CN112362827A - 一种牛奶产地溯源方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛奶产地溯源方法，包括如下步骤：S1)预先获取来自不同产地的牛奶样品；S2)测定牛奶样品稳定同位素比质谱数据；S3)检测牛奶样品的元素数据；S4)测定牛奶样品的脂肪酸数据；S5)构建基于稳定同位素比质谱数据、元素数据和脂肪酸数据的正交偏最小二乘判别分析模型，对不同产地已知的牛奶样品进行识别，进而筛选出区分牛奶产地的关键质量因子，用于判别实际待测牛奶的产地来源。本发明提供的牛奶产地溯源方法，能够准确判别牛奶的产地，为保护具有产地优势的牛奶提供数据支撑，有效避免进口牛奶中假冒、伪劣、以次充好等现象的发生。

Description

一种牛奶产地溯源方法

技术领域

本发明涉及一种乳品溯源方法，尤其涉及一种牛奶产地溯源方法。

背景技术

产地来源的判别是当今食品领域面临的重要问题之一。尤其是当前食品贸易全球化的状态和消费者的透明度要求使得各种食品需要有明确且真实的地理来源。随着我国进出口贸易的蓬勃发展，进口产品已成为国内消费者日常选择的对象。而牛奶作为人们日常饮食中不可或缺的一部分，进口牛奶在国内的消费量占有一定的比重。但是目前市场中牛奶的销售价格参差不齐，相同类型和规格的牛奶，由于产地的不同可能会带来几倍甚至几十倍的价格差异，因此追溯牛奶产地的真实性对确定其价值具有非常重要的意义。

目前国内外产地溯源研究众多，基于稳定同位素比值和元素特征进行产地判别的研究最多，也有一些研究的判别模型中使用了脂肪酸、氨基酸等指标。这些研究已广泛应用在葡萄酒、奶酪、水稻、肉类等各种产品中。Chung,I.M.对韩国三个地区的牛奶利用稳定同位素比值δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ³⁴S构建产地判别模型对牛奶进行产地溯源，发现稳定同位素δ¹³C是在产地溯源中最重要的影响因子。但目前大多数的研究多是采用一种变量构建判别模型，其判别精确度还有待提高。Tricia Hoffman对多个国家的奶粉利用元素进行产地溯源时发现只用元素进行溯源的模型只能对部分国家的样品进行准确的判别。

因此本发明选择稳定同位素比值、元素与脂肪酸三种变量构建了一个用于牛奶产地判别的多变量OPLS-DA溯源模型，与目前现有的研究方法相比更稳健、可靠，也为贴有欺诈性产地标签的商业牛奶的检测提供了参考。

近年来，乳制品的产地溯源研究也受到了各国研究人员的关注。而且具有产地保护标志的产品价格通常会比普通产品高出很多，因此，很多不法商家会利用掺假、以次充好的手段来赚取高额利益。因此开发进口牛奶的产地溯源模型可以规范中国的进口牛奶市场，提高相关部门的监管技术水平，维护消费者的权益，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牛奶产地溯源方法，能够准确判别牛奶的产地，为保护具有产地优势的牛奶提供数据支撑，有效避免进口牛奶中假冒、伪劣、以次充好等现象的发生。

本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种牛奶产地溯源方法，包括如下步骤：S1)预先获取来自不同产地的牛奶样品；S2)测定牛奶样品稳定同位素比质谱数据；S3)检测牛奶样品的元素数据；S4)测定牛奶样品的脂肪酸数据；S5)构建基于稳定同位素比质谱数据、元素数据和脂肪酸数据的OPLS-DA模型，对不同产地已知的牛奶样品进行识别，进而筛选出区分牛奶产地的关键质量因子，用于判别实际待测牛奶的产地来源。

进一步地，所述步骤S2包括利用稳定同位素比质谱仪检测所述牛奶样品在液体状态下的δ¹⁸O值，然后将牛奶样品经过冷冻干燥，并研磨成粉，接着对冻干奶粉样品继续检测δ¹³C、δ¹⁵N值；所述步骤S3和步骤S4对冻干奶粉样品检测元素数据和脂肪酸数据。

进一步地，所述牛奶样品冷冻干燥过程如下：将样品分装在干燥、洁净的培养皿中，放置于台式冷冻干燥机中，在-45℃温度下冻干过夜。

进一步地，所述步骤S2中每个样品利用稳定同位素比质谱仪平行检测多次求取平均值得到每个牛奶样品的稳定同位素比值质谱数据；并根据牛奶样品中稳定同位素比值质谱数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品稳定同位素比值质谱数据。

进一步地，所述步骤S3利用电感耦合等离子体发射光谱测定元素钠Na、钾K、锰Mn、磷P、锌Zn、钙Ca、铁Fe和镁Mg，利用电感耦合等离子体质谱测定其他元素物质，每个样品平行测定多次求取平均值得到每个牛奶样品的元素数据；并根据牛奶样品中元素数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品元素数据。

进一步地，所述步骤S4利用气相色谱仪检测冻干奶粉样品的脂肪酸含量，每个样本利用气相色谱平行检测多次求取平均值得到每个牛奶样品的脂肪酸数据；并根据牛奶样品中脂肪酸数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品脂肪酸数据。

进一步地，所述奇异点样本剔除过程如下：计算每个牛奶样品的检测数据的平均值，当样本的标准偏差超过设定阈值，将该样本从样本集中剔除并重新进行检测。

进一步地，所述步骤S5还包括根据已建立的OPLS-DA模型中的VIP值对建模的数据集进行筛选，移除VIP值低于0.5的变量，筛选出统计学差异P值小于0.05且VIP值大于1的变量作为关键质量因子。

进一步地，所述步骤S5中筛选出的关键质量因子为Rb、δ¹⁸O、Tl、Ba、Mo、Sr、δ¹⁵N、Cs、As、Eu、C20:4n6、Sc、C13:0、K、Ca和C16:1n7。

进一步地，所述步骤S5中，如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为4.554～16.002mg/kg、-4.05～3.90‰、0～3.957μg/kg、0.632～1.393mg/kg、0.152～0.286mg/kg、4.362～9.673mg/kg、5.45～7.24‰、0～0.029mg/kg、0～5.711μg/kg、1.818～24.70μg/kg、0.002～0.043g/100g、10.45～223.6μg/kg、0～0.046g/100g、1.170～1.472g/100g、0.850～1.182g/100g、0.022～0.574g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自澳大利亚；

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为21.21～44.14mg/kg、-6.14～-1.01‰、0～6.408μg/kg、1.023～2.373mg/kg、0.162～0.277mg/kg、2.281～6.439mg/kg、4.94～7.19‰、0～3.391mg/kg、0～4.317μg/kg、1.218～58.21μg/kg、0.002～0.027g/100g、8.052～375.9μg/kg、0.007～0.023g/100g、1.194～1.615g/100g、0.965～1.173g/100g、0.079～0.552g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自新西兰；

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为19.22～26.83mg/kg、-10.32～-7.51‰、0～0.655μg/kg、0.604～1.500mg/kg、0.277～0.358mg/kg、2.175～6.588mg/kg、4.51～5.43‰、0～0.038mg/kg、0～8.100μg/kg、0.323～22.35μg/kg、0.003～0.026g/100g、11.38～218.1μg/kg、0.008～0.023g/100g、1.286～1.596g/100g、0.899～1.144g/100g、0.078～0.407g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自奥地利。

本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供了一种基于稳定同位素比值、元素和脂肪酸的多变量牛奶产地溯源方法；首先收集不同产地的牛奶样品，对液体样品的δ¹⁸O进行稳定同位素比质谱分析，同时样品经过冷冻干燥、研磨成粉等前处理后，对样品中δ¹³C、δ¹⁵N、51种元素和35种脂肪酸分别进行稳定同位素比质谱分析、电感耦合等离子体质谱与电感耦合等离子体发射光谱分析、气相色谱分析，通过正交偏最小二乘判别分析构建了牛奶溯源模型，对牛奶产地进行判别，进而筛选出对不同产地牛奶的质量属性中关键的质量因子。本发明选取的样本来自多个国家，鉴别模型基于多变量，分析结果避免了片面性、不稳定性等缺点，提高了鉴别的准确度。

附图说明

图1A-1C是根据本发明实施例对三种数据集分别建模得到的OPLS-DA模型得分图；

图2A-2D是根据本发明实施例的基于不同变量对牛奶产地判别的OPLS-DA溯源模型得分图；

图3A是根据本发明实施例的基于三种变量对牛奶产地判别的OPLS-DA溯源模型的载荷图；

图3B是根据本发明实施例的基于三种变量对牛奶产地判别的OPLS-DA溯源模型的VIP值示意图；

图4A-4C是根据本发明实施例的基于三种变量对牛奶产地判别的OPLS-DA溯源模型的置换验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明提供的牛奶产地溯源方法，包括如下步骤：

S1、采集来自不同产地的牛奶样品，包括常见的进口国澳大利亚、新西兰和奥地利。首先，利用稳定同位素比质谱仪检测所述牛奶样品在液体状态下的δ¹⁸O值，然后将牛奶样品经过冷冻干燥，并研磨成粉。牛奶样品冷冻干燥具体为：将样品分装在干燥、洁净的培养皿中，于台式冷冻干燥机在-45℃冻干过夜。

S2、利用稳定同位素比质谱仪检测上述S1中液体牛奶样品的δ¹⁸O值和冻干牛奶粉末样品中δ¹³C、δ¹⁵N的值，每个样本利用稳定同位素比质谱仪平行检测六次，对六次所采集的稳定同位素比值数据求取平均值得到每个牛奶样本的稳定同位素比值质谱数据；根据牛奶样品中稳定同位素比值数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品稳定同位素比值质谱数据。

S3、参照国标GB 5009.268-2016对上述S1中冻干牛奶粉末样品的元素含量进行检测，元素钠Na、钾K、锰Mn、磷P、锌Zn、钙Ca、铁Fe和镁Mg利用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)测定，其他元素物质(钒V、钴Co、银Ag、铂Pt、金Au、铊Tl、钪Sc、钇Y、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、锂Li、铝Al、钛Ti、镍Ni、锶Sr、钼Mo、铑Rh、锑Sb、碲Te、钡Ba、汞Hg、铷Rb、铯Cs、铱Ir、铬Cr、铜Cu、砷As、硒Se、镉Cd、锡Sn和铅Pb)利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定，每个样本平行测定三次，对三次所采集的元素数据求取平均值得到每个牛奶样本的元素数据；根据牛奶样品中元素数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品元素数据。

S4、参照国标GB 5009.168-2016利用气相色谱仪检测上述S1中冻干牛奶粉末样品的脂肪酸含量，每个样本利用气相色谱平行检测三次，对三次所采集的脂肪酸数据求取平均值得到每个牛奶样本的脂肪酸数据；根据牛奶样品中脂肪酸数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品脂肪酸数据。

进一步地，所述剔除奇异点样本具体为：

计算每个牛奶样品的检测数据的平均值，当样本的标准偏差超过设定阈值，将该样本从样本集中剔除并重新进行检测；所述检测数据包括稳定同位素比值数据、元素数据及脂肪酸数据。

S5、对所述牛奶样品的稳定同位素比值数据、元素数据和脂肪酸数据集分别建模、两两组合建模及多变量建模，构建一个稳健的、且可识别出该模型中对产地鉴别重要的关键质量因子的OPLS-DA溯源模型(正交偏最小二乘判别分析，Orthogonal Projection toLatent Structure-Discriminant Analysis)。具体为：对数据集进行分别建模、两两组合建模和多变量建模，可得到分别基于稳定同位素比值、元素、脂肪酸、稳定同位素比值-元素；稳定同位素比值-脂肪酸、元素-脂肪酸、稳定同位素比值-元素-脂肪酸对牛奶产地进行鉴别的OPLS-DA溯源模型。

本发明可进一步根据已建立的OPLS-DA溯源模型中的VIP(Variable Importantin the Projection)值对建模数据集进行筛选，移除VIP值较低的变量以获得更稳健的模型。具体为：VIP值不仅代表模型中变量对X的解释率，还代表着其与Y之间的相关性。VIP>1的变量通常被认为是该模型中比较重要的变量，而VIP<0.5的变量通常是不重要的变量，而值在0.5和1之间的变量被认为是灰色区域，这些变量的重要性取决于数据集的规模，因此VIP值较低的变量将从模型中移除。

本发明还可进一步对比上述模型的性能并选择最佳、最稳健的模型作为最终的牛奶产地溯源模型，判断牛奶样品的产地质量属性。具体为：

在OPLS-DA溯源模型中，Q²值是通过7倍交叉验证将每次预测值与实际值对比得到的，其大小代表模型的稳定性及鉴别样本的预测能力。模型在建立时，一部分的数据会被留出，而这部分留出的数据会被用来做预测，然后将模型预测的值与实际值比较，一直重复直到所有变量都被用来预测一次。因此该值越接近1，模型越稳健。Q²>0.8的模型通常被认为是很好的模型，Q²>0.6的模型被认为是一个较好的模型，Q²>0.5则是可接受的。

下面给出一个具体实施例，样品采集：分别采集了3个国家的牛奶样品，共40份，其中17个牛奶样品来自澳大利亚，14个牛奶样品来自新西兰，9个牛奶样品来自奥地利。收集到的牛奶样品先利用稳定同位素比质谱仪测定其液体状态下水中的稳定氧同位素比值δ¹⁸O，然后在冷冻干燥机中冻干过夜，取出后，研磨成均匀的粉末，再测定其稳定碳同位素比值δ¹³C、稳定氮同位素比值δ¹⁵N、元素和脂肪酸含量。

1、稳定同位素比值的测定：

(1)δ¹⁸O的测定

使用水平衡－连续流动稳定同位素比质谱仪(GasBench II-CF-IRMS)测定牛奶样品中的稳定氧同位素比值。样品制备采用CO₂-H₂O平衡法。将少量苯甲酸加入干净的样品瓶中，然后加入200μL牛奶样品并加盖密封。样品瓶中的残留空气通过自动进样器辅助吹扫程序从样品瓶中排出，以含0.5％CO₂的He混合气充满样品瓶，经100mL/min的流速吹扫5min，然后以混合气体为平衡气，样品在28℃下平衡20h，顶部空间中少量的CO₂确保平衡期间氧同位素可完全转移(CO₂/H₂O<1:3000)。采集顶空10μL气体经70℃恒温气相色谱柱分离纯化，然后通过分流接口进入IRMS进行测定。Gasbench-IRMS状态：样品盘温度28℃；EI离子源模式，离子源电压为3.07kv；真空度为1.6×10^-6mbar；He和CO₂/He压力4bar。

(2)δ¹³C和δ¹⁵N的测定

利用元素分析-稳定同位素比质谱仪(EA-IRMS)测定牛奶样品中的稳定碳、氮同位素比值。分别称取适量样品用锡杯包裹后，通过自动进样器进样。样品中的碳和氮元素首先在氧化还原管中于980℃燃烧并转化为CO₂和氮氧化物，然后通过铜丝将氮氧化物还原为N₂。载气(He)将其稀释后转移到稳定同位素比质谱仪中进行检测。EA的工作条件为：氧化炉温度980℃；柱温50℃；载气(He)流速为100mL/min；氧气流速为175mL/min；吹扫气体(N₂)为180mL/min；注氧时间为4s。IRMS设置如下：电离模式为EI离子源；离子源电压为3.07kv；真空度为1.6×10^-6mbar；氦气、氧气、二氧化碳和氮气压力都是4bar。

2、元素含量的测定：

参考GB 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》标准，称取0.5g样品到塑料消化管中，加入5mL硝酸，将其密封后涡旋30s。然后将其放入微波消解仪中进行消解。消解程序的条件：初始温度120℃，保持5min；升至150℃并保持10min；升至190℃，保持20min。消解后，取出所得混合溶液并冷却至室温。最后用水定容至50mL待测。

元素钠Na、钾K、锰Mn、磷P、锌Zn、钙Ca、铁Fe和镁Mg用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)测定，其他元素物质用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测。

电感耦合等离子体发射光谱仪的基本参数：重复3次；泵速为12rpm；提升延时为15s，测量条件如下：读取时间为3s；射频功率为1.2kw；稳定时间为10s；观察模式为SVDV(径向和轴向双向观察)；观察高度为8mm；等离子气体流速为12.0L/min；雾化气体流速为0.70L/min；辅助气体流速为1.0L/min；无额外的空气流动。所有气体如载气和等离子体气体都是纯度为99.999％的氩气(Ar)。

所用的电感耦合等离子体质谱方法的测量参数如下：扫描方式为峰跃；每个光谱峰值检测3个点；每次复制的读取时间为3次；取样深度为10mm；雾化室温度为2℃；样品提升速率为0.5r/s；载气和氢气的流速分别为0.82mL/min和4mL/min；稀释等离子体的流速为0.3L/min；射频功率为1600w。

3、脂肪酸含量的测定：

参考国标GB5009.168-2016中方法，称取0.5g奶粉样品在20mL玻璃试管中，加入6mL 10％的乙酰氯-甲醇溶液(1:10，v:v)、5mL甲苯和200μL 5mg/mL的十一碳酸甘油三酯，并将所得混合物涡旋30s，然后迅速放入水浴(80℃)中振荡加热2h(30min后取出振荡一次)。最后将样品转移到50mL离心管中，用3mL 6g/100mL碳酸铵清洗3次，以4500r/min离心5min，取上清液放入样品瓶中进行测试。

脂肪酸组成及含量通过配有自动进样器的气相色谱系统测定。脂肪酸甲酯通过色谱柱(100m×0.25μm，0.25μm；美国安捷伦科技有限公司)分离，在60：1的分流模式下，进样量为1μL；载气是氮气；进样口温度为280℃；升温程序设定如下：120℃保持5min，然后以4℃/min升至240℃并保持25min。FID检测器的温度为260℃。

4、数据分析和模型构建

在澳大利亚、新西兰和奥地利三个国家中，澳大利亚的δ¹³C、δ¹⁵N和δ¹⁸O测定值均最高，其次是新西兰，最后是奥地利，三种稳定同位素比值的变化趋势表现出了一致性。方差分析结果表明稳定氧同位素比值在三个国家之间均存在显著差异，稳定氮同位素比值在奥地利与澳大利亚、奥地利与新西兰间存在显著差异。而稳定碳同位素比值只在奥地利与澳大利亚间存在显著差异，如表1所示，不同上标字母代表具有显著差异(P<0.05)。由此可见，奥地利和澳大利亚、新西兰之间的差异非常大，这与牛奶产地的地理位置有很大联系。因此稳定同位素比值特征在对牛奶产地溯源中发挥着比较重要的作用。

表1不同国家牛奶中同位素比值对比

分别统计不同产地牛奶中51种元素的含量和35种脂肪酸含量，方差分析结果表明，在51种测得的元素中有11种元素在不同国家间具有显著差异，分别是Tl，Sc，Eu，Sr，Mo，Ba，Rb，Cs，As，K，Ca。在这11种元素中，K和Ca属于人体中的常量元素，其余的9种元素多是微量元素。在检测到的35种脂肪酸中有8种脂肪酸的含量在三个国家间具有显著差异，分别是C10:0，C12:0，C13:0，C14:1n5，C16:1n7，C18:3n6，C21:0和C20:4n6。

当对三种数据集分别建模(图1)时，发现基于元素的溯源模型基本可以将三个国家的牛奶样品清楚地分开，且经过交叉验证的Q²值为0.65，也是一个比较好的模型(见图1B)。但是其R²值低于0.5，因此在模型中增加新变量是很有必要的。另外，从基于稳定同位素比值的溯源模型(图1A)中可以看出，奥地利与澳大利亚、新西兰呈现出了比较清楚的分类，这主要是因为奥地利是欧洲中部的一个国家，而澳大利亚和新西兰都是四面环海的岛国。由此可发现，地理位置对同位素比值特征和元素的影响比较大，稳定同位素比值和元素是产地溯源的重要工具。

接着对三种数据集两两组合建模和多变量建模，并根据VIP值大小移除VIP值比较小、使模型不稳定的变量，得到了图2中的4个模型。在这四个模型中，除了基于稳定同位素比值和脂肪酸的溯源模型(图2A)，其他的模型对各国的牛奶样品均有比较清晰的分类。但在这三个模型中，通过对比各自的R²和Q²值，基于多变量的溯源模型(图2D)更稳健，溯源能力更佳。

另外，在该模型中对不同产地牛奶属性判别比较重要的质量因子有Rb、δ¹⁸O、Tl、Ba、Mo、Sr、δ¹⁵N、Cs和As(VIP>1)等(图3B)，且这些质量因子在三个国家间具有显著差异(P<0.05)。另外从载荷图(图3A)中可看出Rb、Cs、Ba和Tl等位于载荷图左下方，Mo、As和K位于载荷图左上方，Sr、δ¹⁸O和δ¹⁵N等在载荷图右侧，它们在此溯源模型中具有较大的贡献度，综合得分图(图2D)可看出，上述变量分别在新西兰、奥地利和澳大利亚三个产地的牛奶中测定值较高。

优选关键质量因子为Rb(P＝0.00)、δ¹⁸O(P＝0.00)、Tl(P＝0.00)、Ba(P＝0.00)、Mo(P＝0.00)、Sr(P＝0.00)、δ¹⁵N(P＝0.00)、Cs(P＝0.00)、As(P＝0.002)、Eu(P＝0.007)、C20:4n6(P＝0.002)、Sc(P＝0.009)、C13:0(P＝0.003)、K(P＝0.013)、Ca(P＝0.012)和C16:1n7(P＝0.03)。

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为4.554～16.002mg/kg、-4.05～3.90‰、0～3.957μg/kg、0.632～1.393mg/kg、0.152～0.286mg/kg、4.362～9.673mg/kg、5.45～7.24‰、0～0.029mg/kg、0～5.711μg/kg、1.818～24.70μg/kg、0.002～0.043g/100g、10.45～223.6μg/kg、0～0.046g/100g、1.170～1.472g/100g、0.850～1.182g/100g、0.022～0.574g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自澳大利亚(A)。

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为21.21～44.14mg/kg、-6.14～-1.01‰、0～6.408μg/kg、1.023～2.373mg/kg、0.162～0.277mg/kg、2.281～6.439mg/kg、4.94～7.19‰、0～3.391mg/kg、0～4.317μg/kg、1.218～58.21μg/kg、0.002～0.027g/100g、8.052～375.9μg/kg、0.007～0.023g/100g、1.194～1.615g/100g、0.965～1.173g/100g、0.079～0.552g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自新西兰(D)。

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为19.22～26.83mg/kg、-10.32～-7.51‰、0～0.655μg/kg、0.604～1.500mg/kg、0.277～0.358mg/kg、2.175～6.588mg/kg、4.51～5.43‰、0～0.038mg/kg、0～8.100μg/kg、0.323～22.35μg/kg、0.003～0.026g/100g、11.38～218.1μg/kg、0.008～0.023g/100g、1.286～1.596g/100g、0.899～1.144g/100g、0.078～0.407g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自奥地利(G)。

最终对该模型中三个国家的牛奶样品数据进行200次置换验证(图4A-4C)，置换验证结果中三个国家牛奶样品的200次置换验证的Q²值回归线截距都在-0.7以下，均小于-0.5，这表明所构建的多变量产地判别模型具有可靠的稳定性，能够准确的预测牛奶样品的产地来源。

综上所述，本发明提供的牛奶产地溯源方法，选择了三种具有鉴别潜力的质量指标——稳定同位素比、元素和脂肪酸的特征，构建基于多变量数据的OPLS-DA溯源模型，可有效鉴别多来源牛奶的产地属性。综合了三种变量的鉴别技术，相比仅使用一种或两种变量的鉴别方法，其稳健性和可靠性有很大程度的提高。因此，本发明的牛奶产地溯源方法能为保护具有产地保护产品标签的牛奶提供数据支撑，有效保护这类产品的质量水平，避免以次充好的现象发生，具有广泛的应用前景。可规范进口奶市场，保护消费者权益，提高食品安全监管部门的监控技术水平，保障牛奶产品的质量安全。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种牛奶产地溯源方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1)预先获取来自不同产地的牛奶样品；

S2)测定牛奶样品稳定同位素比质谱数据；

S3)检测牛奶样品的元素数据；

S4)测定牛奶样品的脂肪酸数据；

S5)构建基于稳定同位素比质谱数据、元素数据和脂肪酸数据的OPLS-DA模型，对不同产地已知的牛奶样品进行识别，进而筛选出区分牛奶产地的关键质量因子，用于判别实际待测牛奶的产地来源。

2.如权利要求1所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S2包括利用稳定同位素比质谱仪检测所述牛奶样品在液体状态下的δ¹⁸O值，然后将牛奶样品经过冷冻干燥，并研磨成粉，接着对冻干奶粉样品继续检测δ¹³C、δ¹⁵N值；所述步骤S3和步骤S4对冻干奶粉样品检测元素数据和脂肪酸数据。

3.如权利要求2所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述牛奶样品冷冻干燥过程如下：将样品分装在干燥、洁净的培养皿中，放置于台式冷冻干燥机中，在-45℃温度下冻干过夜。

4.如权利要求2所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S2中每个样品利用稳定同位素比质谱仪平行检测多次求取平均值得到每个牛奶样品的稳定同位素比值质谱数据；并根据牛奶样品中稳定同位素比值质谱数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品稳定同位素比值质谱数据。

5.如权利要求2所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S3利用电感耦合等离子体发射光谱测定元素钠Na、钾K、锰Mn、磷P、锌Zn、钙Ca、铁Fe和镁Mg，利用电感耦合等离子体质谱测定其他元素物质，每个样品平行测定多次求取平均值得到每个牛奶样品的元素数据；并根据牛奶样品中元素数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品元素数据。

6.如权利要求2所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S4利用气相色谱仪检测冻干奶粉样品的脂肪酸含量，每个样本利用气相色谱平行检测多次求取平均值得到每个牛奶样品的脂肪酸数据；并根据牛奶样品中脂肪酸数据的方差及标准差，剔除奇异点样本，得到最终的牛奶样品脂肪酸数据。

7.如权利要求4、5或6中所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述奇异点样本剔除过程如下：计算每个牛奶样品的检测数据的平均值，当样本的标准偏差超过设定阈值，将该样本从样本集中剔除并重新进行检测。

8.如权利要求1所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S5还包括根据已建立的OPLS-DA模型中的VIP值对建模的数据集进行筛选，移除VIP值低于0.5的变量，筛选出统计学差异P值小于0.05且VIP值大于1的变量作为关键质量因子。

9.如权利要求8所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S5中筛选出的关键质量因子为Rb、δ¹⁸O、Tl、Ba、Mo、Sr、δ¹⁵N、Cs、As、Eu、C20:4n6、Sc、C13:0、K、Ca和C16:1n7。

10.如权利要求9所述的牛奶产地溯源方法，其特征在于，所述步骤S5中，如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为4.554～16.002mg/kg、-4.05～3.90‰、0～3.957μg/kg、0.632～1.393mg/kg、0.152～0.286mg/kg、4.362～9.673mg/kg、5.45～7.24‰、0～0.029mg/kg、0～5.711μg/kg、1.818～24.70μg/kg、0.002～0.043g/100g、10.45～223.6μg/kg、0～0.046g/100g、1.170～1.472g/100g、0.850～1.182g/100g、0.022～0.574g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自澳大利亚；

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为21.21～44.14mg/kg、-6.14～-1.01‰、0～6.408μg/kg、1.023～2.373mg/kg、0.162～0.277mg/kg、2.281～6.439mg/kg、4.94～7.19‰、0～3.391mg/kg、0～4.317μg/kg、1.218～58.21μg/kg、0.002～0.027g/100g、8.052～375.9μg/kg、0.007～0.023g/100g、1.194～1.615g/100g、0.965～1.173g/100g、0.079～0.552g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自新西兰；

如果实际待测牛奶的上述关键质量因子的测定值范围分别为19.22～26.83mg/kg、-10.32～-7.51‰、0～0.655μg/kg、0.604～1.500mg/kg、0.277～0.358mg/kg、2.175～6.588mg/kg、4.51～5.43‰、0～0.038mg/kg、0～8.100μg/kg、0.323～22.35μg/kg、0.003～0.026g/100g、11.38～218.1μg/kg、0.008～0.023g/100g、1.286～1.596g/100g、0.899～1.144g/100g、0.078～0.407g/100g，则由OPLS-DA模型判定该样品来自奥地利。

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