CN105378099A - Hcv核心脂质结合结构域单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测丙型肝炎病毒（HCV）抗原的单克隆抗体。所述抗体特异性与HCV核心抗原氨基酸残基134-171的脂质结合结构域的至少一个表位发生免疫反应。进一步提供了使用抗体、包含所述抗体的试剂盒和组合物用于检测HCV感染的免疫测定方法。

Description

HCV核心脂质结合结构域单克隆抗体

相关申请

本申请作为要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/783,529的优先权权益的PCT专利申请提交。前述申请的整个文本通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容提供了HCV核心蛋白的新单克隆抗体以及将其用于检测HCV感染的方法和组合物。

背景技术

根据WHO统计，全世界多达1.7亿人被丙型肝炎病毒(HCV)感染，即肝脏的一种病毒性感染。75-85%的被HCV感染的人会发展成慢性感染，这些病例中的大约20%会发展慢性丙型肝炎的并发症，包括感染20年以后的肝硬化或肝细胞癌。当前推荐的HCV感染的治疗是干扰素和利巴韦林药物的组合，但是，该治疗并不是在所有情况下都是有效的，并且在丙型肝炎相关的末期肝病中指示肝移植。目前，没有可用于预防HCV感染的疫苗，因此必须采取所有预防措施来避免感染。

因而，患者护理、以及通过血液和血液制品或通过亲近人接触发生的丙型肝炎病毒(HCV)的传播的预防需要使用灵敏检测测定的极度警觉。这建立了对用于筛查和鉴定HCV的载体和HCV-污染的血液或血液制品的特定方法的需求。HCV暴露的血清学测定依赖于存在于人血浆或血清中的HCV的检测。这可以通过检测由该病毒编码的独特结构蛋白和非结构蛋白来完成。

HCV病毒是黄病毒科家族的肝炎病毒属中的一种(+)义单链有包膜RNA病毒。病毒基因组具有大约10 kb的长度，且编码3011个氨基酸的多蛋白前体。HCV基因组具有编码独特多蛋白的单个大开放读码框(ORF)。该多蛋白在翻译同时和在翻译后通过细胞蛋白酶和病毒蛋白酶加工成3种结构蛋白，即，核心、E1和E2和至少6种非结构NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白(Choo等人, Science 244: 359-362 (1989))。

在HCV暴露以后，该病毒进入易感的肝细胞并发生病毒复制。在大约10天的隐晦期阶段中，病毒的存在不是明显的(即，不可检测到病毒RNA)，血清转氨酶水平是在正常限度内，且不存在针对HCV的免疫应答的证据(Busch等人, Transfusion 40:143 (2000))。通常，在暴露后约10天，可以检测到HCV RNA，经常具有每ml血清100,000-120,000,000个HCV RNA拷贝的病毒载量。通常在几周后，观察到ALT水平的增加，从而指示肝脏的炎症；在暴露以后平均约70天检测到抗体。

对HCV的暴露的血液筛查（通过检测HCV的抗体，或通过检测血清/血浆中的病毒特异性的分子(例如，HCV RNA或HCV核心蛋白)）是患者护理的一个重要组成部分。通过这些试验鉴定为已经暴露于HCV的个体所衍生出的血液或血液制品被从血液供给除去，且不用于分配给血液制品的受体(参见，例如，美国专利号6,172,189)。这些试验也可以用在临床场合中以诊断可归因于HCV感染的肝病。

血清学抗体试验依赖于代表病毒多蛋白的选定片段的重组抗原或合成肽的应用。第一代抗-HCV筛查试验是基于针对重组蛋白(HCV基因型1a)的抗体的检测，所述重组蛋白源自位于非结构NS-4蛋白(C100-3)中的序列(Choo等人, Science 244:359 (1989)；Kuo等人, Science 244:362 (1989))。第一代测定不能检测大约10%的具有慢性HCV感染的个体和多达10-30%的呈现急性HCV感染的个体中的抗体。第二代抗-HCV测定已经包含得自HCV基因组(HCV基因型1a)的3个不同区域的重组蛋白，包括得自核心、NS3和NS4蛋白的氨基酸序列(Mimms等人, Lancet 336:1590 (1990); Bresters等人, Vox Sang 62:213 (1992))，从而允许对在鉴定HCV感染的血液供体中的第一代试验的显著改进(Aach等人, N Engl J Med 325:1325 (1991)；Kleinman等人, Transfusion 32:805 (1992)。第二代测定检测接近100%的慢性HCV病例(Hino K., Intervirology 37:77 (1994))和在感染后12周之前在几乎100%的急性病例(Alter等人, N Engl J Med 327:1899 (1992); Bresters等人, Vox Sang 62:213 (1992))中的抗体。第三代试验包括表达得自NS5区域的氨基酸序列的重组蛋白、以及得自核心、NS3和NS4的抗原。有些研究已经指示第三代试验与第二代试验相比灵敏度的轻微提高(Lee等人, Transfusion 35:845 (1995)；Courouce等人. Transfusion 34:790-795 (1994))，但是该提高主要归因于NS3蛋白的变化，而不是NS5的包含(Courouce等人, Lancet 343:853 (1994))。

一般而言，第二代和第三代HCV抗体试验检测暴露以后约70天对HCV的暴露。由于HCV建立持久的、且在许多情况下终生的感染，HCV的抗体的检测代表一种非常有效的确定对HCV的暴露的方法。但是，单独的抗体试验经常不能在暴露以后的前70天中检测HCV感染的个体。

已经提出，针对HCV抗原的试验比抗体试验明显更早地检测对HCV的暴露，并且代表在血清转化前阶段中检测对HCV的暴露的核酸试验的替代方案。HCV抗原检测试验是快速的、简单的，可能不需要样品提取或其它预处理，且不象在HCV RNA试验中可能发生的那样易于出现操作错误(例如，污染)。因而，HCV核心抗原试验提出了用于筛查血液供体或用于监测抗病毒疗法的、针对HCV RNA的实用替代方案。

现有的HCV抗原试验依赖于检测HCV核心抗原在血清或血浆中的存在。HCV核心蛋白是包含多蛋白的前191个氨基酸的HCV的结构蛋白，且其形成将基因组RNA衣壳化的内部病毒包膜。已经开发了2种不同类型的血清学测定，其允许检测血清中的HCV核心抗原。一种测定形式检测血清转化之前受试者中的HCV核心抗原并用在筛查血液供体中，而另一种测定形式仅检测丙型肝炎患者中的核心抗原（不论它们的HCV抗体状态），且用在临床实验室中以诊断对HCV的暴露或监测抗病毒疗法。目前可得到的核心抗原检测测定都使用针对HCV核心的位于核心蛋白的氨基酸1-125处的DNA结合结构域的抗体。所述核心蛋白也含有位于氨基酸134-171之间的脂质结合结构域。迄今为止，尚未描述得自核心蛋白的该部分的抗原，且直到现在已经假定核心检测需要针对DNA结合结构域的抗体。

因而，可以真实地检测HCV核心抗原的结合蛋白将显著地改善患者中的HCV暴露的检测的可用方法。因而，公认需要可以容易地用在筛查试验中的新抗体。

发明内容

本发明大体上涉及可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应的单克隆抗体。更具体地，HCV核心抗原是HCV的氨基酸残基134-171。在更具体的实施方案中，所述抗体特异性地结合至少一个由氨基酸序列MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG形成的表位。在更具体的实施方案中，所述抗体可与由HCV核心抗原的氨基酸141-161、134-154和151-171形成的表位免疫反应。

本发明的另一个方面提供了可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体具有选自图1A中列出的抗体的重链可变结构域和选自图1B中列出的抗体的轻链可变结构域。

预见到，本文描述的任意抗体可以制备为免疫测定试剂，更具体地，这样的试剂优选地用可检测标记物标记。

在其它实施方案中，本发明的免疫测定试剂包含与固相结合的一种或多种本文公开的抗体。

包含本发明的抗体的免疫测定试剂可以进一步包含另外的针对HCV抗原的抗体。例如，这样的另外的抗体是另外的抗-核心抗体。

本发明的另一个方面涉及用于检测试验样品中的HCV的免疫测定，所述免疫测定包括：

(i) 使疑似含有HCV的试验样品与针对HCV核心抗原的第一抗体接触以形成所述第一抗体和位于所述试验样品内的抗原之间的复合物；

(ii) 使在步骤(i)中形成的所述复合物与权利要求1-6中的任一项的抗体接触，以形成权利要求1-6中的任一项的所述抗体和在步骤(i)中形成的复合物中的抗原之间的复合物，其中权利要求1-6中的任一项的所述抗体被可检测地标记，和

(iii) 检测在步骤(ii)中形成的复合物的标记物。

在更具体的实施方案中，所述免疫测定可以进一步特征在于，所述第一抗体针对HCV核心抗原的DNA结合结构域。在更具体的实施方案中，在步骤(ii)中采用的抗体用荧光标记物标记。在示例性实施方案中，所述标记物是吖啶鎓。

在某些实施方案中，所述免疫测定是其中将步骤(i)的抗体包被在固相上的免疫测定。在特定优选的实施方案中，步骤(i)的抗体包含与步骤(ii)的抗体不同的抗体。可替换地，所述免疫测定是其中步骤(i)的抗体包含与步骤(ii)的抗体相同的抗体的免疫测定。

本发明的任意免疫测定可以用在得自患者的试验样品上，且所述方法进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性处理的效力，其中，如果所述方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，则所述方法任选地进一步包括根据需要改变患者的治疗性/预防性处理以提高效力。

如在本文中将更详细地描述的，本领域技术人员将理解，本发明的任意免疫测定可以容易地改造用在自动化的系统或半自动化的系统中。

附图说明

图1A显示了本发明的优选抗体的重链可变结构域。

图1B显示了本发明的优选抗体的轻链可变结构域。

图2显示了从图1A的比对衍生出的聚簇简图的2个图示。

具体实施方式

本发明描述了针对丙型肝炎病毒核心抗原（具体地，核心抗原的氨基酸134-171之间的脂质结合结构域）的单克隆抗体的开发。使用的免疫原是合成肽，且杂交瘤的筛选利用所述免疫原肽和在134-171区域内的一组三个重叠的较小肽。另外，将代表氨基酸1-169的重组核心抗原用于筛选以确定鉴定为可与HCV核心蛋白反应的单克隆抗体的效力。通过它们与抗原的反应性、免疫原肽和包含免疫原的较小重叠肽来描绘所述抗体。使用BIAcore 4000仪器，通过SPR (表面等离子体共振)确定抗体与免疫原肽的结合动力学。通过标准ELISA确定与重组核心抗原的免疫反应性。

另外，为了证实本发明的单克隆抗体可以用于分析核心抗原的存在，使用针对HCV核心的DNA结合结构域(例如氨基酸1-125)内的表位的单克隆抗体作为捕获试剂和使用本发明的针对134-171的抗体作为检测试剂，进行核心抗原捕获微孔滴定板测定。这些测定产生的结果证实本发明的针对134-171的抗体用于HCV核心抗原检测免疫测定的实用性。这是独立地靶向HCV核心的2个主要结构域的抗原捕获测定用于捕获和检测的首次证实。以前报道的核心抗原检测测定使用结合DNA结合结构域(例如，氨基酸1-125)内的表位的抗体。

为了产生本发明的抗体，将小鼠用合成肽免疫，所述合成肽包含与BSA连接的得自氨基酸134-171的HCV核心基因型1共有序列。更具体地，所述免疫原具有以下序列：

。

另外，也表征了单克隆抗体与三个特定N-端生物素化的表位区域的结合，并在实施例中进一步讨论。具体地，所述三个重叠表位衍生自以上区域且具有以下序列：

。

将免疫原缀合至BSA以产生抗体。在其它实施方案中，将免疫原缀合至TT和纤丝（fibrils）。TT序列经常用于在小鼠中提供更稳健的免疫应答。TT缀合物的序列是：

。

纤丝缀合物的序列是：

。

将B-淋巴细胞与骨髓瘤融合配偶体融合以建立杂交瘤，然后将其关于针对免疫原肽的反应性、在免疫原肽序列内的三个重叠肽和重组HCV核心抗原进行筛选。使用Biacore 4000的动力学描绘（profiling）允许鉴定抗体的簇（其中所述簇通过它们的结合免疫原肽的能力来限定）或重叠134-171区域的较短肽。将这些结果与通过ELISA确定的对重组抗原的免疫反应性或其缺失组合，允许进一步将抗体描绘成具有类似特征(特异性)的组。

为了简要地总结在实施例中更详细地讨论的筛选结果，在用与BSA连接的肽免疫的小鼠中观察到最大免疫应答。另外，得自这些小鼠的应答主要集中在氨基酸141-161区域，尽管同样也存在一些对氨基酸134-154和151-171区域的应答。利用与TT连接的HCV肽，观察到免疫应答，但是，该应答不像利用BSA那样强烈。所述应答分布在所有3个表位区域上。另一方面，使用与将形成纤丝网络的肽连接的氨基酸134-171肽免疫的小鼠没有表现出显著的免疫应答。在图1A和1B中和在实施例中更详细地描述了本发明的抗体。

将用于这些研究的HCV核心抗原在大肠杆菌（E. coli）中表达，并基于以前公开的方法(Boulant等人, J. Virol. (2005), 79(17):11353-11365)使用IMAC和随后的反相HPLC通过两步法纯化。

以此方式，已经生产了一大批对HCV核心的脂质结合结构域特异性的单克隆抗体。这些单克隆抗体被用于开发诊断测定，所述诊断测定用于检测受感染的个体的血清和血浆中的HCV核心抗原。在本发明之前，尚未报道针对核心氨基酸134-171区域内的多个表位的单克隆抗体的产生，所述单克隆抗体已经表现出对HCV全长核心肽的结合活性。本发明的单克隆抗体的可用性允许开发用于核心抗原检测的免疫测定，其中靶向HCV核心抗原的2个主要结构域。以前的核心抗原测定描述了针对氨基酸1-125 (核酸结合结构域)内的表位的单克隆抗体的应用。因为以前描述的单克隆抗体仅仅能够靶向HCV核心的核酸结合结构域，它们在检测核心蛋白片段、分解产物或通过内部翻译起始衍生出的较小核心蛋白时充其量是低效的，且经常是无效的。本发明通过提供特异性单克隆抗体首次克服了以前测定中的这些不足，所述特异性单克隆抗体可以用作试剂以更有效地和快速地检测存在于试验样品中的HCV核心。

更具体地，本文描述的抗体是可用于检测HCV核心抗原的试剂，且是可用于促进HCV的生命周期研究的试剂。如上面所指出的，HCV编码的蛋白在协定的（concerted）方法中表达，其中核糖体结合内核糖体进入位点(IRES)并开始翻译，从而导致病毒多蛋白的合成，其被切割以产生经典的HCV蛋白、p21核心、E1、E2、p7和非结构蛋白。在没有核心基因区域中的翻译起始的情况下，不可能产生病毒酶，包括病毒聚合酶。因为该暂时关联，据信，在该区域中的翻译事件控制所有HCV蛋白的表达。因此，核心基因及其基因产物的完全理解是理解病毒的生命周期所必需的，且可以促进我们对病毒致病性机制的理解。近年来，已经描述了一个新的保守病毒蛋白家族，其被称作微核心(Eng等人, J Virol. 2009年4月;83(7):3104-3114)。这些蛋白在与核心基因相同的读码框中编码，但是被认为衍生自内部翻译起始事件而不是全长核心蛋白的翻译后加工。描述的微核心蛋白之一被称作“91微核心”，其因为核心内假定的起始密码子而得名。假定“134微核心”也存在，其衍生自在密码子134处的翻译起始，该密码子134编码许多HCV分离物中的甲硫氨酸。但是，不可得到用于检测基本上从脂质结合结构域衍生出的微核心的试剂。这样的蛋白可能在HCV持久性中起重要作用。

由于针对从HCV核心134-171衍生出的线性合成肽而产生单克隆抗体，未知它们是否会结合存在于受感染的个体中的天然完整核心抗原或加工形式的HCV核心。但是，前提条件是，本发明的单克隆抗体至少能够结合得自氨基酸134-171的线性HCV核心区域呈现的一个或多个表位，预见到，这样的结合足以提供明显可用在HCV检测测定中的这些单克隆抗体。本发明的一些单克隆抗体会与重组核心抗原反应，而其它则不会，从而提示，在核心氨基酸134-171区域内，存在线性表位和构象表位。识别线性表位和构象表位的抗体通常是用于研究受感染的细胞内的病毒装配和病毒生命周期的非常有用的工具。

最后，这些试剂还可以用在其中希望确定仅脂质结合结构域的存在的免疫测定中。由于关于受感染的个体中的微核心的循环水平知之甚少，它们可能以比含有氨基酸1-125的区域的核心蛋白高得多的水平存在。在提供检测氨基酸1-125的区域之外的HCV核心肽的抗体时，本发明提供了具有比目前可得到的那些大得多的灵敏度的HCV核心抗原检测测定。

定义

本文中使用的关于抗体、蛋白或肽与第二种化学物质的相互作用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指，所述相互作用依赖于在化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体会识别和结合特定蛋白结构，而不是普遍地识别和结合蛋白。如果抗体对表位“A”是特异性的，含有表位A (或游离的、未标记的A)的分子在含有标记的“A”和所述抗体的反应中的存在会减少与所述抗体结合的标记的A的量。

本文中使用的术语“抗体”概括地表示包含4个多肽链（2个重(H)链和2个轻(L)链）或其任意功能片段、突变体、变体或衍生物的任何免疫球蛋白(Ig)分子，其保留Ig分子的基本表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。下面讨论了它们的非限制性的实施方案。

在全长抗体中，每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区域可以进一步细分成被称作互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

术语“Fc区”用于确定免疫球蛋白重链的C-端区域，其可以通过木瓜蛋白酶对完整抗体的消化而产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域：CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。Fc部分中的改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter, 等人. 美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如，细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在某些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体而言是合乎需要的，但是在其它情况下可能是不必要的或甚至有害的，取决于治疗目的。某些人IgG同种型（特别是IgG1和IgG3）会通过分别结合Fc.γ.R5和补体Clq而介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是确定抗体的循环半衰期的关键组分。抗体的恒定区（例如抗体的Fc区）中的至少一个氨基酸残基被替换，从而改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两个相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化介导，且通过铰链区内的二硫键稳定化(Huber等人. Nature; 264: 415-20; Thies等人1999 J Mol Biol; 293: 67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基的阻止重链-重链二硫键的突变将使CH3结构域的二聚化失稳。已经鉴定出负责CH3二聚化的残基(Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73.)。因此，可能产生单价半Ig。令人感兴趣的是，已在自然界中发现IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70; Biewenga等人1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400)。已经确定FcRn: Ig Fc区的化学计量学为2:1 (West等人. 2000 Biochemistry 39: 9698-708)，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人1994 Eur J Immunol; 24: 542-548)。破坏CH3结构域的二聚化的突变对于其FcRn结合可能不具有较大不利影响，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3 β片结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。但是，半Ig分子可能由于它比常规抗体的尺寸更小的尺寸而在组织穿透方面具有某些优点。可以替换本公开内容的结合蛋白的恒定区(例如Fc区)中的至少一个氨基酸残基，使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎活性完全依赖于IgG Fc片段的N连接的聚糖的唾液酸化。已经确定对抗炎活性的精确聚糖需求，使得适当的IgG1 Fc片段可以产生，由此产生具有极大增强的效价的完全重组的唾液酸化的IgG1 Fc (Anthony, R. M., 等人(2008) Science 320:373-376)。

本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)指，抗体的保留特异性地结合抗原的能力的一个或多个片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。这样的抗体实施方案也可以是双特异性的、双重特异性的或多特异性的形式；特异性地结合两种或更多种不同的抗原。被术语抗体的“抗原结合部分”包含的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')₂片段，即包含2个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546, Winter等人, PCT公开WO 90/05144 A1，通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接到一起，所述合成接头使它们能够制成单个蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；和Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图被术语抗体的“抗原结合部分”包括。也包括单链抗体的其它形式，诸如双体。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但使用因为过短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger, P., 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., 等人(1994) Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的(参见，例如，Kontermann和Dubel编, Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 第790页(ISBN 3-540-41354-5))。另外，单链抗体也包括“线性抗体”，其包含一对串联的Fv区段(VH--CH1-VH--CH1)，所述Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata等人, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)；和美国专利号5,641,870)。

术语“多价结合蛋白”贯穿本说明书用于表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在一个方面，所述多价结合蛋白被工程改造成具有三个或更多个抗原结合位点，且一般不是天然存在的抗体。双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，且是四价或多价结合蛋白。如本文中所述的DVD可以是单特异性的，即，能够结合一种抗原诸如HCV核心蛋白，或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原。包含2个重链DVD多肽和2个轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称作DVD-Ig，且描述在例如美国专利号7,612,181中，其公开内容通过引用整体并入本文。DVD-Ig的每半包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽以及两个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点总共有6个CDR参与抗原结合。

结合蛋白的“功能性抗原结合位点”是能够结合靶抗原的结合位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力未必与所述抗原结合位点所来源的亲本抗体一样强，但是结合抗原的能力必须可使用已知用于评价抗体与抗原的结合的多种方法中的任一种测量。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不需要在数量上相同。

“免疫球蛋白恒定结构域”表示重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。

本文中使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”表示从基本上同源的抗体的群体得到的抗体，即，构成所述群体的各个抗体除了可能以微小量存在的可能天然存在的突变以外都相同。单克隆抗体针对单一抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个mAb针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆的”不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。

本文中使用的术语“人抗体”意图包括具有从人种系免疫球蛋白序列衍生出的可变区和恒定区的抗体。本公开内容的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机的或位点特异性的体外诱变或体内体细胞突变而导入的突变)，例如在CDR中且特别是在CDR3中。但是，本文中使用的术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中从另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系衍生出的CDR序列已经移植至人框架序列上。

本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下面的II C部分中进一步描述)、从重组的组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom H. R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., 和Highsmith W. E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., 和Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., 和Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378)、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，Taylor, L. D., 等人(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A.和Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. 等人(2000) Immunology Today 21:364-370)、或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、建立或分离的抗体。这样的重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生出的可变区和恒定区。可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，使得重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：其尽管衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系全套抗体（repertoire）内。

“亲和力成熟的”抗体是这样的抗体：其具有在其一个或多个CDR中的一个或多个改变，所述改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比，抗体对抗原的亲和力提高。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的规程来产生亲和力成熟的抗体。Marks等人. BidlTechnology 10:779-783 (1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。以下文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等人. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier等人. Gene 169:147-155 (1995); Yelton等人. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson等人, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins等人, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)，且在选择性诱变位置、接触或高突变位置处的具有增强活性的氨基酸残基的选择性突变如美国专利号6,914,128 B1中所述。

术语“嵌合抗体”表示这样的抗体：其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列，诸如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。

术语“CDR-移植抗体”表示这样的抗体：其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列被另一个物种的CDR序列替换，诸如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR (例如，CDR3)已经被人CDR序列替换。

术语“人源化抗体”表示这样的抗体：其包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL序列的至少一部分已经被改变得更“类人”，即，与人种系可变序列更相似。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中人CDR序列被引入非人VH和VL序列中以替换对应的非人CDR序列。“人源化抗体”也是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合目标抗原，且其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。本文中使用的术语“基本上”在CDR的背景下表示这样的CDR：其氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。人源化抗体包含基本上所有的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab') 2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些CDR区，且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。在一个方面，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)（通常是人免疫球蛋白的恒定区）的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换地使用。本领域公认的这些术语表示氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体的重链和轻链可变区或其抗原结合部分中的其它氨基酸残基更可变(即高变) (Kabat等人(1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391和, Kabat, E. A., 等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公开号91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31-35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24-34，对于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置89-97。

本文中使用的术语“CDR”表示在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，命名为CDR1、CDR2和CDR3。本文中使用的术语“CDR集合”表示存在于能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR的集合。这些CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定。Kabat (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991))描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)和Chothia等人, Nature 342:877-883 (1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性，但是呈现几乎相同的肽主链构象。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，所述Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界已由Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))和MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))描述。仍然其它的CDR边界定义可能不严格地遵循本文所述系统之一，但尽管如此仍将与Kabat CDR重叠，尽管考虑到以下预测或实验发现，可以缩短或加长它们：特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任一种限定的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。

本文中使用的术语“框架”或“框架序列”表示可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的精确定义可以由不同系统确定，所以可以相应地不同地解释框架序列的含义。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，和重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的框架区分成每个链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，且CDR3位于FR3与FR4之间。在不将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其他人提及的框架区代表在单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。本文中使用的FR代表四个子区域之一，且FR代表构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。本文中使用的术语“种系抗体基因”或“基因片段”表示由尚未经历成熟过程的非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述成熟过程导致特定免疫球蛋白的基因重排和表达突变(参见，例如，Shapiro等人, Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002)；Marchalonis等人, Adv Exp Med. Biol. 484:13-30 (2001))。由本公开内容的不同实施方案提供的优点之一源于以下认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保留物种中的个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当治疗性地用于该物种中时不太可能被识别为来自外来来源。

本文中使用的术语“人源化抗体”是这样的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段：其免疫特异性地结合目标抗原，且其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。本文中使用的术语“基本上”在CDR的背景下表示这样的CDR：其氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80%、优选地至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。人源化抗体包含基本上所有的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab') 2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些CDR区，且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。优选地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)（通常是人免疫球蛋白的恒定区）的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。

本文中使用的术语“中和”表示，当结合蛋白特异性地结合抗原时，抵消所述抗原的生物活性。在一个方面，中和性结合蛋白结合细胞因子且使它的生物活性降低至少约20%、40%、60%、80%、85%或更多。

术语“表位”包括能够特异性地结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子（例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基）的化学活性表面分组（grouping），且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中识别它的靶抗原时，就说所述抗体特异性地结合所述抗原。如果抗体交叉竞争(一种阻止另一种的结合或调节效应)，就说所述抗体“结合相同表位”。另外，表位的结构定义(重叠、类似、相同)具有信息性，但因为功能定义涵盖结构(结合)和功能(调节、竞争)参数，所以功能定义经常更具有相关性。

本文中使用的术语“表面等离子体共振”表示，允许通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变而分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore®系统(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)。关于进一步描述，参见Jonsson, U., 等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., 等人(1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., 等人(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnnson, B., 等人(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。

本文中使用的术语“Kon”意图表示结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成例如如本领域已知的抗体/抗原复合物的结合速率常数。“Kon”也称为如在本文中互换使用的术语“结合速率常数”或“ka”。该值指示抗体与它的靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间形成复合物的速率。

本文中使用的术语“Koff”意图表示结合蛋白(例如抗体)从例如如本领域已知的抗体/抗原复合物解离的解离速率常数或“解离速率常数”。该值指示抗体从它的靶抗原解离或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的解离速率。

本文中使用的术语“KD”意图表示“平衡解离常数”，且表示在滴定测量中在平衡时得到的值，或通过将解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)而得到的值。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。用于确定结合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术会提供高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其它实验方法和仪器，诸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)测定(例如可得自BIAcore International AB（GE Healthcare公司，瑞典，乌普萨拉）的仪器)。另外，也可以使用KinExA®(动态排除测定法(Kinetic Exclusion Assay))测定法，其可得自Sapidyne Instruments (Boise, Id.)。

“标记物”和“可检测标记物”是指这样的部分：其连接至特异性结合配偶体，诸如抗体或分析物，例如，以使得特异性结合对的成员（诸如抗体和分析物）之间的反应是可检测的，且如此标记的特异性结合配偶体（例如，抗体或分析物）被称作“可检测地标记的”。因而，本文中使用的术语“标记的结合蛋白”表示具有掺入的标记物的蛋白，所述标记物提供结合蛋白的鉴定。在一个方面，所述标记物是可检测的标志物，其可以产生通过视觉或仪器方式可检测的信号，例如，放射性地标记的氨基酸的掺入或可以被标记的抗生物素蛋白检测到的生物素基部分（例如，含有可以通过光学或比色测量方法检测到的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素）与多肽的连接。用于多肽的标记物的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；色原、荧光标记物（例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体），酶促标记（例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素基基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）；和磁性试剂，例如钆螯合物。免疫测定常用的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶鎓（acridinium）化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。本文描述了其它标记。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。“可检测地标记的”的应用意图包括后一类可检测标记。

术语“缀合物”表示与第二化学部分（诸如治疗剂或细胞毒性剂）化学连接的结合蛋白（诸如抗体）。术语“试剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或从生物学材料制备的提取物。在一个方面，所述治疗剂或细胞毒性剂包括、但不限于百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。当用在免疫测定的上下文中时，缀合抗体可以是用作检测抗体的可检测地标记的抗体。

在本文中互换使用的术语“分离的多核苷酸”和“分离的核苷酸分子”是指这样的多核苷酸(例如，具有基因组、cDNA或合成起源，或它们的某种组合)：其没有伴随在自然界中与所述“分离的多核苷酸”或“分离的核苷酸分子”一起发现的多核苷酸的全部或部分，或在自然界中没有作为较大序列的一部分而出现。“分离的多核苷酸”或“分离的核苷酸分子”可以可操作地连接至在自然界中没有连接的多核苷酸。

在本文中互换使用的术语“调节”和“调整”表示目标分子的活性(例如，细胞因子的生物活性)的变化或改变。调节可以是目标分子的某种活性或功能的量级的增加或下降。分子的示例性的活性和功能包括、但不限于结合特征、酶活性、细胞受体活化和信号转导。相应地，本文中使用的术语“调节剂”是能够变化或改变目标分子的活性或功能(例如，细胞因子的生物活性)的化合物。例如，调节剂可以造成与在没有所述调节剂存在下观察到的活性或功能的量级相比，分子的某种活性或功能的量级的增加或下降。在某些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能的量级。示例性的抑制剂包括、但不限于蛋白、肽、抗体、肽体、碳水化合物或小有机分子。肽体描述在例如WO01/83525中。

“患者”和“受试者”可以在本文中互换地用于表示动物，诸如哺乳动物，包括灵长类动物(例如，人、猴和黑猩猩)、非灵长类动物(例如，牛、猪、骆驼、骆马、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、鲸鱼)、禽类(例如，鸭或鹅)和鲨鱼。优选地，患者或受试者是人，诸如治疗或评估疾病、障碍或病症的人，处于疾病、障碍或病症的风险中的人，具有疾病、障碍或病症的人，和/或治疗疾病、障碍或病症的人。

本文中使用的术语“样品”以它的最宽的含义使用。本文中使用的“生物样品”包括、但不限于得自活物或曾经的活物的任何量的物质。这样的活物包括、但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其它动物。这样的物质包括、但不限于：血液、（例如，全血）、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

“组分”和“至少一种组分”通常表示捕获抗体、检测抗体或缀合抗体、对照、校准物、校准物系列、灵敏度实验对象组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、停止溶液等，其可以包含在根据本文所述的方法和本领域已知的其它方法用于测定试验样品（诸如患者尿、血清或血浆样品）的试剂盒中。因而，在本公开内容的背景下，“至少一种组分”和“组分”可以包括如上的多肽或其它分析物，诸如包含分析物（诸如多肽）的组合物，所述分析物任选地固定化在固体支持物上，诸如通过结合至抗-分析物(例如，抗-多肽)抗体。一些组分可以是在溶液中或者被低压冻干以重构用于测定。

“对照”表示已知不含有分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准物”可以在本文中互换使用以表示包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可以用于建立测定性能特征，且是试剂(例如，分析物)的完整性的有用指示。

“预定的截止值”和“预定水平”通常表示这样的测定截止值：其用于通过将测定结果与预定的截止值/水平进行对比来评估诊断/预后/治疗效果结果，其中预定截止值/水平已经与各种临床参数（例如，疾病的严重程度、进展/非进展/改进等）联系或相关。虽然本公开内容可以提供示例性的预定水平，但众所周知，截止值可能随免疫测定的性质（例如，采用的抗体等）而变化。另外，完全在本领域技术人员的一般技能内的是，基于本公开内容改进本文公开内容用于其它免疫测定以获得关于那些其它免疫测定的免疫测定特异性的截止值。尽管预定的截止值/水平的精确值在测定之间可能变化，但如本文中所述的相关性(如果存在的话)应当是普遍适用的。

如本文中所述的诊断测定中所用的“预处理试剂”(例如，裂解、沉淀和/或增溶试剂)是将存在于试验样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物增溶的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了别的以外，增溶分析物（例如，目的多肽）可能引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的（不要求分离步骤）或异质的（要求分离步骤）。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，从试验样品取出任何沉淀的分析物结合蛋白。

在本文所述的免疫测定和试剂盒的背景下的“质量控制试剂”包括、但不限于校准物、对照和灵敏度实验对象组。通常使用“校准物”或“标准物”(例如一种或多种，诸如多种)以便建立校准(标准)曲线用于内插分析物(诸如抗体或分析物)的浓度。可替换地，可以使用接近预定阳性/阴性截止值的单个校准物。可以联合使用多种校准物（即，多于一个校准物或不同量的校准物），从而构成“灵敏度实验对象组”。

“风险”表示特定事件在目前或在将来的某个时点发生的可能性或概率。“风险分级”表示已知临床风险因素的阵列，其允许医师将患者分类成发展特定疾病、障碍或病症的低、中、高或最高风险。

“特异性的”和“特异性”在特异性结合对(例如，抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应性片段))的成员之间的相互作用的背景下表示所述相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语表示抗体(或其抗原反应性片段)的特异性地结合分析物(或其片段)且不特异性地结合其它实体的能力。

“特异性结合配偶体”是特异性结合对的一个成员。特异性结合对包含2个不同的分子，所述分子通过化学或物理方式彼此特异性地结合。因此，除了普通免疫测定的抗原和抗体特异性结合对以外，其它特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白（或链霉亲和素）、碳水化合物和凝集素、互补的核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性的特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体（包括变体的片段），无论是分离的还是重组产生的。

单克隆抗体

图1A和1B显示了多种抗体的序列，所述抗体已经确定对HCV核心抗原是特异性的，且更具体地，已经确定对HCV核心抗原的脂质结合结构域是特异性的。已经发现，这些单克隆抗体可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应。更具体地，发现本发明的抗体特异性地结合至少一个由氨基酸序列MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG形成的表位。更具体地，所述单克隆抗体至少可与由HCV核心抗原的氨基酸141-161、134-154和151-171形成的表位免疫反应。鉴于这些单克隆抗体的公开，本发明预见到其在特定免疫测定中的用途，以通过确定HCV核心抗原在这样的试验样品中的存在来促进HCV在试验样品中的存在的快速且有效的检测。

抗-HCV核心结合蛋白可以用在用于诊断或预测哺乳动物中的丙型肝炎病毒感染的免疫测定中，所述抗-HCV核心结合蛋白包括单克隆抗体及其任何衍生物(例如，片段或变体)，所述衍生物包含本文描述的单克隆抗体的重链和轻链的CDR(参见图1A和1B)，前提条件是，这样的衍生物保留特异性地结合HCV核心蛋白脂质结合结构域的性质。如贯穿本公开内容使用的，“哺乳动物”包括人类和非人灵长类动物，以及其它动物。应该理解，免疫测定和有关方法中的靶分析物是HCV核心蛋白的脂质结构域，且因此靶分析物是存在于样品中的HCV核心蛋白，例如，在HCV感染以后。另外，应当理解，免疫测定可以检测2种或更多种靶分析物，前提条件是，至少一种分析物是HCV核心蛋白，第二种或另外的靶分析物可以是另一种核心蛋白分析物(例如，HCV核心蛋白的DNA结合结构域)，或可以是非HCV核心蛋白的分析物。

通过用合成肽免疫小鼠，得到编码抗-HCV核心单克隆抗体的重链和轻链可变结构域的核苷酸(DNA)序列和推论的蛋白序列，所述合成肽包含得自氨基酸134-171的HCV核心基因型1共有序列和破伤风类毒素(TT)肽序列。在某些实施方案中，将氨基酸134-171序列缀合至BSA。但是，在其它实施方案中，也将合成肽缀合至TT序列，因为这经常用于通过本领域技术人员已知的方法在小鼠中提供更稳健的免疫应答，所述方法诸如在下文和在例如以下文献中详述的那些方法：Goding, J. W. 1983. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, N.Y., 第56-97页。简而言之，为了生产人-人杂交瘤，选择人淋巴细胞供体。已知被HCV感染的供体(其中感染已经例如通过抗-病毒抗体在血液中的存在或通过病毒培养来证实)可以充当合适的淋巴细胞供体。可以将淋巴细胞从外周血样品分离，或者如果要对供体进行脾切除术，则可以使用脾细胞。爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)可以用于永生化人淋巴细胞，或人融合配偶体可以用于生产人-人杂交瘤。使用肽的初次体外免疫接种还可以用于制备人单克隆抗体。筛选由永生化的细胞分泌的抗体以确定分泌具有期望的特异性的抗体的克隆。对于单克隆抗-HCV核心抗体而言，所述抗体必须结合HCV核心蛋白，且更具体地，分别是HCV核心蛋白的脂质结合结构域。选择生产具有期望的特异性的抗体的细胞。如本领域已知的，可以使用得到单克隆抗体的其它方法。下面的实施例描述了如何在从细胞培养物中生长的杂交瘤细胞分离mRNA以后得到和表征抗-HCV核心单克隆抗体。本发明的抗-HCV核心单克隆抗体的重链和轻链可变区的推论氨基酸序列分别列出在图1A和图1B中。

给重链和轻链结构域的推论氨基酸序列分配SEQ ID NO，且编码它们的对应cDNA序列显示在附录A的序列表中。

在序列表中阐述的cDNA序列代表公开的cDNA的示例性实施方案。在其中显示的cDNA序列中预见到变异。这样的变异包括将产生特定核酸序列的那些变异，所述特定核酸序列能够指导在序列表中显示的对应蛋白的类似物的产生。应该理解，由于遗传密码的简并性，可能做出许多核苷酸置换，其将产生仍然能够指导对应的蛋白或它的类似物的产生的DNA序列。本公开内容包括所有这样的变体DNA序列，其在功能上与本文描述的任何序列等同。

本文描述的任何结合蛋白(如图1A和1B所示的本发明的单克隆抗体举例说明的)的变体是指，在氨基酸序列上与给定蛋白(例如，抗-HCV核心单克隆抗体)的差别在于氨基酸的添加(例如，插入)、缺失或保守置换、但是其保留给定蛋白的生物活性的蛋白(或多肽)。氨基酸的保守置换，即将氨基酸用具有相似特性（例如，亲水性和带电区域的程度和分布）的不同氨基酸替换，在本领域中被公认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些微小变化(参见，例如，Kyte等人, J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982))。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知，具有类似亲水指数的氨基酸可以被置换，且仍然保留蛋白功能。在一个方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被置换。也可以使用氨基酸的亲水性来揭示将引起保留生物学功能的蛋白的置换。在肽的上下文中，对氨基酸的亲水性的考虑允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度(参见，例如，美国专利号4,554,101，其通过引用并入本文)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的置换可以产生保留生物学活性（例如免疫原性）的肽。在一个方面，用具有在彼此的±2以内的亲水性值的氨基酸进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与该观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸置换理解为取决于氨基酸（尤其是那些氨基酸的侧链）的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示的。“变体”也可以用于描述已经经过差别加工（诸如通过蛋白酶解、磷酸化或其它翻译后修饰）、仍然保留它的生物活性或抗原反应性（例如，结合IL-18的能力）的多肽或其片段。“变体”在本文中的应用意图包括变体的片段，除非上下文另外抵触。

通过基因工程也可以生产本发明的抗体或那些抗体的抗原结合片段(例如，包含本发明的抗体的重链和轻链CDR的片段)。例如，用于在大肠杆菌中表达重链和轻链基因的技术是以下文献的主题：PCT专利申请公开号WO 901443、WO901443和WO 9014424，和Huse等人, 1989 Science 246:1275 1281。本公开内容也包括包含如本文中所述的核酸分子的分离的重组载体、以及包含这样的重组载体的宿主细胞。载体是能够运输已经与它连接的另一种核酸的核酸分子，其可以是构建体。载体可以包括任何优选的或需要的操作元件。优选的载体是这样的载体：已经描述了其限制位点，且其含有核酸序列的转录所需的操作元件。这样的操作元件包括例如至少一个合适的启动子、至少一个操纵基因、至少一个前导序列、至少一个终止子密码子以及核酸序列的的适当转录和随后翻译所必需或优选的任意其它DNA序列。这样的载体含有至少一个被宿主生物识别的复制起点以及至少一个选择标记和至少一个能够开始核酸序列转录的启动子序列。载体可以是其中可以连接进另外DNA区段的质粒。载体可以是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接进病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”（或简单地称作“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本公开内容意图包括这样的其它形式的表达载体，诸如起等同功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

可操作地连接的序列处于允许它们以它们的预期方式起作用的关系。与编码序列可操作地连接的控制序列以这样的方式连接：在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。可操作地连接的序列包括与目标基因邻接的表达控制序列以及反式起作用或者在控制目标基因的距离处的表达控制序列。表达控制序列是这样的多核苷酸序列：其是实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分泌的序列。所述控制序列的性质因宿主生物体而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子和转录终止序列。控制序列包括其存在对于表达和加工而言必需的组分，且也可以包括其存在是有利的另外组分，例如，前导序列和融合配偶体序列。

可以用载体转化宿主细胞，所述载体将外源DNA引入宿主细胞中以便使得该细胞成为重组地生产本发明的抗体的细胞。使用本领域众所周知的多种方法，可以在天然或人工条件下进行转化。转化可以依赖于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。所述方法基于要转化的宿主细胞进行选择，且可以包括、但不限于病毒感染、电穿孔、脂转染和颗粒轰击。转化的细胞包括稳定地转化的细胞（其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的组成部分进行复制）和瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。

合适的宿主生物包括例如真核细胞系统，诸如但不限于细胞系诸如HeLa、MRC-5或CV-1。如本领域众所周知的，在适合用于扩增载体和表达蛋白的条件下培养宿主生物诸如宿主细胞。通过本领域也众所周知的许多方法中的任一种，可以检测表达的重组蛋白。

尽管本发明的HCV检测方面仅仅需要抗体是单克隆抗体使得它们特异性地识别HCV核心抗原，但是在某些实施方案中可能需要生产人源化形式的本发明的抗体。“人源化的”抗体及其生产是本领域技术人员众所周知的。Morrison S., 1985 Science 229:1202和Oi等人, 1986 BioTechniques 4:214提供了“人源化的”抗体的一般综述。合适的“人源化的”抗体可以可替换地通过CDR或CEA置换来生产(Jones等人, 1986 Nature 321:552; Verhoeyan等人, 1988 Science 239:1534; Biedler等人. 1988 J. Immunol. 141:4053，它们的整个公开内容通过引用并入本文)。

在其它实施方案中，本发明的单克隆抗体可以充当用于生产经工程改造的和衍生化的结合蛋白的有用起始原料，所述结合蛋白包括包含一个或多个如本文中所述的抗-HCV单克隆抗体的双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白。例如，如在例如美国专利号7,612,181（其整个公开内容特此通过引用并入）中所述，可以生产对HCV核心蛋白具有独特结合亲合力的DVD-Ig。DVD-Ig结合蛋白能够结合一种或多种靶标。优选地，所述结合蛋白包含含有VD1-(X1)n-VD2-C--(X2)n的多肽链，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区，且n是0或1。使用多种技术，可以制备结合蛋白。

在示例性的技术中，可以用4个多肽链形成DVD-Ig，所述多肽链形成4个功能性抗原结合位点。因而，例如，DVD-Ig能够结合HCV核心蛋白。所述结合蛋白可以能够调节HCV核心蛋白的生物学功能或中和HCV核心蛋白。示例性的这样的结合蛋白具有至少一个重链可变结构域和至少对应的轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与本发明的抗体之一具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与该轻链可变结构域的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

DVD结合蛋白的可变结构域可以得自亲本抗体，包括能够结合目标抗原的多克隆和单克隆抗体。特异性地结合本文描述的HCV核心蛋白的单克隆抗体是合适的亲本抗体。通常，用于DVD结合蛋白的抗体可以是天然存在的或可以通过重组技术来制备。

使用本领域已知的多种技术，可以制备单克隆抗体，所述技术包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，使用杂交瘤技术，可以生产单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括如本文中所述的用于制备抗-HCV核心蛋白单克隆抗体的那些和本领域已知的和在例如以下文献中教导的那些：Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988年第2版); Hammerling, 等人,见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (所述参考文献通过引用整体并入)。本文中使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”表示从单个克隆（包括任何真核、原核或噬菌体克隆）衍生出的抗体，且不是用于生产它的方法。如在下面实施例1中讨论的，对杂交瘤进行选择、克隆和进一步筛选合乎需要的特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产生和合乎需要的抗体特征。可以在体内在同基因动物中、在缺少免疫系统的动物（例如，裸鼠）中、或在体外细胞培养物中培养和繁殖杂交瘤。选择、克隆和繁殖杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在一个优选的实施方案中，所述杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，在非人、非小鼠物种（诸如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马）中生产杂交瘤。在另一个实施方案中，所述杂交瘤是人杂交瘤，其中将人非分泌型骨髓瘤与表达能够结合特定抗原的抗体的人细胞融合。

如在以下文献中所述，使用在本领域中被称作选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法，也从单个分离的淋巴细胞制备重组单克隆抗体：美国专利号5,627,052、PCT公开WO 92/02551和Babcock, J. S. 等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848。在该方法中，鉴定分泌目标抗体的单个细胞，例如，从免疫的动物衍生出的淋巴细胞，且通过逆转录酶-PCR从所述细胞挽救重链和轻链可变区cDNA，然后可以在哺乳动物宿主细胞（诸如COS或CHO细胞）中在适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)的背景下表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列（衍生自体内选择的淋巴细胞）转染的宿主细胞然后可以经历进一步体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对目标抗原的抗体的细胞。可以进一步在体外操作扩增的免疫球蛋白序列，诸如通过体外亲和力成熟方法，诸如在PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。

通过用目标抗原免疫包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物，也会生产单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，所述非人动物是XENOMOUSE®转基因小鼠，即包含人免疫球蛋白基因座的大片段且具有小鼠抗体产生缺陷的经工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人. Nature Genetics 7:13-21 (1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。也参见1991年7月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的WO 98/16654，1998年6月11日公开的WO 98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的WO 99/45031，1999年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的WO 00 09560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE®转基因小鼠产生全人抗体的成年-样人全套抗体，且产生抗原-特异性的人Mab。通过引入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小的、种系构型YAC片段，XENOMOUSE®转基因小鼠含有大约80%的人抗体全套抗体。参见Mendez等人, Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green和Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)，它们的公开内容特此通过引用并入。

体外方法也可以用于制备亲本抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有期望的结合特异性的抗体。这样的筛选重组抗体文库的方法是本领域众所周知的，且包括在例如以下文献中描述的方法：Ladner等人. 美国专利号5,223,409; Kang等人. PCT公开号WO 92/18619; Dower等人. PCT公开号WO 91/17271; Winter等人. PCT公开号WO 92/20791; Markland等人. PCT公开号WO 92/15679; Breitling等人. PCT公开号WO 93/01288; McCafferty等人. PCT公开号WO 92/01047; Garrard等人. PCT公开号WO 92/09690; Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay等人(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse等人(1989) Science 246:1275-1281; McCafferty等人, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths等人(1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins等人(1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson等人(1991) Nature 352:624-628; Gram等人(1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad等人(1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom等人(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137；和Barbas等人(1991) PNAS 88:7978-7982，美国专利申请公开20030186374，和PCT公开号WO 97/29131，它们中的每一篇的内容通过引用并入本文。

还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法来制备亲本抗体。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具体地，这样的噬菌体可以用于展示从全套抗体或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用抗原选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如，使用标记的抗原、或与固体表面或珠子结合或捕获至固体表面或珠子的抗原。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组地融合的Fab、Fv或二硫化物稳定化的Fv抗体结构域的噬菌体表达的fd和M13结合结构域。可以用于制备如本文中所述的抗体的噬菌体展示方法的例子包括在以下文献中公开的那些：Brinkman等人, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames等人, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough等人, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic等人, Gene 187 9-18 (1997); Burton等人, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT申请号PCT/GB91/01134; PCT公开WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

如在以上参考文献中所述，在噬菌体选择以后，可以分离得自噬菌体的抗体编码区并用于制备完整抗体，包括人抗体或任意其它期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主（包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌）中表达，例如，如在下面详细描述的。例如，使用本领域已知的方法，诸如在以下文献中公开的那些，也可以采用重组地生产Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术：PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人, BioTechniques 12(6):864-869 (1992)；和Sawai等人, AJRI 34:26-34 (1995)；和Better等人, Science 240:1041-1043 (1988) (所述参考文献通过引用整体并入)。可以用于生产单链Fv和抗体的技术的例子包括在以下文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498; Huston等人, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991)；Shu等人, PNAS 90:7995-7999 (1993)；和Skerra等人, Science 240:1038-1040 (1988)。

作为通过噬菌体展示来筛选重组抗体文库的替代方案，可以应用本领域已知的用于筛选大组合文库的其它方法来鉴定亲本抗体。一类替代表达系统是这样的：其中将重组抗体文库表达为RNA-蛋白融合体，如Szostak和Roberts在PCT公开号WO 98/31700中所述，和在Roberts, R. W.和Szostak, J. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中所述。在该系统中，建立mRNA和肽或蛋白之间的共价融合体，所述mRNA通过在它们的3'末端携带嘌呤霉素（一种肽基受体抗生素）的合成mRNA的体外翻译编码所述肽或蛋白。因而，基于编码的肽或蛋白（例如，抗体或其部分）的性能（诸如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合），可以从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)富集特定mRNA。从这样的文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列可以通过如上所述的重组方式进行表达(例如，在哺乳动物宿主细胞中)，且此外可以通过mRNA-肽融合体（其中已经将突变引入原始选择的序列中）的另外筛选轮回或通过如上所述的重组抗体的体外亲和力成熟的其它方法进行进一步亲和力成熟。

在另一个方案中，还可以使用本领域已知的酵母展示方法来制备亲本抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法将抗体结构域连接至酵母细胞壁并将它们展示在酵母的表面上。具体地，这样的酵母可以用于展示从全套抗体或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用于制备亲本抗体的酵母展示方法的例子包括在Wittrup, 等人. 美国专利号6,699,658（通过引用并入本文）中公开的那些。

可以进一步修饰本文描述的单克隆抗体以制备CDR嫁接的和人源化的亲本抗体。CDR嫁接的亲本抗体包含得自人抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域被能够结合目标抗原的鼠抗体的CDR序列替换。得自任何人抗体的框架序列可以充当CDR嫁接的模板。但是，在这样的框架上的直链替换经常导致与抗原的结合亲和力的一些损失。人抗体与原始鼠抗体的同源性越高，将鼠CDR与人框架组合将引起可以降低亲和力的CDR变形的可能性越小。因此，优选的是，选择的用于替换远离CDR的鼠可变框架的人可变框架与鼠抗体可变区框架具有至少65%序列同一性。更优选的是，远离CDR的人和鼠可变区具有至少70%序列同一性。甚至更优选的是，远离CDR的人和鼠可变区具有至少75%序列同一性。最优选的是，远离CDR的人和鼠可变区具有至少80%序列同一性。生产这样的抗体的方法是本领域已知的(参见EP 239,400; PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，贴面或重修表面(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka等人, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska等人, PNAS 91:969-973 (1994)), 和链改组(美国专利号5,565,352)。

人源化抗体是得自结合期望的抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有一个或多个得自非人物种的互补性决定区(CDR)和得自人免疫球蛋白分子的框架区。已知的人Ig序列公开在，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.html; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.aboutjraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/virV_-mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stataim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/ Webpages/Pept/spottech.html; wwwjerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.con/ibm.html.Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)，每篇完整地通过引用并入本文。如本领域已知的，这样的引入的序列可以用于降低免疫原性，或降低、增强或修改结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任意其它合适的特征。

可以用得自CDR供体抗体的对应残基置换人框架区中的框架残基以改变、优选地改善抗原结合。通过本领域众所周知的方法，例如，通过CDR和框架残基的相互作用的模型化（以鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基）和序列对比（以鉴定在特定位置处的罕见框架残基），鉴定这些框架置换(参见，例如，Queen等人, 美国专利号5,585,089; Riechmann等人, Nature 332:323 (1988)，它们通过引用整体并入本文)。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的，并且是本领域技术人员熟知的。可得到显示和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些显示的检查，允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白的结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有和引入序列选择FR残基并组合，从而实现期望的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接地并且最显著地涉入影响抗原结合。使用本领域已知的多种技术，诸如但不限于在以下文献中描述的那些，可以将抗体人源化：Jones等人, Nature 321:522 (1986); Verhoeyen等人, Science 239:1534 (1988)), Sims等人, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta等人, J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka等人, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. 等人, PNAS 91:969-973 (1994); PCT公开WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400，美国专利号5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567，每篇完整地通过引用并入本文，包括其中引用的参考文献。

亲本单克隆抗体可以选自多种能够结合如本领域众所周知的特定靶标（包括HCV蛋白，或除了HCV蛋白以外）的单克隆抗体。

亲本单克隆抗体也可以选自多种被批准使用的、在临床试验中的、或在临床应用开发中的治疗性抗体，特别是可能适用于治疗HCV感染的症状或治疗与HCV感染共存的病症或疾病（诸如癌症，特别包括肝细胞癌）的那些。

如贯穿本发明指出的，可能合乎需要的是，标记本发明的抗体。经标记的抗体(或从本发明的抗体之一衍生出的结合蛋白)包含衍生化的或与另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白)连接的抗体。例如，通过将其在功能上连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它分子实体（诸如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双体)、可检测的试剂、细胞毒性剂、药学试剂和/或可以介导结合蛋白与另一种分子(诸如链霉亲和素核心区域或聚组氨酸标签)的结合的蛋白或肽），可以将单克隆抗体衍生化。

可以用于将单克隆抗体衍生化的有用可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。所述抗体也可以用可检测的酶（诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等）衍生化。当用可检测的酶衍生化时，通过加入所述酶用于产生可检测的反应产物的另外试剂来实现检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入会导致可检测的有色的反应产物。本发明的单克隆抗体也可以用生物素衍生化，并通过抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的间接测量来检测，或反之亦然。

尽管本发明的组合物已经表现出在用于确定HCV核心抗原在试验样品中的存在的诊断应用中的用途，预见到，本发明的组合物也可以用于诊断或治疗目的用于在体内施用给哺乳动物。因而，在某些实施方案中，本发明提供了药物和诊断组合物，其包含一种或多种本文中公开的抗-HCV核心结合蛋白作为活性成分。药物或诊断组合物可以包含本文描述的任何单克隆抗体或它们的任意组合和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。通常，通过将活性成分与载体、稀释剂和/或赋形剂组合来制备药物和诊断组合物。

包含如本文中所述的结合蛋白的组合物被用于、但不限于诊断、检测或监测障碍，但是也可以用于预防、治疗、控制或改善障碍或其一种或多种症状和/或用在研究中。在一个具体实施方案中，组合物包含一种或多种本发明的单克隆抗体或从一种或多种本发明的单克隆抗体衍生出的结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种如本文中所述的单克隆抗体或从其衍生出的结合蛋白以及一种或多种除了如本文中所述的单克隆抗体或从其衍生出的结合蛋白以外的诊断剂、预防剂或治疗剂。

免疫测定

根据本公开内容的免疫测定包括在本领域中通常公知的这样的技术，包括例如放射免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、免疫沉淀等。本领域已知的用于ELISA的标准技术是众所周知的，且描述在例如Methods in Immunodiagnosis, 第2版, Rose和Bigazzi,编, John Wiley and Sons, 1980和Campbell等人, Methods of Immunology, W. A. Benjamin, Inc., 1964中，它们二者通过引用并入本文。免疫测定可以是如本领域中描述的直接的、间接的、竞争性的或非竞争性的免疫测定(Oellerich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. BioChem 22:895 904)。适合用于这样的检测测定的生物样品包括、但不限于血液、血浆、血清、肝、唾液、淋巴细胞或其它单核细胞。

在优选的实施方案中，将本文描述的抗体用在对HCV检测特异性的免疫测定中。例子包括、但不限于夹心免疫测定、放射性同位素检测(放射免疫测定(RIA))和酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA) (例如，Quantikine ELISA测定, R&D Systems, Minneapolis, Minn.))、竞争性的抑制免疫测定(例如，正向和反向)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶多种免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均匀化学发光测定等。在基于SELDI的免疫测定中，将特异性地结合目标分析物诸如HCV核心(或其片段)的捕获试剂连接至质谱法探针（诸如预活化的蛋白芯片阵列）的表面。然后将分析物(或其片段)特异性地捕获在生物芯片上，并通过质谱法检测捕获的分析物(或其片段)。可替换地，可以将分析物(或其片段)从捕获试剂洗脱，并通过传统的MALDI (基质辅助的激光解吸/电离)或通过SELDI进行检测。化学发光微粒免疫测定，特别是采用ARCHITECT®自动化分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)的化学发光微粒免疫测定，是优选的免疫测定的一个例子。

用于确定人丙型肝炎病毒在样品中的存在或量的免疫测定可以包括，例如，将HCV核心蛋白结合蛋白与样品组合足以使所述结合蛋白结合可能存在于样品中的任何人丙型肝炎病毒的时间，并基于所述结合蛋白与人丙型肝炎病毒核心蛋白的特异性结合来确定在样品中存在的人丙型肝炎病毒的存在或量。本公开内容也包括用于检测人HCV在样品中的存在或不存在的免疫测定装置，其中所述装置包含固定化在固体支持物上的本文描述的任意抗体。可以以试剂盒的形式制备抗-HCV核心抗体及其任意类似物，所述试剂盒单独地或与其它试剂（诸如第二抗体）组合地用于免疫测定中。

本领域众所周知的用于收集、操作和加工尿、血液、血清和血浆和其它体液的方法被用在本公开内容的实践中，例如，当将本发明的抗-HCV核心抗体用作免疫诊断试剂和/或用在分析物免疫测定试剂盒中时。所述试验样品可以包含除了HCV核心抗原以外的其它部分，包括例如，抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白、肽、多肽、寡核苷酸和/或多核苷酸。例如，所述样品可以是得自受试者的全血样品。在如本文中所述的免疫测定之前，可能必须或期望例如用预处理试剂处理试验样品，特别是全血。即使在预处理不是必需的情况下(例如，大多数尿样品)，可以任选地进行预处理(例如，作为商业平台上的方案的组成部分)。

预处理试剂可以是适合与本公开内容的免疫测定和试剂盒一起使用的任何试剂。所述预处理任选地包含：(a)一种或多种溶剂(例如，甲醇和乙二醇)和任选的盐，(b)一种或多种溶剂和盐、和任选的去污剂，(c)去污剂，或(d)去污剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，且这样的预处理可以如以前已经描述的那样使用，例如，用于在Abbott TDx、AxSYM®和ARCHITECT®分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)上的测定，如在文献中所述(参见，例如，Yatscoff等人, Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), 和Wallemacq等人, Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999))，和/或如商购可得的。另外，可以如在以下文献中所述进行预处理：美国专利号5,135,875, 欧洲专利公开号0 471 293, 2006年12月29日提交的美国临时专利申请60/878,017，和美国专利申请公开号2008/0020401 (针对它关于预处理的教导，通过引用整体并入)。

由于预处理试剂的应用，通过破坏试验样品中的预形成的/预存在的免疫复合物或病毒颗粒而使得测定更敏感。在这样的预处理的试验样品中，使样品中的抗-HCV核心抗体与抗原分离，且然后使用本发明的单克隆抗体针对HCV核心抗原的存在来试验样品中的剩余抗原。因此对试验样品中的HCV核心抗原进行抗体捕获步骤以捕获在试验样品中存在的任何HCV抗原。

在一些其它的实施方案中，预处理的应用不需要这样的分离步骤。使试验样品和预处理试剂的整个混合物与对靶向的抗原(在该情况下，HCV核心抗原，或更具体地，HCV核心抗原脂质结合结构域)特异性的抗体接触。在用第一抗体（其用于捕获HCV抗原）捕获之前或过程中，通常将用于这样的测定的预处理试剂在预处理的试验样品混合物中稀释。尽管有这样的稀释，特定量的预处理试剂仍然可能在捕获过程中存在于试验样品混合物中。捕获试剂可以是本发明的抗体，可替换地，它可以是另一种抗-HCV核心抗原抗体，或实际上它可以是针对HCV的非核心蛋白抗原的抗体(例如，针对HCV的包膜蛋白、E1或E2或其它部分的抗体)。

在一种测定形式中，在从受试者得到试验样品以后，制备第一混合物。所述混合物含有要评估给定抗原的存在(例如，在该情况下，HCV核心抗原的存在)的试验样品和第一特异性结合配偶体(通常是识别HCV表位的抗体)，其中所述第一特异性结合配偶体和所述试验样品中含有的任何HCV抗原形成第一抗体-抗原复合物。加入所述试验样品和所述第一特异性结合配偶体以形成混合物的次序不是至关重要的。所述第一特异性结合配偶体可以固定化在固相上，但是在替代实施方案中，所述第一特异性结合配偶体可以是在溶液相中。在免疫测定中使用的固相(用于第一特异性结合配偶体，和任选地，第二特异性结合配偶体)可以是本领域已知的任意固相，例如，但不限于，磁性颗粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘和芯片。

所述的方法适合用于利用微粒技术的系统，包括自动化的和半自动化的系统，其中固相包含微粒。这样的系统包括在未决的美国专利申请系列号425,651和425,643（分别对应于公开的EPO申请号EP 0 425 633和EP 0 424 634，它们通过引用并入本文）中描述的那些。

在形成含有第一特异性结合配偶体-分析物复合物的混合物以后，使用本领域已知的任何技术从复合物除去任何未结合的分析物。例如，可以通过洗涤除去未结合的分析物。但是，理想地，所述第一特异性结合配偶体以超过存在于试验样品中的任何分析物的量存在，以便优化第一特异性结合配偶体对存在于试验样品中的分析物的最大结合。

除去未结合的分析物以后，将第二特异性结合配偶体加入混合物中以形成第一特异性结合配偶体-分析物-第二特异性结合配偶体复合物。所述第二特异性结合配偶体优选地是结合分析物上的表位的抗-分析物抗体，所述表位不同于第一特异性结合配偶体结合的分析物上的表位。简单地作为例子，假定测定是用于检测HCV核心抗原，使用对HCV核心抗原的DNA结合结构域特异性的第一“捕获”抗体(可替换地，第一抗体是对HCV核心抗原脂质结合结构域特异性的抗HCV核心抗体，诸如本文描述的抗体)，只要该第一捕获抗体从样品捕获HCV核心蛋白，第二抗-核心抗原抗体结合HCV核心抗原的脂质结合结构域(其中第一抗体结合DNA结合结构域，或可替换地，其中第一抗体是对HCV核心抗原脂质结合结构域特异性的第一抗体，第二抗体可以是对HCV核心抗原的DNA结合结构域特异性的)。优选地，在这样的实施方案中，第二特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记物标记或者含有如上所述的可检测标记物标记，以便促进[捕获抗体-抗原-第二抗体]复合物的检测。

可以使用本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，所述可检测标记可以是放射性标记(诸如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P)、酶标记(诸如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(诸如吖啶酯、硫代酸酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记物(诸如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温标记物或免疫聚合酶链式反应标记物。对标记物、标记方法和标记检测的介绍，参见：Polak和Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 第2版, Springer Verlag, N.Y. (1997), 和Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)，它是由Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg出版的组合手册和目录。荧光标记物可以用在FPIA中(参见，例如，美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，它们特此通过引用整体并入)。吖啶鎓化合物可以在均相化学发光测定中用作可检测标记(参见，例如，Adamczyk等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006)；Adamczyk等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004)；Adamczyk等人, Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004)；和Adamczyk等人, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003))。

一种优选的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。用于制备吖啶鎓9-甲酰胺的方法描述在Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk等人, J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk等人, Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk等人, Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk等人, Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly等人, In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. 编; CRC Press: Boca Raton, 第77-105页(2002); Adamczyk等人, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)；和美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699 (针对它关于相同内容的教导，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。

另一种优选的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酸芳基酯。式II的吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的一个例子是10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶鎓氟代磺酸盐(可得自Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich.)。制备吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的方法描述McCapra等人, Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965)；Razavi等人, Luminescence 15: 245-249 (2000)；Razavi等人, Luminescence 15: 239-244 (2000)；和美国专利号5,241,070 (针对它关于相同内容的教导，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。这样的吖啶鎓-9-甲酸芳基酯是至少一种氧化酶在分析物的氧化中产生的过氧化氢在信号的强度和/或信号的迅速方面的有效化学发光指示剂。吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的化学发光发射的进程快速地（即，在1秒以下）完成，而吖啶鎓-9-甲酰胺化学发光发射延长超过2秒。但是，吖啶鎓-9-甲酸芳基酯在有蛋白存在下丧失它的化学发光性能。因此，它的应用要求在信号产生和检测过程中不存在蛋白。用于分离或除去样品中的蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的，且包括、但不限于超滤、萃取、沉淀、透析、色谱法和/或消化(参见，例如，Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003))。从试验样品除去或分离的蛋白的量可以是约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%。关于吖啶鎓-9-甲酸芳基酯和它的用途的其它细节阐述在美国专利申请系列号11/697,835，其于2007年4月9日提交，且于2008年10月9日公开为美国专利申请公开号2008/0248493。可以将吖啶鎓-9-甲酸芳基酯溶解在任意合适的溶剂中，诸如脱气的无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或胆酸钠水溶液。

根据在Adamczyk等人, Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006)中描述的方法，可以进行化学发光测定。尽管可以使用任意合适的测定形式，微量培养板化学光度计(Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, Tenn.)能够快速地测定多个小体积的样品。使用96-孔黑色聚苯乙烯微量培养板(Costar #3792)，可以给化学光度计配备多个试剂注射器。可以将每个样品加入单独的孔中，随后同时/相继加入如通过采用的测定的类型确定的其它试剂。理想地，避免采用吖啶鎓芳基酯的中性或碱性溶液中的假碱的形成，诸如通过酸化。然后逐孔记录化学发光应答。在这点上，记录化学发光应答的时间部分地取决于采用的试剂和特定吖啶鎓的加入之间的延迟。

加入试验样品和特异性结合配偶体以形成化学发光测定混合物的次序不是至关重要的。如果第一特异性结合配偶体用化学发光试剂（诸如吖啶鎓化合物）可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物复合物。可替换地，如果使用第二特异性结合配偶体且第二特异性结合配偶体用化学发光试剂（诸如吖啶鎓化合物）可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物-第二特异性结合配偶体复合物。使用本领域已知的任何技术，诸如洗涤，可以从混合物除去任何未结合的特异性结合配偶体，无论是标记的还是未标记的。

在加入上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后，可以在混合物中原位产生过氧化氢，或者可以向混合物提供或供应过氧化氢(例如过氧化氢的来源是一种或多种已知含有过氧化氢的缓冲液或其它溶液)。可以以许多方式(诸如本领域技术人员将会明白的方式)原位产生过氧化氢。

在同时或随后向样品加入至少一种碱性溶液之后，产生指示分析物的存在的可检测信号，即化学发光信号。所述碱性溶液含有至少一种碱且具有大于或等于10、优选地大于或等于12的pH。碱性溶液的例子包括、但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。加入样品中的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于所用碱性溶液的浓度，本领域技术人员可以容易地确定加入样品中的碱性溶液的量。

使用本领域技术人员已知的常规技术，可以检测产生的化学发光信号。基于产生的信号的强度，可以定量样品中的分析物的量。具体地，样品中的分析物的量与产生的信号的强度成比例。通过将产生的光的量与分析物的标准曲线对比或通过与参比标准对比，可以定量存在的分析物的量。通过质谱法、重量分析方法和本领域已知的其它技术，使用分析物的已知浓度的系列稀释液或溶液，可以产生标准曲线。尽管以上描述着重于使用吖啶鎓化合物作为化学发光试剂，但是本领域普通技术人员可以容易地改进该描述以使用其它化学发光试剂。

通常可以使用本领域已知的任何形式(例如，但不限于，夹心形式)进行分析物免疫测定。具体地，在一种免疫测定形式中，采用至少两种抗体来捕获和定量样品中的分析物(诸如人分析物)或其片段。更具体地，优选地，至少两种抗体结合分析物(或其片段)上的不同表位，从而形成免疫复合物，其被称作“夹心”。通常，在免疫测定中，可以使用一种或多种抗体来捕获试验样品中的分析物(或其片段)(这些抗体常被称作“捕获”抗体)，且可以使用一种或多种抗体使可检测的(即，可计量的)标记物结合夹心(这些抗体常被称作“检测抗体”或“缀合物”)。因此，在夹心免疫测定形式的背景下，本发明的抗-HCV核心抗体可以用作捕获抗体、检测抗体或两者。例如，一种具有可以结合分析物上的第一表位(例如，HCV核心抗原的脂质结合结构域)的结构域的抗-HCV核心抗体可以用作捕获抗体，和/或另一种具有可以结合第二表位(例如，HCV核心抗原的DNA结合结构域)的结构域的抗-HCV核心抗体可以用作检测抗体，或反之亦然。可替换地，一种具有可以结合HCV核心抗原上的表位的第一结构域的抗体和结合不同HCV抗原上的表位的第二抗体可以用作捕获抗体和/或检测抗体以检测和任选地定量两种或更多种分析物。

一般而言，可以使针对(例如疑似含有)分析物进行试验的样品与至少一种捕获抗体(或多种捕获抗体)和至少一种检测抗体(其可以是第二检测抗体或第三检测抗体或甚至连续编号的抗体，例如如在捕获抗体和/或检测抗体包含多种抗体的情况下)同时或依次且以任何顺序接触。例如，可以首先使试验样品与至少一种捕获抗体接触，且然后(依次)与至少一种检测抗体接触。可替换地，可以首先使试验样品与至少一种检测抗体接触，且然后(依次)与至少一种捕获抗体接触。在另一个替代方案中，可以使试验样品同时与捕获抗体和检测抗体接触。

在夹心测定形式中，首先在允许形成第一抗体/分析物复合物的条件下使疑似含有分析物(或其片段)的样品与至少一种第一捕获抗体接触。如果使用超过一种捕获抗体，那么形成包含两种或更多种捕获抗体的第一捕获抗体/分析物复合物。在一种夹心测定中，以试验样品中预期的分析物(或其片段)的最大量的摩尔过量量使用抗体，即，优选地，至少一种捕获抗体。例如，可以使用约5 μg至约1 mg抗体/mL缓冲液(例如，微粒包被缓冲液)。

竞争性抑制免疫测定（其经常用于测量小分析物，因为需要仅一种抗体实现的结合）包括依次和经典形式。在一个依次竞争性抑制免疫测定中，将针对目标分析物的捕获抗体包被在微孔滴定板的孔或其它固体支持物上。当将含有目标分析物的样品加入孔中时，目标分析物结合捕获抗体。在洗涤后，将已知量的标记的(例如，用生物素或辣根过氧化物酶(HRP))的分析物加入孔中。酶标记的底物是产生信号所必需的。HRP的合适底物的一个例子是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在洗涤后，测量由标记的分析物产生的信号，且其与样品中的分析物的量成反比。在一个经典的竞争性抑制免疫测定中，将针对目标分析物的抗体包被在固体支持物(例如微孔滴定板的孔)上。但是，不同于依次竞争性抑制免疫测定，同时将样品和标记的分析物加入孔中。样品中的任何分析物与标记的分析物竞争对捕获抗体的结合。在洗涤后，测量由标记的分析物产生的信号，且其与样品中分析物的量成反比。

任选地，在使试验样品与至少一种捕获抗体(例如，第一捕获抗体)接触之前，所述至少一种捕获抗体可以结合至固体支持物，这会促进第一抗体/分析物(或其片段)复合物从试验样品的分离。捕获抗体所结合的基质可以是促进捕获抗体-分析物复合物从样品分离的任意合适的固体支持物或固相。

固相或支持物的例子是本领域技术人员众所周知的，且包括板(诸如微孔滴定板)的孔、试管、多孔凝胶(例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶)、聚合物薄膜(例如，聚丙烯酰胺)、珠子(例如，聚苯乙烯珠子或磁珠)、滤纸/膜(例如，硝酸纤维素或尼龙)的条带、微粒(例如，胶乳颗粒、可磁化的微粒(例如，具有氧化铁或氧化铬核心和均聚或杂聚涂层以及约1-10微米半径的微粒))。基质可以包含合适的多孔材料，其具有结合抗原的合适表面亲和力和允许检测抗体到达的足够孔隙率。微孔材料一般是优选的，尽管可以使用水合状态的凝胶状材料。这样的多孔基质优选地呈具有约0.01至约0.5 mm、优选约0.1 mm的厚度的薄片形式。尽管孔径可能有相当大的变化，但是优选地孔径是约0.025至约15微米，更优选约0.15至约15微米。这样的基质的表面可以通过造成抗体与基质共价键合的化学过程来活化。抗原或抗体与基质发生不可逆结合，通常通过疏水力实现的吸附；可替换地，化学偶联剂或其它方式可以用于使抗体与基质共价结合，前提条件是，这样的结合不会干扰抗体的结合分析物的能力。可替换地，抗体可以与微粒结合，所述微粒以前已经用链霉亲和素(例如，DYNAL®Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, Calif.)或生物素(例如，使用Power-Bind™-SA-MP链霉亲和素包被的微粒(Seradyn, Indianapolis, Ind.))或抗-物种-特异性的单克隆抗体包被。如果必要的话，可以将基质衍生化以允许与抗体上的不同官能团的反应性。这样的衍生化需要使用某些偶联剂，其例子包括、但不限于马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。如果需要的话，可以将一种或多种捕获试剂（诸如抗体(或其片段)，其中的每一种对分析物是特异性的）在不同的物理位置或可到达的位置连接至固相(例如，诸如以生物芯片构型(参见，例如，美国专利号6,225,047；国际专利申请公开号WO 99/51773；美国专利号6,329,209；国际专利申请公开号WO 00/56934，和美国专利号5,242,828)。如果捕获试剂连接至作为固体支持物的质谱法探针，那么通过激光解吸电离质谱法可以检测与探针结合的分析物的量。可替换地，单个柱可以用不同珠子填充，所述珠子用一种或多种捕获试剂衍生化，由此将分析物捕获在单个位置中(参见抗体衍生化的基于珠子的技术，例如Luminex (Austin, Tex.)的xMAP技术)。

在使针对分析物(或其片段)测定的试验样品与至少一种捕获抗体(例如，第一捕获抗体)接触之后，将混合物温育以便允许形成第一抗体(或多种抗体)-分析物(或其片段)复合物。可以在约4.5至约10.0的pH在约2℃至约45℃的温度进行温育，且持续至少约一(1)分钟至约十八(18)小时、优选约1分钟至约24分钟、最优选约4分钟至约18分钟的时段。本文描述的免疫测定可以在一个步骤中(意味着试验样品、至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体都依次或同时加入反应容器中)或在超过一个步骤(诸如两个步骤、三个步骤等)中进行。

在形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物复合物之后，然后使所述复合物在允许形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物/第二检测抗体复合物的条件下与至少一种检测抗体接触。虽然为了清楚起见而冠以“第二”抗体(例如，第二检测抗体)，但是实际上，在将多种抗体用于捕获和/或检测的情况下，至少一种检测抗体可以是在免疫测定中使用的第二抗体、第三抗体、第四抗体等。如果使捕获抗体/分析物复合物与超过一种检测抗体接触，那么形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)/(多种)检测抗体复合物。与捕获抗体(例如，第一捕获抗体)一样，当使至少一种(例如，第二和任何随后的)检测抗体与捕获抗体/分析物(或其片段)复合物接触时，需要在与上述那些类似的条件下温育一段时间以形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物。优选地，至少一种检测抗体含有可检测标记物。可以在形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物之前、同时或之后，使所述可检测标记物结合至少一种检测抗体(例如，第二检测抗体)。可以使用本领域已知的任何可检测标记物(参见上面的讨论)。

可检测标记物可以直接地或通过偶联剂结合抗体。可使用的偶联剂的一个例子是EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺, 盐酸盐)，其可商购得自Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo。可使用的其它偶联剂是本领域已知的。用于使可检测标记物结合抗体的方法是本领域已知的。另外，可以购买或合成许多可检测标记物，其已含有促进所述可检测标记物与抗体的偶联的端基，诸如CPSP-吖啶酯(即，9-[N-甲苯磺酰基-N-(3-羧基丙基)]-10-(3-磺丙基)吖啶鎓羧酰胺)或SP SP-吖啶酯(即，N10-(3-磺丙基)-N-(3-磺丙基)-吖啶鎓-9-甲酰胺)。

(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物可以、但不一定在标记物的定量之前与试验样品的其余部分分离。例如，如果使至少一种捕获抗体(例如，第一捕获抗体)结合固体支持物(诸如孔或珠子)，那么可以通过移除流体(试验样品的流体)免于与固体支持物接触来实现分离。可替换地，如果使至少第一捕获抗体结合固体支持物，那么它可以同时与含有分析物的样品和至少一种第二检测抗体接触以形成第一(多种)抗体/分析物/第二(多种)抗体复合物，随后移除流体(试验样品)免于与固体支持物接触。如果至少一种第一捕获抗体没有结合固体支持物，那么为了定量标记物的量，不必从试验样品移除(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物。

在形成标记的捕获抗体/分析物/检测抗体复合物(例如，第一捕获抗体/分析物/第二检测抗体复合物)之后，使用本领域已知的技术定量所述复合物中标记物的量。例如，若使用酶标记物，则使经标记的复合物与所述标记物的底物反应，所述底物会产生可计量的反应诸如颜色的显影。如果标记物是放射性标记，那么使用适当方式(诸如闪烁计数器)定量标记物。如果标记物是荧光标记物，那么如下定量标记物：用一种颜色的光(其称为“激发波长”)刺激标记物，并检测所述标记物响应于所述刺激而发射的另一种颜色(其称为“发射波长”)。如果标记物是化学发光标记物，那么通过目视或通过使用光度计、x-射线胶片、高速照相胶片、CCD照相机等检测发射的光来定量标记物。一旦已经定量复合物中标记物的量，就通过适当方式（诸如通过使用已使用已知浓度的分析物或其片段的系列稀释物产生的标准曲线）来确定试验样品中的分析物或其片段的浓度。除了使用分析物或其片段的系列稀释物以外，通过比重测定法、通过质谱法和通过本领域已知的其它技术可以产生标准曲线。

在采用ARCHITECT®分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应当是约6.0±0.2，微粒包被缓冲液应当维持在约室温(即，在约17至约27℃)，微粒包被缓冲液pH应当是约6.5±0.2，且微粒稀释剂pH应当是约7.8±0.2。固体优选地小于约0.2%，诸如小于约0.15%，小于约0.14%，小于约0.13%，小于约0.12%，或小于约0.11%，诸如约0.10%。

FPIA是基于竞争性结合免疫测定原理。当被线性偏振光激发时，荧光地标记的化合物将发射具有与它的旋转速率成反比的偏振度的荧光。当荧光地标记的示踪剂-抗体复合物被线性偏振光激发时，因为荧光团在吸收光的时间与发射光的时间之间的旋转受限制，所以发射的光保持高度偏振。当“游离的”示踪剂化合物(即没有结合抗体的化合物)被线性偏振光激发时，它的旋转比在竞争性结合免疫测定中产生的相应示踪剂-抗体缀合物快得多。因为不存在需要特殊处理和处置的放射性物质，所以FPIA比RIA有利。另外，FPIA是可以容易地和快速地执行的均质测定。

考虑到以上内容，提供了一种确定试验样品中的HCV核心(或其片段)的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过以下测定法来测定试验样品的HCV核心抗原(或其片段)：(i)采用(i’)抗体、可以结合分析物的抗体片段、可以结合分析物的抗体变体、可以结合分析物的抗体变体片段、或可以结合HCV核心抗原的DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)中的至少一种，和(ii’)至少一种可检测标记物，和(ii)包括将作为试验样品中的HCV核心抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的可检测标记物产生的信号与作为对照物或校准物中的HCV核心抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的所产生的信号进行对比。校准物任选地是一系列校准物的一部分，其中每种校准物与其它校准物的差别在于分析物的浓度。

所述方法可以包括(i)使试验样品与HCV核心(或其片段)的至少一种第一特异性结合配偶体接触，所述第一特异性结合配偶体选自本发明的抗体、这样的可以结合HCV核心抗原的抗体的片段、可以结合HCV核心抗原的抗体的变体、可以结合HCV核心抗原的抗体变体的片段、或可以结合HCV核心抗原的DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)，从而形成第一特异性结合配偶体/HCV核心抗原(或其片段)复合物，(ii)使所述第一特异性结合配偶体/HCV核心抗原(或其片段)复合物与HCV核心抗原(或其片段)的至少一种第二特异性结合配偶体接触，所述第二特异性结合配偶体选自可检测地标记的抗-HCV核心抗体、可检测地标记的可以结合HCV核心抗原的抗-HCV核心抗体的片段、可检测地标记的可以结合HCV核心抗原的抗-HCV核心抗体的变体、可检测地标记的可以结合HCV核心抗原的抗-HCV核心抗体的变体片段、和可检测地标记的DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)，从而形成第一特异性结合配偶体/HCV核心抗原(或其片段)/第二特异性结合配偶体复合物，和(iii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/HCV核心抗原(或其片段)/第二特异性结合配偶体复合物中的可检测标记物产生的信号，确定试验样品中的HCV核心抗原的存在、量或浓度。

可替换地，所述方法可以包括，使试验样品与HCV核心(或其片段)的至少一种第一特异性结合配偶体接触，所述第一特异性结合配偶体选自抗体、可以结合HCV核心的抗体片段、可以结合HCV核心的抗体变体、可以结合HCV核心的抗体变体的片段、和DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)，并同时或依次以任一种次序，使试验样品与至少一种第二特异性结合配偶体接触，所述第二特异性结合配偶体可以与HCV核心(或其片段)竞争对至少一种第一特异性结合配偶体的结合且其选自可检测地标记的HCV核心、可检测地标记的可以结合第一特异性结合配偶体的HCV核心的片段、可检测地标记的可以结合第一特异性结合配偶体的HCV核心的变体、和可检测地标记的可以结合第一特异性结合配偶体的HCV核心的变体的片段。存在于试验样品中的任何HCV核心(或其片段)和至少一种第二特异性结合配偶体彼此竞争以分别形成第一特异性结合配偶体/HCV核心(或其片段)复合物和第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物。所述方法进一步包括，通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物中的可检测标记物产生的信号，确定试验样品中HCV核心的存在、量或浓度，其中由第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物中的可检测标记物产生的信号与试验样品中HCV核心的量或浓度成反比。

以上方法可以进一步包括，诊断、预测或评估从其得到试验样品的患者的治疗性/预防性处理的效力。如果所述方法进一步包括评估从其得到试验样品的患者的治疗性/预防性处理的效力，所述方法任选地进一步包括根据需要改变患者的治疗性/预防性处理以提高效力。所述方法可以适合用于自动化的系统或半自动化的系统中。

关于测定方法(和用于此的试剂盒)，可能采用商购可得的抗-HCV核心抗体或如文献中所述的用于生产抗-HCV核心的方法。各种抗体的商业供应商包括、但不限于Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Calif.)、GenWay Biotech, Inc. (San Diego, Calif.)和R&D Systems (RDS; Minneapolis, Minn.)。

通常，可以将预定水平用作基准，相对于它来评估在测定试验样品的HCV核心或其片段后获得的结果，例如，用于检测疾病或疾病的风险。通常，在进行这样的对比时，如下获得预定水平：以足够次数且在适当条件下运行特定测定，使得可得到HCV核心存在、量或浓度与疾病、障碍或病症的特定阶段或终点或与特定临床标志的联系或关联。通常，用参照受试者(或受试者群体)的测定来获得预定水平。所测量的HCV核心可以包括其片段、其降解产物和/或其酶切割产物。

具体地，关于如用于监测HCV疾病进展和/或治疗的预定水平，分析物或其片段的量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或“有利变化的”)或“不利的”(或“不利变化的”)。“升高”或“增加”表示试验样品中的量或浓度高于典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)，或高于另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)。术语“降低”或“减少”表示试验样品中的量或浓度低于典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)或低于另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)。术语“改变”表示样品中的量或浓度与典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)相比或与另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)相比有所改变(增加或减小)。

根据标准实践来确定HCV核心抗原的典型的或正常的水平或范围。因为HCV核心的水平在某些情况下是非常低的，所以当与典型的或正常的水平或范围或参比水平或范围相比存在不可通过实验误差或样品偏差解释的任何净变化时，可以视为已经发生所谓的改变的水平或变化。因此，在特定样品中测量的水平将与在得自所谓正常受试者的类似样品中确定的水平或水平范围进行对比。在该背景下，“正常受试者”是例如不具有可检测的疾病的个体，且“正常”(有时称为“对照”)患者或群体分别是例如没有表现出可检测疾病的患者或群体。此外，鉴于HCV核心通常不以高水平见于大多数人群体中，所以“正常受试者”可以视为不具有HCV核心的量或浓度的大幅可检测的增加或升高的个体，且“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是没有表现出HCV核心的量或浓度的大幅可检测的增加或升高的患者或群体。“表观正常受试者”是其中尚未评估或当前正在评估HCV核心的受试者。当HCV核心通常不可检测(例如正常水平是零，或在正常群体的约25至约75%的范围内)但在试验样品中被检测到时，以及当HCV核心以高于正常水平存在于试验样品中时，称作HCV核心的水平“升高”。因而，除了别的以外，本公开内容提供了一种筛选具有特定疾病、障碍或病症或处于具有特定疾病、障碍或病症的风险中的受试者的方法。所述测定方法也可以涉及测定其它标记物等。

因此，本文所述的方法也可以用于确定受试者是否具有HCV疾病、障碍或病症或处于发展HCV疾病、障碍或病症的风险中。具体地，这样的方法可以包括以下步骤：

(a)确定得自受试者的试验样品中的HCV核心(或其片段)的浓度或量(例如，使用本文所述的方法或本领域已知的方法)；和

(b)将在步骤(a)中确定的HCV核心(或其片段)的浓度或量与预定水平进行对比，其中，如果在步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相对于预定水平而言是有利的，那么确定所述受试者不具有给定的疾病、障碍或病症或未处于给定的疾病、障碍或病症的风险中。但是，如果在步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相对于预定水平而言是不利的，那么确定受试者具有给定的疾病、障碍或病症或处于给定的疾病、障碍或病症的风险中。

另外，本文提供了一种监测受试者的疾病进展的方法。最优地，所述方法包括以下步骤：

(a)确定得自受试者的试验样品中的HCV核心的浓度或量；

(b)确定得自受试者的稍后试验样品中的HCV核心的浓度或量；和

(c)将如步骤(b)中确定的HCV核心的浓度或量与在步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量进行对比，其中如果在步骤(b)中确定的浓度或量当与在步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相比时未变化或是不利的，那么确定受试者的疾病已经持续、进展或恶化。通过对比，如果如在步骤(b)中确定的HCV核心的浓度或量当与如步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相比时是有利的，那么确定受试者的疾病已经停止、消退或改善。

任选地，所述方法进一步包括将如步骤(b)中确定的HCV核心的浓度或量与例如预定水平进行对比。进一步，任选地，如果所述对比表明如步骤(b)中确定的HCV核心的浓度或量例如相对于预定水平而言不利地改变，那么所述方法包括用一种或多种药物组合物治疗受试者一段时间。

在其它实施方案中，本文描述的用于监测HCV核心抗原的存在或水平的任何测定可以有利地与也确定HCV感染的其它测定组合。例如，本发明的任何HCV核心测定方法可以进一步包括，确定另一种HCV抗原或针对核心蛋白以外的抗原的HCV抗体的水平，包括、但不限于确定HCV核心、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b和NS5的存在。

另外，所述方法可以用于监测接受一种或多种药物组合物治疗的受试者的治疗。具体地，这样的方法涉及在已经给受试者施用一种或多种药物组合物之前提供得自受试者的第一试验样品。接着，确定得自受试者的第一试验样品中的HCV核心的浓度或量(例如，使用本文所述的或本领域已知的方法)。在确定HCV核心的浓度或量之后，任选地随后将HCV核心的浓度或量与预定水平进行对比。如果在第一试验样品中确定的HCV核心的浓度或量低于预定水平，那么不用一种或多种药物组合物治疗受试者。但是，如果在第一试验样品中确定的HCV核心的浓度或量高于预定水平，那么用一种或多种药物组合物治疗受试者一段时间。用一种或多种药物组合物治疗受试者的时间段可以由本领域技术人员确定(例如时间段可以为约七(7)天至约两年，优选约十四(14)天至约一(1)年)。

在用一种或多种药物组合物治疗的过程期间，随后从受试者获得第二试验样品和后续试验样品。试验样品的数目和从受试者获得所述试验样品的时间不是至关重要的。例如，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后七(7)天获得第二试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后两(2)周获得第三试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后三(3)周获得第四试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后四(4)周获得第五试验样品，等。

在从受试者获得每个第二试验样品或后续试验样品之后，确定第二试验样品或后续试验样品中的HCV核心的浓度或量(例如，使用本文所述的或本领域已知的方法)。随后将在第二试验样品和后续试验样品的每一个中确定的HCV核心的浓度或量与在第一试验样品(例如，最初任选地与预定水平对比的试验样品)中确定的HCV核心的浓度或量进行对比。如果如步骤(c)中确定的HCV核心的浓度或量当与如步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相比时是有利的，那么确定受试者的疾病已经停止、消退或改善，且应当继续给受试者施用步骤(b)的一种或多种药物组合物。但是，如果在步骤(c)中确定的浓度或量当与如步骤(a)中确定的HCV核心的浓度或量相比时未变化或是不利的，那么确定受试者的疾病已经持续、进展或恶化，且应当用较高浓度的在步骤(b)中施用给受试者的一种或多种药物组合物治疗受试者，或应当用不同于步骤(b)中施用给受试者的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者。具体地，可以用不同于受试者先前已经接受的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者以减少或降低受试者的HCV核心水平。

通常，对于其中可能进行重复试验的测定(例如，监测疾病进展和/或对治疗的反应)，在已经从受试者获得第一试验样品之后的时段获得第二试验样品或后续试验样品。具体地，得自受试者的第二试验样品可以在已经从受试者获得第一试验样品之后数分钟、数小时、数天、数周或数年获得。例如，可以在从受试者获得第一试验样品之后约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年的时段从受试者获得第二试验样品。

当用于监测疾病进展时，以上测定可以用于监测遭受急性病症的受试者的疾病进展。急性病症（也被称作危急护理病症）表示急性的、危及生命的疾病或其它涉及例如心血管系统或排泄系统的危急医学病症。通常，危急护理病症表示需要在基于医院的场合(包括、但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心或其它紧急护理场合)中的急性医学干预或由护理人员或其它基于场所的医护人员进行施用的那些病症。对于危急护理病症，通常在较短的时间范围内进行重复监测，即，数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，且初始测定同样通常在疾病或病症发作的较短时间范围(例如，约数分钟、数小时或数天)内进行。

测定也可以用于监测遭受慢性或非急性病症的受试者的疾病进展。非危急护理或非急性病症表示除了急性的、危及生命的疾病或涉及例如心血管系统和/或排泄系统的其它危急医学病症以外的病症。通常，非急性病症包括较长期或长持续时间的那些病症。对于非急性病症，通常在较长的时间范围内进行重复监测，例如，数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，且初始测定同样通常在疾病或病症发作的较长时间范围(例如，约数小时、数天、数月或数年)内进行。

此外，可以使用从受试者获得的第一试验样品执行上述测定，其中所述第一试验样品得自自一种来源，诸如尿、血清或血浆。任选地，可以随后使用从受试者获得的第二试验样品重复上述测定，其中所述第二试验样品得自自另一来源。例如，如果第一试验样品得自尿，那么第二试验样品可以得自血清或血浆。可以将得自使用第一试验样品和第二试验样品的测定的结果进行对比。所述对比可以用于评估受试者的疾病或病症的状态。

此外，本公开内容也涉及确定易感或遭受给定的疾病、障碍或病症的受试者是否将受益于治疗的方法。具体地，本公开内容涉及HCV核心伴侣诊断方法和产品。因此，如本文中所述的“监测受试者的疾病的治疗”的方法进一步最佳地也可以包括为疗法选择或鉴定候选者。

因而，在特定实施方案中，公开内容也提供了一种确定具有给定的疾病、障碍或病症或处于给定的疾病、障碍或病症的风险中的受试者是否是疗法的候选者的方法。通常，受试者是这样的受试者：其已经经历给定的疾病、障碍或病症的某种症状，或其实际上已经被诊断为具有给定的疾病、障碍或病症或处于给定的疾病、障碍或病症的风险中，和/或其表现出如本文中所述的不利浓度或量的HCV核心或其片段。

所述方法任选地包括如本文中所述的测定，其中在用一种或多种药物组合物(例如，特别是用与涉及HCV核心的作用机理有关的药物)、用免疫抑制疗法或通过免疫吸附疗法治疗受试者之前和之后评估HCV核心，或其中在这样的治疗之后评估HCV核心并将HCV核心的浓度或量与预定水平进行对比。在治疗后观察到的HCV核心的不利浓度或量证实所述受试者将不会受益于接受进一步或持续治疗，而在治疗后观察到的HCV核心的有利浓度或量证实所述受试者将受益于接受进一步或持续治疗。该证实有助于临床研究的管理和改进的患者护理的提供。

所述测定方法也可以用于鉴定改善给定的疾病、障碍或病症的化合物。例如，可以使表达HCV核心的细胞与候选化合物接触。可以使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的HCV核心的表达水平与对照细胞中的表达水平进行对比。

在另一种检测方法中，如本文中所述的每种结合蛋白可以用于检测固定的组织切片中的HCV抗原以及通过免疫组织化学分析检测固定的细胞。

另外，这些结合蛋白可以结合至与CNBr-活化的Sepharose类似的基质，并用于从细胞培养物或生物组织（诸如血液和肝脏）亲和纯化特定HCV蛋白。

如本文中所述的单克隆抗体还可以用于制备嵌合抗体用于治疗用途或其它类似的用途。另外，如贯穿本文讨论的，所述抗体也可以用于生产DVD-Ig分子。

可以个别地提供单克隆抗体或其片段以检测HCV核心抗原。预见到，本文中提供的单克隆抗体(及其片段)的组合也可以一起用作至少一种如本文中所述的抗-HCV核心抗体与针对其它HCV区域的抗体（各自具有不同的结合特异性）的混合物或“混合液”中的组分。因而，该混合液可以包括如本文中所述的针对HCV核心蛋白的单克隆抗体和针对HCV基因组的其它抗原决定簇的其它单克隆抗体。对于这些预见到的混合液而言有用的其它单克隆抗体的例子包括针对HCV C-100、HCV 33C、HCV核心、HCV NS5和/或HCV假定的ENV的那些，它们公开在例如标题为MONOCLONAL ANTIBODIES TO HEPATITIS C VIRUS AND METHOD FOR USING SAME的美国系列号07/610,175、标题为MONOCLONAL ANTIBODIES TO HCV 33C PROTEINS AND METHODS FOR USING SAME的美国系列号07/610,175、标题为MONOCLONAL ANTIBODIES TO PUTATIVE HCV ENVELOPE REGION AND METHODS FOR USING SAME的美国系列号07/648,475、标题为MONOCLONAL ANTIBODIES TO HCV CORE PROTEINS AND METHODS FOR USING SAME的美国系列号07/648,473、和标题为MONOCLONAL ANTIBODIES TO HCV NS5 PROTEIN AND METHODS FOR USING SAME的共同提交的专利申请、美国系列号07/748,563中，它们都享有共同的所有权，且通过引用并入本文。如本文中所述的单克隆抗体的该混合液可以以本文中详述的测定形式使用替代针对HCV核心的单克隆抗体，且因而能够检测HCV核心和其它HCV抗原。

可以用在测定形式中的多克隆抗体或其片段应当特异性地结合HCV核心或在测定中使用的其它HCV蛋白，诸如HCV C-100蛋白、HCV 33C蛋白、HCV ENV、HCV E2/NS1或HCV NS5蛋白。使用的多克隆抗体优选地具有哺乳动物起源；可以使用人、山羊、兔或绵羊抗-HCV多克隆抗体。最优选地，所述多克隆抗体是兔多克隆抗-HCV抗体。在测定中使用的多克隆抗体可以单独使用或作为多克隆抗体的混合液使用。由于在测定形式中使用的混合液包含具有不同HCV特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，它们可以用于HCV感染的诊断、评价和预后、以及用于研究HCV蛋白分化和特异性。

如贯穿本文在别处指出的，本文所述通过如本文中所述的方法可以试验的试验样品包括人和动物体液诸如全血、血清、血浆、脑脊液、尿、生物流体诸如细胞培养物上清液、固定的组织样本和固定的细胞（ceil）样本。

指示试剂包含产生信号的化合物(标记物)，其能够产生可测量的信号，所述信号可通过与HCV核心的特异性结合成员缀合(连接)的外部装置检测到。本文中使用的“特异性结合成员”是指特异性结合对的成员。也就是说，两个不同的分子，其中所述分子之一通过化学或物理方式特异性地结合第二个分子。除了是HCV核心的特异性结合对的抗体成员以外，指示试剂也可以是任何特异性结合对的成员，包括半抗原-抗-半抗原系统诸如生物素或抗-生物素、抗生物素蛋白或生物素、碳水化合物或凝集素、互补的核苷酸序列、效应物或受体分子、酶辅因子和酶、酶抑制剂或酶等。免疫反应性的特异性结合成员可以是抗体、抗原或抗体/抗原复合物，其能够结合HCV核心（如在夹心测定中）、捕获试剂（如在竞争性测定中）或辅助性的特异性结合成员（如在间接测定中）。

预见到的各种产生信号的化合物(标记物)包括色原体、催化剂诸如酶、发光的化合物诸如荧光素和罗丹明、化学发光的化合物诸如吖啶鎓、菲啶鎓和二氧杂环丁烷化合物、放射性元素和直接视觉标记物。酶的例子包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等。特定标记物的选择不是至关重要的，但是它将能够自身或与一种或多种另外的物质结合地产生信号。

用于免疫测定的扫描探针显微术(SPM)的应用也是如本文中所述的单克隆抗体可容易地适应的技术。在扫描探针显微术中，特别是在原子力显微术中，将捕获相（例如，如本文中所述的单克隆抗体中的至少一种）附着至固相，并利用扫描探针显微镜检测可能存在于固相表面上的抗原/抗体复合物。扫描隧道显微术的应用会消除对标记物的需要，所述标记物在许多免疫测定系统中通常必须使用以检测抗原/抗体复合物。这样的系统描述在未决的美国专利申请系列号662,147中，其享有共同的所有权且通过引用并入本文。

SPM的监测特异性结合反应的用途可以以许多方式进行。在一个实施方案中，将特异性结合配偶体的一个成员(HCV核心特异性的物质，其是如本文中所述的单克隆抗体)附着于适合扫描的表面。HCV核心特异性的物质的附着可以是按照本领域普通技术人员已知的方法吸附至试验片，所述试验片包含塑料或金属表面的固相。或者，可以利用特异性结合配偶体(HCV核心特异性的物质)与试验片的共价连接，所述试验片包含衍生化的塑料、金属、硅或玻璃的固相。共价连接方法是本领域技术人员已知的，且包括多种方式以将特异性结合配偶体不可逆地连接至试验片。如果试验片是硅或玻璃，在连接特异性结合配偶体之前必须活化表面。活化的硅烷化合物诸如三乙氧基氨基丙基硅烷(可得自Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)、三乙氧基乙烯基硅烷(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.)和(3-巯基-丙基)三甲氧基硅烷(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)可以用于分别引入反应基团诸如氨基-、乙烯基和巯基。这样的活化的表面可以用于直接连接结合配偶体(在氨基或巯基的情况下)，或可以使活化的表面进一步与接头诸如戊二醛、双(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、SPPD (3-[2-吡啶基二硫代]丙酸琥珀酰亚胺酯)、SMCC (4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)、SIAB ([4-碘乙酰基]氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)和SMPB (4-[1-马来酰亚胺基苯基]丁酸琥珀酰亚胺酯)反应以从表面分离结合配偶体。可以将乙烯基氧化以提供共价连接方式。它也可以用作多种聚合物（诸如聚丙烯酸）的聚合的锚，其可以提供特异性结合配偶体的多个附着点。可以使氨基表面与不同分子量的氧化葡聚糖反应以提供不同大小和能力的亲水接头。可氧化的葡聚糖的例子包括葡聚糖T-40 (分子量40,000道尔顿)、葡聚糖T-110 (分子量110,000道尔顿)、葡聚糖T-500 (分子量500,000道尔顿)、葡聚糖T-2M (分子量2,000,000道尔顿) (它们都可得自Pharmacia, Piscataway, N.J.),或蔗聚糖(分子量70,000道尔顿(可得自Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)。并且，通过使用未决的美国专利申请系列号150,278（1988年1月29日提交）和系列号375,029（1989年7月7日提交）（它们中的每一篇享有共同的所有权，且它们中的每一篇通过引用并入本文）描述的技术和化学试剂，可以使用聚电解质相互作用将特异性结合配偶体固定化在试验片的表面上。优选的附着方法是通过共价方式。在特异性结合成员的附着之后，可以用材料诸如血清、蛋白或其它封闭剂进一步处理表面以使非特异性结合最小化。还可以在制造场所或使用地点扫描表面以检验它对于测定目的的适合性。预期所述扫描过程不会改变试验片的特异性结合性能。

尽管本公开内容表达了使用固相的偏好，预见到，如本文中所述的单克隆抗体可以用在非固相测定系统中。这些测定系统是本领域技术人员已知的，且被视作是在本公开内容的范围内。

预见到，可以以含有一个或多个容器（诸如管形瓶或瓶子）的试剂盒的形式提供用于测定的试剂，其中每个容器含有在测定中采用的单独的试剂诸如单克隆抗体或单克隆抗体的混合液、检测试剂和洗涤试剂。

所述抗体还可以用作增强免疫应答的方式。可以以与抗体的其它治疗性施用所用的那些量类似的量施用抗体。例如，在其它病毒性疾病（诸如狂犬病、麻疹和乙型肝炎）的早期潜伏期中以0.02-0.1 ml/lb体重施用正常免疫球蛋白，以干扰病毒向细胞中的进入。因而，可以将可与HCV核心蛋白反应的抗体被动地单独地或与另一种抗病毒剂结合地施用给被HCV感染的宿主以增强免疫应答和/或抗病毒药的有效性。

当用作在动物中诱导抗-HCV病毒抗体的方式时，注射抗体的方式与用于疫苗接种目的相同，即肌肉内地、腹膜内地、皮下地等，在含有或不含佐剂的生理学上合适的稀释剂中呈有效浓度。可能需要一次或多次加强注射。

试剂盒

本文中也预见到试剂盒，其用于测定试验样品中HCV核心蛋白(或其片段)在试验样品中的存在、量或浓度。这样的试剂盒包含用于测定试验样品的HCV核心蛋白(或其片段)的至少一种组分和关于测定试验样品的HCV核心(或其片段)的说明书。用于测定试验样品的HCV核心(或其片段)的至少一种组分可以包括包含任选地固定化在固相上或能够固定化在固相上的抗-HCV核心蛋白单克隆抗体或抗-HCV核心蛋白DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)的组合物。

所述试剂盒可以包含用于通过免疫测定(例如，化学发光的微粒免疫测定)测定试验样品的HCV核心蛋白的至少一种组分和关于通过免疫测定(例如，化学发光的微粒免疫测定)测定试验样品的HCV核心的说明书。例如，所述试剂盒可以包含HCV核心的至少一种特异性结合配偶体，诸如抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体(或其可以结合HCV核心的片段、其可以结合HCV核心的变体、或可以结合HCV核心的变体片段)或抗-HCV核心DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)，其中的任一种可以被可检测地标记。可替换地或额外地，所述试剂盒可以包含可检测地标记的HCV核心(或其可以结合抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体或抗-HCV核心DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)的片段)，其可以与试验样品中的任何HCV核心竞争对抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体(或其可以结合HCV核心的片段、其可以结合HCV核心的变体、或可以结合HCV核心的变体片段)或抗-HCV核心DVD-Ig (或其片段、变体或变体片段)的结合，所述抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体或抗-HCV核心DVD-Ig中的任一种可以固定化在固体支持物上。所述试剂盒可以包含校准物或对照物，例如，分离的或纯化的HCV核心。所述试剂盒可以包含至少一个用于进行测定的容器(例如，试管、微孔滴定板或条带，其可以已经用例如第一特异性结合配偶体包被)和/或缓冲液（诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一种可以提供为浓缩的溶液）、可检测标记物(例如，酶标记物)的底物溶液或停止溶液。优选地，所述试剂盒包含执行测定必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。说明书可以呈纸形式或计算机可读形式，诸如磁盘、CD、DVD等。

任何抗体（诸如抗-HCV核心抗体或抗-HCV核心DVD-Ig）或示踪剂可以掺入如本文中所述的可检测标记物，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记物、生色团、化学发光标记物等，或试剂盒可以包括用于进行可检测标记的试剂。抗体、校准物和/或对照物可以提供在单独容器中或预分配至适当测定形式中，例如预分配至微孔滴定板中。

任选地，所述试剂盒包括质量控制组分(例如，灵敏度实验对象组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的，且描述在多种免疫诊断产品的插页上。灵敏度实验对象组成员任选地用于确立测定性能特征，且进一步任选地是免疫测定试剂盒试剂的完整性和测定的标准化的有用指标。

所述试剂盒还可以任选地包括进行诊断测定或促进质量控制评价所需的其它试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、酶底物、检测试剂等。用于分离和/或处理试验样品的其它组分(诸如缓冲液和溶液)(例如，预处理试剂)也可以包括在试剂盒中。所述试剂盒可以另外包括一种或多种其它对照物。试剂盒的一种或多种组分可以被低压冻干，在该情况下，试剂盒可以进一步包含适合用于重构低压冻干的组分的试剂。

试剂盒的各种组分任选地根据需要提供在合适的容器（例如微孔滴定板）中。试剂盒可以进一步包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于尿样品的容器或筒)。在适当的情况下，试剂盒任选地也可以含有反应容器、混合容器和促进试剂或试验样品的制备的其它组分。试剂盒也可以包括一种或多种用于辅助获得试验样品的仪器，诸如注射器、移液器、镊子、测量匙等。

如果可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物，那么所述试剂盒可以包含至少一种吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一种吖啶鎓-9-甲酸芳基酯或它们的任意组合。如果可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物，那么所述试剂盒也可以包含过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。如果需要的话，所述试剂盒可以含有固相，诸如磁性颗粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片。

所述试剂盒(或其组分)、以及通过如本文中所述的测定（诸如免疫测定）测定试验样品中的HCV核心的存在、量或浓度的方法可以改进以用于多种自动化的和半自动化的系统（包括其中固相包含微粒的那些）中，如在例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述，和如例如作为ARCHITECT®由Abbott Laboratories (Abbott Park, Ill.)商业销售的。

自动化的或半自动化的系统与非自动化的系统(例如，ELISA)相比的一些差异包括第一特异性结合配偶体(例如，抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体片段)或抗-HCV核心DVD-Ig (或其片段、其变体、或其变体片段)所附着的基质(任一种方式都可影响夹心形成和HCV核心反应性)、以及捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的时长和时机。尽管非自动化的形式（诸如ELISA）可能需要相对较长的与样品和捕获试剂一起的温育时间(例如，约2小时)，自动化的或半自动化的形式(例如，ARCHITECT®, Abbott Laboratories)可能具有相对较短的温育时间(例如，对于ARCHITECT®，大约18分钟)。类似地，尽管非自动化的形式（诸如ELISA）可能温育检测抗体（诸如缀合物试剂）相对较长的温育时间(例如，约2小时)，自动化的或半自动化的形式(例如，ARCHITECT®)可能具有相对较短的温育时间(例如，对于ARCHITECT®，大约4分钟)。

可以从Abbott Laboratories获得的其它平台包括、但不限于AxSYM®、IMx®(参见，例如，美国专利号5,294,404，其特此通过引用整体并入)、PRISM®、EIA (珠子)和Quantum™II、以及其它平台。另外，可以以其它形式采用所述测定、试剂盒和试剂盒组分，例如，在电化学或其它手提式或照护现场测定系统上。本公开内容例如适用于执行夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。在例如下述文献中描述了在一次性使用的试验装置中的免疫传感器及其制备和操作方法：美国专利号5,063,081, 美国专利申请公开号2003/0170881, 美国专利申请公开号2004/0018577, 美国专利申请公开号2005/0054078,和美国专利申请公开号2006/0160164，针对它们关于相同内容的教导，它们都通过引用整体并入。

具体地，关于HCV核心测定对I-STAT®系统的适应，下述构型是优选的。用一对金电流计工作电极和银-氯化银参比电极制造微制造的硅芯片。在工作电极之一上，将具有固定化的抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体片段)或抗-HCV核心DVD-Ig (或其片段、其变体、或其变体片段)的聚苯乙烯珠子(0.2 mm直径)附着于电极上的图案化聚乙烯醇的聚合物涂层。将该芯片装配成具有适合于免疫测定的流控技术形式的I-STAT®筒。在筒的样品保留腔室的壁的一部分上，存在包含HCV核心的特异性结合配偶体（诸如抗-HCV核心的单克隆/多克隆抗体(或可以结合HCV核心的其片段、其变体、或其变体片段)或抗-HCV核心DVD-Ig (或可以结合HCV核心的其片段、其变体、或其变体片段)，其中的任一种可以被可检测地标记）的层。在筒的流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸酯的水性试剂。

在运行中，将疑似含有HCV核心的样品加入试验筒的保留腔室中，且将该筒插入I-STAT®读数器中。在HCV核心的特异性结合配偶体已经溶解在样品中以后，在该筒内的泵元件迫使样品进入含有芯片的导管中。在这里，它被振荡以促进夹心的形成。在测定的倒数第二个步骤中，将流体驱出袋并进入导管中以将样品洗出芯片和进入废物腔室中。在测定的最终步骤中，碱性磷酸酶标记物与对氨基苯酚磷酸酯反应以切割磷酸酯基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极处电化学地氧化。基于测量的电流，读数器能够借助于嵌入的算法和工厂确定的校正曲线计算样品中的HCV核心的量。

进一步不言而喻，如本文中所述的方法和试剂盒必然包括用于进行免疫测定的其它试剂和方法。例如，包括各种缓冲液，诸如本领域中已知和/或可以容易地制备或优化以例如用于洗涤、用作缀合物稀释剂、微粒稀释剂和/或用作校准物稀释剂的缓冲液。一种示例性的缀合物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)中所用且含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、盐、蛋白封闭剂、抗微生物剂和去污剂的ARCHITECT®缀合物稀释剂。一种示例性的校准物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)中所用的ARCHITECT®人校准物稀释剂，其包含含有MES、其它盐、蛋白封闭剂和抗微生物剂的缓冲液。另外，如在2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142,048所述，使用与信号抗体连接的核酸序列作为信号放大剂，可以例如以I-Stat筒形式得到改进的信号产生。

本领域技术人员将容易明白，本文描述的本发明的方法的其它合适修改和改进是明显的，且可以使用合适的等效物来进行，而不脱离本发明的范围或本文公开的实施方案。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例仅为了举例说明的目的而包括，且不意图成为本发明的限制。

实施例

实施例 1.

动物免疫接种。

在第0、4和10周用50µg与BSA (ALRZ-8免疫原)共价连接的对应于氨基酸(所有编号按照HCV-1) 134-171的HCV核心肽免疫雌性CAF1/J和RBF/DnJ小鼠(二者得自The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)。

HCV核心肽-BSA由AnaSpec, Inc. (Fremont, CA)制备。将免疫原肽在完全或不完全Adjulite弗氏佐剂(Pacific Immunology, Ramona, CA)中乳化。将完全弗氏佐剂用于初次免疫接种，并将不完全弗氏佐剂用于第二次和第三次免疫接种。如下制备每种接种物：首先将HCV肽-BSA在无菌盐水(0.9%氯化钠)中稀释至适当的浓度，加入等体积的佐剂，并然后经由3-路活塞在两个注射器之间来回穿过进行混合，直到形成浓稠的稳定乳状液。在第3次免疫接种以后10-14天取血清样品。在B细胞收获之前第4天和第3天，给RBF/DnJ小鼠#306和315施用在无菌盐水中稀释的50µg肽-BSA。将该接种物在脾附近递送进体腔中。

ALRZ-8免疫原

。

实施例 2.

筛选小鼠血清的抗原免疫反应性。

首先在96-孔微量滴定酶免疫测定(EIA)中试验在它们的最终免疫接种以后7-10天收集的小鼠血清样品对3种合成的(Anaspec, Inc.)羧基端生物素化的HCV核心肽中的每一种的反应性。用于筛选的肽衍生自在实施例1中描述的免疫原序列，且具有以下命名和序列：肽1 (所有编号按照HCV-1)，氨基酸134-151: MGYIPLVGAPLGGAARALAHG；肽2，氨基酸141-161: GAPLGGAARALAHGVRVLEDG, 肽3，氨基酸151-171, LAHGVRVLEDGVNYATGNLPG。用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至2µg/mL的100µL/孔的绵羊抗-小鼠IgG Fc特异性抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)包被测定平板(NUNC Corporation, Naperville, IL)。将平板在37℃温育约2小时，然后在约21℃温育约2小时。然后除去捕获抗体，并加入200µL/孔的封闭溶液(3%w/v [重量/体积]牛血清白蛋白(BSA)和0.5%（v/v）[体积/体积]的在PBS中稀释的聚山梨酯-20。将平板温育约30分钟，然后用蒸馏水洗涤。接着，将小鼠血清或阳性对照的系列稀释物(在封闭溶液中)加入测定平板(100µL/孔)中，温育2-20小时，然后用dH₂O洗涤。接着，加入100µL/孔的正常血清溶液(NSS；含有2%（v/v）正常小鼠血清的封闭溶液)进行另外的封闭。该溶液有助于阻止测定孔中的非特异性结合。将平板温育约30分钟，然后用dH₂O洗涤。随后，将100µL/孔的每种肽的224 nM溶液加入测定孔中进行简短温育，此后将平板用dH₂O洗涤(试验血清样品对各种肽（而不是所有3种的混合物）的反应性)。接着，加入100µL/孔的在封闭溶液中稀释至200 ng/mL的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch)，温育约30分钟，然后洗涤平板；邻苯二胺底物(OPD)用作发色团来产生信号，并使用1 N硫酸淬灭反应。在492 nm的波长读出信号。

实施例 3.

筛选小鼠血清的相对亲和力。

针对在以前的测定中观察到其强信号的每个血清样品-肽组合完成相对亲和力试验。为了确定每个血清样品对各个核心肽的相对亲和力，试验了样品对有限浓度的每种生物素标记的肽的反应性。测定形式与上述的测定形式相同，除了不是制备小鼠血清试验样品的系列稀释物，而是在封闭溶液中在单一稀释度制备每个样品。另外，在不同的浓度试验各种肽，从在封闭溶液中的500 nM溶液开始，随后是也在封闭溶液中的10个log 2稀释。制备结合曲线，并用于确定每个血清样品的相对亲和力。基于这些结果，选择RBF/DnJ小鼠# 306和315用于B细胞融合。

实施例 4.

小鼠脾细胞融合。

在融合的当天，将小鼠安乐死，并将它们的脾细胞收获和放入补充了Pen Strep (Invitrogen Corporation)的Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM)中。如Kohler和Milstein (Nature 1975; 256:495-7)所述进行细胞融合。将每个小鼠脾放入含有IMDM的培养皿中。使用含有IMDM的注射器和细胞刮棒，将脾细胞灌注出每个脾。将得自小鼠# 306和315的所有脾细胞分离，并汇集进50 ml离心管中，然后使用具有锥虫蓝染料排除的血球计数器计数以确定生存力。从这些脾回收了总计大约8.0 x 10⁸个具有89%生存力的细胞。基于它们在显微镜下的物理外观，估计大约7.6 x 10⁶个细胞^/ml为B-细胞。将大约5 mL该细胞混悬液用于第一融合实验(融合208A)，并使用磁性活化细胞分选(MACS)和Pan B-细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)处理剩余的细胞以富集B-细胞的细胞群体和除去其它细胞类型。按照生产商的说明书，将总计大约6.7 x 10⁸个细胞与Pan B-细胞生物素标记的抗体混合液一起温育，随后与抗-生物素微珠一起温育。将细胞混悬液/微珠混合物通过离心洗涤，并在磁场内所含的Miltenyi Biotech LS柱上穿过。B-细胞自由地流过柱，且其它细胞类型被保留在柱中。将柱用含有2%FBS的PBS洗涤3次，以洗出所有B-细胞。将B-细胞混悬液离心，并将沉淀物再悬浮于IMDM中，然后使用血球计数器计数。从富集操作回收大约1.4 x 10⁸个B-细胞。将得自该混悬液的大约7.0 x 10⁷个B-细胞用于第二融合实验(融合208B)，并将剩余的B-细胞冷冻保存用于以后使用。

将得自脾的未富集的脾细胞(用于融合208A的~3.8 x 10⁷个B-细胞)和富集的B-细胞集合(用于融合208B的~7.0 x 10⁷ B-细胞)通过在单独试管中离心进行洗涤，并将细胞沉淀物再悬浮于IMDM中。将这些脾细胞与等数量的NS/0骨髓瘤细胞混合，并离心进沉淀物中。通过将脾细胞和NS/0细胞暴露于在HSFM中的50%聚乙二醇(PEG) (美国典型培养物保藏中心- 分子量1300-1600)，完成融合。将1 mL PEG溶液历时30秒加入每种细胞沉淀物，随后温育另外1分钟。通过历时30秒缓慢地加入30 mL IMDM，将PEG和细胞沉淀物稀释。然后通过离心和倾析上清液，从混悬液除去融合的细胞。将得自每次融合(208A和208B)的细胞沉淀物再悬浮进~250 mL补充了~10%FBS (Hyclone Laboratories)、HAT (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷) (Sigma Laboratories)、HT补充物(Invitrogen Corporation)、BM Condimed H1 (Roche Applied Science)、胆固醇和L-谷氨酰胺(Invitrogen Corporation)的IMDM中，以便选择杂交瘤。将融合的细胞接种进含有HAT培养基的T162培养瓶中，并在37℃和5%CO₂下分批（in bulk）培养大约48小时。HAT选择48小时以后，将分批培养物离心，并将沉淀物再悬浮于半固体组织培养基中。所述半固体组织培养基由补充了10%FBS、HT补充物、Penn/Strep、L-谷氨酰胺和抗-小鼠IgG-FITC Clone Detect (Molecular Devices)的2X IMDM (Invitrogen)和Clone Matrix (Molecular Devices)的50%混合物组成。将半固体培养板温育7-10天，然后在ClonepixFL (Molecular Devices)上进行集落选择。在半固体培养基上生长的集落被视作克隆，因为开始它的单个细胞尚不允许在生长过程中移动和与其它细胞混合，但是所有目标细胞系将在以后的日期被亚克隆以确保克隆形成能力。在由集落产生的抗体和发荧光的山羊抗-小鼠IgG Fc-FITC之间发生免疫沉淀反应。观察到的荧光信号越亮，产生的抗体越多。在ClonepixFL上分析集落的荧光，并选择具有最亮荧光信号的集落用于自动化转移至含有补充了10%FBS、HT补充物、胆固醇、L-谷氨酰胺和Pen Strep的IMDM的96孔组织培养板。允许96孔组织培养板在37℃生长3-7天，然后针对抗体产生来筛选上清液。

实施例 5.

使用肽的杂交瘤筛选和选择。

通过EIA分析细胞上清液样品的抗-HCV抗体。将绵羊抗-小鼠IgG Fc (Jackson Immunoresearch)以1µg/mL包被在96孔微量滴定EIA平板上。在已经将捕获试剂包被在固相上以后，将剩余的溶液除去，并使用3%的BSA在PBS中的溶液封闭平板。将孔用蒸馏水洗涤，并将细胞上清液加入封闭的平板，并允许在室温温育至少1小时。抗-小鼠IgG Fc从上清液捕获抗-HCV小鼠抗体。温育以后，使用蒸馏水洗涤平板。将在BSA封闭溶液中的3%正常小鼠血清加入所有孔中，并在室温温育30分钟以封闭包被在平板上的任何未结合的绵羊抗-小鼠IgG Fc捕获位点。将孔用蒸馏水洗涤，并加入各自100 ng/mL的在实施例2中描述的生物素化的HCV肽的混合物(即对应于HCV-1的氨基酸134-154、141-161和151-171)，并在室温温育30分钟。该温育以后，使用蒸馏水从平板洗涤生物素化的抗原，并将稀释至大约200 ng/mL的链霉亲和素-HRPO (Jackson Immunoresearch)加入平板中和允许温育30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并使用邻苯二胺底物作为发色团来产生信号。在492 nm读出平板，并分析结果。如果孔具有比背景大至少3倍的EIA信号，认为所述孔是阳性的。在补充了10%FBS、HT补充物、胆固醇和L-谷氨酰胺的IMDM中将阳性孔扩增至24孔板。

在生长5-14天以后，以与前述相同的方式通过EIA评价24孔培养物，但是相对于每种生物素化的HCV核心肽（单个地）和BSA滴定上清液样品，以鉴别可能非特异性地结合肽或封闭蛋白的克隆。用至少一种筛选肽产生比0.08 OD单位的平均BSA背景值大至少5倍的信号的24孔培养物被视作阳性的，并选择用于进一步评价。值列出在表1中。

实施例 6.

重组HCV核心1-169的克隆和表达。

将编码HCV-1的氨基酸1-169的核苷酸序列对于大肠杆菌表达进行密码子优化，并克隆进修饰的pET32a载体中，其中将编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列消除并用甲硫氨酸(M)替换。另外，在HCV核心的密码子169之后紧邻处包括羧基端六组氨酸标签以促进经由固定化的金属亲和色谱法(IMAC)的纯化。用纯化的质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并鉴别携带质粒pET-HCV核心1-169的克隆。从其表达的蛋白被命名为HCV核心1-169。

通过在极品肉汤(terrific broth, TB)培养基中培养pET-HCV核心1-169转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，实现蛋白表达。在发酵罐中培养细胞至10的OD600nm，然后用1 mM IPTG诱导，并在37℃培养大约3小时，直到得到大约20的OD600nm。将细胞通过离心进行收获，并通过在含有150 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM MgCl₂、溶菌酶和benzonase的25 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中超声处理进行裂解。通过离心来澄清裂解物，并将不溶性的级分溶解在含有150 mM NaCl、6 M脲、1.0%正十二基-ß-D-麦芽糖苷、1 mM DTT和5 mM MgCl₂的25 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中。将溶解的裂解物再次通过离心进行澄清，并将可溶性的级分加载到HisTrap Fast Flow柱(GE Healthcare)上。然后将柱用25柱体积的含有150 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM MgCl₂、6 M脲、0.1%正十二基-ß-D-麦芽糖苷和10 mM咪唑的25 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗涤。使用相同缓冲液和咪唑的线性梯度(0-500 mM)进行洗脱。合并洗脱的含有期望的目标蛋白的级分(通过SDS-PAGE确定)，并在含有150 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM MgCl₂、有和没有6 M脲和0.1%正十二基-ß-D-麦芽糖苷的25 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中透析。

HCV核心1-169核苷酸序列

HCV核心1-169氨基酸序列

实施例 7.

使用核心抗原的杂交瘤筛选。

然后通过EIA评价24孔培养物的结合直接包被在微孔滴定板上的HCV核心1-169的能力(如在实施例6中所述) (固相测定)。将HCV核心1-169以1µg/mL包被在96孔微量滴定EIA平板上。已经将捕获试剂包被在固相上以后，除去溶液，并使用3%的BSA在PBS中的溶液封闭平板。将孔用蒸馏水洗涤，并加入细胞培养物上清液的5倍系列稀释物，并在室温温育至少1小时。将平板用蒸馏水洗涤，并将在BSA封闭溶液中以大约200 ng/ml稀释的HRP标记的山羊抗-小鼠IgG FC抗体加入平板，并允许在室温温育30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并使用邻苯二胺底物作为发色团来产生信号。在492 nm读出平板，并分析结果。

具有大于或等于核心1-169反应性值的BSA背景反应性的抗体被视作阴性的，且不用于计算平均BSA背景值。对于要视作核心1-169阳性的剩余抗体，它们必须具有至少0.50 OD单位的EIA信号，或比0.10 OD单位的平均BSA背景信号大至少5倍的EIA信号。值列出在表2中。

实施例 8.

经由核心抗原捕获测定的杂交瘤筛选。

将通过基于肽的EIA (实施例5)或HCV核心1-169固相免疫测定(实施例7)在24孔阶段鉴别为阳性的细胞系扩增用于冷冻保存，随后制备高密度的耗尽细胞的上清液。将得自融合208A和208B细胞系的高密度耗尽上清液试验它们的检测单克隆抗体(14-153-229, 美国专利7,858,752)从溶液捕获的HCV核心1-169的能力，所述单克隆抗体针对HCV核心的核酸结合结构域(例如氨基酸1-125)内的表位，也被称作结构域1。将抗-结构域1单克隆抗体以1µg/mL包被在96孔微量滴定EIA平板的固相上。已经将捕获试剂包被在固相上以后，将它除去，并使用含有2%鱼明胶、0.5%吐温20和0.1%正十二基-N,N-二甲基胺-N-氧化物(Affymetrix)的5X PBS缓冲液在室温封闭平板30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并将在鱼明胶/去污剂溶液中稀释的核心1-169抗原的50 ng/ml溶液加入所有孔中，并在室温温育至少30分钟。将孔用蒸馏水洗涤，并将细胞上清液滴定到封闭的平板上，并在室温温育至少30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并将在BSA封闭溶液中稀释至大约200 ng/ml的HRP标记的山羊抗-小鼠IgG FC抗体加入平板，并在室温温育30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并使用邻苯二胺底物作为发色团来产生信号。在492 nm读出平板，并分析结果。如果抗体具有至少0.50 OD单位的EIA信号，或比0.10 OD单位的平均BSA背景信号大至少5倍的EIA信号，则认为所述抗体是核心1-169阳性的。值列出在表3中。

实施例 9.

抗-HCV核心抗体结合动力学的确定。

使用Biacore 4000仪器(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, 瑞典)确定抗-HCV核心肽134-171单克隆抗体的亲和力/动力学。首先，在用100 mM HCl、50 mM NaOH和0.1%SDS的双份注射预处理CM5 Series S生物传感器芯片(GE Healthcare)以后，通过经由在胺偶联试剂盒 (GE Healthcare)中提供的EDC/NHS/乙醇胺化学试剂将兔抗-小鼠IgG抗体(GE Healthcare, Piscataway, NJ)胺偶联在生物传感器芯片的所有4个流动池中的斑点1、2、4和5上，制备兔抗-小鼠IgG 捕获生物传感器。将澄清的抗-HCV核心抗体耗尽的杂交瘤上清液和HCV核心肽稀释进过滤的缓冲液中，所述过滤的缓冲液由在蒸馏水中稀释10倍的10x HBS-EP+ 缓冲液(GE Healthcare；在下文中称作“运行缓冲液”)组成，补充了0.1%BSA和0.1%CM-葡聚糖，并经0.2µm过滤。将每种HCV核心抗体上清液用运行缓冲液1:1稀释，并再次0.2µm过滤。将53氨基酸定制肽(ALRZ-9肽, Anaspec, Fremont, CA)化学合成以含有HCV核心残基134-171和羧基端破伤风类毒素(TT)免疫原性的T-细胞表位肽(Eur. J. Immunol. (1989), 19:2237-2242)，其末端氨基和羧基分别被乙酰化和酰胺化。将低压冻干的HCV核心134-171-破伤风类毒素合成肽免疫原在蒸馏水中稀释至0.7或1 mg/mL的储备浓度，并在运行缓冲液中进一步稀释至0.457-3,000 nM或0.412-2,700 nM的浓度，二者都使用3倍稀释系列。所有抗原溶液在使用之前经过0.2µm过滤。

HCV核心134-171-TT肽操作如下：将10µL HCV核心抗体以10µL/分钟单独地注射在所有4个流动池中的斑点1和5上。所有斑点都含有捕获的抗体以后，使流速增加至30µL/分钟，并在该新流速将生物传感器平衡2分钟；然后，注射(90µL) HCV核心肽3分钟，随后是4分钟的运行缓冲液。将所有生物传感器表面用一次30µL的10 mM甘氨酸（pH 1.7）(GE Healthcare)注射（流速为10µL/分钟）再生。一式两份地试验所有浓度。经由抗原注射过程中的传感图和随后的运行缓冲液监测结合动力学(结合和解离)。将传感图双参照，并使用Biacore 4000评价软件(GE Healthcare Bio-Sciences AB)拟合至1:1结合模型以确定结合和解离速率、以及总K_D。动力学和亲和力值列出在表4中。如果值不存在，那么不可以确定结合动力学，或者抗体在该测定中不会与HCV核心134-171-TT肽反应。

ALRZ-9肽

。

实施例 10

使用核酸结合结构域mAb的BIAcore抗体结合对分析

使用Biacore 4000仪器(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，确定了抗-HCV核心肽134-171单克隆抗体与抗-HCV核心C11-3、C11-7、C11-9和C11-14 (美国专利6,727,092; Morota, 等人, J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14)抗体和重组HCV核心1-169抗原形成抗体结合对的能力。首先，在用100 mM HCl、50 mM NaOH和0.1%SDS的双份注射预处理CM5 Series S生物传感器芯片(GE Healthcare)以后，通过经由在胺偶联试剂盒 (GE Healthcare)中提供的EDC/NHS/乙醇胺化学试剂将兔抗-小鼠IgG抗体(GE Healthcare, Piscataway, NJ)胺偶联在生物传感器芯片的所有4个流动池中的斑点1、2、4和5上，制备兔抗-小鼠IgG Capture Biosensor。

将澄清的抗-HCV核心(肽氨基酸134-171)抗体耗尽的杂交瘤上清液、重组HCV核心1-169抗原、3种不同的纯化的小鼠单克隆IgG（代表不与用作封闭试剂的HCV核心反应的同种型IgG1、IgG2a和IgG2b）以及抗-HCV核心C11-3、C11-7、C11-9和C11-14 mAb稀释进过滤的运行缓冲液(在下文中“运行缓冲液”)中，所述运行缓冲液由在蒸馏水中稀释5倍的10x PBS缓冲液(GE Healthcare)构成，补充了3 mM EDTA、0.1%BSA、0.1%CM-葡聚糖、0.1%正十二基-N,N-二甲基胺-N-氧化物、额外的500 mM NaCl，并经0.2µm过滤。将每种HCV核心抗体上清液1:1稀释，按照计算的二聚体分子量(39,453 Da)将重组HCV核心1-169抗原稀释至500 nM，将抗-HCV核心C11-3、C11-7、C11-9和C11-14纯化的单克隆抗体单个地稀释至20µg/mL，并将3种小鼠IgG封闭试剂都在运行缓冲液中稀释为库，其中每种同种型具有至少100µg/mL的浓度。所有稀释物在使用之前经过0.2µm过滤。

HCV核心抗体-抗原-抗体夹心操作如下。将20µL HCV核心C11抗体以10µL/分钟注射到所有4个流动池中的斑点1和5上：C11-3在流动池1中，C11-7在流动池2中，C11-9在流动池3中，和c11-14在流动池4中。将流速增加至30µL/分钟，并通过将60µL注射到所有流动池中斑点1和2上，然后将60µL注射到所有流动池中的斑点4和5上，用小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b同种型库封闭生物传感器上的剩余可利用的抗-小鼠IgG结合位点。将60µL HCV核心1-169抗原注射到所有流动池中斑点1上，然后将另外60µL注射到所有流动池中的斑点5上。将60µL一种HCV核心抗体稀释的上清液注射到所有流动池的斑点1和2上，并将另一份稀释的上清液注射到所有流动池的斑点4和5上。使流速下降至10µL/分钟，并将所有生物传感器表面用10 mM甘氨酸（pH 1.7）(GE Healthcare)的一次30µL注射进行再生。

使用Biacore 4000评价表位作图软件模块(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，在每次注射以后确定每种C11抗体、抗原和HCV核心抗体上清液的结合应答，并用于使用二聚体抗原和抗体(150,000 Da)分子量计算预期的应答参考值。使用各个样品相对于参考值确定预期的百分比结合值。大于5.0的任何预期的百分比结合值被视作就与重组HCV核心1-169抗原形成抗体夹心而言是阳性的。预期的百分比值列出在表5中。

实施例 11.

免疫球蛋白纯化和标记。

将抗-HCV核心杂交瘤在补充了L-谷氨酰胺和10%超低IgG FBS (Invitrogen Corporation)的杂交瘤无血清培养基(Invitrogen Corporation)中繁殖，并以大约0.5 x10E⁵个细胞/mL接种进滚瓶中。在大约1转/分旋转的同时将培养物在37℃温育10-14天，或直到得到最终目标培养物。将最终滚瓶上清液收获，并用0.45微米过滤器澄清。将澄清的上清液用等体积的1.5 M甘氨酸、3M NaCl缓冲液（pH 8.9）稀释，然后使用AKTA自动化的纯化系统(Amersham/Pharmacia/GE)加载到预平衡的5 ml蛋白A柱上。然后将柱用大约5柱体积的结合缓冲液洗涤，并在达到稳定基线时，将mAb用0.1 M柠檬酸钠缓冲液（pH 2.8）洗脱。然后将IgG转移至脱盐柱并交换进PBS（pH 7.2-7.4）中，然后使用10,000分子量截止透析膜(Pierce Chemical)在PBS（pH 7.2-7.4）中进一步透析。将选择的抗体使用20倍摩尔过量的磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)生物素化，并在室温温育30分钟。通过在PBS（pH 7.2-7.4）中透析，除去未结合的生物素。通过EIA试验所有生物素化的单克隆抗体以证实成功的标记。

实施例 12.

HCV核心抗原捕获测定。

使用HCV核心1-169重组抗原以EIA形式评价了纯化的抗-HCV核心134-171单克隆抗体与它们自身和两种其它结构域1单克隆抗体形成结合对的能力。将抗-HCV结构域1单克隆抗体C11-7和C11-9和抗-HCV核心134-171单克隆抗体以大约1000 ng/ml包被在微孔滴定板上，并允许在2-8℃温育过夜。已经将捕获试剂包被在固相上以后，使用含有2%鱼明胶、0.5%吐温20和0.1%正十二基-N,N-二甲基胺-N-氧化物的5X PBS缓冲液封闭平板。将孔用蒸馏水洗涤，并将纯化的核心1-169抗原（在鱼明胶块中稀释的50-0.78 ng/ml的系列稀释物中）加入封闭的平板中，然后允许在室温温育大约30分钟。将孔用蒸馏水洗涤，并将生物素标记的抗-HCV核心单克隆抗体以100-5000 ng/ml的浓度加入平板，然后在室温温育30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并将稀释至大约200 ng/mL的链霉亲和素-HRPO加入平板，并允许在室温温育30分钟。将平板用蒸馏水洗涤，并使用邻苯二胺底物作为发色团来产生信号，和测量在492 nm的光密度。

表6总结了使用25 ng/ml核心1-169抗原的每个抗体对组合的测定信号(OD492nm)，其指示每个结合对是否能够形成夹心。比作为捕获或缀合试剂的阴性对照(NC)单克隆抗体产生的值大至少3倍的OD492值被视作就核心抗原检测而言阳性的。

实施例 13.

抗-核心134-171可变结构域的序列。

选择抗-HCV核心134-171杂交瘤的子集用于确定可变重链(VH)和可变轻链(VL)核苷酸和推论的氨基酸序列。根据生产商的推荐，使用Trizol (Invitrogen)或Tri-Reagent (Sigma)从杂交瘤细胞提取总RNA。使用Superscript III (Life Technologies)和寡dT引物按照标准方案从提取的总RNA制备重链和轻链cDNA。使用dC锚定引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACCCCCCCCCCCCCCCCC-3’)和对小鼠重链或轻链的恒定区特异性的通用引物(Novogen)，使用5' RACE (cDNA末端的快速扩增)方案扩增可变重链和轻链cDNA序列。将扩增子按照生产商的指导克隆进商购可得的载体(pCR2.1-TOPO cloning kit, Invitrogen)中，并转化进TOP10大肠杆菌中。选择至少8个集落用于使用M13正向引物和反向引物PCR扩增克隆的可变结构域序列。在使用M13正向引物和BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)测序之前，用ExoSap (Affymetrix)处理扩增子。使用ABI3130xl自动化的测序仪得到序列，并使用Vector NTI软件(Invitrogen)装配和分析。

使用如在MEGA5软件包(Tamura等人, Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739, 2011)中实现的ClustalW (Higgins等人, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680, 1994)，比对推论的氨基酸序列。使用MEGA5软件确定得自比对和系统树构造（使用Neighbor Joining方法，在比对中完全删除序列缺口）的相关重链氨基酸序列的分组或簇。使用得自1000个副本的引导试验，检查了树拓扑学的可靠性，并从而检查了其中的簇或组的可靠性。作为一般规则，如果给定的内部分支的引导值是95%或更高，那么在该分支处的拓扑学被视作“正确的”(Nei和Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics, 2000; Oxford University Press, New York)。得自52种抗-HCV核心134-171单克隆抗体的重链可变结构域序列的分析揭示了4个具有>95%的引导值的主组的存在。包含这些组中的3个组的抗体表现出结合用于筛选的每种肽之一的特异性，即含有肽1 (134-154)的组B，含有肽2 (141-161)的组A，和含有肽3 (151-171)的组C。图2提供了树拓扑学的两种表示。

Claims (19)

1.单克隆抗体，其可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述HCV核心抗原是HCV的氨基酸残基134-171。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体特异性地结合由氨基酸序列MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG形成的至少一个表位。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体可与由HCV核心抗原的氨基酸141-161、134-154和151-171形成的表位免疫反应。

5.单克隆抗体，其可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应，其中所述单克隆抗体具有选自表1A中列出的抗体的重链可变结构域和具有选自表1B中列出的抗体的轻链可变结构域。

6.免疫测定试剂，其包含权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体用可检测标记物标记。

7.免疫测定试剂，其包含权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合至固相。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的免疫测定试剂，所述的免疫测定试剂进一步包含针对HCV抗原的另外抗体。

9.根据权利要求8所述的免疫测定试剂，其中所述另外抗体是另外的抗-核心抗体。

10.用于检测试验样品中的HCV的免疫测定，所述免疫测定包括：

(i) 使疑似含有HCV的试验样品与针对HCV核心抗原的第一抗体接触以形成所述第一抗体和位于所述试验样品内的抗原之间的复合物；

(ii) 使在步骤(i)中形成的所述复合物与权利要求1-6中的任一项的抗体接触，以形成权利要求1-6中的任一项的所述抗体和在步骤(i)中形成的复合物中的抗原之间的复合物，其中权利要求1-6中的任一项的所述抗体被可检测地标记，和

(iii) 检测在步骤(ii)中形成的复合物的标记物。

11.根据权利要求10所述的免疫测定，其中所述第一抗体针对HCV核心抗原的DNA结合结构域。

12.根据权利要求10所述的免疫测定，其中所述步骤(ii)的抗体用荧光标记物标记。

13.根据权利要求12所述的免疫测定，其中所述标记物是吖啶鎓。

14.根据权利要求10所述的免疫测定，其中所述步骤(i)的抗体结合至固相。

15.根据权利要求10所述的免疫测定，其中所述步骤(i)的抗体包含不同于步骤(ii)的抗体的权利要求1-6中的任一项的抗体。

16.根据权利要求10所述的免疫测定，其中步骤(i)的所述抗体包含与步骤(ii)的抗体相同的权利要求1-6中的任一项的抗体。

17.根据权利要求10所述的免疫测定方法，其中所述试验样品得自患者，且所述方法进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性处理的效力，其中，如果所述方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，则所述方法任选地进一步包括根据需要改变患者的治疗性/预防性处理以提高效力。

18.根据权利要求17所述的免疫测定方法，其中所述方法适合用在自动化的系统或半自动化的系统中。

19.试剂盒，其包含权利要求1的免疫诊断试剂和关于在用于检测试验样品中的HCV的免疫测定中使用所述免疫诊断试剂的说明书。