KR20090114481A - 활성화된 폴리옥사졸린 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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KR20090114481A
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Abstract

본 발명은, 다양한 반응 조건 하에서 단일 작용성 POZ 유도체와 다양한 타겟 분자의 콘쥬게이션을 가능하게 하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 생성하는, 다양항 작용 활성기를 갖는 종결부 활성화된 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 또한, 본 발명은 개시된 종결부 활성화된 단일 작용성 POZ 유도체 및 상기 종결부 활성화된 단일 작용성 POZ 유도체를 이용하여 제조되는, 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 합성 방법을 제공한다.

Description

활성화된 폴리옥사졸린 및 이를 포함하는 조성물{ACTIVATED POLYOXAZOLINES AND COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME}
본원은 2007년 2월 28일자로 출원된 미국 가출원 제60/892,212호에 대하여 우선권을 주장한다.
본원은 폴리옥사졸린 유도체, 그 합성 방법과 이러한 폴리옥사졸린 유도체를 제조하는데 유용한 중간체 화합물, 및 상기 폴리옥사졸린 유도체를 사용하여 제조한 가수분해에 대해 안정한(hydrolytically stable) 타겟 분자-폴리옥사졸린 콘쥬게이트(conjugates)에 관한 것이다.
고분자-개질(polymer-modified) 치료제는 현대 의과학에 있어서 매우 유용한 것으로 입증되었다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 결합된 단백질은, 다양한 질환의 치료에 있어서 매우 중요한 여러가지 치료제를 구성한다. 고분자-개질 치료제의 성공으로 인해 치료제로서 사용될 수 있는 고분자의 범위를 확대하고, 특히, 폴리에틸렌 글리콜이 가지지 않은 특성을 갖는 고분자를 제공하는 것에 관심이 집중되고 있다.
정의
본원에서, 용어 "POZ", "POZ 화합물" 또는 "POZ 고분자"는 -[N(COR7)CH2CH2]n- 의 구조를 갖는 반복 단위를 포함하는 2-치환된-2-옥사졸린의 고분자를 의미하며, 각 반복 단위에 있어서, R7 은 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기 또는 헤테로사이클릴알킬기로부터 독립적으로 선택되며, n은 3 내지 1000이며, 하나의 태양에 있어서, 탄소 원자 수 1 내지 10의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기 또는 헤테로사이클릴알킬기를 포함하며, 또 다른 태양에 있어서 R7 은 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기이다.
본원에서 용어 "PMOZ"는 -[N(COCH3)CH2CH2]n-의 구조를 갖는 반복 단위를 포함하는 POZ를 의미한다.
본원에서 용어 "PEOZ"는 -[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-의 구조를 갖는 반복 단위를 포함하는 POZ를 의미한다.
본원에서 용어 M-POZ, M-PMOZ 또는 M-PEOZ는 개시부 말단 상의 질소가 메틸기에 결합되어 있는 상기 (전술한) 고분자를 의미한다.
본원에서 용어 "POZ 유도체" 또는 "폴리옥사졸린 유도체"는 POZ 고분자를 포함하는 구조를 의미하며, POZ 고분자는 POZ 고분자의 종결부 말단에 단일 활성 작용기를 가지며, 상기 작용기는 타겟 분자 상의 화학기와 직접적 또는 간접적으로 결합을 형성할 수 있다. 하나의 태양에 있어서, POZ 유도체는 단일 작용성 POZ 유도체이다.
본원에서 용어 "타겟 분자(target molecule)"는 치료, 진단 용도 또는 타겟팅 기능을 갖는 임의의 분자를 의미하며, 상기 타겟 분자는 예를 들면, 치료 성분(약물을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않음), 진단 성분, 대상 성분, 유기 소분자, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 항체 단편 및 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 POZ 고분자 또는 POZ 유도체 상의 활성 작용기와 반응할 수 있다.
본원에서 용어 "가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트(target molecule-POZ conjugate)"는 본 발명의 POZ 유도체와 타겟 분자 간의 콘쥬게이트를 의미하며, POZ 콘쥬게이트와 타겟 분자 간의 모든 화학적 결합은 가수분해에 대해 안정하다.
본원에서 용어 "가수분해에 대해 안정한"은 생리학적 조건 하의 수용액 중에서 안정한 결합(linkage)을 의미한다, 하나의 태양에 있어서, 그러한 결합들은 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 192 시간 이상 안정하다. 또 다른 태양에 있어서 그러한 결합들은 무제한적으로 안정하다.
본원에서 용어 "가수분해에 대해 불안정한(hydrolytically unstable)"은 생리학적 조건 하의 수용액 중에서 불안정한 결합(linkage)을 의미한다,
본원에서 용어 "생리학적 조건"은 pH가 6-8이며 온도가 30-42℃인 수용액을 의미한다.
본원에서 용어 "활성 작용기"는 반응을 위해서 강한 촉매, 고온 또는 비실용적인 반응 조건을 요하는 작용기와는 대조적으로, 쉽게 친전자성기 또는 친핵성기와 반응하거나 쉽게 고리 첨가 반응하는 기를 의미한다.
본원에 있어서 본 발명의 POZ 유도체 또는 이들의 화합물과 관련하여 사용되는 용어 "결합하다", "결합된", "결합" 또는 "결합제(linker)"는 일반적으로 화학적 반응의 결과로 형성되고, 전형적으로는 공유결합인 결합 또는 기를 의미한다.
본원에서 하이드록실기, 아민기, 설피드릴기 및 기타 반응기와 관련하여 용어 "보호된"은 [Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T. W.; Wuts, P.G.M., John Wiley & Sons, New York, N.Y., (3rd Edition, 1999)]에 기재된 공정에 의해 첨가되거나 제거될 수 있는 공지된 보호기에 의하여, 원치 않는 반응으로부터 보호되는 작용기들의 형태를 의미한다. 보호된 하이드록실기의 예로는 t-부틸메틸-클로로실란, 트리메틸클로로실란, 트리이소프로필클로로실란, 트리에틸클로로실란을 포함하지만 이에 제한되지 않는 시약과 하이드록실기를 반응시켜 얻은 실릴 에테르; 메톡시메틸 에테르, 메틸티오메틸 에테르, 벤질옥시메틸 에테르, t-부톡시메틸에테르, 2-메톡시에톡시메틸 에테르, 테트라하이드로피라닐 에테르, 1-에톡시에틸 에테르, 알릴 에테르, 벤질 에테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치환된 메틸 및 에틸 에테르; 벤조일포르메이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리클로로아세테이트, 및 트리플루오로아세테이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 보호된 아민기의 예로는 포름아미드, 아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 및 벤즈아미드와 같은 아미드; 프탈이미드 및 디티오숙신이미드와 같은 이미드; 및 기타 이미드가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 보호된 설피드릴기의 예로는 S-벤질 티오에테르 및 S-4-피콜릴 티오에테르와 같은 티오에테르; 헤미티오, 디티오 및 아미노티오 아세탈과 같은 치환된 S-메틸 유도체; 및 기타 기들이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어 "알킬기"는 단독으로 또는 치환기의 부분으로 사용되고 탄소 원자 수 1 내지 20의 직쇄 탄화수소기를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 도데실기 등의 직쇄 알킬기를 포함한다. 또한, 상기 용어는 하기 직쇄 알킬기의 분지쇄 이성질체를 포함하며, 그 예는 하기를 포함한다.
-CH(CH3)2, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -C(CH2CH3)3, -CH2 CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH(CH2CH3)2, -CH2C(CH3)3, -CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH2CH3)2, -CH2CH2C(CH3)3, -CH2CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2, -CH(CH2 CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3) 등.
또한, 상기 용어는 사이클릴 알킬기, 예를 들면 사이클로프로필기, 사이클로부틸기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기, 사이클로헵틸기 및 사이클로옥틸기, 및 상기 정의된 직쇄 또는 분지쇄 알킬기로 치환된 고리를 포함한다. 상기 용어는 또한 폴리사이클릭 알킬기, 예를 들면 아다만틸 노르보닐기 및 바이사이클로[2.2.2]옥틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며 상기 정의된 직쇄 및 분지쇄 알킬기로 치환된 고리를 포함한다.
본원에서 용어 "알케닐기"는 단독으로 또는 치환기의 부분으로 사용되고 임의의 2개의 인접하는 탄소 원자 사이에 1개 이상의 이중 결합을 가지는 알킬기를 포함한다.
본원에서 용어 "알키닐기"는 단독으로 또는 치환기의 부분으로 사용되고 임의의 2개의 인접하는 탄소 원자 사이에 1개 이상의 삼중 결합을 가지는 알킬기를 포함한다.
본원에서 용어 "비치환된 알킬기", "비치환된 알케닐기" 및 "비치환된 알키닐기"는 헤테로 원자를 포함하지 않는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기를 의미한다.
용어 "치환된 알킬기", "치환된 알케닐기" 및 "치환된 알키닐기"는 탄소(들) 또는 수소(들)과의 1개 이상의 결합이 예를 들면, 알콕시기 및 아릴옥시기의 산소 원자; 알킬 및 아릴 설파이드기, 설폰기, 설포닐기 및 설폭사이드기의 황 원자; 트리알킬실릴기, 디알킬아릴실릴기, 알킬디아릴실릴기 및 트리아릴실릴기의 규소 원자; 및 다양한 기타 기의 헤테로 원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-수소 또는 비-탄소 원자와의 결합으로 대체된, 상기 정의된 알킬기, 알케닐기, 알키닐기를 의미한다.
본원에서 용어 "비치환된 아릴기"는 고리 내 탄소 원자 수 6 내지 12의 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 탄화수소기를 의미하며, 예를 들면 헤테로 원자를 포함하지 않는 페닐기, 나프틸기, 안트라세닐기, 바이페닐기 및 디페닐기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "비치환된 아릴"은 나프탈렌과 같은 축합 고리를 가지는 기를 포함하지만, 톨릴기와 같은 아릴기는 하기에서 기술한 바와 같이 본원에서 치환된 아릴로 간주되기 때문에, 고리 구성원의 어느 하나에 결합된 알킬기 또는 할로기와 같은 기타 기를 갖는 아릴기는 포함하지 않는다. 그러나, 비치환된 아릴기는 모화합물의 1 개 이상의 탄소 원자(들), 산소 원자(들), 질소 원자(들), 및/또는 황 원자(들)에 결합될 수 있다.
본원에서 치환된 알킬기가 비치환된 알킬기에 대하여 가지는 의미와 동일하게 용어 "치환된 아릴기"는 비치환된 아릴기와 관련된다. 그러나, 치환된 아릴기는 또한 방향족 탄소 중 어느 하나가 비-탄소 또는 비-수소 원자, 예를 들면 치환된 알킬기와 관련하여 전술한 원자들 중 어느 하나와 결합되어 있는 아릴기를 포함하고, 아릴기의 1개 이상의 방향족 탄소가 상기 정의된 치환 또는 비치환된 알킬기, 알케닐기에 결합된 아릴기도 포함한다. 이러한 아릴기는 아릴기의 2개의 탄소가 알킬기 또는 알케닐기의 2개의 원자에 결합하여 혼합 고리 시스템(예: 디하이드로나프틸, 테트라하이드로나프틸)을 형성하는 결합 구조를 포함한다. 따라서, 용어 "치환된 아릴기"는 특히, 톨릴기 및 하이드록시페닐기를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 용어 "비치환된 아랄킬기"는 비치환되거나 치환된 알킬기 또는 알케닐기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 치환되거나 비치환된 아릴기와의 결합으로 대체된 비치환된 알킬기 또는 알케닐기를 의미한다.예를 들면, 메틸기(CH3)는 비치환된 알킬기이다. 만약 메틸기의 수소 원자가 페닐기와의 결합으로 대체된다면, 메틸기의 탄소 원자가 벤젠의 탄소에 결합된 것으로, 화합물은 비치환된 아랄킬기(예:즉 벤질기)가 된다.
본원에서 "치환된 아랄킬기"는, 비치환된 아랄킬기에 대하여, 치환된 아릴기가 비치환된 아릴기에 대하여 가지는 의미와 동일한 의미를 가진다. 그러나, 치환된 아랄킬기는 그룹의 알킬기 부분의 탄소 또는 수소 결합이 비-탄소 또는 비-수소와의 결합으로 대체된 그룹도 포함한다.
본원에서 용어 "비치환된 헤테로사이클릴기"는 모노사이클릭, 바이사이클릭 및 폴리사이클릭 고리 화합물을 포함하는 방향족 및 비방향족 고리 모두를 의미하며, 폴리사이클릭 고리 화합물의 예로는 고리 구성원의 1개 이상이 N, O 및 S를 포함하지만 이에 제한되지 않는 헤테로 원자인, 3개의 고리 구성원을 갖는 퀴누클리딜기를 들 수 있다. 2-메틸벤즈이미다졸릴기와 같은 화합물은 하기 정의된 바와 같이 "치환된 헤테로사이클릴기"이므로, 용어 "비치환된 헤테로사이클릴기"는 벤즈이미다졸릴기와 같은 축합 헤테로사이클릭 고리를 포함하지만, 고리 구성원 중의 어느 하나에 결합된 알킬기 또는 할로기와 같은 기타 기를 가지는 헤테로사이클릴기는 포함하지 않는다. 헤테로사이클릴기의 예로는 피롤릴기, 피롤리닐기, 이미다졸릴기, 피라졸릴기, 피리딜기, 디하이드로피리딜기, 피리미딜기, 피라지닐기, 피리다지닐기, 트리아졸릴기, 테트라졸릴기가 포함되지만 이에 제한되지 않는 1 내지 4개의 질소 원자를 함유하는 불포화 3 내지 8원 고리; 피롤리디닐기, 이미다졸리디닐기, 피페리디닐기, 피페라지닐기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 1 내지 4개의 질소 원자를 함유하는 포화 3 내지 8원 고리; 인돌릴기, 이소인돌릴기, 인돌리닐기, 인돌리지닐기, 벤즈이미다졸릴기, 퀴놀릴기, 이소퀴놀릴기, 인다졸릴기, 벤조트리아졸릴기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 4개의 질소 원자를 함유하는 축합 불포화 헤테로사이클릭기; 옥사졸릴기, 이속사졸릴기, 옥사디아졸릴기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 포함하는 불포화 3 내지 8원 고리; 모르포리닐기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 포함하는 포화 3 내지 8원 고리; 벤조옥사졸릴기, 벤조옥사디아졸릴기, 벤조옥사지닐기(예: 2H-1,4-벤조옥사지닐기 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 포함하는 불포화 축합 헤테로사이클릭기; 티아졸릴기, 이소티아졸릴기, 티아디아졸릴기(예: 1,2,3-티아디아졸릴기, 1,2,4-티아디아졸릴기, 1,3,4-티아디아졸릴기, 1,2,5-티아디아졸릴기 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 3개의 황 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 불포화 3 내지 8원 고리; 티아졸로디닐기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 황 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 포화 3 내지 8원 고리; 티에닐기, 디하이드로디티오닐기, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로티오피란을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 황 원자를 함유하는 포화 및 불포화 3 내지 8원 고리; 벤조티아졸릴기, 벤조티아디아졸릴기, 벤조티아지닐기(예: 2H-1,4-벤조티아지닐기 등), 디하이드로벤조티아지닐기(예: 2H-3,4-디하이드로벤조티아지닐기 등)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 황 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 불포화 축합 헤테로사이클릭기; 푸릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 산소 원자를 함유하는 불포화 3 내지 8원 고리; 밴조디옥솔릴기(예: 1,3-벤조디옥솔릴 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 1 내지 2개의 산소 원자를 함유하는 불포화 축합 헤테로사이클릭 고리; 디하이드로옥사티오닐기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 산소 원자 및 1 내지 2개의 황원자를 함유하는 불포화 3 내지 8원 고리; 1,4-옥사티안과 같은 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 2개의 황 원자를 함유하는 포화 3 내지 8원 고리; 벤조티에닐기, 벤조디티오닐기와 같은 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 포화 3 내지 8원 고리; 벤조옥사티오닐기와 같은 산소 원자 및 1 내지 2개의 황원자를 함유하는 불포화 축합 헤테로사이클릭 고리를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 헤테로사이클릴기는 또한 고리 내 1개 이상의 황 원자가 1 또는 2개의 산소 원자와 이중 결합을 이루는(설폭사이드 및 설폰) 헤테로사이클릴기도 포함한다. 예를 들면, 헤테로사이클릴기는 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로티오펜 옥사이드 및 테트라하이드로티오펜 1,1-디옥사이드를 포함한다. 바람직한 헤테로사이클릴기는 5 또는 6원 고리이다. 더욱 바람직한 헤테로사이클릴기는 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피롤리딘, 이미다졸, 피라졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 티오모르폴린을 포함하며, 티오모르폴린의 S 원자는 1개 이상의 산소 원자, 피롤, 호모피페라진, 옥사졸리딘-2-온, 피롤리딘-2-온, 옥사졸, 퀴누클리딘, 티아졸, 이속사졸, 퓨란 및 테트라하이드로퓨란과 결합한다.
본원에서 "치환된 헤테로사이클릴기"는, 비치환된 헤테로사이클릴기에 대하여, 치환된 아킬기가 비치환된 아킬기에 대하여 가지는 의미와 동일한 의미를 가진다. 그러나 치환된 헤테로사이클릴기는 탄소 원자 중 어느 하나가 치환된 알킬 및 치환된 아릴과 관련하여 전술한 원자들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비-탄소 또는 비-수소 원자에 결합된 헤테로사이클릴기를 포함하고 또한, 헤테로사이클릴기의 1개 이상의 탄소가 전술한 치환 및/또는 비치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아릴기와 결합된 헤테로사이클릴기도 포함한다. 이는 헤테로사이클릴기의 2개의 탄소 원자가 2개의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기와 결합하여 혼합 고리 시스템을 형성하는 결합 구조를 포함한다. 예를 들면, 여러 가지 치환된 헤테로사이클릴 알킬기는 5-메틸벤즈이미다졸릴기, 5-클로로벤즈티아졸릴기, 1-메틸 피페라지닐기, 및 2-클로로피리딜기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어 "비치환된 헤테로사이클릴알킬기"는 전술한 비치환된 알킬기 또는 알케닐기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기와의 결합으로 대체된 비치환된 알킬기 또는 알케닐기를 일컬는다. 예를 들면 메틸기(CH3)는 비치환된 알킬기이다. 메틸기의 수소 원자가 헤테로사이클릴기와의 결합으로 대체되는 경우, 즉, 메틸기의 탄소가 피리딘의 탄소 2 또는 피리딘의 탄소 3 또는 4와 결합되는 경우, 화합물은 비치환된 헤테로사이클릴알킬기이다.
본원에서 "치환된 헤테로사이클릴알킬기"는, 비치환된 헤테로사이클릴기에 대하여, 치환된 아릴기가 비치환된 아릴기에 대하여 가지는 의미와 동일한 의미를 가진다. 그러나 치환된 헤테로사이클릴알킬기는, 비-수소 원자가, 헤테로사이클릴알킬기에 있어서 헤테로사이클릴기의 헤테로원자에 결합된, 헤테로사이클릴기 또한 포함하며, 헤테로 원자는 피페리디닐알킬기에 있어서 피페리딘 고리의 질소 원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적 설명
폴리옥사졸린(POZ)는 2-치환된-2-옥사졸린 단량체로부터 제조되는 고분자이다. 이러한 고분자는 수용성이며 포유 동물 모델 시스템에 대하여 무독성인 것으로 보고되었다. POZ는 일반적으로 적절한 화학량론적 양의 2-알킬-2-옥사졸린을 친전자성 개시제 예를 들면, 메틸 p-톨루엔설포네이트(또는 "토실레이트", CH3-OSO2-C6H4-CH3) 또는 메틸 트리플레이트(CH3-OSO2-SF3)와 반응시킨 후, 하이드록사이드 또는 아민과 같은 친핵체로 반응을 종결함으로써 제조된다. 제조된 고분자는 편의상 왼쪽 끝에 개시기를, 오른쪽 끝에 종결기를, 가운데에 2-알킬-2-옥사졸린 부분을 표시한 약칭으로 기술된다. 따라서, 본원에서 약칭이 사용되는 경우, 별 다른 언급이 없는 한, 식의 왼쪽은 "개시부 말단"을 의미하며 오른쪽은 "종결부 말단"을 의미한다.
예를 들면, 2-치환된-2-옥사졸린이 2-메틸-2-옥사졸린이며, 메틸 토실레이트가 개시제로 사용되고 하이드록사이드가 종결제로 사용되는 경우, 하기 고분자가 생성된다:
CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH
메틸 개시제가 (개시부 말단에서) 왼쪽 끝의 M으로 표시되고, PMOZ는 PMOZ의 M이 나타내는 메틸기의 반복 단위를 가지는 폴리메틸옥사졸린을 나타내며, 종결부의 하이드록실기는 (종결부 말단에서) -OH로 표시되어, 상기 고분자는 편의상 M-PMOZ-OH으로 기술된다. 중합의 정도(n)는 대략 3 내지 약 1000의 범위이다.
통상적으로 사용되는 또 다른 단량체인 2-에틸-옥사졸린은 메틸 트리플레이트 개시 및 하이드록사이드 종결에 의하여 하기의 POZ 고분자를 제공한다:
CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH
메틸 개시제가 (개시부 말단에서) 왼쪽 끝의 M으로 표시되고, PEOZ는 PEOZ의 E가 나타내는 에틸기의 반복 단위를 가지는 폴리에틸옥사졸린을 나타내며, 종결되는 하이드록실기는 (종결부 말단에서) -OH로 표시되어 상기 고분자는 편의상 M-PEOZ-OH로 약칭된다.
더욱 복잡한 친전자체 및 친핵체가 사용될 수 있다. 예를 들면 벤질 브로마이드로 2-에틸-옥사졸린의 중합 반응을 개시하고 과량의 에틸렌 디아민으로 반응을 종결하여 하기의 고분자를 생성한다:
C6H5-CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-NH-CH2CH2-NH2
또한, 상이한 단량체가 동일한 고분자에서 사용되어 여러가지 랜덤 및 블록 공중합체를 생성할 수 있다.
옥사졸리늄 양이온이 친핵체에 의한 개시에 의하여 생성된 뒤, 연쇄적인 반응으로 추가적인 단량체 단위와 반응하여 성장하는 "리빙(living: 살아 있는)" 양이온을 생성하기 때문에 중합 공정은 리빙 양이온성 중합 반응이라 불린다.
Figure 112009059094943-PCT00001
리빙 양이온이 하기의 비-사이클릭 형태로 표시될 수 있는 것으로 추정하여 종결 생성물을 예측할 수 있지만, 실제적으로는 사이클릭 형태가 가장 중요하며 고리의 5번 위치상의 친핵성 공격에 의해 목적하는 생성물이 생성된다.
CH3-[N(COCH3)CH2CH2]n-N(COCH3)CH2CH2 +
본원에 있어서, 상기 양이온은 M-PMOZ+로 표시된다. 상기 언급한 바와 같이 POZ 양이온은 하이드록사이드 또는 아민과 같은 친핵체와의 반응에 의하여 "종결"될 수 있다. 흥미롭게도 약한 친핵체인 물에 의한 종결은 5번 위치를 공격하여 목적 생성물(열역학적 생성물)을 제공하지 않고 그 대신 2 번 위치를 공격하여 (반응 속도론적 생성물)을 제공한다. 반응 속도론적 생성물은 안정하지 않으므로, 에스테르 생성물로 전환되거나 양이온으로의 역반응이 일어날 수 있다 (O. Nuyken, G. Maier, A. Gross, Macromol. Chem. Phys. 197, 83-85 (1996)).
하이드록실 종결 고분자는 추가로 개질되어 목적하는 유도체를 제공할 수 있다. 예를 들면, 잘립스키(Zalipsky)는 종결 -OH와 무수 글루타르산을 반응시켜 글루타레이트기로 종결된 POZ를 제조하였다(M. C. Woodle, C. M. Engbers and S. Zalipsky, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 493-496).
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2H
상기 고분자를 숙신이미딜 에스테르로서 활성화시키고 인지질과 결합시켜 POZ-개질 리포좀을 제조하는데 사용하였다. 이러한 리포좀은 PEG-개질 리포좀과 유사한 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
아민 종결 고분자 또한 추가 유도체화를 위한 유용한 반응기를 제공한다. 예를 들면, 메틸 아민에 의한 종결은 -NHCH3로 종결된 POZ를 제공한다. 사이클릭 디아민 피페라진에 의한 종결 또한 유용할 수 있다.
옥사졸린 중합 반응은 작용성 친핵체에 의해서도 개시될 수 있다. 예를 들면 친전자성 개시제인 에틸-3-브로모프로피오네이트는 2-에틸-2-옥사졸린 중합 반응을 개시하는데 사용된다. 하이드록사이드에 의한 종결은 하기의 화합물을 제공한다:
HO2C-CH2CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH
종결부 말단의 그룹이 탄소에 결합되어 있는 반면, 개시부 말단의 그룹은 질소에 결합되어 있어, 개시부 말단과 종결부 말단에 서로 동일한 작용기를 가지는 POZ 간에도 화학적 특성이 서로 상이하다는 것을 주목할 만하다. 예를 들면, 하기 2개의 고분자는 모두 PMOZ의 프로피온산 유도체이지만 개시부 말단의 프로피온산은 질소 원자에 결합되어 있으며, 종결부 말단의 프로피온산은 탄소 원자에 결합되어 있다는 점에서 상이하다(개시부 또는 종결부 단량체 단위가 명확히 표시되어 있음):
HOOCCH2CH2-N(COCH3)CH2CH2-PMOZ-OH
M-PMOZ-N(COCH3)CH2CH2-O-CH2CH2COOH
활성 작용기를 갖는 폴리옥사졸린을 제조하는 또 다른 방법은, 2-에틸-2-옥사졸린과 같은 단량체를, 2 위치에 활성 작용기를 가지는 옥사졸린 단량체와 공중합시키는 것이다. 예를 들면 조던(Jordna)과 그의 동료들은 아세틸렌 및 2 위치에 보호된 알데하이드, 카르복시산 및 아민을 갖는 옥사졸린을 제조하였다(F.C. Gaertner, R. Luxenhofer, B. Blechert, R. Jordan and M. Essler, J. Controlled Release, 2007, 119, 291-300). 이러한 작용성 단량체들과 2-에틸-2-옥사졸린의 중합은 다중 팬던트 또는 측쇄 활성 작용기를 갖는 랜덤 공중합체를 제공한다. 예를 들면, 메틸 트리플레이트로 2-에틸-2-옥사졸린과 2-펜티닐-2-옥사졸린의 중합 을 개시하고 피페라진(NHC4H8NH)으로 종결하여 하기 랜덤 공중합체를 제공한다.
CH3-{[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-[N(COCH2CH2CH2-CCH)CH2CH2]m}ran-NC4H8NH
상기 용어 "ran"은 고분자가 랜덤 고분자임을 의미한다. n의 값은 전형적으로 약 20 내지 30이며, m은 2 내지 5이다.
폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 타겟 분자에 POZ를 결합시키기 위해서는, 타겟 분자의 기와 결합을 형성할 수 있는 1개 이상의 활성 작용기를 고분자의 종결부에 결합시킴으로써 고분자를 "활성화"시켜야 한다. 타겟 분자에 결합시키기 위해 POZ의 활성화를 위한 약간의 처리가 수행된다. 활성기는 개시부 말단(왼쪽) 및 종결부 말단(오른쪽) 또는 양쪽 모두에 결합될 수 있다. 예를 들어 타겟 분자가 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드는 표면에 다수의 아미노기를 가지므로 POZ 상의 작용기와 반응할 수 있으며, 단백질에 결합된 POZ로서 유일하게 개시된 예로서는 미야모토(Myamoto) 및 그의 동료들이 하기 POZ를 효소 카탈라아제의 아미노기에 결합시킨 것을 들 수 있다(M. Myamoto, T. Saegusa, et al., Macromolecules, 1990, 23, 3201-3205):
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS
M-PMOZ-OH를 무수 글루타르산과 반응시켜, 생성된 카르복시산을 NHS로 표시된는 N-하이드록시숙신이미드로 활성화시켰다. NHS 활성 에스테르는 통상적으로 사용되는 카르복시산의 활성 형태이다. 이러한 예로서 POZ-카탈라아제 콘쥬게이트가 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
공지 기술은 타겟 분자와 콘쥬게이트될 수 있는 3개의 종결부-활성화된 POZ화합물을 개시하고 있다. 그러나 전술한 POZ 유도체 각각은 한계를 가지고 있다. 잘립스키는 활성화기가 분자의 개시부 말단에 결합되어 있는 활성화된 프로피온산 POZ 화합물인, NHS-OOCCH2CH2-PEOZ-OH에 대해 기술하였다(S. Zalipsky, C. B. Hansen, J. M. Oaks and T. M. Allen, J. Pharm. Sci., 85, 133-137 (1996)). POZ 화합물은 활성화기를 함유하는 모이어티(moiety)를 이용한 중합 반응의 개시에 의해 제조된다. 그러나, 조던, 후겐붐(Hoogenboom) 등은 상이한 활성기에 의해 중합 반응이 개시되는 경우, 매우 상이한 반응조건이 필요하며 이들의 최적 반응 조건을 결정하기 위해서는 상당한 연구가 필요함을 밝혔다. 따라서, POZ 화합물을 활성화하기 위한 개시 방법을 선택하기 위해서는 각각의 신규한 화합물에 대하여 적절한 반응 조건을 결정하기 위하여 예비적인 연구를 수행하여야 한다. 또한, 상기 화합물은 알킬기와 같은 불활성기가 아니라 하이드록실기로 종결되기 때문에 이중 작용성(difunctional)을 갖는다. 또한, 하기 논의되는 바와 같이, 알킬 할라이드에 의한 중합 반응의 개시는 리빙-양이온성 메카니즘에 의해 진행되지 않으므로 고다분산적(polydispersityㄴ)인 것으로 밝혀졌다.
NHS-활성화된 글루타레이트 유도체는 미야모토 및 잘립스키에 의하여 제조되었다. 이러한 유도체는 종결부 활성화기(M-PMOZ-OH)로서 OH기를 갖는 단일 작용성 POZ 고분자로부터 제조된다. 그러나 글루타레이트 및 숙시네이트 유도체는 타겟 분자와 POZ 화합물의 연결이 가수분해에 대해 불안정한 에스테르 결합이다. 예를 들면 NHS-활성화된 글루타레이트 유도체는 하기 단백질로 예시된 타겟 분자와 반응한다.
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS + PROTEIN-NH2 ->
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
가수분해에 대해 불안정한 에스테르 결합으로 인하여, 생성된 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트는 생리학적 조건 하에서 예를 들면, 인간 또는 기타 포유류의 생물학적 시스템에서 안정하지 않으며 가수분해되어 단백질로부터 POZ가 절단된다.
M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
-> M-PMOZ-OH + HO2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
추가로, 상기 반응식에서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트가 불안정한 에스테르 결합의 절단으로 인해 가수분해되는 경우, 생성된 타겟 분자는 타겟 분자의 면역원성을 야기하는 "태그(tag)" 또는 "합텐(hapten)"을 포함한다.
궁극적으로, 오르소피리딜 다이설파이드(OPPS) 유도체가 제조된다(G. Hsiue, et al., Bioconjugate Chem., 2006, 17, 781-786). 상기 유도체는 이론적으로 단백질 티올기와 결합되어 다이설파이드 결합을 제공할 수 있으나, Hsiue에 의하여 수행된 바는 없다. 다만 다이설파이드는 불안정하고 혈장 내에서 쉽게 감소되는 것으로 알려져 있다.
타겟 분자를 개질하기 위해 공지의 POZ 고분자를 사용하는 것을 제한하는 또 다른 문제점은 일부의 POZ 고분자가 단일 활성 작용기를 갖지 않는다는 것이다. 즉, POZ 고분자가 "단일 작용성"이 아니다. 고분자 백본(backbone) 상의 타겟 분자들의 교차결합 및/또는 다중 결합을 방지하기 위해서는 단일 작용성이 요구된다. 예로서 조던 및 그의 동료들은 2-에틸-2-옥사졸린과 작용기를 포함하는 옥사졸린 단량체와의 공중합 반응을 보여주는 연구를 발표하였다. 일례로 이러한 펜던트 작용기는 단백질과 결합할 수 있다. 하지만, 상기 기술은 단일 작용성 POZ 고분자를 제공하기 위해 설계된 것이 아니고 백본을 따라서 펜던트기를 갖는 다중 작용성 화합물을 제공한다. 일부 예에서는 POZ 백본에 존재하는 다중 작용기를 가지는 것이 유리할 수 있으나, 폴리펩티드 및 단백질 등의 다중-작용성 타겟 분자와 결합되는 경우에 교차 결합 및 응집체 형성을 야기할 수 있다. 또한, 하나의 타겟 분자를 하나의 고분자와 결합시키고자 하는 경우, 다중-작용성 POZ가 이를 허용하지 않는다.
상기 작용성 POZ 화합물의 일부는 단백질 및 소분자 약물과 같은 타겟 분자와 결합될 가능성을 가진다. 그러나, 폴리에틸렌 글리콜-개질 치료제에 관한 연구에서 밝혀진 바와 같이, 고분자-개질 약물의 상업적 개발을 위해서는 분자량(MWs)이 40,000 Da 이상이고, 분자량 분배 또는 다분산도(PDs)가 1.1 미만인 고분자를 사용하는 것이 빈번히 요구되고 있다. 다양한 연구에 의하여 통상의 기술로는 상기 범위 내의 분자량 및 다분산도를 갖는 POZ를 달성할 수 없음이 밝혀졌다. 일반적으로 성장하는 POZ 체인의 분자량은 대략 5,000 Da이므로, 다분산도는 현저히 증가된다. 연쇄 전달(chain transfer)을 포함하는 부반응(side reaction)이 매우 증가하게 된다. 일반적이지 않은 낮은 중합 반응 온도로 몇 주간 반응하는 경우 허용 가능한 PD를 제공하는 것으로 밝혀졌으나, 그러한 조건은 상업적 규모의 제조에 적합하지 않다(J. S. Park and K. Kataoka, Macromolecules, 39, 6622 (2006)). 후겐붐, 슈버트(Schubert)와 그들의 동료들은 전자파 조사를 이용하여 낮은 PD를 갖는 POZ를 제조할 수 있음을 밝혔으나, 이러한 기술에 의해서도 상업적 규모의 중합은 불가능하다(R. M. Paulus, T. Erdmenger, C. R. Becer, R. Hoogenboom 및 U. S. Schubert, Macromol. Rapid Comm., 28, 484-491 (2007)). 결국, 일반적으로 관측되는 넓은 다분산도 때문에 현재 밝혀진 작용성 POZ 화합물들은 고분자 치료제로 사용되기에는 매우 제한적이다.
타겟 분자를 개질하는데 있어 POZ 유도체를 사용하는 것을 제한하는 또 다른 문제점은 다양한 조건 하에서 타겟 분자와 반응할 수 있는, 적절히 활성화된 POZ 고분자의 사용이 용이하지 않다는 것이다. 더욱이, 현재 사용가능한 POZ분자는 다중 작용성이거나 타겟 분자와 콘쥬게이트되는 경우, 가수분해에 대해 불안정한 결합을 포함하므로써 그와 관련된 단점을 가지거나 활성 치환기가 개시 반응 중에 첨가되어 그로 인한 단점을 갖는다. 또한, 펜던트 작용기가 기술되었으나, 이러한 유도체는 다중 작용성이고 본원에 적합하지 않다.
본 발명의 요약
본 발명은, 다양한 반응 조건 하에서 단일 작용성 POZ 유도체를 다양한 범위의 타겟 분자와 콘쥬게이트시켜, 하나의 타겟 분자가 POZ 유도체에 결합되며 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있도록 하는, 활성기를 갖는 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 상이한 타겟 분자는 서로 다른 반응 조건에 대하여 민감하고, POZ 유도체와 타겟 분자의 콘쥬게이트 형성에 가장 효과적인 반응 조건은, 타겟 분자의 고유 성질 및 POZ 유도체와 반응하는 타겟 분자 상의 그룹에 따라 자주 변하기 때문에, 상이한 반응 조건 하에서 타겟 분자 상의 선택된 기와 반응할 수 있는 다양한 활성기를 갖는 단일 작용성 POZ 유도체를 제공할 수 있다면 공지 기술에 비하여 상당한 이점을 갖는다.
본 발명은 이전에 공지되지 않은 POZ 유도체를 제공하므로써 전술한 POZ 고분자의 한계점을 해결한다. 추가로, 본 발명은 공지되지 않은 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 또한, 본원은 그의 종결부 말단 상에 활성 작용기를 갖는 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 또한, 본원은 하이드록실기를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 사용이 쉽고 공지된 화학 제조법에 의하여 제조될 수 있는 종결부 말단기를 갖는 POZ 분자를 사용하여 개시된 POZ 유도체의 합성 방법을 제공함으로써 공지 기술의 문제점을 해결하고 있다. 다양한 POZ 유도체는 단계적으로 소 활성 분자를 사용가능한 종결기와 결함시킴으로써 제조되어, POZ 유도체에 (본원에 기술된) 목적 활성 작용기를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 전술한 단일 작용성 POZ 유도체를 이용하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 제공하면서 공지 기술의 한계점을 해결하고 있다. 이러한 접근 방법은 하나 이상의 타겟 분자가 각 POZ 유도체에 결합되는 타겟 분자-PZ 콘쥬게이트를 제공할 뿐 아니라, 인 비보(in vivo) 상에서의 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 반감기를 증가시키고 타겟 분자의 "합텐 태깅(hapten tagging)"과 관련된 면역원성의 문제점을 감소시켰다. 개시된 단일 작용성 POZ 유도체, 합성 방법 및 생성된 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트는당해 기술 분야에서 인지되지 않았다.
따라서, 기술된 단일 작용성 POZ 유도체 및 합성 방법은 당해 기술 분야의 문제점을 극복하고 하나의 타겟 분자가 POZ의 유도체에 결합된, 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 제조하는 메카니즘을 제공한다.
임의의 2-치환된-2-옥사졸린 화합물은, PMOZ 및 PEOZ를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 하기에서 더욱 자세히 논의된 바와 같이 본 발명의 POZ 유도체를 제조하는데 사용될 수 있다. 하나의 태양에 있어서, PEOZ 및 PMOZ는 2-치환된-2-옥사졸린 분자이다. 공지된 바와 같이 2-알킬-2-옥사졸린 분자의 상이한 알킬기는 본원의 POZ 유도체에 대한 용해성, 약물동력학 및 막 투과성에 있어서 서로 다르다. 또한 POZ 고분자 백본의 반복 단위의 고유 성질은 호모폴리머(homopolymer:예를 들면 PMOZ 및 PEOZ를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 생성하는 반복 단위와 동일하거나 또는 예를 들면 랜덤 또는 블록 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 공중합체를 제공하기 위하여 1개 이상의 반복 단위가 서로 상이할 수 있다.
또한, 본 발명은 낮은 다분산도(PD) 값을 가지며 연쇄 전달과 같은 원치 않는 부반응에 의한 불순물의 생성량이 감소된 POZ 고분자를 합성하는 신규한 방법을 제공한다. 하나의 태양에 있어서, 본 발명은 연쇄 전달과 같은 원치 않는 부반응을 최소화하여 낮은 PD 값을 가지는 높은 순도의 POZ 고분자를 생성 가능할 수 있는 신규한 방법을 제공한다. 하나의 태양에 있어서, 본 발명의 방법은 증가된 분자량 수치에서 낮은 PD 값을 갖는 POZ 유도체를 제공한다. 또 다른 태양에 있어서, POZ 고분자의 불순물의 량이 감소된다. 본 발명에서 제공되는 방법은 공지 방법에 비하여 향상된 것으로 매우 다양한 타겟 분자의 개질에 사용되기 적합한 POZ 고분자의 대규모의 상업적 제조용으로 제공된다.
따라서, 본 발명은 또한 약학적 적용에 적합한, 증가된 순도와 낮은 PD 값을 갖는 POZ 고분자를 제공한다. 공지된 바와 같이, PD 값은 분자량에 따라 달라진다. 일반적으로 분자량이 증가할 수록 PD 값도 증가한다. 본 발명의 방법을 사용하면 상업적으로 이용가능한 선행 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있는 분자량에 대하여 낮은 PD 값을 갖는 다양한 분자량의 POZ 고분자를 대량 생산할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 방법을 사용하여, 1.1 이하의 PD 값을 갖는 분자량이 20,000 Da 이하인 POZ 유도체를 제조할 수 있다. 또 다른 태양에 있어서, 불순물 량이 감소된 상기 POZ 유도체가 제조될 수 있다. 당해 기술 분야에서 공지되고 실시예에 기술된 바와 같이, 종래 기술 방법을 사용하여 합성된 POZ 유도체는 GPC 방법에 의해 고분자량의 숄더(shoulder) 및 저분자량의 테일(tail)로서 나타난 임의의 불순물을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 불순물들은 부분적으로는, 연쇄 전달과 같은 원치 않는 부반응을 통하여 생성된다. 결과적으로, 개시된 POZ 유도체는 다양한 타겟 분자의 개질에 사용하기 적합하다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 상이한 활성 작용기를 갖는 다양한 단일 작용성 POZ 유도체가 제공된다. 추가로 본 발명은 효율적인 방법으로 그러한 단일 작용성 POZ 유도체를 생성하는 합성 방법을 제공한다. 결과적으로, 기재된 단일 작용성 POZ 유도체를 사용하여 하나의 타겟 분자가 POZ 유도체에 결합되어 있는, 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 제조할 수 있다.
낮은 PD 값을 갖는 POZ 유도체의 합성 방법
2-아릴- 및 2-알킬-2-옥사졸린의 중합 반응의 최신 기술은 코바야시(Kobayshi), 뉴켄(Nuyken) 및 조던에 의하여 공개되었다[ 참조: S. Kobayashi, E. Masuda, S. Shoda and Y. Shimano, Macromolecules, 1989, 22, 2878-2884; A. Gross, G. Maier and O. Nuyken, Macromol. Chem. Phys., 1996, 197, 2811-2826; and F. C. Gaertner, R. Luxenhofer, B. Blechert, R. Jordan and M. Essler, J. Controlled Release, 2007, 119, 291-300]. 이러한 중합 방법은 알킬 토실레이트 또는 알킬 트리플레이트와 같은 친전자체에 의하여 개시된다. 하나의 태양에 있어서, 메틸 토실레이트 또는 메틸 트리플레이트가 사용된다. 이론상 이러한 강한 친전자체를 사용하는 경우 리빙-양이온성 메카니즘이 종결되지 않고 연쇄 전달 반응이 일어나지 않으므로, 중합 반응시 강한 친핵체가 선호된다[참조: Q. Liu, M. Konas and J. S. Riffle, Macromolecules, 1993, 26, 5572-5576] (도 1 참조). 그러나, 선행 기술로부터, 연쇄 전달 반응이 일어나며 반응은 리빙 양이온성 메카니즘에 따라 정확하게 진행되지 않는다는 것이 이미 알려져 있다. 알킬 할라이드와 같은 약한 친전자체가 사용되는 경우, 반응은 결과적으로 PD가 상당히 증가하는 공유(covalent) 메카니즘에 따라 반응이 진행된다. 선행 기술의 중합 반응은 클로로벤젠, 디클로로벤젠 또는 아세토니트릴을 용매로서 사용한다. 전파 단계(propagation phase)는 약 80℃에서 약 1 내지 3일 동안 수행한다. 탄산 나트륨 수용액에서 약 80-90℃로 가열하여 하이드록실 종결기를 제공하거나 모르폴린 또는 피페리딘과 같은 제2차 아민과 반응시켜 종결 3차 아민을 제공함으로써 반응을 종결시킨다.
이러한 전형적인 선행 기술 방법을 사용하는 경우, 겔 투과 크로마토그래피에 의하면 약 5-10%의 고분자량 숄더 및 낮은 분자량 테일가 상당량 존재한다. 이러한 결과는 당업계에 알려져 있다(참조: J. Park and K. Kataoka, Macromolecules, 2006, 39, 6622-6630.). 상기 공정에 대한 상세한 구조 및 실험적 자료는 제한적이지만, 문헌에는 일반적으로 광범위한 분자량의 분배가 제거-이합체화(elimination-dimerizatoin) 메커니즘을 통한 연쇄 전달 진행 때문인 것으로 나타나있다(M. Litt, A. Levy and J. Herz, J. Macromol. Sci.-Chem., 1975, A9, 703-727). 연쇄 전달 반응이 일어난다는 점에서 그러한 반응은 실제적으로 리빙 메커니즘으로 간주되지 않는다. 따라서, 연쇄 전달과 같은 원치 않는 부반응의 발생을 제한하는 것이 바람직하다.
발명자들은 제거-이합체화 메커니즘을 구체화하여 명시하였으며, 메커니즘의 실험 자료를 제공하고 종결 단계에 의한 메커니즘의 의미를 제공하였다. 이로 인하여 어떤 종결 반응이 성공적이지 못한 이유가 밝혀지고 성공적인 종결 반응을 선택할 수 있게 됨으로써 이러한 발견은 큰 의의를 갖는다 할 것이다. 또한, 이는 공지된 바가 없으며, 원치 않는 부반응을 감소시키고 목적하는 종결 생성물을 생성하는 합성 방법을 제공하는 지침이 되고 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 선행 기술에 의하면 POZ 생성물 총량의 약 5-10%의 고분자량 숄더를 함유하는 POZ가 제조된다. 선행기술의 합성 방법을 사용하면 상기 고분자량 숄더는 허용불가능한 PD 값을 야기한다. 선행 기술 방법에서 인지되는 고분자량 숄더는 적어도 부분적으로는, 중합 및/또는 종결 단계 과정에서 형성되는 고분자량의 이합체(dimer)로 구성되어 있다(참조: 도 3). 종결 단계에서 연쇄 전달이 발생하는 경우, 제거-이합체화 메카니즘에 의하여 고분자량 숄더 내의 물질이 목적 생성물 분자량의 약 2배일 것으로 예측된다. 또한, 전파 단계에서 연쇄 전달이 발생하는 경우, 새로운 고분자 사슬이 개시되며, 이 시점에서의 단량체의 농도가 낮기 때문에 상기 고분자의 분자량은 고분자 덩어리(bulk of polymer)의 분자량보다는 작을 것이다. 또한, 새로운 고분자 사슬은 연쇄 전달에 의하여 생성되기 때문에 메틸기 보다 프로톤에 의하여 개시되어야 하므로, 상기 고분자의 MALDI 스펙트럼은 주 피크 보다 적은 14 Da 피크 세트를 나타낸다.
현재까지 인식되지 않았던 종결 단계에 관해서도 시사되어있다. 예를 들면, 강한 염기이면서 약한 친핵체인 종결 친핵체의 첨가는 상당한 제거 및 이합체화를 야기하는 것으로 예상된다. 또한, 옥사졸리니늄 양이온이 이동되거나 "약한(soft)" 친전자체이며, 이론상 "약한" 또는 확산된 친핵체가 염기보다 종결 친핵체로 작용하기 더 쉽다. 예를 들면 "약한" 머캅타이드는 "강한(hard)" 알콕사이드보다 더욱 효과적인 종결제이다.
상기 예측은 실험적으로 확인되었다. 하나의 실시예에서, 입체적으로 방해받는 에틸디이소프로필아민(강한 염기 및 약한 친핵체)을 첨가하여 2-에틸-2-옥사졸린 중합 반응을 종결시켰다. 상기 반응은 고분자량 이합체의 생성물을 75%까지 증가시켰다(참조: 실시예 3) GPC의 불순물 피크의 분자량은 목적 생성물 분자량의 약 2 배인 것으로 확인되었다. 또한, MALDI-TOF 스펙트럼에 의하여 주 피크 부는 예측한 것보다 적은 14 질량 단위인 제2 세트 피크를 나타냈다. 발명자들은 제2 세트의 피크가 목적 생성물 분자량의 2 배보다 다소 적은 것을 관측하였다. 이는 고분자가 완전히 형성되고 단량체가 제거되기 전에 전파 단계 과정에서 일부 연쇄 전달이 발생하기 때문일 것으로 예상된다. 이러한 경우 가장 강한 염기가 전파 단계 에서 존재하기 때문에 염기가 단량체가 된다.
또한, 강한 친핵체로서 알콕사이드에 의한 종결은 목적하는 친전자성 공격에 의하여 유도되는 생성물 없이 상당량의 고분자량 이합체를 야기한다(참조: 실시예 5). 또한, 약한 친핵체로 알려진 머캅타이드에 의한 종결은 친핵체 공격에 의한 목적 생성물을 유도한다(참조: 실시예 11).
상기 관측에 의한 결과, 발명자들은 연쇄 전달과 같은 부반응을 감소시키고 선행 기술에 비하여 우수한 특성을 갖는 POZ 고분자 및 그의 유도체를 생성할 수 있는 새로운 합성 방법을 개발하였다. 개선된 방법은 하기의 개선점을 하나 이상 사용할 수 있다.
하나의 태양에 있어서, POZ 중합 반응은 알킬 토실레이트 또는 알킬 트리플레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 강한 친전자체에 의하여 개시된다. 하나의 태양에 있어서 메실 토실레이트 또는 메틸 트리플레이트가 사용된다.
이분자의 제거 반응(bimolecular elimination)이 고온에서 쉽게 일어나기 때문에 제거-이합체화 메카니즘은 전파 및 종결 모두가 저온에서 수행되는 것이 바람직하다. 전파 및 종결 모두의 온도가 낮아지면 고분자량의 이합체 형성이 감소되는 것이 실시예에서 확인되었다. 이러한 예측은 카타오카에 의하여 확인되었다(참조: J. Park and K. Kataoka, Macromolecules, 2006, 39, 6622-6630). 그러나, 모든 연쇄 반응을 방지하기 위하여 온도를 현저히 낮추게 되면 반응이 완료되기까지는 수 주가 걸리므로 그러한 반응은 상업적으로 이용 불가능하다. 본 발명은 상업적으로 이용가능한 방법에 대하여 하기에 서술한다. 본 발명자들은 전파 단계가 종료되거나 거의 종료 된 후 계속해서 가열하면 제거-이합체화가 형성되는 것을 관측하였다. 본 발명은 기존 공지 기술에 의하는 경우보다 저온에서 중합 반응을 조기에 종결시킴으로써 POZ 유도체 품질이 놀랍게도 매우 개선됨을 보였다. 또한, 전파 반응 기간은 단량체 소비가 종료되거나 실질적으로 종료(90% 이상)되기까지 요구되는 최소한의 시간이다. 온도 및 전파 반응의 지속 기간이 서로 연관된 것을 주의하여야 한다. 즉, 높은 전파 온도는 더 짧은 전파 단계 반응 시간이 걸린다. 역으로 전파 반응 시간이 더 긴 경우 온도는 낮아져야 한다.
POZ 생성물의 상업적 규모의 제조에 있어서 매우 중요하며, 일반적으로 사용되는 아세토니트릴 용매를 사용한 경우보다 클로로벤젠과 같은 용매를 사용하는 경우 더욱 빨리 중합 반응이 일어난다. 선행 기술에 있어서 클로로벤젠이 용매로서 인식되었으나, 반응 속도를 향상시키는 것으로 인식되지는 않았다. 용매로서 클로로벤젠을 사용하였을 경우, 더욱 빠른 반응 시간을 제공하는 예상치 못한 결과는 고분자량 이합체 생성물의 형성을 증가시키지 않는 동시에 고온에서 조기에 중합 반응을 종결짓는 것을 가능하도록 하였다. 이러한 개선점에 대해서는 공지되 바가 없다.
또한, 특히 OH기로 종결되는 POZ 생성물의 양이온-교환 수지에 의한 여과는 PD 값을 증가시켰다. 상기 여과는 저분자량 및 고분자량 생성물을 제거하는 것으로 여겨진다. 여과의 효과는 특히 고분자량 POZ 생성물(예를 들면, 10,000 Da 이상인 생성물)에 대하여 우수하다. 하지만 여과는 분자량에 상관없이 POZ 유도체에 이점을 제공한다. 상기 개선점을 보여주는 하나의 예로서, (본 발명의 발명에 의해 제조된) 비여과된 M-PEOZ-OH 10,000는 상당량의 저분자량 테일를 갖지며 Mn은 7950 Da이고, PD는 1.21(GPC)을 나타냈다. 카르복시에틸-세파로스(carboxyethyl-sepharose)에 의한 상기 생성물의 여과는 저분자량의 테일 없이 약간의 2% 고분자량 숄더(GPC에 의하여 측정됨)를 가지며 Mn가 9180 Da이고 PD가 1.05(GPC)이며 Mn 9780 Da 및 PD 값이 1.01(MALDI)이었다. 고분자량 숄더가 조질 생성물에 있어서 발견되지 않는다는 사실로부터 양이온-교환 수지 여과가 고분자량 및 저분자량 불순물을 제거하는 것을 알 수 있다.
또한, POZ 생성물이 종결기로서 카르복시산을 포함하는 경우, 음이온-교환 크로마토그래피가 목적 생성물을 분리하고 임의의 고분자량 생성물을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 M-PEOZ-S-CH2CH2-CO2H에 대하여 상기 실험을 수행하였다. 크로마토그래피 실험이 고분자량 이합체가 중성임을 보인 것은 주목할 만한다. 따라서, 주요 이합체화 생성물은 도 3의 알켄이다. 상기 실험에 있어서, 조질 생성물의 Mn은 9600 Da이고, PD 값이 1.09(GPC)이며 고분자량 숄더가 6%였다. DEAE-세파로스 상의 음이온-교환 크로마토그래피 후, Mn은 9500 Da이고, PD 값은 1.06(GPC)이었으며 고분자량 숄더는 존재하지 않았다.
또 다른 태양에 있어서, 종결 반응은 염기보다 우수한 친핵체인 친핵체를 사용하여 저온(하나의 태양에 있어서, 80℃ 미만; 또 다른 태양에 있어서는 15 내지 40℃)에서 수행되었다. 친핵체의 대표적인 예로는 머캅타이드와 같은 약한 친핵체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명자들은 나트륨 알콕사이드 화합물을 종결제로 사용하는 경우, 목적하는 생성물이 생성되지 않으며 오히여 비종결된 양이온이 남아 있는 것을 발견하였다. 그러나 나트륨 머캅타이드 및 NaS-CH2CH2-CO2Et과 같은 관련 화합물을 사용하는 경우 효과적으로 종결이 이루어져 낮은 PD 값과 같은 원하는 특성을 지닌 POZ 생성물을 제공하였다. 상기 에스테르를 카르복시산으로 가수분해한 뒤, 음이온-교환 크로마토그래피 하여 낮은 PD 값을 가지며 고분자량 숄더가 없는 고품질의 POZ 생성물을 수득하였다. 이러한 예로서 Mn이 9600 Da이고, PD가 1.09(GPC)이며 6% 숄더인 M-PEOZ-S-CH2CH2-CO2H을 생성하였다. DEAD-세파로스 상의 음이온 -교환 크로마토그래피는 Mn이 9500 Da이고, PD가 1.06(GPC)이었으며, 숄더가 없었다.
합성에 있어서 이러한 새로운 개선점들은 본원의 POZ 고분자 및 유도체의 제조에서 사용된다. 상기 개선점들은 당업자에게 자명한 것으로 다양한 조합으로 합성시 사용될 수 있다. 특정 합성에서 사용되기 위해서 각각의 개선점이 요구되는 것으로 해석되는 것은 아니다.
M-PEOZOH 2000을 합성하는데 2가지 방법으로 선행 기술의 방법을 사용하였다. 상기 POZ 유도체의 합성에 대한 설명은 실시예 1(도 2A) 및 실시예 2(도 2B)에 제공되어 있다. 생성된 POZ 유도체를 분석하였다. 도 2A의 POZ 유도체에 있어서, GPC는 측정가능한 고분자량 숄더(Mn-3600Da, 9%)를 갖는 단일 피크를 보였다. 주피크는 Mn이 980Da이고, PD가 1.08이었다. NMR은 예측된 피크를 나타냈다(참조: 실시예 6). MALDI-TOF MS는 최대값이 2000Da이고, PD 값은 1.04이며 99.1 Da의 분리를 갖는 피크 세트를 보였다. MALDI 스펙트럼은 99.1 Da 분리된 제2 세트 피크로서, 각 피크는 주 세트보다 14Da 적었다. 상기 피크 세트의 최대값은 1600Da이었다. 도 2B의 POZ 유도체에 대하여, GPC는 측정가능한 고분자 숄더(Mn=3300Da, 6%)를 갖는 단일 피크를 보였다. 주피크는 Mn이 2200Da이고 PD가 1.06이었다. NMR은 예측된 피크를 나타냈다(참조: 실시예 6). MALDI-TOF MS의 최대값은 2300Da에서 99.1 Da 분리된 피크 세트를 보였다. MALDI 스펙트럼은 또한 99 .1 Da 분리된 제2 피크 세트를 보였다. 상기 피크 세트의 최대값은 2100Da이었다.
본 발명의 방법은 비교를 위해 M-PEOZ-OH 2000 (도 4A) 및 M-PEOZ-OH 5000 (도 4B)의 2가지 POZ 유도체를 합성하는데 사용하였다. 상기 POZ 유도체의 합성에 관한 기술은 실시예 6(도 3A) 및 실시예(도 4B)에 개시되어 있다. GPC 크로마토그램은 도 4A 및 도 4B에게 개시되어 있다. 도 4A 및 도 4B는 본 발명의 방법을 사용하여 얻은 M-PEOZ-OH 2000 및 5000의 GPC가 매우 향상되었음을 보여준다. (a) 메틸 트리플레이트 개시 반응, 클로로벤젠 내에서 110℃로 1.5 시간 전파 반응하고 실온에서 탄산수의 종결 반응 조건으로 M-PEOZ 2000을 반응시켰다. M-PEOZ 2000 유도체는 1900 Da의 Mn(MALDI 및 GPC)와 1.07(GPC) 및 1.03 (MALDI) PD를 가지며 고 분자량 숄더 및 저분자량 테일를 가지지 않는 것으로 관측되었다. (a) 메틸 트리플레이트 개시 반응, 클로로벤젠 내 42℃로 1 시간 및 80℃로 3.75 시간 전파 반응하고, 실온에서 탄산수의 종결 반응 조건으로 M-PEOZ 5000을 반응시켰다. M-PEOZ 5000 유도체는 4900 Da의 Mn(MALDI)와 1.06(GPC) 및 1.02(MALDI)의 PD를 가지며 매우 적은 고분자량 숄더를 가지고 저분자량 테일을 갖지 않는 것으로 관측되었다. 유사한 조건에서 제조된 M-PEOZ 5000 유도체는 9780 Da의Mn(MALDI)와 1.01 (MALDI) 및 1.05 (GPC) PD를 가지며 2%의 매우 소량의 고분자량 숄더를 보였다.
요약하면, 본원의 발명자들은 선행 기술의 합성 방법을 사용하는 경우에 발생하는 원치않는 부반응의 고유 성질을 규명하고 그러한 부반응을 최소화시킬 수 있는 반응 조건을 규명하였다. 결과적으로 본 발명의 방법에 의하여 이용 가능한 선행 기술에 비하여 우수한 특성을 갖는 POZ 고분자 및 유도체를 제조가능하게 되었다. 하나의 태양에 있어서, 본 발명의 방법에 의하여 낮은 PD 값을 갖는 POZ 고분자 및 유도체의 제조가 가능하다. 구체적인 태양에 있어서, 본 발명에 의해 고분자량에서 낮은 PD 값을 갖는 POZ 고분자 및 유도체의 제조가 가능하다. 또한, 본원 방법에 의해서는 대량 생산에 적합한 방법으로도 POZ 고분자 및 유도체의 제조가 가능하다. 상기 특성을 갖는 POZ 고분자 및 유도체 뿐 아니라 이를 제조하는 방법은 공지된 바가 없다.
하나의 태양에 있어서, 본 발명의 방법은 POZ 합성의 개시, 중합 또는 종결 공정 도중에 발생하는 1 이상의 부반응을 전부 또는 부분적으로 감소시키므로 POZ 고분자 합성에 유리하다. 구체적인 태양에 있어서, 부반응은 연쇄 전달 공정이다. 연쇄 전달 공정과 같은 원치 않는 반응은 POZ 생성물을 제조하시 현 공지 기술이 갖는 문제점이다. 상기 부반응은 높은 PD 값과 같이 원치 않는 특성을 갖는 POZ 유도체를 제공한다.
단일 작용성 POZ 유도체의 합성 방법
본 발명은 전술한 단일 작용성 POZ 유도체의 합성 방법을 제공한다. 본원에서 새로운 합성 방법은 일반적으로 빌딩 블록(building block) 방법이라 한다. 빌딩 블록 방법의 하나의 태양으로, 1-단계 합성 방법이 개시되어 있다. 또 다른 빌딩 블록 방법의 하나의 태양으로, 2- 단계 방법이 개시되어 있다. 추가적인 빌딩 블록 방법의 하나의 태양으로는 리빙 고분자 합성 방법이 기술되어 있다. 각 방법은 하기에서 자세하게 서술된다.
빌딩 블록 1-단계 방법
빌딩 블록 접근 방법의 첫째 태양으로서 1-단계 방법이 개시되어 있다. 1-단계 방법에 있어서, 다양한 단일 작용성 POZ 유도체는 단일 종결부-작용화된 POZ 분자와 목적 활성기를 함유하는 화합물 세트를 반응시킴으로써 생성된다. 상기 방법에 있어서 단일-종결부 작용화된 POZ 분자는 다양한 활성화된 단일 작용성 POZ 유도체로 전환될 수 있다. 이러한 접근 방법은 단일 작용성 POZ 유도체를 제조하기 위해 중합 화학 조건만을 최적화하면 됨을 의미한다. POZ 종결기(하기 Y)는 상기 다양한 반응을 통해 다양한 활성기를 제공할 수 있도록 신중하게 선택한다. 1-단계 방법은 하기 반응식 1의 일반적 형태로 나태낼 수 있다.
R1-POZ-Y -> R1-POZ-Pp-Qq-X
상기 식에서, POZ는 -[N(COR7)CH2CH2]n-이고;
R7은 각 반복 단위에 대하여, 탄소수 1 내지 12의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되며;
R1 은 수소 또는 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기이고;
R2 내지 R4, R11 및 R14 내지 R15는 수소 또는 하나의 태양에 있어서, 탄소수 1 내지 10의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각각 독립적으로 선택되며;
R8은 -C6H10-CH2- (사이클로헥실메틸렌)이며;
R23 는 하나의 태양에 있어서, 탄소수 1 내지 10개의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아키닐기 또는 아랄킬기거나 치환된 또는 비치환된 아릴기이며;
Y 는 -OH, -SH, -S-(CH2)k-CO2H, 피페라지닐기, 치환된 피페라지닐기, 치환된 피페리디닐기 또는 NHR2이고;
P는 결합기이며, P는 반응식에 1에 나타난 결합을 형성할 수 있는 임의의 기일 수 있으며, 결합을 형성하는 기의 화학적 성질에 기초하여 선택된다. 대표적인 P의 예로는 -O-, -S-, -NH-, -NR11- 또는 피페라지닐(NC4H8N)와 같은 비치환된 헤테로사이클릴기가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다;
Q는 결합기이며, Q는 반응식에 1에 나타난 결합을 형성할 수 있는 임의의 기일 수 있으며, 결합을 형성하는 기의 화학적 성질에 기초하여 선택된다. 대표적인 Q 그룹은 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)m-CONH-(CH2)m-, -NH-(CH2)m, -NHCO-(CH2)m, -CO-(CH2)m-, -CO-C6H4-, or -CO-R8, -(R15)m- 또는 -(CR3R4)m가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다;
n은 3 내지 1000의 정수이며;
k 및 m은 0 또는 1로부터 독립적으로 선택되며;
p 및 q은 0 또는 1로부터 독립적으로 선택되는 정수이며;
X는 타겟 분자와 결합을 형성하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이크를 생성할 수 있는 활성 작용기이다.
하나의 태양에 있어서, 활성 작용기는 하기의 일반급의 화합물로부터 선택된다: 알데하이드(-CHO), 활성 카보네이트(-O-CO-Z), 말레이미드, 트레실레이트 (2,2,2-트리플루오로에탄설포네이트) 및 메실레이트 (-O-SO2-CH3 또는 -OMs)와 같은 설포네이트 에스테르(-OSO2-R23), 하이드라자이드 (-CONHNH2), 에폭사이드, 요오도아세트아미드, 알킨, 아자이드(-N3), 이소시아네이트(-OCN), 시아네이트(-NCO), 이소티오시아네이트(-SCN), 티오시아네이트(-NCS), 니트릴(-CN), 카르보닐디이미다졸 유도체, 비닐설폰, 카르복시산 할라이드, 활성 에스테르(-CO-Z) 및 카르복시산(-CO2-H)이고; 및
Z는 N-숙신이미딜옥시기, 염소, 브롬, 설포-N-숙신이미딜옥시기, p-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기 및 1-벤조트리아졸릴옥시기를 포함하는 공지된 다수의 활성기이다.
활성 작용기는 보호된 활성 작용기를 생성하기 위하여 공지된 방법에 의하여 보호될 수 있다. 예를 들면, 아세탈 [CH(OR14)2]은 가수분해되어 알데하이드기를 생성하는 보호기의 대표적 예이다. 활성 작용기는 치환된 알킬기 및 치환되거나 비치환된 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아랄킬기 또는 헤테로사이클로알킬기와 관련하여 이들과 같은 그룹에 의하여 치환될 수 있다. 또한, 활성 작용기는 활성 작용기로 전환될 수 있는 화합물들도 포함한다. 예를 들면, X 그룹은 특정 반응 조건 하에서 (예들 들면, POZ 유도체를 타겟 분자에 결합시키기 위해 사용되는 조건 하에서) 가수분해되어 결합이 끊어지고 활성 작용기가 노출되어 타겟 분자 상의 기와 반응하는 하기 쉬운 결합으로 개질된, 화합물을 포함할 수 있다.
반응식 1에 있어서, 반응물 R1-POZ-Y는 POZ의 중합 반응의 직접적인 생성물이며, Y 그룹은 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 단일 작용성 POZ 유도체의 일련물로 직접 전환될 수 있다. 예를 들면, 하나의 태양에 있어서, Y는 -OH이고 상기 Y는 POZ 중합 반응이 하이드록사이드에 의하여 종결되는 경우에 얻어진다. 또 다른 태양에 있어서, Y는 -NHR2이고, POZ 중합 반응이 아미노기 R2NH2를 포함하는 화합물에 의하여 종결되는 경우에 얻어진다. 유용한 Y기를 제공하는 기타 유용한 아민 종결제는 피페라진 또는 치환된 피페라진 예를 들면, 1-피페라진프로판올(H-NC4H8N-CH2CH2CH2-OH)이다. 또한, 치환된 피페리딘은 통상 아민에 대하여 빠른 종결 반응을 제공하고 다양한 작용기를 도입하기 때문에 유용하다. 상업적으로 이용가능한 치환된 피페리딘은 4-피페리딘 부탄산, 3-피페리딘 카르복시산 및 4-피페리딘 메탄올을 포함한다. 또 다른 태양에 있어서, Y는 -S-CH2CH2-CO2H이며, -S-CH2CH2-CO2-CH3로 종결되는, (그 후, 분리 없이 가수분해 함) POZ 중합 반응에 의하여 얻어진다.
1-단계 반응을 통한 R1-POZ-X 유도체의 제조방법을 나타내는 다양한 반응의 대표예가 하기에 제시되어 있다. 하기에 제시된 반응에 있어서, R1 및 R7 은 메틸기이며 Y는 -OH 또는 -NHR2 이며, R2는 CH3이다.
Figure 112009059094943-PCT00002
Figure 112009059094943-PCT00003
상기 구조는 반응식 1의 내용과 일치한다. 예를 들면 상기 활성 카보네이트 (M-PMOZ-OCO2-NHS)의 R1 및 R7은 메틸기이며, p 및 q는 0이며, X는 숙신이미딜 카보네이트이다. 상기 활성 에스테르 (M-PMOZ-O-CH2-CO2NHS)의 R1 및 R7은 메틸기이며, P는 -O-이고 p는 1이며, Q응 -CH2-이고, q는 1이며, X는 -CO2NHS이다.
상기 기재된 활성기를 갖는 단일 작용성 POZ 유도체는 유용하면서 서로 상이한 특성을 다수 가지므로, 타겟 분자의 본질 및 목적 반응 조건에 따라 원하는 작용 활성기를 갖는 특정 단일 작용성 POZ 유도체를 선택가능할 수 있다. 예를 들면 작용 활성기가 알데하이드인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 정의된 pH 내에서 타겟 분자의 N-종결 아민과 우세하게 반응하여 (전형적으로 보로하이드라이드로 환원되는 2차 아민) 이민을 형성한다. 작용 활성기가 활성 에스테르인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 타겟 분자 상의 비-종결부 라이신기 등과 같은 아민과 우세하 게 반응한다. 마찬가지로, 작용 활성기가 활성 카보네이트 또는 트레실레이트인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 아민과 쉽게 반응하나, 반응 조건 및 선택성은 활성 에스테르 및 알데히드와 상이하다. 또한, 작용 활성기가 비닐설폰 또는 말레이미드인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 티올과 우세하게 반응하나, 반응 조건은 각 활성기에 따라 다르고, 다양한 타겟 분자에 따라 적합한 다양한 반응 조건이 제공된다.
특히, 상기 합성 반응식을 사용하여 형성된 각 단일 작용성 POZ 유도체는 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
빌딩 블록 2-단계 방법
또 다른 태양에 있어서, 2-단계 합성 방법이 개시되어 있다. 2-단계 방법의 첫 단계에 있어서, 전술한 중합 반응에 의하여 제조된 개시 고분자 생성물(하기 R1-POZ-Y)은 목적 화합물과 반응하여 POZ 중간체(하기 R1-POZ-X)를 생성한다. 2-단계 방법의 둘째 단계에 있어서, 상기 POZ 중간체는, 다양한 작용 활성 기를 포함하는 다양한 화합물과 추가 반응하여, 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 단일 작용성 POZ 유도체(하기 R1-POZ-X)의 일련물을 형성한다. 2-단계 합성 방법은 2가지 반응만을 이용하여 단일 작용성 POZ 유도체를 제공하고 하나의 개시 고분자 생성물(R1-POZ-Y)로부터 출발하는 하는 이점을 제공함으로써, 여러가지 고분자 생성물을 위해 중합 조건을 최적화하여야 하는 수고를 덜 수 있다. 2-단계 방법은 1-단계 방법에 의해서는 불가능한 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 가장 일반적인 형태로서, 하기 반응식 2에 빌딩 블록의 전환하는 방법이 나타나 있다.
R1-POZ-Y -> R1-POZ-Y' -> R1-POZ-X
빌딩 블록의 2-단계 방법은 하기 반응식 3과 같이 구체적으로 나타낼 수 있다. 반응식 3에서 Y'은 활성기로서 활성 에스테르 및 활성 카보네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, T 그룹으로 표시되는 작용성 친핵체와 반응할 수 있다.
단계 1
R1-POZ-Y -> R1-POZ-Pp-Qq-Y'
단계2
R1-POZ-Pp-Qq-Y' + T-Uu-X -> R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X
상기 식에서,
R1 내지 R4, R7 , R8, R11, R14내지 R15, R23, POZ, P, Q, k, m, n, p, q, Y 및 X는 상기 정의와 동일하며;
U는 결합기이며, U는 반응식 3에 나타난 결합을 형성할 수 있는 임의의 기일 수 있으며, 결합을 형성하는 그룹의 화학적 성질에 기초하여 선택될 수 있다. U 기의 대표적인 예로는 -(R16)o-, -(CR5R6)o-, -NH-R21-NHCO-R22-를 포함하지만, 이에 제한되지는 않고;
o는 1 내지 10의 정수이고;
w 및 u는 1 또는 0으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고;
R5, R6, R16, R21 및 R22는 수소 또는 하나의 태양에 있어서, 탄소 원자 수 1 내지 10의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R17은 수소 또는 하나의 태양에 있어서, 탄소 원자 수 1 내지 10의 치환되거나 비치환된 치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기로부터 독립적으로 선택된다.
Y' 및 T는 가수분해에 대해 안정한 W 결합을 형성하는 반응짝이며, 상기 Y' 및 T 반응짝 및 생성된 W 결합은 표 1에 나타난 그룹 및 결합으로부터 선택된다. Y' 및 T 그룹은 W 결합의 고유 성질에 영향을 미치지 않고 서로 바뀔 수 있다.
Figure 112009059094943-PCT00004
가수분해에 대해 안정한 R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X 유도체의 제조를 나타내는 대표 반응이 하기에 기술되어 있다. 상기 반응에서, R1은 수소이고 R7은 메틸기이며, Y 는 -OH이고, p 및 q은 0이고, U는 -CH2CH2-이며, u는 1이고, 우레탄 W 결합을 형성하는 반응짝 T 및 Y'은 각각 NH2 및-O-CO2-NHS이고, w는 1이며, X는 아세탈(보호된 알데하이드)이다.
H-PMOZ-OH -> M-PMOZ-O-CO2-NHS
H-PMOZ-O-CO2-NHS + NH2-CH2CH2-CH(OEt)2 -> H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CH(OEt)2
가수분해 후 H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CHO가 생성된다.
반응식 3의 또 다른 실시예가 하기에 나타나 있다. 상기 반응에서, R1 및 R7은 메틸기이고, Y 은 -OH이고, P는 -O-이고, p는 1이며, Q는 -CH2CH2-이고, q은 1이며, 아미드(-CONH) W 결합을 형성하는 반응짝 T 및 Y'은 각각 NH2 및-CO2H이고, w는 1이며, U는 -CH2CH2-이며, u는 1이고, X는 아세탈(보호된 알데하이드)이다.
M-PMOZ-OH -> M-PMOZ-O-CH2CH2-CO2H
M-PMOZ-O-CH2CH2-CO2H + NH2-CH2CH2-CH(OEt)2 ->
M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CH(OEt)2
가수분해 후 M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CHO가 생성된다.
상기 논의된 바와 같이, 반응식 3의 활성 작용기 각각은 타겟 분자와 반응 시 독특한 이점 및 특이성을 갖는다. 추가로 서로에 대한 T 및 Y' 기의 서로에 대한 반응성은 Q 및 U 기의 고유 성질에 의하여 조절될 수 있다. 상기 Q 및 U 기의 크기를 증가시킴으로써 T 및 Y' 및/또는 T 및 X 그룹 간의 화학적 거리를 증가시켜, Y' 및 T 그룹의 반응성을 달리할 수 있다. 또한 타겟 분자에 대한 활성 작용기 X의 반응성도 유사하게 조절할 수 있다.
1-단계 방법에 의하는 경우와 마찬가지로, 상기 2-단계 합성 반응식을 이용하여 형성된 단일 작용성 POZ 유도체는 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
리빙 -고분자( living polymer ) 방법
본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 타겟 분자와 반응하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성하는 단일 작용성 POZ 유도체를 직접적으로 제조하기 위하여 작은 반응성 분자를 옥사졸린 중합 반응을 종결시키는데 사용할 수 있다. 상기 방법은 리빙 고분자 방법이다. 리빙 고분자 방법은 가장 일반적인 형태로서 하기 반응식 4로 나타낼 수 있다.
R1-POZ+ + Nuc-Qq-X -> R1-POZ-C-Qq-X
상기 식에서,
R1 내지 R4, R7 , R8 및 R14 내지 R15, R23, POZ, Q, k, m, n, q, Y, 및 X 는 상기 정의와 동일하고;
POZ+ 옥사졸린 중합 과정에서 형성된 양이온 -N(COR7)CH2CH2]n + 을 나타낸다.
R19 는 수소 또는, 하나의 태양에 있어서, 탄소 원자 수 1 내지 10의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기이고;
Nuc는 종결 양이온 -N(COR7)CH2CH2 + 과 반응함으로써 리빙 POZ 중합 반응을 종결시켜 가수분해에 대해 안정한 결합 C를 형성할 수 있는 친핵체이며, 여기서 Nuc기 및 생성된 C 결합은 표 2에 제시된 기 및 결합으로부터 선택될 수 있다.
Figure 112009059094943-PCT00005
R1-POZ-C-Qq-X 유도체의 제조의 대표적인 반응예가 하기에 제시되어 있다. 하기에 제시된 반응에 있어서, R1 및 R7은 메틸기이고, Nuc은 -NH2이고, C는 -NH-이고, Q는 -CH2-이고, q은 1이며, X는 -CO2H이다(하기 반응 도중 메틸 에스테르는 가수분해 됨).
CH3-PMOZ + + -S-CH2-CO2CH3 -> CH3-PMOZ-S-CH2-CO2H
당업계에서 제안되는 것과는 대조적으로, 본 발명은 -O-CH2-CO2-CH3,와 같은 알콕사이드로 트랩핑(trapping)된 양이온은 목적 생성물을 생성하지 않음을 보여준다.
표 2에서 나타난 바와 같이 피페라진 및 피페리딘이 Nuc 기로 사용되는 경우, C 결합은 상기 화합물의 고리 구조와 결합된다. 피페라진 및 피페리딘을 Nuc로 이용하여 생성되는 C 결합 및 구조는 하기에 제한된다.
상기 반응의 하나의 태양에 있어서, 머캅타이드 화합물이 옥사졸린 중합 반응을 종결하는데 사용된다. 상기 방법에 있어서, 본원에 기술된 바와 같이 옥사졸린 중합 반응이 개시되어 POZ 고분자의 종결부 말단에 옥사졸리늄 양이온을 갖는 POZ 고분자를 형성한다. 친핵성 머캅타이드 분자를 반응에 첨가함으로써 상기 반응이 종결되고 따라서 리빙 POZ 중합 반응이 종결된다. 머캅타이드 분자는 타겟 분자 상의 기와 반응하여 가수분해에 대해 안정한 결합을 형성할 수 있는 활성 작용기(활성 작용기는 전술한 바와 같이 보호될 수 있음)를 포함한다.
상기 반응의 구체적 태양으로, 머캅타이드는 하기 구조식을 가진다:
R25S-Dd-X
상기 식에서,
X는 상기 정의와 동일하고;
R25는 금속이고, 하나의 태양에서, R25는 Li, Na 또는 K이며;
D는 결합기이며, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)b-CONH-(CH2)b-, -NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b, -CO-(CH2)b-, -CO-C6H4-, 또는 -CO-R26 또는 -(CR27R28)b를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며;
R27 및 R28은 수소 또는, 하나의 태양에 있어서, 탄소 원자 수 1 내지 10의 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각각 독립적으로 선택되며;
R26는 -C6H10-CH2- (사이클로헥실메틸렌)이고;
d 는 0 또는 1이고;
b는 1 내지 10의 정수이다.
하나의 태양에 있어서, 활성 작용기는 보호된 작용기이거나 활성 작용기로 전환될 수 있는 화합물이다. 상기 논의된 바와 같이, 활성 작용기 각각은 타겟 분자와 반응시에 독특한 이점 및 특이성을 갖는다. 이와 같이 상기 합성 반응식을 이용하여 형성된 단일 작용성 POZ 유도체 각각은 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
특정 POZ 유도체
본 발명은 상기 기술된 방법에 의하여 제조될 수 있는 다양한 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 추가로 본 발명은 단일 작용성 POZ 유도체 합성에 유용한 다수의 화합물을 제공한다.
하나의 태양에 있어서, 단일 작용성 POZ 유도체는 하기 일반 화학식 (I), (II) 및 (III)으로 표시된다.
R1-POZ-Pp-Qq-X
R1-POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X
R1-POZ-C-Qq-X
상기 일반 화학식 (I), (II) 및 (III)의 정의는 반응식 1 내지 4에서 제공된것과 같다.
또한, 본 발명의 단일 작용성 POZ 유도체의 여러가지 구체적 구조가 하기에 제시되어 있다. 이들 구조는 대표적인 예로서 나열된 것뿐이며, 본원의 단일 작용성 POZ 유도체의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 상기 살펴본 바와 같이, 하기 내용 참조시, 반응식 1 내지 4의 정의는 하기 구조식에 대해서도 적용된다. 또한, 하기 제시된 모든 구조식에 대하여, R1 기는 개시기 위치(POZ 기의 왼쪽)에 포함되는 것으로 이해된다.
R9은 예를 들면 -(R16)O- 또는 -NH-R21-NHCO-R22-인 결합기이고;
G는 비치환되거나 치환된 아릴기 또는 치환되거나 비치환된 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기, 예를 들면, 플루오로알킬기이며; 및
Ar는 비치환된 아릴기 또는 치환된 아릴기이다.
하나의 태양에 있어서, 본 발명은 빌딩 블록의 1-단계 방법에 의하여 제조된 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 상기 루트에 의하여 유도된 구조의 대표적인 예는 하기 구조식들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure 112009059094943-PCT00006
또 다른 태양에 있어서, 본 발명은, POZ 설포네이트 에스테르(POZ-OH로부터 유도된 중간체)를 친핵성 치환하는, 빌딩 블록의 2-단계 방법에 의하여 제조되는 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 상기 루트에 의하여 유도된 구조의 대표예는 하기 구조들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure 112009059094943-PCT00007
또 다른 태양에 있어서, 본 발명은, POZ 활성 카르보네이트(POZ-OH로부터 유도된 중간체)를 친핵성 치환하는, 빌딩 블록의 2-단계 방법에 의하여 제조되는 하기 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다:
Figure 112009059094943-PCT00008
또 다른 태양에 있어서, 본 발명은 상기 임의의 활성 에스테르의 친핵성 치환에 의하여 말레이미드와 결합한 하기 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다:
Figure 112009059094943-PCT00009
상기 식에서,
POZ-L-CO-은 본원에 기술된 활성 카르보네이트 에스테르 중 어느 하나로부터 유도되며; 및
L은 POZ를 카르복실기에 결합시키는 상기 제시된 결합 모이어티 중 어느 하나이며, -P-(CR3R3)m-, -P-Ar- 및 피리디늄 -NC5H4 +-를 포함한다.
상기 말레이미드는 상기 POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X 화학식으로 표시될 수 있으며, 여기서 L은 Pp-Qq 단편을 포함하고, -CONH-는 Ww 단편을 포함하며 R9 는 Uu 단편을 포함한다.
또 다른 태양에 있어서, 본 발명은 2-알킬-2-옥사졸린 중합에서 생성되는 POZ 양이온을 친핵성 공격하는, 리빙 양이온성 방법에 의하여 제조된 POZ 유도체를 제공한다.
Figure 112009059094943-PCT00010
상기 POZ 유도체 모두는 타겟 분자의 기와 반응하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자와 POZ 유도체 간의 결합을 형성한다.
피페리딘 또는 피페라진으로부터 유도된 특정 POZ 유도체
본원에서 논의된 바와 같이, 리빙 POZ 양이온은 치환되거나 비치환된 피레리딘 또는 피페라딘 또는 이들의 유도체로 종결된다. 치환체는 치환된 알킬 및 치환 되거나 비치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기 또는 헤테로사이클로알킬기과 관련하여 전술한 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 반응식 4의 C로 표시된 결합기가 피페리딘 또는 피페라진 고리 구조의 일부이기 때문에 이들 POZ 유도체는 상기 반응식 1 내지 4로 설명하기 어렵다. 예를 들면, POZ 양이온은 4-피페리딘 메탄올로 트랩하여 POZ 알코올을, 4-피페리딘 부탄산으로 트랩하여 POZ 카르복시산을, 피페라진 자체로 트랩하여 POZ 아민을 생성할 수 있다:
Figure 112009059094943-PCT00011
강한 친핵체 질소는 빠르고 깔끔한 종결반응을 제공하여 종결부 작용 활성기를 도입하기 때문에, 상기 피페리딘 및 피페라진에 의한 종결 반응은 유용하다. 1-피페라진프로판올, 4-피페리딘 부탄산, 3-피페리딘 카르복시산 및 4-피페리딘 메 탄올을 포함하는 4 이상의 피페리딘 및 피페라진 유도체는 상업적으로 유용하며, 기타 유도체 등은 쉽게 합성될 수 있다.
POZ 알코올, 산 또는 아민으로부터 제조되는 상기 기술된 POZ 유도체 중 어느 하나는 알코올, 산 또는 아민을 제공하는 질소-포함 고리인 상기 피페리딘 또는 피페라진으로부터 합성될 수 있다. 예를 들면, 하기 화합물은 4-피페리딘 메탄올로 종결되는 상기 POZ로부터 제조될 수 있다.
Figure 112009059094943-PCT00012
하기 화합물은 차례로 아세탈, 말레이미드 및 활성 에스테르를 포함하는 다양하고 유용한 유도체로 전환될 수 있다.
Figure 112009059094943-PCT00013
POZ 유도체의 용도
기술된 단일 작용성 POZ 유도체는 작용 활성기를 통하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있다. 또한, 본원의 단일 작용성 POZ 유도체를 사용하여 하나의 타겟 분자가 각 POZ 유도체에 결합될 수 있다. 즉, 1개의 타겟 분자만이 POZ 유도체에 결합되는 것을 의미한다. 단일 작용성 POZ 유도체에 존재하는 다양한 작용 활성기는 다양한 반응 화학적 성질을 통하여 단일 작용성 POZ 유도체가 타겟 분자의 다양한 기와 반응할 수 있다. 예를 들면, 작용 활성기가 알데하이드인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 정의된 pH 범위 내에서 타겟 단백질 분자의 N-종결부 아민과 우세하게 반응한다. 작용 활성기가 활성 에스테르인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 타겟 분자 상의 라이신기와 같은 아민과 우세하게 반응한다. 마찬가지로, 작용 활성기가 활성 카르보네이트 또는 트레실레이트인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 아민과 반응하지만 반응 조건 및 선택성은 활성 에스테르 및 알데하이드와 상이하다. 또한, 작용 활성기가 비닐설폰 또는 말레이미드 또는 요오도아세트아미드인 경우, 단일 작용성 POZ 유도체는 티올과 우세하게 반응하나, 반응 조건은 각 활성기에 따라 다르고, 다양한 타겟 분자에 적합한 다양한 반응 조건이 제공된다.
특히, 상기 합성 반응식을 사용하여 형성된 각 단일 작용성 POZ 유도체는 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 타겟 분자는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 단일 작용성 POZ 유도체는 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 치료학적으로 중요한 단백질과 결합될 수 있다.
이러한 대표적인 반응은 다음의 반응으로 도시화된다.
M-POZ-OCO-O-NHS + GCSF-NH2 -> M-POZ-OCONH-GCSF
상기 태양에 있어서, GCSF의 아민은 여러가지 유용한 라이신기 중 어느 하나를 나타낸다.
마찬가지로 GCSF는 이용 가능한 티올기를 가지고 있으며, 적절한 조건 하에서 단일 작용 활성기로서 말레이미드를 갖는 단일 작용성 POZ 유도체는 상기 티올기와 반응할 수 있다.
활성 POZ 유도체는 펩타이드와도 결합될 수 있다. 예를 들면, 작용 활성기 로서 활성 에스테르를 갖는, 단일 작용성 POZ 유도체는 인슐린 상의 이용가능한 아미노기와 결합될 수 있다.
M-POZ-O-CH2-CO2-NHS + 인슐린-NH2 ->
M-POZ-O-CH2-CONH-인슐린
또 다른 태양에 있어서, 타겟 분자는 소분자, 약물 또는 진단 시약이다.
타겟 분자- POZ 콘쥬게이트
본 발명은 타겟 분자와 결합을 형성하여 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 다양한 단일 작용성 POZ 유도체를 제공한다. 일반적 태양에 있어서, 본 발명은 하기 일반 화학식 (IV)를 갖는 가수분해에 대해 안정한 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 제공한다.
A-B-TM
상기 식에서,
A는 POZ 유도체 상의 작용 활성기가 타겟 분자 상의 바인딩 파트너와 반응하는 동안 이탈되는 이탈기를 제외한 본원의 단일 작용성 POZ 유도체이고;
TM은 타겟 분자이고;
B는 본 발명의 단일 작용성 POZ 유도체와 타겟 분자 상의 바인딩 파트너 간에 형성된 가수분해에 대해 안정한 결합이며, 가수분해에 대해 안정한 B 결합은 단일 작용성 POZ 유도체 상의 활성 작용기의 고유 성질 및 타겟 분자 상의 바인딩 파 트너에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 대표적인 작용 활성기, 바인딩 파트너 및 B 결합의 예가 하기 표3에 제시되어 있다. 표 3에 나열된 것이 모든 예를 망라하는 것은 아니며, 본 발명의 범위 내에서 기타 조합 및 생성된 B 결합은 확장될 수 있다.
Figure 112009059094943-PCT00014
도 1은 2-알킬-2-옥사졸린(예: 2-에틸-옥사졸린)의 중합 반응에 있어 리빙-양이온성(living-cation) 메카니즘을 나타낸 것이며, 여기서 -OTf는 -OSO2-CF3 또는"트리플레이트"이며 NUC- 는 음전하 친핵체(nuecleophile)이다.
도 2A 및 2B는 공지 방법에 따라 제조된 M-PEOZ-OH 2000의 겔 침투 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 폴리옥사졸린 유도체의 중합 반응시 연쇄 전달의 제거-이합체 화(elimination-dimerization) 메카니즘을 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 본 발명의 최적화 상태에서 제조된 M-PEOZ-OH 2000(도 4A) 및 M-PEOZ-OH 5000(도 4B)의 겔 침투 크로마토그램을 나타낸 것이다.
EM 사이언스(science) 또는 알드리치(Aldrich)의 시약을 구입하여 사용하기 전 증류시켰다. 클로로벤젠 및 옥사졸린을 수소화 칼슘로부터 증류하였다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 1100 4차 펌프 및 RI 측정기를 이용하여 알질런트 테크놀로지(Agilent technologies) 기계 상에서 수행하였다. 컬럼 가열기(60℃) 내에서 2개의 페노겔(PhenoglTM) GPC 컬럼(페노메넥스, 5μ, 500Å, 300 x 7.8 mm)을 시리즈로 사용하였다. 이동상은 1mL/min 유속의 100% N, N'-디메틸포름아미드(DMF)이었다. 보정 곡선은 MALDI(750, 1K, 2K, 5K 및 10K)에 의해 결정되는 분자량이 서로 상이한 M-PEOZ-OH 시료에 의해 생성하였다. 쇼덱스(Shodex) KW-803 컬럼, 1 mM HEPES 및 이동상으로 pH 7.0 완충액을 사용한 동일한 시스템으로 겔 여과 크로마토그래피(GFC)를 수행하였다. UV 측정기는 228nm로 조정하여 사용하였다. 매트릭스로서 디트라놀을 사용한 브루커, 마이크로플렉스(Bruker, MicroflexTM) 장치로 MALDI-TOF MS을 수행하였다. NMR은 Varian 500 MHz 장치를 사용하였다.
실시예 1. M- PEOZ - OH 2000의 전형적인 제조 방법
메틸 트리플레이트(0.113 mL, 0.001 mol)를 아세토니트릴(3.0 mL, 6.7M) 내 의 2-에틸-2-옥사졸린 (2.02 mL, 0.020 mol) 용액에 첨가하고 용액을 10분 교반하였다. 그 후 반응을 80℃로 가열하고 18시간 교반하였다. 탄산 나트륨(1.167 g) 및 물(1 mL)을 첨가하고 생성된 혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 메틸렌 클로라이드(40 mL)로 희석시킨 뒤 분리 깔래기로 옮겼다. 물(5 mL) 및 염수(3 mL)를 첨가하여 흔들었다. 바닥층을 버리고 수성층을 메틸렌 클로라이드(2 x 20 mL)로 2회 추출하였다. 결합 유기상을 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과하고 회전 증발시켜 농축하였다. 조질의 오일을 아세톤에 용해시키고 에틸 에테르(80 mL)에 적가하여 침전시켰다. 생성된 분발은 진공으로 건조하였다(1.90 g, 94% 수율).
GPC는 측정가능한 고분자량 숄더 (Mn = 3600 Da, 9%) (도 2A)의 단일 피크를 보였다. 주 피크는 Mn가 1980 Da이고, PD가 1.1이었다. NMR은 예측된 피크를 보였다(참조: 실시예 6) MALDI-TOF MS는 2000 Da에서 최대를 갖지며 PD가 1.04이고 99.1 Da 분리된 피크 세트를 나타냈다. ALDI 스펙트럼은 또한 99.1 Da 분리된 피크의 두번째 세트를 보였지만, 각 피크는 주 세트보다 14 Da 적었다. 피크 세트의 최대는 1600 Da에서 발생하였다.
실시예 2. M- PEOZ - OH 2000의 두 번째 제조 방법
클로로벤젠(6.9 mL), 아세토니트릴(2.3 mL) 및 메틸 트리플레이트(0.164 mL, 1.5 mmole)를 질소 하 상온에서 혼합하였다. 2-에틸-2-옥사졸린 (3.05 mL, 3.0 g, 30 mmole)를 혼합한 후, 천천히 교반하였다. 혼합물을 70℃로 가열하고 8시간 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 빙욕하여 실온으로 냉각시켰다. 1 mL 메탄올 내 의 수산화칼륨(2 mmol)을 첨가하고 혼합물을 1시간 교반하였다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드(40 mL)로 추출하였다. 메틸렌 클로라이드 층을 분리하고 물(40 mL total)로 3회 세척하였다. 유기층을 건조하고, 여과하고 회전 증발로 농축시켜 5 mL를 생성하였다 생성물을 디에틸 에테르(100 mL)에 첨가하여 침전시키고 진공 건조시켰다(수득량 0.7g).
GPC는 측정가능한 고분자량 숄더 (Mn = 3300 Da, 6%)(도 2B)의 단일 피크를 보였다. 주 피크는 Mn가 2200 Da이고, PD가 1.07이었다. NMR은 예측된 피크를 보였다(참조: 실시예 6) MALDI-TOF MS는 2300 Da에서 최대를 갖지며 99.1 Da 분리된 피크 세트를 나타냈다. MALDI 스펙트럼은 또한 99.1 Da 분리된 피크의 두번째 세트를 보였지만, 각 피크는 주 세트보다 14 Da 적었다. 피크 세트의 최대는 2100 Da에서 발생하였다.
실시예 3. 에틸디이소프로필아민의 M- PEOZ + 종결 효과
실온에서 클로로벤젠(5 mL, 2M) 내의 2-에틸-2-옥사졸린 용액(1.01 mL, 10.0 mmol)에 메틸 트리플레이트(0.0566 mL, 0.5 mmol)를 첨가하고 용액을 10분 교반하였다. 그 후 용액을 110℃로 가열하고 30분 교반하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 디이소프로필에틸아민 (0.261 mL, 1.5 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 50℃에서 18시간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 디에틸 에테르(50 mL)에 적가하여 백색 침전물을 수득하였다. 고체를 거의 정량적 수율로 진공 건조시켰다.
GPC는 두개의 피크를 나타내며, 하나는 대략 2000 Da (24%)이고 다른 하나는 대략 3800 Da (76%)이었다. MALDI 스펙트럼에 의하여 고- 및 저분자량 생성물을 확인하였다.
실시예 4. 2,6- 루티딘의 M- PEOZ + 종결 효과
실온에서 클로로벤젠(3.75 mL) 내의 2-에틸-2-옥사졸린 용액(0.758 mL, 7.5 mmol)에 메틸 트리플레이트(0.0424 mL, 0.375 mmol)을 첨가하고 용액을 10분 교반하였다. 그 후 용액을 110℃로 가열하고 30분 교반하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 2,6-루티딘(0.170 mL, 1.5 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 50℃에서 18시간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 디에틸 에테르(50 mL)에 적가하여 백색 침전물을 수득하였다. 고체를 거의 정량적 수율로 진공 건조시켰다.
GPC는 두개의 피크를 나타내며, 일부 이합체와 일치하여 하나는 대략 2000 Da (89%)이고 다른 하나는 대략 4000 Da (11%)이었다. MALDI 스펙트럼은 비종결된 옥사졸리늄 양이온 존재하는 경우와 일치되게 4.2 및 5.0 ppm에서 피크를 보였다.
실시예 5. 메틸 글리콜레이트에 의한 옥사졸린 중합 반응의 종결 시도
실온에서 메틸 트리플레이트(0.453 mL, 0.004 mol)를 클로로벤젠(5 mL, 2M) 내의 2-에틸-2-옥사졸린 용액(4.04 mL, 0.040 mol)를 첨가하고, 용액을 10분 교반하였다. 그 후, 용액을 110℃로 가열하고 30분 교반하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 2,6-루티딘(0.929 mL, 0.008 mol)을 첨가하고 메틸 글리콜레이트 (0.609 mL, 0.008 mol)를 첨가하고 생성된 반응물을 실온에서 18시간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 디에틸 에테르(1500 mL)에 적가하여 백색 침전물을 수득하였다. 고체를 거의 정량적 수율로 진공 건조시켰다.
NMR은 옥사졸리윰 이온과 일치하여 4.46 및 4.99 ppm에서 피크를 나타냈으며, 중합 반응을 종결시키는 글리콜레이트와 일치하지 않았다.
실시예 6. 최적 조건 하에서 M- PEOZ - OH 2000의 제조
클로로벤젠(30mL) 및 MeOTf(344 ㎕, 3.0 mmol)을 질소 하의 실온에서 혼합하고 20 mL 클로로벤젠 내의 2-Et-2-Ox(6.06 mL, 60 mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 110℃로 가열하면서 35분 교반하였다. 그 다음 용액을 0℃로 냉각시킨 후, 40 mL 물 내의 탄산 나트륨(2.12 g)용액을 첨가하여 밤새 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기에 부어 40 mL 물을 첨가하였다. 바닥층을 제거하고 수성층을 메틸렌 클로라이드(3 x 60 mL)로 추출하였다. 결합 유기층을 황산 마그네슘로 건조하고, 여과하고, 회전 증발하여 농축시켰다. 두꺼운 오일 잔여물을 7 mL 메틸렌 클로라이드 내 용해시키고, 0℃에서 디에틸 에테르(80 mL)에 적가하였다. 얻어진 침전물에 상기 과정을 반복하여 4.2 g의 백색 분말(84% 수율)을 제공하였다.
NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음, s) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적: 2H, CH3 CH 2 CO-); 및 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상의 백본 피크를 나타냈다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.05 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛 피크를 보였다. 종결부 메틸 렌(- CH 2 -OH)은 3.8 ppm(s)에서 나타났다. GPC는 고분자량 숄더 및 측정가능한 테일링(tailing)이 없는 단일 피크를 보였다; Mn = 1900 Da, 및 다분산도(PD) = 1.03 (도 3A). MALDI 는 Mn가 1900 Da이고, 분리 질량 단위가 99.1 Da인 스펙트럼을 제공하였다. 계산된 PD는 1.03이었다.
p- 니트로페닐 카르보네이트의 유도체화
생성물을 p-니트로페닐 카르보네이트로 전환하고, 그 후 정제하여 0.2N NaOH 용액 (pH 8) 하에서 가수분해하였다. p-니트로페놀 측정시, -OH 치환된 정도가 99%이었다(400 nm UV 흡수, ε= 18,000 M-1 cm-1).
실시예 7. 최적 조건 하에서 M- PEOZ - OH 5000의 제조
250 mL 1-구 둥근 바닥 플라스크 내에서 클로로벤젠(80mL) 및 MeOTf(354 ㎕, 3.2 mmole)을 질소 하의 실온에서 혼합하였다. 2-Et-2-Ox (16.4 mL, 16.0 g, 160 mmol)를 플라스크에 천천히 첨가하면서 교반하였다. 옥사졸린을 첨가하자 반응물이 탁해졌다. 혼합물을 42℃로 가열하고 1시간 교반하였다. 혼합물을 데우자 혼합물이 투명해졌다. 그 후 혼합물을 80℃로 가열하고 3.75 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 15분 동안 냉욕시켰다.
40 mL 물 및 2g 탄산 나트륨을 첨가하여 중합 반응을 종결하고 30분 교반하였다. 수성층을 분리하고 유기층을 40 mL 물 및 1g 탄산 나트륨으로 한번 더 추출하고 30분 교반하였다. 수성 층을 분리하고 첫번째 수성층과 결합 수성 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 0.5 M HCl(~40 mL)로 pH가 6 이하로 될 때까지 탁한 수 성층(~80mL)을 산성화하여 투명한 용액을 얻었다.
그 후 고분자를 메틸렌 클로라이드(매회 200 mL)로 4회 추출하고 결합 유기층을 교반하면서 무수 황산 마그네슘으로 1 시간 건조하였다. 메틸렌 클로라이드 용액을 진공 증발시키고 생성된 잔여물을 25 mL 건조 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 250 mL 에틸 에테르(실온)에 적가하여 침전시켰다. 생성된 백색 고체를 50℃의 진공 하에서 밤새 건조시켰다. 백색 분말의 건조될 물질이 얻어졌다(14.1 g, 88% 수율).
NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음, s) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 및 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상의 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.05 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 피크를 보였다. 종결부의 메틸렌(- CH 2 -OH)은 3.8 ppm(s)에서 나타났다. GPC GPC는 13.5 분 경과 후 단일 피크를 보였다. Mn = 4100 Da, 및 다분산도(PD) = 1.06. Mn (이론적) = 4980 Da. 12.4 분 후의 작은 숄더는 약 1%의 고분자량 불순물을 나타낸다; Mn = 8900 Da (도. 3B). MALDI 는 Mn = 4910 Da, 및 분리 질량 단위가 99.1 Da인 스펙트럼을 제공하였다. 계산된 PD는 1.03이었다. 계산된 PD는 1.02이었다.
p- 니트로페닐 카르보네이트의 유도체화
생성물은 p-니트로페닐 카르보네이트로 전환되고, 그 후 정제하고 0.2N NaOH 용액(pH 8) 하에서 가수분해시켰다. -OH 치환된 정도가 99%이었다(400 nm UV 흡수, ε= 18,000 M-1 cm-1).
실시예 8. POZ p- 니트로페닐 카르보네이트의 합성
Figure 112009059094943-PCT00015
80 mL 아세토니트릴 내의 M-PEOZ-OH의 용액(10.0 g, 1.0 mmol)을 회전 증발을 이용하여 농축하였다. 잔여물을 메틸렌 클로라이드(40 mL)에 용해시키고 0℃에서 p-니트로페닐클로로포르메이트(1.61 g, 7.96 mmol)를 첨가하였다. 피리딘(0.80 mL, 9.95 mmol)을 적가하고 혼합물을 실온에서 3시간 교반하였다. 회전 증발을 이용하여 혼합물을 농축한 뒤, 디에틸 에테르에 첨가하여 백색 침전물을 얻었다. 용액을 옮기고 침전물을 진공 건조시켰다. 생성물을 약 산성 물에 용해시키고 20분 교반한 뒤 여과하였다. 생성물을 메틸렌 클로라이드로 추출하여 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 회전 증발로 농축시키고 디에틸 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 용매를 옮겨 생성물을 진공 건조하였다. 8.7 g 수득량. NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음 m) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-); 7.38 ppm(d, 2H, J = 5.2Hz); 및 8.29 ppm(d, 2H, J = 5.2Hz)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸( CH 3 -NCH2CH2) 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.03 ppm(큼)에서 2개의 싱 글렛을 나타냈다. 종결부 메틸렌 (- CH 2 -O-CO-)은 4.42 ppm(s)에서 나타났다.
p- 니트로페닐 카르보네이트의 치환
생성물을 0.2N NaOH 용액 존재 하에서 가수분해 하였다. 자유 p-니트로페놀 측정시, -OH 치환된 정도가 100%이었다(400 nm UV 흡수, ε= 18,000 M-1 cm-1).
실시예 9. M- PEOZ 아민의 합성
Figure 112009059094943-PCT00016
메틸렌 클로라이드(20 mL) 내의 M-PEOZ-PNPC의 용액(3.60 g,0.694 mmol)을 0℃로 냉각시키고 메틸렌 디아민을 첨가하였다. 용액을 찬 곳에서 1 시간 교반하고 실온에서 18시간 교반하였다. 회전 증발을 이용하여 혼합물을 농축시키고 n-부틸 알코올(20 mL)을 첨가하여 희석한 뒤, 회전 증발(디아민을 공비혼합으로 제거하기 위하여)로서 알코올을 제거하였다. 잔여물을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 디에틸 에테르를 첨가하였다. 용매를 옮기고 백색 분말을 메틸렌 클로라이드(100 mL) 내 용해시켰다. 용액을 1N NaOH 용액으로 세척하였다. 수성층을 메틸렌 클로라이드(2 x 70 mL)로 2회 세척하고, 유기층을 결함하고 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 여과하고, 농축시키소 에틸 에테르에 첨가하였다. 용매를 옮기고 백색 분말을 진공 건조하였다.
NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3) 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-), 2.31 ppm(작음, s) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-) 및 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상적인 백본 피크 세트를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.05 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 보였다. 종결메틸렌 (- CH 2 -OCO-NH-)은 4.2 ppm(br s, 2H)에서 보이고 에틸렌 디아민과 관련된 프로톤은 2.82 ppm(m, 2H, -NH-CH2- CH 2 -NH2) 및 3.23 ppm(m, 2H, -NH- CH 2 -CH2-NH2)에서 나타났다.
실시예 10. POZ 숙신이미딜 카르보네이트의 합성
M-PEOZ-OH의 용액(0.5 g, 0.23 mmol)을 5 mL 건식 디클로로메탄 또는 건식아세토니트릴 내에서 제조하고 회전 증발로 농축하였다. 5 mL 건식 디클로로메탄 또느 건식 아세토니트릴 중의 디숙신이미딜 카르보네이트(0.24 g, 0.9 mmol)의 현탁액을 제조하였다. 피리딘 (0.094 mL, 1.16 mmol)을 상기 현탁액에 첨가하였다. M-PEOZ-OH 용액을 상기 현탁액에 적가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고 회전 증발을 이용하여 농축한 뒤, 디에틸 에테르에 첨가하였다. 용매를 옮기고 백색 분말을 진공 건조하였다. 분발을 건식 아세톤에 용해시키고 디에틸 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 수득량 0.6 g. NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음 m) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-); 2.70 ppm(s, 4H, SC group)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.03 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 나타냈다. 종결 메틸렌 (- CH 2 -O-CO-) 4.24 ppm(s)에서 나타났다.
실시예 11. M- PEOZ -T- COOH 2000의 합성
a. 메틸 에스테르의 합성
Figure 112009059094943-PCT00017
1 mmol M-PEOZ 용액을 전술한 클로로벤젠 중에서 제조하였다. 용액을 실온으로 냉각시켰다. 0℃에서 THF 중의 NaH (0.12 g, 5 mmol) 헌탁액에 메틸 3-머캅토프로피오네이트 (0.65 mL, 6 mmol)를 적가하였다. 그 후, M-PEOZ+ 용액을 THF 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 에테르에 첨가하여 백색 침전물을 얻었다. 용매를 옮기고 고체를 진공 건조하여 1.5 g 백색 분말을 얻었다.
NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음 m) 및 2.41 ppm(큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.03 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 나타냈다. 종결 메틸렌(- CH 2 -COO-CH3)은 2.64 ppm(s)에서, 그의 이웃 메틸렌 (S- CH 2 -CH2-CO-)은 2.81 ppm(s)에서 나타나고, 황 그룹에 인접하는 메틸렌(- CH 2 -S-CH2-) 2.71 ppm(s)에서 나타났다. 메틸 에스테르기(-CH2-COO- CH 3 )는 3.71 ppm에서 뾰족한 싱글렛을 보였다.
티오산의 합성
20 mL 메탄올 중의 상기 에스테르 용액(8.1 g, 0.004 mol)mf 합성하고 30 mL 0.05N NaOH 용액(0.02 mol)과 혼합하였다 혼합물을 실온에서 40분 교반한 뒤, 5% HCl로 산성화시켰다. 메탄올을 회전 증발로 제거하고 클로로메탄으로 추출하였다. 추출액을 황산 마그네슘으로 건조하고 여과하고 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 에테르를 옮기고 잔여물을 진공 건조하였다. NMR 스펙트럼은 3.71 ppm에서 메틸 에스테르 피크가 소멸됨을 나타내었다. GPC는 6% 고분자량 숄더를 보였다. 주 피크는 Mn가 1870 Da이고, PD가 1.15 이었다. 상기 시료를 EAE 세파로스 FF 매질을 이용하여 이온-교환 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물의 GPC는 고분자량 숄더를 가지지 않으며 Mn 1970 Da 및 PD 1.08인 단일 주 피크를 보였다. MALDI는 Mn 2090 Da 및 PD 1.04었다.
실시예 12. M- PEOZ -T-프로판산 (M- PEOZ -T- PA ) 1000의 합성
Figure 112009059094943-PCT00018
전술한 바와 같이 클로로벤젠(25 mL) 중의 2-에틸-2-옥사졸린(5.05 mL, 50 mmol) 및 메틸 트리플레이트(0.63 mL, 5.56 mmol)을 이용하여 M-PEOZ+ 을 제조하였 다. 종결 시약을 얻기 위하여 0℃에서 메틸 3-머캅토프로피오네이트(2.41 mL, 22.2 mmol)를 클로로벤젠(10 mL) 중의 칼륨 tert-부톡사이드 (1.25 g, 11.1 mmol) 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 2시간 교반하고 클로로벤젠 중의 M-PEOZ+ 용액을 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 4시간 교반하고 실온에서 18시간 교반하였다. 물 (50 mL)을 첨가하고 5 % HCl수용액을 첨가하여 (pH ~3) 산성화하였다. 클로로벤젠을 포함하는 휘발물을 회전 증발로 제거하였다. 생성된 수용액을 H2O (70 mL) 중의 NaOH (1.33 g, 33.3 mmol) 용액으로 처리하였다. 1 시간 교반 후, 혼합물을 5 % HCl 수용액으로 산성화한 뒤, 디클로로메탄으로 추출하였다. 결합 유기상을 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축한 뒤, 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 에테르를 옮기고 및 잔여물을 진공 건조하였다. EAE 세파로스 FF 매질을 이용하여 이온-교환 크로마토그래피로 추가 정제하였다. GPC 및 GFC 는 Mn 910 Da 이고 PD 1.02인 단일 피크를 보였다. MALDI는 Mn 1100 Da이고 PD 1.05를 나타냈다.
실시예 13. M- PEOZ -T-프로판산 NHS 에스테르(M- PEOZ -T- SPA )의 합성
Figure 112009059094943-PCT00019
0℃에서 N-하이드록시숙신이미드(0.467 g, 2.26 mmol) 및 DCC(0.467 g, 2.26 mmol)를 상기로부터 제조된, 디클로로메탄(44 mL) 중의 M-PEOZ-T-CO2의 용액에 첨가하였다. 찬 곳에서 2시간 교반한 후, 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 주사기 여과를 사용하여 혼합물을 여과하고 여과물을 디에틸 에테르에 첨가하여 백색 분말을 제공하였다. 생성물을 진공 여과에 의하여 수집하고 진공 건조하였다(2.0 g, 89% 수율). 숙신이미딜기의 결합은 통상적인 백본 피크에 추가로 숙신이미딜 프로톤을 가지는 것으로 나타나는 1H NMR 스펙트럼에 의하여 설명된다.수율을 측정하기 위하여 화합물(calc. Mn 1025 Da, 0.4 g, 0.39 mmol)을 디클로로메탄(4 mL) 중의 페닐에틸아민(0.15 mL, 1.17 mmol) 및 트리에틸아민(0.16 mL, 1.17 mmol)로 처리하였다. 밤새 교반 후, 혼합물을 여과하고 디에틸 에테르에 첨가하였다. 백색 분말을 여과하고 진공 건조하였다. 겔 여과 크로마토그래피에 따른 전환 수율이 99%이었다.
실시예 14. 머캅타이드를 통한 M- PEOZ - 티오 - NH 2 의 합성
tBoc 에스테르의 합성
Figure 112009059094943-PCT00020
메틸 트리플레이트(0.283 mL, 0.0025 mol)를 클로로벤젠(25 mL) 중의 2-에틸-2-옥사졸린 용액(5.05 mL, 0.05 mol)에 첨가하였다. 실온에서 10분 교반한 뒤, 혼합물을 100℃로 30분 가열한 뒤 0℃로 냉각하였다. 종결 시약을 얻기 위하여 Boc-시스테아민(0.84 mL, 0.0075 mol)을 클로로벤젠(5 mL) 중의 칼륨 tert-부톡사이드(0.561 g, 0.005 mol) 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 1시간 교반하여 투명한 용액을 얻고, 0℃에서 클로로벤젠 중의 M-PEOZ+ 용액을 주사기를 이용하여 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 4 시간 교반한 뒤, 실온에서 18시간 교반하였다. 혼합물을 디에틸 에테르에 서서히 첨가하여 백색 침전물을 얻었다. 에테르를 옮기고잔여물을 물에 용해킨 뒤, 디클로로메탄으로 추출하였다. 결합 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고, 농축시킨 후, 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 혼합물을 여과하고 생성된 백색 분말을 진공 건조하여 87% 수율로 목적 화합물 4.0 g 얻었다.
NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(s) 및 2.41 (s)(총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 및 3.47 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm 및 3.03 ppm( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 보였다. Boc 시스테아민 종결기 피크는 1.44 ppm(s, 9H, -CH2NH Boc ), 2.67 ppm(m, 2H, -S CH 2 CH2NHBoc), 2.71 ppm(m, 2H, - CH 2 SCH2CH2NHBoc), 및 3.32 ppm(m, 2H, -SCH2 CH 2 NHBoc)이었다. 상기 NMR을 종합하였을 때 조질 혼합물은 8% M-PEOZ-OH 종을 포함함을 알 수 있다. GPC은 Mn = 1790 Da 및 PD = 1.07인 뾰족한 피크를 보였다.
아민의 합성
0℃에서 염산(디옥산 중의 4 M 용액, 34.0 mL)을 M-PEOZ-T-NH(Boc)(Mn 1850 Da, 3.218 g, 1.74 mmol)이 함유된 플라스크에 첨가하면서 혼탁하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 교반하였다. 혼합물을 회전 증발로 농축시키고 물(50 mL)로 희석하고 pH를 13 이하로 조절하였다. 생성된 수용액을 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 결합 유기층을 Na2SO4으로 건조하고 여과하고 농축시킨 뒤,에테르에 첨가하여 백색 분말을 얻고 이를 여과하고 진공 건조하여 2.5g 생성물을 얻었다. CM 세파로스 FF 매질을 이용한 이온-교환 크로마토그래피에 의한 추가 정제하였다. 컬럼 정제로부터 2개의 분획을 수집하였다. 전 단계로부터 얻어진 제1 분획 0.2 g은 순수한 아민 고분자를 함유하고 제 2 분획 2.2g은 8% 순도(M-PEOZ-OH)를 갖는 아민 고분자를 함유한다.
1H NMR(Varian, 500 MHz, 10 mg/mL CDCl3) 은 1.14 ppm(m, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.32 ppm(m) 및 2.41 (s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 및 3.47 ppm(m, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm 및 3.03 ppm( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 보였다. 종결 시스테아미노기 피크는 2.69 ppm(m, 4H, -S CH 2 CH2NH2, - CH 2 SCH2CH2NH2), 및 2.91 ppm(m, 2H, -SCH2 CH 2 NH2)에서 발견되었다. 1.44 ppm(s, 9H, -CH2NH Boc )에서의 피크가 소멸되었으므로 Boc기의 제거를 확인하였 다. GPC는 PDI가 1.10이고 Mn 값이 1700 Da이었다.
실시예 15. M- PEOZ -T- SCM (M- PEOZ -S- CH 2 - CO 2 - NHS )의 합성
산의 합성
클로로벤젠(100 mL) 및 2-에틸-2-옥사졸린 (39.7 g, 0.4 mole, 50 eq.)을 아르곤 하에서 혼합하고 0℃에서 30분 혼합하였다. 메틸 트리플레이트(1.31 g, 1 eq.)를 교반하면서 플라스크에 첨가하고 0℃에서 30분, 25℃에서 30분, 42℃에서 1시간, 그 후 80℃에서 3.5 시간 계속하여 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 칼륨 t-부톡사이드(2.25 g, 5 eq.) 및 메틸 2-머캅토아세테이트(2.9 g, 6 eq.) 및 클로로벤젠(100 mL)을 혼합함으로써 종결 혼합물을 분리 플라스크에서 제조하였다. 중합 혼합물을 종결 반응물에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드(50 mL)로 희석하고, 여과한 뒤 디에틸 에테르(750 mL)에 첨가하였다. 상층을 옮기고 침전물을 수집하여 1시간 진공 건조하였다. 분말을 0.1 M NaOH 100 mL에 용해시키고 4시간 교반하였다. 0.5 M HCl을 25 mL 첨가하여 혼합물을 산성화하였다. 수용액을 메틸렌 클로라이드(150 mL x 3 times)로 추출하고, MgSO4로 건조시키고, 50 mL로 농축한 뒤, 디에틸에테르(400 mL) 내에서 침전시켰다. 생성된 백색 분말을 진공 건조하였다.
생성된 산을 DEZE 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제하여 (GFC 크로마토그래피에 의하여 나타난 바와 같이) 순수한 산을 얻었다. NMR은 1.30 및 4.19에서 각 에스테르의 메틸 및 메틸렌 피크가 소멸됨을 보였다.
NHS 에스테르의 합성
0℃에서 N-하이드록시숙신이미드(0.139 g, 1.21 mmol) 및 DCC(0.249 g, 1.21 mmol)를 디클로로메탄(60 mL)에 용해된 M-PEOZ-T-CM(M-PEOZ-S-CH2-CO2H, Mn 4970 Da, 6.0 g, 1.21 mmol)를 함유하는 용액에 첨가하였다. 상기 온도에서 2시간 교반한 뒤, 투명한 무색 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 백색 침전물을 갖는 혼합물을 주사기 필터를 이용하여 여과하였다. 여과물을 교반하면서 디에틸 에테르에 첨가하여 백색 분말의 침전물을 얻었다. 소결 유리 갈때기(sintered glass funnel)을 이용하여 잔여물을 수집하고, 진공 건조하여 목적 생성물 5.2 g을 얻었다(85% 수율).
H1-NMR: PEOZ의 통상적인 백본 피크 외 2.87 ppm(s, 4H)에서 숙신이미딜 프로톤을 나타내는 1H NMR 스펙트럼을 통하여 하이드록시숙신이미드의 결합을 확인하였다.
전환율을 측정하기 하기 위하여, 상기 화합물(calc. Mn 5070 Da, 0.100 g, 0.0197 mmol)을 디클로로메탄(2 mL) 중의 페네틸아민(0.012 mL, 0.0987 mmol) 및 트리에틸아민(0.014 mL, 0.0987 mmol)으로 처리하였다. 밤새 교반 후, 혼합물을 여과하고 디에틸 에테르에 첨가하였다. 백색 분말을 여과하고 진공 여과하여 거의 정략적 수득량의 목적 아미드를 얻었다. GFC에 의하면 전환 수율이 95+%이었다.
실시예 16. 티오 NHS 에스테르의 가수분해 속도
티오 NHS 에스테르 M-PEOZ-T-SCM 5K 및 M-PEOZ-T-SPA 5K의 반응성을 pH 8 붕 소염 완충액에서 평가하였다. 정확히 측정된 두 에스테르를 100mL 부피 플라스크에 넣고 pH 8 붕소염 완충액(0.2M)에 용해시켰다. 각 플라스크로부터 초기 매 1 분간, 후기 매 10분간 분취량을 취하여 λmax가 260nm인 UV 분광광도법으로 실험하였다. 흡수값이 증가하는 속도를 시간에 대하여 도시하였다. 이러한 계산으로부터 최대 흡수값의 50%인 경우의 속도를 계산하였다. M-PEOZ-T-SCM 5K 및 M-PEOZ-T-SPA 5K의 계산된 t1 /2은 각각 1분 및 15분 미만이었다.
실시예 17. M- PEOZ - OCO 2 - NHS 와 GCSF 의 콘쥬게이션
하기에 기재된 바와 같이 단일 작용성 유도체 M-PEOZ-OCO2-NHS를 본 실시예에 있어서 GCSF인 타겟 분자에 콘쥬게이션시켰다. 4 mg GCSF (0.215 μmol, MW = 18.6 kDa )를 1 ml의 0.2 M 나트륨 붕산염 (pH 8.5)에 용해시키고 실온에서 GCSF의 아미노기(총 5개의 라이신과 α-아민) 1 개 당 M-PEOZ-OCO2-NHS 3 당량을 60분 반응시켰다. 이러한 반응 조건 하에서, 단일 작용성 POZ 유도체와 아미노 GCSF 상의 아미노기 간의 반응은 더욱 노출된 친핵성 아민에서 주로 발생한다.
60% 완충액 A(HPLC 그레이드 0.05% TFA을 함유한 H2O)로 평형상태인 분석용 C18 아질런트 컬럼을 이용하는 RP-HPLC으로 GCSF의 개질을 분석하고 1 ml/min의 유속인 1% 완충액 B/min(70% CH3CN 및 0.05% TFA) 선형 그래디언트(linear gradient)로 용출하였다. 용출된 물질은 280 nm 흡광도로 확인하였다. GCSF-POZ 콘쥬게이트는 18.8 분의 체류시간 후, 비대칭 피크로서 용출되었으며, 이는 GCSF 분자에 콘 쥬게이트된 POZ 분자의 수와 관련하여 GCSF-POZ 콘쥬게이트의 불균질성(heterogeneity)을 시사한다.
SDS-PAGE 및 크기 배제 HPLC(SEC)로 다수의 콘쥬게이트의 형성을 확인하였다. 파마시아 파스트 시스템(Pharmacia Phast System)을 이용하여 SDS-PAGE 실험을 수행하였다. 미니겔((12% 폴리아크릴아미드)을 일정한 전압에서 사용하고 리에믈리(Laemmli)의 방법에 의하여 제조하였다. 고분자 염색용으로 바륨 요오드 용액이 사용된 반면, 단백질 염색을 위해서는 겔을 Coomassie blue 용액에 넣었다. 고분자 염색은 바륨 요오드 복합체의 형성에 의한 것이다. SDS-PAGE 데이터는 화학적으로 서로 상이한 콘쥬게이트된 분자 GCSF의 혼합물을 의미하는 여러가지 밴드를 보이며, 상기 콘쥬게이트는 1, 2 또는 3개의 POZ 분자를 포함한다.
0.5 ml/min 유속인 0.1 M 인산 나트륨, 0.2 M 염화 나트륨, pH 7.2, 및 20% 아세토니트릴의 등용매 이동상으로 용출되는 분석용 Biosep SEC S2000 컬럼을 이용하여 크기-배재 HPLC 분석을 수행하였다. 용출된 물질은 280 nm 흡광도로 확인하였다. 크로마토그램은 5.75분에 천연 단백질(90분에 용출 피크)이 아닌 고분자량의 용출 피크를 보였으며, 이는 GCSF-POZ 콘쥬게이트가 형성됨을 나타낸다.
실시예 18. 리보뉴클레아제 A와 M- PEOZ - OCO 2 - NHS 의 콘쥬게이션
하기와 같이 본 실시예에 있어서 리보뉴클레아제 A (RNAse A)인 타겟 분자에 단일 작용성 POZ 유도체 M-PEOZ-OCO2-NHS를 콘쥬게이션시켰다. 5 mg RNAse A (0.36 μmol, MW 13 KDa )DMF 1 ml의 0.2 M 붕산염 나트륨 완충액(pH 8.5)에 용해 시키고, RNAse A 아미노기(총 5개의 라이신과 α-아민) 1개 당 M-PEOZ-OCO2-NHS 3 당량을 반응시켰다. 반응을 실온에서 60분 수행하였다.
80% 완충액 A(HPLC 그레이드 0.05% TFA을 함유한 H2O)로 평형상태인 분석용 C18 아질런트 컬럼을 이용하는 RP-HPLC으로 GCSF의 개질을 분석하고 1 ml/min의 유속인 1% 완충액 B/min(70% CH3CN 및 0.05% TFA) 선형 그래디언트(linear gradient)로 용출하였다. 용출된 물질은 280 nm 흡광도로 확인하였다. 크로마토그램은 개질되지 않은 단백질의 10% 미만이 소량을 나타냈었다. POZ-개질 단백질은 꽤 넓은 피크를 보였으며, 이는 RNAse A 분자에 콘쥬게이트된 POZ 분자의 수와 관련하여 RNAse A-POZ 콘쥬게이트의 불균질성(heterogeneity)을 시사한다. 아미노기에 대한 하비 실험(Habeeb assay)에 의하여 RNAse A 상의 26% 아미노기가 개질 되었엄을 확인하였다.
SDS-PAGE 및 크기 배제 HPLC(SEC)로 다수의 콘쥬게이트의 형성을 확인하였다. 파마시아 파스트 시스템(Pharmacia Phast System)을 이용하여 SDS-PAGE 실험을 수행하고 상기 실시예에 기재된 바와 같이 염색하였다. GCSF 결과와 마찬가지로 SDS-PAGE 데이터는 서로 상이한 RNAse A-POZ 콘쥬게이트를 나타냈다. 상기 실시에에서 기술된 분석용 Biosep SEC S2000을 이용하여 크기-배재 HPLC 분석을 수행하였다. 크로마토그램은 천연 단백질보다 고분자량인 RNAse A-POZ 콘쥬게이트의 형성을 의미하는 초기 넓은 피크를 보였다.
실시예 19. M- PEOZ - 말레이미드와 오르쏘피리딜다이설파이드의 제조
본 실시예에 있어서, 상기 M-PEOZ-NH2로부터 단일 작용성 POZ 유도체 M-PEOZ-말레이미드를 제조하였다. 무수 클로로폼 중의 126 mg HOBT (1.09 mmol) 및 226 mg DCC (1.09 mmol)을 100 mg (0.55 mmol, 3 eq)의 4-말레이미도부탄산에 첨가하였다. 3 시간 후, 16 mg (0.00254 mmol)의 M-PEOZ-NH2를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 보관하였다. 반응 혼합물을 0.1N HCl로 세척하고 건조하고 진공 증발시켰다. 에틸 에테르를 첨가하고 여과에 의하여 침전물을 수집한 후, 건조시켰다. 반응 수율은 65%이었다.
실온에서 트리에틸아민 (3 eq.)의 존재 하의 클로로포름 내에서 숙신이미딜 프로판산 디티오피리딘(SPDP) (3 배의 과량)과 M-PEOZ-NH2을 5 시간 커플링 반응시키는 것과 동일한 방법으로 오르쏘피리딜다이설파이드(OPSS) 시약을 제조하였다. 에테르로부터 최종 생성물을 침전시켜 65%의 수율로 제공하였다 .
실시예 20. M- PEOZ - 말레이미드 , M- PEOZ - OPSS , PEG - 말레이미드 및 PEG - OPSS 간의 티올과의 반응 비교
M-PEOZ-말레이미드 및 M-PEOZ-OPSS의 반응성을 측정하고, M-PEOZ-말레이미드 및 M-PEOZ-OPSS들의 유도체와 그들의 PEG 유도체와의 반응성을 비교하기 위하여 PEOZ 및 PEG고분자를 트리펩티드 글루타티온을 함유하는 시스테인에 콘쥬게이트시켰다. 글루타티온과의 반응을 공지된 엘만 시험(Ellman's assay)에 의하여 관측하였다. PEOZ 또는 PEG 유도체 20 mM와 2 mM 티올의 용액을 0.1 M 인산 완충액 pH=7 (containing 5 mM EDTA) 중에서 제조하였다. 분취량(30 ㎕)을 취하여 pH 7 완충 액 920 ㎕을 첨가하여 급랭시켰다. DTNB 50 마이크로리터를 첨가하고, 5분 뒤 420 nm에서 흡광도를 측정하여 티올의 잔량을 계산하였다. 시스테인의 개질 정도는 표4에 기재되어 있다.
Figure 112009059094943-PCT00021
실시예 21. M- PEOZ -p- 니트로페닐 카르보네이트와 PEG -p- 니트로페닐 카르보네 이트의 가수분해 및 가아민 분해 연구
하기 pH 8의 0.1 M 붕소염 완충액 중의 p-니트로페놀의 412 nm에서의 UV 흡광도로 또는 아민에 대한 고분자의 속도로 M-PEOZ-p-니트로페닐 카르보네이트 및 대응하는 PEG-p-니트로페닐 카르보네이트의 가수분해 속도를 측정하였다. 본 실시예에 있어서, Gly-Gly (Gly-Gly/고분자 비가 1:1임)의 용액을 활성화된 PEOZ 또는 PEG 용액에 첨가하였다. 표 5는 반감기로서 가수분해 및 가아민 분해 속도를 보여준다.
Figure 112009059094943-PCT00022
실시예 22. M- PEOZ -O- CH 2 - CO 2 H 의 제조
M-PEOZ-OH (1.5 g, 0.00024 moles, 1 eq)를 60 ml 톨루엔 내에서 공비 증류 시키고 30 ml 증류액을 제거하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 냉각시킨 후, t-부탄올 내의 1.0 M 칼륨 t-부톡사이드 용액 0.5 ml(0.5 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1 시간 교반한 뒤, t-부틸 브로모아세테이트 94 mg (0.48 mmol)을 첨가하였다. 생성된 탁한 혼합물을 가열하여 환류시키고 냉각한 뒤 실온에서 18시간 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 용매를 진공 제거하였다. 잔여물을 에틸 에테르 내에서 침전시켰다. 생성물을 4℃에서 원심 분리하고, 3회 세척하고 용매를 제거하였다. NMR(1.47 ppm) 에서의 t-부틸 피크와 종결 메틸 피크의 비교는 정량적 전환을 나타낸다.
생성된 카르복실 산 t-부틸 에스테르를 CH2Cl2/트리플루오로아세트 산/물(50 ml/0.1ml/100 ml)의 혼합물에 용해시키고 용액을 실온에서 3시간 가열하였다. TFA를 완전히 제거하기 위하여 용매를 진공 하에서 제거한 뒤, 에틸 에테르 내에서 원심 분리하여 생성물 900 mg(60%)을 제공하였다. NMR은 t-부틸 피크가 제거되고 4.08 ppm에서 메틸렌 피크가 관측되었음을 보였다.
이온성 교환 크로마토그래피에 의하여 과량의 M-PEOZ-OH로부터 카르복실 산을 정제하였다. 900 mg의 생성물을 예비-평형상태 컬럼(pre-equilibrated column, QAE 50) 내 1 ml/min 유속으로 로드하였다. M-PEOZ-OH 가 완전히 용출될 때까지 물을 이용하여 등용매 용출을 수행하였다. 용매를 0.01 N NaCl로 변경하고 생성물을 수집하였다. 분획을 I2 실험하였다. 분획을 30 ml로 진공 농축시키고 CH2Cl2 (40 ml x 6)로 6회 세척하였다. 수득량은 600 mg이었다.
실시예 23. M- PEOZ -O- CH 2 - CO 2 - NHS 의 제조
M-PEOZ-COOH(600 mg, 0.11 mmol)을 15 mL의 디클로로메탄에 내 용해시키고 N-하이드록시숙신이미드(104 mg 0.9 mmol) 및 DCC(185 mg, 0.9 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 남겨 24 시간 반응시키고 에틸 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시키고 여과하여 수집한 뒤, 건조하였다. TNBS을 사용하여 잔여 NH2기의 측정하여, 기질인 글리신-글리신의 아미노기 개질에 의해 계산된 활성화 정도는 85%이었다.
실시예 24. M- PEOZ -O- CH 2 - CO 2 - NHS 및 PEG -O- CH 2 - CO 2 - NHS 의 가수분해 및 가아민 분해 연구
실온에서 pH 8의 0.1 M 붕소염 완충액 중의 N-하이드록시숙신이미드의 412 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 M-PEOZ-O-CH 2 -CO2-NHS 및 PEG-O-CH 2 -CO2-NHS의 가수분해 속도를 계산하였다. 비교 분석 상, 아민에 대한 고분자의 반응성을 측정하기 위하여 Gly-Gly(Gly-Gly/고분자 비가 1:1임)의 용액을 (공지 방법으로 제조된) M-PEOZ-O-CH 2 -CO2-NHS 및 PEG-O-CH 2 -CO2-NHS의 용액에 첨가하였다. 표 6은 반감기로서 가수분해 및 가아민 분해를 나타낸다.
Figure 112009059094943-PCT00023
실시예 25. M- PEOZ -O- CH 2 - CO 2 - NHS 와 GCSF 의 콘쥬게이션
2.5 mg GCSF (0.134 μmol, MW = 18.6 KDa)를 1 ml의 0.2 M 나트륨 붕소염 완충액(pH 8.5)에 용해시키고 실온에서 60 분간 GCSF 상의 아미노기(총 5 개의 라이신과 α-아민) 1 개당 M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS의 3 당량을 반응시켰다. 이러한 조건 하에서는 더욱 노출된 친핵성 아민에서 주로 개질이 일어났다.
분석용 C18 아질런트 컬럼을 사용한 RP-HPLC에 의하여 GCSF의 개질을 분석하였다. 용출액 A는 0.05% TFA를 함유하는 H2O이고, 용출액 B는 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 유속은 1 ml/min이고, 280 nm에서 검출하였다. 사용된 그래디언트는 0 분에서 30% B이고, 30분 초과시 30-80% B이고, 3분 초과시 80-30% B이었다. 크로마토그램은 유리 단백질이 존재하지 않음을 나타내고, 유리 GCSF 보다 늦은 체류 시간에서 나타난 넓은 피크는 GCSF-POZ 형태가 다수 존재함을 시사한다.
크기-배제 HPLC에 의하여 여러가지 콘쥬게이트의 형성을 확인하였다. 0.3 ml/min 유속으로 0.1 M 인산 나트륨, 0.2 M 염화 나트륨, pH= 7.2이고 20% 아세토니트릴의 등용매 이동상으로 용출되는 아질런트 GF-250 컬럼을 사용하여 크기-배제 HPLC 분석을 수행하였다. 크로마토그램은 천연 GCSF 에 관하여 광범위한 콘쥬게이션 및 질량의 증가에 따라서 고분자량 GCSF-POZ 콘쥬게이트에 대응하는 넓은 용출 피크를 나타냈다.
실시예 26. M- POZ -O- CH 2 - CO 2 - NHS 및 PEG -O- CH 2 - CO 2 - NHS 에 의해 개질된 효소의 특성 비교
본 발명의 POZ 유도체와 공지된 대응 POZ 고분자의 중합 기능으로서 효소 특성에 대한 상이한 효과를 측정하기 위하여, 리보뉴클라아제 A, 우리카아제 및 카탈라아제를 M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS (6 kDa) 및 PEG-O-CH2-CO2-NHS (5.5 kDa)로써 개질하였다. 비교 분석을 위해, 효소에 대한 고분자의 비율, 완충액, pH 및 반응 온도가 유사한 조건 하에서 각 효소를 개질시켰다.
전술한 POZ 및 PEG 고분자에 의한 효소 개질의 조건은 pH 8.5의 0.2 M, 붕산염 완충액 내이다. 개질을 위해 사용된 POZ 및 PEG 고분자의 함량은 각 효소 내의 계산된 총 이용가능한 아미노기에 기초하여 계산하였다. 예를 들면, 리보뉴클라아제 A는 분자량이 13.7 kDa이고, 이용가능한 아미노기를 11개 가지며, 분자량이 130 kDa이고, 이용가능한 아미노기를 100개 가지며, 분자량이 240 kDa 이고, 이용가능한 아미노기 1112개를 가진다.
실온에서 3가지 효소 용액(2.5 mg/ml)에 단백질 아미노기에 대한 고분자의 몰비가 각각 1/2 및 1/1인 M-POZ-O-CH2-CO2-NHS 또는 PEG-O-CH2-CO2-NHS 고체를 첨가하였다. 리보뉴클라아제 A, 우리카아제 및 카탈라아제의 천연 형태에 대한 단백질 농도를 각각 9.45 x 103, 13 x 103 및 1.67 x 105 의 몰 흡광 계수를 사용하여 흡수분광법으로 측정하였다. 30 분 뒤, pH 7.4의 0.1M 인산염 완충액을 용출액으로 사용한 겔 여과 크로마토그래피 세파덱스(Sephadex) G-75 컬럼으로, 반응하지 않은 고분자 및 n-하이드록시숙신이미드로부터 고분자-효소 콘쥬게이트를 정제하였다.
단백질 개질 정도는 TNBS 실험에 의하여 측색적으로(Colorimetrically)로 계산하고 단백질 상의 총 아미노기에 대한 콘쥬게이트 아미노의 퍼센트로 표현하였다. 천연 및 개질된 효소의 효소 활성은 하기와 같이 계산하였다. 리보뉴클라아제의 활성은 크룩(Crook) 등(Biochem J. 1960 Feb;74:234-8)의 방법에 의하여 평가하고; 우리카아제 활성은 말러(Mahler)(Anal Biochem. 1970 Nov;38(1):65-84)의 방법에 의하여 결정하였며, 카탈라아제는 Beers 및 Sizer(J. Biol. Chem. 1952 Mar;195(1):133-40)이 보고한 방법에 의하여 평가하였다.
리보뉴클라아제 A, 우리카아제 및 카탈라아제에 대한 각가의 결과는 표 7A 내지 C에 제공되어있다.
Figure 112009059094943-PCT00024
리보뉴클라아제는 M-POZ-O-CH2-CO2-NHS에 의한 경우보다 PEG-O-CH2-CO2-NHS에 의하여 개질되는 경우 개질 정도가 큰 것으로 나타났으며, 따라서, 활성 감소도 컸다. 우리카아제에 있어서는, 개질의 정도 및 활성의 감소가 PEG-O-CH2-CO2-NHS와 M-POZ-O-CH2-CO2-NH가 유사하였다, 하지만, 테스트한 모든 몰비에 대하여 POZ 콘쥬게이트가 다소 높은 활성을 보였다. 카탈라아제는 PEG-O-CH2-CO2-NHS와 M-POZ-O-CH2-CO2-NHS에 의한 개질 정도가 유사하고, 모든 경우에 있어서, 효소 활성의 감소가 적은 것으로 나타났으며, 테스트된 모든 몰 비에 대하여 POZ 콘쥬게이트가 PEG 콘쥬게이트보다 더욱 활성이 높았다.
실시예 27. TGAse 을 사용한 M- PEOZ - NH 2 와 G- CSF 의 콘쥬게이션
본 실시예에 있어서, 효소 TGAse를 사용하여 POZ-NH2에 의한 G-CSF의 특정 위치 개질을 실험하였다. 비교를 위하여 동일한 시약 농도의 PEG-NH2를 사용하여 동일한 반응을 수행하였다.
전술한 생성물 M-PEOZ-OH로부터 시작하여 단일 작용성 알킬아민 M-PEOZ 유도체를 제조하였다. 1.6 mg G-CSF, 50 mg 아민 및 2 mg/ml(시판되는) TGAse를 사용하여 pH 7.2의 0.1 M 인산염 완충액 내에서 TGAse-촉매화시킨 M-PEOZ-NH2 및 PEG-NH2 와 G-CSF간의 콘쥬게이션을 18 시간 수행하였다. 이러한 조건 하에서 PEG-NH2가 명백한 콘쥬게이션을 제공하는 반면, 상당한 또는 명백한 G-CSF 및M-PEOZ-NH2의 콘쥬게이션은 일어나지 않는다.
2 mg/ml의 TGAse 효소를 M-PEOZ-NH2의반응 혼합물에 추가로 추가하였다. 천연 G-CSF 단백질 피크는 감소하고 콘쥬게이트 M-PEOZ-G-CSF를 나타내는 새로운 피크가 관찰되었다.
실시예 28. M- PEOZ 알데하이드의 제조
Figure 112009059094943-PCT00025
디올의 제조
유기 바이알 내에서 pH 8.0의 0.1 M 붕산 완충액(3 mL) 중의 3-아미노-1,2-프로판디올(1.41 mg, 15 mmol)을 제조하였다. 진한 HCl를 사용하여 용액의 pH를 9로 조정하였다. 상기 용액에 앞서 제조된 M-PEOZ NHS 에스테르(1.00 mg, 0.197 mmol)를 혼탁하면서 첨가하였다. 1 N NaOH을 첨가하여 용액의 pH를 9로 유지하였다. 상기 용액을 실온에서 3 시간 교반하였다. 1N HCl을 이용하여 용액의 pH를 6.8로 조정하였다. 상기 용액에 염화 나트륨(3 mg)을 첨가하였다. 물(1 mL)를 상기 용액에 첨가한 뒤, 디클로로메탄(3 x 10 mL)으로 3회 추출하였다. 수성층을 버렸다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과하고 회전 증발에 의하여 농축시켰다. 농축된 용액을 디에틸 에테르(100 mL) 내에서 침전시켰다. 생성된 분말은 고진공 하에서 밤새 건조하였다. 수득량: 0.7 mg. NMR에 의한 치환은 96%이고, GFC는 95%이었다. DMSO-d6 내 NMR: -C(=O)NHCH2CH(OH)CH2OH: 1H, δ4.49, t; -C(=O)NHCH2CH(OH)CH2OH: 1H, δ4.70, d; -C(=O)NHCH2CH(OH)CH2OH: 1H, δ7.87, t (해상력 나쁨).
알데하이드의 산화
디올(0.500 mg, 0.112 mmol)을 물(8 mL)에 용해하였다. 0.1 N NaOH을 첨가하여 용액의 pH를 6.85로 조정한 뒤, 나트륨 과요오드산(27.9 mg, 0.130 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 1시간 교반하였다. 물(2 mL) 및 NaCl(2 mg)을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 디클로로메탄(3 x 10 mL)으로 3회 추출하였다. 결합 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 혼합물을 여과한 뒤, 감압 하에서 여과물을 농축하였다. 에틸 에테르(50 mL)를 첨가하여 잔여물을 침전시켰다. 여과 후, 생성된 분말을 고 진공 하에서 건조하였다. 수득량: 0.47 mg. GPC에 의하여 측정된 Mn의 값은 4840 Da이었다. CDCl3 내의 NMR에 의해 측정된 알데하이드의 치환은 89%이었다.
CDCl3 내 1H-NMR: -C(=O)NHCH2CHO, 1H, δ9.635, s; -C(=O)NHCH2CHO, 2H, δ4.175, q (해상력 낮음).
실시예 29. M- PEOZ - PNPC 로부터 M- PEOZ 말레이미드 2K의 합성
Figure 112009059094943-PCT00026
전술한 바와 같이 M-PEOZ p-니트로페닐카르보네이트(Mn 2150 Da, 0.500 g, 0.232 mmol)를 제조하여 메틸렌 클로라이드(5 mL) 중의 N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염(0.065 g, 0.255 mmol) 및 트리에틸아민 (0.097 mL, 0.696 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 18시간 교반한 후, 혼합물을 여과한 뒤, 디에틸 에테르에 적가하여 황색 침전물을 제공하였다. 용매를 옮기고, 고체를 진공 건조하여 정량적 수득량을 제공하였다. 1H NMR 스펙트럼은 통상의 백본 피크 이외에도 4.15 ppm(br s, 2H)에서 종결 메틸렌 프로톤(- CH 2 -OCO-NH-)을, 6.72 ppm(s, 2H)에서 말레이미드와 결합된 프로톤을 나타냈다. 개시 메틸기 및 말레이미드의 종합적 비교에 의하여 수득량은 80% 이하인 것으로 측정되엇다.
실시예 30. 에틸 이소니페코테이트에 의한 M- PEOZ NHS 에스테르의 합성
Figure 112009059094943-PCT00027
에틸 에스테르의 합성
실온에서 클로로벤젠(250 mL) 중의 2-에틸-2-옥사졸린 단량체(50.47 mL, 0.500 mol)의 용액에 메틸 트리플레이트(2.83 mL, 25.0 mmol)를 첨가하였다. 10 분 교반 후, 반응 혼합물을 110℃로 40분 가열하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨 뒤, 에틸 이소니페코테이트(11.55 mL, 75.0 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2 시간 교반한 후, 에테르(1500 mL) 내에서 침전시켜 57g의 백색 분말을 수득하였다. 침전물을 200 mL의 H2O에 용해시킨 뒤, 200 mL 메틸렌 클로라이드로 3회 추출하였다. 결합된 유기층을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공 농축시켰다. 두꺼운 오일 잔여물을 CH2Cl(100 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(1000 mL)에서 침전시켰다. 용매를 옮긴 후, 잔여물을 진공 건조하여 43.5 g의 백생 분말을 86%의 수율로 제공하였다. NMR(500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 1.12 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CO-); 2.31 ppm(작음, s) 및 2.41 (큼, s) (총 면적 2H, CH3 CH 2 CO-); 및 3.46 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.9 ppm(작음) 및 3.03 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2)에서 2개의 싱글렛을 보였다. 피페리딘 피크는 1.68 ppm(br s, 3H), 1.90 ppm(br s, 2H), 2.15 ppm(br s, 2H), 및 2.84 ppm(br s, 2H)에서 나타났다. 종결 에틸 에스테르 피크는 1.26 ppm(t, 3H, J = 7.0 MHz, -C(=O)OCH2 CH 3 ) 및 4.13 ppm(q, 2H, J = 6.5 MHz, -C(=O)O CH 2 CH3)에서 나타났다. GPC는 Mn = 1770 Da이고 PD =1.06이었으며, MALDI는 Mn = 2050 Da이고 PD = 1.02이었다.
산의 합성
M-PEOZ 에틸 에스테르(Mn = 2050 Da, 10.0 g, 4.89 mmol)를 H2O (60 mL)에 용해시켰다. H2O(20 mL) 중의 NaOH(0.977 g, 24.4 mmol) 용액을 첨가하고 혼합물을 40분 교반하였다. 혼합물을 5% HCl 수용액으로 산성화한 뒤, 디클로로메탄으로 추출하였다. 결합 유기상을 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고, 농축한 뒤 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 에테르를 옮기고 및 잔여물을 진공 건조하여 9.0 g의 백색 분말을 91%의 수율로 제공하였다. 1H NMR는 에틸 에스테르 피크가 가수분해 후 완전히 제거됨을 보였다.
NHS 에스테르의 합성
N-하이드록시숙신이미드(0.173 g, 1.50 mmol) 및 DCC(0.310 g, 1.5 mmol)를 디클로로메탄(50 mL) 중의 M-PEOZ-CO2H (Mn 2020 Da, 3.0 g, 1.49 mmol) 용액에 첨가하였다. 찬 곳에서 2 시간 교반한 뒤, 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 디에틸 에테르에 첨가하여 백색 분말을 제공하였다. 생성물을 여과로 수집하고 진공 건조하였다(2.8 g, 93% 수율). 1H NMR 스펙트럼은 2.89 ppm에서 숙신이미딜 프로톤(s, 2H) 및 통상의 백본 피크를 보였다.
실시예 31. M- PEOZ - 메실레이트 제조의 시도
Figure 112009059094943-PCT00028
전술한 바와 같이 M-PEOZ-OH 2K를 제조하였다. M-PEOZ-OH 2K(1.00 mg, 0.608 mmol)를 무수 아세토니트릴(20 mL) 내 용해시키고 회전 증발기 상에서 증발시켜 건조하였다. 아세토니트릴(20 mL) 내에 잔여 시럽을 내 용해시키고 회전 증발기 상에서 증발시켜 건조하였다. 무수 디클로로메탄(5 mL)을 첨가하였다. 아르곤 기체를 서서히 주입하면서, 트리에틸아민(169.3 μL, 1.215 mmol)을 첨가한 뒤 메실 클로라이드(84.6 μL, 1.094 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 실온의 아르곤 분위기 하에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 회전 증발로 농축시켰다. 농축된 용액을 디에틸 에테르에 첨가함으로써 침전시켰다. 침전물을 수집하고 고진공 하에서 건조하였다. 수득량: 0.6 mg. CDCl3 중의 NMR은 - CH2CH 2OMs(d4.44)의 피크를 보였지만 면적은 오직 대략 50%의 전환률과 일치한다. -OMs의 낮은 치환도는 메실레이트 형성에 따른 옥사졸리늄 이온을 형성하는 부반응에 기인한다. CDCl3 중의 NMR은 δ5.01 (2H, t, 양이온성를 가지는 5원 고리: -O-CH 2CH2N) 및 δ4.44 (2H, t, 동일한 5원 고리: -O-CH2CH 2N; -CH 2-OMs과 동일한 이동)에서 피크를 보인다.
실시예 32. M- PPOZ - OH 의 합성
Figure 112009059094943-PCT00029
새롭게 건조하고 증류한 2-n-프로필-2-옥사졸린(0.500 g, 4.42 mmol)과, 새롭게 건조하고 증류된 클로로벤젠(2 mL)과 혼합된 용액에 메틸 트리플레이트(MeOTf, 25.0 mL, 0.221 mmol)를 첨가하였다. 10 분 교반 후, 혼합물을 100℃로 20분 가열하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 메탄올(2 mL) 중의 NaOH(0.044 g, 1.11 mmol)의 용액을 사용하여 반응을 종결하였다. NMR(500 MHz, 10 mg/mL CDCl3)은 0.95 ppm(s, 3H, CH 3 CH2CH2CO-); 1.65 ppm(s, 2H, CH3 CH 2 CH2CO-); 2.25 ppm(작음, s) 및 2.34 (큼, s) (총 면적 3H, CH3CH2 CH 2 CO-); 및 3.45 ppm(s, 4H, -N CH 2 CH 2 N-)에서 백본 피크를 보였다. 개시 메틸 피크는 2.94 ppm(작음) 및 3.03 ppm(큼) ( CH 3 -NCH2CH2, 총 면적 3H)에서 2개의 싱글렛을 나타냈다. 종결 메틸렌 (-O CH2 - OH)은 3.8 ppm에서 나타났다. 조질 혼합물의 GPC는 Mn = 1760 Da 및 PD = 1.1을 보였다.
실시예 33. M- PPOZ - 티오 - 프로판산의 합성
Figure 112009059094943-PCT00030
전술한 바와 같이 클로로벤젠(25 mL) 중의 2-프로필-2-옥사졸린 (5.66 mL, 50 mmol) 및 메틸 트리플레이트(0.808 mL, 7.14 mmol)을 사용하여 110℃로 25분 가열한 뒤, 0℃로 냉각시켜 M-PEOZ+를 제조하였다. 종결 시약을 얻기 위하여 메틸 3-머캅토프로피오네이트(3.09 mL, 28.6 mmol)를 0℃에서 클로로벤젠(14 mL) 중의 칼륨 tert-부톡사이드 (1.60 g, 14.3 mmol) 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 2 시간 교반하고, 클로로벤젠 중의 M-PEOZ+ 용액을 주사기를 사용하여 적가하였다. 혼합물을 찬 곳에서 4시간 교반하고, 실온에서 18시간 교반하였다. 물(30 mL)를 첨가하고 5% HCl 수용액을 첨가하여 혼합물을 산성화(pH ~3)하였다. 클로로벤젠을 포함하는 휘발물을 회전 증발을 이용하여 제거하였다. 생성된 수성 용액을 H2O (60 mL) 및 고체 NaOH (1.43 g, 35.7 mmol)로 희석하였다. 1 시간 교반한 후, 혼합물을 5% HCl 수용액으로 산성화한 뒤, 디클로로메탄으로 추출하였다. 결합 유기상을 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 에테르에 추가하여 침전시켰다. 에테르를 옮기고 침전물을 진공 건조하여 점성이 있고 투명한 활색의 오일을 제공하였다. GPC는 Mn가 867 Da이고 PD가 1.01인 단일 주 피크를 보였다. GFC는 서로 상이한 M-PPOZ-T-CO2H(80%) 및 M-PPOZ-T-OH(20%)의 2 종류를 포함하는 조질 생성물을 나타냈다.
실시예 34. M- PEOZ -T- 레티노산의 합성
레티노산(0.0102 g, 0.0425 mmol) 및 하이드록시벤즈트리아졸(HOBt, 0.0115 g, 0.0849 mmol)을 아세토니트릴(10 mL)에 용해시키고 회전 증발을 이용하여 공비혼합하였다. 잔여물을 디클로로메탄(3 mL)에 재용해하였다. DCC(0.0088 g, 0.0425 mmol)를 고체로서 첨가하고 혼합물을 2 시간 교반하였다. M-PEOZ-NH2 4300Da (0.122 g, 0.0283 mmol)를 혼합물에 첨가하고 20시간 교반하였다. 혼합물을 서서히 디에틸 에테르에 첨가하여 옅은 황색 분말을 제공하였다. 생성물을 여과하고 건조하여 생성물 0.0823 g을 63% 수율로 제공하였다.
실시예 35. M- PEOZ - SCM 에 의한 Ara -C의 개질 및 콘쥬게이트 활성
POZ - 콘쥬게이션의 활성
M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS (M-PEOZ-SCM 5000)(180 mg, 0.034 mmol)을 11 mL의 피리딘에 용해시키고 0℃에서 5 mL의 무수 피리딘에 용해시키기 전, 시토신 아라비노스(Ara-C)(5.7 mg, 0.023 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 72시간 교반하였다. 역상 HPLC (C-18 column)은 반응이 종료되었음을 보였다. 용매 증발 후, 생성물을 메틸렌 클로라이드(5 mL)에 용해시키고 150 mL 에테르에 적가하였다. 4℃에서 침전물을 원심 분리하여 수집하고 진공 건조하였다. 수득량: 150 mg, 80%. NMR은 (상기) M-PEOZ 백본의 통상적인 피크 외에도 7.31, 7.67, 8.16, 및 8.62 ppm에서 Ara-C 피리딘 양성자를 보였다. pH 8 완충액에 콘쥬게이트를 노출시키면 Ara-C가 서서히 방출됨이 확인되었으므로, 상기 콘쥬게이트가 프로드러그(Prodrug)으로 간주될 수 있다.
콘쥬게이트 활성
표준 공정에 의하여 배양된 자궁경부암세포(HeLa)를 24-웰 세포 배양 플레이트 각 웰에 파종하였다. 24 시간 후, 증가하는 농도에서 배양 배지를 신선한 배지로 교환하고 M-PEOZ-Ara-C 또는 유리 Ara-C (20 mM in Ara-C)의 수용액으로 처리하였다. 표준 조건 하에서 세포를 72 시간 배양하였다. 세포의 생존도를 측정하기 위하여 트리판 블루 어세이(trypan blue assay)를 수행하였다. 상기 실험에서 콘쥬게이트된 Ara-C는 콘쥬게이트의 느린 분해에 의한 유리 Ara-C보다는 대략 30배 정도 약하지만, HeLa세포에 대하여 세초 독성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동일한 방법으로 제조된 PEG-Ara-C와 비교 시, PEG- 및 POZ-콘쥬게이트는 유사한 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
실시예 36. H- PEOZ -S- CH 2 CH 2 - CO 2 H 의 합성
클로로벤젠(25 mL) 및 2-에틸-2-옥사졸린(9.92 g, 0.1 mol, 200 eq.)을 상온의 아르곤 하에서 혼합하고 0℃로 냉각하였다. 트리플루오로메탄 설폰산(0.075 g, 1 eq.)을 교반하면서 첨가하고 반응 혼합물을 30분 교반하였다. 혼합물을 80℃로 가열한 뒤 7시간 교반하였다. 칼륨 t-부톡사이드 (168 mg, 3 eq.)와 메틸 3-머캅토프로피오네이트(0.360 g, 6 eq.)를 0℃에서 6시간 반응시킴으로써 종결 혼합물을 분리하여 제조하였다. 종결 혼합물을 중합 반응에 첨가한 뒤, 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 50 mL의 0.25M 나트륨 하이드록사이드와 혼합한 뒤, 1시간 교반하였다. 수성층을 분리하고, 염화 나트륨으로 포화시키고, 메틸렌 클로라이드(250 mL x 3)로 추출하였다. 진공 회전으로 메틸렌 클로라이드를 제거하고 고분자를 진공 건조시켰다.
생성된 산을 DEAE 크로마토그래피로 정제하여 1.5 그램의 백색 분말을 수득하였다. 프로톤 NMR은 1.12 ppm(m, 3H, CH 3 CH2CO-), 2.31 ppm(m) 및 2.41 ppm(s) (면적 2H, CH3 CH 2 CO-), 및 3.47 ppm(m, 4H, -NCH2CH2N-)에서 통상적인 백본 피크를 보였다. 프로피오네이트 메틸렌 피크는 2.74, 2.81 및 2.85 ppm에서 나타났으며, GFC는 단일 피크를 보였다. GPC는 Mn이 15,200 Da이고 PD가 1.09이었다.
본원은 본 발명의 화합물 및 적용의 임의의 태양을 설명하고 기술한다. 추가로 본원은 화합물 및 적용의 대표적인 태양만을 나타내고 기술하였으나, 상기 언급한 바와 같이 본 발명은 다양한 기타 조합, 개질 및 환경 조건에서 사용될 수 있으며, 본원 발명에 기재된 요지의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 변경 및 변형할 수 있다. 또한 상기 기재된 태양들은 본 발명을 실시하기 위해 알려진 최적의 모드를 설명하고 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 기술한 것이므로 기타 다른 태양에 있어서 및 본 발명의 특정 적용 및 용도에 따라 필요한 경우 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본원에서 인용된 모든 참조 문헌의 전문은 원용에 의하여 본원에 포함된다.

Claims (63)

  1. 종결부 활성화된 (terminally activated) 폴리옥사졸린(POZ) 화합물로서, 종결부 말단에, 타겟 분자 상의 기와 반응하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트(target molecule-POZ conjugate)를 형성할 수 있는, 단일 활성 작용기를 갖는 POZ 고분자를 포함하며, 타겟 분자와 POZ 화합물 간의 모든 결합이 가수분해에 대해 안정한 결합인, 종결부 활성화된 폴리옥사졸린 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 POZ 화합물이 하기 구조식을 포함하는 화합물:
    R1-[N(COR7)CH2CH2]n
    상기 식에서,
    R1은 수소, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기이고;
    R7은 각 반복 단위에 있어서, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되며;
    n은 3 내지 1000의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서, R7의 탄소 원자 수가 1 내지 12인 화합물.
  4. 제2항에 있어서, R7이 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하로 이루어진 군으로부터 선택되는 다분산도 값을 갖는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 화합물.
  7. 폴리옥사졸린 화합물로서, 종결부 말단에, 타겟 분자 상의 기와 반응하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는, 단일 활성 작용기를 갖는 POZ 고분자를 포함하며, 타겟 분자와 POZ 화합물 간의 모든 결합이 가수분해에 대해 안정한 결합이며, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하의 다분산도 값을 갖는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 하기의 구조식을 포함하는 화합물:
    R1-[N(COR7)CH2CH2]n,
    상기 식에서,
    R1은 수소, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기이고;
    R7은 각 반복 단위에 있어서, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되며;
    n은 3 내지 1000의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서, R7의 탄소 원자 수가 1 내지 12인 화합물.
  10. 제8항에 있어서, R7이 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기인 화합물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 화합물.
  12. 제7항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 화합물.
  13. 하기 일반 구조식으로 표시되는 종결부 활성화된 폴리옥사졸린(POZ) 화합물:
    Pp-Qq-X,
    상기 식에서,
    POZ는 [N(COR7)CH2CH2]n이며;
    X는 타겟 분자와 가수분해에 대해 안정한 결합을 형성하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 활성 작용기이며;
    P는 결합기이며, -O-, -S-, NH, -NR11-, 비치환된 헤테로사이클릴기를 포함하지만 이에 제한되지 않으며;
    Q는 결합기이며, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)m-CONH-(CH2)m-, -NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-, -CO-(CH2)m-, -CO-C6H4-, -CO-R8, -(R15)m- 또는 -(CR3R4)m-를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며;
    R7은 POZ의 각 반복 단위에 있어서, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기; 아랄킬기, 헤테로사이클릴기, 아릴기, 알켄으로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R3 내지 R4, R11 및 R14 내지 R15는 수소, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각각 독립적으로 선택되며 ;
    R8는 -C6H10-CH2-이고;
    n은 3 내지 1000의 정수이며;
    m은 1 내지 10의 정수이며;
    p 및 q는 0 또는 1로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 활성 작용기가 보호된 화합물.
  15. 제13항에 있어서, R7의 탄소 원자 수가 1 내지 12인 화합물.
  16. 제13항에 있어서, R7이 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기인 화합물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 활성 작용기가 알데하이드, 활성 카보네이트(-O-CO-Z), 말레이미드, 설포네이트 에스테르(-OSO2-R23), 하이드라자이드, 에폭사이드, 요오도아세트아미드, 알킨, 아자이드, 이소시아네이트, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 티오시아네이트, 니트릴, 카르보닐디이미다졸 유도체, 비닐설폰, 카르복시산 할라이드, 활성 에스테르(-CO-Z) 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 활성 작용기는 치환되거나 비치환될 수 있으며, Z는 활성기이고 R23은 비치환되거나 치환된 알킬, 알케닐기, 알키닐기, 알랄킬기 또는 아릴기인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 설폰 에스테르가 트레실레이트 또는 메실레이트인 화합물.
  19. 제17항에 있어서, Z가 N-숙신이미딜옥시기, 염소, 브롬, 설포-N-숙신이미딜옥시기, p-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기 또는 1-벤조트리아졸릴옥시기인 화합물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 활성 작용기의 헤테로사이클기가 치환되거나 비치환 된 피페라지닐기 또는 치환된 피페리디닐기인 화합물.
  21. 제13항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 화합물.
  22. 제13항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 화합물.
  23. 하기 일반 구조식으로 표시되는 종결부 활성화된 폴리옥사졸린(POZ) 화합물:
    Pp-Qq-Ww-Uu-X,
    상기 식에서,
    POZ는 [N(COR7)CH2CH2]n이며;
    X는 타겟 분자와 가수분해에 대해 안정한 결합을 형성하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 활성 작용기이며;
    P는 결합기이며, -O-, -S-, NH, -NR11-, 비치환된 헤테로사이클릴기를 포함하지만 이에 제한되지 않으며;
    Q는 결합기이며, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)m-CONH-(CH2)m-, -NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-, -CO- (CH2)m-, -CO-C6H4-, -CO-R8, -(R15)m- 또는 -(CR3R4)m-를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며;
    U는 -(R16)o-, -(CR5R6)o- 및 -NH-R21-NHCO-R22-으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합기이며;
    W는 -NH-CO-O-, -NH-CO, -NH-CO-NH-, -NH-CS-NH-, -O-, -S-, -NH- 및 SO-CO-NH로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합기이며;
    R7은 POZ의 각 반복 단위에 있어서, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R3 내지 R6, R11, R14 내지 R16 및 R21 내지 R22는 수소, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각기 독립적으로 선택되며 ;
    R8는 -C6H10-CH2-이고;
    n은 3 내지 1000의 정수이며;
    m 및 o는 1 내지 10으로부터 독립적으로 선택되는 정수이며;
    p, q, w 및 u는 0 또는 1로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 활성 작용기가 보호된 화합물.
  25. 제23항에 있어서, R7의 탄소 원자 수가 1 내지 12인 화합물.
  26. 제23항에 있어서, R7이 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기인 화합물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 활성 작용기가 알데하이드, 활성 카보네이트(-O-CO-Z), 말레이미드, 설포네이트 에스테르(-OSO2-R23), 하이드라자이드, 에폭사이드, 요오도아세트아미드, 알킨, 아자이드, 이소시아네이트, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 티오시아네이트, 니트릴, 카르보닐디이미다졸 유도체, 비닐설폰, 카르복시산 할라이드, 활성 에스테르(-CO-Z) 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 활성 작용기는 치환되거나 비치환될 수 있으며, Z는 활성기이고 R23은 비치환되거나 치환된 알킬, 알케닐기, 알키닐기, 알랄킬기 또는 아릴기인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 설폰 에스테르가 트레실레이트 또는 메실레이트인 화합물.
  29. 제27항에 있어서, Z가 N-숙신이미딜옥시기, 염소, 브롬, 설포-N-숙신이미딜옥시기, p-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기 또는 1-벤조트리아졸릴옥시기인 화합물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 활성 작용기의 헤테로사이클기가 치환되거나 비치환된 피페라지닐기 또는 치환된 피페리디닐기인 화합물.
  31. 제23항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 화합물.
  32. 제23항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 화합물.
  33. 하기 일반 구조식으로 표시되는 종결부 활성화된 폴리옥사졸린(POZ) 화합물:
    R1-POZ-C-Qq-X
    상기 식에서,
    POZ는 [N(COR7)CH2CH2]n이며;
    X는 타겟 분자와 가수분해에 대해 안정한 결합을 형성하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 활성 작용기이며;
    Q는 결합기이며, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 아랄킬기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)m-CONH-(CH2)m-, -NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-, -CO-(CH2)m-, -CO-C6H4-, -CO-R8, -(R15)m- 또는 -(CR3R4)m-를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며;
    C는 -O-, -NR19-, -S-, -NH- 및 POZ 부와 피페리딘 또는 피페라진 고리의 N 기 사이에 형성된 -N- 함유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합기이며;
    R7은 POZ의 각 반복 단위에 있어서, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R3 내지 R4, R11, R14 내지 R15 및 R19는 수소, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각기 독립적으로 선택되며 ;
    R8는 -C6H10-CH2-이고;
    n은 3 내지 1000의 정수이며;
    m은 1 내지 10의 정수이며;
    p 및 q는 0 또는 1의 정수이다.
  34. 제33항에 있어서, 상기 활성 작용기가 보호된 화합물.
  35. 제33항에 있어서, R7의 탄소 원자 수가 1 내지 12인 화합물.
  36. 제33항에 있어서, R7이 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기인 화합물.
  37. 제33항에 있어서, 상기 활성 작용기가 알데하이드, 활성 카보네이트(-O-CO-Z), 말레이미드, 설포네이트 에스테르(-OSO2-R23), 하이드라자이드, 에폭사이드, 요 오도아세트아미드, 알킨, 아자이드, 이소시아네이트, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 티오시아네이트, 니트릴, 카르보닐디이미다졸 유도체, 비닐설폰, 카르복시산 할라이드, 활성 에스테르(-CO-Z) 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 활성 작용기는 치환되거나 비치환될 수 있으며, Z는 활성기이고 R23은 비치환되거나 치환된 알킬, 알케닐기, 알키닐기, 알랄킬기 또는 아릴기인 화합물.
  38. 제37항에 있어서, 설폰 에스테르가 트레실레이트 또는 메실레이트인 화합물.
  39. 제37항에 있어서, Z가 N-숙신이미딜옥시기, 염소, 브롬, 설포-N-숙신이미딜옥시기, p-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기 또는 1-벤조트리아졸릴옥시기인 화합물.
  40. 제37항에 있어서, X기의 헤테로사이클기가 치환되거나 비치환된 피페라지닐기 또는 치환된 피페리디닐기인 화합물.
  41. 제33항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 화합물.
  42. 제33항에 있어서, 하기 화합물 중 어느 하나인 화합물.
    Figure 112009059094943-PCT00031
  43. 제33항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 화합물.
  44. 하기 일반 화학식으로 표시되는 타겟 분자 POZ 콘쥬게이트:
    A-B-TM
    상기 식에서,
    A는 POZ 유도체 상의 작용 활성기가 타겟 분자 상의 바인딩 파트너와 반응하는 동안 이탈되는 임의의 이탈기를 제외한, 종결부 말단에 단일 활성 작용기를 갖는 POZ 화합물이며;
    TM은 타겟 분자이고, 상기 타겟 분자는 바인딩 파트너를 포함하며; 및
    B는 상기 활성 작용기와 상기 바인딩 파트너 간에 형성된 가수분해에 대해 안정한 결합이다.
  45. 제44항에 있어서, 상기 활성 작용기가 트레실레이트이고, 바인딩 파트너가 SH이며, B가 티오에스테르 결합인 콘쥬게이트.
  46. 제44항에 있어서, 상기 활성 작용기가 말레이미드이고, 바인딩 파트너가 SH이며, B가 티오에스테르 결합인 콘쥬게이트.
  47. 제44항에 있어서, 상기 활성 작용기가 활성 카르보네이트이고, 바인딩 파트너가 NH2이며, B가 우레탄 결합인 콘쥬게이트.
  48. 제44항에 있어서, 상기 활성 작용기가 활성 에스테르이고, 바인딩 파트너가 NH2이며, B가 아미드 결합인 콘쥬게이트.
  49. 제44항에 있어서, 상기 활성 작용기가 알데하이드이고, 바인딩 파트너가 NH2이며, B가 아민 결합인 콘쥬게이트.
  50. 제44항에 있어서, 상기 POZ 화합물이 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 콘쥬게이트.
  51. 제44항에 있어서, 상기 POZ 화합물이 제1항, 제13항, 제23항 또는 제33항 중 어느 하나의 POZ 화합물인 콘쥬게이트.
  52. 제44항에 있어서, 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트의 인 비보(in vivo) 반감기가 생리학적 조건에서 증가하는 콘쥬게이트.
  53. 제44항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 콘쥬게이트.
  54. 종결부 활성화된 폴리옥사졸린(POZ) 화합물의 합성 방법으로서,
    (a) 종결부 말단에 양이온을 갖는 POZ 고분자를 형성하기 위하여 POZ 중합 반응을 개시하는 단계; 및
    (b) 상기 POZ 고분자를 친핵체로 종결하는 단계 를 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 친핵체가 머캅타이드인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 머캅타이드가 하기의 구조식을 포함하는 방법:
    R25S-Dd-X
    상기 식에서,
    X는 활성 작용기이거나 활성 작용기로 전환될 수 있는 기이며, 활성 작용기는 타겟 분자와 가수분해에 대해 안정한 결합을 형성하여 타겟 분자-POZ 콘쥬게이트를 형성할 수 있으며;
    R25는 금속이고;
    D는 결합기이며, 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기, 헤테로사이클릴기 또는 아릴기, -(CH2)b-CONH-(CH2)b-, -NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b, -CO-(CH2)b-, -CO-C6H4-, -CO-R26 또는 -(CR27R28)b를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며;
    R27 및 R28은 수소 또는 비치환되거나 치환된 알킬기, 알케닐기 또는 아랄킬기로부터 각각 독립적으로 선택되며;
    R26는 -C6H10-CH2-이고;
    d 는 0 또는 1이며; 및
    b는 1 내지 10의 정수이다.
  57. 제56항에 있어서, 상기 활성 작용기가 알데하이드, 활성 카보네이트(-O-CO-Z), 말레이미드, 설포네이트 에스테르(-OSO2-R23), 하이드라자이드, 에폭사이드, 요오도아세트아미드, 알킨, 아자이드, 이소시아네이트, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 티오시아네이트, 니트릴, 카르보닐디이미다졸 유도체, 비닐설폰, 카르복시산 할라이드, 활성 에스테르(-CO-Z) 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 활성 작용기는 치환되거나 비치환될 수 있으며, Z는 활성기이고 R23은 비치환되거나 치환된 알킬, 알케닐기, 알키닐기, 알랄킬기 또는 아릴기인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 설폰 에스테르가 트레실레이트 또는 메실레이트인 방법.
  59. 제56항에 있어서, Z가 N-숙신이미딜옥시기, 염소, 브롬, 설포-N-숙신이미딜옥시기, p-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기 또는 1-벤조트리아졸릴옥시기인 방법.
  60. 제56항에 있어서, R25가 Li, Na 또는 K인 방법.
  61. 제56항에 있어서, 상기 활성 작용기가 보호된 방법.
  62. 제54항에 있어서, 상기 POZ 고분자가 1.2 이하, 1.1 이하 또는 1.05 이하의 다분산도 값을 갖는 방법.
  63. 하기의 구조식 중 어느 하나를 가지는 화합물:
    Figure 112009059094943-PCT00032
    상기 식에서 n은 3 내지 1000의 정수이다.
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