CN105699472B - 基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法 - Google Patents

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Abstract

基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于主要包括如下步骤：1）采集样品，建立建模样品集：2）稳定同位素检测：所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr；3）数据标准化处理及样本赋值得到变量Z(C)、Z(N)、Z（O）、Z（D）、Z（Cd）、Z（206Pb/207Pb）、Z（207Pb/208Pb）、Z（Sr）；4）建立决策树分析模型；5）未知样品判定；该方法不仅可满足茶叶的质量安全，也可有效遏制茶叶的假冒，通过决策树树分析进行产地判别，回代检验正确判别率达91.35%，外部验证准确率达92%，模型是可靠的。

Description

基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法
技术领域
本发明属于农产品产地识别技术，具体涉及一种基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法。
背景技术
我国茶叶文化底蕴深厚，地域特色和品质特征明显，是典型的地理标志保护产品。西湖龙井茶是我国的十大名茶之首，有着1200多年的历史，产于浙江杭州西湖区，以“色绿、香郁、味甘、形美”的品质特征而成了杭州特产的金字招牌，响誉海内外。同时西湖龙井茶也因其名气大，品质佳而带给其经营者较高的效益，同时假冒龙井等现象也随之出现。虽然当地政府采用了原产地保护、按生产者的种植数量发放标识数量等办法来阻止假冒西湖龙井茶的发生，但由于经相同的工艺加工而的扁茶用肉眼根本难以区分，且目前仍没有一种十分理想的方法来鉴定西湖龙井茶的真伪。这常给消费者带来了困惑，开发一种能识别西湖龙井茶真伪的检测方法或模型对维护西湖龙井茶品牌，规范西湖龙井茶市场具有十分重要的意义。此外，针对我国扁形茶的主要产区的产地鉴别技术也未见报道。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，用于判别未知茶叶样品是来源于山东日照、四川青川、贵州黎平、西湖龙井茶产区和浙江非西湖龙井茶产区等五个产区的哪一具体产区，同时也用以鉴别西湖龙井茶的真伪。
实现本发明的所采用的技术方案如下：
基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于主要包括如下步骤：
1）采集样品，建立建模样品集：茶叶样品分别取自山东日照、四川青川、贵州黎平、西湖龙井茶产区和浙江非西湖龙井茶产区，样品经前处理后备用；
样品前处理方法为：用球磨机对茶叶样品进行粉碎处理，震荡频率30次/s，时间1min，茶粉装入2 ml离心管，待测；
2）稳定同位素检测：所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr；
稳定性碳氮同位素比率检测：称取约2-4 mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪样品盘中，样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2和N2通过氦载气流经阱，通过吸附解吸附得到分离纯化，然后进入同位素质谱仪，利用 IAEA-N1、 IAEA-N3和USGS24 、USGS41、IAEA-S-1、NBS123对标准气体进行校正，在分析过程中，每12个样品穿插一个实验室标样进行校正。仪器长期标准偏差为0.2 ‰，参数为:元素分析仪氦气吹扫流量为230ml/min，氧化炉和还原炉温度分别为1120 ℃、850 ℃，进入质谱仪载气氦气流量为100 ml/min；
稳定性氢氧同位素比率检测：称取约3 mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪样品盘中，样品在1400 °C的条件下在玻璃碳管中高温裂解与反应形成H2和CO，H2、CO在通过水阱和CO2捕集阱时得到纯化，在通过吸附解吸附阱时得到分离；在分析过程中，采用国际上通用的平衡时间，利用国际标样IAEA-CH7，IAEA-600，IAEA-601和IAEA-602采用2点校正的方式对测试样品进行校正；氦气流量为125 ml/min；
锶、铅、镉重稳定性同位素比率检测：
称取0.3 g经球磨机磨碎的样品于高压消解罐中，加入5 ml 70% HNO3加盖静置1h；高压消解罐使用前经20%硝酸浸泡过夜，超纯水清洗至无酸味、晾干；将静置后的样品放入微波消解仪进行消解，消解程序参数为第一步5 min升至120℃保持5 min，第二步5 min升至140℃保持10 min，第三步5 min升至180℃保持10 min，冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，将高压消解罐置于控温电热板上140℃赶酸，将消化液转移至25 ml容量瓶中，超纯水定容至刻度，混匀备用；用ICP-MS测定锶、铅重稳定性同位素比率；ICP-MS 工作参数为：射频功率1400 W，冷却气流速18 L/min，辅助气流速1.65 L/min，雾化器流速0.95 L/min，鞘气流速0.25 L/min；采样高度6.5 mm，泵稳定时间30 s；
3）数据标准化处理及样本赋值：将数据：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr导入分析软件SPSS 20.0进行标准化处理，处理方法为：将各值分别减去建模样品集中该元素的均值后再除以该元素的标准偏差，得到变量Z(C)、Z(N)、Z（O）、Z（D）、Z（Cd）、Z（206Pb/207Pb）、Z（207Pb/208Pb）、Z（Sr）；对山东日照茶、四川青川茶、贵州黎平茶、西湖龙井茶和浙江非西湖龙井茶分别赋值为1、2、3、4、5，将赋值单独作为变量，形成模型构建的数据源文件“chon”；
4）建立决策树分析模型：将数据源文件“chon”导入Clementine 12.0分析软件，每个元素为一列，作为输入变量，将步骤3）中的赋值变量作为输出变量，读取各变量值，连接Type节点，Type节点连接决策树C5.0模型节点，运行该工作流，得到模型，将模型分别与Type和Table节点连接，运行工作流得到训练集结果；
5）未知样品判定：测定未知样品中稳定同位素比例，所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr，并按照步骤3）的方法进行数据标准化处理，导入Clementine12.0分析软件，按照步骤4）的方法选择输入变量，但不规定输出变量，将其与Type连接，将数据源文件“chon”与Type节点的连接断开，运行模型，得到预测集的结果。
通过决策树树分析进行产地判别，回代检验正确判别率达91.35 %，外部验证准确率达92%。
附图说明
图1为图决策树C5.0模型默认参数设置图；
图2为决策树C5.0模型工作流。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步具体说明。
实施例1
1.样品采集
样品取自山东、四川、浙江、贵州四省，其中杭州西湖龙井茶产区35只样品；浙江非西湖龙井茶产区20只样品，四川青川扁茶19只，贵州黎平扁茶15只，山东日照扁茶15只。茶叶样品采取定点取样方式获得，样品的采摘时间包括了春茶的早、中、晚三个时期，山东日照茶区采摘时间集中在4月15日至5月25日，其他茶区集中在4月1日至4月25日。采样时，每一地区均选择了第3批（早）、第6批（中）、第9批（晚）采摘的1芽1叶新梢，并根据龙井茶工艺制成茶叶样品；取样时选取了当地代表性茶树品种：龙井43和当地种，每个时间段及品种的样品数基本相等。
样品预处理
进行稳定同位素检测前，用球磨机（MM301，Retsh公司）对茶叶样品进行粉碎处理，震荡频率30次/s，时间1 min，茶粉装入2 ml离心管，待测。
稳定同位素检测
所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr；
（1）稳定性碳、氮、氢、氧同位素比率检测
稳定性碳氮同位素比率检测：称取约2-4mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪(Elementervario PYRO cube，德国Elementer公司) 样品盘中，样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2和N2通过氦载气流经阱，通过吸附解吸附得到分离纯化，然后进入同位素质谱仪。利用 IAEA-N1、 IAEA-N3和USGS24 、USGS41、IAEA-S-1、NBS123等对标准气体进行校正，在分析过程中，每12个样品穿插一个实验室标样进行校正。仪器长期标准偏差为0.2‰。具体条件:元素分析仪氦气吹扫流量为230 ml/min，氧化炉和还原炉温度分别为1120℃、850℃，进入质谱仪载气氦气流量为100 ml/min。
稳定性氢氧同位素比率检测：称取约3 mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪样品盘中，样品在1400°C的条件下在玻璃碳管中高温裂解与反应形成H2和CO，H2、CO在通过水阱和CO2捕集阱时得到纯化，在通过吸附解吸附阱时得到分离。在分析过程中，采用国际上通用的平衡时间，利用国际标样IAEA-CH7，IAEA-600，IAEA-601和IAEA-602等采用2点校正的方式对测试样品进行校正。氦气流量为125ml/min。
稳定同位素比率计算公式：
δ‰=[(R样品/R标准)-1]*1000
R样品：所测样品中重同位素与轻同位素丰度比，即13C/12C，15N/14N，18O/16O， D/1H。
R标准：国际标准样中，δ15N的参照标准为大气，δ13C以国际标准的V-PDB为基准，δ18O和δD以平均海洋水为基准（SMOW）。
（2）锶、铅、镉等重稳定性同位素比率检测
样品34个为一组，另有2个空白样，2个标准样，2个加内标标准样，总共四十个为一大组进行测定。高压消解罐使用前经20%硝酸浸泡过夜，超纯水清洗至无酸味，晾干待用。称取0.3 g经球磨机（MM301，德国，Retsch）磨碎的样品于高压消解罐中，加入5 ml 70% HNO3（优级纯，美国，Thermo Fisher Scientific）加盖静置1 h。将静置后的样品放入微波消解仪进行消解，消解程序参数为5 min升至120℃保持5 min，5 min升至140℃保持10 min，5min升至180℃保持10 min，冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，将高压消解罐置于控温电热板上140℃赶酸，将消化液转移至25 ml容量瓶中，超纯水定容至刻度，混匀备用。ICP-MS工作参数如表1。
内标溶液：一定体积的1000 μg/ml Rh，In，Re混合标准溶液（中国计量科学研究院），用1%HNO3稀释为1 μg/ml，由内标管在线引入质谱仪。
仪器调谐贮备液：10 μg/ml Be，Mg，Co，In，Ce，Tl调谐贮备液用1% HNO3稀释为1ng/ml，备用。
标准曲线绘制：元素标准（国家有色金属及电子材料分析测试中心）用1%稀硝酸逐级稀释为1，2，4，6，8 μg/L。在ICP-MS的工作条件下采集空白溶液（1% HNO3）和标准溶液系列，由仪器自动绘制标准曲线。
数据预处理
将训练集和测试集数据分别导入SPSS20.0，并分别命名为chon和chon-test。在其中进行UV标准化，即将数据阵中各元素减去该列元素的均值后再除以该列元素的标准偏差，得到新的变量Z(C)、Z(N)、Z（O）、Z（D）、Z（Cd）、Z（206Pb/207Pb）、Z（207Pb/208Pb）、Z（Sr）。山东日照茶、四川青川茶、贵州黎平茶、西湖龙井茶和浙江非西湖龙井茶分别赋值为1、2、3、4、5，将赋值单独作为变量，默认命名为VAR00001。
决策树分析模型建立与未知样品判定
决策树分析的基本原理是采用自上而下的单向递归,在决策树的内部分支点进行属性值的比较并判断需要向下进入的分支，在决策树的末端节点得到结论，最终从一组无规则的事例推理出决策树表示形式。因此,从起始端到末端节点就对应着一条合理规则 ,整棵树就对应着一组表达式规则。为优化模型，选取70%样本作为训练集，另外30%样本作为验证集，基于验证集估计的模型预测准确性为84.62%。通过对不同产区扁形茶的稳定同位素比率进行决策树分析（表2），西湖龙井茶与山东日照、贵州黎平及四川青川的扁茶区分度较好，回代检验正确判别率达91.35 %，外部验证准确率达92%。
具体操作为：将文件chon导入clementine12.0中，连接Type节点，双击Type在其中将Z(C)、Z(N)、Z（D）、Z（O）、Z（Cd）、Z（206Pb/207Pb）、Z（207Pb/208Pb）、Z（Sr）这8个变量作为输入变量，将VAR00001作为输出变量，读取各变量值，连接决策树C5.0模型节点，采用软件默认参数（见图1），执行模型后的到决策树模型VAR00001，连接Type节点与决策树模型，并将模型连接输出节点Table和Analysis，点击运行，得到训练集结果。至此，得到决策树C5.0模型工作流（见图2）。将chon-test文件导入该工作界面，按照如上方法选择输入变量，但不规定输出变量，将其与Type连接，将chon与Type的连接断开，运行模型，即得到预测集的结果。

Claims (4)

1.基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于主要包括如下步骤：
1）采集样品，建立建模样品集：茶叶样品分别取自山东日照、四川青川、贵州黎平、西湖龙井茶产区和浙江非西湖龙井茶产区，样品经前处理后备用；
2）稳定同位素检测：所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr；
3）数据标准化处理及样本赋值：将数据：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr导入分析软件SPSS 20.0进行标准化处理，处理方法为：将各值分别减去建模样品集中该元素的均值后再除以该元素的标准偏差，得到变量Z(C)、Z(N)、Z（O）、Z（D）、Z（Cd）、Z（206Pb/207Pb）、Z（207Pb/208Pb）、Z（Sr）；对山东日照茶、四川青川茶、贵州黎平茶、西湖龙井茶和浙江非西湖龙井茶分别赋值为1、2、3、4、5，将赋值单独作为变量，形成模型构建的数据源文件；
4）建立决策树分析模型：将数据源文件导入Clementine 12.0分析软件，每个元素为一列，作为输入变量，将步骤3）中的赋值变量作为输出变量，读取各变量值，连接Type节点，Type节点连接决策树C5.0模型节点，运行工作流，得到模型，将模型分别与Type和Table节点连接，运行工作流得到训练集结果；
5）未知样品判定：测定未知样品中稳定同位素比例，所测定的指标为：13C/12C、15N/14N、18O/16O、 D/1H、111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr，并按照步骤3）的方法进行数据标准化处理，导入Clementine12.0分析软件，按照步骤4）的方法选择输入变量，但不规定输出变量，将其与Type节点连接，将数据源文件与Type节点的连接断开，运行模型，得到预测集的结果。
2.根据权利要求1所述的基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于：所述的样品前处理方法为：用球磨机对茶叶样品进行粉碎处理，震荡频率30次/s，时间1min，茶粉装入2 ml离心管，待测。
3.根据权利要求1所述的基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于：所述的稳定同位素检测方法如下：
稳定性碳氮同位素比率检测：称取2-4 mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪样品盘中，样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2和N2通过氦载气流经阱，通过吸附解吸附得到分离纯化，然后进入同位素质谱仪，利用 IAEA-N1、 IAEA-N3和USGS24 、USGS41、IAEA-S-1、NBS123对标准气体进行校正，在分析过程中，每12个样品穿插一个实验室标样进行校正；仪器长期标准偏差为0.2 ‰，参数为：元素分析仪氦气吹扫流量为230 ml/min，氧化炉和还原炉温度分别为1120 ℃、850 ℃，进入质谱仪载气氦气流量为100 ml/min；
稳定性氢氧同位素比率检测：称取3 mg待测样，用锡杯包好后放置于元素分析仪样品盘中，样品在1400 °C的条件下在玻璃碳管中高温裂解与反应形成H2和CO，H2、CO在通过水阱和CO2捕集阱时得到纯化，在通过吸附解吸附阱时得到分离；在分析过程中，采用国际上通用的平衡时间，利用国际标样IAEA-CH7，IAEA-600，IAEA-601和IAEA-602采用2点校正的方式对测试样品进行校正；氦气流量为125 ml/min；
锶、铅、镉重稳定性同位素比率检测：称取0.3 g经球磨机磨碎的样品于高压消解罐中，加入5 ml 70% HNO3加盖静置1 h；高压消解罐使用前经20%硝酸浸泡过夜，超纯水清洗至无酸味、晾干；将静置后的样品放入微波消解仪进行消解，消解程序参数为第一步5 min升至120℃保持5 min，第二步5 min升至140℃保持10 min，第三步5 min升至180℃保持10 min，冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，将高压消解罐置于控温电热板上140℃赶酸，将消化液转移至25 ml容量瓶中，超纯水定容至刻度，混匀备用；用ICP-MS测定锶、铅重稳定性同位素比率。
4.根据权利要求3所述的基于稳定同位素比例差异的扁形茶产地判别方法，其特征在于：用ICP-MS测定锶、铅、镉重稳定性同位素比率时，ICP-MS 工作参数为：射频功率1400 W，冷却气流速18 L/min，辅助气流速1.65 L/min，雾化器流速0.95 L/min，鞘气流速0.25 L/min；采样高度6.5 mm，泵稳定时间30 s。
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