CN105055311A

CN105055311A - 乳液微流化和/或均化期间的组分循环

Info

Publication number: CN105055311A
Application number: CN201510552611.1A
Authority: CN
Inventors: H·吕克利克; H·舍弗兹克; B·桑特里
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2015-11-18
Also published as: IL219984A0; AU2010325752B2; EP2356983A1; USRE46441E1; NZ600323A; WO2011067673A2; ES2402569T3; EP2506834A2; JP5820390B2; SG10201501611QA; IL219984B; BR112012013427B8; EP2638895A3; BR112012013427A2; US20130142833A1; CN102753149A; PT2356983E; SI2506834T1; HK1160396A1; US20200268661A1

Abstract

生产水包油乳液的改良方法涉及通过匀浆器和/或通过微流化装置在第一容器和第二容器之间进行乳液组分的循环。有用的是，来自第一容器的所有乳液组分在返回前倾空。

Description

乳液微流化和/或均化期间的组分循环

本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB2010/003394，国际申请日为2010年12月03日，进入中国国家阶段的申请号为201080062766.2，名称为“乳液微流化和/或均化期间的组分循环”的发明专利申请的分案申请。

本申请要求2009年12月3日提交的美国临时专利申请61/283,518的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及通过微流化制备疫苗的水包油乳液佐剂领域。

技术背景

称作‘MF59’[1-3]的疫苗佐剂是一种鲨烯、聚山梨酯80(也称作吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯(也称作司盘85)的亚微米水包油乳液。它也可包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲剂。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％吐温80和约0.5％司盘85。参考文献4的第10章、文献5的第12章、文献6的第19章更详细地描述了该佐剂及其制备。

如参考文献7中所述，MF59的商业规模的制备是通过将司盘85分散在鲨烯相中且吐温80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后将这种粗乳液重复通过微流化机，产生具有均一油滴尺寸的乳液。如文献6所述，然后将微流化乳液滤过0.22μm膜，以除去任何大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4℃下保持至少3年不变。可如文献8所述测定最终乳液中的鲨烯含量。

水包油乳液含有油滴。这些乳液中含有的较大油滴可作为聚集的成核位置，引起储存过程中的乳液降解。

本发明的目的是提供制备微流化水包油乳液(例如MF59)的进一步和改良方法，特别是适用于商业规模和提供改良的匀化和微流化以产生含较少大颗粒乳液的方法。

发明内容

本发明提供一种生产含有鲨烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步骤(i)用匀浆器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液是通过使第一乳液组分循环通过匀浆器多次形成的。

本发明还提供生产含鲨烯的水包油乳液的方法，该方法包括步骤：(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液是通过循环第二乳液组分形成的，所述循环通过将第二乳液组分从第一乳液容器经第一微流化装置转移到第二乳液容器，然后通过第二微流化装置，其中第一和第二微流化装置相同。

任选地，本发明方法包括早期步骤(a)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液。

任选地，本发明方法包括步骤(c)过滤所述第二乳液。

如下文详述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸在为300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸>1.2μm的油滴数量可为5x10¹¹/ml或以下。尺寸>1.2μm的油滴是不利的，因为它们可由于液滴聚集和凝结而导致乳液不稳定[14]。

形成后，第一乳液可随后至少通过一次微流化，形成平均油滴尺寸减小的第二乳液。如下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸为500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数量可为5x10¹⁰/ml或以下。为了实现这些特征，必须将乳液组分通过微流化装置多次，例如2、3、4、5、6、7次。

然后第二乳液可滤过例如亲水聚醚砜膜，得到可适用作疫苗佐剂的水包油乳液。过滤后产生的水包油乳液的平均油滴尺寸可为220nm或以下，例如135-175nm，145-165nm，或约155nm。过滤后产生的水包油乳液中存在的尺寸>1.2μm的油滴数量可以是5x10⁸/ml或更少，例如5x10⁷/ml或更少，5x10⁶/ml或更少，2x10⁶/ml或更少，或5x10⁵/ml或更少。

过滤后形成的最终水包油乳液与第一乳液相比尺寸>1.2μm的油滴可少至少10²倍，理想的是至少少10³倍(例如少10⁴倍)。

在一些实施方式中，在步骤(iii)之间进行一轮以上的步骤(i)和(ii)。类似地，可多次重复独立步骤(i)和(ii)。

通常，在20-60℃，理想地在40+5℃进行本方法。虽然第一和第二乳液组分可能在较高温度下也相对稳定，但一些组分的热分解仍然会发生，因此优选较低温度。

乳液组分

可用动态光散射技术，如参考文献13所述测定平均油滴尺寸(即乳液油滴的平均直径数)。动态光散射测量机的一个例子是Nicomp380亚微米粒度分析仪(来自PSS公司(ParticleSizingSystems))。

可用颗粒计数器，例如Accusizer^TM770(来自PSS公司)测定尺寸>1.2μm的颗粒数。

本发明的方法用于制备水包油乳液。这些乳液包含三种核心成分：油；水性组分；和表面活性剂。

由于乳液要用于药学应用，油通常应该是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。

油优选包含鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油(C₃₀H₅₀；[(CH₃)₂C[＝CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂＝CHCH₂-]₂；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯；CASRN7683-64-9)。鲨烯特别适用于本发明。

本发明的油可包括油的混合物(或组合)，例如包含鲨烯和至少一种其他油。

替代(或除了)使用鲨烯，乳液可含有来自例如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳液的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。

大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。

其他有用的油为生育酚，特定是和鲨烯结合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用这种生育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括鲨烯和生育酚(如DL-α-生育酚)的油组合。

所述水性组分可为淡水(如w.f.i.)或可包括其他组分如溶质。例如，可包含盐以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐，例如钠盐。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂一般是5-20mM。

表面活性剂优选是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。可通过'HLB'(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类，其中1-10范围内的HLB表示表面活性剂比起水更易溶于油，而10-20范围内的HLB表示比起油更易溶于水。乳液优选包含至少一种HLB为至少10，例如至少15或优选至少16的表面活性剂。

可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；

(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80(吐温80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。

所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂(如吐温80，HLB为15.0)和HLB值为1-10的表面活性剂(如司盘85，HLB为1.8)。

第一乳液的形成

微流化步骤前，可混合乳液组分形成第一乳液。

第一乳液中油滴的平均尺寸可以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm或以下，2000nm或以下，1200nm或以下，1000nm或以下，例如平均尺寸为800-1200nm或300nm-800nm。

在第一乳液中，尺寸>1.2μm的油滴数可以是5x10¹¹/ml或更少，例如5x10¹⁰/ml或更少，或5x10⁹/ml或更少。

然后，微流化第一乳液形成平均油滴尺寸小于第一乳液和/或尺寸>1.2μm的油滴更少的第二乳液。

可通过将第一乳液组分在匀浆器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如图1所示，可将其在混合容器(12)中混合，然后将混合组分引入(13)机械匀浆器，例如转子-定子匀浆器(1)。

可以垂直和/或水平方式操作匀浆器。为了方便在商业配置中使用，优选直列式匀浆器。

将组分引入转子-定子匀浆器，并接触含有槽或孔的迅速旋转的转子。组分以类似泵的方式向外离心甩出，通过槽/孔。在一些实施方式中，匀浆器包括多种转子和定子的组合，例如梳齿环同心排列，如图1的特征(3)和(4)；(5)和(6)以及(7)和(8)及图2所示。用于大规模匀浆器的转子可以在水平方向的多刃叶轮上具有梳齿环(例如图1中的特征(9))，彼此精密排列，以配合静态衬里中的齿。第一乳液通过转子和定子之间空隙中发生的湍流、空化和机械剪切组合形成。以与转子轴平行的方向有用地引入组分。

转子-定子匀浆器中的重要性能参数是定子的叶尖速度(圆周速度)。该参数是转速和转子直径的函数。至少10ms^-1的叶尖速度是有用的，且理想上更快，例如≥20ms^-1、≥30ms^-1、≥40ms^-1等。可用小型匀浆器在10,000rpm轻易实现40ms^-1的叶尖速度，或用较大的匀浆器在较低转速(例如2,000rpm)实现。合适的高剪切匀浆器可市售获得。

对于商业规模生产，匀浆器应理想地具有至少300升/小时，例如≥400升/小时,≥500升/小时,≥600升/小时,≥700升/小时,≥800升/小时,≥900升/小时,≥1000升/小时,≥2000升/小时,≥5000升/小时,或甚至≥10000升/小时的流速。合适的高性能匀浆器可市售获得。

优选的匀浆器提供3x10⁵和1x10⁶s^-1的剪切速率，例如3x10⁵-7x10⁵s^-1、4x10⁵-6x10⁵s^-1,如约5x10⁵s^-1。

虽然转子定子匀浆器在操作过程中产热较少，但在使用中也可冷却匀浆器。理想的是，第一乳液的温度在匀浆过程中维持于60℃以下，例如45℃以下。

在一些实施方式中，可对第一乳液成分匀浆多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多次)。为了避免对一长串容器和匀浆器的需求，也可另外循环乳液成分(例如图1中特征(11)所示)。具体说，可将第一乳液组分循环通过某一匀浆器多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100次等)来形成第一乳液。然而，太多次循环可能不利，因为可能如参考文献14中所述产生重凝结。因此，如果使用匀浆器循环，可监控油滴尺寸，以检查是否达到所需液滴大小和/或不发生重凝结。

循环通过匀浆器是有利的，因为可以减少第一乳液中的油滴平均尺寸。循环是有利的，还因为可以减少第一乳液中尺寸>1.2μm的油滴的数量。第一乳液中这些平均液滴尺寸和尺寸>1.2μm的液滴数量的减少可在下游过程中提供益处。具体说，第一乳液组分循环通过匀浆器可实现改良微流化过程，随后引起第二乳液中即微流化后尺寸>1.2μm的油滴数量减少。第二乳液参数的该改进可提供改良的滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤期间内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失更少。

本文中的两种具体类型的循环称作“I型”和“II型”。I型循环如图5所示，II型循环如图6所示。

第一乳液组分的循环可包括在第一预混容器和匀浆器之间转移第一乳液组分的I型循环。第一预混容器的尺寸可以是50-500L，例如100-400L、100-300L、200-300L、250L或280L。可用不锈钢制造第一预混容器。I型循环可持续10-60分钟，例如10-40分钟，或20分钟。

第一乳液组分的循环可以包含将第一乳液组分从第一预混容器通过第一匀浆器转移到第二预混容器(可任选地具有与第一预混容器相同的性质)，然后通过第二匀浆器的II型循环。第二匀浆器通常与第一匀浆器相同，但在一些配置中第一和第二匀浆器不同。第一乳液组分通过第二匀浆器后，第一乳液组分可移回第一预混容器中，例如如果要重复II型循环过程。因此，乳液组分可以图8的路径在第一和第二预混容器之间通过一个匀浆器移动(见图6)。II型循环可以进行一次或多次，例如2,3,4,5次等。

与I型循环相比，II型循环是有利的，因为它能帮助确保第一乳液中的所有组分通过匀浆器。倾空第一预混容器意味着全部乳液内含物通过匀浆器进入第二预混容器。类似地，第二预混容器的内容物也可倾空，再次确保其全部通过匀浆器。因此，II型配置可便于确保全部乳液组分至少匀浆两次，可以减少第一乳液中的油滴平均尺寸和尺寸>1.2μm的油滴数量。因此理想的II型循环涉及倾空第一预混容器，将几乎全部其内含物通过匀浆器进入第二预混容器，然后倾空第二预混容器，将几乎全部其内含物通过匀浆器重进入第一(空)预混容器。因此全部颗粒通过匀浆器至少两次，这是I型循环难于实现的。在一些实施方式中使用I型和II型循环的组合，该组合提供了具有良好特性的第一乳液。特定地，该组合可以减少第一乳液中尺寸>1.2μm的油滴的数量。该组合可包含任何顺序的I型和II型循环，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。在一个实施方式中，所述组合包括20分钟的I型循环然后是一轮II型循环，即将经循环的第一乳液组分从第一预混容器通过第一匀浆器转移到第二预混容器，然后再通过第二匀浆器一次。

第一和第二预混容器可以置于惰性气体，例如多至0.5巴(bar)的氮气下。这可以防止乳液成分氧化，如果乳液组分之一是鲨烯则特别有利。这可提高乳液稳定性。

如上所述，匀浆器中的最初输入可以是未均质化的第一乳液组分的混合物。制备该混合物可通过将各种第一乳液组分单独混合,但在一些实施方式中，在该混合前可合并多种组分。例如，如果乳液包括HLB低于10的表面活性剂，那么该表面活性剂可与油在混合前先合并。类似地，如果乳液包括HLB高于10的表面活性剂，那么该表面活性剂可与水性组分在混合前先合并。缓冲盐可与水性组分在混合前先合并，或单独加入。

本发明的方法可以更大规模使用。因此，该方法涉及制备第一乳液，其体积大于1升，例如≥5升，≥10升，≥20升，≥50升，≥100升，≥250升等。

第一乳液可在形成后进行微流化，或可储存等待微流化。

在一些实施方式中，特定是使用多重循环的步骤(i)和(ii)时，匀浆器的输入可以是微流化机的输出，从而第一乳液进行微流化，然后再进行匀浆。

微流化

第一乳液在形成后进行微流化，以降低其平均油滴尺寸和/或减少尺寸>1.2μm的油滴数量。

微流化设备通过几何学固定的通道以高压和高速推动输入流组分来降低油滴平均尺寸。交互作用室入口处的压力(也称作“第一压力”)可以在至少85％，例如至少87％、至少90％、至少95％，至少99％或100％的时间内基本稳定(即±15％；例如±10％、±5％、±2％)，期间组分被加入微流化机器。

在一个实施方式中，在乳液加入微流化机的85％的时间内第一压力为1300巴(bar)±15％(18kPSI(磅/英寸²)±15％)，即1,100-1500巴(15-21kPSI)。图3显示了两种适合的压力分布。图3A中，压力在至少85％的时间内基本恒定，而在图3B中压力一直保持基本恒定。

微流化装置通常包括至少一个强化泵(优选两个泵，可同步)和交互作用室。强化泵理想上是电力-液压驱动的，提供高压(即第一压力)以迫使乳液进入和通过交互作用室。可用强化泵的同步性质提供上述乳液基本恒定的压力，意味着乳液滴在微流化过程中都接触基本相同水平的剪切力。

使用基本恒定压力的一个优点是可减少微流化装置中的疲劳失效，从而延长装置寿命。使用基本恒定压力的另一个优点是可改善第二乳液的参数。具体说，可减少存在于第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数目。另外，当使用相对恒定的压力时，可减少第二乳液的平均油滴尺寸。第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸>1.2μm的油滴数目的减少可提高滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤期间内含物损失更少，例如当乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失更少。

交互作用室可包含多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等通过乳液的固定几何通道。乳液通过直径为200-250μm的输入管线进入交互作用室。在乳液进入交互作用室时，分成液流，在高压下加速到高速。当通过管道时，高压产生的力能够减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸>1.2μm的油滴数目。这些力可包括：剪切力，通过使乳液流接触管道壁而变形；冲击力，通过高速乳液流彼此撞击时产生的碰撞；和空化力，通过液流内空腔的形成和瓦解。交互作用室通常不包括运动部件。其可包括陶瓷(例如氧化铝)或钻石(例如多晶钻石)管道表面。其它表面可用不锈钢制成。

交互作用室内多条管道的固定几何学可以是“Y”型几何或“Z”型几何。

在Y型几何交互作用室中，一条输入乳液流分成第一和第二乳液流，然后重新组合成一条输出乳液流。在重新混合前，第一和第二乳液流可以各自独立分成多条第一和第二(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流。当乳液流重新合并时，第一和第二乳液流(或其子流)理想地以基本相对的方向(例如第一和第二乳液流或其子流基本在同一平面(±20°)内流动，而第一乳液流的流动方向与第二乳液流的流动方向有180±20°的差异)。当乳液流重新合并时产生的力能够减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸>1.2μm的油滴数目。

在Z型几何交互作用室中，乳液流通过多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)几乎成直角的角(即90°±20°)。图4显示了具有Z型几何的交互作用室，其在流动方向中有两个直角拐角。输入的乳液流在绕过拐角流动时可以分成多条(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流，然后重新合并成一条输出乳液流(如图4所示，有4条子液流(32))。分裂然后重新组合(31)可在输入和输出之间的任何点发生。当乳液绕过拐角并接触管道壁时产生的力能够减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸>1.2μm的油滴数目。Z型交互作用室的一个例子是微流体公司(Microfluidics)的E230Z交互作用室。

在一个实施方式中，乳液流绕过至少两个基本直角的拐角。在输入乳液流绕过第一个基本直角的拐角时，其分成5条子流。当子流绕过第二个基本直角的拐角时，其重新组合成一条输出乳液流。

在现有技术中，通常对类似本发明的水包油乳液使用Y-型交互作用室。然而，我们发现对于水包油乳液使用Z型管道几何交互作用室是有利的，因为这使得第二乳液中存在的尺寸>1.2μm的油滴数目小于Y型几何交互作用室。第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数目减少可提供改善的滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤期间内含物损失更少，例如当乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失更少。

优选的微流化装置在170-2750巴(大约2500psi-40000psi)，例如约345巴、690巴、1380巴、2070巴等的压力下操作。

优选的微流化装置在多至20升/分钟，例如多至14升/分钟，多至7升/分钟，多至3.5升/分钟的流速下操作。

优选的微流化装置具有剪切速率超过1x10⁶s^-1，例如≥2.5x10⁶s^-1,≥5x10⁶s^-1,≥10⁷s^-1等的交互作用室。

微流化装置可包括多个平行使用的交互作用室，例如包括2、3、4、5或更多个，但有用的是包括一个交互作用室。

微流化装置可包括含至少一条管道的辅助处理模块(APM)。APM也有助于通过微流化装置的乳液中油滴的平均尺寸降低，虽然主要降低是在交互作用室中发生的。如上所述，乳液组分通过强化泵在第一压力下引入交互作用室。乳液组分通常可以第二压力离开APM，其比第一压力低(例如大气压)。一般通过交互作用室第一和第二压力之间的压力差下降了80-95％(例如图4中的P1-P2)，通过辅助处理模块第一和第二压力之间的压力差下降了5-20％，例如，交互作用室可提供约90％的压降，而APM可提供约10％的压降。如果通过交互作用室的压降和通过辅助处理模块的压降不引起整个第一和第二压力之间的压力差，这可能是由于交互作用室和辅助处理模块之间接头的有限压降。

APM通常不包括运动部件。其可包括陶瓷(例如氧化铝)或钻石(例如多晶钻石)管道表面。其它表面可用不锈钢制成。

APM通常位于交互作用室下游，还可与交互作用室依次排列。在现有技术中，APM通常位于包含Y型管道的交互作用室下游，以抑制空化并将Y型室中的流速提高达30％。另外，在现有技术中APM通常位于包含Z型管道的交互作用室上游，以减少大聚集物的尺寸。在后一种情况下，APM仅使Z型室中的流速减少达3％。然而，已发现将APM置于包含多条Z型管道的交互作用室下游在本发明中是有利的，因为它能导致第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸>1.2μm的油滴数目下降更多。如上所述，第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数目减少可提供改善的滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤期间内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失更少。如此放置Z型交互作用室和下游APM的另一个优点是能够在交互作用室后产生较慢的压力下降。较慢的压力下降能使得产物稳定性提高，因为减少了包封在乳液中的气体。

APM含有至少一条通过乳液的固定几何管道。APM可包含多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等通过乳液的固定几何通道。APM的管道可以是线性或非线性。合适的非线性管道是“Z”型几何或“Y”型几何，其与上面就交互作用室所述的相同。在一个实施方式中，APM的一条或多条管道是Z型几何。当乳液进入APM时，多条Z型管道将其分成液流。

与生产商的推荐相反，使用含有多条固定几何管道的APM与含有一条固定几何管道的APM相比是有利的，因为其能使得第二乳液中存在的尺寸>1.2μm的油滴数目减少更多。如上所述，第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数目减少可提供改善的滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤期间内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失更少。

在操作过程中微流化装置产热，其可将乳液温度与第一乳液相比提高15-20℃。因此，有利的是尽可能快地冷却微流化乳液。第二乳液的温度可维持在60℃以下，例如45℃下。因此，交互作用室的输出和/或APM的输出可加入冷却机制，例如热交换器或冷却线圈。输出和冷却机制之间的距离可以保持尽可能短，以通过减少冷却延迟而缩短总时间。在一个实施方式中，微流化机输出和冷却机制之间的距离为20-30cm。当乳液进行多次微流化步骤时，冷却机制特别有用，用于防止乳液过热。

微流化的产物是水包油乳液，即第二乳液，其中油滴的平均尺寸为500nm或以下。该平均尺寸特别有用，因为它能促进乳液过滤除菌。其中至少80％数量的油滴具有500nm或以下，例如400nm或以下，300nm或以下，200nm或以下或165nm或以下的乳液特别有用。另外，第二乳液中尺寸>1.2μm油滴数目为5x10¹⁰/ml或更少，例如5x10⁹/ml或更少，5x10⁸/ml或更少，或2x10⁸/ml或更少。

微流化的初始输入可以是第一乳液。然而在一些实施方式中，微流化的乳液再次微流化，从而发生多轮微流化。具体说，可将第二乳液组分循环通过某一微流化装置多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次等来形成第二乳液。可将第二乳液组分通过微流化装置循环4-7次，形成第二乳液。

第二乳液组分的循环可包括将第二乳液组分在第一乳液容器(可任选地具有与第一预混容器相同的性质)和微流化装置之间转移的I型循环。

第二乳液组分的循环可以包含将第二乳液组分从第一乳液容器通过第一微流化装置转移到第二乳液容器(可任选地具有与第一预混容器相同的性质)，然后通过第二微流化装置的II型循环。

第二微流化装置可与第一微流化装置相同。或者第二微流化装置也可与第一微流化装置不同。

第一乳液容器可与第一预混容器相同。或者，第一乳液容器可与第二预混容器相同。

第二乳液容器可与第一预混容器相同。或者，第二乳液容器可与第二预混容器相同。

第一乳液容器可与第一预混容器相同，第二乳液容器可与第二预混容器相同。或者，第一乳液容器可与第二预混容器相同，第二乳液容器可与第一预混容器相同。

或者，第一和第二乳液容器可以与第一和第二预混容器不同。

第二乳液组分通过第二微流化装置后，第二乳液组分可移回第一乳液容器中，例如如果要重复II型循环过程。II型循环可以进行一次或多次，例如2,3,4,5次等。

II型循环是有利的，因为它确保所有第二乳液组分通过微流化装置至少2次，减少了第二乳液中的平均油滴尺寸和尺寸>1.2μm的油滴数目。

微流化过程中可联用I型循环和II型循环。该组合可包含任何顺序的I型和II型循环，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。

第一和第二乳液容器可以置于惰性气体，例如多至0.5巴的氮气下。这可以防止乳液成分氧化，如果乳液组分之一是鲨烯则特别有利。这使得乳液稳定性提高。

本发明的方法可以更大规模使用。因此，该方法涉及微流化，其体积大于1升，例如≥5升、≥10升、≥20升、≥50升、≥100升、≥250升等。

过滤

微流化后，过滤第二乳液。该过滤除去任何可能经受匀化和微流化过程的大油滴。虽然数目很少，这些油滴体积可能较大且可用作聚集的成核位点，导致储存过程中乳液降解。另外，该过滤步骤可实现过滤除菌。

适用于过滤除菌的颗粒过滤膜视第二乳液的液体特性和所需过滤程度而定。滤器的特征可影响其过滤微流化乳液的适用性。例如，其孔径和表面特征是重要的，尤其在过滤基于鲨烯的乳液时。

用于本发明的膜孔径应允许所需液滴通过，而保留不需要的液滴。例如，其应当保留尺寸≥1μm的液滴而允许<200nm的液滴通过。0.2μm或0.22μm的滤器是理想的，而且也能实现过滤除菌。

可将乳液预先滤过例如0.45μm滤器。可用已知的双层滤器一步实现预过滤和过滤，所述滤器包括具有较大孔的第一膜层和具有较小孔的第二膜层。双层滤器对于本发明特别有用。第一层理想上孔径>0.3μm，例如0.3-2μm或0.3-1μm，或0.4-0.8μm，或0.5-0.7μm。优选第一层中的孔径≤0.75μm。因此，第一层的孔径为例如0.6μm或0.45μm。第二层理想上孔径小于第一层孔径的75％(理想地小于一半)，例如为第一层孔径的25-70％或25-49％，如30-45％,例如第一层孔径的1/3或4/9。因此，第二层的孔径为<0.3μm,例如0.15-0.28μm或0.18-0.24μm，如0.2μm或0.22μm孔径。在一个实施例中，具有较大孔的第一膜层提供0.45μm滤器，而具有较小孔的第二膜层提供0.22μm滤器。

滤膜和/或预过滤膜可以是不对称的。不对称膜是滤膜一侧与另一侧尺寸不同，例如进入面的孔径大于离开面的孔径。不对称膜的一面可称为“粗糙多孔表面”，而不对称膜的另一面可称为“精细多孔表面”。在双层滤器中，两层之一或(理想地)两者可以是不对称的。

滤膜可以是多孔或均匀的。均匀膜通常是10-200μm的致密膜。多孔膜具有多孔结构。在一个实施方式中，滤膜是多孔的。在双层滤器中，两层都可以是多孔的，两层都可以是均匀的，或可以是一层多孔一层均匀。优选的双层滤器是其中一层为多孔的。

在一个实施方式中，第二乳液预先滤过不对称的亲水多孔膜，然后滤过另一孔径小于预过滤膜的不对称亲水多孔膜。这可用双层滤器。

滤膜可在使用前高压灭菌，以确保其无菌。

滤膜通常用聚合物支撑材料制成，例如PTFE(聚四氟乙烯)、PES(聚醚砜)、PVP(聚乙烯吡咯烷)、PVDF(聚偏二氟乙烯)、尼龙(聚酰胺)、PP(聚丙烯)、纤维素(包括纤维素酯)、PEEK(聚乙醚乙醚酮)、硝基纤维素等。这些具有不同特性，一些载体本身是疏水的(例如PTFE)，其它本身是亲水的(例如乙酸纤维素)。然而，可通过处理膜表面来改变这些固有特性。例如，已知通过用其它材料(例如其它聚合物、石墨、硅等)涂覆膜表面处理来制备亲水性或疏水性膜，例如见参考文献15的2.1节。在双层滤器中，两层膜可用不同材料或(理想地)用相同材料制备。

用于本发明的理想滤器具有亲水表面，与参考文献9-12应使用疏水(聚砜)滤器的教导相反。可用亲水材料，或通过使疏水材料亲水化形成具有亲水表面的滤器，优选用于本发明的滤器是亲水聚醚砜膜。已知多种不同方法将疏水PES膜转化成亲水PES膜。这通常是通过在膜上涂覆亲水聚合物实现。为了使得亲水聚合物永久结合于PES，亲水涂覆层通常进行交联反应或接枝。参考文献15公开了一种改变具有可官能化链末端的疏水聚合物表面性质的方法，包括使聚合物接触接头部分溶液，形成共价连接，然后使反应的疏水聚合物与改性剂溶液接触。文献16公开了一种通过直接膜涂覆使PES膜亲水化的方法，包括预先用醇湿润，然后浸入含有亲水性单体、多官能单体(交联剂)和聚合引发剂的水溶液中。用热或UV引发单体和交联剂的聚合，在膜表面形成交联亲水聚合物涂层。类似地，文献17和18公开了PES膜涂覆，将其浸入亲水聚合物(聚环氧烷)和至少一种多官能单体(交联剂)的水溶液中，然后聚合单体以提供不能提取的亲水涂层。文献19描述了通过接枝反应来亲水化PES膜，其中PES膜经历低温氦等离子体处理，然后将亲水性单体N-乙烯-2-吡咯烷(NVP)接枝到膜表面。其它的这种方法公开于参考文献20-26。

在不依赖于涂层的方法中，PES可溶于溶剂，与可溶性亲水添加剂混合，然后用混合溶液铸造亲水膜，例如通过沉淀或引发共聚。这种方法公开于参考文献27-33。例如，文献33公开了一种制备亲水荷电膜的方法，该膜可提取物少，能够快速回复超纯水抗性，具有交联的相互渗透聚合物网络结构，制得混合PES、PVP、聚乙二亚胺和脂族二缩水甘油醚的聚合物溶液，形成溶液薄膜，并沉淀所述薄膜形成膜。类似的方法公开于参考文献34。

可使用杂交方法，其中亲水添加剂存在于膜形成过程中并还在随后作为涂层添加，例如见参考文献35。

也可通过低温等离子体处理实现PES膜的亲水化。参考文献36描述了通过低温CO₂等离子体处理对PES膜进行亲水改性。

还可通过氧化，如参考文献37所述实现PES膜的亲水化。该方法涉及用具有低表面张力的液体预润湿疏水PES膜，使湿PES膜接触氧化剂水溶液，然后加热。

还可使用相转化法，如参考文献38所述。

可通过用PVP(亲水性)处理PES(疏水性)获得理想的亲水PES膜。发现用PEG(亲水性)代替PVP处理得到容易积垢的亲水PES膜(特别是在用含鲨烯的乳液时)，而且在高压灭菌时不利地释放甲醛。

优选双层滤器具有第一亲水PES膜和第二亲水PES膜。

已知的亲水膜包括Bioassure(来自坤诺公司(Cuno))；EverLUX^TM聚醚砜；STyLUX^TM聚醚砜(都来自迈斯纳公司(Meissner))；MillexGV,MillexHP,Millipak60,Millipak200和DuraporeCVGL01TP3膜(来自密理博(Millipore))；Fluorodyne^TMEXEDF膜，Supor^TMEAV；Supor^TMEBV,Supor^TMEKV(都来自颇尔公司(Pall))；Sartopore^TM(来自赛多利斯(Sartorius))；Sterlitech的亲水PES膜；和Wolftechnik的WFPESPES膜。

过滤期间，乳液可维持在40℃或以下的温度，例如30℃或以下，以促进成功无菌过滤。一些乳液可能在40℃以上的温度时不能通过无菌滤器。

有利的是在产生第二乳液的24小时内，例如在18小时内，12小时内，6小时内，2小时内，30分钟内进行过滤步骤，因为这段时间以后第二乳液可能无法通过无菌滤膜而不使其堵塞，如参考文献39中所述。

本发明的方法可以更大规模使用。因此，该方法涉及过滤，其体积大于1升，例如≥5升，≥10升，≥20升，≥50升，≥100升，≥250升等。

最终乳液

微流化和过滤结果得到水包油乳液，其中油滴的平均尺寸可为220nm以下，例如155±20nm,155±10nm或155±5nm,其中尺寸>1.2μm的油滴数目可以为5x10⁸/ml或以下，例如5x10⁷/ml或以下，5x10⁶/ml或以下，2x10⁶/ml或以下，或5x10⁵/ml或以下。

本文所述乳液的平均油滴尺寸(包括第一和第二乳液)通常不小于50nm。

本发明的方法可以更大规模使用。因此，该方法涉及制备最终乳液，其体积大于1升，例如≥5升，≥10升，≥20升，≥50升，≥100升，≥250升等。

一旦形成水包油乳液，其可转移到无菌玻璃瓶内。玻璃瓶的大小可以是5、8、或10升。或者，水包油可以转移到无菌柔性袋(柔性袋)内。柔性袋的大小可以是50、100、或250升。另外，柔性袋可接上一个或多个无菌接头，以连接柔性袋与系统。使用装有无菌接头的柔性袋与玻璃瓶相比是有利的，因为柔性袋比玻璃瓶更大，意味着不需要更换柔性袋来储存一批中制备的全部乳液。这可为乳液制备提供无菌的密闭系统，其减少了存在于最终乳液中的杂质几率。如果最终乳液用于药学目的，例如如果最终乳液是MF59佐剂，这就特别重要。

最终乳液中油的含量(体积％)优选为2-20％，例如约10％。约5％或约10％的鲨烯含量特别有用。30-50mg/ml的鲨烯含量(w/v)是有用的，例如35-45mg/ml,36-42mg/ml,38-40mg/ml等。

最终乳液中表面活性剂的优选量(重量％)为：聚氧乙烯山梨醇酯(例如吐温80)0.02-2％，特定是约0.5％或约1％；去水山梨醇酯(例如司盘85)0.02-2％，特定是约0.5％或约1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100)0.001-0.1％,特定是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20％,优选0.1-10％，特定是0.1-1％或约0.5％。4-6mg/ml的聚山梨醇酯80含量(w/v)有用，例如4.1-5.3mg/ml。4-6mg/ml的去水山梨糖醇三油酸酯含量(w/v)有用，例如4.1-5.3mg/ml。

该方法对于制备任何下列水包油乳液特别有用：

·含有鲨烯、聚山梨酯80(吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)的乳液。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％去水山梨糖醇三油酸酯。以重量计，这些含量变为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％去水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂称为‘MF59’。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·包含鲨烯、α-生育酚(理想的是DL-α-生育酚)和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有(重量计)2-10％鲨烯，2-10％α生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，例如4.3％鲨烯、4.7％α-生育酚、1.9％聚山梨酯80。鲨烯：生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这提供了更稳定的乳液。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过以下方法制备一种这类乳液：将聚山梨酯80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5gDL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物相混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有如尺寸为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可含有3-O-脱酰化单磷酰脂质A(‘3d-MPL’)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有鲨烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[40]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4激动剂，如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[41]。这类乳液可冻干。

如上以百分数表示的这些乳液的组合物可通过稀释或浓缩来改变(例如可以改变整数倍，如2或3倍，或改变部分，例如2/3或3/4)，其中其比例保持不变。例如，2倍浓缩的MF59可包含约10％鲨烯，约1％聚山梨酯80和约1％去水山梨糖醇三油酸酯。可稀释浓缩形式(例如用抗原溶液)，得到所需的乳液终浓度。

本发明的乳液理想地储存在2℃-8℃。其不应冷冻。它们理想地应避直射光保存。特别是本发明含鲨烯的乳液和疫苗应当受到保护避免鲨烯的光化学分解。如果储存本发明的乳液，那么优选在惰性气体，例如氮气或氩气中。

疫苗

虽然可能将水包油乳液佐剂本身给予患者(如为单独给予患者的抗原提供佐剂效应)，但更常见的是将佐剂与抗原混合形成免疫原性组合物例如疫苗，然后给予患者。可以在临用前或者在疫苗生产过程中混合乳液和抗原，然后装填。本发明的方法可用于两种情况。

因此，本发明方法还可包括将乳液与抗原组分混合的工艺步骤。或者，还可包括将佐剂与抗原组分一起包装到药盒中作为药盒组分的步骤。

因此，综上所述，制备混合的疫苗时或制备包含用前混合的抗原和佐剂的药盒时，可使用本发明。如果在生产过程中混合，那么混合的散装抗原和乳液的体积一般大于1升，例如≥5升、≥10升、≥20升、≥50升、≥100升、≥250升等。如果在使用时混合，那么混合的体积一般小于1毫升，例如≤0.6ml、≤0.5ml、≤0.4ml、≤0.3ml、≤0.2ml等。在这两种情况下，通常混合的乳液和抗原溶液的体积基本相等，即基本上为1:1(例如1.1:1-1:1.1，优选1.05:1-1:1.05，更优选1.025:1-1:1.025)。然而，在一些实施方式中，可采用过量的乳液或过量的抗原[42]。当一种组分的体积过量时，过量通常为至少1.5:1，例如≥2:1、≥2.5:1、≥3:1、≥4:1、≥5:1等。

抗原和佐剂作为药盒中的单独组分时，它们在药盒中物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，组分可以装在不同的容器，如药瓶中。需要时，可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。

在另一种配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内含物注入药瓶中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合内容物给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。

在另一优选配置中，这两种药盒组分在同一注射器中但分开保存，例如双室注射器(如参考文献43-50等所述)。当操作注射器时(例如给予患者时)，将这两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。

不同药盒组成的内容物通常均为液体形式。在一些配置中，组分(一般是抗原组分而非乳液组分)是干燥形式(例如冻干形式)，而另一组分是液体形式。可将这两种组分混合，以再次激活干燥组分并得到给予患者的液体组合物。冻干组分一般置于药瓶中，而非注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置使用预填装注射器中的液态乳液组分和药瓶中的冻干抗原组分。

如果疫苗还含有乳液和抗原以外的组分，那么这些其它组分可包含于这两种药盒组分之一，或者可以是第三种药盒组分的一部分。

适用于本发明混合疫苗或单独药盒组分的容器包括药瓶和一次性注射器。这些容器应无菌。

组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。在一个实施方式中，药瓶具有丁基橡皮塞。药瓶可包含单一剂量的疫苗/组分，或者可以包含一个以上剂量('多剂量'药瓶)，如10个剂量。在一个实施方式中，药瓶包含10x0.25ml剂量的乳液。优选的药瓶由无色玻璃制成。

药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶中移出注射器后，可连上针头并将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。

将组合物/组分包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可提供注射器单独的针头以组装和使用。优选安全性针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。

可用缓冲液稀释乳液，然后包装入药瓶或注射器。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。稀释可降低佐剂组分的浓度，而维持其相对比例，例如提供“半强度”佐剂。

容器可标注有半剂量体积，以例如利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。

采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。

各种抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于：病毒抗原，如病毒表面蛋白；细菌抗原，如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生物抗原；和肿瘤抗原。本发明特别可用于针对以下的疫苗：流感病毒、HIV、钩虫、乙肝病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、衣原体、SARS冠状病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏菌(NeisseriaMeningitidis)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、EB病毒、人乳头瘤病毒等。例如：

流感病毒抗原.抗原可以采取活病毒或者灭活病毒的形式。采用灭活病毒时，该疫苗可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。流感抗原也可以病毒体形式出现。所述抗原可具有选自下组的任何血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16。疫苗可包括来自一种或多种(例如1、2、3、4或更多种)流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原，例如单价A/H5N1或A/H1N1疫苗或三价A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是重配毒株，并可通过逆向遗传学技术获得[如51-55]。因此，该病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6:2重配毒株)的一个或多个RNA节段。可以在鸡蛋(如含胚鸡蛋)或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。使用细胞培养物时，细胞底物一般是哺乳动物细胞系，如MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括：MDCK细胞[56-59]，衍生自马达二氏(MadinDarby)犬肾；Vero细胞[60-62]，衍生自非洲绿猴肾；或PER.C6细胞[63]，衍生自人胚视网膜母细胞。在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合物宜不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。通常参照血凝素(HA)含量(通常用SRID测定)标准化疫苗的单位剂量。现有的疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但也可使用更低的剂量，特别是使用佐剂时。采用了分数剂量如1/2(即7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8[64、65]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[66、67])。因此，疫苗可包含0.1-150μgHA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5μg等/毒株。

人免疫缺陷病毒，包括HIV-1和HIV-2。该抗原一般是包膜抗原。

乙肝病毒表面抗原。该抗原优选通过重组DNA方法获得，例如在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达后获得。与天然病毒HBsAg不同，重组酵母表达的抗原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。不像天然HBsAg颗粒，酵母表达的颗粒可能包含磷脂酰肌醇。HBsAg可来自以下任何亚型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-和adrq+。

钩虫，特别是犬中发现的钩虫(犬钩虫(Ancylostomacaninum))。这种抗原可以是重组Ac-MTP-1(虾红素样金属蛋白酶)和/或天冬氨酸血红蛋白酶(Ac-APR--1)，它可以在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达为分泌蛋白[68,69]。

单纯疱疹病毒抗原(HSV).用于本发明的优选HSV抗原是膜糖蛋白gD。优选使用HSV-2毒株的gD('gD2'抗原)。该组合物可使用C-末端膜锚定区缺失的gD形式[70]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短型gD。这种蛋白质形式包括信号肽，信号肽被切割后产生成熟的283个氨基酸的蛋白质。缺失锚定物可将该蛋白制备成可溶形式。

人乳头瘤病毒抗原(HPV).用于本发明的优选HPV抗原是L1衣壳蛋白，该蛋白可组装形成称为病毒样颗粒(VLP)的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或昆虫细胞(例如夜蛾(Spodoptera)细胞，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，或果蝇(Drosophila)细胞)中重组表达L1产生VLP。在酵母细胞中，质粒载体可携带L1基因；在昆虫细胞中，杆状病毒载体可携带L1基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已证明这种二价组合非常有效[71]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-11毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60μg/ml(如约40μg/ml)的L1/HPV毒株。

炭疽抗原。炭疽是由炭疽杆菌(Bacillusanthracis)引起的。合适的炭疽杆菌抗原包含A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者共有称为保护性抗原(PA)的B组分。任选地，可使抗原脱毒。其它详情可参见参考文献[72-74]。

金黄色葡萄球菌(S.aureus)抗原已知各种金黄色葡萄球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如5型和/或8型菌株)和蛋白(例如IsdB,Hla,等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。

肺炎链球菌(S.pneumoniae)抗原已知各种肺炎链球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和/或23F)和蛋白质(例如肺炎球菌溶血素、脱毒的肺炎球菌溶血素、聚组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。

癌抗原.已知各种肿瘤特异性抗原。本发明可使用引发针对肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治疗性应答的抗原。

抗原溶液通常与乳液，例如以1:1的体积比混合。该混合可以由疫苗生产商在装填前进行，或可在使用时由健康护理工作者进行。

药物组合物

用本发明方法制备的组合物是药学上可接受的。它们可包含除了乳液和可任选抗原以外的组分。

所述组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[75,76]。更优选无汞的疫苗和组分。组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5。因此，本发明方法可包括在包装前调整疫苗pH的步骤。

该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。

疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。

治疗方法和所述疫苗给予

本发明提供用本发明方法制备的药盒和组合物。根据本发明方法制备的组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将这种组合物给予患者的步骤。

本发明也提供用作药品的这些药盒和组合物。

本发明也提供以下应用：(i)抗原的水性制剂；和(ii)按照本发明制备的水包油乳液在制备引起患者中免疫应答的药物中的应用。

这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。

可以各种方式给予该组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[77-79]、口服[80]、皮内[81,82]、经皮、透皮[83]等。

可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。患者可以是老年人(如≥50岁，优选≥65岁)、青少年(如≤5岁)、住院患者、健康护理人员、军队服役人员和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去国外旅行的人。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。

可在与其它疫苗基本相同的时间(例如在向健康护理专业人员的同一次医疗咨询或就诊期间)，将本发明疫苗给予患者。

中间过程

本发明还提供了制备水包油乳液的方法，包括微流化第一乳液形成第二乳液，然后过滤第二乳液。第一乳液具有如上所述的特征。

本发明还提供了制备水包油乳液的方法，包括过滤第二乳液，即微流化乳液。微流化乳液具有如上所述的特征。

本发明还提供了制备疫苗的方法，包括组合乳液和抗原，其中乳液具有上述特征。

特定实施方式

本发明的特定实施方式包括：

·一种生产含鲨烯的水包油乳液的方法，包括步骤(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水膜过滤第二乳液。

·一种生产水包油乳液疫苗的方法，包括步骤(i)形成具有5000nm或以下的第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水膜过滤第二乳液。

·一种生产水包油乳液的方法，包括步骤(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水聚醚砜膜过滤第二乳液。

·一种生产含有鲨烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步骤(i)用匀浆器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液通过使第一乳液组分循环通过匀浆器多次而形成。

·一种生产含鲨烯的水包油乳液的方法，该方法包括步骤(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液通过循环第二乳液组分形成，所述循环通过将第二乳液组分从第一乳液容器经第一微流化装置转移到第二乳液容器，然后通过第二微流化装置，其中第一和第二微流化装置相同。

·一种生产水包油乳液的方法，包括：使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸小于的第二乳液；其中微流化装置包括含多条Z型管道的交互作用室和含至少一根管道的辅助处理模块；其中辅助处理模块位于交互作用室下游。

·一种生产水包油乳液的方法，包含步骤：使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中微流化装置包括含多条管道的交互作用室和辅助处理模块。

·一种生产水包油乳液的方法，包括步骤：使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中微流化装置包括交互作用室，其中交互作用室入口处的乳液组分压力在乳液加入微流化机期间至少85％的时间内基本恒定。

·一种生产水包油乳液的方法，包括步骤：形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中在惰性气体，例如氮气，如在多至0.5巴的压力下形成第一乳液。

·一种生产水包油乳液的方法，包含步骤：使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中在惰性气体，例如氮气，如在多至0.5巴的压力下形成第二乳液。

·一种生产水包油乳液的方法，包括步骤(i)成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；(iii)过滤第二乳液；(iv)将水包油乳液转移入无菌柔性袋中。

概述

术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是任选的，其表示(例如)x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并物再与第三种组分混合等。

将动物(且具体是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，具体是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

附图简要说明

图1显示了能用于形成第一乳液的匀浆器的具体例子。

图2显示了可用于这种匀浆器的转子和定子的细节。

图3显示了同步强化泵模式的两种压力分布。

图4显示了Z型管道交互作用室。

图5显示了I型循环，而图6显示了II型循环。容器标为“C”，匀浆器标为“H”。显示了流体运动的方向和顺序。在图6中，匀浆器具有两个输入箭头和两个输出箭头，但是实际上匀浆器只有一条输入管道和一条输出管道。

具体实施方式

实施例1：

将乳液组分角鲨烯、聚山梨酯80、去水山梨糖醇三油酸酯和柠檬酸钠缓冲液引入直列式、高速、转子/定子匀浆器(IKA超级Dispax反应器DRS2000/5)。使用280L和250L的乳液起始体积，匀浆器速度设置为5000±1000rpm。匀化期间的乳液温度维持在低于60℃。

进行三次检测运行。在第一测试运行中，280L的乳液组分进入匀浆器和第一预混容器之间的I型循环运行20分钟，然后是单一II型循环，将来自第一预混不锈钢容器的所述第一乳液组分通过匀浆器转移到第二预混不锈钢容器中，然后通过匀浆器返回。在第二测试运行中，280L的乳液组分进入匀浆器和第一预混不锈钢容器之间的I型循环运行5分钟，然后是5次II型循环，将来自第一预混不锈钢容器的所述第一乳液组分通过匀浆器转移到第二预混不锈钢容器中，然后通过匀浆器返回所述第一预混不锈钢容器。在第三测试运行中，250L的乳液组分进入匀浆器和第一预混不锈钢容器之间的I型循环运行20分钟，然后是单一II型循环，将来自第一预混不锈钢容器的所述第一乳液组分通过匀浆器转移到第二预混不锈钢容器中，然后通过匀浆器返回所述第一预混不锈钢容器。

均质化所述第一乳液直到其平均油滴尺寸为1200nm或更小，且尺寸>1.2μm的油滴数目为5x10⁹/ml或更少。

然后所述第一乳液进行微流化以形成第二乳液。所述乳液通过微流化装置5次。在约600-800巴(即约9000-12000psi)操作所述微流化装置，且微流化期间使用冷却机制将所述乳液维持在40±5℃的温度中。

然后无菌过滤所述第二乳液。

各测试运行中滤出乳液的油滴平均尺寸满足MF59乳液的规格。

表1示出所述第一、第二和第三测试运行中的其他乳液参数。

参数	单位	第一次运行	第二次运行	第三次运行
					第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数量	/ml	43.7x 10⁶	56.4x 10⁶	45.1x 10⁶
过滤后尺寸>1.2μm的油滴数量	/ml	0.2x 10⁶	0.6x 10⁶	0.5x 10⁶

表1

三次运行的结果都很优异。然而，表1中的结果显示测试运行1中，过滤后的乳液中尺寸>1.2μm的颗粒数量相比第二乳液中存在的数量降低百分比最大(99.5％)。因此，最佳的均质化循环形式是约20分钟的I型循环然后是II型循环。

实施例2：

其他实验中，I型(图5)或II型(图6)循环形成第一乳液。5次单独运行中，每毫升最大颗粒的平均数量如下：

	均值	变化系数
			I型	1.70x 10⁹	0.23
II型	1.04x 10⁹	0.13

因此，II型循环产生更少的大液滴且批次间变化更小。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。

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Claims

1.一种生产含有鲨烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步骤：(i)用匀浆器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中所述第一乳液通过包含下述的循环形成：

a)I型循环，所述I型循环在第一容器和匀浆器之间转移所述第一乳液组分，然后

b)II型循环，所述II型循环通过匀浆器将所述第一乳液组分从所述第一容器转移到第二容器中，然后通过同一匀浆器将它们从所述第二容器返回所述第一容器。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一容器中基本所有的乳液组分通过所述匀浆器进入所述第二容器，然后所述第二容器中基本所有的乳液组分通过所述匀浆器返回所述第一容器。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括：(ii)微流化所述第一乳液以形成具有小于所述第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二乳液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述匀浆器提供多至1x10⁶s^-1的剪切速率，且其中所述微流化在提供>2.5x10⁶s^-1的剪切速率的交互作用室中发生。

5.如前述权利要求中任一所述的方法，所述方法包括：(iii)过滤所述第二乳液。

6.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，步骤(i)包括将所述第一乳液组分从所述第一容器转移到所述第二容器并再返回的两次或更多的循环。

7.如权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中所述第二乳液通过将所述第二乳液组分多次循环通过微流化装置来形成。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二乳液组分的循环包括在第一乳液容器和微流体装置之间转移第二乳液组分。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第二乳液组分的循环包括将第一乳液容器中的第二乳液组分通过第一微流化装置转移到第二乳液容器中，然后通过第二微流化装置，其中所述第一和第二微流化装置相同。

10.如权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于，所述第二乳液组分通过所述第二微流化装置后返回所述第一乳液容器，并且权利要求10或11所述循环重复一次或多次。

11.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第一平均油滴尺寸是5000nm或更小。

12.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第一乳液中尺寸>1.2μm的油滴数量为5x10¹¹/ml或更少。

13.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第二平均油滴尺寸是500nm或更小。

14.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第二乳液中尺寸>1.2μm的油滴数量为5x10¹⁰/ml或更少。

15.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述水包油乳液包含2-20％的油。

16.如前述权利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述水包油乳液包含鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯。

17.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括按照权利要求1-18中任一所述制备乳液，并将所述乳液与抗原混合。

18.一种制备疫苗药盒的方法，所述药盒包括按照权利要求1-16任一所述制备乳液，并将所述乳液作为药盒组分与抗原组分一起包装入药盒。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述药盒组分在独立的药瓶中。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述药瓶用硼硅酸盐玻璃制成。

21.如权利要求18-20中任一所述的方法，其特征在于，所述佐剂是散装佐剂，且所述方法包括从所述散装佐剂提取单位剂量作为药盒组分包装。

22.如权利要求17-21中任一所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感病毒抗原。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述乳液与所述抗原的组合形成疫苗组合物且其中所述疫苗组合物包括每流感病毒株约15μg、约10μg、约7.5μg、约5μg、约3.8μg、约1.9μg或约1.5μg血凝素。

24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述乳液和所述抗原组合形成疫苗组合物，且其中所述疫苗组合物包含硫柳汞或2-苯氧基乙醇防腐剂。