CN106046370A - 聚噁唑啉poz化合物、合成其的方法、以及靶分子‑poz偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚噁唑啉POZ化合物、合成其的方法、以及靶分子‑POZ偶联物。本发明公开了一种合成末端活化的聚噁唑啉POZ化合物的方法，所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物具有基本结构R1‑[N(COR7)CH2CH2]n‑S‑Qq‑X，所述方法包括步骤：(a)引发POZ聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的POZ聚合物；以及(b)用结构为R25S‑Dd‑X的硫醇盐终止所述POZ聚合物。本发明还公开了利用该方法制备的聚噁唑啉POZ化合物，另外还公开了通式为A‑B‑TM的水解稳定的靶分子‑POZ偶联物。

Description

聚噁唑啉POZ化合物、合成其的方法、以及靶分子-POZ偶联物
本申请是申请日为2008年2月28日、申请号为“200880013983.5”、发明名称为“活化的聚噁唑啉及包含该聚噁唑啉的组合物”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2007年2月28日提交的美国临时申请60/892,212的权益。
技术领域
本公开涉及聚噁唑啉衍生物、这类聚噁唑啉衍生物的制备中可用的合成方法和中间体、以及用这类聚噁唑啉衍生物产生的水解稳定的靶分子-聚噁唑啉偶联物。
背景技术
在现代药物科学中，聚合物修饰疗法已被证实具有高实用性。特别地，与聚乙二醇类(PEGs)偶联的蛋白质现已构成治疗一系列疾病的诸多很重要的疗法。由于聚合物修饰疗法的成功，故扩展具有这类应用的聚合物的范围、尤其是提供具有聚乙二醇所不具有的性质的聚合物是人们所感兴趣的。
发明内容
本发明提出了一种合成末端活化的聚噁唑啉POZ化合物的方法，所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物具有基本结构R1-[N(COR7)CH2CH2]n-S-Qq-X，所述方法包括步骤：
(a)引发POZ聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的POZ聚合物；以及
(b)用结构为R25S-Dd-X的硫醇盐终止所述POZ聚合物，
其中，
X为活性官能团或能转化为活性官能团的基团；
R25为金属；
D为连接基团；
d和q为1；
Q为连接基团；
POZ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
R1是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；以及
n为从3至1000的整数；
其中，
所述活性官能团能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-POZ偶联物。
根据本发明的一个实施方式，X选自由醛、活性碳酸盐(-O-CO-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(OSO2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-CO-Z)和羧酸组成的集合，其中任何前述基团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。
根据本发明的一个实施方式，R7含1-12个碳原子。
根据本发明的一个实施方式，R7为甲基、乙基或正丙基。
根据本发明的一个实施方式，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、杂环基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-R8、-(R15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、R11和R15各自独立地选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C6H10-CH2-。
根据本发明的一个实施方式，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
(a)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(b)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2-CO2H
(c)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n S-CH2CH2-NH2
(d)CH3-[N(COCH2CH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(e)H-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(f)
(g)或者
其中n是从3到1000的整数。
根据本发明的一个实施方式，R25是Li、Na或者K。
根据本发明的一个实施方式，所述连接基团D是未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基或芳基，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基、芳基、-(CH2)b-CONH-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b-、-CO-(CH2)b-、-CO-C6H4-、或-CO-R26、或-(CR27R28)b，其中，R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，以及R26为-C6H10-CH2-。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团与靶分子形成水解稳定的连接。
本发明还公开了根据本发明的上述方法所制备的聚噁唑啉POZ化合物。
本发明还提出了一种末端活化的聚噁唑啉POZ化合物，具有基本结构R1-[N(COR7)CH2CH2]n-S-Qq-X，
其中，
所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物中的所有连接是水解稳定的，
X为能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-POZ偶联物的活性官能团，其中，该水解稳定的连接不是酯键或者二硫键，所述活性官能团选自由醛、活性碳酸盐(-O-CO-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(OSO2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-CO-Z)和羧酸组成的集合，其中任何前述官能团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基；
Q为连接基团；
POZ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
R1是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
n为从3至1000的整数；以及
q为1。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团被保护。
根据本发明的一个实施方式，R7含1-12个碳原子。
根据本发明的一个实施方式，R7为甲基、乙基或正丙基。
根据本发明的一个实施方式，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、杂环基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-R8、-(R15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、R11和R15各自独立地选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C6H10-CH2-。
根据本发明的一个实施方式，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
(a)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(b)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2-CO2H
(c)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n S-CH2CH2-NH2
(d)CH3-[N(COCH2CH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(e)H-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(f)
(g)或者
其中n是从3到1000的整数。
本发明还提出了一种通式为A-B-TM的水解稳定的靶分子-POZ偶联物，其中，
A为上文所述的本发明的POZ化合物减去所述POZ化合物上的活性官能团与靶分子上的结合对象的反应过程中消除的任何离去基团；
TM为靶分子，所述靶分子含所述结合对象，并且所述靶分子选自药物、低聚核苷酸、多肽、抗体、抗体片段和蛋白质；以及
B为所述活性官能团与所述结合对象间形成的水解稳定的连接，该水解稳定的连接不是酯键或者二硫键。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为三氟乙基磺酸酯，所述结合对象为SH，以及B为硫醚连接。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为马来酰亚胺，所述结合对象为SH，以及B为硫醚连接。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为活性碳酸盐，所述结合对象为NH2，以及B为氨酯连接。
根据本发明的一个实施方式，其中，所述活性官能团为活性酯，所述结合对象为NH2，以及B为酰胺连接。
根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为醛，所述结合对象为NH2，以及B为胺连接。
附图说明
图1示出了2-烷基-2-噁唑啉(如2-乙基-2-噁唑啉)聚合的活性阳离子机制，其中-OTf为-OSO2-CF3或“三氟甲磺酸盐”，Nuc-为负的亲核试剂；
图2A和图2B示出了通过现有技术的方法制得的M-PEOZ-OH 2000的凝胶渗透色谱；
图3示出了聚噁唑啉衍生物(这里以2-乙基-2-噁唑啉示出)的聚合过程中链转移的消除-二聚机制的机制；
图4A和图4B示出了通过本发明的优化条件制得的M-PEOZ-OH 2000(图4A)和M-PEOZ-OH 5000(图4B)的凝胶渗透色谱。
具体实施方式
定义
本文中用到的术语“POZ”、“POZ化合物”或“POZ聚合物”指含具有结构-[N(COR7)CH2CH2]n-的重复单元的2-取代-2-噁唑啉聚合物，其中各个重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或杂环基烷基，n为3-1000；在一个实施方案中，所述未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或杂环基烷基包含1-10个碳原子，在一个更具体的实施方案中，R7为甲基、乙基或正丙基。
本文中用到的术语“PMOZ”指含具有结构-[N(COCH3)CH2CH2]n-的重复单元的POZ。
本文中用到的术语“PEOZ”指含具有结构-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-的重复单元的POZ。
本文中用到的术语M-POZ、M-PMOZ或M-PEOZ指其中引发端(initiating end)上的氮与甲基结合的上述聚合物。
本文中用到的术语“POZ衍生物”或“聚噁唑啉衍生物”指包含POZ聚合物的结构，所述POZ聚合物在POZ聚合物的末端上具有单个活性官能团，所述官能团能直接或间接地与靶分子上的化学基团形成连接；在一个实施方案中，所述POZ衍生物为单官能POZ衍生物。
本文中用到的术语“靶分子”指具有治疗、诊断应用或靶向功能的任何分子，其中所述靶分子能与本公开的POZ聚合物或POZ衍生物上的活性官能团反应，包括但不限于治疗部分(例如但不限于药物)、诊断部分、靶向部分、有机小分子、低聚核苷酸、多肽、抗体、抗体片段和蛋白质。
本文中用到的术语“水解稳定的靶分子-POZ偶联物”指本公开的POZ衍生物与靶分子的偶联物，以使POZ偶联物与靶分子间的所有化学连接均水解稳定。
本文中用到的术语“水解稳定的”指在生理条件下的水溶液中稳定的连接；在一个实施方案中，这样的连接将稳定至少12小时、24小时、48小时、96小时、192小时或更久；在一个替选实施方案中，这样的连接无限期稳定。
本文中用到的术语“水解不稳定的”指在生理条件下的水溶液中不稳定的连接。
本文中用到的术语“生理条件”指pH为6-8、温度为30-42摄氏度的水溶液。
本文中用到的术语“活性官能团”指与反应需要强催化剂、高温或不切实际的反应条件的那些基团相比，易于与亲电或亲核基团反应或易于通过环加成反应来反应的那些基团。
本文中关于本文中所述的POZ衍生物或其组分用到的术语“连接”、“被连接的”、“连接”或“连接剂”指通常因化学反应而形成且通常为共价连接的基团或键。
本文中关于羟基、胺基、巯基及其他反应性基团用到的术语“被保护的”指经本领域技术人员熟知的保护基(如Protective Groups in Organic Synthesis,Greene,T.W.；Wuts,P.G.M.,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,(第三版，1999)中记载的那些)保护而避免不希望的反应的这些官能团形式，所述保护基可用其中记载的程序添加或除去。被保护的羟基的实例包括但不限于：甲硅烷基醚，如通过羟基与试剂(如但不限于叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷)的反应获得的那些；取代的甲基和乙基醚，如但不限于甲氧基甲基醚、甲硫基甲基醚、苄氧基甲基醚、叔丁氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、四氢吡喃醚、1-乙氧基乙基醚、烯丙基醚、苄基醚；酯，如但不限于苯甲酰甲酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保护的胺基的实例包括但不限于：酰胺，如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺；酰亚胺，如邻苯二甲酰亚胺和二硫代琥珀酰亚胺；等等。被保护的巯基的实例包括但不限于：硫醚，如S-苄基硫醚和S-4-吡啶甲基硫醚；取代的S-甲基衍生物，如硫代半缩醛、二硫缩醛和氨基硫缩醛；等等。
无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语“烷基”包括包含一到二十个碳原子的直链烃基。因此该表述包括直链烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。该表述也包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于作为实例给出的如下基团：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)等。该表述也包括环状烷基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，以及被如上所定义的直链和支链烷基所取代的这类环。该表述也包括多环烷基，如但不限于金刚烷基冰片基和双环[2.2.2]辛基，以及被如上所定义的直链和支链烷基所取代的这类环。
无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语“烯基”包括在任何两个相邻的碳原子间具有至少一个双键的烷基。
无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语“炔基”包括在任何两个相邻的碳原子间具有至少一个三键的烷基。
本文中用到的术语“未取代的烷基”、“未取代的烯基”和“未取代的炔基”指不含杂原子的烷基、烯基和炔基。
表述“取代的烷基”、“取代的烯基”和“未取代的炔基”指如上所定义的烷基、烯基和炔基，其中与碳或氢的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键所代替，所述非氢或非碳原子如但不限于基团如烷氧基和芳氧基中的氧原子；基团如烷基和芳基硫化物、砜基、磺酰基和亚砜基中的硫原子；基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其他基团中的其他杂原子。
本文中用到的术语“未取代的芳基”指环部分中具有6-12个碳原子的不含杂原子的单环或双环芳族烃基，如但不限于苯基、萘基、蒽基、联苯基和二苯基。虽然表述“未取代的芳基”包括含稠环的基团(如萘)，但其不包括环成员中的一个上结合有其他基团(如烷基或卤素基团)的芳基，因为如下所述，如甲苯基的芳基在本文中被视为取代的芳基。但未取代的芳基可与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子结合。
本文中用到的术语“取代的芳基”相对于未取代的芳基具有与取代的烷基相对于未取代的烷基相同的含义。但取代的芳基也包括其中一个芳族碳与一个非碳或非氢原子结合的芳基，所述非碳或非氢原子如但不限于上面关于取代的烷基所描述的那些原子，而且也包括其中芳基的一个或多个芳族碳与如本文中所定义的取代的和/或未取代的烷基、烯基或炔基结合的芳基。这包括其中芳基的两个碳原子与烷基或烯基的两个原子结合而限定稠环系(如二氢萘基或四氢萘基)的键合排列。因此，表述“取代的芳基”除了别的之外还包括但不限于甲苯基和羟苯基。
本文中用到的术语“未取代的芳烷基”指如上所定义的未取代的烷基或烯基，其中未取代的或取代的烷基或烯基的氢或碳键被与如上所定义的取代的或未取代的芳基的键所代替。例如，甲基(CH3)为未取代的烷基。如果该甲基的氢原子被与苯基的键所代替，例如如果该甲基的碳与苯的碳结合，则该化合物为未取代的芳烷基(即苄基)。
本文中用到的术语“取代的芳烷基”相对于未取代的芳烷基具有与取代的芳基相对于未取代的芳基相同的含义。但取代的芳烷基也包括其中基团的烷基部分的碳或氢键被与非碳或非氢原子的键所代替的基团。
本文中用到的术语“未取代的杂环基”指芳族和非芳族环化合物，包括单环、双环和多环化合物，如但不限于含3个或更多个环成员的奎宁环基，这些环成员中的一个或多个为杂原子，如但不限于N、O和S。虽然表述“未取代的杂环基”包括稠合杂环(如苯并咪唑基)，但其不包括环成员中的一个上结合有其他基团(如烷基或卤素基团)的杂环基，因为如2-甲基苯并咪唑基的化合物为如下面所定义的“取代的杂环基”。杂环基的实例包括但不限于：含1-4个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基；含1-4个氮原子的饱和3-8员环，如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基；含1-4个氮原子的稠合不饱和杂环基，如但不限于吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、茚满基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基；含1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于噁唑基、异噁唑基、噁二唑基；含1-2个氧原子和1-3个氮原子的饱和3-8员环，如但不限于吗啉基；含1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基，如苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(如2H-1,4-苯并噁嗪基等)；含1-3个硫原子和1-3个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(如1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等)；含1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3-8员环，如但不限于噻唑烷基；含1-2个硫原子的饱和和不饱和3-8员环，如但不限于噻嗯基、二氢二硫杂环己二烯基(dihydrodithiinyl)、二氢二亚硫酰、四氢噻吩、四氢噻喃；含1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环，如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(如2H-1,4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(如2H-3,4-二氢苯并噻嗪基)；含氧原子的不饱和3-8员环，如但不限于呋喃基；含1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，如苯并间二氧杂环戊烯基(如1,3-苯并间二氧杂环戊烯基等)；含氧原子和1-2个硫原子的不饱和3-8员环，如但不限于二氢氧硫杂环己二烯基(dihydrooxathiinyl)；含1-2个氧原子和1-2个硫原子的饱和3-8员环，如1,4-氧硫杂环己烷；含1-2个硫原子的不饱和稠环，如苯并噻嗯基、苯并二硫杂环己二烯基(benzodithiinyl)；以及含氧原子和1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，如苯并氧硫杂环己二烯基(benzoxathiinyl)。杂环基也包括上面描述的其中环中的一个或多个S原子与一个或两个氧原子双键键合的那些(亚砜和砜)。例如，杂环基包括四氢噻吩、氧化四氢噻吩、和1,1-二氧化四氢噻吩。优选的杂环基含5或6个环成员。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、硫代吗啉、其中硫代吗啉的S原子与一个或多个O原子结合的硫代吗啉、吡咯、高哌嗪、噁唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、噁唑、奎宁环、噻唑、异噁唑、呋喃和四氢呋喃。
本文中用到的术语“取代的杂环基”相对于未取代的杂环基具有与取代的烷基相对于未取代的烷基相同的含义。但取代的杂环基也包括其中一个碳与一个非碳或非氢原子结合的杂环基，所述非碳或非氢原子如但不限于上面关于取代的烷基和取代的芳基所描述的那些原子，而且取代的杂环基也包括其中杂环基的一个或多个碳与如本文中所定义的取代的和/或未取代的烷基、烯基或芳基结合的杂环基。这包括其中杂环基的两个碳原子与烷基、烯基或炔基的两个原子结合而限定稠环系的键合排列。实例除了别的以外还包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基。
本文中用到的术语“未取代的杂环基烷基”指如上所定义的未取代的烷基或烯基，其中未取代的烷基或烯基的氢或碳键被与如上所定义的取代的或未取代的杂环基的键所代替。例如，甲基(CH3)为未取代的烷基。如果该甲基的氢原子被与杂环基的键所代替，例如如果该甲基的碳与吡啶的碳2(与吡啶的N结合的碳中的一个)或吡啶的碳3或碳4结合，则该化合物为未取代的杂环基烷基。
本文中用到的术语“取代的杂环基烷基”相对于未取代的杂环基烷基具有与取代的芳基相对于未取代的芳基相同的含义。但取代的杂环基烷基也包括其中非氢原子与杂环基烷基的杂环基中的杂原子(如但不限于哌啶基烷基的哌啶环中的氮原子)结合的基团。
总体描述
聚噁唑啉(POZ)是自2-取代-2-噁唑啉单体制备的聚合物。这些聚合物是水溶性的且据报道在哺乳动物模型系统中是无毒的。POZ通常通过适当化学计量的量的2-烷基-2-噁唑啉与亲电引发剂(如对甲苯磺酸甲酯(或“甲苯磺酸酯”，CH3-OSO2-C6H4-CH3)或三氟甲磺酸甲酯(CH3-OSO2-CF3))反应、然后用亲核试剂(如氢氧化物或胺)终止制备。所产生的聚合物便于以简写形式描述为引发基团由最左侧的基团表示、终止基团由最右侧的基团表示、2-烷基-2-噁唑啉组分在中间。因此，当本说明书中使用这种简写描述时，除非另有指出，否则名称的左侧将代表“引发剂端”，而名称的右侧将代表“末端”。
例如，当2-取代-2-噁唑啉为2-甲基-2-噁唑啉、甲苯磺酸甲酯被用作引发剂、氢氧化物被用作终止剂时，将产生如下聚合物：
CH3-[N(COCH3)CH2CH2]n-OH
上面的聚合物便于以简写符号描述为M-PMOZ-OH，其中甲基引发剂由最左侧的M(在引发剂端处)表示，PMOZ代表聚甲基噁唑啉，其中重复单元的甲基由PMOZ的M表示，终止羟基由-OH(在末端处)表示。聚合度n可在约3到约1000范围内。
另一常用的单体为2-乙基-噁唑啉，该单体由三氟甲磺酸甲酯引发、由氢氧化物终止时将提供如下POZ聚合物：
CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH
上面的聚合物便于以简写符号描述为M-PEOZ-OH，其中甲基引发剂由最左侧的M(在引发剂端处)表示，PEOZ代表聚甲基噁唑啉，其中重复单元的乙基由PEOZ的E表示，终止羟基由-OH(在末端处)表示。
可使用更复杂的亲电试剂和亲核试剂。例如，用苄基溴引发2-乙基-2-噁唑啉聚合并用过量的乙二胺终止产生如下聚合物：
C6H5-CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-NH-CH2CH2-NH2
此外，在相同的聚合物中可使用不同的单体来产生各种无规和嵌段共聚物。
该聚合工艺被称为活性阳离子聚合，因为用亲电试剂进行的引发产生噁唑啉盐(oxazolinium)阳离子，该噁唑啉盐阳离子然后以链反应与其他单体单元反应产生增长的“活性”阳离子。
通过假定活性阳离子可由下面的非环形式表示，可以预测终止的产物，虽然事实上环状形式无疑是最重要的，且所需的产物通过亲核攻击环的5-位产生：
CH3-[N(COCH3)CH2CH2]n-N(COCH3)CH2CH2 +
本公开中以M-PMOZ+代表该阳离子。如上面所提到的，该POZ阳离子可通过与亲核试剂(如氢氧化物或胺)反应而“被终止”。有趣的是，用弱亲核试剂水进行的终止不产生所需的5-位攻击产物(“热力学”产物)，而是产生2-位攻击(“动力学”产物)。该动力学产物不稳定且可能重排得到酯产物或变回阳离子(O.Nuyken,G.Maier,A.Gross,Macromol.Chem.Phys.197,83-85(1996))。
羟基终止的聚合物可经进一步改性得到所需的衍生物。例如，Zalipsky使端-OH与戊二酸酐反应得到由戊二酸酯基团终止的POZ(M.C.Woodle,C.M.Engbers andS.Zalipsky,Bioconjugate Chem.,1994,5,493-496)。
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2H
上面的聚合物被活化为琥珀酰亚胺基酯、与磷脂偶联并用来制备POZ-修饰脂质体。已发现这些脂质体与PEG-修饰脂质体具有相似的性质。
胺终止的聚合物也具有可用于进一步衍生化的反应性基团。例如，用甲胺终止得到由活性基团-NHCH3终止的POZ。也可用环状二胺哌嗪终止。
噁唑啉聚合也可用功能性亲核试剂引发。例如，亲电引发剂3-溴丙酸乙酯已被用来引发2-乙基-2-噁唑啉聚合。用氢氧化物终止得到如下聚合物：
HO2C-CH2CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH
值得一提的是，在引发剂端和末端上具有相同官能团的POZ在化学上是不同的，因为在引发剂端处的基团与氮相连，而在末端处的基团与碳相连。例如，下面的两种聚合物均是PMOZ的丙酸衍生物，但不同在于引发剂端的丙酸与氮相连，而末端的丙酸与碳相连(为清楚起见示出了开始或结束单体单元)：
HOOCCH2CH2-N(COCH3)CH2CH2-PMOZ-OH
M-PMOZ-N(COCH3)CH2CH2-O-CH2CH2COOH
但制备含活性官能团的聚噁唑啉的另一途径是使单体(如2-乙基-2-噁唑啉)与在2-位上有活性官能团的噁唑啉单体共聚。例如，Jordan和其同事已制备了2-位上有乙炔和被保护的醛、羧酸和胺的噁唑啉(F.C.Gaertner,R.Luxenhofer,B.Blechert,R.Jordan andM.Essler,J.Controlled Release,2007,119,291-300)。这些功能性单体与2-乙基-2-噁唑啉的共聚产生含多个悬挂或侧链活性官能团的无规共聚物。例如，用三氟甲磺酸甲酯引发2-乙基-2-噁唑啉和2-戊炔基-2-噁唑啉的聚合，并随后用哌嗪(NHC4H8NH)终止产生如下无规共聚物：
CH3-{[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-[N(COCH2CH2CH2-CCH)CH2CH2]m}ran-NC4H8NH
下标“ran”表示该聚合物为无规共聚物。n的值通常为约20-30而m为约2-5。
为使POZ与靶分子(如但不限于多肽)偶联，有必要通过在聚合物的至少一个末端连上能与靶分子上的基团形成连接的活性官能团来“活化”该聚合物。关于活化POZ以与靶分子偶联所做的工作尚很少。活性基团可加在引发剂(左)端处或末(右)端处或两端处。例如，当靶分子为多肽时，多肽表面上有许多可与POZ上的活性官能团反应的氨基，在唯一出版了的连接POZ与蛋白质的实例中，Myamoto和其同事将下面的POZ与过氧化氢酶的氨基相连(M.Myamoto,T.Saegusa,et al.,Macromolecules,1990,23,3201-3205)：
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS
在这种情况下，使M-PMOZ-OH与戊二酸酐反应，所得羧酸经N-羟基琥珀酰亚胺(由NHS表示)活化。NHS活性酯是常用的羧酸活性形式。在本实例中，POZ-过氧化氢酶偶联物经证实是活性的。
现有技术已描述了三种能与靶分子偶联的末端活化的POZ化合物。但各个前述POZ衍生物均受到限制。Zalipsky描述了活化的丙酸POZ化合物NHS-OOCCH2CH2-PEOZ-OH，其中活化基团与分子的引发剂端相连(S.Zalipsky,C.B.Hansen,J.M.Oaks and T.M.Allen,J.Pharm.Sci.,85,133-137(1996))。该POZ化合物通过用含活化基团的部分引发聚合来制备。但Jordan、Hoogenboom等已说明用不同的活化基团引发聚合可能需要很不同的反应条件，从而需要广泛的研究来确定最佳反应条件。因此，如果选择引发剂法来制备活化的POZ化合物，则必须进行探索性工作来为每种新化合物确定适宜的反应条件。此外，上面的化合物是双官能的，因为其由羟基而非惰性基团(如烷基)所终止。另外，如下面所讨论的，用卤代烷引发的聚合不经由活性阳离子机制进行并因此发现多分散性高。
Myamoto和Zalipsky已制备了NHS-活化的戊二酸酯衍生物。该衍生物自含OH基团作为末端活化基团的单官能POZ聚合物(M-PMOZ-OH)制备。但戊二酸酯和琥珀酸酯衍生物具有连接靶分子与POZ化合物的水解不稳定的酯连接。例如，NHS-活化的戊二酸酯衍生物将如所示与靶分子(这里以蛋白质示意)反应：
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS+PROTEIN-NH2→
→M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
由于水解不稳定的酯连接，故所产生的靶分子-POZ偶联物在生理条件下的生物体系(如人或其他哺乳动物)中将不稳定，而将水解而使POZ与蛋白质分裂：
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN→
→M-PMOZ-OH+HO2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
此外，在上面的图式中，当靶分子-POZ偶联物因不稳定的酯连接的分裂而水解时，所得靶分子将含“标签”或“半抗原”，其可导致靶分子的免疫原性。
最后，已制备出了邻二硫吡啶(OPSS)衍生物(G.Hsiue,et al.,BioconjugateChem.,2006,17,781-786)。理论上该衍生物可与蛋白质硫醇基团偶联产生二硫化物连接，虽然Hsiue未进行此工作，但众所周知二硫化物是不稳定的而容易在血浆中还原。
阻碍已知的POZ聚合物用于修饰靶分子的另一问题在于一些POZ聚合物不具有单个活性官能团；即它们不是“单官能的”。如果要设法避免交联和/或在聚合物主链上与多个靶分子结合，则单官能性是必要的。例如，Jordan和其同事已发表著作示出了2-乙基-2-噁唑啉与含官能团的噁唑啉单体的共聚。这些悬挂官能团有时能与肽偶联。但该技术未设计为提供单官能POZ聚合物，而是产生含沿主链的悬挂基团的多官能化合物。在POZ主链中存在多个官能团有时可能是有利的，但在与多官能靶分子(如但不限于多肽和蛋白质)偶联时会导致交联和团聚体形成。此外存在希望单个靶分子与聚合物偶联的情况，而多官能POZ聚合物不允许这样做。
上述官能POZ化合物中的一些具有与靶分子(如蛋白质和小分子药物)偶联的潜能。但如对聚乙二醇修饰疗法进行的工作已表明的，聚合物修饰药物的商业开发通常需要采用分子量(MW)高达40,000Da或以上以及分子量分布或多分散性(PD)低于1.1的聚合物。大量的工作已表明用常规技术的POZ不能获得在上述范围内的MW和PD。通常见到的是，随着增长的POZ链的分子量达到大约5,000Da，多分散性也略微增高。副反应(包括链转移)开始大量发生。非常低的聚合温度与数周的反应时间的结合使用已表明可产生可接受的PD，但这样的条件对于工业规模的制备来说是不现实的(J.S.Park and K.Kataoka,Macromolecules,39,6622(2006))。Hoogenboom、Schubert及其同事指出，低-PD POZ可通过使用微波照射制备，但用这种技术同样不能得到工业规模的聚合(R.M.Paulus,T.Erdmenger,C.R.Becer,R.Hoogenboom and U.S.Schubert,Macromol.Rapid Comm.,28,484-491(2007))。由于通常发现多分散性宽，故迄今所述的官能POZ化合物在聚合物疗法中的使用严重受限。
阻碍POZ衍生物用于修饰靶分子的又一问题在于不能得到一系列能在一系列条件下与靶分子反应的适宜的活化的POZ分子。此外，目前可得到的POZ分子是多官能的或当与靶分子偶联时含水解不稳定的键，而具有与之相关的缺点，或活性取代基在引发反应过程中加入，而具有与之相关的缺点。此外已描述了悬挂官能性，但这些衍生物是多官能的而不适合本应用。
本公开提供了具有一系列活性基团的单官能POZ衍生物，所述活性基团可使所述单官能POZ衍生物与广泛的靶分子在广泛的反应条件下偶联以产生水解稳定的靶分子-POZ偶联物，其中，一个靶分子与POZ衍生物结合。提供具有一系列能在不同的反应条件下与靶分子上的选定基团反应的活性基团的单官能POZ衍生物的能力提供了优于现有技术的显著优势，因为不同的靶分子对不同的反应条件敏感且对于POZ衍生物与靶分子的偶联来说最有效的反应条件常随靶分子的性质及靶分子上与POZ衍生物反应的基团而异。
本公开通过提供一系列本领域中先前未知的POZ衍生物解决了前述POZ聚合物的局限。另外，本公开提供了本领域中先前未知的单官能POZ衍生物。此外，本公开提供了在其末端上有活性官能团的单官能POZ衍生物。此外，本公开通过提供所公开的POZ衍生物的合成方法解决了现有技术的局限，所述合成方法利用含易于得到且可用熟知的制备化学获得的终止剂端基(如但不限于羟基)的POZ分子。然后可通过以逐步方式偶联小的活性分子与可利用的端基而在POZ衍生物(如本文中所述)上生成所需的活性官能团来制得广泛的POZ衍生物。此外，本公开通过使用所述的单官能POZ衍生物提供水解稳定的靶分子-POZ偶联物而解决了现有技术的局限。这样的方法不仅提供了其中不超过一个靶分子与每种POZ衍生物结合的靶分子-POZ偶联物，而且提高了靶分子-POZ偶联物的体内半衰期并减少了与靶分子的“半抗原标记”有关的免疫原性问题。所公开的单官能POZ衍生物、合成方法和所得水解稳定的靶分子-POZ偶联物在现有技术中尚未认识到。
因此，所述的单官能POZ衍生物和合成方法避免了现有技术中固有的问题并提供了产生其中一个靶分子与POZ衍生物结合的水解稳定的靶分子-POZ偶联物的机制。
如下面更详细地讨论的，任何2-取代-2-噁唑啉化合物(如但不限于PMOZ和PEOZ)均可用来产生本公开的POZ衍生物。在某些实施方案中，PEOZ或PMOZ为2-取代-2-噁唑啉POZ分子。如本领域中熟知的，2-烷基-2-噁唑啉分子中不同的烷基可为本文中所述的POZ衍生物提供不同的溶解性、药代动力学和膜渗透能力。此外，POZ聚合物主链中重复单元的性质可相同以产生均聚物(如但不限于PMOZ和PEOZ)或至少一个重复单元可不同以提供共聚物(如但不限于无规或嵌段共聚物)。
此外，本公开提供了合成具有低多分散性(PD)值且由不希望的副反应(如但不限于链转移)所产生的杂质的量减少的POZ聚合物的新方法。在一个实施方案中，本公开描述了最大限度减少不希望的副反应(如但不限于链转移)的新方法，从而使纯度提高的POZ聚合物产物的PD值低。在一个实施方案中，本公开的方法提供了在提高的MW值下具有低PD值的POZ衍生物。在另一实施方案中，产生的POZ聚合物的杂质量减少。本公开中提供的新方法是对现有技术方法的改进并提供了适用于修饰广泛的靶分子的POZ聚合物的大规模工业制备。
因此，本公开也提供了纯度提高且PD值低的适用于药物应用中的POZ聚合物。如本领域中熟知的，PD值将随MW而变；一般来说，随着分子量增大，PD值也增大。使用本公开的方法可以工业规模生产各种MW的POZ聚合物，所述POZ聚合物在给定MW下的PD值比用现有技术的工业适用方法可产生的低。例如，使用本公开的方法可产生MW为20,000Da或以下、PD值低于或等于1.1的POZ衍生物。在另一特别的实施方案中，产生的前述POZ衍生物的杂质量减少。如本领域中熟知并在本文中的实施例中示出的，使用现有技术的方法合成的POZ衍生物含有某些杂质，这些杂质在GPC图中表现为高MW肩和低MW尾。这些杂质至少部分是通过不希望的副反应(如但不限于链转移)生成的。因此，所公开的POZ衍生物适用于修饰广泛的靶分子。
通过使用本文中所述的方法，可得到一系列具有不同的活性官能团的单官能POZ衍生物。此外，本公开提供了以高效方式产生这类单官能POZ衍生物的合成方法。最后，通过使用所述的单官能POZ衍生物，可产生其中一个靶分子与POZ衍生物结合的水解稳定的靶分子-POZ偶联物。
合成低PD值POZ衍生物的方法
聚合2-芳基-和2-烷基-2-噁唑啉的现有技术源于Kobayshi、Nuyken和Jordan的出版物(S.Kobayashi,E.Masuda,S.Shoda and Y.Shimano,Macromolecules,1989,22,2878-2884；A.Gross,G.Maier and O.Nuyken,Macromol.Chem.Phys.,1996,197,2811-2826；和F.C.Gaertner,R.Luxenhofer,B.Blechert,R.Jordan and M.Essler,J.ControlledRelease,2007,119,291-300)。在这些方法中，聚合由亲电试剂(如对甲苯磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯)引发；在一个实施方案中，使用甲苯磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯。使用这些强亲电试剂是为了通过活性阳离子机制促进聚合，因为理论上该机制不会产生终止或链转移反应(Q.Liu,M.Konas and J.S.Riffle,Macromolecules,1993,26,5572-5576)(参见图1)。但从现有技术已知，链转移反应确实发生且该反应不严格按活性阳离子机制进行。如果使用弱亲电试剂(如但不限于卤代烷)，则反应会按共价机制进行，结果PD显著增大。现有技术聚合方法使用氯苯、二氯苯或乙腈作为溶剂。增长阶段在约80℃下进行约1-3天。终止通过对碳酸钠水溶液于80-90℃下加热进行而产生羟基端基或通过与仲胺(如吗啉或哌啶)反应而得到末端的叔胺。
这些典型的现有技术方法的使用导致凝胶渗透色谱中约5-10％的高-MW肩及显著的低-MW尾的存在。本领域中已注意到这样的结果(参见J.Park and K.Kataoka,Macromolecules,2006,39,6622-6630)。文献中常见提到，这种MW分布的变宽是由于通过消除-二聚机制进行的链转移，虽然该过程的结构细节和实验支持是有限的(M.Litt,A.Levyand J.Herz,J.Macromol.Sci.-Chem.,1975,A9,703-727)。到链转移反应确实发生的程度，这样的反应不能被认为是真正的活性聚合。因此，减少不希望的副反应(如链转移)的发生是有利的。
本申请人已弄清了消除-二聚机制的细节、为该机制提供了实验支持并提出了关于终止步骤的机制的推论。这一新近进展特别重要，因为其揭示了为何某些终止反应会失败而使我们选择成功的终止反应。这样的发现在本领域中尚未见述及且其为创建最大限度地减少不希望的副反应的发生并产生所需的终止产物的合成方法提供了指导。
如本文中所讨论的，使用现有技术方法产生的POZ产物中含占POZ产物总质量的约5-10％的高MW肩。该高MW肩导致用现有技术合成方法获得的PD值不可接受。现有技术方法中观察到的高MW肩至少部分由聚合和/或终止步骤过程中形成的高-MW二聚体组成(参见图3)。消除-二聚机制预计，如果链转移在终止步骤过程中发生，则高MW肩中的物质将约是所需产物的MW的两倍。此外，如果链转移在增长步骤过程中发生，则将引发新的聚合物链，且由于此时单体浓度较低，故该聚合物的MW将低于聚合物本体的MW。此外，由于该新的聚合物链由链转移得到，故其必须由质子而不是甲基引发，因此该聚合物的MALDI谱将呈现出一组比主峰的低14Da的峰。
关于终止步骤也有迄今尚未认识到的推论。例如，为强碱和弱亲核试剂的终止亲核试剂的加入预计将导致显著的消除和二聚。此外，噁唑啉盐阳离子是离域的或“软”亲电试剂，且理论预测“软”或弥散的亲核试剂会更可能用作终止亲核试剂而非用作碱。举例来说，可以预期“软”硫醇盐是比“硬”醇盐更有效的终止剂。
上面的预测得到了实验的确认。在一个实施例中，加入了空间受阻的乙基二异丙基胺(强碱和弱亲核试剂)来终止2-乙基-2-噁唑啉聚合。该反应导致高MW二聚体产物增多至75％(参见实施例3)。经确认，GPC中杂质峰的MW约为所需产物的MW的两倍。此外，MALDI-TOF谱确认，部分主峰具有比预期的小14质量单位的第二组峰。我们已观察到，该第二组峰的MW稍小于所需产物的MW的两倍。这大概因为在聚合物完全形成而单体被耗尽之前、在增长阶段过程中发生了某链转移而发生；在这种情况下，所述碱必定是单体，因为其是增长过程中存在的最强的碱。
此外，由已知为硬亲核试剂的醇盐进行终止导致大量的高MW二聚体而没有源自所需亲核攻击的产物(参见实施例5)。此外，由已知为软亲核试剂的硫醇盐进行终止确实如预测的那样导致了所需的亲核攻击产物(参见实施例11)。
基于前述观察，本申请人已开发出了新的合成方法，所述新的合成方法减少了不希望的副反应(如链转移)，并可制备出比现有技术具有更优异的性质的POZ聚合物和衍生物。所述改进的方法可用到如下改进中的一个或多个。
在一个实施方案中，POZ聚合反应由强亲电试剂(如但不限于对甲苯磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯)引发；在一个实施方案中，使用甲苯磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯。
消除-二聚机制也表明，增长和终止应在低温下进行，因为高温有助于双分子消除。实施例通过示出降低增长和终止的温度会减少高MW二聚体的形成来确认了此言论。此预测也已得到了Kataoka的确认(参见J.Park and K.Kataoka,Macromolecules,2006,39,6622-6630)。但如果降低温度至足以消除所有链转移，则可能要花数周来达到反应的完成，因此这样的反应在工业上是不可行的。本公开下面描述的方法是工业上可行的。我们已观察到，在增长完成或接近完成后继续加热将引起消除-二聚的产生。本公开已惊人地发现，通过比现有技术方法中早得多地且在更低温度下终止聚合，POZ衍生物的质量大大改进。此外，增长反应的持续时间为单体完全或基本完全(高于或等于90％)消耗所需的最短时间。应指出，增长反应的温度和持续时间是相互关联的。换句话说，可使用较高的增长温度和较短的增长反应时间。相反，如果使用较长的增长反应时间，则应相应降低温度。
也已发现，溶剂(如但不限于氯苯)的使用比对于POZ产物的工业大规模制备来说关键性的常用乙腈溶剂提供更快的聚合。虽然现有技术已认识到以氯苯作溶剂，但尚未认识到对反应速率的改进。使用氯苯作溶剂提供更快的反应时间这一出乎意料的结果使聚合反应可较早地在较高温度下终止，而不增加高MW二聚体产物的形成。这样的改进是本领域中未认识到的。
此外，POZ产物、特别是用OH基团终止的那些，通过阳离子交换树脂的过滤改善PD值。据认为这样的过滤将除去低-MW和高-MW产物。对于较高分子量的POZ产物(例如10,000Da及以上的那些产物)，过滤的效果尤其显著；但过滤为POZ衍生物提供的好处与MW无关。给出该改进的一个实例，未经过滤的M-PEOZ-OH 10,000(通过本公开的方法制备)显示出Mn为7950Da、PD为1.21(GPC)，具有显著的低-MW尾。该产物通过羧乙基-琼脂糖凝胶过滤后得到的Mn为9180Da、PD为1.05(根据GPC)，以及Mn为9780、PD为1.01(根据MALDI)，且没有可观察到的低-MW尾，而有微不足道的2％的高-MW肩(根据GPC测定)。粗产物未呈现出高-MW肩的事实表明，阳离子交换过滤既除去了低-MW杂质也除去了高-MW杂质。
此外，在某些情况下，如果POZ产物包含羧酸作为端基，则可使用阴离子交换色谱来分离所需的产物和除去所形成的任何高分子量产物。我们已对M-PEOZ-S-CH2CH2-CO2H进行了该实验。值得一提的是，该色谱实验表明高-MW二聚体是中性的。因此，主要的二聚产物必定为图3的链烯。在该实验中，粗产物的Mn为9600Da，PD为1.09(GPC)，并有6％的高-MW肩。在DEAE-琼脂糖凝胶上的阴离子交换色谱后，Mn为9500Da，PD为1.06(GPC)，且无高-MW肩。
在另一实施方案中，终止反应在低温(在一个实施方案中，低于80℃；在一个可替选的实施方案中，15-40℃)下用比作为碱更好的亲核试剂的亲核试剂进行；示例性的亲核试剂包括但不限于软亲核试剂，如硫醇盐。本申请人已发现，醇钠化合物作为终止剂的使用不产生所需的产物；而是保留未终止的阳离子。但硫醇钠和相关化合物(如但不限于NaS-CH2CH2-CO2Et)的使用产生高效的终止并得到具有所需性质(如但不限于低PD值)的POZ产物。阴离子交换色谱后，该酯水解成为羧酸而产生具有低PD值和无高-MW肩的高质量POZ产物。在一个这样的实例中，M-PEOZ-S-CH2CH2-CO2H的Mn为9600Da、PD为1.09(GPC)并有6％的肩。在DEAE-琼脂糖凝胶上的阴离子交换色谱得到Mn为9500、PD为1.06(GPC)、且无肩。
合成中的这些新的改进被用在本文中所述POZ聚合物和衍生物的制备中。本领域普通技术人员能够明白，合成中的这些改进可以各种组合使用；前述内容不应理解为需要在给定的合成中使用各个所述改进。
使用两种现有技术方法合成M-PEOZ-OH 2000。这些POZ衍生物的合成的描述在实施例1(对于图2A)和实施例2(对于图2B)中给出。分析所产生的POZ衍生物。对于图2A的POZ衍生物，GPC呈现出具有可感知的高-MW肩(Mn＝3600 Da,9％)的单个峰。主峰的Mn为1980Da，PD为1.08。NMR呈现出预期的峰(参见实施例6)。MALDI-TOF MS呈现出一组最大值在2000Da、PD 1.04和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出具有分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主要的那组低14Da。这组峰的最大值发生在1600Da。对于图2B的POZ衍生物，GPC呈现出具有可感知的高-MW肩(Mn＝3300Da,6％)的单个峰。主峰的Mn为2200Da，PD为1.06。NMR呈现出预期的峰(参见实施例6)。MALDI-TOF MS呈现出一组最大值在2300Da和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出具有分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主要的那组低14Da。这组峰的最大值发生在2100Da。
使用本公开的方法合成用于比较的两种POZ衍生物M-PEOZ-OH 2000(图4A)和M-PEOZ-OH 5000(图4B)。这些POZ衍生物的合成的描述在实施例6(对于图3A)和实施例7(对于图4B)中给出。图4A和图4B中给出了GPC色谱。图4A和图4B示出了用本公开的合成方法获得的M-PEOZ-OH 2000和5000的有很大改进的GPC。对于M-PEOZ 2000，反应条件为：(a)三氟甲磺酸甲酯引发，在氯苯中于110℃增长1.5小时，以及在室温下用碳酸盐水溶液终止。观察到M-PEOZ 2000衍生物的Mn为1900Da(根据MALDI和GPC)、PD为1.07(GPC)和1.03(MALDI)、且无高-MW肩也无低-MW尾。对于M-PEOZ-OH 5000，反应条件为：(a)三氟甲磺酸甲酯引发，在氯苯中于42℃增长1小时，然后于80℃增长3.75小时，以及在室温下用碳酸盐水溶液终止。观察到M-PEOZ 5000衍生物的Mn为4900Da(根据MALDI)、PD为1.06(GPC)和1.02(MALDI)、有非常轻微的高-MW肩(1％)、无低-MW尾。在类似条件下制得的M-PEOZ-OH 10,000的Mn为9780Da(MALDI)、PD为1.01(MALDI)和1.05(GPC)，有2％的非常轻微的高-MW肩。
总之，本公开的申请人已弄清了当使用现有技术的合成方法时发生的不希望的副反应的性质，从而使本申请人确定最大限度地减少这类副反应的影响的反应条件。因此，本公开的方法可制备出比现有技术中可得到的那些具有更优异的性质的POZ聚合物和衍生物。在一个实施方案中，本公开的方法可制备出具有低PD值的POZ聚合物和衍生物；在一个特别的实施方案中，本公开的方法可制备出在高MW值下具有低PD值的POZ聚合物和衍生物。此外，本公开的方法可以适于大规模生产的方式生产前述POZ聚合物和衍生物。具有这类特征的这类POZ聚合物和衍生物及其生产方法是本领域中缺乏的。
在一个实施方案中，本公开的方法通过提供完全或部分地减少POZ合成的引发、聚合或终止过程中发生的一种或多种副反应而在POZ聚合物合成中提供这样的好处。在一个特别的实施方案中，所述副反应为链转移过程。这类不希望的副反应(如但不限于链转移过程)是制备POZ产物的现有技术程序中存在的问题。这样的副反应使POZ衍生物具有不希望的特征，如高PD值。
合成单官能POZ衍生物的方法
本公开提供了合成所述单官能POZ衍生物的新方法。该新的合成方法在本文中通常称为构建单元法(building block method)。在构建单元法的一个实施方案中公开了一步合成法。在构建单元法的一个可替选的实施方案中公开了两步法。在构建单元法的另一可替选的实施方案中描述了活性聚合物合成。每种方法均将在下面更详细地描述。
构建单元一步法
在构建单元法的第一个实施方案中公开了一步法。在一步法中，通过单个末端官能化的POZ分子与含所需活性基团的一组化合物间的反应在单个步骤中生成一系列单官能POZ衍生物。这样，单个末端官能化的POZ分子可被转化为一系列活化的单官能POZ衍生物。该方法意味着仅需要优化制备单个单官能POZ衍生物的聚合化学。POZ端基(下面的Y)经仔细选取以使这一系列反应可提供一系列活性基团。所述一步法的一般形式可由如下图式1代表：
R1-POZ-Y→R1-POZ-Pp-Qq-X I
图式1
其中,
POZ为-[N(COR7)CH2CH2]n-；
各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在一个实施方案中含1-12个碳；
R1为氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合；
R2-R4、R11和R14-R15各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一个实施方案中含1-10个碳；
R8为-C6H10-CH2-(环己亚甲基)；
R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基或芳烷基集合(在一个实施方案中含1-10个碳原子)、或为取代的或未取代的芳基；
Y为-OH、-SH、-S-(CH2)k-CO2H、哌嗪基、取代哌嗪基、取代哌啶基、或-NHR2；
P为连接基团；P可为任何能形成图式1中所示的连接的基团并可根据与其形成连接的基团的化学性质来选择；代表性的P基团包括但不限于-O-、-S-、-NH-、-NR11-、或未取代的杂环基(如但不限于哌嗪基(NC4H8N))；
Q为连接基团；Q可为任何能形成图式1中所示的连接的基团并可根据与其形成连接的基团的化学性质来选择；代表性的Q基团包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-R8、-(R15)m-或-(CR3R4)m；
n为3-1000的整数；
k和m为独立地选自1-10的整数；
p和q为独立地选自0或1的整数；
X为能与靶分子形成连接而产生水解稳定的靶分子-POZ偶联物的活性官能团。
在一个实施方案中，所述活性官能团选自如下大类的化合物：醛(-CHO)、活性碳酸盐(-O-CO-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(-OSO2-R23)(包括但不限于三氟乙基磺酸酯(2,2,2-三氟乙基磺酸酯)和甲磺酸酯(-O-SO2-CH3或-OMs))、酰肼(-CONHNH2)、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物(-N3)、异氰酸盐(-OCN)、氰酸盐(-NCO)、异硫氰酸盐(-SCN)、硫氰酸盐(-NCS)、腈(-CN)、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-CO-Z)和羧酸(-CO2-H)；以及
Z为活化基团，本领域内熟知的活性基团有很多，包括N-琥珀酰亚胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亚胺氧基、对硝基苯氧基、1-咪唑基和1-苯并三唑氧基；
活性官能团也可通过本领域中熟知的方法保护起来而产生被保护的活性官能团。例如，缩醛[CH(OR14)2]为示例性的保护基，其可水解产生醛基。活性官能团可被基团(如但限于关于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或杂环基烷基所描述的那些基团)所取代。此外，活性官能团包括可转化为活性官能团的那些化合物。例如，X基团可包括被在某些反应条件下可被水解的连接改性的化合物(如用来连接POZ衍生物与靶分子的那些)，从而断开连接而暴露活性官能团以与靶分子上的基团反应。
在图式1中，反应物R1-POZ-Y为POZ聚合的直接产物，Y基团能直接转化为一系列能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物的单官能POZ衍生物。例如，在一个实施方案中，Y等于-OH且当POZ聚合反应由氢氧化物终止时获得。在一个可替选的实施方案中，Y等于-NHR2且当POZ聚合反应由含氨基的化合物R2NH2终止时获得。提供可用的Y基团的其他可用的胺终止剂有哌嗪或取代的哌嗪，如1-哌嗪丙醇(H-NC4H8N-CH2CH2CH2-OH)。取代的哌啶也可用，因为它们提供胺通常提供的快速终止，且它们也引入一系列官能团。市场上可获得的取代的哌啶包括4-哌啶丁酸、3-哌啶羧酸和4-哌啶甲醇。在一个可替选的实施方案中，Y等于-S-CH2CH2-CO2H且当POZ聚合反应由-S-CH2CH2-CO2-CH3终止(随后不经分离即水解)时获得。
下面示出了说明经由R1-POZ-X衍生物的一步法的制备的各种示例性反应。在下面给出的反应中，R1和R7为甲基，Y为-OH或-NHR2，其中R2为CH3。
可以看出上面的结构落在图式1的描述内。例如，对于上面的活性碳酸盐(M-PMOZ-OCO2-NHS)，R1和R7为甲基，p和q为0，以及X为琥珀酰亚胺基碳酸酯。对于上面的活性酯(M-PMOZ-O-CH2-CO2NHS)，R1和R7为甲基，P为-O-，p为1，Q为-CH2-，q为1，以及X为-CO2NHS。
含上述活性基团的单官能POZ衍生物提供若干有用而不同的性质，从而可根据靶分子的性质和所需的反应条件选择具有所需活性官能团的特定单官能POZ衍生物。例如，当活性官能团为醛时，单官能POZ衍生物在限定的pH范围内主要与靶分子的N-端胺反应以形成亚胺(其通常被氢硼化物还原为仲胺)。当活性官能团为活性酯时，单官能POZ衍生物主要与胺(包括但不限于靶分子上的非末端赖氨酸基团)反应。同样，当活性官能团为活性碳酸盐或三氟乙基磺酸酯时，单官能POZ衍生物易于与胺反应，但反应条件和选择性不同于活性酯和醛。此外，当活性官能团为乙烯基砜或马来酰亚胺时，单官能POZ衍生物主要与硫醇反应，但反应条件随各个基团而不同，从而提供了一系列适合于一系列靶分子的反应条件。
重要的是，用上面的合成图式形成的各个单官能POZ衍生物能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物。
构造单元两步法
在一个可替选的实施方案中公开了两步合成法。在两步法的第一步中，通过如上所述的聚合制得的起始聚合物产物(下面的R1-POZ-Y)与所需的化合物反应产生POZ中间体(下面的R1-POZ-Y’)。在两步法的第二步中，该POZ中间体再与一系列包含一系列活性官能团的化合物反应形成一系列能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物的单官能POZ衍生物(下面的R1-POZ-X)。该两步合成法具有仅用两个反应并从单个起始聚合物产物(R1-POZ-Y)开始提供一系列单官能POZ衍生物的优势，从而最大限度地减少针对多个聚合物产物优化聚合条件的需要。该两步法提供用一步法不能得到的单官能POZ衍生物。构造单元两步法的转化的最一般形式在下面的图式2中示出。
R1-POZ-Y→R1-POZ-Y’→R1-POZ-X II
图式2
构造单元两步法可以图式3中的如下详细形式示出。在图式3中，Y’为能与T基团所代表的功能性亲核试剂反应的活性基团，包括但不限于活性酯和活性碳酸盐。
步骤1
R1-POZ-Y→R1-POZ-Pp-Qq-Y’
步骤2
R1-POZ-Pp-Qq-Y’+T-Uu-X→R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X III
图式3
其中，
R1-R4、R7、R8、R11、R14-R15、R23、POZ、P、Q、k、m、n、p、q、Y和X同如上所述；
U为连接基团；U可为任何能形成图式3中所示的连接的基团并可根据与其形成连接的基团的化学性质来选择；代表性的U基团包括但不限于-(R16)o-、
-(CR5R6)o-、-NH-R21-NHCO-R22-；
o为一到十的整数；
w和u为独立地选自1或0的整数；
R5、R6、R16、R21和R22各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在一个实施方案中含1-10个碳原子；
R17选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合(在一个实施方案中含1-10个碳原子)、或取代的或未取代的芳基。
Y’和T为反应形成水解稳定的连接W的反应性对，其中Y’和T反应性对和所得W连接选自表1中所示的那些基团和连接。Y’和T基团可反过来而不影响W连接的性质。
下面示出了说明水解稳定的R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X衍生物的制备的示例性反应。在该反应中，R1为氢，R7为甲基，Y为-OH，p和q为0，U为-CH2CH2-，u为1，反应性对T和Y’分别为-NH2和-O-CO2-NHS，它们形成氨酯W连接，w为1，以及X为缩醛(被保护的醛)：
H-PMOZ-OH→M-PMOZ-O-CO2-NHS
H-PMOZ-O-CO2-NHS+NH2-CH2CH2-CH(OEt)2→
H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CH(OEt)2,
其在水解后产生H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CHO。
下面示出了图式3的另一实例。在该反应中，R1和R7为甲基，Y为-OH，P为-O-，p为1，Q为-CH2CH2-，q为1，反应性对T和Y’分别为-NH2和-CO2H，它们形成酰胺(-CONH)W连接，w为1，U为-CH2CH2-，u为1，X为缩醛(被保护的醛)：
M-PMOZ-OH→M-PMOZ-O-CH2CH2-CO2H
M-PMOZ-O-CH2CH2-CO2H+NH2-CH2CH2-CH(OEt)2→
M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CH(OEt)2
其在水解后产生M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CHO。
如上面所讨论的，图式3的各活性官能团在与靶分子的反应中具有独特的优势和特殊性。此外，T和Y’基团与彼此的反应性可通过Q和U基团的性质控制。通过如所述地增大Q和U基团的尺寸来增大T和Y’和/或T和X基团间的化学距离，改变Y’和T基团的反应性。此外，活性官能团X与靶分子的反应性可类似地调节。
与一步法一样，用上面的两步合成图式形成的各单官能POZ衍生物能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物。
活性聚合物方法
在本发明的另一可替选的实施方案中，可使用小的活性分子来终止噁唑啉聚合以直接提供单官能POZ衍生物，其可与靶分子反应形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物。该方法被称为活性聚合物方法。活性聚合物方法的最一般形式可由如下图式4表示：
R1-POZ++Nuc-Qq-X→R1-POZ-C-Qq-X IV
图式4
其中，
R1-R4、R7、R8和R14-R15、R23、POZ、Q、k、m、n、q、Y和X同如上所述；POZ+代表噁唑啉聚合过程中形成的阳离子-[N(COR7)CH2CH2]n +；
R19选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一个实施方案中含1-10个碳原子；以及
Nuc为能通过与末端阳离子-N(COR7)CH2CH2 +相互作用终止活性POZ聚合反应而形成水解稳定的连接C的亲核试剂，其中Nuc基团和所得C连接可选自表2中所示的那些基团和连接。
下面给出了说明R1-POZ-C-Qq-X衍生物的制备的示例性反应。在下面所示的反应中，R1和R7为甲基，Nuc为-NH2，C为-NH-，Q为-CH2-，q为1，以及X为-CO2H(注：甲酯在下面的反应过程中水解)：
CH3-PMOZ++-S-CH2-CO2CH3→CH3-PMOZ-S-CH2-CO2H
与本领域中的意见相反，本公开表明，醇盐(如-O-CH2-CO2-CH3)捕获阳离子不产生所需的产物。
如表2中所提及的，当使用哌嗪和哌啶作为Nuc基团时，C连接将结合进哌嗪和哌啶环结构中。下面提供了用哌嗪和哌啶作为Nuc基团所得到的C连接及结构的实例。
在该反应的一个实施方案中，硫醇盐化合物被用来终止噁唑啉聚合。在该方法中，噁唑啉聚合如本文中所述被引发以形成在POZ聚合物的终止端处具有噁唑啉盐阳离子的POZ聚合物。通过向反应中加入亲核硫醇盐分子来终止该反应，从而终止活性POZ聚合。硫醇盐分子包含能与靶分子上的基团反应而形成水解稳定的连接的活性官能团(该活性官能团可如本文中所述被保护起来)。
在该方法的一个具体实施方案中，硫醇盐具有结构R25S-Dd-X，其中：
X的定义同上；
R25为金属；在一个实施方案中，R25为Li、Na或K；
D为连接基团，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基或芳基、-(CH2)b-CONH-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b、-CO-(CH2)b-、-CO-C6H4-、或-CO-R26或-(CR27R28)b；
R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一个实施方案中含1-10个碳；
R26为-C6H10-CH2-(环己亚甲基)；
d为0或1；以及
b为1-10的整数。
在一个实施方案中，活性官能团为被保护的官能团或可转化为活性官能团的化合物。如上面所讨论的，各活性官能团在与靶分子的反应中具有独特的优势和特殊性。如同上述，用上面的合成图式形成的各单官能POZ衍生物能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物。
特定的POZ衍生物
本公开描述了多种可通过上述方法制备的单官能POZ衍生物。此外，本公开描述了许多可用于合成本公开的单官能POZ衍生物的化合物。
在一个实施方案中，单官能POZ衍生物由通式(I)、(III)或(IV)描述：
R1-POZ-Pp-Qq-X (I)
R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X (III)
R1-POZ-C-Qq-X (IV)
其中通式(I)、(II)和(III)中的定义与上面关于图式1-4中所提供的相同。
此外，下面提供了本公开的单官能POZ衍生物的若干具体结构。这些结构仅为示例的目的给出，而非意在限制本文中所述的单官能POZ衍生物的范围。同上，当在下面提及时，上面的图式1-4中给出的定义适用于下面的结构；下面的定义也适用于可应用的地方。此外，对于下面提供的所有结构，R1基团应理解为含在引发剂基团的位置处(POZ基团的左侧)。
R9为连接部分，如-(R16)O-或-NH-R21-NHCO-R22-；
G为未取代的或取代的芳基或取代的或未取代的烷基、烯基或炔基，如但不限于氟代烷基；以及
Ar为未取代的芳基或取代的芳基。
在一个实施方案中，本公开提供了通过构造单元一步法制得的单官能POZ衍生物。源自该途径的示例性结构包括但不限于如下结构。
POZ-P-(CR3R4)m-CH(OR14)2
POZ-P-(CR3R4)m-CHO and POZ-NHCO-C6H4-CHO
POZ-P-(CR3R4)m-CO2H
POZ-P-(CR3R4)m-CO-Z
POZ-P-(CR3R4)m-CO-NH-NH2
POZ-O2C-O-Z
POZ-O-SO2-G
POZ-P-CH2CH2-SO2-CH＝CH2和POZ-NHCO-C6H4-SO2-CH＝CH2
POZ-NH-CO-C6H4-NHCO-CH2-I
POZ-P-(CR3R4)n-CCH
在另一实施方案中，本公开提供了通过构造单元两步法利用POZ磺酸酯(源自POZ-OH的中间体)上的亲核取代制得的单官能POZ衍生物：
POZ-N3
POZ-P-(CR3R4)n-CH(OR14)2
POZ-P-(CR3R4)n-CHO
POZ-OCN
POZ-SCN
POZ-CN
POZ-P-(CR3R4)n-CCH
POZ-P-(CR3R4)n-CO2H和POZ-P-(CR3R4)n-CO-Z
POZ-P-Ar-CO2H和POZ-P-Ar-CO-Z
在另一实施方案中，本公开提供了通过构造单元两步法利用POZ活性碳酸盐(源自POZ-OH的中间体)上的亲核取代制得的单官能POZ衍生物：
POZ-OCONH-(CR3R4)n-CO2H
POZ-OCONH-(CR3R4)n-CO-Z
POZ-OCONH-C6H4-CHO
在另一实施方案中，本公开提供了通过任何上述活性酯上的亲核取代制得的结合了马来酰亚胺的单官能POZ衍生物：
其中，
POZ-L-CO-源自任何本文中所述的活性羧酸酯；以及
L为任何上面所示的连接POZ与羧基的连接部分，包括-P-(CR3R3)m-、-P-Ar-、和吡啶盐-NC5H4 +-。
可以看出这些马来酰亚胺适合上面的POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X式，其中L包含Pp-Qq段，-CONH-包含Ww段，以及R9包含Uu段。
在另一实施方案中，本公开提供了通过利用亲核攻击2-烷基-2-噁唑啉的聚合过程中生成的POZ阳离子的活性阳离子方法制得的POZ衍生物：
POZ-P-(CR3R4)n-CO2H
POZ-P-Ar-CO2H和POZ-P-Ar-CO-Z
所有上面的POZ衍生物与靶分子上的基团反应以在靶分子与PO衍生物间形成水解稳定的连接。
源自哌啶或哌嗪的特定POZ衍生物
如本文中所讨论的，活性POZ阳离子可用取代的或未取代的哌啶或哌嗪或其衍生物终止。取代基包括但不限于关于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、芳烷基或杂环基烷基所描述的那些基团。这些POZ衍生物难以用上面的图式1-4说明，因为连接基团(图式4中指定的C)是哌啶或哌嗪环结构的一部分。例如，POZ阳离子可被4-哌啶甲醇捕获而产生POZ醇，被4-哌啶丁酸捕获而产生POZ羧酸，或被哌嗪本身捕获而产生POZ胺：
用这类哌啶和哌嗪的终止是有用的，因为强氮亲核试剂赋予快速并完全的终止而引入末端活性官能团。市场上可获得的哌啶和哌嗪衍生物有至少四种，包括1-哌嗪丙醇、4-哌啶丁酸、3-哌啶羧酸和4-哌啶甲醇，其他的可容易地合成。
应理解，任何上述自POZ醇、酸或胺制得的POZ衍生物也可自这类哌啶或哌嗪制备，其中的含氮环提供醇、酸或胺。例如，如下化合物可自上面的用4-哌啶甲醇终止的POZ来制备：
这些化合物可再转化为一系列有用的衍生物，包括缩醛、马来酰亚胺和活性酯：
POZ衍生物的使用
所述单官能POZ衍生物可用来通过活性官能团产生水解稳定的靶分子-POZ偶联物。此外，使用本文中所述的单官能POZ衍生物，一个靶分子被每个POZ衍生物结合。换句话说，各POZ衍生物上结合的靶分子不超过1个。单官能POZ衍生物中存在的活性官能团的多样性使单官能POZ衍生物可用多种反应化学与靶分子上的多种基团偶联。例如，当活性官能团为醛时，单官能POZ衍生物在限定的pH范围内主要与靶蛋白分子的N-端胺反应。当活性官能团为活性酯时，单官能POZ衍生物主要与胺(包括但不限于靶分子上的赖氨酸基团)反应。同样，当活性官能团为活性碳酸盐或三氟乙基磺酸酯时，单官能POZ衍生物与胺反应，但反应条件和选择性不同于活性酯和醛。此外，当活性官能团为乙烯基砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺时，单官能POZ衍生物主要与硫醇反应，但反应条件随各个基团而不同，从而提供了一系列适合于一系列靶分子的反应条件。
重要的是，用上面的合成图式形成的各个单官能POZ衍生物均能形成水解稳定的靶分子-POZ偶联物。
在一个实施方案中，靶分子为多肽，如但不限于蛋白质。例如，单官能POZ衍生物可与治疗学重要的蛋白质(如但不限于粒细胞集落刺激因子(GCSF))偶联。该示例性的反应在下面通过如下反应示意性地说明：
M-POZ-OCO-O-NHS+GCSF-NH2→
M-POZ-OCONH-GCSF
在该实施方案中，GCSF上所示的胺代表若干可利用的赖氨酸基团中的一种。
同样，GCSF含可利用的硫醇基团，且在适当的条件下，含马来酰亚胺作为活性官能团的单官能POZ衍生物可与该硫醇基团反应。
活性POZ衍生物也可与肽偶联。例如，含活性酯作为活性官能团的单官能POZ衍生物可与胰岛素上可利用的氨基偶联：
M-POZ-O-CH2-CO2-NHS+胰岛素-NH2→M-POZ-O-CH2-CONH-胰岛素
在一个可替选的实施方案中，靶分子为小分子、药物或诊断剂。
靶分子-POZ偶联物
如上所讨论的，本公开描述了多种能与靶分子形成连接而产生水解稳定的靶分子-POZ偶联物的单官能POZ衍生物。在一般的实施方案中，本公开提供了具有通式(IV)的水解稳定的靶分子-POZ偶联物：
A-B-TM (IV)
其中，
A为本文中所述的单官能POZ衍生物减去POZ衍生物上的活性官能团与靶分子上的结合对象的反应过程中消除的任何离去基团；
TM为靶分子；以及
B为本公开的单官能POZ衍生物的活性官能团与靶分子上的结合对象间形成的水解稳定的连接，应理解，水解稳定的B连接的性质将取决于单官能POZ衍生物上的活性官能团及靶分子上的结合对象的性质。示例性的活性官能团、结合对象和B连接在下表3中给出。表3中的列举不是详尽无遗漏的，根据本公开可想到其他组合和所得的B连接。
实施例
试剂
试剂购自EM Science或Aldrich并在用前蒸馏。氯苯和噁唑啉从氢化钙中馏出。凝胶渗透色谱(GPC)在具有1100四元泵和RI检测器的Agilent Technologies机器上进行。在柱加热器(60℃)中串联地使用两个PhenogelTM GPC柱(Phenomenex,5μ,500A°,300×7.8mm)。流动相为100％的N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，流速为1mL/min。校准曲线用据MALDI测得具有不同分子量(750,1K,2K,5K和10K)的M-PEOZ-OH样品生成。凝胶过滤色谱(GFC)用使用Shodex KW-803柱的相同系统进行，以pH 7.0的1mM HEPES缓冲溶液作流动相。使用UV检测器对228nm加以监测。MALDI-TOF MS用Bruker,MicroflexTM仪器使用蒽三酚作为基质进行。NMR在Varian 500MHz仪器上进行。
实施例1：M-PEOZ-OH 2000的典型现有技术制备。
向2-乙基-2-噁唑啉(2.02mL,0.020mol)/乙腈(3.0mL,6.7M)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.113mL,0.001mol)，溶液搅拌10分钟。然后将反应加热至80℃并搅拌18小时。加入碳酸钠(1.167g)和水(1mL)，并且所得混合物于90℃加热整夜。冷却至室温后，混合物用二氯甲烷(40mL)稀释，然后移入分液漏斗中。加入水(5mL)和盐水(3mL)并摇动。弃去底层，水层用二氯甲烷萃取两次(2×20mL)。结合的有机层用硫酸镁干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。将粗油溶解在丙酮中并通过逐滴加到二乙醚(80mL)中而沉淀。所得粉末经真空干燥(1.90g,产率94％)。
GPC呈现出具有可感知的高-MW肩的单个峰(Mn＝3600Da,9％)(图2A)。主峰的Mn为1980Da，PD为1.1。NMR呈现出预期的峰(参见实施例6)。MALDI-TOF MS呈现出一组最大值在2000Da、PD 1.04和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主要的那组低14Da。该组峰的最大值发生在1600Da。
实施例2：M-PEOZ-OH 2000的第二种现有技术制备。
将氯苯(6.9mL)、乙腈(2.3mL)和三氟甲磺酸甲酯(0.164mL,1.5mmole)在氮气和环境温度下混合。然后在搅拌下缓慢加入2-乙基-2-噁唑啉(3.05mL,3.0g,30mmole)。混合物被加热至70℃并搅拌8小时。然后通过浸没在冰浴中将反应混合物冷却至室温。加入氢氧化钾(2mmol)/甲醇(1mL)，混合物搅拌1小时。然后用二氯甲烷(40mL)萃取混合物。分离出二氯甲烷层并用水(总共40mL)洗涤三次。有机层被干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩至5mL。产物通过加到二乙醚(100mL)中沉淀并在真空下干燥(产量0.7g)。
GPC呈现出具有可感知的高-MW肩的单个峰(Mn＝3300Da,6％)(图2B)。主峰的Mn为2200Da，PD为1.07。NMR呈现出预期的峰(参见实施例6)。MALDI-TOF MS呈现出一组最大值在2300Da和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主要的那组低14Da。该组峰的最大值发生在2100Da。
实施例3：乙基二异丙基胺对M-PEOZ + 终止的影响。
在室温下向2-乙基-2-噁唑啉(1.01mL,10.0mmol)/氯苯(5mL,2M)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.0566mL,0.5mmol)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110℃并搅拌30分钟。将溶液冷却至0℃，加入二异丙基乙基胺(0.261mL.1.5mmol)，所得混合物于50℃搅拌18小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚(50mL)中，以得到白色沉淀。固体物于真空下以几乎为定量产率进行干燥。
GPC呈现出两个峰，一个在约2000Da处(24％)，一个在约3800Da处(76％)。MALDI谱确认了高-和低-MW产物的存在。
实施例4：2,6-二甲基吡定对M-PEOZ + 终止的影响。
在室温下向2-乙基-2-噁唑啉(0.758mL,7.5mmol)/氯苯(3.75mL)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.0424mL,0.375mmol)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110℃并搅拌30分钟。将溶液冷却至0℃，加入2,6-二甲基吡啶(0.170mL.1.5mmol)，所得混合物于50℃搅拌18小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚(20mL)中，得到白色沉淀。固体物于真空下以几乎为定量产率进行干燥。
GPC呈现出两个峰，一个在约2000Da处(89％)，一个在约4000Da处(11％)，这与某些二聚相一致。NMR谱在4.2和5.0ppm处呈现出峰，这与未终止的噁唑啉盐阳离子的存在相一致。
实施例5：尝试用乙醇酸甲酯终止噁唑啉聚合。
在室温下向2-乙基-2-噁唑啉(4.04mL,0.040mol)/氯苯(5mL,2M)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.453mL,0.004mol)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110℃并搅拌30分钟。将溶液冷却至0℃，加入2,6-二甲基吡啶(0.929mL.0.008mol)和乙醇酸甲酯(0.609mL,0.008mol)，所得混合物于室温下搅拌18小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚(1500mL)中，得到白色沉淀。固体物于真空下以几乎为定量产率进行干燥。
NMR在4.46和4.99ppm处呈现出峰，这与噁唑啉盐离子相一致，并与乙醇酸酯未能终止聚合相一致。
实施例6：最适条件下M-PEOZ-OH 2000的制备。
将氯苯(30mL)和MeOTf(344μL,3.0mmol)在氮气下于室温混合并加到2-Et-2-Ox(6.06mL,60mmol)/氯苯(20mL)中。混合物搅拌35分钟，同时加热到110℃。接着将混合物冷却至0℃，然后加入碳酸钠(2.12g)/水(40mL)溶液并搅拌整夜。将混合物倒进分液漏斗中并加入40mL水。除去底层，水层用二氯甲烷萃取(3×60mL)。结合的有机层用硫酸镁干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。将稠油状残余物溶解在7mL二氯甲烷中并于0℃逐滴加到二乙醚(80mL)中。重复此沉淀作用，得到4.2g白色粉末(产率84％)。
NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、及3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-OH)出现在3.8ppm(s)处。GPC呈现出单个峰，无高MW肩并无可感知的谱尾；Mn＝1900Da，多分散性(PD)＝1.03(图3A)。MALDI谱的Mn＝1900Da，且有99.1Da质量单位的分离。计算的PD为1.03。
对硝基苯基碳酸酯衍生作用。将产物转化为对硝基苯基碳酸酯，其然后经纯化并在0.2N NaOH溶液(pH 8)的存在下水解。对硝基苯酚的测定(400nm处的UV吸收，ε＝18,000M-1cm-1)表明-OH取代度为99％。
实施例7：最适条件下M-PEOZ-OH 5000的制备。
将氯苯(80mL)和MeOTf(354μL,3.2mmole)于室温在氮气下于250mL单颈圆底烧瓶中混合。搅拌的同时向烧瓶中缓慢加入2-Et-2-Ox(16.4mL,16.0g,160mmol)。加入噁唑啉后混合物即变混浊。混合物于42℃加热并搅拌一小时。随着加热混合物，混合物变澄清。然后将混合物加热至80℃并搅拌3.75小时。接着通过浸没在冰浴中15分钟而将混合物冷却至室温。
聚合通过加入40mL水和2g碳酸钠并然后搅拌30分钟被终止。分离出水层，有机层被再次用40mL水和1g碳酸钠并然后搅拌30分钟来萃取。分离出水层并与第一水层合并，合并得到的水溶液于室温下搅拌整夜。混浊的水层(～80mL)然后用0.5M HCl(～40mL)酸化直至pH低于6(pH试纸)，并获得澄清溶液。
然后聚合物用二氯甲烷萃取4次(每次200mL)，合并的有机层在搅拌的同时用无水硫酸镁干燥一小时。在真空下蒸发二氯甲烷溶液，将所得残余物溶解在25mL干燥的二氯甲烷中并通过逐滴加到250mL乙醚(室温)中而沉淀。然后将所得白色固体物在真空炉中于50℃干燥整夜。干燥得到白色粉末(14.1g,产率88％)。
NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、及3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-OH)出现在3.8ppm(s)处。GPC呈现出单个峰，保留时间为13.5分钟。Mn＝4100Da，多分散性(PD)＝1.06。Mn(理论)＝4980Da。12.4分钟处的小肩表明有约1％的高MW杂质；Mn＝8900Da(图3B)。MALDI谱的Mn＝4910Da，且有99.1Da质量单位的分离。PD为1.02。对硝基苯基 碳酸酯衍生作用。将产物转化为对硝基苯基碳酸酯，其然后经纯化并在0.2N NaOH溶液(pH8)的存在下水解。对硝基苯酚的测定(400nm处的UV吸收，ε＝18,000M-1cm-1)表明-OH取代度为99％。
实施例8：POZ对硝基苯基碳酸酯的合成
用旋转蒸发浓缩M-PEOZ-OH(10.0g,1.0mmol)/乙腈(80mL)溶液。将残余物溶解在二氯甲烷(40mL)中并在0℃下加入对硝基苯基氯甲酸酯(1.61g,7.96mmol)。逐滴加入吡啶(0.80mL,9.95mmol)，混合物于室温下搅拌三小时。用旋转蒸发浓缩混合物，然后加到二乙醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出溶剂，真空下干燥沉淀。将产物溶解在略酸性的水中，搅拌20分钟并过滤。产物在二氯甲烷中萃取并用硫酸镁干燥。通过旋转蒸发浓缩溶液并加到二乙醚中沉淀。轻轻倒出溶剂，产物在真空下干燥。产量8.7g。NMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)、7.38ppm(d,2H,J＝5.2Hz)和8.29ppm(d,2H,J＝5.2Hz)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-O-CO-)出现在4.42ppm(s)处。对硝基苯基碳酸酯取代。使产物在0.2N NaOH溶液的存在下水解。游离对硝基苯酚的测定(400nm处的UV吸收，ε＝17,000M- 1cm-1)表明-OH取代度为100％。
实施例9：M-PEOZ胺的合成
将M-PEOZ-PNPC(3.60g,0.694mmol)/二氯甲烷(20mL)溶液冷却至0℃并加入乙二胺(2.33mL,34.7mmol)。溶液在冷态搅拌一小时，然后于室温搅拌18小时。混合物用旋转蒸发浓缩，通过加入正丁醇(20mL)稀释，然后通过旋转蒸发除去醇(以共沸除去二胺)。将残余物溶解在二氯甲烷中并加到二乙醚中。轻轻倒出溶剂并将白色粉末溶解在二氯甲烷(100mL)中。溶液用1N NaOH溶液洗涤。水相用二氯甲烷洗涤两次(2×70mL)，合并有机层，并用硫酸镁干燥。溶液被过滤、浓缩并加到乙醚中。轻轻倒出溶剂，白色粉末在真空下干燥。
NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)和3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-OCO-NH-)出现在4.2ppm(br s,2H)处，与乙二胺有关的质子出现在2.82ppm(m,2H,-NH-CH2-CH2-NH2)和3.23ppm(m,2H,-NH-CH2-CH2-NH2)处。
实施例10：POZ琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成
在5mL干燥的二氯甲烷或干燥的乙腈中制备M-PEOZ-OH(0.5g,0.23mmol)的溶液并通过旋转蒸发浓缩。制备二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.24g,0.9mmol)在5mL干燥的二氯甲烷或干燥的乙腈中的悬浮液。向该悬浮液中加入吡啶(0.094mL,1.16mmol)。向上面的悬浮液中逐滴加入M-PEOZ-OH溶液，混合物于室温下搅拌整夜。混合物被过滤，用旋转蒸发浓缩，然后加到二乙醚中。轻轻倒出溶剂，白色粉末在真空下干燥。将粉末溶解在干燥的丙酮中并通过加到二乙醚中沉淀。产量0.6g。NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)、2.70ppm(s,4H,SC基团)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-O-CO-)出现在4.24ppm(s)处。
实施例11：M-PEOZ-T-COOH 2000的合成
a.甲酯的合成
按如上所述在氯苯中制备1mmol M-PEOZ+的溶液。将溶液冷却至室温。在0℃下向NaH(0.12g,5mmol)/THF悬浮液中逐滴加入3-巯基丙酸甲酯(0.65mL,6mmol)。然后将M-PEOZ+溶液缓慢加到THF溶液中。使所得混合物升温至室温并搅拌整夜。反应混合物被过滤并加到醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出溶剂，固体物在真空下干燥得到1.5g白色粉末。
NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-COO-CH3)出现在2.64ppm(s)处，其邻近的亚甲基(S-CH2-CH2-CO-)出现在2.81ppm(s)处，与硫基团相邻的亚甲基(-CH2-S-CH2-)出现在2.71ppm(s)处。甲酯基团(-CH2-COO-CH3)在3.71ppm处以尖锐的单峰出现。
硫代酸的合成
制备上面的酯(8.1g,0.004mol)在20mL甲醇中的溶液并与30mL 0.05N NaOH溶液(0.02mol)混合。混合物于室温下搅拌40分钟，然后用5％的HCl酸化。通过旋转蒸发除去甲醇，溶液用二氯甲烷萃取。萃取物用硫酸镁干燥，过滤，浓缩并加到醚中沉淀。轻轻倒出醚，残余物在真空下干燥。NMR谱表明3.71ppm处的甲酯峰消失。GPC表明有6％的高MW肩。主峰的Mn为1870Da，PD为1.15。上面的样品通过离子交换色谱用DEAE琼脂糖凝胶FF介质纯化。产物的GPC给出没有高-MW肩的单个主峰，Mn为1970Da，PD为1.08。MALDI给出的Mn为2090Da，PD为1.04。
实施例12：M-PEOZ-T-丙酸(M-PEOZ-T-PA)1000的合成
如上所述，用2-乙基-2-噁唑啉(5.05mL,50mmol)和三氟甲磺酸甲酯(0.63mL,5.56mmol)在氯苯(25mL)中制备M-PEOZ+。为获得终止试剂，在0℃下向叔丁醇钾(1.25g,11.1mmol)/氯苯(10mL)悬浮液中逐滴加入3-巯基丙酸甲酯(2.41mL,22.2mmol)。混合物在冷态搅拌2小时后，逐滴加入M-PEOZ+/氯苯溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌18小时。加入水(50mL)并通过加入5％的HCl水溶液使混合物酸化(pH～3)。用旋转蒸发除去挥发物(包括氯苯)。所得水溶液用NaOH(1.33g,33.3mmol)/H2O(70mL)溶液处理。搅拌1小时后，用5％的HCl水溶液使混合物酸化，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻轻倒出醚，残余物在真空下干燥。通过离子交换色谱用DEAE琼脂糖凝胶FF介质进行进一步的纯化。GPC和GFC呈现出单个峰，Mn为910Da，PD为1.02。MALDI给出的Mn为1100Da，PD为1.05。
实施例13：M-PEOZ-T-丙酸NHS酯(M-PEOZ-T-SPA)的合成
于0℃下向来自上面的制备的M-PEOZ-T-CO2H(Mn 910Da,2.0g,2.20mmol)/二氯甲烷(44mL)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.467g,2.26mmol)和DCC(0.467g,2.26mmol)。在冷态搅拌2小时后，使混合物升温至室温并搅拌整夜。用针头过滤器过滤混合物并将滤液加到二乙醚中得到白色粉末。产物通过真空过滤收集并在真空下干燥(2.0g,产率89％)。琥珀酰亚胺基的连接得到1H NMR谱的证实，该谱示出除普通的主链峰外还在2.86ppm(s,2H)处有琥珀酰亚胺基质子。为确定产率，将化合物(Mn计算值1025Da,0.4g,0.39mmol)在二氯甲烷(4mL)中用苯乙胺(0.15mL,1.17mmol)和三乙胺(0.16mL,1.17mmol)处理。搅拌整夜后，混合物被过滤并加到二乙醚中。白色粉末被过滤并用真空干燥。根据凝胶渗透色谱，转化产率为99％。
实施例14：经由硫醇盐合成M-PEOZ-硫代-NH 2
tBoc酯的合成
向2-乙基-2-噁唑啉(5.05mL,0.05mol)/氯苯(25mL)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.283mL,0.0025mol)。室温搅拌10分钟后将混合物加热至110℃并保持30分钟，然后冷却至0℃。为获得终止试剂，在0℃下向叔丁醇钾(0.561g,0.005mol)/氯苯(5mL)悬浮液中逐滴加入Boc-半胱胺(0.84mL,0.0075mol)。混合物在冷态搅拌1小时以得到澄清溶液后，在0℃下用注射器逐滴加入M-PEOZ+/氯苯溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌18小时。将混合物缓慢加到二乙醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出醚，将残余物溶解在水中，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。过滤混合物，残余的白色粉末在真空下干燥得到4.0g目标化合物，产率为87％。
NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(s)和2.41ppm(s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、及3.47ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm和3.03ppm处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。Boc半胱胺端基峰出现在1.44ppm(s,9H,-CH2NHBoc)、2.67ppm(m,2H,-SCH2CH2NHBoc)、2.71ppm(m,2H,-CH2SCH2CH2NHBoc)和3.32ppm(m,2H,-SCH2CH2NHBoc)处。根据NMR积分，粗混合物含约8％的M-PEOZ-OH物类。GPC产生Mn＝1790Da、PD＝1.07的尖锐峰。
胺的合成
在0℃及剧烈搅拌下将盐酸(二氧六环中的4M溶液，34.0mL)加到含M-PEOZ-T-NH(Boc)(Mn 1850Da,3.218g,1.74mmol)的烧瓶中。使混合物升温至室温并搅拌1小时。通过旋转蒸发浓缩混合物并用水(50mL)稀释，调节pH至～13。所得水溶液用二氯甲烷萃取三次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，在醚中沉淀以得到白色粉末，过滤该白色粉末并在真空下干燥，得到2.5g产物。通过离子交换色谱用CM琼脂糖凝胶FF介质进行进一步纯化。通过柱纯化收集两个馏分。一个0.2g的馏分含纯胺聚合物，第二个2.2g的馏分含胺聚合物和8％的从前一步骤带来的杂质(M-PEOZ-OH)。
1H NMR(Varian,500MHz,10mg/mL CDCl3)在1.14ppm(m,3H,CH3CH2CO-)、2.32ppm(m)和2.41(s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、及3.47ppm(m,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm和3.03ppm处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端半胱氨基峰见于2.69ppm(m,4H,-SCH2CH2NH2,-CH2SCH2CH2NH2)和2.91ppm(m,2H,-SCH2CH2NH2)处。Boc基团的移除通过1.44ppm(s,9H,-CH2NHBoc)处峰的消失得到证实。GPC示出Mn值为1700Da，PDI为1.10。
实施例15：M-PEOZ-T-SCM(M-PEOZ-S-CH 2 -CO 2 -NHS)的合成
酸的合成
在氩气下混合氯苯(100mL)与2-乙基-2-噁唑啉(39.7g,0.4mol,50eq.)并于0℃搅拌30分钟。搅拌下向烧瓶中加入三氟甲磺酸甲酯(1.31g,1eq.)，继续在0℃搅拌30分钟、在25℃搅拌30分钟、在42℃搅拌1小时、然后在80℃搅拌3.5小时。使混合物冷却至室温。在单独的烧瓶中通过混合叔丁醇钾(2.25g,5eq.)和2-巯基乙酸甲酯(2.9g,6eq.)及氯苯(100mL)并于0℃搅拌1小时制备终止混合物。将聚合混合物加到终止混合物中并于室温搅拌整夜。混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，过滤并加到二乙醚(750mL)中。轻轻倒出上清液，收集沉淀，在真空下干燥1小时。将粉末溶解在100mL 0.1M NaOH中并搅拌4小时。通过加入25mL 0.5M HCl使混合物酸化。水溶液用二氯甲烷萃取(150mL×3次)，用MgSO4干燥，浓缩至50mL，并在二乙醚(400mL)中沉淀。所得白色粉末在真空下干燥。
所得酸通过DEAE离子交换色谱纯化得到纯酸(如GFC色谱所示)。NMR表明1.30和4.19ppm处酯的甲基和亚甲基峰已分别消失。
NHS酯的合成
于0℃下向含溶解在二氯甲烷(60mL)中的M-PEOZ-T-CM(M-PEOZ-S-CH2-CO2H,Mn4970Da,6.0g,1.21mmol)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.139g,1.21mmol)和DCC(0.249g,1.21mmol)。在此温度搅拌2小时后，使该澄清的无色混合物升温至室温并搅拌整夜。含白色沉淀的混合物用针头过滤器过滤。搅拌下将滤液加到二乙醚中，得到白色粉状沉淀。残余物用烧结玻璃漏斗收集并在真空下干燥，得到5.2g所需产物(产率85％)。
H1-NMR：羟基琥珀酰亚胺的连接得到1H NMR谱的证实，该谱表明除PEOZ的普通的主链峰外还在2.87ppm(s,4H)处有琥珀酰亚胺基质子。
为确定转化产率，将该化合物(Mn计算值5070Da,0.100g,0.0197mmol)在二氯甲烷(2mL)中用苯乙胺(0.012mL,0.0987mmol)和三乙胺(0.014mL,0.0987mmol)处理。搅拌整夜后，混合物被过滤并加到二乙醚中。过滤白色粉末并用真空干燥，得到定量产率的所需酰胺。根据GFC，转化产率为95+％。
实施例16：硫代NHS酯的水解速率
硫代NHS酯M-PEOZ-T-SCM 5K和M-PEOZ-T-SPA 5K的反应性在pH 8的硼酸盐缓冲溶液中评价。精确称量的两种酯的样品，置于100mL容量瓶中，并溶解在pH 8的硼酸盐缓冲溶液(0.2M)中。先每1分钟、后每10分钟从各烧瓶中取等分试样并通过UV-分光光度计于260nm的最大吸收波长(λmax)下分析。以吸光度值增加的速率对时间作图。从这些计算确定最大吸光度值的50％时的速率。M-PEOZ-T-SCM 5K和M-PEOZ-T-SPA 5K的t1/2计算值分别为<1分钟和15分钟。
实施例17：M-PEOZ-OCO 2 -NHS与GCSF的偶联
按如下所述使单官能衍生物M-PEOZ-OCO2-NHS与靶分子(本实施例中为GCSF)偶联。溶解在1ml 0.2M的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的4mg GCSF(0.215μmol,MW＝18.6kDa)与每GCSF氨基(总共5个赖氨酸加α-胺)3当量的M-PEOZ-OCO2-NHS在室温下反应60分钟。在这些反应条件下，单官能POZ衍生物与GCSF上的氨基间的反应主要发生在更裸露的亲核胺上。
GCSF的修饰通过RP-HPLC采用C18Agilent分析柱分析，该柱平衡于60％的缓冲溶液A(HPLC级水，含0.05％的TFA)中并用1％的缓冲溶液B/min(70％CH3CN和0.05％TFA)的线性梯度以1ml/min的流速洗脱30分钟。洗脱的物质通过280nm下的吸光度检测。GCSF-POZ偶联物呈非对称峰被洗脱，保留时间为18.8分钟，其表明了GCSF-POZ偶联物在与GCSF分子偶联的POZ分子数方面的不均一性。氨基含量的Habeeb分析表明70％的蛋白质氨基不再是游离的。
若干偶联物的形成通过SDS-PAGE及通过尺寸排除HPLC确认。SDS-PAGE实验用Pharmacia Phast System进行。微型凝胶(12％的聚丙烯酰胺)上施加恒定电压(200V)，并按Laemmli的方法制备。对于蛋白质染色，将凝胶置于Coomassie蓝色溶液中，而对于聚合物染色，使用碘化钡溶液。聚合物染色基于碘化钡络合物的形成(Kurfust,M.M.,1992,Analytical Biochemistry,200,244-248)。SDS-PAGE数据显示出若干条带，表明获得了化学上不同的分子GCSF偶联物的混合物，这样的偶联物包含一个、两个或三个POZ分子。
尺寸排除HPLC分析用Biosep SEC S2000分析柱进行，该柱用0.1M磷酸钠、0.2M氯化钠(pH 7.2)和20％乙腈的等强度流动相以0.5ml/min的流速洗脱。洗脱的物质通过280nm下的吸光度检测。色谱在5.75min处呈现出洗脱峰，其对应着比天然蛋白质(洗脱峰在9.00min处)高的分子量，表明形成了GCSF-POZ偶联物。
实施例18：M-PEOZ-OCO 2 -NHS与核糖核酸酶A的偶联
按如下所述使单官能POZ衍生物M-PEOZ-OCO2-NHS与靶分子(本实施例中为核糖核酸酶A(RNAse A))偶联。溶解在1ml 0.2M的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的5mg RNAse A(0.36μmol,MW 13kDa)与每RNAse A氨基(总共5个赖氨酸加α-胺)3当量的M-PEOZ-OCO2-NHS反应。反应在室温下进行60分钟。RNAse A修饰的程度通过RP-HPLC采用C4Agilent分析柱分析，该柱平衡于80％的缓冲溶液A(HPLC级水，含0.05％的TFA)中并用1％的缓冲溶液B/min(90％CH3CN和0.05％TFA)的线性梯度以1ml/min的流速洗脱30分钟。洗脱的物质通过280nm下的吸光度检测。色谱表明有少量(<10％)未被修饰的蛋白质。POZ-修饰蛋白质的峰很宽，表明了RNAse A-POZ偶联物在与RNAse A分子偶联的POZ分子数方面的不均一性。氨基含量的Habeeb分析表明RNAse A上26％的氨基被修饰。
若干偶联物的形成通过SDS-PAGE及通过尺寸排除HPLC确认。SDS-PAGE实验用Pharmacia Phast System进行并按上面的实施例中所述染色。同GCSF结果一样，SDS-PAGE数据显示出若干条带，表明有若干不同的RNAse A-POZ偶联物。尺寸排除HPLC分析用BiosepSEC S2000分析柱按上面的实施例中所述进行。色谱较早出现宽峰，其对应着比天然蛋白质高的分子量，这与RNAse A-POZ偶联物的形成相一致。
实施例19：M-PEOZ-马来酰亚胺和邻二硫吡啶的制备
本实施例中自M-PEOZ-NH2(见上)制备单官能POZ衍生物M-PEOZ-马来酰亚胺。向100mg(0.55mmol,3eq)4-马来酰亚胺丁酸中加入无水氯仿中的126mg HOBT(1.09mmol)和226mg DCC(1.09mmol)。3小时后加入16mg(0.00254mmol)M-PEOZ-NH2。所得溶液在室温下保持整夜。反应混合物用0.1N HCl洗涤，干燥，并真空蒸发。加入乙醚，通过过滤收集沉淀并干燥。反应产率为65％。
以同样的方式通过在氯仿中于室温下及三乙胺(3eq.)存在下偶联琥珀酰亚胺丙酸二硫吡啶(SPDP)(3倍过量)与M-PEOZ-NH2 5小时制备邻二硫吡啶(OPSS)试剂。最终产物在醚中沉淀获得，产率为65％。
实施例20：M-PEOZ-马来酰亚胺、M-PEOZ-OPSS、PEG-马来酰亚胺和PEG-OPSS与硫醇 的反应的比较
为评价M-PEOZ-马来酰亚胺和M-PEOZ-OPSS的反应性以及比较M-PEOZ-马来酰亚胺和M-PEOZ-OPSS衍生物与它们的相应的PEG衍生物的反应性，将PEOZ和PEG聚合物偶联到含半胱氨酸的三肽谷胱甘肽上。与谷胱甘肽的反应用本领域中熟知的Ellman’s分析监测。在0.1M pH＝7的磷酸盐缓冲溶液(含5mM EDTA)中制备20mM PEOZ或PEG衍生物和2mM硫醇的溶液。取等分试样(30μl)并通过加入到920μl pH 7的缓冲溶液猝灭。加入50微升DTNB，5分钟后测定420nm下的吸光度来评价剩余的硫醇。半胱氨酸修饰的程度在表4中给出。
实施例21：M-PEOZ-对硝基苯基碳酸酯和PEG-对硝基苯基碳酸酯的水解和氨解研 究
M-PEOZ-对硝基苯基碳酸酯和相应的PEG-对硝基苯基碳酸酯的水解速率通过释放在0.1M pH 8的硼酸盐缓冲溶液中的对硝基苯酚在室温和412nm下的UV吸光度或聚合物对胺的反应性评价。本实施例中向活化的PEOZ或PEG溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比率1:1)的溶液。表5以半衰期记载了水解和氨解速率。
实施例22：M-PEOZ-O-CH 2 -CO 2 H的制备
在60ml甲苯中共沸蒸馏M-PEOZ-OH(1.5g,0.00024mol,1eq)；除去30ml蒸馏物。使反应混合物缓慢冷却至室温，然后加入0.5ml(0.5mmol)1.0M的叔丁醇钾/叔丁醇溶液。所得混合物在室温下搅拌1小时，然后加入94mg(0.48mmol)溴代乙酸叔丁酯。将所得混浊混合物加热至回流，冷却并于室温下搅拌18小时。反应混合物通过Celite过滤并在真空下除去溶剂。残余物在乙醚中沉淀。产物于4℃离心，洗涤三次并除去溶剂。NMR中叔丁基峰(1.47ppm)与末端甲基峰的比较表明为定量转化。
将所得羧酸叔丁酯溶解在CH2Cl2/三氟乙酸/水(50ml/0.1ml/100ml)的混合物中，溶液于室温搅拌3小时。然后在真空下除去溶剂以完全除去TFA，然后在乙醚中离心，得到900mg产物(60％)。NMR表明叔丁基峰已消除而在4.08ppm处观察到新的亚甲基峰。
通过阴离子交换色谱从过量的M-PEOZ-OH中纯化羧酸。将900mg产物装入预平衡的柱(QAE 50)中，流速为1ml/min。用水进行等强度洗脱直至M-PEOZ-OH被完全洗脱。将溶剂换为0.01N的NaCl并收集产物。馏分通过I2分析鉴定。在真空下浓缩馏分至30ml并用CH2Cl2洗涤六次(40ml×6)。产量为600mg。
实施例23：M-PEOZ-O-CH 2 -CO 2 -NHS的制备
将M-PEOZ-COOH(600mg,0.11mmol)溶解在15mL二氯甲烷中，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(104mg,0.9mmol)和DCC(185mg,0.9mmol)。让反应混合物反应24小时，然后通过加入乙醚沉淀产物，通过过滤收集产物并干燥。根据用于测定残余NH2基团的TNBS测得的作为底物的甘氨酸-甘氨酸的氨基修饰率确定活化度为85％。
实施例24：M-PEOZ-O-CH 2 -CO 2 -NHS和PEG-O-CH 2 -CO 2 -NHS的水解和氨解研究
M-PEOZ-O-CH 2 -CO2-NHS和PEG-O-CH 2 -CO2-NHS的水解速率通过测定释放在0.1M pH8的硼酸盐缓冲溶液中的N-羟基琥珀酰亚胺在室温和260nm下的UV吸光度来评价。为评价聚合物对胺的反应性，向M-PEOZ-O-CH 2 -CO2-NHS和PEG-O-CH 2 -CO2-NHS(按本领域中熟知的那样制备)溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比率1:1)的溶液，以用于比较。表6以半衰期记载了水解和氨解。
实施例25：M-PEOZ-O-CH 2 -CO 2 -NHS与GCSF的偶联
溶解在1ml 0.2M的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的2.5mg GCSF(0.134μmol,MW＝18.6kDa)与每GCSF氨基(总共5个赖氨酸加α-胺)3当量的M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS在室温下反应60分钟。在这些条件下，修饰主要发生在更裸露的亲核胺上。
GCSF的修饰通过RP-HPLC采用C18Agilent分析柱分析。洗脱剂A为含0.05％TFA的H2O，洗脱剂B为含0.05％TFA的乙腈。流速为1ml/min，检测在280nm下进行。所用梯度为0分钟时B为30％；30分钟内B从30％变到80％，3分钟内B从80％变到30％。色谱表明无游离蛋白质存在，且在比游离GCSF晚的保留时间下出现宽峰，表明存在GCSF-POZ的多种形式。
若干偶联物的形成通过尺寸排除HPLC确认。尺寸排除HPLC分析用Agilent GF-250柱进行，该柱用0.1M磷酸钠、0.2M氯化钠(pH 7.2)和20％乙腈的等强度流动相以0.3ml/min的流速洗脱。色谱呈现出宽洗脱峰，这对应着比天然GCSF具有更高分子量的GCSF-POZ偶联物，并与广泛的偶联和质量的增加相一致。
实施例26：经M-POZ-O-CH 2 -CO 2 -NHS和PEG-O-CH 2 -CO 2 -NHS修饰的酶的性质的比较
为评价因与本公开的POZ衍生物和本领域中熟知的相应PEG聚合物的聚合对酶性质的影响，将三种不同的酶——核糖核酸酶A、尿酸酶和过氧化氢酶用M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS(6kDa)和PEG-O-CH2-CO2-NHS(5.5kDa)修饰。为便于比较，各酶在就聚合物-酶比率、缓冲溶液、pH和反应温度方面而言相似的条件下被修饰。
用上述POZ和PEG聚合物修饰酶的条件为0.2M、pH 8.5、硼酸盐缓冲溶液。修饰所用POZ和PEG聚合物的量根据各酶中总共可利用的氨基的计算值来计算。例如，核糖核酸酶A的分子量为13.7kDa，有11个可利用的氨基；尿酸酶的分子量为130kDa，有100个可利用的氨基；过氧化氢酶的分子量为240kDa，有112个可利用的氨基。
室温下分别以2/1和1/1的聚合物-蛋白质氨基摩尔比向三种酶溶液(2.5mg/ml)中加入M-POZ-O-CH2-CO2-NHS或PEG-O-CH2-CO2-NHS固体。天然形式的核糖核酸酶、尿酸酶和过氧化氢酶的蛋白质浓度分别用9.45×103、13×103和1.67×105的摩尔消光系数在280nm下用分光光度法评价。30分钟后，通过凝胶过滤色谱Sephadex G-75柱用0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液作洗脱剂从未反应的聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺中纯化聚合物-酶偶联物。
用比色法通过TNBS分析评价蛋白质修饰度并以偶联的氨基对蛋白质上存在的总的氨基的百分数表示。天然和经修饰的酶的酶活性按如下评价：核糖核酸酶活性通过Crook等(Biochem J.1960Feb；74:234-8)的方法分析；尿酸酶活性通过Mahler的方法测定(AnalBiochem.1970Nov；38(1):65-84)；过氧化氢酶按Beers和Sizer报道的方法分析(J.Biol.Chem.1952Mar；195(1):133-40)。
核糖核酸酶(RNAse)、尿酸酶和过氧化氢酶的结果分别在表7A-C中给出。
发现当用PEG-O-CH2-CO2-NHS修饰时比用M-POZ-O-CH2-CO2-NHS修饰时核糖核酸酶被修饰的程度高并因此有更高的活性损失。在尿酸酶中，使用PEG-O-CH2-CO2-NHS和M-POZ-O-CH2-CO2-NHS时的修饰度和活性损失相似；但在受试的两种摩尔比下POZ偶联物表现出略高的活性。对于过氧化氢酶，使用PEG-O-CH2-CO2-NHS和M-POZ-O-CH2-CO2-NHS时的修饰程度相似，且注意到两种情况下酶活性的损失均较小，且在受试的两种摩尔比下POZ偶联物的活性比PEG偶联物更高。
实施例27：TGAse下M-PEOZ-NH 2 与G-CSF的偶联
本实施例中检查了使用酶TGAse时POZ-NH2对G-CSF的位点特异性修饰。也用PEG-NH2和相同的试剂浓度进行相同的反应作为比较。
如上所述从产物M-PEOZ-OH开始制备单官能烷基胺M-PEOZ衍生物。TGAse-催化的M-PEOZ-NH2和PEG-NH2与G-CSF的偶联在0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中于室温进行18小时，其中使用1.6mg G-CSF、50mg任一胺和2mg/ml TGAse(市场上可获得)。在这些条件下，G-CSF与M-PEOZ-NH2没有显著或明显的偶联发生(如反相色谱所示；详情见上)，而PEG-NH2给出明显的偶联。
当向M-PEOZ-NH2的反应混合物中再加入2mg/ml TGAse酶时，天然G-CSF蛋白质峰将减小并观察到代表偶联物M-PEOZ-G-CSF的新峰。
实施例28：M-PEOZ醛的制备
二醇的制备
在细颈瓶中制备3-氨基-1,2-丙二醇(1.41gm,15mmol)/0.1M pH 8.0的硼酸缓冲溶液(3mL)。用浓HCl调节溶液pH至pH 9。剧烈搅拌下向该溶液中加入如上所述制备的M-PEOZ NHS酯(1.00gm,0.197mmol)。加入1N NaOH使溶液pH保持在9。溶液在室温下搅拌三小时。用1N HCl调节溶液pH至pH 6.8。向溶液中加入氯化钠(3gm)。向溶液中加入水(1mL)，然后用二氯甲烷萃取三次(3×10mL)。弃去水相。有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。浓缩溶液在二乙醚(100mL)中沉淀。所得粉末在高真空下干燥整夜。产量：0.7gm。根据NMR，取代度为96％；根据GFC，取代度为95％。在DMSO-d6中的NMR：-C(＝O)NHCH2CH(OH)CH2OH：1H,δ4.49,t；-C(＝O)NHCH2CH(OH)CH2OH:1H,δ4.70,d；-C(＝O)NHCH2CH(OH)CH2OH:1H,δ7.87,t(分辨率不良)。
氧化成醛
将二醇(0.500gm,0.112mmol)溶解在水(8mL)中。通过加入0.1N NaOH调节溶液pH至6.85，然后加入高碘酸纳(27.9mg,0.130mmol)。溶液于室温搅拌一小时。向溶液中加入水(2mL)和NaCl(2gm)。用二氯甲烷萃取溶液三次(3×10mL)。合并的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤混合物，然后在减压下浓缩滤液。残余物通过加到乙醚(50mL)中而沉淀。过滤后所得粉末在高真空下干燥。产量：0.47gm。GPC测得Mn为4840Da。根据CDCl3中的NMR，醛取代度为89％。CDCl3中的1H-NMR：-C(＝O)NHCH2CHO,1H,δ9.635,s；-C(＝O)NHCH2CHO,2H,δ4.175,q(分辨率差)。
实施例29：从M-PEOZ-PNPC合成M-PEOZ马来酰亚胺2K
向二氯甲烷(5mL)中N-(2-氨乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(0.065g,0.255mmol)和三乙胺(0.097mL,0.696mmol)的混合物中加入如上所述制备的M-PEOZ对硝基苯基碳酸酯(Mn 2150Da,0.500g,0.232mmol)。室温搅拌18小时后，混合物被过滤，然后逐滴加入二乙醚中，得到淡黄色沉淀。轻轻倒出溶剂，固体物在真空下干燥，得到定量产率。除普通的主链峰外，1H NMR谱还表明在4.15ppm(br s,2H)处有末端亚甲基质子(-CH2-OCO-NH-)且在6.72ppm(s,2H)处有与马来酰亚胺有关的质子。通过比较引发甲基和马来酰亚胺的积分，确定产率为～80％。
实施例30：经由异烟酸乙酯合成M-PEOZ NHS酯
乙酯的合成
在室温下向2-乙基-2-噁唑啉单体(50.47mL,0.500mol)/氯苯(250mL)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(2.83mL,25.0mmol)。搅拌10分钟后，将反应混合物加热至110℃并保持40分钟。将反应混合物冷却至0℃，然后加入异烟酸乙酯(11.55mL,75.0mmol)。所得混合物于室温搅拌2小时后，在醚(1500mL)中沉淀，得到57g白色粉末。将沉淀溶解在200mL H2O中，然后用200mL二氯甲烷萃取三次。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将稠油状残余物溶解在CH2Cl2(100mL)中并在二乙醚(1000mL)中沉淀。轻轻倒出溶剂后，残余物经真空干燥得到43.5g白色粉末，产率为86％。NMR(500MHz,10mg/ml CDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(总面积2H,CH3CH2CO-)、及3.46ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。哌啶峰出现在1.68ppm(br s,3H)、1.90ppm(br s,2H)、2.15ppm(br s,2H)和2.84ppm(br s,2H)处。末端乙酯峰出现在1.26ppm(t,3H,J＝7.0MHz,-C(＝O)OCH2CH3)和4.13ppm(q,2H,J＝6.5MHz,-C(＝O)OCH2CH3)处。GPC表明Mn＝1770Da，PD＝1.06。MALDI给出Mn＝2050Da，PD＝1.02。
酸的合成
将M-PEOZ乙酯(Mn＝2050Da,10.0g,4.89mmol)溶解在H2O(60mL)中。加入NaOH(0.977g,24.4mmol)/H2O(20mL)溶液，混合物被搅拌40分钟。用5％的HCl水溶液酸化混合物，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻轻倒出醚，残余物在真空下干燥得到9.0g白色粉末，产率为91％。1H NMR表明水解后乙酯基峰已完全消失。
NHS酯的合成
在0℃下向M-PEOZ-CO2H(Mn 2020Da,3.0g,1.49mmol)/二氯甲烷(50mL)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.173g,1.50mmol)和DCC(0.310g,1.5mmol)。在冷态搅拌2小时后，使混合物升温至室温并搅拌整夜。过滤混合物并将滤液加到二乙醚中，得到白色粉末。通过过滤收集产物并在真空下干燥(2.8g,产率93％)。1H NMR谱在2.89ppm(s,2H)处呈现出琥珀酰亚胺基质子并有普通的主链峰。
实施例31：尝试制备M-PEOZ-甲磺酸盐
按如上所述制备M-PEOZ-OH 2K。将M-PEOZ-OH 2K(1.00gm,0.608mmol)溶解在无水乙腈(20mL)中并在旋转蒸发器上蒸发至近干。将残余浆料再次溶解在乙腈(20mL)中并通过旋转蒸发蒸发至近干。加入无水二氯甲烷(5mL)。在缓慢的氩气流下先后加入三乙胺(169.3μL,1.215mmol)和甲磺酰氯(84.6μL,1.094mmol)。溶液在氩气氛下于室温搅拌整夜。通过旋转蒸发浓缩溶液。通过加到二乙醚中使浓缩溶液沉淀。收集沉淀并在高真空下干燥。产量：0.6gm。CDCl3中的NMR表明有-CH2CH2OMs(δ4.44)的峰，但面积与仅有约50％转化的情况相一致。-OMs的低取代归因于形成甲磺酸盐后形成噁唑啉盐离子的副反应。CDCl3中的NMR在δ5.01(2H,t,带正电荷的五员环:-O-CH2CH2N)和δ4.44(2H,t,相同的五员环:-O-CH2CH2N；位移与-CH2-OMs同)处呈现出峰。
实施例32：M-PPOZ-OH的合成
向刚干燥并蒸馏的2-正丙基-2-噁唑啉(0.500g,4.42mmol)与刚干燥并蒸馏的氯苯(2mL)的混合溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(MeOTf,25.0μL,0.221mmol)。搅拌10分钟后，将混合物加热至110℃并保持20分钟。将混合物冷却至0℃并用NaOH(0.044g,1.11mmol)/甲醇(2mL)溶液终止。NMR(500MHz,10mg/mL CDCl3)在0.95ppm(s,3H,CH3CH2CH2CO-)、1.65ppm(s,2H,CH3CH2CH2CO-)、2.25ppm(小s)和2.34ppm(大s)(总面积3H,CH3CH2CH2CO-)、及3.45ppm(s,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.94ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2，总面积3H)。末端亚甲基(-OCH2-OH)出现在3.8ppm处。粗混合物的GPC表明Mn＝1760Da，PD＝1.1。
实施例33：M-PPOZ-硫代丙酸的合成
按如上所示用2-丙基-2-噁唑啉(5.66mL,50mmol)和三氟甲磺酸甲酯(0.808mL,7.14mmol)在氯苯(25mL)中加热至110℃保持25分钟并然后冷却至0℃制备M-PEOZ+。为获得终止试剂，在0℃下向叔丁醇钾(1.60g,14.3mmol)/氯苯(14mL)悬浮液中逐滴加入3-巯基丙酸甲酯(3.09mL,28.6mmol)。混合物在冷态搅拌2小时后，用注射器逐滴加入M-PEOZ+/氯苯溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌18小时。加入水(30mL)并通过加入5％的HCl水溶液使混合物酸化(pH～3)。用旋转蒸发除去挥发物(包括氯苯)。所得水溶液用H2O(60mL)和固体NaOH(1.43g,35.7mmol)稀释。搅拌1小时后，用5％的HCl水溶液使混合物酸化，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻轻倒出醚，残余物在真空下干燥得到粘稠而澄清的黄色油。GPC呈现出单个主峰，Mn为867Da，PD为1.01。GFC表明粗产物含两种不同的物类：M-PPOZ-T-CO2H(80％)和M-PPOZ-T-OH(20％)。
实施例34：M-PEOZ-T-视黄酸的合成
将视黄酸(0.0102g,0.0425mmol)和羟基苯并三唑(HOBt,0.0115g,0.0849mmol)溶解在乙腈(10mL)中并用旋转蒸发共沸。将残余物再溶解在二氯甲烷(3mL)中。加入固体DCC(0.0088g,0.0425mmol)，混合物搅拌2小时。向混合物中加入M-PEOZ-NH2 4300Da(0.122g,0.0283mmol)并搅拌40小时。将混合物缓慢加到二乙醚中，得到浅黄色粉末。过滤产物并干燥，得到0.0823g产物，产率为63％。
实施例35：用M-PEOZ-SCM修饰Ara-C及偶联物活性
POZ-偶联
将M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS(M-PEOZ-SCM 5000)(180mg,0.034mmol)溶解在11mL吡啶中并于0℃下加到事先溶解在5mL无水吡啶中的胞嘧啶阿拉伯糖(Ara-C)(5.7mg，0.023mmol)溶液中。所得溶液于室温搅拌72小时。反相HPLC(C-18柱)表明反应完全。蒸发除去溶剂后将产物溶解在二氯甲烷(5mL)中并逐滴加到150mL醚中。于4℃离心收集沉淀并在真空下干燥。产量150mg，产率80％。NMR呈现出M-PEOZ主链的普通峰(见上)及在7.31、7.67、8.16和8.62ppm处呈现出Ara-C的嘧啶质子峰。将偶联物暴露于pH 8缓冲溶液后显示Ara-C缓慢释放(24小时后释放15％)，故该偶联物可被视为前药。
偶联物活性
将按标准程序培养的人子宫颈腺癌细胞(HeLa)接种在24孔细胞培养板的各孔中。24小时后更换新鲜的培养基并用浓度渐增的M-PEOZ-Ara-C或游离的Ara-C(20mM,Ara-C中)的水溶液处理细胞。将细胞在标准条件下孵育72小时。进行台盼蓝检测确定细胞活力。该检测发现偶联的Ara-C对Hela细胞有细胞毒性，但比游离的Ara-C的细胞毒性低约30倍，这与偶联物的缓慢释放过程相一致。与以类似方式制备的PEG-Ara-C的比较表明，PEG-和POZ-偶联物具有相似的性质。
实施例36：H-PEOZ-S-CH 2 CH 2 -CO 2 H的合成
在环境温度和氩气下混合氯苯(25mL)与2-乙基-2-噁唑啉(9.92g,0.1mol,200eq.)并冷却至0℃。搅拌下加入三氟甲磺酸(0.075g,1eq.)，反应混合物被搅拌30分钟。然后将混合物加热至80℃并搅拌7小时。通过使叔丁醇钾(168mg,3eq.)与3-巯基丙酸甲酯(0.360g,6eq.)在0℃下反应6小时单独制备终止混合物。将终止混合物在0℃下加到聚合反应中，然后于室温搅拌整夜。然后将溶液与50mL0.25M的氢氧化钠混合并搅拌一小时。分离水层，用氯化钠饱和，并用二氯甲烷萃取(250mL×3)。通过旋转蒸发除去二氯甲烷，聚合物在真空下干燥。
所得酸通过DEAE色谱纯化，得到1.5克白色粉末。质子NMR在1.12ppm(m,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(m)和2.41ppm(s)(面积2H,CH3CH2CO-)、及3.47ppm(m,4H,-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。丙酸酯亚甲基峰出现在2.74、2.81和2.85ppm处。GFC呈现出单个峰。GPC给出Mn为15,200Da，PD为1.09。
前面的描述说明和描述了本公开的化合物和应用的某些实施方案。此外，本公开仅示出和描述了所述化合物和应用的示例性实施方案，如上面所提到的，应理解本公开的公开能用于各种其他组合、变型和环境中并能与上面的公开和/或相关领域技能或知识相适应地在本文中所明确的构思范围内变化和改变。上文中描述的实施方案还意在说明已知的实施本发明的最佳方式以及使本领域技术人员能以这样或那样的实施方案及本发明的特定应用或用途所需的各种变型利用本发明。因此，本说明书非意在限制本发明于本文中所公开的形式。本文中引用的所有参考文献通过引用结合到本文中，就好像完全是本公开中给出的一样。

Claims (22)

1.一种合成末端活化的聚噁唑啉POZ化合物的方法，所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物具有基本结构R1-[N(COR7)CH2CH2]n-S-Qq-X，所述方法包括步骤：
(a)引发POZ聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的POZ聚合物；以及
(b)用结构为R25S-Dd-X的硫醇盐终止所述POZ聚合物，
其中，
X为活性官能团或能转化为活性官能团的基团；
R25为金属；
D为连接基团；
d和q为1；
Q为连接基团；
POZ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
R1是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；以及
n为从3至1000的整数；
其中，
所述活性官能团能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-POZ偶联物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，X选自由醛、活性碳酸盐(-O-CO-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(OSO2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-CO-Z)和羧酸组成的集合，其中任何前述基团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。
3.如权利要求1所述的方法，其中，R7含1-12个碳原子。
4.如权利要求1所述的方法，其中，R7为甲基、乙基或正丙基。
5.如权利要求1所述的方法，其中，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、杂环基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-R8、-(R15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、R11和R15各自独立地选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C6H10-CH2-。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
(a)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(b)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2-CO2H
(c)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]nS-CH2CH2-NH2
(d)CH3-[N(COCH2CH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(e)H-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(f)
或者
(g)
其中n是从3到1000的整数。
7.如权利要求1所述的方法，其中，R25是Li、Na或者K。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接基团D是未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基或芳基，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基、芳基、-(CH2)b-CONH-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b-、-CO-(CH2)b-、-CO-C6H4-、或-CO-R26、或-(CR27R28)b，其中，R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，以及R26为-C6H10-CH2-。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述活性官能团与靶分子形成水解稳定的连接。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法所制备的聚噁唑啉POZ化合物。
11.一种末端活化的聚噁唑啉POZ化合物，具有基本结构R1-[N(COR7)CH2CH2]n-S-Qq-X，
其中，
所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物中的所有连接是水解稳定的，
X为能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-POZ偶联物的活性官能团，其中，该水解稳定的连接不是酯键或者二硫键，所述活性官能团选自由醛、活性碳酸盐(-O-CO-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(OSO2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-CO-Z)和羧酸组成的集合，其中任何前述官能团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基；
Q为连接基团；
POZ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
R1是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
n为从3至1000的整数；以及
q为1。
12.如权利要求11所述的化合物，其中，所述活性官能团被保护。
13.如权利要求11所述的化合物，其中，R7含1-12个碳原子。
14.如权利要求11所述的化合物，其中，R7为甲基、乙基或正丙基。
15.如权利要求11所述的化合物，其中，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、杂环基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-R8、-(R15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、R11和R15各自独立地选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C6H10-CH2-。
16.如权利要求11所述的化合物，其中，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
(a)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(b)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2-CO2H
(c)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]nS-CH2CH2-NH2
(d)CH3-[N(COCH2CH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(e)H-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-S-CH2CH2-CO2H
(f)
或者
(g)
其中n是从3到1000的整数。
17.一种通式为A-B-TM的水解稳定的靶分子-POZ偶联物，其中，
A为权利要求11所述的POZ化合物减去所述POZ化合物上的活性官能团与靶分子上的结合对象的反应过程中消除的任何离去基团；
TM为靶分子，所述靶分子含所述结合对象，并且所述靶分子选自药物、低聚核苷酸、多肽、抗体、抗体片段和蛋白质；以及
B为所述活性官能团与所述结合对象间形成的水解稳定的连接，该水解稳定的连接不是酯键或者二硫键。
18.如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为三氟乙基磺酸酯，所述结合对象为SH，以及B为硫醚连接。
19.如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为马来酰亚胺，所述结合对象为SH，以及B为硫醚连接。
20.如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为活性碳酸盐，所述结合对象为NH2，以及B为氨酯连接。
21.如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为活性酯，所述结合对象为NH2，以及B为酰胺连接。
22.如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为醛，所述结合对象为NH2，以及B为胺连接。
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