JP4115085B2

JP4115085B2 - アミノ酸修飾ポリペプチド

Info

Publication number: JP4115085B2
Application number: JP2000549707A
Authority: JP
Inventors: エリオットエイグルースキン; ダグラスディービュークター; グアングイーツァン; ケヴィンコーノリー
Original assignee: United States Surgical Corp
Current assignee: United States Surgical Corp
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: WO1999060099A1; AU746967B2; AU7581398A; JP2002515241A; DE69832908D1; DE69832908T2; EP1080182B1; CA2328423C; ES2252838T3; CA2328423A1; EP1080182A4; US5821089A; EP1080182A1

Description

【０００１】
1. 技術分野
ポリペプチドの特性を増強する、あるいは、改変するようなアミノ酸を取り込んだ、操作されたポリペプチド。
【０００２】
2. 関連技術の説明
遺伝子操作は、ある生物体から別の生物体へとポリペプチド産生を移すことを可能とする。その場合、元の宿主に固有の産生装置の一部がレシピエントに移植される。しばしば、元の宿主は、レシピエントに含まれないまたは導入されないようなポリペプチド産生に関連したある独自のプロセシング経路を発達させている。例えば、哺乳類細胞は、システムのタンパク質産物に独自の特性を付与する翻訳後酵素システムの複合体セットを含んでいることはよく知られている。通常哺乳類細胞によって産生されるタンパク質をコードしている遺伝子が細菌又は酵母細胞に導入される場合、このタンパク質は、このような翻訳後修飾を受けず、このタンパク質は当初意図されたようには機能しないことがある。
【０００３】
通常、生体細胞におけるポリペプチド又はタンパク質の合成過程は、DNAのRNAへの転写及びRNAのタンパク質への翻訳を含んでいる。３つの形態のRNAがタンパク質合成に関与している：メッセンジャーRNA(mRNA)は、遺伝情報をリボソームRNA(rRNA)から作られているリボソームに伝える一方で、トランスファーRNA(tRNA)は、細胞プールの遊離アミノ酸に連結している。アミノ酸／tRNA複合体は、mRNAのコドンの隣に並び、実際の認識及び結合はtRNAにより媒介される。細胞は、組み合わされて種々の順列配列でタンパク質へ取り込まれる最大２０種のアミノ酸を含むことができる。各アミノ酸は、他の19種のアミノ酸と区別され、かつアミノアシル-tRNAシンテターゼとして知られている酵素によりｔRNAに装荷さる。原則として、アミノ酸／tRNA複合体は、極めて特異的であり、通常的確な立体化学的配置を持つ分子のみが、特定のアミノアシル-tRNAシンテターゼにより作用を受ける。
【０００４】
多くの生体細胞において、いくつかのアミノ酸が周囲環境から取入れられ、その一部は細胞内において前駆体から合成され、次に細胞の外部から同化される。ある場合には、細胞は栄養要求性であり、すなわち、通常の代謝及び繁殖が必要とする最小限のもの以外の特異的増殖物質を必要とし、これを周囲環境から得なければならない。いくつかの栄養要求株は、特定のアミノ酸を供給するために外部環境に左右される。この特徴は、アミノアシル-tRNAシンテターゼの立体化学特性に関する前述の規則に対する比較的稀な例外を利用することで、ある種のアミノ酸アナログの、栄養要求株によって産生されるタンパク質への取込みを可能にする。例えば、プロリンはこのような例外であり、すなわちプロリル-tRNA複合体の合成に寄与するアミノ酸活性化酵素は、他のものほど特異的ではない。その結果ある種のプロリンアナログが、細菌、植物及び動物の細胞システムに取込まれる。Tanら、「プロリンアナログは培養においてヒトヒフ繊維芽細胞増殖及びコラーゲン産生を阻害する(Proline Analogs Inhibit Human Skin Fibroblast Growth and Collagen Production in Culture)」、Journal of Investigative Dermatology、80:261-267(1983)を参照のこと。
【０００５】
例えばNorenら、「非天然アミノ酸のタンパク質への位置指定取込みの一般的方法(A General Method For Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino Acids Into Protein)」、Science、244：182-188（1989）において、非天然アミノ酸をタンパク質に取込む方法が説明されており、ここでは、化学的にアシル化されたサプレッサーtRNAを使用して、停止コドンを問題のコドンをコードしている残基に置換したことに対応してアミノ酸が挿入される。更にDoughertyら、「周期的セレノメチオニン残基を含有する遺伝子操作された反復ポリペプチドの合成(Synthesis of a Genetically Engineered Repetitive Polypeptide Containing Periodic Selenomethionine Residues)」、Macromoleculus、26(7):1779-1781(1993)も参照できるが、これは大腸菌（E.coli）メチオニン栄養要求株にセレノメチオニン含有培地を施し、細胞によって産生された全てのタンパク質においてセレノメチオニンが完全にメチオニンと置換され得ることを実験データを基に仮定している。
【０００６】
cis-ヒドロキシ-L-プロリンを使用して、培養された正常ヒフ繊維芽細胞（Tanら、前掲）及び鶏胚由来の腱細胞（Uittoら、「cis-4-ヒドロキシ-L-プロリンを含有するプロコラーゲンポリペプチドは、過剰グリコシル化されかつ非らせんプロ-γ-鎖として分泌される(Procollagen Polypeptide Containing cis-4-hydroxy-L-proline are Overglycosylated and Secreted as Nonhelical Pro-γ-Chains)」、Archives of Biochemistry and Biophysics、185:1:214-221(1978)を参照）のような真核細胞への取込みによるコラーゲンに対するその作用を試験した。しかし研究者達は、trans-4-ヒドロキシプロリンが、原核細胞E. coliのプロリン特異性tRNAに連結しないことを発見した。Papasら、「大腸菌のプロリンtRNAへのアミノ酸結合の分析(Analysis of the Amino Acid Binding to the Proline Transfer Acid Ribonucleic Synthetase of Escherichia coli)」、Journal of Biological Chemistry、245:7:1588-1595(1970)を参照のこと。別の不首尾に終わったtrans-4-ヒドロキシプロリンを原核細胞に取込む試みは、Demingら、「プロリンアナログの人工タンパク質へのin vitro取込み(In Vitro Incorporation of Proline Analogs into Artificial Proteins)」、Poly. Mater. Sci. Engin. Proceed.、71:673-674(1994)に記載されている。Demingらは、特定のプロリンアナログ、すなわちL-アゼチジン-2-カルボン酸、L-γ-チアプロリン、3,4-デヒドロプロリン、及びL-trans-4-ヒドロキシプロリンのE. coli細胞において発現される人工タンパク質への取込みの可能性を研究し報告している。L-アゼチジン-2-カルボン酸、L-γ-チアプロリン及び3,4-デヒドロプロリンのみが、in vivoにおいてE. coliのタンパク質へ取込まれたとして報告されている。
【０００７】
I型コラーゲンは、線維状、間質型コラーゲンの最も豊富な形であり、細胞外マトリックスの主成分である。コラーゲンモノマーは、Gly-X-Yトリプレットの反復配列として約1000個のアミノ酸残基からなる。X及びY位のおよそ35％が、プロリン及び4-ヒドロキシプロリンで占拠されている。コラーゲンモノマーは、1本のα2鎖及び2本のα1鎖からなる三重らせんへ会合している。三重らせんは会合して、配向した強固な束(tight bundle)となった繊維になっている。コラーゲン線維束は更に集合し、細胞外マトリックスへのスカフォールド(scafold)を形成する。
【０００８】
哺乳類細胞において、コラーゲンの翻訳後修飾はその最終的な化学的及び物理的特性に寄与しており、これはプロ領域(proregion)のタンパク質分解性消化、リシン及びプロリンのヒドロキシル化、並びにヒドロキシル化されたリシンのグリコシル化を含んでいる。コラーゲンのタンパク質分解性消化は、N及びC末端のプロ領域の切断に関連している。プロリンのヒドロキシル化がコラーゲンの力学的特性に不可欠であることはわかっている。低レベルの4-ヒドロキシルプロリンを有するコラーゲンは、壊血病に関連した続発症により明示されるように、力学的特性が不良である。4-ヒドロキシプロリンは、ポリペプチド骨格において、水素結合を介し、かつC-N結合のまわりの回転を制限することにより、三重らせんに安定性を加える。安定構造が存在しない場合、天然の細胞酵素は、コラーゲンポリペプチドの分解を招く。
I型コラーゲンの構造的特質は、その一般に認識された生体適合性と共に、コラーゲンを望ましい手術用インプラント材料にする。コラーゲンは、ウシのヒフ又は腱から精製され、かつ止血鉗子、移植用ゲル、薬物送達ビヒクル及び骨代用品を含む様々な医療用具の形で使用される。しかし、ヒトにウシコラーゲンが移植される場合、即時型又は遅延型免疫応答を引き起こすことがある。
【０００９】
従って、研究者達は、その構造的特質を全て伴うヒト組換えコラーゲンを遺伝子操作により商業的量で作製することを試みてきた。残念ながら、E. coliのようなタンパク質の商業的大量生産者によるコラーゲンの産生は成功していない。主要な問題点は、E. coliには存在しない酵素によるコラーゲンの大規模な翻訳後修飾である。E. coli細胞がヒドロキシル化されていないコラーゲンプロリンのプロリンヒドロキシル化を提供することができないということは、商業的量のしっかりした構造のコラーゲンの製造を妨げている。
【００１０】
発明の概要
細胞によって産生されるポリペプチドへアミノ酸アナログを取込ませる方法であって、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供すること、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸アナログを含有する増殖培地を提供すること、および、前記細胞をそれらの増殖培地に接触させ、そこで前記少なくとも1種のアミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつ少なくとも1種のポリペプチドに取込まれることを含む、前記方法が提供される。
更に、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞により産生されるポリペプチド中のアミノ酸の、アミノ酸アナログによる置換法も提供され、これは、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供すること、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸アナログを含有する増殖培地を提供すること、および前記細胞を前記増殖培地に接触させ、そこで前記少なくとも1種のアミノ酸が細胞に同化され、かつ少なくとも1種のポリペプチドにおいて少なくとも1個の天然のアミノ酸と置換され取込まれることを含む。
【００１１】
ポリペプチドへ取込まれるアミノ酸アナログ量を制御する方法も提供され、これは、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される少なくとも第一の細胞を提供すること、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸アナログの第一の所定量を含有する増殖培地を提供すること、第一の細胞を第一の増殖培地と接触させ、そこで第一のアミノ酸アナログ量が第一の細胞に同化され、かつ少なくとも1種のポリペプチドに取込まれせることを含む。少なくとも原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される第二の細胞も、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸アナログの第二の所定量を含有する第二の増殖培地と共に提供され、かつ少なくとも第二の細胞を第二の増殖培地と接触させ、そこで第二のアミノ酸アナログ量が第二の細胞に同化され、かつ少なくとも1種のポリペプチドに取込まれる。
【００１２】
更に、細胞により産生される組換えポリペプチドの安定性を増大する方法が提供され、これは、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供すること、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸アナログを含有する増殖培地を提供すること、および、前記細胞を前記増殖培地に接触させ、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつ組換えポリペプチドに取込まれ、これによりポリペプチドを安定化させることを含む。
細胞へのアミノ酸アナログの取込を増大させる、及び、アミノ酸アナログ／tRNA形成を生じさせる方法も提供され、これも同じく、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供すること、trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸アナログを含有する高張の増殖培地を提供すること、前記細胞を前記高張の増殖培地に接触させること、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつアミノ酸アナログ／tRNA複合体へ取込まれることを含む。前述の他のいずれかの方法において、細胞へのアミノ酸アナログの取り込み増大のために、場合により高張の増殖培地を取り入れることができる。
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞、並びにtrans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸アナログを含有する高張の培地を含む組成物も提供される。
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
前掲のPapesら及びDemingら両者とは対照的に、原核細胞及び真核細胞は、意外にもタンパク質にtrans-4-ヒドロキシプロリンを同化及び取込むようにすることができる。このような同化及び取込みは、ポリペプチドの構造及び機能が、組換え宿主の本来のタンパク質産生システムによってはもたらされないプロリンの翻訳後のヒドロキシル化によって決まる場合に特に有用である。従って、E. coliのような原核細胞、並びに通常プロリンをヒドロキシル化しないサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・カールスベルグンシス(Saccharomyces carlsbergnsis)及びシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のような真核細胞、並びに、更に、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、トリコプラシアニ(Trichoplasia ni)、ヘリオシス・ビレスセンス(Heliothis virescens)、ボンビック・モリ(Bombyx mori)を含む鱗翅目細胞株のような昆虫細胞であって、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞のような真核細胞；その構造及び機能がヒドロキシル化によって左右されるある種のポリペプチドを充分に産生することができないCHO細胞、COS細胞及びNIH3T3細胞を、ヒドロキシル化されたプロリンを有するポリペプチドを産生するようにすることができる。取込みは、例えば最初にアミノ酸をプロリンへ変更し、その後trans-4-ヒドロキシプロリンへ置換できる新たなプロリン位置を作り出すことによってポリペプチドへtrans-4-ヒドロキシプロリンを追加すること、または、ポリペプチド中の天然に生じるプロリンをtrans-4-ヒドロキシプロリンに置換することを含む。
【００１４】
大量生産生物体における組換えポリペプチド作製法はよく知られたものである。プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体のような複製可能な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を一方の宿主から他方へと輸送するために常用されている。遺伝子クローニング、発現ベクターへの遺伝子ライゲーション及びこのような発現ベクターによる宿主細胞の形質転換のいずれの既知の方法も本発明の説明を進めるために使用することができると考えられる。
化学的及び物理的特性がtrans-4-ヒドロキシプロリンによって左右されるポリペプチドへのtrans-4-ヒドロキシプロリンの取込みは、プロリンのtrans-4-ヒドロキシプロリンへの転換のための適当なシステムを有さない産生システムにおいて有用であるのみではなく、更に通常はtrans-4-ヒドロキシプロリンを有さないポリペプチドの構造及び機能の研究においても有用である。本開示により、以下のアミノ酸アナログも、取込むことができると考えられる：trans-4-ヒドロキシプロリン、3-ヒドロキシプロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン及びそれらの組合せ（以後「アミノ酸アナログ」と称する）。原核細胞及び真核細胞の使用は、これらがこのようなポリペプチドの比較的安価な大量生産を可能にするので望ましい。これらのアミノ酸アナログをいずれの所望のポリペプチドにも取込むことができると考えられている。好ましい実施態様において、原核細胞及び真核細胞は、増殖培地中にアミノ酸アナログを添加する前に、培地中のプロリン量を減少又は除去することにより、プロリンに対して飢餓状態にされる。
【００１５】
例えばニューイングランドバイオラボ社から市販されている、図１に示されたようなプラスミドpMAL-c2のような、マルトース結合タンパク質(MBP)の遺伝子を含む発現ベクターは、タンパク質合成及び同化作用が外部から供給されたプロリンによって決まるような、E. coliのような原核細胞プロリン栄養要求株又はS. cerevisiaeのような真核細胞の栄養要求株に形質転換される。原核細胞において使用するための他の好ましい発現ベクターは、pKK-223（ファルマシア社）、pTRC（インビトロゲン社）、pGEX（ファルマシア社）、pET（ノバゲン社）及びpQE（キアゲン社）を含む市販されているプラスミドである。プロリルtRNAシンテターゼは、前述のアミノ酸アナログのいずれか一つとプロリンtRNAの誤アシル化を行うのに十分な程曖昧である(promiscuaus)ので、タンパク質合成におけるプロリンのアミノ酸アナログへの置換が生じる。形質転換された細胞の細胞内取込みにおいてプロリンと競合するのに充分量、すなわち典型的には約0.001M〜約0.1Mの範囲であり、より好ましくは約0.005M〜約0.5Mのアミノ酸アナログ（複数）が増殖培地に添加される。充分な時間が経過した後、一般に約30分〜約24時間又はそれ以降、アミノ酸アナログ（複数）が、細胞により同化され、かつタンパク質合成経路に取込まれる。図２に示されるように、trans-4-ヒドロキシプロリンの細胞内濃度は、増殖培地内のtrans-4-ヒドロキシプロリン濃度が上昇するにつれて上昇する。好ましい実施態様において、原核細胞および／または真核細胞は、増殖培地中にアミノ酸アナログが添加されるに先立ち、培地中のプロリン量を減少又は除去することによりプロリンについて飢餓状態とされる。
【００１６】
ヒトI型(α1)コラーゲンの遺伝子を含む発現ベクター（DNA配列は図３及び3Aに示す；プラスミド地図は図４に示す）は、タンパク質合成及び同化作用が外部から供給されたプロリンによって決まる原核細胞または真核細胞のプロリン栄養要求株に形質転換される。前述のように、プロリルtRNAシンテターゼは、アミノ酸アナログ（複数）とプロリンtRNAの誤アシル化を行うのに十分な程曖昧であるので、アミノ酸アナログ（複数）の置換が生じる。前述の培地中のアミノ酸アナログ（複数）の量が、この場合も適用可能である。
ヒトI型(α1)コラーゲンの断片をコードしているDNAを含む発現ベクター（例えば、DNA配列は図５に示し、プラスミド地図は図６に示す）は、前述のように原核細胞または真核細胞のプロリン栄養要求株に形質転換される。同様に、コラーゲン様ポリペプチドをコードしているDNAを含む発現ベクター（例えば、DNA配列は図７に示し、アミノ酸配列は図８に示し、プラスミド地図は図９に示す）を使って、前述のように原核細胞または真核細胞の栄養要求株が形質転換される。コラーゲン様ペプチドとは、コラーゲンと少なくとも部分的な相同性を有し、かつコラーゲンに類似した化学的及び物理的特性を示すものである。従って、コラーゲン様ペプチドは、例えばX及びY位の約35％がプロリン及び4-ヒドロキシプロリンで占拠されているようなGly-X-Yトリプレットの反復配列からなる。本願明細書に記された特定の好ましいコラーゲン断片及びコラーゲン様ペプチドは、細胞外マトリックスに集成(assembling)することが可能である。前述のようなコラーゲン断片及びコラーゲン様ペプチドの両方において、プロリルtRNAシンテターゼは、アミノ酸アナログ（複数）とプロリンtRNAの誤アシル化を行うのに十分な程曖昧であるので、アミノ酸アナログ（複数）との置換が生じる。前述のアミノ酸アナログ（複数）量が、この場合も適用可能である。
【００１７】
本願明細書の開示によれば、コラーゲン、コラーゲン断片又はコラーゲン様ペプチドドメインを有する任意のポリペプチドを、アミノ酸アナログ（複数）を取込むように作出することができると考えられている。このようなポリペプチドには、コラーゲン、コラーゲン断片又はコラーゲン様ペプチドドメイン並びに糖タンパク質、タンパク質、ペプチド及びプロテオグリカンのような1種以上の生理活性物質を取込む領域を有するドメインが含まれる。生理活性物質は、生体に存在する生理的機能の制御又は修飾を発揮する。生理活性物質には、ホルモン、増殖因子、酵素、リガンド及び受容体が含まれる。生理活性物質の多くの活性ドメインは同定されかつ単離されている。コラーゲン、コラーゲン断片又はコラーゲン様ペプチドドメインを有するポリペプチドも同じく、このような生理活性物質の活性断片である1個以上の生理的活性ドメインを取込むドメインを有することができると考えられている。従って、原核細胞のプロリン栄養要求株又は真核細胞のプロリン栄養要求株の適当な発現ベクターを使った形質転換、並びに形質転換された栄養要求株の少なくとも1種のアミノ酸アナログを含有する増殖培地との接触により、アミノ酸アナログ（複数）を取込むようにキメラタンパク質が作製される。例えば、コラーゲン／骨形成因子(BMP) キメラ構築物又は様々なコラーゲン／増殖因子キメラ構築物が、本発明において有用である。このような増殖因子はよく知られており、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血小板由来増殖因子などを含む。図10は、コラーゲンをコードしているDNA、コラーゲン断片をコードしているDNA又はコラーゲン様ペプチドをコードしているDNAの3'末端に融合されたBMPのDNAを示している。図11は、コラーゲン／BMP構築物を含むpCBCプラスミド地図を示している。好ましい実施態様において、コラーゲン、コラーゲン断片又はコラーゲン様ペプチドドメインを有するタンパク質は、手術用インプラントとして使用することができる細胞外マトリックスを形成するように集成されている。
【００１８】
別の側面において、標的細胞へのアミノ酸アナログ（複数）輸送の量は、増殖培地の張度を制御することによって調節することができる。図12に示したように、高張の増殖培地は、trans-4-ヒドロキシプロリンのE. coliへ取込みを増加させる。増殖培地の浸透圧を増大する全ての既知の方法が、本願明細書における使用に適しており、これは塩化ナトリウム、KCl、MgCl₂などの塩、並びにスクロース、グルコース、マルトースその他のような糖、並びにポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、セルロースその他などのようなポリマー、並びにグリシンのようなアミノ酸の添加を含む。増殖培地の浸透圧の上昇は、アミノ酸アナログ（複数）のより大きい細胞内濃度、並びにアミノ酸アナログ（複数）のtRNAへのより高度の複合体化(complexation)を生じる。その結果、この細胞によって産生されるタンパク質は、アミノ酸アナログのより高度の取込みを達成している。図12は、等張及び高張の培地条件下でのプロリン及びヒドロキシプロリンのMBPへの取込の割合を、天然のMBPにおけるプロリンと比較して示している。この結果、増殖培地におけるアミノ酸アナログ（複数）の濃度の調節に加えて、浸透圧の操作は、前述のような原核細胞及び真核細胞へのそれらの取込みの調節、その結果としての標的ポリペプチドへの取込みを調節するための二面的な解決方法をもたらす。
【００１９】
ここで使用することのできる培地には、M9最少培地（ギブコライフテクノロジー社から入手）、LB培地、NZCYM培地、テリフィック培地（terrific broth）、SOB培地及びその他の当該技術分野においてよく知られた市販の増殖培地のいずれもが含まれる。
様々な組織に由来するコラーゲンは、trans-4-ヒドロキシプロリンを異なる量含有することができる。例えば、骨のようなより大きい強度が必要な組織については、ヒフのような低い強度が求められる組織のコラーゲンよりも、より多いtrans-4-ヒドロキシプロリン残基が含まれる。本システムは、コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン様ペプチド、並びに生理活性ドメインに融合されたコラーゲンドメイン、コラーゲン断片ドメイン、又はコラーゲン様ドメインを有するキメラペプチド中のtrans-4-ヒドロキシプロリン量を調節する方法を提供する。なぜなら、増殖培地中のtrans-4-ヒドロキシプロリン濃度の増減により、それに応じてこのようなポリペプチドに取込まれるtrans-4-ヒドロキシプロリン量が増減するからである。コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン様ペプチド及び前述のキメラペプチドは、所定のレベルのtrans-4-ヒドロキシプロリンを有するように発現することができる。この方法において、細胞外マトリックスの物理的特性は、最終用途の必要要件に応じて調節することができる。
【００２０】
組換え法により作出されたヒトのコラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン様ペプチド及び前述のキメラポリペプチドは、ヒト以外の動物から得られるコラーゲン及びその誘導体に勝る顕著な利点を有する。ヒト遺伝子を使用するので、このコラーゲンは医療用インプラントとしての状況において異種移植片として作用することがない。更に、天然のコラーゲンとは異なり、プロリンのヒドロキシル化の程度を予め設定することができる。この前例のない制御の程度は、三重らせんの安定化、線維形成及び生体活性に関するtrans-4-ヒドロキシプロリンの貢献の詳細な研究を可能にする。加えて所望のコラーゲン線維の強度を基にした医療用インプラントの設計が可能である。
下記の実施例は、例証を目的として記されており、本明細書における限定として解釈してはならない。
【００２１】
実施例１
膜横断輸送
アンピシリン耐性を付与されたプラスミド(pMAL-c2、図１)を有するE. coli株DH5α（supE44 ΔlacU169(φ80lacZ ΔM15)hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1）の培養物5mlを、コンフルエントになるまでルリア・ブロス中で増殖させた（接種後約16時間）。これらの細胞を用いて、M9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、全てのアミノ酸を20μg/mlで補充）500mlを含有する1L振盪フラスコに接種し、これをAU₆₀₀が1.0になるまで増殖させた（18〜20時間）。この培養物を二分し、細胞を遠心により収集した。一方の培養物からの細胞をM9培地250mlに、及び他方からのものを0.5M NaClを含有するM9培地250mlに再懸濁した。これらの培養物を、空気式振盪機において20分間37℃で(225rpm)平衡化し、25mlアリコート10個に分けた。これらの培養物を振盪機に戻し、蒸留水中の1Mヒドロキシプロリン125μlを各チューブに添加した。2、4、8、12及び20分後に、4本の培養チューブ（2本は等張、2本は高張）を、1μmポリカーボネートフィルターで減圧濾過し、これをすぐに蒸留水中に0.2M NaOH／2％SDSの1.2mlが入った2ml微量遠心チューブに移した。一晩溶解した後、チューブからフィルターを慎重に取り除き、かつ上清緩衝液をGrantの方法（Journal of Clinical Pathology、17:685(1964)）に従ってヒドロキシプロリンについてアッセイした。 trans-4-ヒドロキシプロリンの細胞内濃度対時間を、図２に図示した。
【００２２】
実施例２
膜横断輸送に対する塩濃度の作用
膜横断輸送に対する塩濃度の作用を決定するために、実施例１と同様の方法を行った。アンピシリン耐性を付与されたプラスミド(pMAL-c2、図１)を含むE. coli株DH5α（supE44 ΔlacU169(φ80lacZ ΔM15)hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1）の培養物5mlを、コンフルエントになるまでルリア・ブロス中で増殖させた（接種後約16時間）。これらの細胞を用いて、M9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、全てのアミノ酸を20μg/mlで補充）500mlを含有する1L振盪フラスコに接種し、これをAU₆₀₀が0.6になるまで増殖させた。この培養物を三等分し、各々の細胞を遠心により収集し、かつそれぞれ、M9培地150ml、0.5M NaClを含有するM9培地150ml、及び1.0M NaClを含有するM9培地150mlに再懸濁した。これらの培養物を、振盪機において20分間37℃で(225rpm)平衡化とし、25mlのアリコート6個に分けた。これらの培養物を振盪機に戻し、蒸留水中の1Mヒドロキシプロリン125μlを各チューブに添加した。5及び15分後に、9本の培養チューブ（3本は等張、3 x 0.5M NaCl、3 x 1.0M NaCl）を、1μmポリカーボネートフィルター上で減圧濾過し、これをすぐに蒸留水中に0.2M NaOH／2％SDSの1.2mlが入った2ml微量遠心チューブに移した。一晩溶解した後、チューブからフィルターを慎重に取り除きし、かつ上清緩衝液を前記Grantの方法に従ってヒドロキシプロリンについてアッセイした。
【００２３】
実施例３
E. coliにおけるプロリン飢餓条件の決定
アンピシリン耐性を付与されたプラスミドpMAL-cを含むプロリン栄養要求株E. coli株NM519(pro^-)を、M9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、プロリン以外の全てのアミノ酸を20μg/mlで、プロリンを12.5mg/lで補充）において増殖させ、AU₆₀₀が0.53AUで一定になるまで（接種後17時間）増殖させた。ヒドロキシプロリンを0.08Mになるよう添加し、1時間以上の期間にわたってOD₆₀₀が0.61AUになるまで増加することにより、ヒドロキシプロリンに依存した増殖が示された。
【００２４】
実施例４
プロリン飢餓条件下のE. coliにおけるタンパク質へのヒドロキシプロリンの取込み
マルトース結合タンパク質(MBP)をコードしているDNAを含むプラスミドpMAL-c2（ニューイングランドバイオラボ社から入手）を用いて、プロリン栄養要求株E. coli NM519(pro^-)を形質転換した。形質転換したNM519(pro^-)の1L培養物2つを、M9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、プロリン以外の全てのアミノ酸を20μg/mlで、プロリンは12.5mg/lで補充）中で増殖させ、かつAU₆₀₀が0.53になるまで（接種後約17時間）増殖させた。細胞を遠心により収集し、かつ1培養物中の培地を、0.08Mヒドロキシプロリンを含有する等量のM9培地で交換し、かつ第二の培養物は、0.08Mヒドロキシプロリン及び0.5M NaClを含有する等量のM9培地で交換した。1時間平衡に保った後、これらの培養物を、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドで誘導した。更に3.25時間増殖した後、細胞を遠心により収集し、10mM Tris-HCl(pH8)、1mM EDTA、100mM NaCl(TEN緩衝液)10ml中に再懸濁し、かつ凍結及び超音波処理により溶解した。この溶解液を、4mlアミロース樹脂スピンカラムの上を通過させ、カラムをTEN緩衝液10mlで洗浄し、その後結合したMBPを10mMマルトースを含有するTEN緩衝液2mlで溶離することによって、MBPを精製した。溶離した試料は、窒素下でアンプル中に等量の濃HCl(11.7M)と共に密封し、12時間120℃で加水分解した。活性炭により透明化した後、試料中のヒドロキシプロリン含量を、HPLC及び前記Grantの方法に従って測定した。trans-4-ヒドロキシプロリンの取込みパーセントを、MBPへのプロリンと比較し、図12に図示した。
【００２５】
実施例５
プロリン飢餓条件下での組込みベクターによるS. cerevisiaeにおけるタンパク質へのヒドロキシプロリンの取込み
先に実施例４に示した方法を、プロリン生合成経路を途絶させる組込みベクターを用いて酵母において行った。ヒトI型コラーゲン(α1)をコードしている遺伝子を、固有のシャトルベクターに、誘導性GAL10プロモーターの後ろに挿入した。このプロモーター／遺伝子カセットは、S. cerevisiaeプロリンシンテターゼ遺伝子由来の5'及び3'末端配列が側方にある。このプラスミドを5'及び3'の両末端領域において制限消化により直線状化し、プロリン−原栄養性S. cerevisiae株の形質転換に使用した。形質転換混合物を選択培地上に播種し、形質転換体を選択した。相同的組換え及び遺伝子破壊により、この構築物は、安定した組込みを形成すると同時にS. cerevisiae株をプロリン栄養要求性株へと転換する。単一の形質転換体を選択し、YPD培地上で30℃で、OD₆₀₀が2AUまで培養した。培養物を遠心し、細胞を、プロリン以外の全てのアミノ酸を補充した酵母除外(dropout)培地に再懸濁し、プロリン飢餓状態を示すOD₆₀₀一定まで培養した。その後、L-ヒドロキシプロリン0.08M及び2％(質量／体積(w/v))ガラクトースを添加した。培養物を更に6〜48時間増殖させた。細胞を遠心により収集し（5000rpm、10分間）、かつ機械的破壊により溶解した。ヒドロキシプロリン含有ヒトI型コラーゲン(α1)を、硫安分画及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００２６】
実施例６
プロリン飢餓条件下のS. cerevisiaeにおける、非組込みベクターによるタンパク質へのヒドロキシプロリンの取込み
先に実施例４に示した方法を、非組込みベクターを用いて酵母プロリン栄養要求株において行った。ヒトI型コラーゲン(α1)をコードしている遺伝子を、選択Ura⁺マーカー含むYEp24シャトルベクター中、誘導性GAL10プロモーターの後ろに挿入した。得られたプラスミドを、スフェロプラスト形質転換によりプロリン栄養要求株S. cerevisiaeに形質転換した。形質転換混合物を選択培地上にプレーティングし、形質転換体を選択した。単一の形質転換体を選択し、YPD培地上で30℃でOD₆₀₀が2AUまで培養した。培養物を遠心し、細胞を、プロリン以外の全てのアミノ酸を補充した酵母除外培地に再懸濁し、プロリン飢餓状態を示すOD₆₀₀一定まで培養した。その後、L-ヒドロキシプロリン0.08M及び2％(w/v)ガラクトースを添加した。培養物を更に6〜48時間増殖させた。細胞を遠心により収集し（5000rpm、10分間）、かつ機械的破壊により溶解した。ヒドロキシプロリン含有ヒトI型コラーゲン(α1)を、硫安分画及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００２７】
実施例７
バキュロウイルス発現システムにおけるタンパク質へのヒドロキシプロリンの取込み
ヒトI型コラーゲン(α1)をコードしている遺伝子を、pBacPAK8バキュロウイルス発現ベクター中、AcMNPVポリヘドロンプロモーターの後ろに挿入した。この構築物を、SF9細胞へ、直線状化されたAcMNPV DNAと共に、標準のリン酸カルシウム共沈殿法を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクタントを、10％FBSを補充したTNM-FH培地中で27℃で4日間培養した。この培地を収集し、組換えウイルス粒子をプラークアッセイにより単離した。組換えウイルスを用いて、プロリンを除き10％FBS及び0.08Mヒドロキシプロリンを補充したGrace培地で増殖しているSF9細胞1Lに感染させた。27℃で2〜10日間増殖させた後、細胞を遠心により収集し、かつ機械的破壊により溶解した。ヒドロキシプロリン含有ヒトI型コラーゲン(α1)を、硫安分画及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００２８】
実施例８
プロリン飢餓条件下のE. coliにおける、ヒトコラーゲンタンパク質へのヒドロキシプロリンの取込み
イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)-誘導性tacプロモーターの後ろに配置されたヒトI型コラーゲン(α1)の遺伝子配列（図３及び3A）をコードし、かつβ-ラクタマーゼもコードしているプラスミド（pHuCol、図２）を、Escherichia coli（大腸菌）プロリン栄養要求株NM519(pro^-)に、標準の熱ショック形質転換法により形質転換した。形質転換した培養物をアンピシリン100μg/mlを含有しているルリア培地上にプレーティングし、一晩増殖させた後、アンピシリン−耐性単一コロニーを用い、アンピシリン100μg/mlを含有しているLB 5mlに接種した。37℃で振盪しながら(225rpm)10〜16時間増殖させ、この培養物を用いて、1.5Lの振盪フラスコ中のM9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、プロリン以外の全てのアミノ酸を20μg/mlで、プロリンを12.5mg/lで補充）1Lに接種した。接種後、37℃、225rpmで15〜20時間培養した後、600nmでの光学濃度がおよそ0.5OD/mlで一定となった。細胞を遠心（5000rpm、10分間）により収集し、培地をデカントし、かつ細胞を100μg/mlアンピシリン、0.08M L-ヒドロキシプロリン及び0.5M NaClを含有するM9最少培地1L中に再懸濁した。37℃、225rpmで1時間増殖後、IPTGを1mM添加し、この培養物を更に5〜15時間増殖させた。細胞を遠心により収集し（5000rpm、10分間）、かつ機械的破壊により溶解した。ヒドロキシプロリン含有ヒトI型コラーゲン(α1)を、硫安分画及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００２９】
実施例９
プロリン飢餓条件下のE. coliにおける、ヒトコラーゲンタンパク質断片へのヒドロキシプロリンの取込み
イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)-誘導性tacプロモーターの後ろに配置されたヒトI型コラーゲン(α1)の最初の80個のアミノ酸の遺伝子配列（図５）をコードし、かつβ-ラクタマーゼもコードしているプラスミド（pHuCol-F1、図６）を、Escherichia coliプロリン栄養要求株NM519(pro^-)に標準の熱ショック形質転換法により形質転換した。形質転換した培養物をアンピシリン100μg/mlを含有しているルリア培地（Luria Broth）(LB)上にプレーティングし、一晩増殖させた後、アンピシリン−耐性単一コロニーを用いて、アンピシリン100μg/mlを含有しているLB 5mlに接種した。37℃で振盪しながら(225rpm)10〜16時間増殖させ、この培養物を用いて、1.5Lの振盪フラスコ中のM9最少培地（M9塩、2％グルコース、0.01mg/mlチアミン、100μg/mlアンピシリン、プロリン以外の全てのアミノ酸を20μg/mlで、プロリンを12.5mg/lで補充）1Lに接種した。接種後、37℃、225rpmで15〜20時間培養した後、600nmでの光学濃度がおよそ0.5OD/mlで一定となった。細胞を遠心（5000rpm、10分間）により収集し、培地をデカントし、かつ細胞を100μg/mlアンピシリン、0.08M L-ヒドロキシプロリン及び0.5M NaClを含有するM9最少培地1L中に再浮遊した。37℃、225rpmで1時間増殖した後、IPTGを1mM添加し、この培養物を更に5〜15時間増殖させた。細胞を遠心により収集し（5000rpm、10分間）、かつ機械的破壊により溶解した。ヒドロキシプロリン含有ヒトI型コラーゲン(α1)を、硫安分画及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００３０】
本願明細書において明らかにした実施態様は様々な改変を行うことができることは言うまでもない。例えば、原核細胞及び真核細胞により産生されるいずれのタンパク質も、本発明の開示に従い1個以上のアミノ酸アナログの取込みを行うことができると考えられる。従って前述の説明は、限定として解釈してはならず、単に好ましい実施態様を例証するものとして解釈すべきである。当業者は、本願明細書に添付されたクレームの範囲及び精神の範囲内のその他の変更を予想することができるであろう。
【００３１】
【配列表】
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：3181塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：1本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号１

（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：240塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号２

（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：100塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号３

（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４

（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号５

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、pMAL-c2を示すプラスミド地図である。
【図２】増殖培地におけるtrans-4-ヒドロキシプロリンを基にした細胞内ヒドロキシプロリンの濃度の経時図である。
【図３】図３及び図3Aは、ヒト１(α1)型コラーゲンをコードしているDNA配列を示す。
【図４】図４は、pHuColを示すプラスミド図である。
【図５】図５は、ヒト１(α1)型コラーゲン断片をコードしているDNA配列を示す。
【図６】図６は、pHuCol-F1を示すプラスミド図である。
【図７】図７は、コラーゲン様ペプチドをコードしているDNA配列を示す。
【図８】図８は、コラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、pCLPを示すプラスミド図である。
【図１０】図10は、成熟した骨形成因子タンパク質をコードしているDNA配列を示す。
【図１１】図11は、pCBCを示すプラスミド地図である。
【図１２】図12は、プロリン及びtrans-4-ヒドロキシプロリンのマルトース結合タンパク質への様々な条件下での取込み％を示すグラフである。

Claims

下記工程を含む、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞により産生されるポリペプチドへアミノ酸アナログを取込ませる方法：
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供する工程；
アミノ酸アナログであるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含有する高張増殖培地を提供する工程；及び
前記細胞を前記高張増殖培地と接触させ、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつ少なくとも１種のポリペプチドに取込まれる工程。
細胞がプロリン栄養要求株である、請求項１記載の方法。
細胞が、細菌細胞、酵母細胞及び昆虫細胞からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
少なくとも１種のポリペプチドが、少なくともコラーゲン分子の一部である、請求項１記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号１に示された核酸配列によってコードされている、請求項４記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号２に示された核酸配列によってコードされた断片である、請求項４記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号３に示された核酸配列によってコードされている、請求項４記載の方法。
少なくともコラーゲンの一部が、生理活性物質と融合している、請求項４記載の方法。
生理活性物質がＢＭＰである、請求項８記載の方法。
少なくとも１種のポリペプチドをコードしている核酸が、複製可能な発現ベクター上に保持されている、請求項１記載の方法。
複製可能な発現ベクターがプラスミドである、請求項１０記載の方法。
プロリン栄養要求株が、大腸菌及びサッカロミセス・セレビシアエからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
少なくとも１種のポリペプチドが、マルトース結合タンパク質分子の少なくとも一部である、請求項１記載の方法。
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、スクロース、グルコース、マルトース、ＰＥＧ、デキストラン、セルロース及びグリシンからなる群より選択される浸透圧上昇剤が増殖培地に添加される、請求項１記載の方法。
ＮａＣｌ範囲が、約０．５Ｍ〜約１Ｍである、請求項１記載の方法。
高張増殖培地が、細胞のプロリン飢餓を引き起こすプロリン量を含有する、請求項１記載の方法。
下記工程を含む、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞により産生されるポリペプチド中のアミノ酸アナログを置換する方法：
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供する工程；
アミノ酸アナログであるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含有する高張増殖培地を提供する工程；及び
前記細胞を前記高張増殖培地と接触させ、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつ少なくとも１種のポリペプチドにおいて少なくとも１個の天然のアミノ酸との置換として取込まれる工程。
下記工程を含む、細胞により産生された組換えポリペプチドの安定性を増大させる方法：
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞を提供する工程；
アミノ酸アナログであるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含有する高張増殖培地を提供する工程；及び
前記細胞を前記高張増殖培地と接触させ、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつ組換えポリペプチドに取込まれ、これにより前記ポリペプチドが安定化する工程。
下記工程を含む、細胞へのアミノ酸アナログの取込みを増大させ、及びアミノ酸アナログ／ｔＲＮＡ複合体の形成を生じさせる方法：
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される原核細胞を提供する工程；
アミノ酸アナログであるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含有する高張増殖培地を提供する工程；及び
前記細胞を前記高張増殖培地と接触させ、そこで前記アミノ酸アナログが前記細胞に同化され、かつアミノ酸アナログ／ｔＲＮＡ複合体へ取込まれる工程。
原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される細胞、並びにアミノ酸アナログであるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含有する高張増殖培地を含む組成物であって、前記高張増殖培地が前記アミノ酸アナログの細胞への取込を増大させるものである、前記組成物。