CN114685784A - 一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用 - Google Patents

一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种用于核酸递送的聚(2‑噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒。本发明公开了一种用于核酸递送的聚(2‑噁唑啉)脂质，并通过该聚(2‑噁唑啉)脂质与可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂按特定比例混合得到了一种用于核酸递送的脂质纳米粒。该类聚(2‑噁唑啉)脂质可替代现有的PEG化脂质实现核酸药物的稳定包裹、粒径控制和有效递送，同时避免了见诸报道的PEG化脂质诱发的免疫反应；同时，聚(2‑噁唑啉)脂质本身的pH值响应特点可进一步增强核酸药物LNP制剂的环境适应性靶向摄取及内涵体逃逸，更加适用于相关核酸药物的重复给药和转染效率。

Description

一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用。
背景技术
核酸药物是生物医药发展的前沿领域，包括反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小向导RNA(sgRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)等，核酸药物是基因治疗的一种形式，也是继小分子药物、蛋白药物、抗体药物之后的新一代制药技术。核酸药物能够直接作用于致病靶基因或者靶mRNA，在基因水平上发挥治疗疾病的作用，核酸药物从转录后水平进行基因沉默或激活治疗，相比传统蛋白水平发挥作用的药物具有高特异性、高效性、长效性等明显优势。
在过去的30年里，核酸药物发展曲折，核酸药物想要进入体内主要面临3大个难关：1)核酸的分子量和负电荷使其不能自由通过生物膜；2)RNA容易被血浆和组织中RNase酶降解，被肝脏和肾脏快速清除和被免疫系统识别；3)进入细胞后“卡”在内吞小体中无法发挥功能。药物递送系统是克服核酸类药物发展面临的技术障碍的关键，目前，解决递送问题主要有两个方法：一个是改造核酸分子，让其稳定并躲避免疫系统的识别；另外一个就是利用药物传输系统，比如说脂质纳米颗粒(LNP)和GalNAc(N-乙酰化的半乳糖胺)偶联技术。
LNP是研究最久最成熟的核酸类药物递送系统，目前已上市的第一个核酸干扰药物Alnylam的Onpattro、辉瑞与Moderna的mRNA新冠疫苗以及国内艾博生物mRNA新冠疫苗等均采用了LNP递送系统。可离子化脂质是LNP递送系统的关键，pH＝4时，脂质分子中的氮会完全带正电荷。生理条件pH＝7.4，脂质基本不带电，在保持一定的细胞结合能力的情况下减弱细胞毒性。进入细胞之后，脂质体形成内涵体pH达到5，由于其带正电，与内涵体膜上的负电荷脂质结合使内涵体破裂，将mRNA释放出来避免最后被溶酶体降解。所以可电离阳离子脂质最大的优点就是有效降低LNP细胞毒性，提高mRNA的体内稳定性，并帮助mRNA逃避溶酶体的降解。专利201680063235.2、200980154346.4及200980122413.4等公开了新型可离子化脂质在递送核酸类药物中的应用，可以有效的将核酸类药物递送转染细胞发挥其药效。
可离子化脂质固然重要，但是PEG化脂质对RNA类药物递送也非常关键。PEG化脂质虽然用于控制粒径并充当空间屏障起稳定作用，防止储存过程LNP微粒聚集，延长循环时间，但是，PEG化脂质降低了细胞对LNP的摄取，阻碍了LNP的内涵体逃逸，从而降低RNA转染效率。另外多次注射PEG化脂质体可诱发免疫反应，引起加速血液清除(ABC)现象。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用，该类聚(2-噁唑啉)脂质可替代现有的PEG化脂质实现核酸药物的稳定包裹、粒径控制和有效递送，同时避免了见诸报道的PEG化脂质诱发的免疫反应；同时，聚(2-噁唑啉)脂质本身的pH值响应特点可进一步增强核酸药物LNP制剂的环境适应性靶向摄取及内涵体逃逸，更加适用于相关核酸药物的多次给药和转染效率。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，所述聚(2-噁唑啉)脂质的结构式为式1：
Figure BDA0003616112370000031
或式2：
Figure BDA0003616112370000032
式1或式2中的聚合度n独立的为10～100的任一整数；
所述L1为
Figure BDA0003616112370000041
Figure BDA0003616112370000042
所述L2为
Figure BDA0003616112370000043
所述R1独立的为H、
Figure BDA0003616112370000044
所述R2为
Figure BDA0003616112370000045
所述R3独立的为C12～C18的烷基；
所述R4独立的为C12～C18的烷基；
所述R5为H、C1～C3的烷基或
Figure BDA0003616112370000046
所述R6为C1～C3的烷基。
优选的，所述聚合度n独立的为20～60的任一整数。
优选的，所述L1为
Figure BDA0003616112370000047
Figure BDA0003616112370000048
Figure BDA0003616112370000051
所述L2为
Figure BDA0003616112370000052
Figure BDA0003616112370000053
所述R1独立的为H、
Figure BDA0003616112370000054
所述R2为
Figure BDA0003616112370000055
所述R3独立的为C12烷基、C14烷基或C16烷基；
所述R4独立的为C12烷基、C14烷基或C16烷基；
所述R5为H、CH3或
Figure BDA0003616112370000056
优选的，所述聚(2-噁唑啉)脂质的结构式为：
Figure BDA0003616112370000057
Figure BDA0003616112370000061
Figure BDA0003616112370000071
本发明的另一目的是提供一种包含聚(2-噁唑啉)脂质的脂质纳米粒，包含可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质；所述可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质的摩尔比为40～60：25～40：5～20：0.5～5；
优选的，所述可离子化脂质的结构通式为
Figure BDA0003616112370000081
Figure BDA0003616112370000082
其中，X为C2～C5直链烷基或CH2CH2OCH2CH2；
Y为(C＝O)O；
R7独立的为C10～C20直链烷基、C10～C20直链烯基或C10～C24酯基
R8独立的为C5～C10直链烷基；
R9独立的为C10～C24支链烷基。
优选的，所述甾醇类化合物为胆甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇或谷甾醇。
优选的，所述磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酸和二棕榈酰磷脂酸中的一种或几种。
本发明的再一目的是提供一种脂质纳米粒在制备核酸药物中的应用，所述核酸药物包含脂质纳米粒和核酸分子，所述脂质纳米粒中的可离子化脂质的氮原子与核酸分子中的磷酸基团的摩尔比为1.5～12：1。
优选的，所述核酸药物还包括pH调节剂和保护剂；
pH调节剂为药学接受的pH调节剂；
所述保护剂为甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油葡萄糖苷和四氢嘧啶中的一种。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
PEG化脂质是现有技术中制备核酸药物-LNP制剂的重要辅料成分，但由于PEG成分在食品、药品、化妆品领域中的广泛应用，见诸报道的PEG成分预存免疫已屡见不鲜，一定程度上限制了PEG化核酸药物-LNP制剂的人群适用性，尤其是在多次给药的情景下，会发生PEG成分诱发免疫反应，引起加速血液清除(ABC)现象的风险。本发明中的聚(2-噁唑啉)脂质可以替代现有的PEG化脂质用于制备核酸药物-LNP制剂，是现有技术中PEG化脂质的一种替代策略，可实现核酸药物的稳定包裹、粒径控制和有效递送的同时避免了PEG成分的免疫反应风险，提高了核酸药物-LNP制剂的人群适用性。
聚(2-噁唑啉)脂质本身具有一定的pH响应性特点，在低pH环境，如肿瘤病灶部位、细胞内涵体等会提高LNP制剂的摄取与内吞逃逸效率，相比于PEG化脂质能增强核酸药物-LNP制剂的靶向摄取和转染效能。同时，聚(2-噁唑啉)脂质比PEG化脂质合成更加容易，成本更低，分子量更可精确控制，而且基团侧链具有易修饰性特点，可以使得后续处方产品开发中能针对不同的处方特点和靶向需求较便捷的进行修饰筛选，能进一步拓展核酸药物-LNP制剂技术的应用领域。
具体实施方式
本发明提供了一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，所述聚(2-噁唑啉)脂质的结构式为式1：
Figure BDA0003616112370000101
或式2：
Figure BDA0003616112370000102
式1或式2中的聚合度n独立的为10～100的任一整数，优选为20-60的任一整数，进一步优选为25～40的任一整数，再一步优选为30；
所述L1为
Figure BDA0003616112370000103
Figure BDA0003616112370000104
优选为
Figure BDA0003616112370000105
Figure BDA0003616112370000111
所述L2为
Figure BDA0003616112370000112
优选为
Figure BDA0003616112370000113
所述R1独立的为H、
Figure BDA0003616112370000114
优选为H、
Figure BDA0003616112370000115
所述R2为
Figure BDA0003616112370000116
优选为
Figure BDA0003616112370000117
所述R3独立的为C12～C18的烷基，优选为C12烷基、C14烷基或C16烷基。
所述R4独立的为C12～C18的烷基，优选为C12烷基、C14烷基或C16烷基。
所述R5为H、C1～C3的烷基或
Figure BDA0003616112370000121
优选为H、CH3或
Figure BDA0003616112370000122
所述R6为C1～C3的烷基。
在本发明中，所述聚(2-噁唑啉)脂质优选如下结构：
Figure BDA0003616112370000123
Figure BDA0003616112370000131
本发明还提供了一种由聚(2-噁唑啉)脂质构成的脂质纳米粒，包含可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质；所述可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质的摩尔比为40～60：25～40：5～20：0.5～5；优选为45～55：30～40：8～12：1～3；进一步优选为50：38.5：10：1.5。
在本发明中，所述可离子化脂质的结构通式为
Figure BDA0003616112370000141
Figure BDA0003616112370000142
其中，X为C2～C5直链烷基或CH2CH2OCH2CH2；
Y为(C＝O)O；
R7独立的为C10～C20直链烷基、C10～C20直链烯基或C10～C24酯基
R8独立的为C5～C10直链烷基；
R9独立的为C10～C24支链烷基。
在本发明中，所述可离子化脂质优选如下结构：
Figure BDA0003616112370000143
Figure BDA0003616112370000151
Figure BDA0003616112370000161
在本发明中，所述甾醇类化合物为胆甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇或谷甾醇，优选为胆甾醇。
在本发明中，所述磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酸和二棕榈酰磷脂酸中的一种或几种。
在本发明中，所述脂质纳米粒的粒径为50～200nm，优选为60～170nm，进一步优选为70～120nm；所述脂质纳米粒的多分散性指数为0.05-0.2，优选为0.08-0.18。
本发明还提供了一种脂质纳米粒在制备核酸药物中的应用，所述核酸药物包含脂质纳米粒和核酸分子，所述脂质纳米粒中的可离子化脂质的氮原子与核酸分子中的磷酸基团的摩尔比为1.5～12：1，优选为3～8:1。
在本发明中，所述核酸分子包括任何形式的核酸分子，优选为DNA、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、microRNA(miRNA)、Dicer-substrate RNA(dsRNA)、小向导RNA(sgRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)。
在本发明中，所述核酸药物还包括pH调节剂和保护剂；
pH调节剂为药学接受的pH调节剂，优选为乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种；
所述保护剂为甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油葡萄糖苷和四氢嘧啶中的一种。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1化合物1的合成
Figure BDA0003616112370000181
将化合物1-1(3.5mmol，7.84g)、1-溴代十四烷(6.8mmol，1.88g)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,13.8mmol，1.78g)和无水乙腈(40mL)的混合物在密封烧杯中油浴80℃恒温加热48h。将反应混合物的溶剂蒸发，并用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用甲醇体积分数为8％的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物1(4.5g，40％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.52-3.42(m,102H),3.12(s,3H),2.44-2.25(m,78H),3.15-2.62(m,6H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物1的分子量为2636.57Da。
实施例2化合物2的合成
Figure BDA0003616112370000182
将化合物2-1(8mmol，28.17g)、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC,12mmol，3.07g)溶解于二氯甲烷(DCM，400mL)中，在冰水混合物中搅拌，在搅拌条件下加入三乙醇胺(TEA,24mmol，3.58g)，继续室温搅拌12h。用DCM(400mL)稀释反应混合物，分别用水(400mL)洗涤有机层三次、再用碳酸氢钠水溶液(400mL)洗涤有机层，将有机层在高真空及室温下干燥得化合物2-2。将所得化合物2-2在冰浴搅拌条件下溶解在DCM(400mL)中，在氩气气氛条件下，加入N,N-二肉豆蔻胺(4.8mmol，1.97g)和无水吡啶(Py，60mL)，室温搅拌12h，旋转蒸发去除溶剂等挥发物，向其中加入DCM(200mL)，装载填充乙酸乙酯的硅胶柱，乙酸乙酯洗脱柱子，最后甲醇体积分数为8％的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物2(17.7g，56％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:4.13(m,2H),3.52-3.42(m,162H),3.12(s,3H),2.44-2.25(m,123H),1.58-1.48(m,4H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物2的分子量为4532.17Da。
实施例3化合物3的合成
Figure BDA0003616112370000191
将化合物3-1(3.5mmol，10.38g)、1-溴代十四烷(6.8mmol，1.88g)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,13.8mmol，1.78g)和无水乙腈(40mL)的混合物在密封烧杯中油浴80℃恒温加热48h。反应混混合物蒸发溶剂，并用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用甲醇体积分数为8％的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物3(6.71g，62％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.81(m,2H)3.51-3.42(m,124H),2.43-2.24(m,93H),3.16-2.62(m,6H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物3的分子量为3092.18Da。
实施例4化合物4的合成
Figure BDA0003616112370000201
将化合物4-1(8mmol，19.1g)、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC,12mmol，3.07g)溶解于二氯甲烷(DCM，400mL)中，在冰水混合物中搅拌，在搅拌条件下加入三乙醇胺(TEA,24mmol，3.58g)，继续室温搅拌12h。用DCM(400mL)稀释反应混合物，分别用水(400mL)洗涤有机层三次、再用碳酸氢钠水溶液(400mL)洗涤有机层，将有机层在高真空及室温下干燥得化合物4-2。将所得化合物4-2在冰浴搅拌条件下溶解在DCM(400mL)中，在氩气气氛条件下，加入N,N-二棕榈烷基胺(4.8mmol，2.24g)和无水吡啶(Py，60mL)，室温搅拌12h，旋转蒸发去除溶剂等挥发物，向其中加入DCM(200mL)，装载填充乙酸乙酯的硅胶柱，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用5-10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物4(11.04g，48％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:4.11(m,2H),3.65(s,3H),3.54-3.41(m,92H),2.44-2.25(m,46H),1.58-1.48(m,4H),1.36-1.20(m,48H),1.15(m,69H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物4的分子量为2876.05Da。
实施例5化合物5的合成
Figure BDA0003616112370000211
将化合物5-1(3.5mmol，12.48g)、1-溴代十四烷(6.8mmol，1.88g)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,13.8mmol，1.78g)和无水乙腈(40mL)的混合物在密封烧杯中油浴80℃恒温加热48h。反应混混合物蒸发溶剂，并用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用8％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物3(4.43g，32％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.81(m,2H)3.51-3.42(m,164H),2.43-2.24(m,123H),3.16-2.62(m,6H),1.62(m,2H)1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物5的分子量为3957.19Da。
实施例6化合物6的合成
Figure BDA0003616112370000221
将化合物6-1(4mmol，20.89g)溶解于DCM(100mL)溶液中，氮气保护，温度降至5℃后，分别加入N,N-二肉豆蔻烷基-琥珀酸单酰胺(6mmol，3.06g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP,4.8mmol，0.59g)，分三批等量加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，4.4mmol，0.84g)，反应温度恢复室温继续反应14h，反应液用50mL，0.4N盐酸/10％氯化钠混合液洗涤两次，再用饱和氯化钠溶液洗涤一次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤后真空干燥，再用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用8％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物6(16.69g，73％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:4.11(m,2H),3.51-3.42(m,246H),3.12(s,3H),2.43-2.24(m,187H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物6的分子量为5715.66Da。
实施例7化合物7的合成
Figure BDA0003616112370000222
将化合物7-1(3.5mmol，6.8g)、1-溴代十四烷(6.8mmol，1.88g)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,13.8mmol，1.78g)和无水乙腈(40mL)的混合物在密封烧杯中油浴80℃恒温加热48h。反应混混合物蒸发溶剂，并用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用8％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物7(5.97g，75％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.81(m,2H)3.51-3.42(m,88H),2.43-2.24(m,66H),3.16-2.62(m,6H),1.62(m，2H)1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物7的分子量为2340.24Da。
实施例8化合物8的合成
Figure BDA0003616112370000231
将化合物8-1(8mmol，41.46g)、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC,12mmol，3.07g)溶解于二氯甲烷(DCM，400mL)中，在冰水混合物中搅拌，在搅拌条件下加入三乙醇胺(TEA,24mmol，3.58g)，继续室温搅拌12h。用DCM(400mL)稀释反应混合物，分别用水(每次400mL，共3次)、碳酸氢钠水溶液(400mL)洗涤有机层，将有机层在高真空及室温下干燥得化合物8-2。将所得化合物8-2在冰浴搅拌条件下溶解在DCM(400mL)中，在氩气气氛条件下，加入N,N-二肉豆蔻基胺(4.8mmol，1.97g)和无水吡啶(Py，60mL)，室温搅拌12h，旋转蒸发去除溶剂等挥发物，向其中加入DCM(200mL)，装载填充乙酸乙酯的硅胶柱，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用8％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物8(24.27g，54％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:4.12(m,2H),3.81(m,2H),3.54-3.41(m,244H),3.35(s,3H),2.44-2.25(m,180H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物8的分子量为5618.27Da。
实施例9化合物9的合成
Figure BDA0003616112370000241
将化合物9-1(3.5mmol，12.18g)、1-溴代十八烷(6.8mmol，2.27g)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,13.8mmol，1.78g)和无水乙腈(40mL)的混合物在密封烧杯中油浴80℃恒温加热48h。反应混混合物蒸发溶剂，并用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用5％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物9(8.16g，53％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.81(m,2H)3.51-3.42(m,160H),2.43-2.24(m,80H),3.16-2.62(m,6H),1.14(m,120H)1.36-1.20(m,64H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物9的分子量为4531.37Da。
实施例10化合物10的合成
Figure BDA0003616112370000251
将化合物10-1(3.5mmol，7.73g)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,4.2mmol，0.48g)和DMAP(1.05mmol，0.13g)溶解于DCM(150mL)，并向该DCM溶液中加入1,3-二环己基碳二亚胺(DCC，7mmol，1.44g)，室温搅拌18h。后加入N,N-二肉豆蔻基胺(4.4mmol，1.81g)、三乙胺(17.5mmol，3.48mL)及DCM(50mL)，搅拌12h。反应液用体积比为10:0.3的乙酸乙酯和三乙胺洗涤，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤后真空干燥，再用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物10(3.82g，42％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:3.81(m2H),3.54-3.41(m,124H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物10的分子量为2600.18Da。
实施例11化合物11的合成
Figure BDA0003616112370000261
将化合物11-1(8mmol，14.45g)、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC,12mmol，3.07g)溶解于二氯甲烷(DCM，400mL)中，在冰水混合物中搅拌，在搅拌条件下加入三乙醇胺(TEA,24mmol，3.58g)，继续室温搅拌12h。用DCM(400mL)稀释反应混合物，分别用水(每次400mL，共3次)、碳酸氢钠水溶液(400mL)洗涤有机层，将有机层在高真空及室温下干燥得化合物11-2。将所得化合物11-2冰浴条件下搅拌溶解在DCM(400mL)中，在氩气气氛条件下，加入N,N-二棕榈基胺(4.8mmol，2.24g)和无水吡啶(Py，60mL)，室温搅拌12h，旋转蒸发去除溶剂等挥发物，向其中加入DCM(200mL)，装载填充乙酸乙酯的硅胶柱，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用8％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物11(7.32g，32％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ4.13(m,2H),3.82(m,4H),3.54-3.41(m,84H),2.44-2.25(m,40H),1.36-1.20(m,96H),1.19(m,3H),1.15(m,60H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物11的分子量为2859.27Da。
实施例12化合物12的合成
Figure BDA0003616112370000271
将化合物12-1(3.5mmol，7.86g)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,4.2mmol，0.48g)和DMAP(1.05mmol，0.13g)溶解于DCM(150mL)，并向该DCM溶液中加入1,3-二环己基碳二亚胺(DCC，7mmol，1.44g)，室温搅拌18h。后加入N,N-二肉豆蔻基胺(4.4mmol，1.81g)、三乙胺(17.5mmol，3.48mL)及DCM(50mL)，搅拌12h。反应液用体积比为10:0.3的乙酸乙酯和三乙胺洗涤，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤后真空干燥，再用二氯甲烷(40mL)溶解，装入硅胶柱中，乙酸乙酯洗脱柱子，最后用7％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到化合物12(2.95g,32％)。1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ:4.10(m,2H),54-3.41(m,104H),2.44-2.25(m,78H),1.36-1.20(m,48H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确认化合物12的分子量为2637.56Da。
实施例13人促红细胞生成素(hEPO)mRNA脂质纳米粒(hEPO-mRNA LNP)的制备与检测
将阳离子脂质(SM-102)(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、DSPC(磷脂)(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆甾醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和聚(2-噁唑啉)脂质(化合物1～化合物12)以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶于乙醇中制备乙醇脂质溶液，并将hEPO-mRNA用25mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中配制mRNA水溶液。使用微流控设备以1:3的速度比混合乙醇脂质溶液和mRNA水溶液，SM-102与mRNA的N/P比为6.5:1制备脂质纳米粒。经微流控设备制备的hEPO-mRNALNP混悬液在4℃温度下透析24h除去乙醇并调整pH值为中性(透析液为pH7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液、透析膜截留分子量为8-14kD)，并定容至100μg/mL。最后，hEPO-mRNALNP混悬液通过0.2μm无菌过滤器过滤，得到可使用hEPO-mRNALNP终制剂。使用BeNano 180纳米粒度仪(丹东百特仪器有限公司)，以173°反向散射检测模式通过动态光散射测定脂质纳米颗粒的大小及多分散指数PDI，测试结果见表1。使用Quant-iT Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher)确定脂质纳米颗粒的包封效率，测试结果见表1。
表1(所有LNP颗粒的PDI均小于0.2)
Figure BDA0003616112370000281
Figure BDA0003616112370000291
从表1可以看出本发明制备的核酸药物粒径较小，包封率高。
实施例14 hEPO-mRNALNP动物在体测试
按照0.5mg/kg的剂量对4～6周龄雌性ICR小鼠通过尾静脉注射施用部分实施例13制备的hEPO-mRNA LNP，并在给药后6h采集小鼠血液，采集完血液样品后，使用二氧化碳将小鼠安乐处死。在4℃下以4800g离心15分钟从全血样本中分离血清，采集血清样本液氮速冻并在-80℃下储存以用于分析。使用人促红细胞生成素(hEPO)Quantikine IVD ELISA试剂盒对采集的血清样本进行ELSA分析，检测hEPO表达水平(ng/mL)详见表2。
表2检测结果
hEPO-mRNA LNP hEPO表达水平(ng/mL)
hEPO-mRNA LNP 1 1231
hEPO-mRNA LNP 2 764
hEPO-mRNA LNP 4 895
hEPO-mRNA LNP 7 1072
hEPO-mRNA LNP 10 1564
通过动物在体测试，本发明聚(2-噁唑啉)脂质形成的LNP能够递送核酸药物，将核酸分子成功转运至细胞中并进行表达。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，其特征在于，所述聚(2-噁唑啉)脂质的结构式为式1：
Figure FDA0003616112360000011
或式2：
Figure FDA0003616112360000012
式1或式2中的聚合度n独立的为10～100的任一整数；
所述L1为
Figure FDA0003616112360000013
Figure FDA0003616112360000014
所述L2为
Figure FDA0003616112360000015
所述R1独立的为H、
Figure FDA0003616112360000016
所述R2为
Figure FDA0003616112360000017
所述R3独立的为C12～C18的烷基；
所述R4独立的为C12～C18的烷基；
所述R5为H、C1～C3的烷基或
Figure FDA0003616112360000021
所述R6为C1～C3的烷基。
2.根据权利要求1所述的一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，其特征在于，所述聚合度n独立的为20～60的任一整数。
3.根据权利要求2所述的一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，其特征在于，所述L1为
Figure FDA0003616112360000022
Figure FDA0003616112360000023
所述L2为
Figure FDA0003616112360000024
Figure FDA0003616112360000025
所述R1独立的为H、
Figure FDA0003616112360000026
所述R2为
Figure FDA0003616112360000031
所述R3独立的为C12烷基、C14烷基或C16烷基；
所述R4独立的为C12烷基、C14烷基或C16烷基；
所述R5为H、CH3或
Figure FDA0003616112360000032
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质，其特征在于，所述聚(2-噁唑啉)脂质的结构式为：
Figure FDA0003616112360000033
Figure FDA0003616112360000041
Figure FDA0003616112360000051
5.一种包含聚(2-噁唑啉)脂质的脂质纳米粒，其特征在于，包含可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质；所述可离子化脂质、甾醇类化合物、磷脂和聚(2-噁唑啉)脂质的摩尔比为40～60：25～40：5～20：0.5～5。
6.根据权利要求5所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述可离子化脂质的结构通式为
Figure FDA0003616112360000052
其中，X为C2～C5直链烷基或CH2CH2OCH2CH2；
Y为(C＝O)O；
R7独立的为C10～C20直链烷基、C10～C20直链烯基或C10～C24酯基；
R8独立的为C5～C10直链烷基；
R9独立的为C10～C24支链烷基。
7.根据权利要求6所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述甾醇类化合物为胆甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇或谷甾醇。
8.根据权利要求7所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酸和二棕榈酰磷脂酸中的一种或几种。
9.权利要求5～8所述的脂质纳米粒在制备核酸药物中的应用，其特征在于，所述核酸药物包含脂质纳米粒和核酸分子，所述脂质纳米粒中可离子化脂质的氮原子与核酸分子中的磷酸基团的摩尔比为1.5～12：1。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸药物还包括pH调节剂和保护剂；
pH调节剂为药学接受的pH调节剂；
所述保护剂为甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油葡萄糖苷和四氢嘧啶中的一种。
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