CN110865055B - 无金属偶联方法、偶联物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种无金属的偶联方法、偶联物以及其应用。偶联方法包括将下式I表示的活性炔化合物与具有炔反应性功能团的靶标在无金属的条件下进行偶联反应，
Figure DDA0002166689830000011
其中，R和n如本文所定义。本发明的偶联方法快速高效，能在无需加热并且无需铜等金属催化剂的条件下进行，具有广泛适用性。

Description

无金属偶联方法、偶联物及其应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及一种用于无金属的化学偶联方法、所得的偶联物及其应用，如检测诸如微生物等目标分析物的应用(例如，快速对细菌染色)以及制备荧光探针、试剂盒等的应用。
背景技术
在生物医学领域，探索生物分子的结构、示踪其发挥作用的内在机制与过程是非常重要的，但是采用什么技术手段使这些机制和过程“可视化”非常富有挑战。目前，多数生物分子和生物材料自身没有可以用作有效观察的荧光，通常采用偶联荧光分子或者其它成像单元来实现生物靶标分子的可视化示踪。许多生物分子或生物医用材料需要标记修饰，如多糖、蛋白、合成生物功能高分子、聚乙二醇、胶体粒子甚至活的生命体，如活细胞或细菌。生物偶联反应通常要求反应效率高，一般形成新的碳-碳键、碳-氮键或者碳-硫键，不产生额外副产物或仅产生氮气或水。比如，蛋白是生命体中重要的构筑和功能组分，其结构和功能比较复杂，功能化修饰比较困难，因此限制了其生物医学应用。另外，对活生命体的荧光标记始终是个难题，传统采用基因手段，但是操作复杂，不确定风险高。
总之，由于被修饰生物对象的复杂性，迫切需要发展一种广泛适用、不需要前修饰的直接偶联策略，用于不同生物靶向分子甚至生命体的直接修饰标记，具有重要转化价值。
发明内容
本发明提供了新型的偶联策略或偶联方法、所得的偶联物及其在检测诸如微生物等目标分析物、荧光染色和生物标记中的应用(例如，快速对细菌染色)。
本发明的偶联方法快速高效，能在无需加热并且无需铜等金属催化剂的条件下进行，具有广泛适用性。本发明的方法涉及不需要前修饰的直接偶联策略，可以用于不同生物靶向分子甚至生命体的直接修饰标记。
具体来说，本发明提供了：
1.一种无金属的偶联方法，包括下列步骤：
将下式I表示的活性炔化合物与具有炔反应性功能团的靶标在无金属的条件下进行偶联反应，
Figure BDA0002166689810000021
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
所述偶联反应可以在不加热的环境温度下进行，优选地，环境温度为10℃到40℃。
所述偶联反应可以在溶剂和/或催化剂存在的条件下进行。
任选地，溶剂选自水、卤代烷烃类溶剂、芳香烃类溶剂、醇类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含-S＝O基团的溶剂、N,N-二甲基甲酰胺或其任意组合。
任选地，所述催化剂选自有机碱，优选N,N-二甲基苯胺作为有机催化剂。
所述炔反应性功能团可以选自羟基、氨基以及巯基中的至少一者。
2.一种偶联物，其是由上述的任意一项所述的方法获得的。
该偶联物在介质中为能够发射荧光的纳米颗粒的形式。
所述偶联物可以由下式II表示：
Figure BDA0002166689810000031
其中，T选自天然聚合物、合成聚合物、多肽、氨基酸、蛋白、核酸、细胞、细菌、无机材料以及病毒中的至少一者；
A为杂原子，如氮原子、硫原子、氧原子；
n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；以及
R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
R可以为C1-C18烷基或烷氧基、C6-C18芳烃基、聚集诱导发光基团或其任意组合，
优选地，所述聚集诱导发光基团选自下列基团中的至少一者：
Figure BDA0002166689810000041
Figure BDA0002166689810000051
其中，所述聚集诱导发光基团可以具有取代基或者不具有取代基，在具有取代基的情况下，取代基选自羟烷基、烷氨基、烷基、不饱和烃基、环烃基、杂烃基、芳基和杂芳基的至少一个氢被选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者。
所述天然聚合物选自壳聚糖、羟丙基纤维素等聚多糖；
优选地，所述合成聚合物选自具有末端氨基的聚乙二醇、末端巯基的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)；
优选地，所述多肽选自细胞穿透肽；
优选地，所述蛋白选自牛血清蛋白BSA；
优选地，所述细胞选自癌细胞，如HeLa细胞、EMT6细胞、HepG2细胞、4T1细胞等；
优选地，所述细菌选自革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
优选地，所述病毒选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒等；
优选地，所述无机材料选自具有氨基末端官能团的二氧化硅颗粒，更优选微米颗粒或纳米颗粒。
3.一种用于检测目标分析物的荧光探针，包含所述的偶联物。
4.一种用于检测目标分析物的试剂盒，包含所述的偶联物或者所述的荧光探针。
5.一种标记目标分析物的方法，包括将下式I表示的活性炔化合物与所述目标分析物在无金属和无加热的条件下接触，
Figure BDA0002166689810000061
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
任选地，所述目标分析物选自细胞(例如癌细胞)、细菌(如革兰氏阳性菌，优选金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌)、多肽(如细胞穿透肽)、病毒以及蛋白(如BSA蛋白)中任意一者。
6.一种将革兰氏阳性菌或细胞快速染色的方法，包括在于将下式I表示的活性炔化合物与革兰氏阳性菌或细胞在无金属和无加热的条件下接触，
Figure BDA0002166689810000071
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
本发明具有下列至少一个优点：可以用于天然多糖、合成生物功能高分子、多肽、蛋白、快速全细胞成像以及革兰氏阳性菌快速染色。本发明可以提供一系列具有不同取代基的活化炔分子以用于上述对象生物分子的修饰标记功能化，包括天然多糖、生物相容性聚乙二醇、合成高分子、细胞穿膜肽、蛋白质等，并且可以实现快速全细胞染色成像以及快速革兰氏阳性菌染色。本发明基于活化炔的无金属生物偶联策略拓展了生物偶联的方法学，有望未来在材料科学，生物医学领域等发挥作用。
附图说明
图1示出根据本发明的一些实施方案的无金属偶联方法的概念简要示意图。
图2示出：(A)无金属参与的活化炔荧光分子偶联含氨基的壳聚糖的反应；(B)固体壳聚糖、三苯胺(TPA)功能化壳聚糖和四苯乙烯(TPE)功能化壳聚糖在光辐照条件下的照片；(C)无金属参与的活化炔荧光分子偶联末端具有氨基的聚乙二醇，以得到三苯胺标记聚乙二醇(PEG-TPA)的反应；(D)三苯胺标记聚乙二醇在水溶液中制备纳米粒子的流体力学直径及其分布；(E)三苯胺标记聚乙二醇在水相分散液中的荧光发射光谱；(F)基于三苯胺标记聚乙二醇荧光纳米粒子标记小鼠乳腺癌细胞的荧光成像图。
图3示出：(A)无金属参与的活化炔偶联含巯基的合成高分子聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA)与炔基化四苯乙烯，以得到四苯乙烯标记的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA-TPE)；(B)四苯乙烯标记的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)在不同水含量下的荧光发射光谱；(C)四苯乙烯标记的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)在不同水含量下的最大荧光发射强度的变化(插图表示四苯乙烯标记的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)的分散液在紫外灯照射下的照片)；(D)无金属参与的活化炔偶联羟乙基纤维素，以得到三苯胺标记纤维素(HPC-TPA)的反应。
图4示出根据本发明的一个实施例，无金属生物偶联功能化多肽和蛋白质的示意图：(A)活化炔三苯胺(TPA)偶联功能化细胞穿膜多肽,得到三苯胺荧光标记的多肽(Tat-TPA)；(B)三苯胺标记多肽在水中的荧光发射光谱；(C)三苯胺标记多肽和三苯胺分别染色标记小鼠乳腺癌细胞10分钟的荧光成像图；(D)炔基化三苯胺用于偶联标记牛血清蛋白，得到三苯胺标记牛血清蛋白(BSA-TPA)；(E)牛血清蛋白功能化前后在水溶液中的尺寸变化；(F)三苯胺标记牛血清蛋白的水分散液照片；(G)凝胶电泳验证三苯胺标记牛血清蛋白的成功制备。
图5示出根据本发明的一个实施例，活化炔三苯胺、对照物三苯胺以及活化炔三苯胺与正丁基胺的偶联物对HeLa细胞的全细胞染色和成像的图。
图6示出根据本发明的一个实施例，活化炔三苯胺、对照物三苯胺以及活化炔三苯胺与正丁基胺的偶联物染色革兰氏阳性菌的图。
图7示出：(A)活化炔在无金属参与条件下与无机材料二氧化硅的表面偶联，制备发绿色荧光的三苯胺标记二氧化硅(SiO2-TPA)或发蓝色荧光的四苯乙烯标记的二氧化硅(SiO2-TPE)的示意图；(B)两种荧光功能化微米粒子的荧光成像图。
图8示出活化炔四苯乙烯在CDCl3中的1H NMR谱图。
图9示出活化炔四苯乙烯在CDCl3中的13C NMR谱图。
图10示出活化炔四苯乙烯的HRMS图。
图11示出实施例1中用活化炔四苯乙烯和活化炔三苯胺分别修饰壳聚糖得到的偶联产物的IR谱图。
图12示出实施例1中制备的偶联物三苯胺标记壳聚糖(Chit-TPA)的水分散液的荧光发射光谱，插图示出该水分散液分在自然光和紫外光下的荧光发射照片。
图13示出炔基化三苯胺TPA、端基氨基化聚乙二醇(PEG-NH2)
和偶联物三苯胺标记聚乙二醇(PEG-TPA)在CDCl3中的1H NMR谱图。
图14示出炔基化三苯胺、端基氨基化聚乙二醇和偶联物三苯胺标记聚乙二醇的FT-IR谱图。
图15示出聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)PDMA、巯基末端的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)PDMA-SH和四苯乙烯标记的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA-TPA)在CDCl3中的1H-NMR谱图。
图16示出羟丙基纤维素HPC以及偶联物三苯胺标记的羟丙基纤维素(HPC-TPA)在CDCl3中的1H-NMR谱图。
图17示出羟丙基纤维素、炔基化三苯胺以及偶联物三苯胺标记的羟丙基纤维素的FT-IR谱图。
图18示出多肽Tat以及三苯胺标记多肽的MALDI TOF图，其中多肽的序列为YGRKKRRQRRR。
图19示出牛血清蛋白BSA以及三苯胺标记牛血清蛋白(BSA-TPA)的MALDI TOF图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方案。下面描述的实施方案是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施方案中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
定义和一般术语
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,JohnWiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。
除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。
术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-18烷基”包括甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
本发明使用的术语“烃基”包括芳香族烃基和脂肪族烃基。脂肪族烃基包括“烷基”或“烷基基团”，烯基和炔基，它们可以是饱和或不饱和的直链或支链二价烃基基团。所述烃基可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。在本发明的一个实施方案中，烷基基团含有1-18个碳原子。在另一实施方案中，烷基基团含有1-12个碳原子；在又一实施方案中，烷基基团含有1-6个碳原子；再一实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子；还在一实施方案中，烷基基团含有1-3个碳原子。
烷基基团的实例包含，但并不限于，C1-12烷基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，正己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，3,3-二甲基-2-丁基，正庚基，正辛基，等等。
术语“烯基”表示碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp2双键，其中，所述烯基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，其包括“cis”和“tans”的定位，或者"E"和"Z"的定位。在一实施方案中，烯基基团包含2-8个碳原子；在另一实施方案中，烯基基团包含2-6个碳原子；在又一实施方案中，烯基基团包含2-4个碳原子。烯基基团的实例包括，但并不限于，乙烯基、烯丙基等等。
术语“炔基”表示碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp三键，其中，所述炔基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。在一实施方案中，炔基基团包含2-8个碳原子；在另一实施方案中，炔基基团包含2-6个碳原子；在又一实施方案中，炔基基团包含2-4个碳原子。炔基基团的实例包括，但并不限于，乙炔基、炔丙基、1-丙炔基等等。
术语“羧基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“羧烷基”，表示-CO2H；术语“羰基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“氨基羰基”或“酰氧基”，表示-(C＝O)-。
术语“卤素”和“卤代”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
术语“芳香族基团”包括从芳香环中去掉两个氢原子从而与其他基团直接连接的基团。优选地，芳香族基团在成环原子中具有至少一个杂原子，例如N、O或S。
术语“芳香族环烃基”包括单环、双环和三环的芳基，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含6-18个原子组成的环。芳基基团通常，但不必须地通过芳基基团的芳香性环与母体分子连接。术语“芳基”可以和术语“芳香环”或“芳环”交换使用。芳基基团的实例可以包括苯基、联苯基、萘基和蒽。所述芳基基团任选地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。
在本发明中，取代基可以选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者。
芳香族环烃基和芳香族杂环基的例子包括(例如)苯基、萘基、苯基、萘基、蒽基、菲基、并四苯基、芘基、苯并[c]菲基、苯并菲基、芴基、苯并芴基、二苯并芴基、联苯基、三联苯基、四联苯基、荧蒽基、吡咯基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、吲哚基、异吲哚基、咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、噁唑基、噁二唑基、呋咱基、噻吩基、苯并噻吩基、二氢吖啶基、氮杂咔唑基、喹唑啉基等。
取代基的例子包括：
Figure BDA0002166689810000141
多种合成策略可以用到生物偶联化学中，主要包含两个方面，第一个策略是先预修饰生物分子本身的官能团，然后再和外源的信号报告分子或靶向单元偶联。比如，常见的铜催化的叠氮与炔的环加成反应，由于铜催化剂的毒性问题，该方法不能用于活细胞或者生物体。因此，越来越多的研究希望发展无金属催化的生物偶联策略。此外，生物分子本身预修饰叠氮或者炔基官能团是不容易的，合成本身存在挑战，且有可能改变生物分子的功能。Bertozzi等发展了环张力驱动的叠氮与炔的环加成反应，可以较好避免金属铜催化剂的毒性问题，通过在环辛炔上连接吸电子基团或增加芳环，用于提高环辛炔的反应活性，该策略在细胞水平和活体水平得到了初步验证，但是环辛炔的合成和功能化步骤很多，产品价格昂贵，难以批量生产和大规模使用。其它的一些合成策略，如Diels-Alder加成反应，四嗪与降冰片烯偶联反应等，要么需要复杂的合成与预修饰，或者需要紫外光辐照，这些因素不利于生物偶联的广泛深入应用。
另一个偶联策略是将功能单元直接与生物分子本身的固有官能团反应，不需要生物分子预修饰的步骤。生物分子的固有官能团主要包括氨基、巯基和羟基；其中，氨基和巯基在氨基酸和多肽中比较常见，常用于多肽和蛋白等的修饰；羟基在多糖以及生命体中很常见。基于此偶联策略不需要对生物分子预修饰，对生物分子的功能影响小，在材料修饰和生物分子的偶联应用领域具有广泛的吸引力。
据信，活化炔单体可以与氨基单体或巯基单体在无金属催化条件下发生点击聚合反应，制备线型聚合物或者超支化聚合物；另外，活化炔可以和羟基单体在少量有机碱催化下发生聚合反应，不需要金属催化剂参与。
由此，本发明开发了一种新的偶联方法，其可以无金属催化剂参与，并且可以在室温等环境温度下进行。无金属参与的偶联方法可以用于天然多糖、合成生物功能高分子、多肽、蛋白、快速全细胞成像以及革兰氏阳性菌快速染色。本发明制备了一系列具有不同取代基的活化炔分子并且将其用于上述对象生物分子的修饰标记功能化，包括天然多糖、生物相容性聚乙二醇、合成高分子、细胞穿膜肽、蛋白质等。本发明的方法可以实现快速全细胞染色成像以及快速革兰氏阳性菌染色。因此，本发明基于活化炔的无金属生物偶联策略拓展了生物偶联的方法学，有望未来在材料科学，生物医学领域等发挥作用。
在一个方面中，本发明提供了一种无金属的偶联方法，包括下列步骤：将下式I表示的活性炔化合物与具有炔反应性功能团的靶标在无金属的条件下进行偶联反应，
Figure BDA0002166689810000161
在上式I中，n表示1或更大的整数，但是不超过R的价态，优选n为1-50的整数，更优选n为1-6的整数，1-4的整数，更优选n为1。
R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
优选地，R为C1-C18烷基或烷氧基、C6-C18芳烃基、聚集诱导发光基团或其任意组合。
聚集诱导发光基团可以选自下列中的至少一者：
Figure BDA0002166689810000171
Figure BDA0002166689810000181
以及
Figure BDA0002166689810000182
聚集诱导发光基团可以具有取代基或者不具有取代基。取代基可以选自羟烷基、烷氨基、烷基、不饱和烃基、环烃基、杂烃基、芳基和杂芳基的至少一个氢被选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者。
式I表示的活化炔化合物的例子包括：
Figure BDA0002166689810000183
(活化炔-TPE)、
Figure BDA0002166689810000191
(活化炔-TPA)、
Figure BDA0002166689810000192
靶标可以选自天然聚合物分子、合成聚合物分子、肽、多肽、氨基酸、蛋白、核酸、细胞、细菌、无机材料以及病毒中的至少一者。
天然聚合物分子可以选自壳聚糖、羟丙基纤维素等天然多糖。
合成聚合物分子可以选自具有末端氨基的聚乙二醇、巯基功能化聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。
多肽可以选自细胞穿透肽等。
蛋白可以选自牛血清蛋白BSA等。
细胞可以选自癌细胞，如HeLa细胞、EMT6细胞、HepG2细胞、4T1细胞等等。
细菌可以选自革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
病毒可以选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒等；
无机材料可以选自具有氨基末端官能团的二氧化硅颗粒等，例如二氧化硅纳米颗粒或者二氧化硅微米颗粒。
靶标可以具有炔反应性功能团，如羟基、氨基以及巯基中的至少一者。一些生物分子靶标或者多糖靶标本身可以羟基和/或氨基，例如，蛋白、多肽或氨基酸可以具有羟基和/或氨基。细胞可以具有多糖。革兰阳性菌可以具有氨基等。
如果靶标(如合成高分子聚合物)不具有炔反应性功能团，可以通过本领域已知的反应将其接枝上羟基、氨基以及巯基等功能基团。
例如，可以利用可逆加成断裂链转移(RAFT)技术得到端基是巯基的聚合物分子，如末端巯基化的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。
本发明的一个特征是偶联反应可以在在不加热的环境温度下进行，优选地，环境温度为10℃到40℃。
偶联反应可以在溶剂和/或催化剂(非金属催化剂)存在的条件下进行。
溶剂可以选自水、卤代烷烃类溶剂、芳香烃类溶剂、醇类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含-S＝O基团的溶剂、N,N-二甲基甲酰胺或者其任意组合；
任选地，所述催化剂选自有机碱，优选N,N-二甲基苯胺作为有机催化剂。
发明人发现，偶联反应非常高效迅速，可以在2分钟内在室温或者细胞培养及生理条件下完成。因此，本发明的偶联方法可以用于对活生命体(比如活的的哺乳动物，比如小鼠和大鼠)进行荧光标记，由此可以对生命体内特定的位置、细胞和/组织进行可视化。
在另一方面中，本发明还提供了由上述的偶联方法得到的偶联物。偶联物可以是缀合物、结合物等。偶联物可以具有亲水和亲油部分，因此是两亲性物质。在水介质中，该偶联物在水介质中是能够发射荧光的纳米颗粒的形式存在。
在一个具体实施方案中，偶联物可以由下式II表示：
Figure BDA0002166689810000201
在式II中，T选自天然聚合物、合成聚合物、肽、多肽、氨基酸、蛋白、核酸、细胞、细菌、无机材料以及病毒中的至少一者。A为杂原子，如氮原子、硫原子、氧原子；n表示1或更大的整数，优选为1；以及R表示取代或未取代的C1-C18烷基或烷氧基、取代或未取代的主链杂原子掺杂的C1-C18烷基或烷氧基(其中杂原子选自O、N和P中的至少一者)、取代或未取代的成环碳原子为6-18的芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子为6-18的环烃基、取代或未取代的成环原子为6-18的杂芳基或其组合，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的胺基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基或烷氧基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代。
R可以为C1-C18烷基或烷氧基、C6-C18芳烃基、聚集诱导发光基团或其任意组合。优选的聚集诱导发光基团如上所述。
天然聚合物分子可以选自壳聚糖、羟丙基纤维素等天然多糖。
合成聚合物分子可以选自具有末端氨基的聚乙二醇、巯基功能化聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。
多肽可以选自细胞穿透肽等。
蛋白可以选自牛血清蛋白BSA等；
细胞可以选自癌细胞，如HeLa细胞、EMT6细胞、HepG2细胞、4T1细胞等等。
细菌可以选自革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
病毒可以选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒等；
无机材料可以选自具有氨基末端官能团的二氧化硅微米颗粒等。
本发明的偶联物可以用于各种生物化学和生物医学应用。例如，可以将上述的偶联物用于检测目标分析物的荧光探针。
偶联物也可以用于制备检测目标分析物的试剂盒。
在另一个方面中，本发明还提供了标记目标分析物的方法，包括将上式I表示的活性炔化合物与目标分析物在无金属和无加热的条件下接触
目标分析物可以选自细胞(例如癌细胞)、细菌(如革兰氏阳性菌，优选金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌)、多肽(如细胞穿透肽)、病毒以及蛋白(如BSA蛋白)中任意一者。
在又一个方面中，本发明还提供了一种将革兰氏阳性菌或细胞快速染色的方法，包括在于将上式I表示的活性炔化合物与革兰氏阳性菌或细胞在无金属和无加热的条件下接触，革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
例子
提供下述的例子来示意性描述以帮助本领域技术人员理解本发明。然而，本发明的以下例子不应被构建为不适当地限制本发明。在不脱离本发明发现的范围的情况下，本领域普通技术人员可以对所讨论的例子进行变化和修改。
通用方法
核磁氢谱和碳谱测试在Bruker AV 400核磁共振谱仪上完成，采用CDCl3或DMSO-d6为溶剂。MALDI-TOF高效分辨质谱分析采用GCT premier CAB048完成。紫外-可见吸收光谱采用PerkinElmer Lambda 365光谱仪完成。荧光测试使用Horiba Fluorolog-3光谱仪完成。投射电镜分析在JEM-2010F上完成。
炔基化四苯乙烯和炔基化三苯胺的合成
在例子中，典型的炔基化四苯乙烯和炔基化三苯胺的合成路线如下所示：
Figure BDA0002166689810000231
合成炔基化四苯乙烯
将市售的单醛基四苯乙烯(3.84g,0.01mol)溶解在无水四氢呋喃(50mL)中，在冰水浴中搅拌，然后滴加乙炔溴化镁(1.55g,0.012mol)，在氮气保护下过夜反应，然后采用饱和氯化铵水溶液终止反应，再利用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥得到中间产物，将该中间产物溶解在二氯甲烷中，继续投料加入二氧化锰过夜氧化，经萃取、干燥、浓缩，粗产物经二氯甲烷/正己烷(v/v＝1:1)硅胶柱层析分离纯化，得到炔基化四苯乙烯目标产物(产率约62％)。
图8示出了炔基化四苯乙烯的1H NMR谱。
图9示出了炔基化四苯乙烯的13C NMR谱(100MHz,DMSO-d6)。
图10示出了炔基化四苯乙烯的HRMS谱图。
合成炔基化三苯胺
将市售的单醛基三苯胺(2.73g,0.01mol)溶解在无水四氢呋喃(50mL)中，在冰水浴中搅拌，然后滴加乙炔溴化镁(1.55g,0.012mol)，在氮气保护下过夜反应，然后采用饱和氯化铵水溶液终止反应，再利用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥得到中间产物，将该中间产物溶解在二氯甲烷中，继续投料加入二氧化锰过夜氧化，经萃取、干燥、浓缩，粗产物经二氯甲烷/正己烷(v/v＝2:1)硅胶柱层析分离纯化，得到目标产物炔基化三苯胺产物(产率约67％)。
图13示出了炔基化三苯胺的1H NMR谱。
图14示出了炔基化三苯胺的FT-IR谱。
炔基化四苯乙烯和炔基化三苯胺分别标记壳聚糖以及性能表征
按照图2(A)所示的反应方案，将壳聚糖(20mg)先溶解在水溶液中，然后分别加入炔基化三苯胺(0.2mg)或炔基化四苯乙烯(0.2mg)的二甲亚砜溶液。室温搅拌反应10小时，反应液对水透析，然后冻干可以得到三苯胺和四苯乙烯分别标记的壳聚糖功能化产物，产率约为90％。
图11示出了三苯胺标记壳聚糖和四苯乙烯标记壳聚糖的FT-IR谱图，结果证实了目标产物的成功合成。
如图2(B)和图12所示，三苯胺标记壳聚糖和四苯乙烯标记壳聚糖在紫外光下能够发射黄绿色和蓝绿色荧光，与壳聚糖自身的微弱蓝色发光存在显著区别，再次说明标记成功。
合成三苯胺标记聚乙二醇以及表征
按照图2(C)所示的反应方案，将单氨基化聚乙二醇(50mg)先溶解在二氯甲烷中，然后加入炔基化三苯胺(7.8mg)，在室温下搅拌反应一个小时，然后用乙醚沉淀得到固体沉淀，然后再将其溶解在二氯甲烷中，再用乙醚沉淀，溶解和沉淀过程反复三次，最终真空干燥产物三次，得到三苯胺标记聚乙二醇。图13示出了三苯胺标记聚乙二醇的1H NMR谱。图14示出了三苯胺标记聚乙二醇的FT-IR谱图。
如图2(D)和(E)-(F)所示，三苯胺标记聚乙二醇可以水相中自组装形成纳米粒子，并且在紫外灯下发生荧光，因此可用于生物成像和定位。
四苯乙烯标记聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)合成以及表征
按照图3(A)所示的路线，采用典型的可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合技术来合成聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。具体过程如下，将链转移剂(CPADB,5.58mg,0.02mmol)、AIBN(0.66mg,0.004mmol)和DMA(118.9mg,1.2mmol)溶解在1,4-二氧六环中，经过冻融循环除去气体，密封反应瓶，在70℃油浴中反应12小时后，用液氮快速冷冻淬灭终止聚合。然后用乙醚沉淀得到固体沉淀，然后再将其溶解在二氯甲烷中，再用乙醚沉淀，此过程反复3次，最终真空干燥产物三次，得到聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)，随后将其溶解在二氯甲烷中加入4倍当量正丁胺，得到末端巯基功能化聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)，并采用核磁氢谱表征(图15)。
然后将末端巯基功能化聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(72mg)与炔基化四苯乙烯(3.2mg)溶解在二氯甲烷中，反应1小时，采用乙醚沉淀产物得到最终产物，并采用核磁氢谱表征四苯乙烯标记聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)产物(图15)。
如图3(B)所示，四苯乙烯标记聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)产物在水性介质中可以组装形成纳米颗粒，并且能够发射荧光。因此，其可以用于生物成像。
合成三苯胺标记纤维素以及表征
按照图3(D)所示的路线，先将羟丙基纤维素(100mg)、炔基化三苯胺(6mg)和催化量的N,N-二甲基苯胺共同溶解在二氯甲烷中，过夜搅拌反应，然后将溶液在过量乙醚中沉淀，得到固体产物，该溶解沉淀过程反复三次，产物三苯胺标记纤维素采用核磁共振氢谱表征(图16)。
如图3(C)所示，三苯胺标记纤维素产物在水性介质中能够发射荧光。因此，其可以用于生物成像。
多肽和蛋白质牛血清蛋白的荧光标记以及表征
按照图4(A)所示，将等摩尔含量的炔基化三苯胺加入到多肽(细胞穿膜肽)的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应，最后采用乙醚沉淀得到产物三苯胺标记的多肽。产物用TOF-MALDI表征(图18)。
如图4(B)和图4(C)所示，三苯胺标记的细胞穿膜肽在水性介质中发射荧光，并且与小鼠乳腺癌细胞培养10分钟后，产生荧光图像。
另外，按照图4(D)所示，先将牛血清蛋白(100mg)蛋白溶解在水中，随后加入炔基化三苯胺(0.5mg)的DMSO溶液，搅拌反应数小时之后对水透析，最后采用冷冻干燥得到产物三苯胺标记牛血清蛋白。产物用TOF-MALDI和凝胶电泳表征(图4(G)和图19)。
如图4(E)所示三苯胺标记牛血清蛋白在水中组装成纳米颗粒，并且能够发射荧光(图4F)。
细胞荧光标记成像
HeLa细胞和EMT-6细胞采用正常的细胞培养方法培养。首先，将三苯胺标记聚乙二醇的水相纳米粒子与EMT-6细胞共同孵育4小时，然后用PBS洗三次，在共聚焦显微镜(LSM510/ConfoCor 2,Zeiss)下观察成像，荧光通道采用405nm激光器，进行细胞荧光成像，如图2(F)所示，三苯胺标记聚乙二醇可以染色细胞，用于细胞荧光成像。
另一方面，采用炔基化三苯胺、三苯胺以及炔基化三苯胺与正丁基胺的偶联物分别与HeLa细胞共培养2分钟，采用显微镜观察。如图5所示，活化炔分子能够在短时间内进行快速全细胞标记和成像，而其它两个对照分子不能。
细菌识别染色
将细菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)悬浮液(107CFU/mL,200μL)分别与炔基化三苯胺、三苯胺以及炔基化三苯胺与正丁基胺的偶联物(2μM)在室温孵育2分钟，然后以8000rpm离心，用PBS洗三次，最后采用显微镜观察成像。结果如图6所示。
可以看出，炔基化三苯胺能够对革兰氏阳性菌快速染色并且区分。
二氧化硅纳米颗粒标记成像
按照图7A所示，将二氧化硅球(100mg)分散在乙醇(2mL)中，加入炔基化三苯胺(2mg)或者炔基化四苯乙烯(2mg)，搅拌2h，然后离心，乙醇多次洗涤，离心收集产物，分别得到三苯胺标记二氧化硅和四苯乙烯标记二氧化硅。
图7B示出两种荧光功能化纳米粒子三苯胺标记二氧化硅和四苯乙烯标记二氧化硅的荧光成像图。
可以理解的是，以上实施方案仅仅是为了说明本公开的原理而采用的示例性实施方案，然而本公开并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。

Claims (10)

1.一种无金属的偶联方法，其特征在于包括下列步骤：
将下式I表示的活性炔化合物与具有炔反应性功能团的靶标在无金属的条件下进行偶联反应，所述炔反应性官能团选自羟基、氨基以及巯基中的至少一者，
Figure FDA0003767064270000011
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R为聚集诱导发光基团，所述聚集诱导发光基团选自下列基团中的至少一者：
Figure FDA0003767064270000012
所述靶标选自天然聚合物、合成聚合物、多肽、氨基酸、蛋白、核酸、细胞、细菌、无机材料以及病毒中的至少一者，其中
所述天然聚合物选自壳聚糖、羟丙基纤维素；
所述合成聚合物选自具有末端氨基的聚乙二醇、巯基功能化聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)或其任意组合；
所述多肽选自细胞穿透肽；
所述蛋白选自牛血清蛋白BSA；
所述细胞选自癌细胞；
所述细菌选自革兰氏阳性菌；
所述病毒选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒；
所述无机材料选自具有氨基末端官能团的二氧化硅颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述偶联反应在不加热的环境温度下进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述偶联反应在溶剂和/或催化剂存在的条件下进行，
溶剂选自水、卤代烷烃类溶剂、芳香烃类溶剂、醇类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含-S＝O基团的溶剂、N,N-二甲基甲酰胺或其任意组合；
所述催化剂选自有机碱。
4.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于所述癌细胞选自HeLa细胞、EMT6细胞、HepG2细胞、4T1细胞；
所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌。
5.一种偶联物，其是由权利要求1-4中任意一项所述的方法获得的。
6.根据权利要求5所述的偶联物，其特征在于该偶联物在介质中为能够发射荧光的纳米颗粒的形式。
7.根据权利要求5或6所述的偶联物，其特征在于所述偶联物由下式II表示：
Figure FDA0003767064270000031
其中，T选自天然聚合物、合成聚合物、多肽、氨基酸、蛋白、核酸、细胞、细菌、无机材料以及病毒中的至少一者，其中
所述天然聚合物选自壳聚糖、羟丙基纤维素；
所述合成聚合物选自具有末端氨基的聚乙二醇、末端巯基的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)；
所述多肽选自细胞穿透肽；
所述蛋白选自牛血清蛋白BSA；
所述细胞选自癌细胞；
所述细菌选自革兰氏阳性菌；
所述病毒选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒；
所述无机材料选自具有氨基末端官能团的二氧化硅颗粒；
A选自氮原子、硫原子、氧原子；
n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；以及
R为聚集诱导发光基团，所述聚集诱导发光基团选自下列基团中的至少一者：
Figure FDA0003767064270000032
8.根据权利要求7所述的偶联物，其特征在于所述癌细胞选自HeLa细胞、EMT6细胞、HepG2细胞、4T1细胞；
所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌。
9.一种标记目标分析物的方法，其特征在于包括将下式I表示的活性炔化合物与所述目标分析物在无金属和无加热的条件下接触，
Figure FDA0003767064270000041
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R为聚集诱导发光基团，所述聚集诱导发光基团选自下列基团中的至少一者：
Figure FDA0003767064270000042
所述目标分析物选自癌细胞、革兰氏阳性菌、细胞穿透肽、病毒以及BSA蛋白中任意一者，所述病毒选自噬菌体、疱疹病毒、烟草花叶病毒。
10.一种将革兰氏阳性菌或癌细胞快速染色的方法，其特征在于包括在于将下式I表示的活性炔化合物与革兰氏阳性菌或癌细胞在无金属和无加热的条件下接触，
Figure FDA0003767064270000051
其中，n表示1或更大的整数，条件是n不超过R的价态；
R为聚集诱导发光基团，所述聚集诱导发光基团选自下列基团中的至少一者：
Figure FDA0003767064270000052
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