CN105267249A - 一种纯种发酵制备六神曲的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纯种发酵制备六神曲的方法。其特征在于以产黄青霉菌为单一发酵菌种，以六种原料包括：面粉(和或麦麸)、赤小豆、苦杏仁、青蒿、辣蓼、苍耳草制成培养基，在适宜的条件下，发酵而成六神曲药材。

Description

一种纯种发酵制备六神曲的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域和中药材生产领域，特别涉及一种采用单一菌株——产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)纯种发酵制备中药六神曲的方法。
背景技术
六神曲(MedicatedLeavenMassa)又名神曲、六曲，是常用的消食类药物之一，是由青蒿、苍耳草、辣蓼自然汁拌以苦杏仁粉、赤小豆粉、麦麸及面粉，按比例混合，在适宜条件下发酵而成，是传统发酵曲剂中应用最广泛的一种。六神曲味甘、辛，性温，归脾、胃经；具有消食健胃、和中止泻之功效。
传统制备六神曲的工艺是在自然条件下，在特定的季节，利用天然存在的微生物菌种进行发酵，由于全国各地发酵环境不同，发酵季节时令的差异，造成不同产地产品或相同产地不同批次的产品差异较大，或者引入杂菌如黄曲霉毒素，而严重影响六神曲的使用安全。因此，规范六神曲发酵方法具有重要意义。
本课题组先期从传统工艺发酵的六神曲中分离得到有效的发酵菌株，并首次对其进行了微生物学鉴定，确定为：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)，并将其应用于纯种发酵制备六神曲的中药材生产中。此方法减少了杂菌污染，产品工艺可控、质量可控，操作简单，六神曲疗效得以保证，为规范六神曲发酵工艺提供科学依据，并且在生产中提高经济效益。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种六神曲纯种发酵的菌株，为：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)。
本发明的目的之二是提供一种采用纯种发酵制备六神曲的方法。
本发明的目的之三是提供一种以产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)为发酵菌种，纯种发酵制备六神曲的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供的适用于纯种发酵制备六神曲的产黄青霉菌菌株来源于以下方法：
1、采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵六神曲分离得到3株真菌，使用生物显微镜进行显微形态学鉴定，DNA测序进行分子生物学鉴定，确定3株真菌分别为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)，青霉属真菌产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)以及枝孢属真菌枝孢霉菌(Cladosporiumcladosporioides)。
真菌的鉴定
采用真菌鉴定通用引物ITS4与ITS5，对六神曲中分离的真菌基因组DNA进行序列扩增。
50μL反应体系如下：
循环参数设定：
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
反应结束后，取扩增后产物5μL，经电场强度为5V/cm，1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳时间1小时，在紫外灯下检测目的条带与预期是否相符。
将PCR扩增出来的目的基因片断测序，所测得序列提交至NCBI，与GeneBank数据库中已知基因序列进行Blast对比，选取相似性大于99％，且种属地位明确的序列，应用ClustalX1.83进行多序列对比，同时使用软件MEGA5.0构建系统进化树。此菌有鉴定意义的序列是FJ176474.1、JF440603.1、AM948960.1以及JF834167.1，其中与JF834167.1同源性最高(Blast的Maxident为100％)。
此外，微生物鉴定委托中国科学院微生物研究所进行进一步检验鉴定，并出具鉴定报告，报告编号：(2013)微检字第240号，鉴定结论为：在本实验室条件下，根据送检结果的培养特征、显微特征以及rRNA基因序列等实验数据综合分析，送检菌种(菌株编号：SQ2)的鉴定结果为：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)。
2、以单一菌株发酵替代六神曲原有自然发酵，观察发酵后的气味及外观性状，其中产黄青霉菌发酵的六神曲气味纯香，表面黄衣出现与传统发酵一致；枝孢霉菌发酵六神曲产生霉腐气味，曲块表面暗灰褐色与传统发酵差别大，推测枝孢霉菌为六神曲发酵中产生的杂菌，而产黄青霉菌为适合六神曲纯种发酵的有效菌种。
3、考察产黄青霉菌发酵六神曲95％乙醇提取物对8种肠道致病菌的抑制作用，结果表明，产黄青霉菌六神曲提取物对肠道致病菌具有显著抑制作用。通过ELISA试剂盒检测米曲霉菌及产黄青霉菌六神曲中黄曲霉毒素B1含量，得米曲霉菌发酵六神曲中黄曲霉毒素B1含量为14.25μg/kg，含量超标；产黄青霉菌发酵六神曲中黄曲霉毒素B1含量为1.63μg/kg，符合含量限制要求。
一种纯种发酵制备六神曲的方法，其特征在于以单一发酵菌种，以六种原料包括：面粉(和或麦麸)、赤小豆、苦杏仁、青蒿、辣蓼、苍耳草制成培养基，在适宜的条件下，发酵而成六神曲药材。
一种用于纯种发酵制备六神曲的微生物菌种，其特征在于所述菌株为产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)。
一种以产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)为发酵菌种，纯种发酵制备六神曲的方法。
一种以产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)纯种发酵制备六神曲的方法，其特征在于如下步骤：
称取一定量的青蒿、苍耳草及辣蓼制汁，用作制取发酵软材的粘合剂；称取麦麸、面粉，二者的配比为1∶5～5∶1，加入占麦麸和面粉混合物重量比3～7％的苦杏仁粉，再加入占麦麸和面粉混合物重量比3～7％的赤小豆粉，以上材料混合均匀共同组成发酵所需的固体培养基，提供发酵所需的碳源、氮源；将产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)菌种按每100g混合固体培养基加入1～5g菌种的比例拌入固体培养基中，混合均匀制成软材，再制成曲块，置于28～32℃恒温条件下，湿度70～80％，培养5～10天，至表面遍布黄衣，停止发酵，取出，切成约1cm3大小的曲块，烘干，即得纯种发酵的六神曲。
本发明中六神曲的制备方法，与现市售六神曲的制备存在明显不同。本方法采用直接发酵法，将青蒿、苍耳及辣蓼水制汁后，置于面粉和(或)麦麸、苦杏仁粉及赤小豆粉混合制成的培养基中，将通过生物技术分离得到的产黄青霉菌接种后进行发酵，规定了确切的发酵时间、发酵温度，减少了杂菌污染，简化了操作。该方法所制备的六神曲保存了传统六神曲的特色，改进了传统发酵的不足，新法的发酵品可以更好地发挥药效，对常见人体致病菌具有显著地抑菌、杀菌活性，而发挥消食作用，而且该方法适合工业化的大生产。
附图说明
图1为黄曲霉毒素B1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例一：产黄青霉菌实验室发酵制备六神曲
称取干青蒿、干苍耳、干辣蓼各25g，加入10倍量，8倍量，6倍量蒸馏水煎煮三次，每次40min，合并水煎液，浓缩至250mL，转移至500mL灭菌锥形瓶中，密封，置于洁净工作台中放凉，备用。
称取麦麸500g、面粉500g、苦杏仁粉和赤小豆粉各40g，盛装于1000mL烧杯中，将八层纱布置于牛皮纸中间，密封烧杯口，于103.4kPa、121.3℃，高压蒸汽灭菌器内灭菌20min，灭菌结束后立即取出，转移至洁净工作台中放凉，备用。
将以上处理过的药汁及20g产黄青霉菌体拌入无菌培养基中，混合均匀，制成直径约12cm，厚度约1cm圆饼状，盛装于灭菌后的18cm口径培养皿中，倒置于28℃恒温箱中，相对湿度为70％，培养7天，至有黄衣出现，停止发酵，取出，切成约1cm3大小曲块，烘干，收取贮存，注意防虫蛀。
实施例二：产黄青霉菌生产制备六神曲
称取新鲜的青蒿、苍耳、辣蓼各5kg，榨取鲜汁，作为粘合剂备用。
称取麦麸30kg、面粉20kg、苦杏仁粉和赤小豆粉各2kg，将以上处理过的鲜汁及100g产黄青霉菌体拌入无菌培养基中，混合均匀，制成20×12×8cm的曲块，呈品字形堆置，覆以湿物，于30℃，相对湿度75％，培养10天，至有黄衣出现，停止发酵，取出，切成约1cm3大小曲块，烘干，即得，该法适合于生产使用。
实验例1：最低抑菌浓度考察
六神曲通过抑菌机制发挥抑制肠道菌群紊乱的药效作用，故此本实验将对六神曲发酵原材料、市售六神曲以及产黄青霉菌纯种发酵的六神曲进行抑菌活性考察：
样品A：取青蒿、苍耳草、辣蓼干品各10g，苦杏仁、赤小豆各2g，加入10倍量，8倍量，6倍量蒸馏水分别提取三次，每次1h，合并提取液，浓缩后，减压干燥72h，得样品A稠膏，即不加面粉及麦麸六神曲原材料提取物；
样品B：取市售六神曲100g，加入10倍量，8倍量，6倍量95％乙醇分别提取三次，每次1h，合并提取液，旋转蒸发回收溶剂后，减压干燥72h，得样品B稠膏；
样品C分别为产黄青霉菌单一菌株发酵且炒制处理后六神曲样品，每种样品均称取100g，提取方法同样品B。
精密称取样品A1.0024g、样品B0.3750g、样品C0.3015g，分别置于5mL容量瓶中，加入200MlDMSO促溶，最后加入蒸馏水定容，配制成浓度分别为200.5mg/mL、75.0mg/mL及60.3mg/mL的供试品，另配制4％DMSO水溶液作为空白对照。
最低抑菌浓度(MIC)测定96孔板连续稀释法。向洁净无菌的96孔板加入如下溶液：于96孔板加入100μL营养肉汤培养基；向第1孔加入100μL样品，与培养基混匀后吸取100μL加入第2孔，以此类推加至第10孔，吸取其中100μL弃置废液75％乙醇中；向第11孔再加入100μL营养肉汤培养基；除第12孔外，向每孔中加入100μL实验用菌液混匀，以上过程为无菌操作。
此时，第n孔对应药液浓度为C0/2n+1(C0为初始浓度)，其中第11孔作为药液空白，第12孔作为菌液空白，每种样品平行三次。于37℃恒温培养18h后观察结果。
最低杀菌浓度(MBC)测定采用琼脂板划分区域法，将上述无细菌生长的各菌药混合液接种于营养琼脂培养基上，于37℃恒温培养24h，观察细菌生长情况。
抑菌作用考察结果
除DMSO空白组没有抑菌作用以外，其余三种样品均有不同程度的抑菌作用，其中样品A是六神曲除培养基外的原材料提取物，其抑菌作用相对较弱。经过单一菌株纯种发酵后样品C的抑菌作用明显增强，且抑菌强度明显高于市售样品B六神曲。实验表明六神曲原材料经产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)发酵后有明显抑菌作用，优于市售产品(表1-Table4)。
表1样品A的最低抑菌浓度(MIC)
注：样品A为六神曲原料提取物，“-”表示此孔无细菌生长，“+”表示此孔有细菌生长。
表2样品B的最低抑菌浓度(MIC)
注：样品B为市售六神曲提取物，“-”表示此孔无细菌生长，“+”表示此孔有细菌生长。
表3样品C的最低抑菌浓度(MIC)
注：样品C为产黄青霉菌单一菌株发酵六神曲提取物，“-”表示此孔无细菌生长，“+”表示此孔有细菌生长。
表4最低杀菌浓度(MBC)
注：“-”表示无最低杀菌浓度，样品A为六神曲原料提取物，样品B为市售六神曲提取物，样品C为产黄青霉菌单一菌株发酵六神曲提取物。
实验例2：黄曲霉毒素B1含量测定
样品前处理：将米曲霉和产黄青霉菌单一菌株发酵的六神曲样品粉碎过50目筛，各称取5g，加入25mL样品提取液，振荡10min，于4000r/min离心5min，取5mL上清液，加入10mL二氯甲烷，振荡5min，离心分层，取下层二氯甲烷相待用，向上层水相中再加入10mL二氯甲烷，重复提取一次，合并二氯甲烷相。于50℃下氮气吹干，加入2mL样品提取液，溶解挥发物，再加入8mL样品稀释液进行稀释，得样品待测液。
吸光度测定：实验前将所需试剂从冷藏环境取出，平衡至室温(20～25℃)。取出所需数量微孔板，加入标准品或样品50μL到对应微孔中，加入ABF1酶标物50μL/孔，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应30min，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。加入底物A液50μL/孔，再加入底物B液50μL/孔，轻轻震荡混匀，用盖膜板盖板后置25℃避光环境中反应15min。加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
黄曲霉毒素B1含量测定结果
(1)标准品百分吸光度测定
标准品的百分吸光率等于标准品吸光度的平均值除以第一标准(即0标准)的吸光度值，再乘以100％，即百分吸光率值(％)＝B/B0×100％。
B-标准溶液溶液平均吸光度值
B0-0(ppb)样品溶液的平均吸光度值
测得标准品百分吸光率见Table5。
表5标准品的百分吸光率
注：B0-B5为试剂盒中给定标准品。
(2)标准曲线的绘制
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度(ppb)为横坐标，绘制标准曲线(见图1)。
(3)样品百分吸光度测定
样品的百分吸光率等于样品的百分吸光度的平均值除以第一标准(即0标准)的吸光度值，再乘以100％。即
-样品溶液平均吸光度值
B0-0(ppb)样品溶液的平均吸光度值
样品百分吸光率计算方法同上，结果见Table6。
表6样品的吸光率及黄曲霉毒素B1的含量
实验结果可知，经米曲霉菌发酵的六神曲中黄曲霉毒素B1残留量为14.25μg/kg，大于5μg/kg，含量超标；经产黄青霉菌发酵的六神曲中黄曲霉毒素B1残留量为1.63μg/kg，小于5μg/kg，其含量符合我国食品对黄曲霉毒素B1最大残留量要求限定。因此可推测，米曲霉为黄曲霉毒素的主要来源，是发酵六神曲的有害杂菌。

Claims (4)

1.一种纯种发酵制备六神曲的方法，其特征在于以单一发酵菌种，以六种原料包括：面粉、(和或麦麸)、赤小豆、苦杏仁、青蒿、辣蓼、苍耳草制成培养基，在适宜的条件下，发酵而成六神曲药材。
2.一种用于纯种发酵制备六神曲的微生物菌种，其特征在于所述菌株为产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)。
3.一种以产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)为发酵菌种，纯种发酵制备六神曲的方法。
4.一种以产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)纯种发酵制备六神曲的方法，其特征在于如下步骤：
称取一定量的青蒿、苍耳草及辣蓼制汁，用作制取发酵软材的粘合剂；称取麦麸、面粉，二者的配比为1∶5～5∶1，加入占麦麸和面粉混合物重量比3～7％的苦杏仁粉，再加入占麦麸和面粉混合物重量比3～7％的赤小豆粉，以上材料混合均匀共同组成发酵所需的固体培养基，提供发酵所需的碳源、氮源；将产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)菌种按每100g混合固体培养基加入1～5g菌种的比例拌入固体培养基中，混合均匀制成软材，再制成曲块，置于28～32℃恒温条件下，湿度70～80％，培养5～10天，至表面遍布黄衣，停止发酵，取出，切成约1cm3大小的曲块，烘干，即得纯种发酵的六神曲。
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