理、然后经受胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶处理的纯化蛋白，泳道16是单独的胰蛋白酶，和泳道17是单独的胰凝乳蛋白酶。
图11是解链曲线图，显示了基于使用图10的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对纯化蛋白进行热稳定性分析的结果，根据加热温度所消化的胶原结构域条带的比例。
图12是使用沉淀法进行微胶原纯化的流程图。除非另有说明，所有的步骤都在4℃下进行。在该图中，*1表示用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)的步骤，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mL G418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1×HT补充液(GIBCO)。*2表示以1750×g离心10分钟的步骤(EX-126,TOMY)。*3表示添加氯化钠(Wako)到上清液中以达到0.4M(pH7.4)，并于4℃孵育的步骤。*4表示以10000×g离心30分钟的步骤(EX-146,TOMY)。*5表示使用交叉流过滤(VIVAFLOW50；10,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩培养物上清液到体积为320mL的步骤。*6表示添加氯化钠(Wako)到达到4M(pH7.4)并于4℃孵育的步骤。*7表示以9400×g离心30分钟的步骤(EX-176,TOMY)。*8表示添加1.5mL的50mM乙酸(Wako)溶液到沉淀中的步骤。*9表示用50mM乙酸(Wako)溶液透析(Spectra/ProTM生物技术纤维素酯(CE)透析膜；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,Inc.)5天的步骤。*10表示添加7.4mL的50mM乙酸(Wako)溶液到沉淀中的步骤。
图13是使用与甘露聚糖结合进行微胶原纯化的流程图。除非另有说明，所有的步骤都于4℃下进行。在该图中，*1表示用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)的步骤，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mL G418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1x HT补充液(GIBCO)。*2表示以1750×g离心10分钟的步骤(EX-126,TOMY)。*3表示添加氯化钠(Wako)到上清液中以达到0.4M(pH7.4)，并于4℃孵育的步骤。*4表示以10000×g离心30分钟的步骤(EX-146,TOMY)。*5表示使用交叉流过滤(VIVAFLOW50；10,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩培养物上清液到体积为320mL的步骤。*6表示添加氯化钠(Wako)以达到4M(pH7.4)，并于4℃孵育的步骤。*7表示以9400×g离心30分钟的步骤(EX-176,TOMY)。*8表示添加1M氯化钙溶液以达到20mM，然后于4℃孵育18小时的步骤。*9表示使用交叉流过滤(VIVAFLOW200；30,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩体积到56mL的步骤。*10表示用含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc)7天的步骤。*11表示用5mL甘露聚糖琼脂糖凝胶(SIGMA)填充Econo-柱(Bio-RAD)，用15mL含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)和45mL含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤和平衡凝胶，以1.0mL/min的流速装填上清液，然后用40mL含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤，并用15mL含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脱微胶原，以收集第一个峰(9mL)的步骤。*12表示用0.4M氯化钠、0.1M Tris-盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)该洗脱物5天的步骤。
图14显示了在37℃下使粘附细胞(MG-63细胞系，ATCC)与包被有天然存在的I型人去端肽胶原、天然存在的I型牛去端肽胶原、MC-Salt、MC-Man、3％(w/v)热变性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小时后，通过洗涤除去未粘附的细胞，添加MTS，然后将平板于37℃培养3小时后对其吸光度的测定结果。纵坐标表示用655nm波长作为对照，于490nm波长处测定的吸光度，横坐标表示涂布于平板上的每个样品的名称。
图15的图片中显示了在37℃下使人成骨细胞与包被有天然存在的人I型去端肽胶原、天然存在的I型牛去端肽胶原、MC-Salt、MC-Man、3％(w/v)热变性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小时，并通过洗涤除去未粘附细胞以后，细胞的相位差显微图。该图片显示了粘附到包被有∶1为天然存在的人I型去端肽胶原；2为天然存在的牛I型去端肽胶原；3为MC-Salt；4为MC-Man；5为3％(w/v)热变性的BSA溶液；和6为PBS的平板上的人成骨细胞的状态。箭头指示观察到伸长的细胞。
图16的图片中显示了在37℃下使人成骨细胞与包被有天然存在的人I型去端肽胶原、天然存在的牛I型去端肽胶原、MC-Salt、MC-Man、3％(w/v)热变性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小时，通过洗涤除去未粘附细胞，并将平板于37℃孵育3小时以后，细胞的相位差显微图。图片显示了粘附到包被有∶1为天然存在的人I型去端肽胶原；2为天然存在的牛I型去端肽胶原；3为MC-Salt；4为MC-Man；5为3％(w/v)热变性的BSA溶液；和6为PBS的平板上的人成骨细胞的状态。箭头指示观察到伸长的细胞。
图17显示了I型微胶原和MC-GPP的结构。显示了A∶人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域；B∶SP-D的富含半胱氨酸的结构域；C∶人I型胶原(COL1A1)的三螺旋(593-769)；D∶COL1A1三螺旋(1178-1192)；E∶人甘露糖结合凝集素(MBL)的颈结构域；F∶MBL的糖识别结构域；和G∶6×His区。
图18显示了pDC6/MC-GPP构建体，各自的缩写如下所示。PCMV∶巨细胞病毒启动子；INRBG∶兔生长激素内含子；MC-GPP∶缺少从C-末端区到GPP区部分的微胶原的cDNA；PABGH∶牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV∶增强子缺失的猿猴病毒40启动子；cd180DHFR∶通过把从DHFR的核苷酸序列的5’末端开始的180个碱基范围内的密码子改变为哺乳动物中最不常使用的密码子，而产生的翻译弱化的DHFR基因；PASV:猿猴病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr∶大肠杆菌中的选择标记(氨苄青霉素抗性)。
图19在图片中显示了从培养物上清液纯化的MC-GPP在还原条件下(添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1是纯化的MC-GPP，图片上标示了分子量和MC-GPP寡聚体。
图20在图片中显示了从培养物上清液纯化的MC-GPP在非还原的条件下(未添加2-巯基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1是纯化的MC-GPP，图片上标示了分子量和MC-GPP寡聚体。
图21在图片中显示了从培养物上清液纯化的MC-GPP在非变性条件下(未添加2-巯基乙醇和SDS)的聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。泳道1是纯化的MC-GPP，图片上标示了分子量和MC-GPP寡聚体。
图22在图片中显示了从培养物上清液纯化的MC-GPP在还原条件下(添加2-巯基乙醇)，进行蛋白质印迹并将化学荧光检测图片的明暗对比反转后获得的结果。泳道1是纯化的MC-GPP，图片上标示了分子量和MC-GPP寡聚体。
图23在图片中显示了从培养物上清液纯化的MC-GPP在非还原的条件下(未添加2-巯基乙醇)，进行蛋白质印迹并将化学荧光检测图片的明暗对比反转后获得的结果。泳道1是纯化的MC-GPP，图片上标示了分子量和MC-GPP寡聚体。
图24在图片中显示了将MC-GPP、天然存在的人I型去端肽胶原和纯化的纤维性微胶原酸性条件下用胃蛋白酶消化、在还原条件下(添加2-巯基乙醇)进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。图片上标示了MC-GPP、天然存在的人去端肽胶原(α1，α2，β和γ链)、微胶原、消化以后微胶原或MC-GPP的剩余胶原结构域、和胃蛋白酶的条带的位置。泳道1∶添加MC-GPP；泳道2∶添加胃蛋白酶消化的MC-GPP；泳道3∶单独添加胃蛋白酶(与泳道2中相同的含量)；泳道4∶添加天然存在的人I型去端肽胶原；泳道5∶添加胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽胶原；泳道6∶单独添加胃蛋白酶(与泳道5中相同的含量)；泳道7∶添加纯化的纤维性微胶原；泳道8∶添加胃蛋白酶消化的纯化的纤维性微胶原；泳道9∶单独添加胃蛋白酶(与泳道8中相同的含量)；和泳道10：未添加MC-GPP、天然存在的人I型去端肽胶原、微胶原和胃蛋白酶。
图25是在酸性条件下用胃蛋白酶消化MC-GPP和纯化的纤维性微胶原，并使用ImageJ分析来自在还原条件下(添加2-巯基乙醇)进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的图像的条带以后，所获得的曲线图。*1是MC-GPP，*2是胃蛋白酶消化的MC-GPP，*3是单独的胃蛋白酶(与*2中相同的含量)，*4是纯化的纤维性微胶原，*5是胃蛋白酶消化的纯化的纤维性微胶原，和*6是单独的胃蛋白酶(与*5中相同的含量)。如图中所示分析的标记条带和它们的分子量。
具体实施方式
以下，展示了实施本发明的方式，并对本发明进行了更加详细的说明。
本发明涉及一种具有三螺旋结构的重组蛋白，其包含由从氨基末端依次包含下列(i)到(v)的多核苷酸所编码的蛋白：
(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；
(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；
(iii)人胶原的胶原结构域基因；
(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和
(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因。
本发明中，“具有三螺旋结构的蛋白”可以是通过培养在生产阶段构建的三螺旋结构的蛋白，或者通过培养生产以后的操作如纯化形成的三螺旋结构的蛋白。虽然它是采用三螺旋结构的蛋白，但是可以单链结构的形式大量生产。可以形成三螺旋结构的蛋白可以是表达的蛋白的一部分。
本发明中，“人胶原凝集素的信号肽结构域基因”没有特别限定，但是优选地由“人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域基因”例示，或更优选包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的多核苷酸。
本发明中，“人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因”没有特别限定，但是优选地由“人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的结构域基因”例示，或更优选包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的多核苷酸。
本发明中，“人胶原凝集素的颈结构域基因”没有特别限定，但是优选地由“人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的颈结构域基因”例示，或更优选包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的多核苷酸。
本发明中，“人胶原凝集素的糖识别结构域基因”没有特别限定，但是优选地由“人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的糖识别结构域基因”例示，或更优选包含核苷酸序列SEQ IDNO:7的多核苷酸。
本发明中，“人胶原的胶原结构域基因”没有特别限定，但是该基因优选地包含至少一种或多种α-链人胶原的胶原结构域基因的基因。而且，该基因优选地是由α链人胶原组成的人I型胶原的胶原结构域基因。本发明α-链人胶原的胶原结构域基因的一个例子更优选地是包含核苷酸序列SEQ ID NO:8的多核苷酸。而且，它可以是缺少从胶原结构域基因的C-末端区到GPP区的区域的胶原结构域基因。这种缺少C-末端区到GPP区的部分的胶原结构域基因的一个例子更优选地是包含核苷酸序列SEQ ID NO:15的多核苷酸。
超过20种不同类型的胶原和大约25种构成α链是已知的。已经克隆了编码它们的基因，并已经阐明了其核苷酸序列(“Connective Tissue and Its HeritableDisorders”,145-165页,Weily-Liss Inc.出版(1992))。可以把这些基因引入到本发明中使用的载体中，该载体可以通过本领域技术人员已知的基因重组技术高度表达外源基因(例如，“分子克隆(Molecular Cloning)”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版(1989))。本发明中使用的人胶原cDNA可以是胶原的这些克隆的cDNA中的任何一个，而且包括部分胶原肽的cDNA。
本发明的胶原类型没有特别限定，但是优选哺乳动物型的胶原，而且更优选人型的胶原。
而且，本发明的具有三螺旋结构的蛋白还包括通过取代、缺失等部分修饰了氨基酸序列并具有本发明的三螺旋结构的蛋白。而且，通过将载体引入到宿主哺乳动物细胞中获得表达蛋白质分子的转导细胞的方法是已知的。类似的方法可用于本发明。
本发明的“具有三螺旋结构的蛋白”，更优选地由具有三螺旋结构的重组蛋白例示，包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白，和由包含核苷酸序列SEQ ID NO:3的多核苷酸所编码的蛋白。
而且，本发明涉及一种生产具有三螺旋结构的蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将从氨基末端依次包含下列(i)到(v)的多核苷酸引入到载体中：
(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；
(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；
(iii)人胶原的胶原结构域基因；
(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和
(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因；
(b)使用该载体，通过基因引入转化宿主细胞；和
(c)培养或培育转化体，并从这些细胞或从它们的培养物上清液收集具有三螺旋结构的蛋白质。
下列方法可用于检验引入了上述载体的细胞是否合成了作为重组蛋白的具有三螺旋结构的蛋白。具体地说，使用特异性结合人胶原的市售抗体，通过免疫化学方法如蛋白质印迹鉴定胶原肽。根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子量，胶原通常不迁移(Nature，227，680-685(1970))。因而，可以根据Matsudaira等(J.Biol.Chem.,261,10035-10038(1987))的方法，在样品电泳的同时用胶原作为标记，并在转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜以后，可用抗胶原抗体检验样品的反应性。而且，可以按如下检验具有三螺旋结构的分子是否存在于表达载体产生的重组胶原产品中。
典型的纤维性胶原是由3个亚单位(α链)形成的3链分子，而且具有分子内的三螺旋结构。此外，已知具有三螺旋结构的胶原能抵抗胃蛋白酶消化。因此，可通过酸性条件下，用胃蛋白酶消化引入了上述高外源基因表达载体的细胞的培养物上清液，并检验样品是否具有能抵抗胃蛋白酶的结构，来证实蛋白样品中3链分子的存在。
具体地说，本发明中，将胃蛋白酶处理的蛋白样品在还原条件下进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果，获得的重组胶原显示具有与天然胶原相似的胃蛋白酶抗性，因此引入了高外源基因表达载体的细胞的培养物上清液中预计包含具有能抵抗胃蛋白酶的特性的胶原肽。上述结果表明本发明的表达载体能在宿主细胞中合成具有胃蛋白酶抗性的胶原，该特性与在活体中发现的胶原的特性相同。
生产和纯化具有三螺旋结构的本发明的蛋白的方法如下所示，但不限于此。
在本发明中的作为宿主细胞培养的哺乳动物细胞没有特别限定，但是优选CHO细胞。
可通过悬浮培养进行本发明中使用的CHO细胞的大规模培养。例如，可以使用100ml～1L培养基，在振荡烧瓶或旋转烧瓶中培养引入了人胶原-表达载体的1×108～1×109个重组CHO细胞，该人胶原-表达载体含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因、小鼠二氢叶酸还原酶基因、和编码人胶原或其部分肽的cDNA。培养这些细胞一段合适的时间以后，可以从收集的培养物上清液大量提取蛋白。
在引入了人胶原-表达载体的重组CHO细胞的培养物上清液中，不仅存在具有三螺旋结构的3链蛋白质分子，还存在没有形成正常的3链分子的蛋白，该人胶原-表达载体含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因、小鼠二氢叶酸还原酶基因、和编码人胶原或其部分肽的cDNA。如上所述，胃蛋白酶能消化不具有三螺旋结构的胶原样蛋白。从而，可以通过胃蛋白酶消化除去缺乏三螺旋结构的类胶原蛋白。这种处理可同时降解和除去培养物上清液中除了具有三螺旋结构的3链蛋白质分子以外的蛋白。利用上述特性，可通过对引入了人胶原表达载体的重组CHO细胞的培养物上清液中存在的总蛋白直接进行胃蛋白酶处理，来消化和除去非胶原蛋白和缺乏三螺旋结构的蛋白，该人胶原表达载体含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因、小鼠二氢叶酸还原酶基因、和编码人胶原或其部分肽的cDNA。
本发明中，目标人胶原是所有的人胶原，包括目前已知的I型到XXI型胶原，而且还包括其部分肽。本发明的胶原的类型没有特别限定，但是包括，作为代表性例子的I型、Ⅱ型、III型、IV型、V型、VII型、IX型、XI型、XII型、XVII型和XVIII型，而且优选I型、Ⅱ型、III型。I、IV、V、IX和XI型由两种或三种α链组成，而Ⅱ、III、VII、XII、XVII和XVIII型由一种α链组成。它们各自具有下列分子组成:I型:[α1(I)]2α2(I)，II型:[α1(II)]3，III型:[α1(III)]3，IV型:[α1(IV)]2α2(IV)，V型:[α1(V)]2α2(V)和α1(V)α2(V)α3(V)，VII型:[α1(VII)]3，IX型:α1(IX)α2(IX)α3(IX)，XI型:α1(XI)α2(XI)α3(XI)，XII型:[α1(XII)]3，XVII型:[α1(XVII)]3或XVIII型:[α1(XVIII)]3；但是，本发明的胶原的分子组成没有特别限定。而且，本发明的胶原的分子组成不限于天然胶原的分子组成，并且可以由3种不同类型的α链人工组成。
SEQ ID NO:10表示编码本发明的I型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列，SEQ ID NO:11表示编码I型胶原的α2链的DNA的核苷酸序列，SEQ ID NO:12表示编码II型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列，SEQ ID NO:13表示编码III型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列。
编码本发明的胶原的DNA包括含有任一核苷酸序列SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:13的寡核苷酸，优选地包括与含有任一核苷酸序列SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:13的寡核苷酸选择性杂交的寡核苷酸。“选择性杂交”指在合适的严谨度的杂交条件下，与DNA或RNA样品中存在的具有预定序列(也即，第二个多肽)的分子杂交、形成双链或基本上结合的核酸分子。严谨条件是，例如，42℃、2x SSC和0.1％SDS的通常条件，优选50℃、2x SSC和0.1％SDS的条件，更优选65℃、0.1x SSC和0.1％SDS的条件，但是不特别限定于这些条件。影响杂交严谨度的因素可包括多种因素如温度和盐浓度，而且本领域技术人员可以适当地选择这些因素以获得最合适的严谨度。
本发明生产的具有三螺旋结构的蛋白可以是前胶原分子，其中前肽与胶原结构域中的N-和C-末端连接，或者可以是其中前肽被除去的形式。
本发明中，“胶原的部分肽”指由编码胶原的cDNA的多核苷酸的20％或更多(例如，20，30，40，50，60，70，80或90％)编码的多肽(以下称为微胶原)。该肽还包括其中胶原氨基酸序列被部分修饰的，或具有添加的非胶原氨基酸序列的那些肽。
本发明中，“具有低胶原表达的哺乳动物细胞”指当以1×106个细胞/mL培养时，产生50ng/mL胶原或更少胶原的细胞；优选的例子是CHO细胞。本发明中，“高表达”指通过5.0×105个细胞/mL引入了基因的CHO细胞，培养72小时以后，1μg/mL的微胶原表达或更多表达，优选5μg/mL或更多的微胶原表达。
本发明中，“可高度表达外源基因的载体”指，例如，包含具有弱活性用于在哺乳动物细胞中进行药物筛选的标记基因的载体，以便这种插入选择性发生于哺乳动物细胞染色体上活跃转录的区域。这种载体优选地包括pNC1载体(SEQ ID NO:2)，更优选地包括pDC6/CF载体(SEQ ID NO:9)。本发明的表达载体的例子包括实施例中具体描述的表达载体，但是不限于那些。本发明中，培养方法可以是悬浮或者粘附培养。
本说明书中引用的所有现有技术文献都并入此处作为参考。
实施例
[实施例1]pNC1/I型微胶原的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，通过用SEQ ID NO:3的编码微胶原的cDNA(在下文中描述为I型微胶原)取代SEQ ID NO:2中描述的pNC1载体的第1274个核苷酸序列构建pNC1/I型微胶原(图1)。
[实施例2]将pNC1/I型微胶原引入到CHO细胞中，并使用CD培养基或通过添加非动物基的添加剂到CD培养基中产生的培养基进行G418筛选
利用脂质体方法(Lipofectin method)(使用LipofectamineTM LTX，Invitrogen)，在25cm2-培养瓶中将10μg pNC1/I型微胶原转染到5.0×105CHO细胞中(CHO DG44细胞)中。转染方法根据制造商的手册来进行。转染48小时以后，进行细胞计数，然后在含有4mMGluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)中稀释这些细胞。将细胞以1000个细胞/孔和100个细胞/孔的浓度分别铺板到5个96孔微量滴定板上，共10个板(960孔)，在5％二氧化碳气体存在下、37℃培养大约3周，观察到存活的细胞(G418抗性的克隆)。从存活的细胞中任意挑选72个G418抗性克隆，随后测定培养物上清液中微胶原的生产水平。
[实施例3]经pNC1/I型微胶原-转染的克隆生产微胶原的水平的测定
通过ELISA测定生产水平。如图1中所示，由于微胶原在它的C末端部分包含人MBL的糖识别结构域，所以人MBL抗体用于检测微胶原。在4℃下使用1μg/mL用包被缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3,pH 9.6)稀释的抗人MBL抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)包被96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immunoplate,Cat.no.442404,Nunc)16小时。用4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭以后，添加转染以后14天的培养物上清液(1/10稀释度)、纯化的人MBL(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)在用于CHO细胞无血清培养基的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)中的两倍稀释系列(20～0.3125ng/mL)和IS CHO w/水解物培养基(IS日本)各100μL/孔，并于37℃孵育1小时。另外，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL单克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，并于37℃孵育1小时。已经于37℃孵育30分钟的VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(2滴试剂A，2滴试剂B/5mL，Vector)，以100μL/孔添加，并于37℃反应45分钟。PEROXIDASE SUBSTRATEKIT TMB(2滴缓冲液，3滴TMB，2滴过氧化氢/5mL，Vector)，其已经于室温孵育30分钟，再以100μL/孔添加。在室温中反应15分钟以后，以100μL/孔添加1M磷酸以终止反应。通过使用酶标仪(Model680，BioRad制造)，并于450nm测定吸光度，从纯化的人MBL的校准曲线计算微胶原浓度。根据ELISA获得的结果，确定具有最高微胶原生产水平的前十个样品。这前十个样品进一步传代，与含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)一起转入24孔平板上，并培养细胞直到它们占据每个孔的1/3或更多。每个系取0.4mL置于无菌试管中，并以200×g离心2分钟。丢弃上清液，细胞悬浮于新鲜的培养基中(含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本))，并测定细胞数。然后通过在培养基中稀释将细胞数调整到5×105个细胞/mL，转移0.2mL这种稀释液到新的24孔板中，并在5％二氧化碳气体存在下于37℃孵育72小时。以9300×g离心2分钟以后，收集上清液。随后，测定培养物上清液中微胶原的生产水平。
通过ELISA测定生产水平。在4℃下使用1μg/mL用包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，0.05％NaN3,pH 9.6)稀释的抗人MBL抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)包被96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immunoplate,Cat.no.442404,Nunc)16小时。用4％BlockAce(大日本住友制药株式会社)封闭以后，添加72小时培养物上清液(1/1000稀释度)、纯化的人MBL(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)在用于CHO细胞的无血清培养基的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)中的两倍稀释系列(20～0.3125ng/mL)和IS CHO w/水解物培养基(IS日本)各100μL/孔，并于37℃孵育1小时。而且，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL单克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，并于37℃孵育1小时。已经于37℃孵育30分钟的VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(2滴试剂A，2滴试剂B/5mL，Vector)，以100μmL/孔添加，并于37℃反应45分钟。PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2滴缓冲液，3滴TMB，2滴过氧化氢/5mL，Vector)，其已经于室温孵育30分钟，进一步以100μL/孔添加。在室温中反应15分钟以后，以100μL/孔添加1M磷酸以终止反应。通过使用酶标仪(Model680，BioRad制造)，并于450nm测定吸光度，从纯化的人MBL的校准曲线计算微胶原浓度。根据ELISA获得的结果确定的具有最高微胶原生产水平的前十个样品显示于表1中。
[表1]
G418抗性克隆的微胶原生产水平
[实施例4]pDC6/CF_I型微胶原的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，通过用SEQ ID NO:3的编码微胶原的cDNA(在下文中描述为I型微胶原)取代SEQ ID NO:9中描述的pDC6/CF载体的第1059个核苷酸序列构建pDC6/CF_I型微胶原(图2)。
[实施例5]将pDC6/CF_I型微胶原引入到CHO细胞中，并使用CD培养基或通过添加非动物基添加剂到CD培养基中产生的培养基进行筛选
利用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX，Invitrogen)，在25cm2-培养瓶中将10μg pNC1/I型微胶原转染到5.0×105CHO个细胞(CHO DG44细胞)中。转染方法根据制造商的手册来进行。转染48小时以后，进行细胞计数，然后在含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS Japan)中稀释这些细胞。细胞以4000/个细胞/孔和1000个细胞/孔的浓度分别铺板到5个96孔微量滴定板上，共有10个板(960孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周，观察到存活的细胞(存活的克隆)。从存活的细胞中任意挑选157个存活的克隆，随后测定培养物上清液中微胶原的生产水平。
[实施例6]测定通过pDC6/CF_I型微胶原-转染的克隆生产微胶原的水平
通过ELISA测定生产水平。如图2中所示，由于微胶原在它的C末端部分包含人MBL的糖识别结构域，所以人MBL抗体用于检测微胶原。在4℃下使用1μg/mL用包被缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3,pH 9.6)稀释的抗人MBL抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)包被96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immunoplate,Cat.no.442404,Nunc)16小时。用4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭以后，添加转染以后，添加14天的培养物上清液(1/1000稀释度)、纯化的人MBL(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)的用于CHO细胞的无血清培养基的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)中的两倍稀释系列(20～0.3125ng/mL)和IS CHO w/水解物培养基(IS日本)各100μL，并于37℃孵育1小时。而且，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL单克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，并于37℃孵育1小时。已经于37℃孵育30分钟的VECTASTAION Elite ABC kitSTANDARD(2滴试剂A，2滴试剂B/5mL，Vector)，以100μL/孔添加，并于37℃反应45分钟。已经于室温孵育30分钟的PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2滴缓冲液，3滴TMB，2滴过氧化氢/5mL，Vector)，再以100μL/孔添加。在室温中反应15分钟以后，以100μL/孔添加1M磷酸以终止反应。通过使用酶标仪(Model 680，BioRad制造)，并于450nm测定吸光度，从纯化的人MBL的校准曲线计算微胶原浓度。根据ELISA获得的结果，确定具有最高微胶原生产水平的前十个样品。这前十个样品进一步传代，与含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO CDw/水解物培养基(IS日本)一起转入24孔平板上，并培养细胞直到它们占据每个孔的1/3或更多。把0.4mL每个系置于无菌试管中，并以200×g离心2分钟。丢弃上清液，细胞悬浮于0.1ml新鲜的培养基中(含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本))，并进行细胞计数。然后通过在培养基中稀释把细胞数调节到5×105个细胞/mL，转移0.2mL这种稀释液到新的24孔板中，并在5％二氧化碳气体存在下于37℃孵育72小时。以9300×g离心2分钟以后，收集上清液。随后，测定培养物上清液中微胶原的生产水平。
通过ELISA测定生产水平。在4℃下使用1μg/mL用包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，0.05％NaN3,pH 9.6)稀释的抗人MBL抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)包被96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immunoplate,Cat.no.442404,Nunc)16小时。用4％BlockAce(大日本住友制药株式会社)封闭以后，添加72小时培养物上清液(1/1000稀释度)、纯化的人MBL(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)在用于CHO细胞的无血清培养基的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)中的两倍稀释系列(20～0.3125ng/mL)和IS CHO w/水解物培养基(IS日本)各100μL/孔，并于37℃孵育1小时。而且，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL单克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，并于37℃孵育1小时。已经于37℃孵育30分钟的VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(2滴试剂A，2滴试剂B/5mL，，以100μL/孔添加，并于37℃反应45分钟。已经于室温孵育30分钟的PEROXIDASE SUBSTRATEKIT TMB(2滴缓冲液，3滴TMB，2滴过氧化氢/5mL，Vector)，再以100μL/孔添加。在室温中反应15分钟以后，以100μL/孔添加1M磷酸以终止反应。通过使用酶标仪(Model 680，BioRad制造)，并于450nm测定吸光度，从纯化的人MBL的校准曲线计算微胶原浓度。根据ELISA获得的结果确定的具有最高微胶原生产水平的前十个样品显示于表2中。
[表2]
生长于无HT培养基中的克隆的微胶原生产水平
[实施例7]微胶原的纯化
用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC1/I-21型微胶原)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下、在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mL G418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1x HT补充液(GIBCO)。除非另有说明，下列步骤都于4℃进行。收集培养液并于1750×g离心1小时(EX-126,TOMY)以分离细胞和上清液。添加氯化钠(Wako)到该上清液(1.4L)中以获得0.4M，并使用氢氧化钠(Wako)于4℃调节其pH(F-51,HORIBA)到7.4，利用交叉流过滤(VIVAFLOW50；10,000MWCO PES；VIVASIENCE)把该溶液浓缩到它体积的1/20。通过以1750×g离心(EX-126,TOMY)1小时收集在该过程中形成的沉淀。上清液用含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析3天(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,Inc.)，并分别添加氯化钙(Wako)和氯化钠(Wako)以达到20mM和2M来产生沉淀。该溶液以1750×g离心1小时(EX-126,TOMY)以分离沉淀和上清液。把这些沉淀与前面收集的沉淀合并，用MilliQ水(MILLIPORE)透析(Spectra/ProTM生物技术纤维素酯(CE)透析膜；25,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天，并进行冻干(浓缩器(Concentrator)5301，Eppendorf)以获得纯化的蛋白。将1.47mg纯化的蛋白溶解于1.47mL的50mM乙酸(Wako)溶液中，并用于下面的分析。而且，使用甘露聚糖琼脂糖柱，利用微胶原与甘露聚糖的结合，对上清液中残余的微胶原进行纯化。首先，用4.5mL甘露聚糖琼脂糖凝胶(SIGMA)装填Econo-柱(BIO-RAD)，用45mL含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS和含有5mM氯化钙(Wako)的TBS洗涤和平衡凝胶，以1.0mL/min的流速循环装填上清液17.5小时。除去上清液，接着用10mL含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤，并用20mL含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脱微胶原。洗脱物用0.4M氯化钠-0.1M Tris-盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,Inc.)透析5天。其后，使用Amicon Ultra-15(10,000MWCO；MILLIPORE)，通过以1750×g超滤30分钟浓缩体积到1/10。最终，从1.4L培养物上清液收集7.7mg纤维性微胶原沉淀，接着，从剩余的上清液收集具有与甘露聚糖结合活性的2.5mg水溶性微胶原(参见，图3)。
[实施例8]微胶原的分析
还原条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原进行分析。
更具体地说，取10μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(LaemmliSample Buffer)(BIO-RAD)分别添加到各10μL纯化的蛋白和水溶性微胶原(每个皆用含有20mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了10倍)中，在98℃加热(TaKaRa PCRThermal Cycler PERSONAL,TaKaRa BIOMEDICALS)5分钟进行还原。电泳缓冲液(Tris/Glycine(Glycine)/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取10μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。此后，用25mL DW(MILLIPORE)振动洗涤凝胶5分钟，并重复该过程3次。将凝胶在25mL Quick-CBB PLUS(Wako)中染色1小时，然后在25mL DW(MILLIPORE)中脱色1小时(参见图4)。
[实施例9]微胶原的分析
非还原条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原进行分析。
更具体地说，取10μL不含2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)分别添加到各10μL纯化的蛋白和水溶性微胶原(每个皆用含有20mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了10倍)，在98℃加热(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL,TaKaRaBIOMEDICALS)5分钟进行处理。电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取10mL热处理过的样品溶液添加于17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，边振动(ROTO-SHAKE GENIE，ScientificIndustries)边用25mL DW(MILLIPORE)洗涤凝胶5分钟，并重复该过程3次。将凝胶在25mLQuick-CBB PLUS(Wako)中染色1小时，然后在25mL DW(MILLIPORE)中脱色1小时(参见图5)。
[实施例10]微胶原的分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对从培养物上清液纯化的蛋白和水溶性微胶原进行分析。
更具体地说，取10μL不含2-巯基乙醇和SDS的非变性样本缓冲液(Native SampleBuffer)(BIO-RAD)添加到各10μL纯化的蛋白和水溶性微胶原(每个皆用含有20mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了10倍)中。电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALSCO.,LTD)，取10μL制备的样品溶液添加于17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，边振动(ROTO-SHAKE GENIE，ScientificIndustries)边用25mL DW(MILLIPORE)洗涤凝胶5分钟，并重复该过程3次。将凝胶在25mLQuick-CBB PLUS(Wako)中染色1小时，然后在25mL DW(MILLIPORE)中脱色1小时(参见图6)。
[实施例11]还原条件下的蛋白质印迹
由于微胶原编码MBL的糖识别结构域(CRD)，从而表达的微胶原中包含该CRD结构域。因此，抗MBL(识别CRD结构域)抗体可与其结合。利用这一点，使用兔抗MBL(CRD结构域)多克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，在还原条件下进行蛋白质印迹，并通过化学荧光检测鉴定纯化的蛋白与水溶性微胶原。
更具体地说，取10μL含有5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)分别与各10μL纯化蛋白和水溶性微胶原(每个皆用含有20mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了500倍)混合，在98℃加热(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRaBIOMEDICALS)5分钟进行还原。电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取10μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，从玻璃平板取出凝胶，并在振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下将其在转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在8mL甲醇(Wako)中浸泡15秒、8mL MilliQ水(MILLIPORE)中浸泡2分钟、8mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在转移装置中(TRANS-BLO,SD SEMI-DRY TRANSFER CELL,BIO-RAD)，从负极侧依次铺放转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))浸泡的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size,BIO-RAD)、Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、凝胶和滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，并盖上盖子，以80mA(PowerPac HCTM,BIO-RAD)电泳2小时，以转移分离的蛋白到Immobilon-P转移膜上(MILLIPORE)。转移以后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在8mL ImmunoBlock(注册商标，Laboratory Product Division of Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)中浸泡并于4℃封闭18小时，然后在8mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯,Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤5分钟，3次。将8mL兔抗MBL(CRD结构域)多克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)用含有0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇单月桂酸酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释2000倍，振动(ROTO-SHAKE GENIE,Scientific Industries)同时与膜上的蛋白于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在8mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤该膜5分钟，3次。添加8mL的用含有0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中稀释20000倍的过氧化物酶标记的AffiniPure F(ab’)2片段化驴抗兔IgG(H+L)(AffiniPure F(ab’)2Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L))(Jackson ImmunoResearch)，振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)同时在室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在24mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤该膜10分钟，3次。添加1mLImmobilonTM Western化学荧光HRP底物(Western Chemiluminescent HRP Substrate)(MILLIPORE)用于化学荧光，使用光-捕获ATTO冷却CCD摄影系统(Light-Capture ATTOCooled CCD Camera System)(ATTO)，以它的常规设置拍摄1分钟照片(参见图7)。
[实施例12]非还原的条件下的蛋白质印迹
由于微胶原编码MBL的糖识别结构域(CRD)，从而表达的微胶原中包含该CRD结构域。因此，抗MBL(CRD结构域识别)抗体可与其结合。利用这一点，使用兔抗MBL(CRD结构域)多克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)，在非还原的条件下进行蛋白质印迹，通过化学荧光检测鉴定纯化的蛋白与水溶性微胶原。
更具体地说，取10μL含有5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)分别与各10μL纯化蛋白和水溶性微胶原(每个皆用含有20mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了500倍)混合，在98℃加热(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRaBIOMEDICALS)5分钟进行处理。电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取10μL热处理过的样品溶液添加于17孔3％～10％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。此后，从玻璃平板取出凝胶，并在振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下将其在转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。边振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)边将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在8mL甲醇(Wako)中浸泡15秒、8mL MilliQ水(MILLIPORE)中浸泡2分钟、8mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在转移装置中(TRANS-BLO,SD SEMI-DRY TRANSFER CELL,BIO-RAD)，从负极侧依次铺放转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD)浸泡的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、凝胶和滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，并盖上盖子，以80mA(PowerPac HCTM,BIO-RAD)电泳2小时，以转移分离的蛋白到Immobilon-P转移膜上(MILLIPORE)。转移以后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在8mL ImmunoBlock(注册商标，Laboratory Product Division of Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)中浸泡并于4℃封闭18小时，然后在8mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯,Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤5分钟，3次。将用含有0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇单月桂酸酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)稀释了2000倍8mL兔抗MBL(CRD结构域)多克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)在振动(ROTO-SHAKE GENIE,Scientific Industries)下与膜上的蛋白于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在8mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤该膜5分钟，3次。添加8mL的在含有0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中稀释了20000倍的过氧化物酶标记的AffiniPureF(ab’)2片段化驴抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)，并于室温下振动(ROTO-SHAKEGENIE，Scientific Industries)反应1小时。除去未结合的抗体以后，在24mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)中振动洗涤该膜10分钟，3次。添加1mL ImmobilonTM Western化学荧光HRP底物(MILLIPORE)用于化学荧光，使用光-捕获ATTO冷却CCD摄影系统(ATTO)，以它的常规设置拍摄1分钟照片(参见图8)。
[实施例13]从培养物上清液纯化的蛋白和天然存在的人I型去端肽胶原的胃蛋白酶消化
纯化的蛋白和天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)用胃蛋白酶在酸性条件下进行消化，并从SDS聚丙烯酰胺电泳图像证实了对胃蛋白酶剪切的抗性。
更具体地说，分别添加3μL的0.3M盐酸溶液到各10μL纯化的蛋白(0.5mg/mL)或天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)(1mg/mL)中以调节pH到2，分别添加5μL 2mg/mL胃蛋白酶(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)溶液，20℃(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRaBIOMEDICALS)进行胃蛋白酶消化2小时。这里，制备未添加胃蛋白酶的纯化的蛋白等的样品、和仅仅具有胃蛋白酶(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)而没有添加纯化的蛋白等的样品作为对照，添加5μL的10mM乙酸溶液代替胃蛋白酶溶液，和添加10μL 10mM乙酸溶液代替纯化的蛋白等，并于20℃孵育2小时。添加1μL的1M Tris(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(三氨基甲烷)；Wako)溶液到纯化的蛋白样品与单独的胃蛋白酶样品(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)中，添加5μL该溶液到天然存在的人去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)以终止反应，然后4℃孵育18小时对胶原进行不可逆地再纤维化(refibrillized)。添加19μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到纯化的蛋白样品与单独的胃蛋白酶样品中，并且添加23μL到天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)中，在98℃加热(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRaBIOMEDICALS)5分钟进行还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取10μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳50分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，边振动(ROTO-SHAKE GENIE，ScientificIndustries)边在25mL DW(MILLIPORE)中洗涤凝胶5分钟，并重复该过程3次。将凝胶在25mLQuick-CBB PLUS(Wako)中染色1小时，然后在25mL DW(MILLIPORE)中脱色1小时(参见图9)。结果，胃蛋白酶消化没有剪切天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)。在50kDa处观察到微胶原的条带，而且由于非胶原结构域通过胃蛋白酶消化被剪切和除去，因此在30kDa处观察到单独胶原结构域的条带。这表明微胶原能以与天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)类似的方式抵抗胃蛋白酶剪切(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)，而且正确地折叠成三螺旋结构。
[实施例14]从培养物上清液纯化的蛋白的热稳定性分析
正确地折叠成三螺旋结构的稳定胶原能抵抗蛋白酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的剪切。在该实施例中，利用高浓度的胰蛋白酶(胰蛋白酶，IX-S型，来自猪胰腺，13100单位/mg固体蛋白；SIGMA-ALDRICH)和胰凝乳蛋白酶(α-胰凝乳蛋白酶，I-S型∶来自牛胰腺，58单位/mg蛋白；SIGMA)，在只有胶原能抵抗剪切的条件下，通过酶处理来分析纯化的蛋白的热稳定性。
更具体地说，分别添加1μL 1M Tris(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(三氨基甲烷)；Wako)溶液到各10μL纯化的蛋白中(0.5mg/mL)，以调节pH到7。将样品在30℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃和50℃的温度下各热处理(TaKaRaPCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRa BIOMEDICALS)10分钟，然后立即冷却到20℃(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRa BIOMEDICALS)，添加1mg/mL胰蛋白酶(胰蛋白酶，IX-S,从猪胰腺，13100单位/mg固体，蛋白；SIGMA-ALDRICH)和胰凝乳蛋白酶(α-胰凝乳蛋白酶，I-S型∶来自牛胰腺，58单位/mg蛋白；SIGMA)各1μL，并于20℃(TaKaRa PCRThermal Cycler PERSONAL；TaKaRa BIOMEDICALS)进行酶处理2分钟。这里，制备了未添加酶的样品和具有单独的胰蛋白酶(胰蛋白酶，IX-S型，来自猪胰腺，13100单位/mg固体蛋白；SIGMA-ALDRICH)或胰凝乳蛋白酶(α-胰凝乳蛋白酶，I-S型∶来自牛胰腺，58单位/mg蛋白；SIGMA)的样品，添加2μL 0.4M氯化钠-0.1M Tris盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)代替酶，和添加12μL 0.4M氯化钠-0.1M Tris盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)代替纯化的蛋白等，并于20℃(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRa BIOMEDICALS)孵育2分钟。添加13μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到每个样品溶液中，在98℃加热(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL；TaKaRa BIOMEDICALS)5分钟进行还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔10％～20％的Super SepTM(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取6.5μL热处理过的样品溶液添加于17孔10％～20％的Super SepTM(Wako)，并以40mA电泳60分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，边振动(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)边在25mL DW(MILLIPORE)中洗涤凝胶5分钟，并重复该过程3次。将凝胶在25mL Quick-CBB PLUS(Wako)中染色1小时，然后在25mL DW(MILLIPORE)中脱色1小时(参见图10)。
图11显示了基于在该实施例中利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对从培养物上清液纯化的蛋白进行热稳定性分析的结果，并限定在30℃的热处理温度对胶原结构域条带进行量化获得的值为100％，从在各个加热温度对胶原结构域条带进行量化来绘制解链曲线的结果。由此，纯化的蛋白的胶原结构域的热变性温度(50％被酶消化的热处理温度)是42.9℃(图11)。由于天然存在的人I型去端肽胶原的热变性温度是41.9℃(J.Biochem,115,853-857(1994))，纯化的蛋白具有与天然存在的人I型去端肽胶原相同或更高的耐热性，因此认为形成了稳定的三螺旋结构。
[实施例15]利用沉淀法纯化微胶原
用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mL G418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)和1x HT补充液(GIBCO)。除非另有说明，下列步骤于4℃进行。收集培养液并于1750×g离心10分钟(EX-126,TOMY)以分离细胞和上清液。添加氯化钠(Wako)到该上清液中(1.35L)达到0.4M，于4℃使用氢氧化钠(Wako)调节pH到7.4(F-51,HORIBA)，并4℃储存该上清液。以10000×g离心该上清液30分钟(EX-126,TOMY)除去沉淀，并收集上清液(1.35L)。另外，用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mLG418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1x HT补充液(GIBCO)。收集培养液并于1750×g离心10分钟(EX-126,TOMY)以分离细胞和上清液(1.87L)。把该上清液(1.87L)和前述的上清液(1.35L)合并(3.22L)，并使用交叉流过滤(VIVAFLOW200；30,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩到320mL的体积，添加氯化钠(Wako)以达到4M的终浓度。4℃使用氢氧化钠(Wako)调节pH到7.4(F-51，HORIBA)，该上清液25℃孵育4天。通过以9400×g离心(EX-126,TOMY)30分钟收集在该过程中形成的沉淀。添加1.5mL 50mM乙酸(Wako)溶液到该沉淀中，该全量用50mM乙酸(Wako)溶液透析(Spectra/ProTM生物技术纤维素酯(CE)透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天。然后，收集透析的样品溶液，并于9400×g离心30分钟(EX-126,TOMY)以收集沉淀。添加7.4mL 50mM乙酸(Wako)溶液到该沉淀中，该全量用50mM乙酸(Wako)溶液透析(Spectra/ProTM生物技术纤维素酯(CE)透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天，以收集3.3mg微胶原(在下文中，MC-salt)(参见图12)。
[实施例16]利用与甘露聚糖结合来纯化微胶原
用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mL G418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1×HT补充液(GIBCO)。除非另有说明，下列步骤都于4℃进行。收集培养液并于1750×g离心10分钟(EX-126,TOMY)以分离细胞和上清液。添加氯化钠(Wako)到该上清液中(1.35L)以达到0.4M，于4℃使用氢氧化钠(Wako)调节pH到7.4(F-51,HORIBA)，而且该上清液于4℃贮存。以10000×g离心该上清液30分钟(EX-126,TOMY)除去沉淀，并收集上清液(1.35L)。另外，用IS CHO-CD w/水解物(IS日本)培养基将表达微胶原的CHO细胞(pNC7/MC-21)调整到2.0×105个细胞/mL，并在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中于37℃静置培养14天(HERA细胞150，Heraeus)，所述培养基添加有终浓度为4mM的Gluta MAXTM-I(GIBCO)、0.4mg/mLG418Sulfate Cell Culture Tested(CALBIOCHEM)、和1×HT补充液(GIBCO)。收集培养液并于1750×g离心10分钟(EX-126,TOMY)以分离细胞和上清液(1.87L)。把该上清液(1.87L)和前述的上清液(1.35L)合并(3.22L)，并使用交叉流过滤(VIVAFLOW200；30,000MWCO PES；VIVASIENCE)浓缩到320mL的体积，添加氯化钠(Wako)以达到4M的终浓度。于4℃使用氢氧化钠(Wako)调节pH到7.4(F-51,HORIBA)，而且该上清液于25℃孵育4天。通过以9400x g离心(EX-126,TOMY)30分钟除去在该过程中形成的沉淀。添加1M氯化钙溶液到该上清液中(320mL)以获得20mM，上清液于4℃孵育18小时，并于9400×g离心30分钟(EX-126,TOMY)以分离沉淀和上清液。使用交叉流过滤(VIVAFLOW200；30,000MWCO PES；VIVASIENCE)把上清液(320mL)浓缩到体积为56mL，然后用含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)7天。添加1M氯化钙溶液到该透析过的样品溶液中以达到20mM，该样品溶液于4℃孵育18小时，然后于9400×g离心30分钟(EX-126,TOMY)以分离沉淀和上清液。使用甘露聚糖琼脂糖柱，利用微胶原与甘露聚糖的结合，对上清液(86mL)中残余的微胶原进行纯化。用5mL甘露聚糖琼脂糖凝胶(SIGMA)填充Econo-柱(Bio-RAD)，并用15mL含有5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)和45mL含有5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤和平衡该凝胶。以1.0mL/min的流速装填上清液，然后用40mL包含5mM氯化钙(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗涤。使用15mL包含5mM EDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脱微胶原，并收集第一个峰(9mL)。洗脱物用0.4M氯化钠、0.1M Tris-盐酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)透析(Spectra/ProTM生物技术透析膜；10,000MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.)5天，并收集3.9mg具有与甘露聚糖结合活性(在下文中，MC-Man)的水溶性微胶原(参见图13)。
[实施例17]细胞对胶原包被的平板的粘附的分析
通过使粘附细胞的人成骨细胞(MG-63细胞，ATCC)分别粘附于包被有天然存在的人I型去端肽胶原、天然存在的牛I型去端肽胶原和纯化的微胶原(MC-salt，MC-Man)的96孔微量培养板上，以对细胞粘附特性进行检验。
具体地说，用0.1M乙酸(Wako)分别将天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤；SIGMA-ALDRICH)、天然存在的牛I型去端肽胶原(来自小牛皮，Cellculture tested；SIGMA)、MC-salt和MC-Man稀释、调整到0.1mg/mL。各以100μL/孔添加这些胶原溶液、3％(w/v)热变性的BSA(Invitrogen)溶液和PBS(Wako)到96孔板上(F96MAXISORPNunc-Immuno plate,Nunc)，在室温中包被这些孔13小时(n＝3)。包被的孔用PBS(Wako)洗涤3次，并以300mL/孔添加1％(w/v)热变性的BSA(Invitrogen)溶液用于37℃封闭1小时。封闭以后，孔用PBS(Wako)洗涤1次，并将在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中调整到2.5x 105个细胞/mL的人成骨细胞(MG-63细胞，ATCC)溶液以100μL/孔植入孔中，以便使人成骨细胞(MG-63细胞，ATCC)于37℃粘附1小时。通过利用1％(w/v)热变性的BSA(Invitrogen)溶液单次洗涤除去未粘附的人成骨细胞(MG-63细胞系，ATCC)以后，以100μL/孔添加RPMI-1640培养基(Invitrogen)，并添加20μL CellTiter 96TM Aqueous One Solution Reagent(MTS,Promega)。37℃孵育3小时以后，利用655nm波长作为对照，使用酶标仪(Model 680,BioRad制造)，测定490nm波长的吸光度(参见图14)。另外，使人成骨细胞(MG-63细胞，ATCC)于37℃粘附1小时，并在相差显微镜下观察通过洗涤除去未粘附细胞以后剩余的细胞(参见图15)，以及随后于37℃孵育3小时的细胞(参见图16)。使用倒置显微镜(Nikon ECLIPSE TE2000-S，Nikon制造)观察图像，该倒置显微镜装有一个高清晰度彩色摄影机头(DS-Fi1，Nikon制造)和一个控制单元(DS-L2,Nikon制造)。
结果，包被有天然存在的人I型去端肽胶原、天然存在的牛I型去端肽胶原、MC-salt和MC-Man的孔中的吸光度是没有包被胶原的(PBS)孔中的吸光度的两倍或更高，而且观察到由于胶原包被导致更高水平的人成骨细胞粘附。另外，使人成骨细胞粘附1小时，在相差显微镜中观察通过洗涤除去未粘附细胞以后剩余的细胞(参见图15)，以及随后于37℃孵育3小时的细胞(参见图16)。在包被有天然存在的人I型去端肽胶原、MC-salt和MC-Man的孔中，人成骨细胞显示粘附和伸长。然而，虽然用天然存在的牛I型去端肽胶原观察到人成骨细胞的粘附，但是几乎没看到伸长。从上可知，发现MC-salt和MC-Man具有与天然存在的人去端肽胶原相当的人成骨细胞粘附和伸长特性。
[实施例18]构建其中C-末端区到GPP区缺失的微胶原
为了说明微胶原的三螺旋结构所需的区域，本发明人构建了其中微胶原的C-末端区到GPP区部分被缺失的蛋白(在下文中，缩写为MC-GPP)。图17显示了微胶原(I型微胶原)和MC-GPP的每个区。使用本领域技术人员熟知的方法，通过用SEQ ID NO:15中描述的编码MC-GPP的cDNA取代SEQ ID NO:14中描述的pDC6载体的第1267-1275个核苷酸序列构建了pDC6/MC-GPP(图18)。
[实施例19]将pDC6/MC-GPP引入到CHO细胞中，并使用CD培养基或通过添加非动物基的添加剂到CD培养基中产生的培养基在无HT的培养基中进行筛选
使用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX，Invitrogen)，在25-cm2培养瓶中把2.5μg pDC6/MC-GPP转染到的4000000CHO细胞中(CHO DG44细胞)。转染方法根据制造商的手册来进行的。转染48小时以后，进行细胞计数，然后在含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H培养基(IS日本)中稀释这些细胞。细胞以4000个细胞/孔(480孔)的浓度铺板到5个96孔微量滴定板中，并在5％二氧化碳存在下37℃培养培养大约3周，观察到存活的细胞(生长于无HT的培养基中的细胞系)。还原条件下进行蛋白质印迹，以证实目标蛋白在存活细胞系中的表达。具体地，取10μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)分别与10μL发现增殖的每种细胞系的培养物上清液混合，在98℃加热5分钟进行还原(DTU-18,TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔10％～20％的Super SepTM Ace(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURECHEMICALS CO.,LTD)，取20μL热处理过的样品溶液用于17个孔10％～20％的Super SepTMAce(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。此后，从玻璃平板取出凝胶，边振动(Wave-S1,TAITEC)边在10mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。边振动(Wave-S1,TAITEC)边将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL甲醇(Wako)中浸泡15秒、10mL超纯水(ELGA)中浸泡2分钟、10mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在转移装置中(TRANS-BLO,SD SEMI-DRY TRANSFER CELL,BIO-RAD)，从负极侧依次铺放转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD)浸泡的滤纸(Extra Thick Blot PaperCriterionTM XL Size,BIO-RAD)、Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、凝胶和滤纸(ExtraThick Blot Paper CriterionTM XL Size，BIO-RAD)，并盖上盖子，以80mA电泳90分钟(PowerPac HCTM,BIO-RAD)，以转移分离的蛋白到Immobilon-P转移膜上(MILLIPORE)。转移以后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL ImmunoBlock(Laboratory ProductDivision of Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)中浸泡并于4℃封闭18小时，然后在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯,Wako)的PBS(Wako)中振动(Wave-S1,TAITEC)洗涤5分钟，3次。边振动(Wave-S1,TAITEC)边将10mL用包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)稀释1000倍的6-His单克隆抗体(COVANCE)与膜上的蛋白于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜5分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加10mL在包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中稀释5000倍的山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP(Jackson ImmunoResearch)，并在振动(Wave-S1,TAITEC)下于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在24mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜10分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加2mL ImmobilonTM Western化学荧光HRP底物(MILLIPORE)用于化学荧光，使用光-捕获ATTO冷却CCD摄影系统(ATTO)，以它的常规设置拍摄10秒到1分钟照片。将检测到了MC-GPP表达的细胞与含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)一起转入24孔板上，并培养细胞直到它们占据每个孔的1/3或更多。在如上所述的还原条件下进行蛋白质印迹，将孔中检测到了MC-GPP表达的细胞与含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)一起转入6孔板上，并培养细胞直到它们占据每个孔的1/3或更多。将观察到进一步增殖并且在还原条件下通过蛋白质印迹检测到MC-GPP表达的细胞系与含有4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的ISCHO-CD w/水解物培养基(IS日本)一起转入T-75培养瓶(BD)中，并培养细胞直到它们达到每个孔中1.0×106个细胞/mL。
[实施例20]MC-GPP的纯化
在存在5％二氧化碳存在下，在T-75培养瓶(FALCON)中，用IS CHO-CD w/水解物培养基(IS日本)于37℃静置培养表达MC-GPP的CHO细胞(pDC6/MC-GPP-3)(HERA细胞150，Heraeus)。收集培养液并以1750×g离心10分钟(EX-126，TOMY)以分离细胞和上清液，把该上清液装填到Ni柱上以纯化MC-GPP。具体地，用1mL Ni-NTA琼脂糖凝胶(Invitrogen)填充Poly空柱(BIO-RAD)，并用6mL超纯水(BMS)洗涤凝胶。接着，凝胶用6mL非变性结合缓冲液(0.25M磷酸二氢钠(Wako)，2.5M氯化钠(Wako)，0.01M咪唑(Wako)，pH8.0)洗涤3次，取8mL培养物上清液装填到柱上。罩住柱子，发生结合，同时于4℃混合60分钟(Aikuru,IWAKI)。凝胶用6mL非变性洗涤缓冲液(0.25M磷酸二氢钠(Wako)，2.5M氯化钠(Wako)，0.02M咪唑(Wako)，pH8.0)洗涤9次，并每次使用1mL非变性洗脱缓冲液(0.23M磷酸二氢钠(Wako)，2.3M氯化钠(Wako)，0.25M咪唑(Wako)，pH8.0)洗脱6次。最初的2mL洗脱物在0.02M乙酸溶液中于4℃透析3天，然后收集MC-GPP溶液。
[实施例21]还原条件下MC-GPP的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
还原条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的MC-GPP进行分析。具体地，添加10μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到10μL纯化的MC-GPP中，在98℃加热5分钟进行还原(DTU-18,TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和Super SepTM Ace 10％～20％17孔(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURECHEMICALS CO.,LTD)，取15μL热处理过的样品溶液添加于17孔10％～20％的Super SepTMAce(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，使用2D-银染试剂II(COSMO BIO CO.,LTD)进行银染。首先，凝胶在40mL定影液-I(50％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)和40％水(BMS))中振动固定20分钟。然后，凝胶在40mL定影液-Ⅱ(30％甲醇(Wako)-10％乙酸(Wako)，5％固定剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和55％超纯水(BMS))中振动固定30分钟。然后，在40mL预处理液(50％甲醇(Wako)，5％预处理试剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和45％超纯水(BMS))通过振动进行预处理20分钟。凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，使用40mL银染溶液(5％染色液A(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD)，5％染色液B(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和90％超纯水(BMS))染色30分钟，然后用40mL超纯水(BMS)洗涤5分钟。重复洗涤3次。凝胶使用40mL显影液(5％显影原液(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD.)和95％超纯水(BMS))显影8分钟，并添加2mL终止溶液(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD.))终止显影。最后，凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，并使用扫描仪(GT-X900,EPSON)扫描图像(参见图19)。
[实施例22]非还原的条件下MC-GPP的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
非还原的条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的MC-GPP进行分析。具体地，添加10μL Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到10μL纯化的MC-GPP中，并于98℃热处理5分钟(DTU-18，TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM Ace(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取15μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTM Ace(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，使用2D-银染试剂II(COSMO BIO CO.,LTD)进行银染。首先，凝胶在40mL定影液-I(50％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)和40％水(BMS))中振动固定20分钟。然后，凝胶在40mL定影液-Ⅱ(30％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)，5％固定剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和55％超纯水(BMS))中振动固定30分钟。然后，在40mL预处理液(50％甲醇(Wako)，5％预处理试剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和45％超纯水(BMS))通过振动进行预处理20分钟。凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，使用40mL银染溶液(5％染色液A(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD)，5％染色液B(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和90％超纯水(BMS))染色30分钟，然后用40mL超纯水(BMS)洗涤5分钟。重复洗涤3次。凝胶使用40mL显影液(5％显影原液(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD.)和95％超纯水(BMS))显影8分钟，并添加2mL终止溶液(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIOCO.,LTD.))终止显影。最后，凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，并使用扫描仪(GT-X900,EPSON)扫描图像(参见图20)。
[实施例23]MC-GPP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的MC-GPP进行分析。具体地，添加10μL非变性样品缓冲液(BIO-RAD)到10μL纯化的MC-GPP中。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM Ace(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHIPURE CHEMICALS CO.,LTD)，取15μL制备的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTMAce(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO,LTD)。然后，使用2D-银染试剂II(COSMO BIO CO.,LTD)进行银染。首先，凝胶在40mL定影液-I(50％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)和40％水(BMS))中振动固定20分钟。然后，凝胶在40mL定影液-Ⅱ(30％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)，5％固定剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和55％超纯水(BMS))中振动固定30分钟。然后，在40mL预处理液(50％甲醇(Wako)，5％预处理试剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和45％超纯水(BMS))中通过振动进行预处理20分钟。凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，使用40mL银染溶液(5％染色液A(2D-银染试剂II，COSMO BIOCO.,LTD)，5％染色液B(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和90％超纯水(BMS))染色30分钟，然后用40mL超纯水(BMS)洗涤5分钟。重复洗涤3次。凝胶使用40mL显影液(5％显影原液(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD.)和95％超纯水(BMS))显影8分钟，并添加2mL终止溶液(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD.))终止显影。最后，凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，并使用扫描仪(GT-X900,EPSON)扫描图像(参见图21)。
[实施例24]还原条件下进行MC-GPP的蛋白质印迹
由于MC-GPP的C-末端侧具有His-标记，所以抗His抗体能与它结合。利用该特性，在还原条件下进行蛋白质印迹，并通过化学荧光检测和鉴定纯化的MC-GPP。具体地，添加10μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到10μL纯化的MC-GPP中，在98℃加热5分钟进行还原(DTU-18,TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTM Ace(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURECHEMICALS CO.,LTD)，取15μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTMAce(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO,LTD)。然后，从玻璃平板取出凝胶，并在振动(Wave-S1,TAITEC)下在10mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。边振动(Wave-S1,TAITEC)边将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL甲醇(Wako)中浸泡15秒、10mL超纯水(ELGA)中浸泡2分钟、10mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在转移装置中(TRANS-BLO,SD SEMI-DRY TRANSFER CELL,BIO-RAD)，从负极侧依次铺放转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))浸泡的滤纸(Extra Thick BlotPaper CriterionTM XL Size,BIO-RAD)、Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、凝胶和滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM XL Size，BIO-RAD)，并盖上盖子，以80mA电泳90分钟(PowerPac HCTM,BIO-RAD)，以转移分离的蛋白到Immobilon-P转移膜上(MILLIPORE)。转移以后，Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL ImmunoBlock(Laboratory ProductDivision of Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)中浸泡并于4℃封闭18小时，然后在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯,Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤5分钟，3次。用10mL用包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)稀释1000倍的6-His单克隆抗体(COVANCE)与膜上的蛋白在振动(Wave-S1,TAITEC)下于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜5分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加10mL在包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中稀释5000倍的山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP(Jackson ImmunoResearch)，并在振动(Wave-S1,TAITEC)下于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在24mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜10分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加2mL Immobilon Western化学荧光HRP底物(MILLIPORE)用于化学荧光，使用光-捕获ATTO冷却CCD摄影系统(ATTO)，以它的常规设置拍摄30秒照片(参见图22)。
[实施例25]非还原条件下MC-GPP的蛋白质印迹
由于MC-GPP的C-末端侧链具有His-标记，所以抗His抗体能与它结合。利用该特性，在非还原条件下进行蛋白质印迹，通过化学荧光检测和鉴定纯化的MC-GPP。具体地，添加10μL Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)到10μL纯化的MC-GPP中，于98℃热处理5分钟(DTU-18,TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17孔5％～20％的Super SepTMAce(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取15μL热处理过的样品溶液添加于17孔5％～20％的Super SepTM Ace(Wako)，并以40mA电泳55分钟(MyRun,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，从玻璃平板取出凝胶，并在振动(Wave-S1,TAITEC)下将其在转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。边振动(Wave-S1,TAITEC)边将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL甲醇(Wako)中浸泡15秒、10mL超纯水(ELGA)中浸泡2分钟、10mL转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))中浸泡5分钟。在转移装置中(TRANS-BLO,SD SEMI-DRY TRANSFER CELL,BIO-RAD)，从负极侧依次铺放转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycine缓冲液(BIO-RAD))浸泡的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM XL Size,BIO-RAD)、Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、凝胶和滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM XLSize，BIO-RAD)，并盖上盖子，以80mA电泳90分钟(PowerPac HCTM,BIO-RAD)，以转移分离的蛋白到Immobilon-P转移膜上(MILLIPORE)。转移以后，Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)在10mL ImmunoBlock(Laboratory Product Division of Dainippon Sumitomo PharmaCo.,Ltd.)中浸泡并于4℃封闭18小时，然后在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯,Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤5分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。用10mL用包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)稀释1000倍的6-His单克隆抗体(COVANCE)与膜上的蛋白在振动(Wave-S1,TAITEC)下于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在10mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜5分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加10mL在包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中稀释5000倍的山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP(Jackson ImmunoResearch)，并在振动(Wave-S1,TAITEC)下于室温反应1小时。除去未结合的抗体以后，在24mL包含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯，Wako)的PBS(Wako)中振动洗涤该膜10分钟(Wave-S1,TAITEC)，3次。添加2mL ImmobilonWestern化学荧光HRP底物(MILLIPORE)用于化学荧光，使用光-捕获ATTO冷却CCD摄影系统(ATTO)，以它的常规设置拍摄30秒照片(参见图23)。
[实施例26]MC-GPP和天然存在的人去端肽胶原的胃蛋白酶消化
形成三螺旋结构的胶原能抵抗胃蛋白酶的剪切。因此，用胃蛋白酶在酸性条件下对纯化的MC-GPP、天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)和纯化的纤维性微胶原(实施例7)进行消化，并从SDS聚丙烯酰胺电泳图像证实了对胃蛋白酶剪切的抗性。更具体地说，添加3μL 0.3M盐酸溶液到各10μL纯化的MC-GPP(0.028mg/mL)、天然存在的人I型去端肽胶原(胶原，I型，酸溶性的，来自人皮肤，SIGMA-ALDRICH)(0.1mg/mL)或纤维性微胶原(实施例7)(0.1mg/mL)中以调节pH到2，添加3μL胃蛋白酶(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)溶液(转变成摩尔时，胃蛋白酶的含量是每种蛋白的3倍)，并于20℃进行胃蛋白酶消化2小时(2720热循环仪，Applied Biosystems)。此处，制备没有添加胃蛋白酶的每个样品的制品，单独的胃蛋白酶(胃蛋白酶，来自猪胃粘膜，3370单位/mg蛋白；SIGMA-ALDRICH)(与用于消化每个样品的含量相同的含量)的制品，不含样品和胃蛋白酶的制品用作对照。添加10mM乙酸溶液代替胃蛋白酶溶液或样品，并于20℃孵育2小时。添加1μL 1M Tris(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(三氨基甲烷)；Wako)溶液以终止反应，并通过4℃孵育18小时对胶原进行不可逆地再纤维化。添加17μL包含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD)，于98℃加热5分钟进行还原(DTU-18,TAITEC)。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和Super SepTMAce 10％～20％17孔(Wako)置于电泳槽中(DPE-1020,DAIICHI PURE CHEMICALS CO.,LTD)，取18μL热处理过的样品溶液添加于17孔10％～20％的Super SepTM Ace(Wako)，并以40mA电泳55分钟(My Run,COSMO BIO CO.,LTD)。然后，使用2D-银染试剂II(COSMO BIOCO.,LTD)进行银染。首先，凝胶在40mL定影液-I(50％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)和40％水(BMS))中振动固定20分钟。然后，凝胶在40mL定影液-Ⅱ(30％甲醇(Wako)，10％乙酸(Wako)，5％固定剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD)和55％超纯水(BMS))中振动固定30分钟。在40mL预处理液(50％甲醇(Wako)，5％预处理试剂(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIOCO.,LTD)和45％超纯水(BMS))中通过振动进行预处理20分钟。凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，使用40mL银染溶液(5％染色液A(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD.)，5％染色液B(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD.)和90％超纯水(BMS))染色30分钟，然后用40mL超纯水(BMS)洗涤5分钟。重复洗涤3次。凝胶使用40mL显影液(5％显影原液(2D-银染试剂II，COSMO BIO CO.,LTD.)和95％超纯水(BMS))显影8分钟，并添加2mL终止溶液(2D-银染试剂Ⅱ，COSMO BIO CO.,LTD.))终止显影。最后，凝胶用40mL超纯水(BMS)洗涤10分钟，并使用扫描仪(GT-X900,EPSON)扫描图像(参见图24)。使用ImageJ，对添加MC-GPP、胃蛋白酶消化的MC-GPP、刚好与用于消化MC-GPP的含量相等含量的胃蛋白酶、纯化的纤维性微胶原(实施例7)、胃蛋白酶消化的纤维性微胶原(实施例7)、刚好与用于消化纤维性微胶原的含量相等含量的胃蛋白酶(实施例7)的泳道中的条带进行分析(参见图25)。
结果，天然存在的人I型去端肽胶原没有被胃蛋白酶消化剪切。纯化的纤维性微胶原在接近50kDa处显示了条带，但是除了胶原结构域以外的区域都被胃蛋白酶消化剪切和除去，以致在大约30kDa处观察到胶原结构域的条带。同样对于MC-GPP，除了胶原结构域以外的条带都被除去，以致在接近30kDa处观察到胶原结构域的条带。上述揭示了MC-GPP能抵抗胃蛋白酶剪切，并正确地折叠成三螺旋结构，而且表明SP-D的富含半胱氨酸的结构域的存在导致胶原部分的三螺旋结构的形成。
工业实用性
使用哺乳动物细胞作为宿主，本发明可提供高水准的具有与天然存在的胶原类似的三螺旋结构且比天然存在的胶原更容易处理的人胶原类似物、能生产它的表达载体和生产人胶原类似物的细胞。
本发明的生产方式不仅能用于胶原，而且能用于具有三螺旋结构的蛋白，如胶原凝集素。
由于本发明的胶原类似物具有低于天然存在的胶原的分子量，所以它们更容易纯化和处理。这些具有三螺旋结构的新的胶原类似物被认为具有与已知的胶原不同的特性，而且期待它们作为新的生物材料的应用。
Claims (11)
1.具有三螺旋结构的重组蛋白作为胶原类似物的用途，其中该蛋白包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸从氨基末端依次包含下列(i)～(v)：
(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；
(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；
(iii)人胶原的胶原结构域基因；
(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和
(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因。
2.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的信号肽结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的多核苷酸。
3.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的多核苷酸。
4.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的颈结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的颈结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的多核苷酸。
5.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的糖识别结构域基因是人甘露聚糖结合凝集素(MBL)的糖识别结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:7的多核苷酸。
6.权利要求1的用途，其中人胶原的胶原结构域基因包含至少一种或多种α-链人胶原的胶原结构域基因。
7.权利要求1的用途，其中人胶原的胶原结构域基因是包含α-链人胶原的人I型胶原的胶原结构域基因。
8.权利要求6或7的用途，其中α-链人胶原的胶原结构域基因是包含核苷酸序列SEQ IDNO:8的多核苷酸。
9.权利要求1的用途，其中该蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
10.权利要求1的用途，其中该多核苷酸是包含核苷酸序列SEQ ID NO:3的多核苷酸。
11.一种具有三螺旋结构的重组蛋白，其包含由核苷酸序列SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列。
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