ES2927797T3

ES2927797T3 - Vacunación de sujetos inmunocomprometidos

Info

Publication number: ES2927797T3
Application number: ES15781436T
Authority: ES
Inventors: Giudice Giuseppe Del; Rino Rappuoli; Steven Black; Uwe Nicolay
Original assignee: Seqirus UK Ltd
Current assignee: Seqirus UK Ltd
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: HUE060456T2; JP2022009403A; DK3197487T3; KR20230154072A; EP4144369A1

Abstract

En el presente documento se describen métodos para mejorar las respuestas inmunitarias a una vacuna en individuos inmunocomprometidos, incluidos los que reciben una terapia con estatinas. También se proporcionan productos relacionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunación de sujetos inmunocomprometidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere de manera general a mejorar una respuesta inmunitaria en individuos inmunocomprometidos por medicamentos o por otras razones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La inmunosupresión inducida por fármacos u otras razones en un sujeto es un obstáculo para lograr una vacunación eficaz del sujeto. Es importante tener en cuenta que los individuos pueden estar inmunocomprometidos por una variedad de razones, que incluyen, por ejemplo, una enfermedad o un trastorno asociado con la inmunosupresión, la edad (por ejemplo, los ancianos) y estar bajo tratamiento con medicamentos o procedimientos médicos que suprimen o interfieren de otro modo con su respuesta inmunitaria.

Ciertos fármacos se han implicado en causar inmunomodulación en pacientes, incluyendo las estatinas, los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), los interferones y ciertos fármacos antipsicóticos, como la clozapina y el haloperidol. Tales efectos inmunomoduladores incluyen inmunosupresión adversa o no deseada en los pacientes, en particular aquellos en un régimen terapéutico a largo plazo.

Las estatinas son una clase de fármacos que se usan para reducir los niveles de colesterol inhibiendo la enzima HMG-CoA reductasa. Como la asociación entre los niveles elevados de colesterol y el riesgo de enfermedad cardiovascular y como los estudios que muestran que las estatinas pueden reducir este riesgo, se han administrado estatinas a un gran número de individuos, en su mayoría adultos mayores (Lewington S, Whitlock G, Clarke R, Sherliker P, Emberson J, Halsey J, Qizilbash N, Peto R, Collins R. (2007) "Blood cholesterol and vascular mortality by age, sex, and blood pressure: a meta-analysis of individual data from 61 prospective studies with 55,000 vascular deaths." Lancet 370 (9602): 1829-39). Aunque el objetivo principal de la terapia con estatinas ha sido reducir el colesterol, se ha reconocido que esta clase de fármacos tiene otros efectos, incluyendo efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios (Jain, M. K., & Ridker, P. M. (2005) "Anti-inflammatory effects of statins: clinical evidence and basic mechanisms." Nature Reviews Drug Discovery, 4(12): 977-987).

Los efectos secundarios de una terapia con estatinas en individuos, incluyendo poblaciones tanto de edad avanzada como de edad no avanzada, han sido algo controvertidos en la bibliografía, aunque la mayoría de los estudios han concluido que las estatinas pueden provocar efectos inmunomoduladores y que tales efectos son complejos.

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son una clase de fármacos que proporcionan efectos analgésicos (reductores del dolor) y antipiréticos (reductores de la fiebre) y, en dosis más altas, efectos antiinflamatorios. Los AINE a veces también se denominan agentes antiinflamatorios no esteroideos/analgésicos (NSAIA) o medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIM). Debido a la importancia de la gestión del dolor, el uso de AINE se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas. Sin embargo, todos los AINE tienen el potencial de ciertos efectos adversos, incluyendo la supresión potencialmente no deseada de una respuesta inmunitaria.

Los interferones (IFN) son un grupo de proteínas de señalización elaboradas y liberadas por las células huésped en respuesta a la presencia de patógenos, como virus, bacterias, parásitos o células tumorales. En un escenario típico, una célula infectada por virus liberará interferones haciendo que las células cercanas aumenten sus defensas antivirales. El interferón beta-1a y el interferón beta-1b se usan para tratar y controlar la esclerosis múltiple, un trastorno autoinmune. Este tratamiento es eficaz para reducir los ataques en la esclerosis múltiple remitenterecurrente y ralentizar la progresión y la actividad de la enfermedad en la esclerosis múltiple progresiva secundaria.

Los efectos adversos más frecuentes informados por los pacientes que reciben terapia con interferón son síntomas similares a los de la gripe: aumento de la temperatura corporal, sensación de malestar, fatiga, dolor de cabeza, dolor muscular, convulsiones, mareos, adelgazamiento del cabello y depresión. También se observan frecuentemente eritema, dolor y dureza en el lugar de la inyección. La terapia con IFN provoca inmunosupresión, en particular a través de la neutropenia y puede provocar que algunas infecciones se manifiesten de maneras inusuales. La terapia con IFN también puede mostrar una susceptibilidad aumentada a las infecciones secundarias después de una infección viral, como la gripe. En tales casos, el paciente coinfectado con el patógeno primario (como el virus de la gripe) y un patógeno secundario (como una infección bacteriana) puede tener un riesgo elevado de desarrollar complicaciones por la infección secundaria.

Se ha informado que ciertos compuestos antipsicóticos provocan efectos secundarios, incluyendo la inmunosupresión en sujetos.

La terapia con interferón se usa (en combinación con quimioterapia y radiación) como tratamiento para algunos tipos de cáncer.[26] Este tratamiento puede usarse para el tratamiento de enfermedad maligna hematológica; leucemia y linfomas, incluyendo la leucemia de células pilosas, la leucemia mieloide crónica, el linfoma nodular y el linfoma cutáneo de células T.[26] Los pacientes con melanomas recurrentes reciben IFN-a2b recombinante.[27] Tanto la hepatitis B como la hepatitis C se tratan con IFN-a, a menudo en combinación con otros fármacos antivirales.[28][29] Algunos de los tratados con interferón tienen una respuesta virológica sostenida y pueden eliminar el virus de la hepatitis. La cepa más dañina, el virus de la hepatitis C genotipo I, puede tratarse con una tasa de éxito del 60-80% con el tratamiento estándar actual de interferón-a, ribavirina e inhibidores de la proteasa recientemente aprobados como Telaprevir (Incivek) Mayo de 2011, Boceprevir (Victrelis) mayo de 2011 o el inhibidor de la polimerasa análogo de nucleótido Sofosbuvir (Sovaldi) diciembre de 2013 [30]. Las biopsias de pacientes que recibieron el tratamiento muestran reducciones en el daño hepático y la cirrosis. Cierta evidencia muestra que administrar interferón inmediatamente después de la infección puede prevenir la hepatitis C crónica, aunque el diagnóstico temprano en la infección es difícil ya que los síntomas físicos son escasos en la infección temprana por hepatitis C. El control de la hepatitis C crónica mediante IFN se relaciona con una reducción del carcinoma hepatocelular.[31]

El tratamiento con interferón se evaluó en individuos que padecían queratitis epitelial por el virus del herpes simple. Se demostró que la terapia tópica con interferón es un tratamiento eficaz, especialmente con concentraciones más altas.[32] El interferón, ya sea usado solo o en combinación con desbridamiento, parece ser tan eficaz como un agente antiviral nucleosídico.[32] La combinación de interferón y otro agente antiviral nucleosídico puede acelerar el proceso de curación.[32]

Cuando se usan en la terapia sistémica, los IFN se administran principalmente mediante una inyección intramuscular. La inyección de IFN en el músculo o debajo de la piel generalmente se tolera bien. Los efectos adversos más frecuentes son síntomas gripales: temperatura corporal aumentada, malestar, fatiga, dolor de cabeza, dolor muscular, convulsiones, mareos, adelgazamiento del cabello y depresión. También se observan frecuentemente eritema, dolor y dureza en el lugar de la inyección. La terapia con IFN provoca inmunosupresión, en particular a través de la neutropenia, y puede provocar que algunas infecciones se manifiesten de maneras inusuales.[33]

La WO2014095944 divulga composiciones de vacunas para su uso en poblaciones inmunocomprometidas. Kwong et al. (2009) PLOS one 4, 11, e8087 analiza la morbilidad y mortalidad por gripe en pacientes de edad avanzada que reciben estatinas en un estudio de cohortes.

Hasta la fecha, no ha habido consenso en la técnica en cuanto a la interacción entre la farmacocinética de estos fármacos y sus efectos moduladores sobre varios aspectos de la función inmunitaria in vivo y cómo se deben tener en cuenta dichos efectos en el tratamiento general de la salud de los pacientes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Ahora se ha descubierto que ciertas composiciones de vacunas y/o regímenes de vacunas pueden usarse eficazmente para potenciar una respuesta inmunitaria deseable en un individuo cuyo sistema inmunitario está comprometido. En particular, la presente invención incluye el reconocimiento de que una población de pacientes en terapia con estatinas muestra inmunogenicidad reducida a una vacuna, y que el uso de una vacuna con adyuvante (por ejemplo, vacunas formuladas con un adyuvante de aceite en agua) y/o un antígeno a dosis altas puede restaurar o incluso mejorar una respuesta inmunitaria a tal vacuna.

La invención proporciona una vacuna contra la gripe para su uso en la inmunización de un sujeto contra la infección por el virus de la gripe, en donde la vacuna comprende: (a) un adyuvante y una dosis estándar de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B; o (b) una dosis alta de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B, que tiene entre 30 jg y 150 |jg de antígeno por cepa de gripe; o (c) un adyuvante y una dosis alta de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B, que tiene entre 30 jg y 150 jg de antígeno por cepa de gripe; y en donde el sujeto tiene menos de 65 años, pero 18 años o más y está en tratamiento con estatinas.

En un sentido amplio, la presente invención describe la inmunización de un sujeto cuyo sistema inmunitario está comprometido por una o más razones. Por consiguiente, una vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la invención puede usarse en métodos para inmunizar sujetos en terapia con estatinas mediante la administración de una composición de vacuna que es (i) adyuvante y/o (ii) que contiene una dosis alta de antígeno al sujeto en una cantidad eficaz, de tal manera que, en comparación con una vacuna equivalente sin adyuvante o de dosis estándar, el sujeto provoca una mejor respuesta inmunitaria al mismo antígeno o antígenos contenidos en la vacuna. Los métodos descritos en la presente pueden proporcionar una protección inmunitaria particularmente beneficiosa para aquellos sujetos que de otro modo no producirían una respuesta inmunitaria deseada a una vacuna debido a medicamentos que provocan una inmunosupresión adversa.

Por consiguiente, la presente invención es adecuada para vacunar sujetos que se consideran "en riesgo". Los sujetos en riesgo pueden caracterizarse porque son más susceptibles de desarrollar una infección secundaria después de una infección primaria y porque tienen un mayor riesgo de desarrollar complicaciones debido a las coinfecciones (es decir, las infecciones primaria y secundaria). Sin pretender estar limitados por una teoría particular, se contempla que una infección primaria, como una infección de gripe, puede hacer que la persona sea más susceptible a una infección secundaria debido a la inmunosupresión. Como resultado, el sujeto puede desarrollar la infección secundaria que es atípicamente grave. En algunas realizaciones, la infección secundaria es una infección bacteriana, por ejemplo, infección respiratoria, infección de la piel, etc. Por tanto, la invención tiene como objetivo contrarrestar tales efectos inmunosupresores mediante el uso de vacunas contra la gripe protectoras que comprenden un adyuvante, antígenos en dosis altas o una combinación de los mismos, que a su vez pueden estimular el sistema inmunitario de los sujetos para luchar contra la infección secundaria de manera más eficaz. Por tanto, en algunas realizaciones, una mejor protección contra una infección de gripe en un sujeto en riesgo proporciona una menor probabilidad de que el sujeto desarrolle una complicación de una infección secundaria.

La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la invención puede usarse en métodos para administrar la vacuna contra la gripe a un sujeto en riesgo en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria protectora frente al antígeno o antígenos de la vacuna. Preferiblemente, dicha vacuna contra la gripe es una vacuna con adyuvante. En situaciones en las que un sujeto recibe múltiples dosis de inmunización contra la gripe (por ejemplo, una dosis de cebado y una dosis de refuerzo), es posible administrar una vacuna contra la gripe con adyuvante en una dosis o más, en cualquier orden. Por ejemplo, una dosis de cebado puede no tener adyuvante, mientras que una dosis de refuerzo posterior puede tener adyuvante, o viceversa.

La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la invención puede usarse en métodos para administrar la vacuna contra la gripe a un sujeto que recibe una terapia con estatinas en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra el antígeno o antígenos de la vacuna. Preferiblemente, dicha vacuna contra la gripe es una vacuna con adyuvante. En situaciones en las que un sujeto recibe múltiples dosis de inmunización contra la gripe (por ejemplo, una dosis de cebado y una dosis de refuerzo), es posible administrar una vacuna contra la gripe con adyuvante en una dosis o más, en cualquier orden. Por ejemplo, una dosis de cebado puede no tener adyuvante, mientras que una dosis de refuerzo posterior puede tener adyuvante, o viceversa.

Las composiciones de vacuna contra la gripe de la invención también pueden usarse en un método para potenciar una respuesta inmunitaria en sujetos que están en terapia con estatinas. En algunas realizaciones de la invención, tales composiciones de vacunas se formulan con un adyuvante. Los adyuvantes preferidos incluyen adyuvantes basados en emulsiones de aceite en agua, como los que comprenden escualeno. También se describen kits relacionados.

La invención incluye una vacuna contra la gripe para su uso en un paciente tratado con estatinas, en particular una vacuna contra la gripe con adyuvante o de alta dosis para su uso en un paciente tratado con estatinas, preferiblemente un paciente tratado con una estatina sintética. El paciente tiene menos de 65 años, pero tiene 18 años o más (es decir, tiene entre 18 y 64 años).

Una vacuna contra la gripe para su uso como se describe en la presente también puede usarse para la prevención de la gripe en un sujeto en riesgo que es un paciente tratado con estatinas, en particular una vacuna contra la gripe con adyuvante o de dosis alta para la prevención de la gripe en un paciente tratado con estatinas, preferiblemente un paciente tratado con una estatina sintética. El paciente tiene menos de 65 años, pero tiene 18 años o más (es decir, tiene entre 18 y 64 años).

Las vacunas contra la gripe con adyuvante o de dosis alta pueden fabricarse usando un método en el que se llevan a cabo los siguientes pasos: se cultiva un virus de la gripe en huevos o en una línea celular adecuada; el virus se recoge y purifica, opcionalmente el virus se divide y se aíslan los antígenos; opcionalmente, el virus o los antígenos se formulan y rellenan como vacunas finales.

Cuando los adyuvantes se usan en combinación con los antígenos de la gripe en la presente, el componente de antígeno y el componente de adyuvante de la vacuna pueden premezclarse o, alternativamente, pueden presentarse en recipientes separados para que el usuario final/proveedor de atención médica los mezcle antes de la administración. El componente de antígeno y el componente de adyuvante pueden producirse en el mismo sitio de producción o en diferentes sitios de producción. El o los componentes de antígeno pueden usarse para la formulación y/o envasado en un kit con un componente de adyuvante, en donde el kit es para uso en pacientes que se están tratando con estatinas, preferiblemente pacientes tratados con una estatina sintética. El componente de adyuvante puede usarse para la formulación y/o el envasado en un kit con un componente de antígeno para su uso en pacientes de riesgo tratados con estatinas, preferiblemente pacientes tratados con una estatina sintética.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES

Una serie de factores pueden provocar el deterioro de uno o más aspectos de la función inmunitaria en un sujeto, haciendo que el sujeto esté inmunocomprometido. Se sabe que ciertos medicamentos, como las estatinas, los AINE, los interferones y los antipsicóticos, provocan modulaciones inmunitarias no deseadas. En el contexto de la presente divulgación, la frase "una terapia que provoca inmunosupresión" se refiere a una intervención o tratamiento médico que está asociado con efectos secundarios caracterizados por efectos inmunosupresores no deseados. Los ejemplos no limitativos de tales terapias incluyen una terapia con estatinas, una terapia con AINE, una terapia con interferón, una terapia con antipsicóticos, etc.

Las estatinas son una clase de fármacos usados para tratar la hipercolesterolemia y se usan frecuentemente para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular. Sin embargo, se ha informado que las estatinas ejercen ciertos efectos inmunomoduladores que podrían afectar a la respuesta a la vacuna en aquellos que están en tratamiento con estatinas, incluyendo las vacunas contra la gripe. De manera similar, otros fármacos ampliamente administrados para tratar o aliviar ciertas afecciones también están asociados con efectos secundarios inmunosupresores.

Como se detalla adicionalmente en la presente, las mediciones de inmunogenicidad de la vacuna contra la gripe con adyuvante frente a sin adyuvante obtenidas de individuos que están recibiendo o no tratamiento con estatinas han revelado efectos inmunosupresores significativos de las estatinas en aquellos que reciben estatinas, en comparación con individuos de control que no reciben terapia con estatinas. Como se demuestra adicionalmente a continuación (consultar la sección EJEMPLIFICACIÓN a continuación), este efecto inmunosupresor de las estatinas sobre la respuesta inmunitaria a la vacuna es particularmente dramático en individuos que toman estatinas sintéticas. Estos efectos se observan tanto en los grupos de vacunas tanto con adyuvantes como sin adyuvantes. Sorprendentemente, sin embargo, el impacto negativo de la terapia con estatinas sobre la respuesta a la vacuna puede contrarrestarse, por lo menos parcialmente, mediante el uso de una vacuna con adyuvante y/o un antígeno o antígenos en dosis altas.

Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos para potenciar una respuesta inmunitaria a una vacuna en un sujeto cuyo sistema inmunitario está comprometido, por ejemplo, inmunosuprimido o en riesgo de desarrollar inmunosupresión. Tales métodos comprenden la administración de una composición de vacuna que (i) tiene adyuvante, (ii) contiene uno o más antígenos en dosis altas, a tales sujetos en una cantidad eficaz para potenciar sus respuestas inmunitarias a la vacuna.

Terapia inmunomoduladora

Como se usa en la presente, "una terapia inmunomoduladora" se refiere a cualquier intervención médica, como medicamentos, que provoquen modulaciones en una respuesta inmunitaria en los pacientes. Tales efectos moduladores incluyen la inmunosupresión, que puede provocar una respuesta inmunitaria reducida a una vacuna, lo que deja al receptor de la terapia más susceptible a una infección o enfermedad relacionada. Los ejemplos de terapias inmunomoduladoras incluyen estatinas, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), interferones, antipsicóticos, etc.

Estatinas

Como se usa en la presente, las estatinas se refieren a una clase de fármacos generalmente conocidos como inhibidores de la HMG-CoA reductasa y también abarcan otros compuestos que tienen actividades biológicas equivalentes (es decir, la capacidad de inhibir las actividades de la HMG-CoA reductasa). Las estatinas a las que se hace referencia en la presente divulgación pueden ser no sintéticas (por ejemplo, derivadas de la fermentación o de origen natural) o sintéticas. Los ejemplos no limitativos de estatinas no sintéticas incluyen: pravastatina, simvastatina, lovastatina y mevastatina. Los ejemplos no limitativos de estatinas sintéticas incluyen: fluvastatina, atorvastatina, cerivastatina, rosuvastatina y pitavastatina. Cualquier estatina puede usarse en combinación, ya sea administrada simultáneamente o por separado, pero en conjunto. Las estatinas también se pueden administrar como formulaciones de combinación que incluyen por lo menos una estatina y por lo menos un compuesto que no es una estatina. Los productos que contienen estatinas incluyen, pero no se limitan a ADVICOR® (niacina de liberación prolongada y lovastatina), CADUET® (besilato de amlodipina/atorvastatina cálcica), VYTORIN® (simvastatina y ezetimiba) y SIMCOR® (simvastatina niacina de liberación prolongada).

Por lo tanto, una "terapia con estatinas" se refiere a un régimen que incluye una o más estatinas ya sea solas o en cualquier combinación, independientemente de una condición particular, para la cual se administra la estatina o estatinas. En algunas realizaciones, una terapia con estatinas incluye por lo menos una estatina sintética.

AINE

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, generalmente abreviados como AINE, son una clase de fármacos que proporcionan efectos analgésicos (alivio del dolor) y antipiréticos (reductores de la fiebre) y, en dosis más altas, efectos antiinflamatorios. Los AINE pueden clasificarse en base a su estructura química o mecanismo de acción. Típicamente, los AINE más antiguos se conocían mucho antes de que se dilucidara su mecanismo de acción y, por esta razón, se clasificaron por estructura química u origen. Las sustancias más nuevas, por otro lado, se clasifican más a menudo por su mecanismo de acción.

Los ejemplos no limitativos de AINE incluyen: salicilatos (por ejemplo, aspirina (ácido acetilsalicílico), Diflunisal (Dolobid™), Salsalate (Disalcid™) y Trisalicilato de magnesio y colina (Trilisate™)); derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ibuprofeno, dexibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, ketoprofeno, dexketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina y loxoprofeno); derivados del ácido acético (por ejemplo, indometacina, tolmetina, sulindaco, etodolaco, cetorolaco, diclofenaco, aceclofenaco y nabumetona); derivados del ácido enólico (Oxicam) (por ejemplo, Piroxicam, Meloxicam, Tenoxicam, Droxicam, Lornoxicam e Isoxicam); derivados del ácido antranílico (fenamatos) (por ejemplo, ácido mefenámico, ácido meclofenámico, ácido flufenámico y ácido tolfenámico); inhibidores selectivos de la COX-2 (Coxibs) (por ejemplo, Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Lumiracoxib, Etoricoxib y Firocoxib); sulfonanilidas (por ejemplo, nimesulida) y otras, como licofelona, H-harpagida y clonixinato de lisina.

Interferones

Los ejemplos no limitativos de interferones terapéuticos disponibles en el mercado incluyen: Interferón alfa 2a (por ejemplo, Roferon A); interferón alfa 2b (Intron A/Reliferon/Uniferon); Interferón-alfa de leucocitos humanos (HuIFN-alfa-Le) (Multiferon); interferón beta 1a, forma líquida (Rebif); Interferón beta 1a, liofilizado (Avonex); interferón beta 1a, biogenérico (Irán) (Cinnovex); Interferón beta 1b (Betaseron/Betaferon); interferón gamma 1b (Actimmune); interferón pegilado alfa 2a (Pegasys); interferón pegilado alfa 2a (Egipto) (Reiferon Retard); interferón alfa 2b pegilado (Peglntron); e interferón alfa 2b pegilado más ribavirina (Canadá) (Pegetron).

Antipsicóticos y antidepresivos

Los ejemplos no limitativos de antipsicóticos y/o antidepresivos que pueden provocar inmunosupresión incluyen: clozapina, haloperidol, así como inhibidores de los receptores de serotonina y/o receptores de dopamina. Los ejemplos adicionales incluyen, pero no se limitan a: SB-258719 (un antagonista neutro de 5HT7R disponible de GSK), ^sB-258741 ("AFZ"; un agonista de 5HT7R inverso parcial disponible de GSK), SB-269970 (un agonista inverso de 5HT7R robusto disponible de GSK), Risperidona (un antagonista de los receptores de dopamina D1 y D2 y un agonista inverso de los receptores de serotonina 5HT7; también un agonista inverso de los receptores de histamina H1 y H2), Sertindol (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, 5-HT7, D3, a1); ziprasidona (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT1A, 5-HT1D, 5-HT2C, 5-HT7, D3, a1, NRI, SRI); loxapina (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT6, 5-HT7, D1, D4, a1, M1, H1, NRI); zotepina (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, 5-HT7, D1, D3, D4, a1, H1, NRI); clozapina (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT1A, 5-HT3, 5-HT6, 5-HT7, D1, D3, D4, a1, a2, M1, H1); olanzapina (se une a D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT6, D1, D3, D4, D5, a1, M1-5, H1), quetiapina (se une a D2, 5-HT2A, 5 -HT6, 5-HT7, a1, a2, H1); prometazina (un fuerte antagonista del receptor de histamina H1 con afinidad de débil a moderada por los receptores de serotonina 5HT2a/c y el receptor de dopamina D2; también bloquea los canales de Na+). Ciertos bloqueadores de canales iónicos también pueden ser adecuados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: inhibidores y bloqueadores de los canales de Na+ dependientes de voltaje y la colinesterasa, implicados en el transporte y el metabolismo de los lípidos, como la dibucaína (un inhibidor de la butinesterasa); inhibidores y bloqueadores de los canales de calcio de tipo L activados por voltaje (como la nimodipina); inhibidores y bloqueadores de los canales de sodio como la apridina (un agente estabilizador de la membrana antiarrítmico de clase 1b), amilorida (un bloqueador directo del canal de sodio epitelial ENaC); e inhibidores y bloqueadores de los canales de potasio rectificadores de entrada retardados y los canales de calcio de tipo L, como el hemifumarato de ibutilida (un agente antiarrítmico de clase III)

Sujetos

Los términos "sujeto", "paciente" e "individuo" pueden usarse indistintamente en la presente. Como ya se ha mencionado, los métodos y composiciones descritos en la presente son útiles para inmunizar a sujetos inmunocomprometidos o aquellos en riesgo de desarrollar inmunosupresión. Los métodos y composiciones descritos son particularmente útiles para obtener suficiente inmunoprotección en aquellos que están inmunosuprimidos o en riesgo de desarrollar inmunosupresión debido a ciertos medicamentos que pueden hacer que el sujeto sea vulnerable a la infección.

Por tanto, en el contexto de la invención, las poblaciones objetivo adecuadas incluyen sujetos en ciertas terapias, en particular terapias a largo plazo. Los sujetos están en terapia con estatinas, incluyendo un uso a largo plazo de estatinas. Estos también incluyen sujetos en una terapia con AINE, incluyendo un uso a largo plazo de AINE. Las poblaciones objetivo también incluyen sujetos en más de una de tales terapias. Por ejemplo, un sujeto puede estar en una o más terapias con estatinas, o una combinación de una o más terapias con estatinas y una o más terapias con AINE.

Cuando el sistema inmunitario de un individuo no funciona correctamente, generalmente se dice que el individuo está "inmunocomprometido". Por tanto, "un sujeto inmunocomprometido" es un sujeto con capacidad reducida para provocar una respuesta inmunitaria apropiada debido a cualquier factor relacionado con el huésped, relacionado con el medicamento o relacionado con la farmacología. Un individuo inmunocomprometido puede mostrar uno o más tipos de deterioro del sistema inmunitario, como inmunosupresión (por ejemplo, inmunidad debilitada), inmunodeficiencia, sistema inmunitario alterado o hiperactivo, autoinmunidad o cualquier combinación de los mismos. Por tanto, un individuo inmunocomprometido no es completamente inmunocompetente.

En algunos grupos de población, los sujetos pueden estar inmunocomprometidos como parte del desarrollo normal, como condiciones relacionadas con la edad, no relacionadas con una enfermedad o trastorno específico. Por ejemplo, los niños muy pequeños (por ejemplo, bebés) y los ancianos pueden considerarse no completamente inmunocompetentes. De acuerdo con la divulgación, una población objetivo de interés particular incluye personas que actualmente están recibiendo una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, tomando estatinas, AINE, etc.) que han recibido recientemente una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, tomando estatinas, AINE, etc.), así como aquellos que están a punto o se ha programado que comiencen una terapia que incluye una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, tomar estatinas, AINE, etc.), por ejemplo, una estatina sintética. Puede decirse colectivamente que cualquiera de estas subpoblaciones de pacientes está "en terapia inmunomoduladora", por ejemplo, "en terapia con estatinas". En algunas realizaciones, una población objetivo comprende o consiste de individuos que toman por lo menos una estatina sintética.

En algunas realizaciones, un sujeto ha recibido (y continúa recibiendo) una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.) durante por lo menos 2 días, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 7 días, por lo menos 10 días, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas, por lo menos 4 semanas, por lo menos 6 semanas, por lo menos 8 semanas, por lo menos 12 semanas o más. Un uso a largo plazo o crónico de una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.) puede referirse a una duración de por lo menos 4 semanas, inclusive.

En el contexto de la presente divulgación, se entenderá que un sujeto está "en riesgo de inmunosupresión" si el sujeto tiene propensión a desarrollar una afección que incluye respuestas inmunitarias suprimidas o si el sujeto cumple ciertos criterios para una población asociada con un riesgo aumentado de inmunosupresión o es susceptible a tener un sistema inmunitario comprometido. El término "susceptible" significa tener un riesgo y/o una propensión aumentados a algo (por lo general, según la edad, la predisposición genética, los factores ambientales, el historial personal o una combinación de los mismos), es decir, una enfermedad, trastorno o afección (como, por ejemplo, respuesta inmunitaria comprometida) que la observada en la población general. Por ejemplo, un sujeto que está a punto de comenzar una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.) tiene riesgo de inmunosupresión y, por tanto, puede beneficiarse de los métodos descritos en la presente para estimular una respuesta inmunitaria a una vacuna.

Los sujetos pueden seleccionarse en base a ciertos criterios (es decir, una población objetivo). Como ejemplo, entre los receptores de estatinas, una población de personas asociadas con por lo menos una estatina sintética puede tener un mayor riesgo de inmunosupresión que aquellas asociadas con estatinas no sintéticas.

Se sabe que ciertas enfermedades y trastornos están asociados con una inmunidad deteriorada en los individuos afectados. La inmunidad deteriorada puede implicar un sistema inmunitario suprimido, un sistema inmunitario hiperactivo, autoinmunidad o cualquier combinación de los mismos. La inmunosupresión incluye, sin limitación, inmunodeficiencia primaria e inmunodeficiencia secundaria o adquirida. La inmunodeficiencia primaria puede estar provocada por una anomalía genética. La inmunodeficiencia secundaria o adquirida se asocia comúnmente con ciertas enfermedades, como el SIDA, así como con las inmunodeficiencias adquiridas temporales debidas a ciertos fármacos, como las estatinas, los AINE, agentes quimioterapéuticos o inmunosupresores administrados después de trasplantes de órganos. El sistema inmunitario de una persona también puede verse debilitado por ciertas condiciones de vida o factores ambientales incluyendo el tabaquismo, el consumo de alcohol y la mala nutrición.

Por ejemplo, una población objetivo puede consistir de sujetos de un grupo de edad, como niños y ancianos. Como se usa en la presente, un "sujeto anciano" es un individuo humano de 65 años o más. Un "bebé", es un individuo humano entre la edad de 0-12 meses (siendo 0 un recién nacido), por ejemplo, entre 0-3 meses, entre 0-6 meses, entre 0-9 meses y entre 6-12 meses. De acuerdo con la invención, una población objetivo puede consistir de sujetos humanos entre 18 y 60 años, entre 18 y 55 años, entre 18 y 50 años, entre 18 y 45 años, entre 45 y 60 años, entre 18 y 24 años, entre 18 y 35 años, etc. En cualquiera de dicha población objetivo, los sujetos pueden estar además asociados con por lo menos un factor de riesgo incluyendo, sin limitación: enfermedad o trastorno crónico o genético y medicación/agentes terapéuticos.

De acuerdo con la invención, un sujeto adecuado es un sujeto no anciano, por ejemplo, un individuo humano menor de 65 años. El sujeto tiene menos de 65 años, pero 18 años o más. Tales sujetos pueden estar en una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.), por ejemplo, una terapia con estatinas que incorpore por lo menos una estatina sintética.

Como se usa en la presente, "potenciar una respuesta inmunitaria" puede implicar, por ejemplo, mejorar o aumentar la inmunogenicidad, medida mediante cualquier método adecuado conocido o aceptado en la técnica. Se logra una "respuesta inmunitaria potenciada" cuando se observa un aumento estadísticamente significativo de las respuestas inmunitarias en una medición o combinación de mediciones entre una población de sujetos que cumplen ciertos criterios, es decir, una población objetivo. Una población objetivo puede consistir de individuos que reciben una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.). En algunas realizaciones, un subconjunto de tal población puede representar una categoría particular de individuos, como grupos de edad. La frase "estimular una respuesta inmunitaria" puede referirse a la potenciación de una respuesta inmunitaria previamente preparada en un sujeto.

El adyuvante

Una "vacuna con adyuvante" comprende uno o más adyuvantes. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las vacunas contra la gripe para su uso en la invención comprenden un adyuvante, que puede funcionar para potenciar las respuestas inmunitarias (humorales y/o celulares) provocadas en un paciente que recibe la composición. Los adyuvantes útiles incluyen, pero no se limitan a: adyuvantes a base de sales de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio), agonistas de los receptores tipo Toll (por ejemplo, agonistas de TLR1 humano, agonistas de TLR2 humano, agonistas de TLR3 humano, agonistas de TLR4 humano, agonistas de TLR5 humano, agonistas de TLR6 humano, agonistas de TLR7 humano, agonistas de TLR8 humano, agonistas de TLR9 humano y agonistas de TLR10 humano), adyuvantes basados en emulsión y adyuvantes basados en partículas similares a virus, como virosomas.

En algunas realizaciones, los adyuvantes de vacunas para su uso con la invención comprenden una emulsión de aceite en agua.

Se ha descubierto que las emulsiones de aceite en agua son particularmente adecuadas para su uso en vacunas adyuvantes, incluyendo las vacunas virales, como las vacunas contra el virus de la gripe. Se conocen varias de tales emulsiones, y típicamente incluyen por lo menos un aceite y por lo menos un surfactante, siendo el aceite o aceites y el surfactante o surfactantes biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión generalmente tienen menos de 5 pm de diámetro, e idealmente la mayoría de las gotitas de aceite en la emulsión tienen un diámetro submicrónico (por ejemplo, por lo menos el 90% en número de las gotitas de aceite tienen un diámetro submicrónico), estos tamaños pequeños siendo conseguidos con un microfluidificador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotitas con un tamaño inferior a 220 nm (por ejemplo, inferior a 220 nm, inferior a 200 nm, inferior a 190 nm, inferior a 180 nm, inferior a 170 nm, inferior a 160 nm, inferior a 150 nm, inferior a 140 nm, inferior a 130 nm, inferior a 120 nm, inferior a 110 nm, inferior a 100 nm, etc.) ya que pueden someterse a esterilización por filtración. Por ejemplo, las emulsiones de aceite en agua adecuadas incluyen aquellas con tamaños medios de gotitas de aceite que varían entre aproximadamente 100-200 nm, aproximadamente 110 200 nm, aproximadamente 120-200 nm, aproximadamente 130-200 nm, aproximadamente 140-200 nm, aproximadamente 100-190 nm, 100-180 nm, 100-170 nm, 100-160 nm, 100-150 nm, 130-190 nm, 135-185 nm, 140 180 nm, 145-175 nm o 150-170 nm.

La emulsión puede comprender aceites como los de origen animal (como el pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semilla incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de cereales, el aceite de maíz es el más disponible, pero también puede usarse el aceite de otros cereales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se encuentran de manera natural en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nueces y semillas. Las grasas y los aceites de la leche de los mamíferos son metabolizables y, por lo tanto, pueden usarse en la puesta en práctica de esta invención. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de origen animal son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los pescados contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena como el espermaceti ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en la presente. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene terpenoides insaturados ramificados conocidos como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que en la presente se prefiere particularmente. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de pescado, incluyendo el escualeno y el escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (ver más abajo). Pueden usarse mezclas de aceites.

Los surfactantes pueden clasificarse por su 'HLB' (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los surfactantes preferidos de la invención tienen un HLB de por lo menos 10, preferiblemente por lo menos 15 y más preferiblemente por lo menos 16. La invención puede usarse con surfactantes que incluyen, pero no se limitan a: los surfactantes de ésteres de polioxietilensorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/o óxido de butileno (BO), vendidos bajo el nombre comercial DOWFAX™, como copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) repetitivos, siendo de particular interés el octoxinol-9 (Triton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como surfactantes Brij), como trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los surfactantes no iónicos. Los surfactantes preferidos para incluir en la emulsión son el Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitán o polisorbato 80), el Span 85 (trioleato de sorbitán), la lecitina y el Triton X-100.

Pueden usarse mezclas de surfactantes, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitán como monooleato de polioxietilensorbitán (polisorbato 80) y un octoxinol como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de surfactantes (% en peso) son: ésteres de polioxietilensorbitán (como polisorbato 80) del 0,01 al 1%, en particular de aproximadamente el 0,1%; octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (como Triton X-100, u otros detergentes de la serie Triton) del 0,001 al 0,1%, en particular del 0,005 al 0,02%; éteres de polioxietileno (como laureth 9) del 0,1 al 20%, preferiblemente del 0,1 al 10% y en particular del 0,1 al 1% o aproximadamente del 0,5%.

Los adyuvantes de emulsión preferidos tienen un tamaño medio de gotitas de <1 pm, por ejemplo, <750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm, <190 nm, <180 nm, <170 nm, <160 nm, <150 nm o menor. Estos tamaños de gotitas pueden lograrse convenientemente mediante técnicas como la microfluidización y la filtración adecuada (ver, por ejemplo, Publicaciones de patentes internacionales: WO 2011/067669, WO 2011/067673 y WO 2011/067672).

A continuación se proporcionan ejemplos de adyuvantes de emulsión de aceite en agua específicos útiles para la invención:

• Una emulsión submicrónica de escualeno, polisorbato 80 y trioleato de sorbitán. Estos tres componentes pueden estar presentes en una relación de volumen de 10:1:1 o una relación de peso de 39:47:47. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente un 5% de escualeno, aproximadamente un 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente un 0,5% de trioleato de sorbitán. En términos de peso, estas proporciones se convierten en un 4,3%> de escualeno, un 0,5%> de polisorbato 80 y un 0,48%> de trioleato de sorbitán. Este adyuvante se conoce como "MF59", como se ha descrito anteriormente. La emulsión de MF59 puede incluir ventajosamente un tampón, como iones de citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y polisorbato 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1%>) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener del 2 al 10%> de escualeno, del 2 al 10%> de tocoferol y del 0,3 al 3%> de polisorbato 80, y la relación en peso de escualeno:tocoferol es preferiblemente de <1 ya que proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes en una relación de volumen de aproximadamente 5:2 o en una relación de peso de aproximadamente 11:5. Por tanto, los tres componentes (escualeno, tocoferol, polisorbato 80) pueden estar presentes en una relación en peso de 1068:1186:485 o alrededor de 55:61:25. Una emulsión de este tipo ("AS03") puede elaborarse disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solución al 2%>, luego mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrónicas, por ejemplo, con un diámetro medio de entre 100 y 250 nm, preferiblemente de aproximadamente 180 nm. La emulsión también puede incluir un monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3d-MPL). Otra emulsión útil de este tipo puede comprender, por dosis humana, 0,5-10 mg de escualeno, 0,5-11 mg de tocoferol y 0,1-4 mg de polisorbato 80, por ejemplo, en las proporciones analizadas anteriormente.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver más abajo). Puede contener un tampón, como un tampón de fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación de masa de aproximadamente 75: 11: 10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier aporte de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver más abajo). La fase acuosa puede contener un tampón, como un tampón de fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsión puede formularse en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (0,05-1% de Thr-MDp, 5% de escualano, 2,5% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). También puede usarse sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" (5% de escualano, 1,25% de Pluronic L121 y 0,2%> de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un surfactante no iónico hidrófilo de polioxietilen alquil éter (por ejemplo, polioxietilen (12) cetoestearil éter) y un surfactante no iónico hidrófobo (por ejemplo, éster de sorbitán o éster de manida, como monoleato de sorbitán o 'Span 80'). La emulsión es preferiblemente termorreversible y/o tiene por lo menos un 90% de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño inferior a 200 nm. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, como dodecilmaltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglicósido. La emulsión puede incluir un agonista de TLR4. Tales emulsiones pueden liofilizarse.

• Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care. La concentración final (peso) de estos componentes en vacunas con adyuvantes son un 5% de escualeno, un 4% de poloxámero 105 (poliol plurónico) y un 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG- 16/16 dimeticona; caprílico/triglicérido cáprico).

• Una emulsión que tiene del 0,5 al 50% de un aceite, del 0,1 al 10% de un fosfolípido y del 0,05 al 5% de un surfactante no iónico. Los componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Son ventajosos los tamaños de gotita submicrónicos.

• Una emulsión submicrónica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (como un aceite mineral ligero) y por lo menos un surfactante (como lecitina, Tween 80 o Span 80). Pueden incluirse aditivos, como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (como GPI-0100, producido mediante la adición de una amina alifática a la desacilsaponina a través del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetilidioctadecilamonio y/o N,N- dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA y QS21) y un esterol (por ejemplo, colesterol) están asociados como micelas helicoidales.

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico y un surfactante hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico y un surfactante lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno).

En algunas realizaciones, una emulsión puede mezclarse con el antígeno de manera extemporánea, en el momento de la administración y, por lo tanto, el adyuvante y el antígeno pueden mantenerse separados en una vacuna envasada o distribuida, listos para la formulación final en el momento del uso. En otras realizaciones, se mezcla una emulsión con el antígeno durante la fabricación y, por tanto, la composición se envasa en forma líquida con adyuvante, como en el producto FLUAD™. El antígeno estará generalmente en forma acuosa, de tal manera que la vacuna se prepara finalmente mezclando dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para el mezclado puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5), pero generalmente es de aproximadamente 1:1. Cuando las concentraciones de los componentes se dan en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición sin diluir y, por lo tanto, la concentración después del mezclado con una solución de antígeno disminuirá.

Después de que se hayan mezclado el antígeno y el adyuvante, el antígeno de hemaglutinina generalmente permanecerá en una solución acuosa pero puede distribuirse alrededor de la interfaz aceite/agua. En general, se introducirá poca o ninguna hemaglutinina en la fase oleosa de la emulsión.

Cuando una composición incluye un tocoferol, puede usarse cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 5, £ o ^ (solos o en combinación), pero se prefieren los a-tocoferoles. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, como succinato, acetato, nicotinato, etc. Pueden usarse tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Los tocoferoles se incluyen ventajosamente en vacunas para su uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo, de 60 años o más o de 65 años o más) porque se ha informado que la vitamina E tiene un efecto positivo sobre la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones. Un a-tocoferol preferido es el DL-atocoferol, y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succinato coopera con ligandos relacionados con TNF in vivo. Además, se sabe que el succinato de a-tocoferol es compatible con las vacunas contra la gripe y que es un conservante útil como alternativa a los compuestos mercuriales.

Vacunas de dosis alta

En el contexto de la presente divulgación, una vacuna de dosis alta se refiere a una vacuna que contiene un antígeno (es decir, un inmunógeno) que es por lo menos aproximadamente el doble de la cantidad del mismo antígeno contenido en una vacuna de dosis estándar, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces y diez veces, que pueden expresarse alternativamente como 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x y 10x, respectivamente. Las vacunas de dosis estándar son aquellas típicamente disponibles comercialmente, que no están específicamente etiquetadas o comercializadas como dosis alta o dosis baja. En el caso de las vacunas contra la gripe, una dosis estándar es de aproximadamente 15 pg de antígeno por cepa (ver más abajo para obtener más detalles).

El antígeno del virus de la gripe

La invención usa un antígeno del virus de la gripe, que típicamente comprende hemaglutinina, para inmunizar a un sujeto. El antígeno típicamente se preparará a partir de viriones de gripe pero, como alternativa, los antígenos como la hemaglutinina pueden expresarse en un huésped recombinante (por ejemplo, en una línea celular de insecto usando un vector de baculovirus) y pueden usarse en forma purificada. En general, sin embargo, los antígenos pueden ser de viriones.

El antígeno puede tomar la forma de un virus vivo o, más preferiblemente, un virus inactivado. Los medios químicos para inactivar un virus incluyen el tratamiento con una cantidad eficaz de uno o más de los siguientes agentes: detergentes, formaldehído, formalina, p-propiolactona o luz ultravioleta. Los medios químicos adicionales para la inactivación incluyen el tratamiento con azul de metileno, psoraleno, carboxifullereno (C60) o una combinación de cualquiera de los mismos. En la técnica se conocen otros métodos de inactivación viral, como por ejemplo etilamina binaria, acetil etilenimina o irradiación gamma. El producto INFLEXAL™ es una vacuna inactivada de virión completo.

Cuando se usa un virus inactivado, la vacuna puede comprender viriones completos, viriones divididos o antígenos de superficie purificados (incluyendo la hemaglutinina y habitualmente también la neuraminidasa).

Una vacuna inactivada pero de células no completas (por ejemplo, una vacuna de virus dividido o una vacuna de antígeno de superficie purificada) puede incluir proteína de matriz para beneficiarse de los epítopos de células T adicionales que se encuentran dentro de este antígeno. Por tanto, una vacuna de células no completas (particularmente una vacuna dividida) que incluye hemaglutinina y neuraminidasa puede incluir adicionalmente proteína de matriz MI y/o M2. La nucleoproteína también puede estar presente.

Los viriones pueden recogerse de fluidos que contienen virus mediante varios métodos. Por ejemplo, un proceso de purificación puede implicar la centrifugación zonal usando una solución de gradiente de sacarosa lineal que incluye detergente para alterar los viriones. Luego, pueden purificarse los antígenos, después de una dilución opcional, mediante diafiltración.

Los viriones divididos se obtienen tratando viriones purificados con detergentes y/o solventes para producir preparaciones de subviriones, incluyendo el proceso de división 'Tween-ether'. Los métodos para dividir los virus de la gripe son bien conocidos en la técnica. La división del virus típicamente se lleva a cabo alterando o fragmentando el virus completo, ya sea infeccioso o no infeccioso, con una concentración disruptiva de un agente de división. La disrupción da como resultado una solubilización total o parcial de las proteínas del virus, alterando la integridad del virus. Los agentes de separación preferidos son los surfactantes iónicos y no iónicos (por ejemplo, catiónicos). Los agentes de división adecuados incluyen, pero no se limitan a: éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, alquilglicósidos, alquiltioglicósidos, azúcares de acilo, sulfobetaínas, betaínas, polioxietilenalquiléteres, N, N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanoles, compuestos de amonio cuaternario, sarcosilo, CTAB (bromuros de cetiltrimetilamonio), fosfato de tri-N-butilo, Cetavlon, sales de miristiltrimetilamonio, lipofectina, lipofectamina y DOT-MA, los octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (por ejemplo, los surfactantes Triton, como Triton X-100 o Triton N101), nonoxinol 9 (NP9) Sympatens-NP/090, ésteres de polioxietilensorbitán (los surfactantes Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Un procedimiento útil de división usa los efectos consecutivos del desoxicolato de sodio y el formaldehído, y la división puede tener lugar durante la purificación inicial de los viriones (por ejemplo, en una solución de gradiente de densidad de sacarosa). Por tanto, un proceso de división puede implicar la clarificación del material que contiene virones (para eliminar el material que no es de viriones), concentración de los viriones recogidos (por ejemplo, usando un método de adsorción, como la adsorción de CaHP04), separación de viriones completos del material que no es de viriones, división de viriones usando un agente de división en un paso de centrifugación en gradiente de densidad (por ejemplo, usando un gradiente de sacarosa que contiene un agente de división como el desoxicolato de sodio), y luego la filtración (por ejemplo, la ultrafiltración) para eliminar los materiales no deseados. Los viriones divididos pueden volver a suspenderse de manera útil en una solución isotónica de cloruro de sodio tamponada con fosfato de sodio. Los productos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ y FLUSHIELD™ son vacunas divididas.

Las vacunas de antígenos de superficie purificados comprenden los antígenos de superficie de gripe hemaglutinina y, típicamente, también neuraminidasa. Los procesos para preparar estas proteínas en forma purificada son bien conocidos en la técnica. Los productos FlUv IRIN™, AGRiPpAl™ e INFLUVAC™ son vacunas de subunidades.

Otra forma de antígeno de la gripe inactivado es el virosoma (partículas liposomales de tipo viral libres de ácido nucleico). Los virosomas pueden prepararse mediante la solubilización del virus de la gripe con un detergente seguido de la eliminación de la nucleocápside y la reconstitución de la membrana que contiene las glicoproteínas virales. Un método alternativo para preparar virosomas implica añadir glicoproteínas de membrana viral a cantidades en exceso de fosfolípidos, para dar liposomas con proteínas virales en su membrana. La invención puede usarse para almacenar virosomas a granel, como en el producto INFLEXAL V™. En algunas realizaciones, el antígeno de la gripe no está en forma de virosoma.

El virus de la gripe puede estar atenuado. El virus de la gripe puede ser sensible a la temperatura. El virus de la gripe puede estar adaptado al frío. Estas tres características son particularmente útiles cuando se usan virus vivos como antígeno de vacuna.

Con respecto a las vacunas contra la gripe inactivadas actualmente disponibles, la HA es el inmunógeno principal, y las dosis de la vacuna están estandarizadas por referencia a los niveles de HA, típicamente medidos por SRID. Las vacunas existentes contienen típicamente aproximadamente 15 |jg de HA por cepa, aunque pueden usarse dosis más bajas, por ejemplo, para niños o en situaciones de pandemia, o cuando se usan junto con un adyuvante. Se han usado dosis fraccionadas como 1/2 (por ejemplo, 7,5 jg de HA por cepa), 1/4 y 1/8, así como dosis más altas (por ejemplo, dosis 2x, 3x o 9x).

Para las vacunas vivas, la dosificación se mide por la dosis infecciosa mediana de cultivo de tejido (TCID50) en lugar del contenido de HA, y es típica una TCI^d5^ode entre 106 y 108 (preferiblemente entre 1065-1075) por cepa.

Como se usa en la presente, una "vacuna contra la gripe de dosis alta" puede contener entre aproximadamente 30 jg y 150 jg de un antígeno (por ejemplo, HA) por cepa, en oposición a la vacuna de dosis estándar, que típicamente contiene 15 jg de un antígeno (por ejemplo, HA) por cepa. Por tanto, en algunas realizaciones, una vacuna de dosis alta contiene aproximadamente 30 jg, aproximadamente 35 jg, aproximadamente 40 jg, aproximadamente 45 jg, aproximadamente 50 jg, aproximadamente 55 jg, aproximadamente 60 jg, aproximadamente 65 jg, aproximadamente 70 jg, aproximadamente 75 jg, aproximadamente 80 jg, aproximadamente 85 jg, aproximadamente 90 jg aproximadamente 100 jg aproximadamente 110 jg aproximadamente 120 jg aproximadamente 130 jg aproximadamente 140 jg aproximadamente 150 jg de antígeno por cepa.

Una "vacuna contra la gripe de dosis baja", por otra parte, se refiere a una composición de vacuna que contiene menos de 15 jg de un antígeno (por ejemplo, HA) por cepa, por ejemplo, aproximadamente 12,5 jg, aproximadamente 10 jg, aproximadamente 7,5 jg, aproximadamente 5 jg, aproximadamente 4 jg, aproximadamente 3 jg, aproximadamente 2,5 jg. Cualquiera de las vacunas de dosis alta, las vacunas de dosis estándar y las vacunas de dosis baja pueden tener adyuvantes.

Las cepas del virus de la gripe para su uso en las vacunas cambian de una estación a otra. En el período interpandémico actual, las vacunas incluyen típicamente dos cepas de gripe A (H1N1 y H3N2) y una o dos cepas de gripe B, y las vacunas trivalentes o tetravalentes son típicas para su uso con la invención. Las composiciones de la invención comprenden antígeno del virus de la gripe B y opcionalmente comprenden antígeno de por lo menos un virus de la gripe A. Cuando la composición de la invención comprende antígeno del virus de la gripe A, la invención puede usar cepas estacionales y/o pandémicas. Dependiendo de la estación y de la naturaleza del antígeno incluido en la vacuna, la invención puede incluir (y proteger contra) uno o más de los subtipos de hemaglutinina del virus de la gripe A HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. La vacuna pueden incluir adicionalmente neuraminidasa de cualquiera de los subtipos de NA NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9.

Por tanto, la invención puede usarse con cepas del virus de la gripe A pandémica. Las características de una cepa pandémica son: (a) contiene una hemaglutinina nueva en comparación con las hemaglutininas de las cepas humanas que circulan actualmente, es decir, una que no ha sido evidente en la población humana durante más de una década (por ejemplo, H2), o no se ha visto con anterioridad en absoluto en la población humana (por ejemplo, H5, H6 o h9, que generalmente se han encontrado solo en poblaciones de aves), de tal manera que el receptor de la vacuna y la población humana en general no ha sido tratada inmunológicamente para la hemaglutinina de la cepa; (b) es capaz de transmitirse horizontalmente en la población humana; y (c) es patógena para los humanos. Las cepas pandémicas incluyen, pero no se limitan a, cepas de los subtipos H2, H5, H7 o H9, por ejemplo, cepas H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 y H7N7. Dentro del subtipo H5, un virus puede caer en varios clados, por ejemplo, clado 1 o clado 2. Se han identificado seis subclados del clado 2 con los subclados 1, 2 y 3 que tienen una distribución geográfica distinta y son particularmente relevantes debido a su implicación en infecciones humanas.

El virus de la gripe B actualmente no muestra diferentes subtipos de HA, pero las cepas del virus de la gripe B se dividen en dos linajes distintos. Estos linajes surgieron a fines de la década de 1980 y tienen HA que pueden distinguirse entre sí antigénica y/o genéticamente. Las cepas actuales del virus de la gripe B son del tipo B/Victoria/2/87 o del tipo B/Yamagata/16/88. Estas cepas habitualmente se distinguen antigénicamente, pero también se han descrito diferencias en las secuencias de aminoácidos para distinguir los dos linajes, por ejemplo, las cepas similares a B/Yamagata/16/88 a menudo (pero no siempre) tienen proteínas HA con deleciones en el residuo de aminoácidos 164, numerado en relación con la secuencia HA 'Lee40'. La invención puede usarse con antígenos de un virus B de cualquier linaje o con antígenos de ambos linajes.

Cuando una vacuna incluye más de una cepa de gripe, las diferentes cepas típicamente se cultivan por separado y se mezclan después de que se hayan recogido los virus y se hayan preparado los antígenos. Por tanto, un proceso de fabricación de la invención puede incluir el paso de mezclar antígenos de más de una cepa de la gripe.

Un virus de la gripe usado con la invención puede ser una cepa reordenada y puede haberse obtenido mediante técnicas de genética inversa. Las técnicas de genética inversa permiten que los virus de la gripe con los segmentos del genoma deseados se preparen in vitro usando plásmidos. Típicamente, implica expresar (a) moléculas de ADN que codifican moléculas de ARN viral deseadas, por ejemplo, de promotores de sondeo o promotores de polimerasa de ARN de bacteriófago, y (b) moléculas de ADN que codifican proteínas virales, por ejemplo, de promotores de sondeo, de tal manera que la expresión de ambos tipos de ADN en una célula lleva al ensamblaje de un virión infeccioso intacto completo. El ADN proporciona preferiblemente todo el ARN y las proteínas virales, pero también es posible usar un virus auxiliar para proporcionar parte del ARN y las proteínas. Pueden usarse métodos basados en plásmidos que usan plásmidos separados para producir cada ARN viral, y estos métodos también implicarán el uso de plásmidos para expresar todo o parte (por ejemplo, sólo las proteínas PB 1, PB2, PA y NP) de las proteínas virales, usándose hasta 12 plásmidos en algunos métodos. Para reducir el número de plásmidos necesarios, un enfoque reciente combina una pluralidad de casetes de transcripción de ARN polimerasa I (para la síntesis de ARN viral) en el mismo plásmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o todas 8 segmentos de ARNv de gripe A) y una pluralidad de regiones codificantes de proteínas con promotores de ARN polimerasa II en otro plásmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o las 8 transcripciones del ARNm de gripe A). En algunas realizaciones de la invención, los métodos implican: (a) regiones codificantes de ARNm de PB 1, PB2 y PA en un solo plásmido; y (b) los 8 segmentos que codifican ARNv en un solo plásmido. Incluir los segmentos de NA y HA en un plásmido y los otros seis segmentos en otro plásmido también puede facilitar las cosas.

Como alternativa al uso de promotores de sondeo para codificar los segmentos de ARN viral, es posible usar promotores de polimerasa de bacteriófago. Por ejemplo, pueden usarse convenientemente promotores para las polimerasas SP6, t 3 o T7. Debido a la especificidad de especies de los promotores de sondeo, los promotores de polimerasa de bacteriófago pueden ser más convenientes para muchos tipos de células (por ejemplo, MDCK), aunque una célula también debe transfectarse con un plásmido que codifica la enzima polimerasa exógena.

En otras técnicas, es posible usar promotores de sondeo y de sondeo duales para codificar simultáneamente los ARN víricos y los ARNm expresables a partir de una única plantilla.

Por tanto, un virus de gripe A puede incluir uno o más segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (típicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, siendo los segmentos HA y N de una cepa de vacuna, es decir, un reordenamiento 6:2). También puede incluir uno o más segmentos de ARN de un virus A/WSN/33, o de cualquier otra cepa de virus útil para generar virus reordenados para la preparación de vacunas. Un virus de gripe A puede incluir menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 o 5) segmentos virales de un virus de gripe AA/6/60 (A/ Ann Arbor/6/60). Un virus de gripe B puede incluir menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 o 5) segmentos virales de un virus de gripe AA/1/66 (B/Ann Arbor/ 1/66). Típicamente, la invención protege contra una cepa que es capaz de transmitirse de humano a humano, por lo que el genoma de la cepa incluirá habitualmente por lo menos un segmento de ARN que se originó en un virus de gripe de mamífero (por ejemplo, en un humano). Puede incluir un segmento NS que se originó en un virus de gripe aviar.

Las cepas cuyos antígenos pueden incluirse en las composiciones pueden ser resistentes a la terapia antiviral (por ejemplo, resistentes a oseltamivir y/o zanamivir), incluyendo las cepas pandémicas resistentes.

La HA usada con la invención puede ser una HA natural como la que se encuentra en un virus, o puede haber sido modificada. Por ejemplo, se sabe cómo modificar la HA para eliminar determinantes (por ejemplo, regiones hiperbásicas alrededor del sitio de escisión entre HA1 y HA2) que hacen que un virus sea altamente patógeno en especies aviares, ya que estos determinantes pueden evitar que un virus se cultive en huevos.

Los virus usados como fuente de los antígenos pueden cultivarse en huevos (por ejemplo, huevos libres de patógenos específicos) o en cultivos celulares. El método estándar actual para el cultivo del virus de la gripe usa huevos de gallina embrionados, y el virus se purifica a partir del contenido del huevo (líquido alantoideo). Sin embargo, más recientemente, los virus se han cultivado en cultivos de células animales y, por razones de rapidez y alergias de los pacientes, se prefiere este método de crecimiento.

La línea celular será típicamente de origen mamífero. Las células de origen mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de hámster, ganado, primates (incluyendo humanos y monos) y perros, aunque no se prefiere el uso de células de primates. Pueden usarse varios tipos de células, como células renales, fibroblastos, células retinales, células pulmonares, etc. Los ejemplos de células de hámster adecuadas son las líneas celulares que tienen los nombres BHK21 o HKCC. Las células de mono adecuadas son, por ejemplo, células de mono verde africano, como células de riñón como en la línea celular Vero. Las células de perro adecuadas son, por ejemplo, células de riñón, como en las líneas celulares CLDKy MDCK.

Por tanto, las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a: MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; vero; MRC-5; PER.C6; FRhL2; WI-38; etc. Las líneas celulares adecuadas están ampliamente disponibles, por ejemplo, de la colección American Type Cell Culture (ATCC), de los depósitos de células de Coriell o de la European Collection of Cell Cultures (ECACC). Por ejemplo, la ATCC suministra varias células Vero diferentes con los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, c Rl-1586 y CRL-1587, y suministra células MDCK con el número de catálogo CCL-34. La PER.C6 está disponible en ECACC con el número de depósito 96022940.

Las líneas celulares más preferidas son aquellas con glicosilación de tipo mamífero. Como alternativa menos preferida a las líneas celulares de mamíferos, el virus puede cultivarse en líneas celulares aviares, incluyendo las líneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, retina de pato) o gallinas. Los ejemplos de líneas celulares aviares incluyen células madre embrionarias aviares y células retinales de pato. Las células madre embrionarias aviares adecuadas incluyen la línea celular EBx derivada de células madre embrionarias de pollo, EB45, EB14 y EB 14-074. También pueden usarse fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Sin embargo, en lugar de usar células aviares, el uso de células de mamíferos significa que las vacunas pueden estar libres de ADN aviar y proteínas de huevo (como ovoalbúmina y ovomucoide), lo que reduce la alergenicidad.

Las líneas celulares más preferidas para el cultivo de virus de la gripe son las líneas celulares MDCK, derivadas del riñón canino Madin Darby. La línea celular MDCK original está disponible en la ATCC como CCL-34, pero también pueden usarse derivados de esta línea celular. Por ejemplo, se ha adaptado una línea celular MDCK para el crecimiento en cultivo en suspensión ('MDCK 33016', depositada como DSM ACC 2219). De manera similar, se ha desarrollado una línea celular derivada de MDCK que crece en suspensión en cultivo libre de suero ('B-702', depositada como FERM BP-7449). Se han descrito células MDCK no tumorigénicas, incluyendo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) y 'MDCK-SF103 ' (PTA-6503). Se han desarrollado líneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a la infección, incluyendo las células 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Puede usarse cualquiera de estas líneas celulares.

El virus puede cultivarse en células en cultivo adherente o en suspensión. También pueden usarse cultivos de microportadores. En algunas realizaciones, las células pueden por tanto adaptarse para crecer en suspensión.

Las líneas celulares se cultivan preferiblemente en medios de cultivo libres de suero y/o medios libres de proteínas. Un medio se denomina medio libre de suero en el contexto de la presente invención en el que no hay aditivos de suero de origen humano o animal. Las células que crecen en dichos cultivos contienen de manera natural proteínas, pero se entiende por medio libre de proteínas aquel en el que la multiplicación de las células se produce con exclusión de proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos proteicos y proteínas no séricas, pero puede incluir opcionalmente proteínas como la tripsina u otras proteasas que pueden ser necesarias para el crecimiento viral.

Las líneas celulares que soportan la replicación del virus de la gripe se cultivan preferiblemente por debajo de 37° C (por ejemplo, 30-36° C, o a aproximadamente 30° C, 31° C, 32° C, 33° C, 34° C, 35° C, 36° C).° C) durante la replicación viral.

Los métodos para propagar el virus de la gripe en células cultivadas generalmente incluyen los pasos de inocular un cultivo de células con un inóculo de la cepa que se va a cultivar, cultivar las células infectadas durante un período de tiempo deseado para la propagación del virus, como por ejemplo según se determina por el título del virus o la expresión del antígeno (por ejemplo, entre 24 y 168 horas después de la inoculación) y recoger el virus propagado. Las células cultivadas se inoculan con una proporción de virus (medida por PFU o TCID50) a célula de 1:500 a 1:1, preferiblemente de 1:100 a 1:5, más preferiblemente de 1:50 a 1:10. El virus se añade a una suspensión de células o se aplica a una monocapa de células, y el virus se absorbe en las células durante por lo menos 60 minutos, pero generalmente menos de 300 minutos, preferiblemente entre 90 y 240 minutos a de 25° C a 40° C, preferiblemente de 28° C a 37° C. El cultivo de células infectadas (por ejemplo, monocapas) puede eliminarse mediante congelación-descongelación o mediante acción enzimática para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes del cultivo recogido. Los fluidos recogidos luego se inactivan o se almacenan congelados. Las células cultivadas pueden infectarse con una multiplicidad de infección ("m.o.i.") de aproximadamente 0,0001 a 10, preferiblemente de 0,002 a 5, más preferiblemente de 0,001 a 2. Aún más preferiblemente, las células se infectan con una m.o.i. de aproximadamente 0,01. Las células infectadas pueden recogerse de 30 a 60 horas después de la infección. Preferiblemente, las células se recogen de 34 a 48 horas después de la infección. Aún más preferiblemente, las células se recogen de 38 a 40 horas después de la infección. Las proteasas (típicamente tripsina) generalmente se añaden durante el cultivo celular para permitir la liberación viral, y las proteasas pueden añadirse en cualquier etapa adecuada durante el cultivo, por ejemplo antes de la inoculación, al mismo tiempo que la inoculación, o después de la inoculación.

En realizaciones preferidas, particularmente con células MDCK, una línea celular no se pasa desde el banco de células de trabajo principal más allá de 40 niveles de duplicación de la población.

El inóculo viral y el cultivo viral preferiblemente están libres de (es decir, se habrán probado y habrán dado un resultado negativo de contaminación por) virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza 3, coronavirus del SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus., birnavirus, circovirus y/o parvovirus. Se prefiere particularmente la ausencia de virus del herpes simple.

Cuando el virus se ha cultivado en una línea celular entonces es una práctica estándar minimizar la cantidad de ADN residual de la línea celular en la vacuna final, para minimizar cualquier actividad oncogénica del ADN.

Por tanto, una composición de vacuna preparada de acuerdo con la invención contiene preferiblemente menos de 10 ng (preferiblemente menos de 1 ng y más preferiblemente menos de 100 pg) de ADN de célula huésped residual por dosis, aunque pueden estar presentes trazas de ADN de célula huésped.

Se prefieren las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 15 pg de hemaglutinina, al igual que las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 0,25 ml de volumen.

Se prefieren más las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 5 pg de hemaglutinina, al igual que las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 0,5 ml volumen.

Se prefiere que la longitud media de cualquier ADN residual de la célula huésped sea menor de 500 pb, por ejemplo, menor de 400 pb, menor de 300 pb, menor de 200 pb, menor de 100 pb, etc.

El ADN contaminante puede eliminarse durante la preparación de la vacuna usando procedimientos de purificación estándar, por ejemplo, cromatografía, etc. La eliminación del ADN residual de la célula huésped puede potenciarse mediante el tratamiento con nucleasas, por ejemplo, usando una ADNasa. En la bibliografía se ha descrito un método conveniente para reducir la contaminación del ADN de la célula huésped, que implica un tratamiento de dos pasos, primero usando una DNasa (por ejemplo, Benzonasa), que puede usarse durante el crecimiento viral, y luego un detergente catiónico (por ejemplo, CTAB), que puede usarse durante la disrupción del virión. También puede usarse la eliminación por tratamiento con p-propiolactona.

La medición del ADN de la célula huésped residual es ahora un requisito reglamentario de rutina para productos biológicos y está dentro de las capacidades normales de los expertos en la técnica. El ensayo usado para medir el ADN típicamente será un ensayo validado. Las características de rendimiento de un ensayo validado pueden describirse en términos matemáticos y cuantificables, y se habrán identificado sus posibles fuentes de error. En general, el ensayo habrá sido probado para características como exactitud, precisión y especificidad. Una vez que se ha calibrado un ensayo (por ejemplo, frente a cantidades estándar conocidas de ADN de la célula huésped) y se ha probado, pueden realizarse rutinariamente mediciones cuantitativas de ADN. Pueden usarse tres técnicas principales para la cuantificación del ADN: métodos de hibridación, como transferencias Southern o transferencias de ranura; métodos de inmunoensayo, como el sistema Threshold™; y PCR cuantitativa. Todos estos métodos son familiares para el experto en la técnica, aunque las características precisas de cada método pueden depender de la célula huésped en cuestión, por ejemplo, la elección de sondas para hibridación, la elección de cebadores y/o sondas para amplificación, etc. El sistema Threshold™ de Molecular Devices es un ensayo cuantitativo para niveles de picogramos de ADN total y se ha usado para monitorizar los niveles de ADN contaminante en productos biofarmacéuticos. Un ensayo típico implica la formación no específica de secuencias de un complejo de reacción entre una proteína de unión de ADNmc biotinilado, un anticuerpo anti-ADNmc conjugado con ureasa y el ADN. Todos los componentes del ensayo están incluidos en el kit de ensayo de ADN total completo disponible del fabricante. Varios fabricantes comerciales ofrecen ensayos de PCR cuantitativos para detectar el ADN residual de la célula huésped, por ejemplo, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. Se ha descrito una comparación de un ensayo de hibridación quimioluminiscente y el sistema de ADN total Threshold™ para medir la contaminación del ADN de la célula huésped de una vacuna viral humana.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones de la invención son farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la invención incluyen vacunas. Pueden incluir componentes además del antígeno y el adyuvante, por ejemplo, típicamente incluirán uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticos, que son bien conocidos en la técnica.

La composición puede incluir conservantes como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna esté sustancialmente libre de (por ejemplo, menos de 5 |jg/ml) material mercurial, por ejemplo, libre de tiomersal. Son más preferidas las vacunas que no contienen mercurio, y puede incluirse succinato de a-tocoferol como una alternativa a los compuestos mercuriales. Las más preferidas con las vacunas sin conservantes.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato disódico dihidrato, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferiblemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferiblemente estarán dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg. Se ha informado con anterioridad que la osmolalidad no tiene un impacto sobre el dolor provocado por la vacunación, pero, sin embargo, se prefiere mantener la osmolalidad en este intervalo.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8. Por lo tanto, un proceso de fabricación puede incluir un paso de ajuste del pH de la vacuna a granel antes del envasado.

La composición es preferiblemente estéril. La composición es preferiblemente no pirogénica, por ejemplo, contiene <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0,1 EU por dosis. La composición está preferiblemente libre de gluten.

Las composiciones de la invención pueden incluir detergente, por ejemplo, un surfactante de éster de polioxietilensorbitán (conocido como "Tweens"), un octoxinol (como octoxinol-9 (Triton X-100) o toctilfenoxipolietoxietanol), un bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB "), o desoxicolato de sodio, particularmente para una vacuna de antígeno dividido o de superficie. El detergente puede estar presente solo en cantidades traza. Por tanto, la vacuna puede incluir menos de 1 mg/ml de cada uno de octoxinol-10 y polisorbato 80. Otros componentes residuales en cantidades traza podrían ser antibióticos (por ejemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B).

La composición puede incluir material para una única inmunización, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones, lo que también se denomina kit "multidosis". Se prefiere la inclusión de un conservante en disposiciones multidosis. Como alternativa (o además) a la inclusión de un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la eliminación del material.

Las vacunas contra la gripe se administran típicamente en un volumen de dosificación (dosis unitaria) de aproximadamente 0,5 ml, aunque a los niños puede administrarse la mitad de la dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml).

Las composiciones y los kits se almacenan preferiblemente entre 2° C y 8° C. No deben congelarse. Lo ideal es que se mantengan alejados de la luz directa.

El antígeno y la emulsión en una composición estarán típicamente mezclados, aunque inicialmente pueden presentarse en forma de un kit de componentes separados para el mezclado extemporáneo. Las composiciones estarán generalmente en forma acuosa cuando se administren a un sujeto.

Kits

Las composiciones de la invención pueden prepararse extemporáneamente, en el momento de la administración. Por tanto, la vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la invención puede proporcionarse como un kit que incluye varios componentes listos para mezclar. El kit permite mantener separados el adyuvante y el antígeno hasta el momento de su uso.

Los componentes están separados físicamente entre sí dentro del kit y esta separación puede lograrse de varias maneras. Por ejemplo, los dos componentes pueden estar en dos recipientes separados, como viales. Luego puede mezclarse el contenido de los dos viales, por ejemplo, extrayendo el contenido de un vial y añadiéndolo al otro vial, o extrayendo por separado el contenido de ambos viales y mezclándolos en un tercer recipiente.

En una disposición preferida, uno de los componentes del kit está en una jeringuilla y el otro está en un recipiente como un vial. La jeringuilla puede usarse (por ejemplo, con una aguja) para insertar su contenido en el segundo recipiente para el mezclado, y luego la mezcla puede extraerse en la jeringuilla. El contenido mezclado de la jeringuilla puede administrarse luego a un paciente, típicamente a través de una nueva aguja estéril. El envasado de un componente en una jeringuilla elimina la necesidad de usar una jeringuilla separada para la administración al paciente.

En otra disposición preferida, los dos componentes del kit se mantienen juntos pero por separado en la misma jeringuilla, por ejemplo, una jeringuilla de doble cámara. Cuando se acciona dicha jeringuilla (por ejemplo, durante la administración a un paciente), se mezclan los contenidos de las dos cámaras. Esta disposición evita la necesidad de un paso de mezclado separado en el momento del uso.

Los componentes del kit estarán generalmente en forma acuosa. En algunas disposiciones, un componente (típicamente un componente de antígeno en lugar de un componente de adyuvante) está en forma seca (por ejemplo, en forma liofilizada), el otro componente estando en forma acuosa. Los dos componentes pueden mezclarse para reactivar el componente seco y dar una composición acuosa para la administración a un paciente. Un componente liofilizado típicamente estará localizado dentro de un vial en lugar de una jeringuilla. Los componentes secos pueden incluir estabilizadores como lactosa, sacarosa o manitol, así como mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol, etc. Una disposición posible usa un componente adyuvante acuoso en una jeringuilla precargada y un componente de antígeno liofilizado en un vial.

Envasado de composiciones o componentes de kits

Los recipientes adecuados para las composiciones de la invención (o los componentes del kit) incluyen viales, jeringuillas (por ejemplo, jeringuillas desechables), espráis nasales, etc. Estos recipientes deben ser estériles.

Cuando una composición/componente se encuentra en un recipiente, como un vial, dicho recipiente está hecho opcionalmente de un material de vidrio o plástico. En algunas realizaciones, dicho recipiente es un contenedor siliconizado. Preferiblemente, el vial se esteriliza antes de añadirle la composición. Para evitar problemas con pacientes sensibles al látex, los viales se sellan preferiblemente con un tapón sin látex y se prefiere la ausencia de látex en todo el material de envasado. El vial puede incluir una única dosis de vacuna, o puede incluir más de una dosis (es decir, un vial "multidosis"), por ejemplo, 10 dosis. En algunas realizaciones, los viales están hechos de vidrio incoloro.

Un vial puede tener una tapa (por ejemplo, un cierre Luer) adaptada de tal manera que pueda insertarse una jeringuilla precargada en la tapa, el contenido de la jeringuilla pueda expulsarse al vial (por ejemplo, para reconstituir el material liofilizado en el mismo), y el contenido del vial pueda retirarse de nuevo a la jeringuilla. Después de retirar la jeringuilla del vial, puede unirse una aguja y la composición puede administrarse a un paciente. La tapa está preferiblemente localizada dentro de un sello o cubierta, de tal manera que tiene que retirarse el sello o cubierta antes de que pueda accederse a la tapa. Un vial puede tener una tapa que permita la extracción aséptica de su contenido, particularmente para viales multidosis.

Cuando un componente se envasa en una jeringuilla, la jeringuilla puede tener una aguja acoplada. Si no se acopla una aguja, puede suministrarse una aguja separada con la jeringuilla para su montaje y uso. Dicha aguja puede estar enfundada. Se prefieren las agujas de seguridad. Las agujas de calibre 23 de 1 pulgada, calibre 25 de 1 pulgada y calibre 25 de 5/8 de pulgada son típicas. Las jeringuillas pueden estar provistas de etiquetas desprendibles en las que puede imprimirse el número de lote, la temporada de gripe y la fecha de vencimiento del contenido, para facilitar el mantenimiento de registros. El émbolo de la jeringuilla tiene preferiblemente un tapón para evitar que el émbolo se extraiga accidentalmente durante la aspiración. Las jeringuillas pueden tener una tapa de goma de látex y/o un émbolo. Las jeringuillas desechables contienen una sola dosis de vacuna. La jeringuilla generalmente tendrá una tapa en la punta para sellar la punta antes de acoplar la aguja y la tapa de la punta está preferiblemente hecha de caucho de butilo. Si la jeringuilla y la aguja se envasan por separado, la aguja preferiblemente se ajusta con un protector de goma de butilo. Las jeringuillas útiles son las comercializadas con el nombre comercial "Tip-Lok™".

Los recipientes pueden estar marcados para mostrar un volumen de media dosis, por ejemplo, para facilitar la administración a niños. Por ejemplo, una jeringuilla que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que indique un volumen de 0,25 ml.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringuilla o un vial), entonces se prefiere usar un recipiente hecho de vidrio de borosilicato en lugar de vidrio de cal sodada. En algunas realizaciones, un recipiente es un recipiente siliconado, como un recipiente de vidrio siliconado.

Un kit o composición puede estar envasado (por ejemplo, en la misma caja) con un prospecto que incluye detalles de la vacuna, por ejemplo, instrucciones para la administración, detalles de los antígenos dentro de la vacuna, etc. Las instrucciones también pueden contener advertencias, por ejemplo, para mantener una solución de adrenalina fácilmente disponible en caso de reacción anafiláctica después de la vacunación, etc.

Métodos de tratamiento y administración de la vacuna

Las composiciones de la invención son adecuadas para la administración a pacientes humanos, y la invención proporciona su uso en un método para generar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende el paso de administrar una composición de la invención al paciente.

Estos métodos y usos se usarán generalmente para generar una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectora. Los métodos para evaluar las respuestas de anticuerpos, la capacidad de neutralización y la protección después de la vacunación contra el virus de la gripe son bien conocidos en la técnica. Los estudios en humanos han demostrado que los títulos de anticuerpos contra la hemaglutinina del virus de la gripe humana se correlacionan con la protección (un título de inhibición de la hemaglutinación de una muestra de suero de aproximadamente 30-40 proporciona alrededor del 50% de protección contra la infección por un virus homólogo). Las respuestas de anticuerpos se miden típicamente por inhibición de la hemaglutinación (HI), por microneutralización (Micro-NT) y/o por hemólisis radial simple (SRH), pero puede emplearse cualquier otro método adecuado. Tales técnicas de ensayo son bien conocidas en la técnica.

Como se usan en la presente, los términos "administrar", "administración" y similares, se refieren a hacer que una composición farmacéutica (como vacunas) esté disponible para el cuerpo de un sujeto, local o sistémicamente, por cualquier vía adecuada. Las composiciones de la invención pueden administrarse de varias maneras. La vía de inmunización más preferida es la inyección intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna), pero otras vías disponibles incluyen inyección subcutánea, intranasal, oral, mucosal, transmucosal, parenteral, intradérmica, transcutánea, transdérmica, etc. Una lista más completa de las vías de administración puede encontrarse en: www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/DataStan dardsManualmonographs/ucm071667.htm.

Las composiciones preferidas de la invención satisfarán 1, 2 o 3 de los criterios del CHMP para la eficacia en adultos de cada cepa de gripe, aunque se administren a niños. Estos criterios son: (1) >70% de seroprotección; (2) >40% de seroconversión o aumento significativo; y/o (3) un aumento de GMT de >2,5 veces. En ancianos (>65 años), estos criterios son: (1) >60% de seroprotección; (2) >30% de seroconversión; y/o (3) un aumento de GMT de >2 veces.

La invención es particularmente útil para aumentar las respuestas inmunitarias que protegen frente a diferentes cepas del virus de la gripe, como las cepas del virus A y B.

Como se usa en la presente, los términos "cantidad eficaz" y "dosis eficaz" se refieren a una cantidad o dosis de un compuesto o composición que es suficiente para cumplir con su propósito o propósitos pretendidos, es decir, provocar una respuesta biológica o medicinal deseada en un tejido o sujeto con una relación beneficio/riesgo aceptable. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la presente invención, el propósito o propósitos pueden ser inducir o aumentar una respuesta inmunitaria deseada en un sujeto. El propósito previsto pertinente puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad que, cuando se administra a una población de sujetos que cumplen ciertos criterios (por ejemplo, determinados por el historial médico o de tratamiento, el perfil genético o de edad, etc.), se obtiene una respuesta estadísticamente significativa entre la población. Una cantidad eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier agente farmacéutico particular, una cantidad eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, los perfiles de población, etc. Los expertos en la técnica apreciarán que en algunas realizaciones de la invención, puede considerarse que una dosificación unitaria contiene una cantidad eficaz si contiene una cantidad apropiada para la administración en el contexto de un régimen de dosificación correlacionado con un resultado positivo.

El tratamiento con las composiciones de la invención puede ser mediante un programa de dosis individual o un programa de dosis múltiple. Por tanto, en cualquier estación de gripe particular (por ejemplo, en un período determinado de 12 meses, típicamente en otoño o invierno), un paciente puede recibir una dosis única de una composición de la invención o más de una dosis de la composición de la invención (por ejemplo, dos dosis). Cuando el tratamiento comprende la administración de dos o más dosis de las composiciones de la invención, cada dosis generalmente no se administrará sustancialmente al mismo tiempo, es decir, no se administrarán durante la misma visita a un centro de vacunación. El tiempo entre la administración sucesiva de las composiciones de la invención es típicamente de por lo menos n días, donde n se selecciona de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 42, 49, 56 o más. Típicamente, se administran dos dosis con por lo menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). Administrar dos dosis separadas por 25-30 días (por ejemplo, 28 días) es particularmente útil. El tiempo entre dosis típicamente no será de más de 6 meses. Las dosis pueden administrarse con aproximadamente 4 semanas de diferencia entre sí, por ejemplo, el día 0 y luego aproximadamente el día 28. Se ha descubierto que la separación de las dosificación de esta manera proporciona buenas respuestas inmunitarias

Cuando las composiciones de la invención se usan en un programa de inmunización primaria, la o las dosis con las composiciones de la invención van seguidas de la administración de una o más vacunas de refuerzo (por ejemplo, 1, 2, 3 o más vacunas de refuerzo). La cadencia adecuada entre el cebado y la administración de la vacuna de refuerzo puede determinarse de manera rutinaria. El tiempo entre la administración de una dosis de cebado y la administración de una vacuna de refuerzo es típicamente de por lo menos p meses, donde p se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 o más. Idealmente, p es 9 o más, y puede estar dentro del intervalo de 9-30.

En un programa de dosis múltiples, las varias dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una preparación parenteral y un refuerzo en la mucosa, un cebado en la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Típicamente, pero no necesariamente, se administrarán por la misma vía.. Las vacunas pueden administrarse a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo que otras vacunas (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional de la salud o centro de vacunación), por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubéola, una vacuna contra la MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra la MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tosferina, una vacuna contra la DTP, una vacuna contra la H. influenzae de tipo b conjugada, una vacuna contra el virus de la polio inactivada, una vacuna de virus de la hepatitis B, vacuna meningocócica conjugada (como la vacuna tetravalente AC-W135-Y), vacuna neumocócica conjugada, etc.

De manera similar, las vacunas de la invención pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional de la salud) un compuesto antiviral y, en particular, un compuesto antiviral activo contra el virus de la gripe (por ejemplo, oseltamivir y/o zanamivir). Estos antivirales incluyen inhibidores de la neuraminidasa, como el ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(I-etilpropoxi)-I-ciclohexeno-I-carboxílico o el ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anhidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, incluyendo los ésteres de los mismos (por ejemplo, los ésteres etílicos) y sales de los mismos (por ejemplo, el sales de fosfato). Un antiviral preferido es el éster etílico del ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(I-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxílico, fosfato (1:1), también conocido como oseltamivir fosfato (TAMIFLU™).

Vacunas contra la gripe en dosis altas para los receptores de estatinas

Para realizaciones en las que se administra una vacuna de dosis alta a un sujeto de una población objetivo, dicha vacuna puede ser una vacuna sin adyuvante. En algunas realizaciones, una población objetivo de la presente invención se refiere a sujetos humanos que reciben una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, una terapia con estatinas, una terapia con AINE, etc.) que también pertenecen a un grupo de edad particular, por ejemplo, con edades comprendidas entre 18 y 64 años. etc. Tales sujetos pueden estar en una terapia con estatinas que comprende una estatina no sintética, una estatina sintética o una combinación de las mismas. Aunque cualquiera de tales poblaciones se beneficiará de la invención descrita en la presente, puede ser particularmente beneficiosa para aquellos que están en una terapia con estatinas sintéticas, que están en una terapia con estatinas a largo plazo, o ambas.

Las vacunas de dosis alta incluyen vacunas antigripales multivalentes (por ejemplo, trivalentes y tetravalentes) y pueden contener 50 |jg, 60 |jg, 70 |jg, 80 |jg, 90 |jg de antígeno de cada una de las cepas. Tales composiciones de vacunas pueden formularse como una suspensión estéril inyectable (por ejemplo, 0,5 ml) que contiene antígenos adecuados. El virus usado para producir dichas composiciones puede producirse opcionalmente en huevos de pollo embrionados, opcionalmente puede inactivarse (por ejemplo, con formaldehído), opcionalmente puede dividirse (por ejemplo, con un detergente no iónico) y puede comprender una cepa similar a A/(H1N1), una cepa similar a A/ (H3N2) y una cepa B. Para dar algunos ejemplos, pueden formularse para una estación las cepas A/California/7/2009 (H1N1), A/Victoria/210/2009 (H3N2) y B/Brisbane/60/2008, mientras que pueden formularse para otra estación las cepas A/California/ 7/2009 (H1N1), A/Victoria/361/2011 (H3N2), y B/Texas/6/2011 (virus similar a BMisconsin/1/2010). Tales composiciones de vacuna pueden proporcionarse opcionalmente en jeringuillas listas para su uso (como 0,5 ml) y pueden administrarse por vía intramuscular (IM) a un paciente en tratamiento con estatinas, opcionalmente en el área del deltoides.

General

A lo largo de la memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones, cuando el contexto lo permita, el término "que comprende" y variantes del mismo, como "comprende" o "que comprende", deben interpretarse como que incluyen el elemento (por ejemplo, número entero) o elementos (por ejemplo, números enteros) indicados, sin excluir necesariamente ningún otro elemento (por ejemplo, números enteros).

El término "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico n se refiere a un intervalo de valores numéricos considerados típicos o aceptables, por ejemplo, dentro de errores estadísticos, desviaciones o variaciones dentro de una población particular, a partir de la cual se obtiene un conjunto de datos relevante para ciertas mediciones o análisis. Los expertos en la técnica pueden entender fácilmente tales intervalos. Por ejemplo, un valor numérico n puede significar (n ± 1%), (n ± 1%), (n ± 2%), (n ± 3%), (n ± 4%), (n ± 5%), (n ± 6%), (n ± 7%), (n ± 8%), (n ± 9%), (n ± 10%), (n ± 1%), (n ± 12%), (n ± 13%), (n ± 14%), (n ± 15%), (n ± 16%), (n ± 17), (n ± 18%), (n ± 19%), (n ±20%) y así sucesivamente.

A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende un paso de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. Por tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces dos componentes pueden combinarse entre sí, y luego la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

Cuando se usan materiales animales (y en particular bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes que estén libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) y, en particular, libres de encefalopatía espongiforme bovina (BSE). En general, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales.

Cuando se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición, entonces ese compuesto puede ser reemplazado alternativamente por un profármaco adecuado.

Cuando se usa un sustrato celular para procedimientos de reordenamiento o genética inversa, es preferible que haya sido aprobado para su uso en la producción de vacunas humanas, por ejemplo, como en el capítulo general 5.2.3 de la Farmacopea Europea, "Sustratos celulares para la producción de vacunas para uso en humanos".

EJEMPLIFICACIÓN

Como se ha mencionado anteriormente, la terapia con estatinas se ha asociado con efectos secundarios en el sistema inmunitario. Estos efectos incluyen efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios. Como muchos pacientes que toman estatinas rutinariamente son ancianos y los ancianos tienen mayores riesgos de complicaciones de la gripe (Thompson, W. W., Shay, D. K., Weintraub, E., Brammer, L., Cox, N., Anderson, L. J., & Fukuda, K. (2003). Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States. Jama, 289(2): 179-186), utilizamos datos de un gran estudio comparativo de inmunogenicidad de vacunas contra la gripe con y sin adyuvantes en el ancianos para evaluar la influencia de la terapia con estatinas en la respuesta inmunitaria a la vacuna contra la gripe.

Utilizamos las mediciones de inmunogenicidad disponibles de un ensayo comparativo de vacuna contra la gripe con adyuvante frente a sin adyuvante en pacientes para evaluar la influencia de la terapia con estatinas sobre la respuesta inmunitaria a la vacunación. En general, estaban disponibles para el análisis los datos de más de 5000 participantes del ensayo. La comparación de los títulos de las medias geométricas de HAI para las cepas de gripe H1N1, H3N2 y B en personas que reciben y no terapia crónica con estatinas reveló que los títulos en los receptores de estatinas fueron un 38%, 67% y 38%, respectivamente, más bajos en los receptores de estatinas que en individuos que no recibieron estatinas. Este efecto inmunosupresor de las estatinas sobre la respuesta inmunitaria a la vacuna fue particularmente importante en individuos que tomaban estatinas sintéticas. Estos efectos se observaron en los grupos de vacunas con adyuvante y sin adyuvante. Sin embargo, como los títulos en el grupo de la vacuna con adyuvante fueron más altos, el impacto de la terapia con estatinas sobre la respuesta a la vacuna fue contrarrestado, por lo menos parcialmente, por el uso de la vacuna con adyuvante. Estos resultados tienen implicaciones tanto para el diseño de futuros ensayos clínicos como para las recomendaciones de uso de vacunas en los ancianos.

Métodos

Durante las estaciones de gripe de 2009-2010 y 2010-2011, se realizó un ensayo clínico aleatorizado, controlado y ciego para comparar la seguridad y la inmunogenicidad de la vacuna trivalente contra la gripe con adyuvante MF-59 ("aTIV") y la TIV sin adyuvante en más de 14000 adultos mayores de 65 años en Colombia, Panamá, Filipinas y Estados Unidos (Frey SE, Aplasca-De Los Reyes MR, Reynales H, Bermal NN, Nicolay U, Narasimhan V, Forleo-Neto E, y Arora AK. Comparison of the Safety and Immunogenicity of an MF-59 adjuvanted with a Non-adjuvanted seasonal influenza vaccine in Elderly Subjects. Vaccine in press). Como parte de esta evaluación, se recopiló información sobre el uso de estatinas y esto se consideró como un posible factor de confusión en los análisis comparativos.

Se obtuvieron muestras de sangre el día de la vacunación y 28 días después de recibir la vacuna contra la gripe estacional adecuada. Los títulos de HAI se determinaron usando la metodología estándar (Murphy, B. R., Phelan, M. A., Nelson, D. L., Yarchoan, R., Tierney, E. L., Alling, D. W., & Chanock, R. M. (1981). Hemagglutininspecific enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to influenza A and B viruses. Journal of clinical microbiology, 13(3): 554-560).

Para los propósitos de nuestro análisis post-hoc actual, los pacientes se clasificaron como en terapia con estatinas si habían estado tomando medicamentos durante 28 días o más antes de recibir la vacunación y hasta el día 22 después de la vacunación. Los individuos que no habían recibido estatinas durante este período de tiempo se consideraron controles. El pequeño número de individuos que no encajaban en ninguno de los grupos se eliminó del análisis. Los pacientes se estratificaron adicionalmente en cuanto a si estaban tomando estatinas sintéticas o naturales.

Luego se compararon los títulos medios geométricos (GMT) y las proporciones de GMT entre los grupos de estatina y de control frente a las cepas de gripe A homólogas a la vacuna H1N1 (California), H3N2 (Perth) y gripe B (Brisbane). En las comparaciones ajustadas, un análisis ANCOVA incluyó las siguientes variables: grupo de vacuna (aTIV, TIV), usuario de estatinas en los días -28 a 22 (sí/no), estado de alto riesgo (sí/no), sexo, registro-pre-título de vacunación y edad (ambas variables continuas). Como una evaluación de la interacción entre el tipo de vacuna y las estatinas no reveló un impacto del tipo de vacuna sobre el impacto de las estatinas sobre la respuesta inmunitaria (p>0.05), se calcularon las proporciones de las GMT en los receptores de estatinas y los controles para el grupo de estudio combinado.

Resultados

Un total de 6961 sujetos, 3479 en el grupo de TIV con adyuvante MF-59 ("aTIV") y 3482 en el grupo de TIV sin adyuvante ("TIV"), tenían títulos de HAI el día 22 disponibles para el análisis. En general, 2798 y 2786 receptores de aTIV y TIV respectivamente eran controles y se determinó que 681 y 696 individuos respectivamente cumplían con la definición de usuarios de estatinas. De los usuarios de estatinas, el 76% de los usuarios de estatinas de aTIV y el 74% de los usuarios de TIV tomaban estatinas derivadas de la fermentación (pravastatina, simvastatina, lovastatina, Adivocor) y el resto tomaba estatinas sintéticas (fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina). En general, se consideró que el 75% de los usuarios de estatinas tenían una condición médica de alto riesgo. La categoría más común fue la enfermedad neurológica subyacente, seguida de la EPOC, asma, insuficiencia cardíaca congestiva, la insuficiencia renal y la enfermedad hepática. (Tabla 1). En general, el 55% de los usuarios de estatinas y el 68% de los controles eran hombres y el 74% de los controles y el 67% de los usuarios de estatinas tenían entre 65 y 75 años y el resto tenía más de 75 años. Los resultados de los GMT de HAI contra las tres cepas de la vacuna contra la gripe se muestran en la Tabla Dos con la proporción del día uno ajustada por edad, grupo de riesgo y vacuna y la proporción del día 22 también ajustada por título previo.

T l 1: m r ili n r

T l 2: Tí l MT r in r v n r n l r ri

Como puede verse en la Tabla Dos, los títulos previos generales fueron iguales en cada grupo de vacuna para cada una de las tres cepas. Sin embargo, los individuos que tomaban estatinas tenían títulos previos más altos contra H1N1 y la gripe B, mientras que lo contrario era cierto para la gripe H3N2. Los títulos del día 22 después de la vacunación fueron significativamente más altos en los receptores de aTIV para los tres antígenos. En los análisis que compararon a los que recibieron estatinas con los controles, independientemente del tipo de vacuna, la proporción de títulos de GMT fue un 38% más alta en los controles para H1N1, un 67% más alta para H3N2 y un 38% más alta para gripe B, lo que indica una marcada reducción en la inmunogenicidad en los receptores de estatinas para los tres antígenos a pesar del ajuste por edad, estatus de grupo de alto riesgo, título previo y tipo de vacuna recibida. Se obtuvieron datos similares al probar contra cepas heterólogas de gripe B (Malasia), y H3N2 (Brisbane y Wisconsin), no mostrado.

En la Tabla 3 se muestran los resultados estratificados por tipo de estatina.

Tabla 3: Influencia del ti o de estatina sobre la res uesta a la vacuna evaluada el día 22

Los pacientes que recibieron estatinas derivadas de la fermentación tuvieron títulos más altos que los que recibieron estatinas sintéticas, lo que indica que estas últimas tuvieron un mayor efecto inmunosupresor sobre la respuesta a la vacuna contra la gripe. También se observaron tendencias similares no estadísticamente significativas en las pruebas contra cepas heterólogas.

Análisis

Dentro de los países en desarrollo, la esperanza de vida ha ido aumentando constantemente con una proporción cada vez mayor de la población de los países en desarrollo que son ancianos (Mathers, C. D., Sadana, R., Salomon, J. A., Murray, C. J., & Lopez, A. D. (2001). Healthy life expectancy in 191 countries, 1999. The Lancet, 357(9269): 1685-1691). Estas mejoras se han atribuido a las medidas de salud pública, incluyendo las vacunas y medicamentos como las estatinas (www.who.int/bulletin/volumes/86/2/07-040089/en/ consultado el 16 de julio de 2014). Las estatinas se usan ampliamente en adultos y ancianos para el tratamiento de la hipercolesterolemia. Hemos demostrado que esta clase de fármacos, especialmente las estatinas derivadas sintéticamente, suprimen drásticamente la respuesta inmunitaria a las vacunas contra la gripe tanto con y sin adyuvante en la población evaluada. Sorprendentemente, para dos de las tres cepas, la vacuna con adyuvante fue capaz por lo menos de contrarrestar este efecto inmunosupresor. Para la cepa H3N2 analizada, mientras que los títulos de la vacuna con adyuvante fueron más altos que los de la TIV, los títulos en los receptores de estatinas fueron más bajos después de la aTIV que en los controles que recibieron la vacuna sin adyuvante.

Dada la naturaleza cada vez más compleja de las intervenciones de salud en poblaciones de alto riesgo, incluyendo los ancianos y los que toman ciertos medicamentos, en particular la terapia a largo plazo, será importante evaluar las posibles interacciones entre dichas intervenciones.

Nuestros resultados contrastan directamente con los estudios del impacto de las estatinas sobre la respuesta inmunitaria a la vacuna contra la hepatitis A y el toxoide tetánico en adultos jóvenes. En un estudio de Seigrist et al., la edad media de los sujetos fue de 24 años. En este estudio, se asignaron al azar sujetos sanos para recibir atorvastina o placebo. La respuesta a la vacuna contra la hepatitis A se evaluó 28 días después de recibir la vacuna. No se observaron diferencias en la respuesta inmunitaria entre los dos grupos. Sin embargo, es importante señalar que, a diferencia de nuestro estudio en el que los receptores de estatinas estaban en terapia crónica en el momento de la vacunación, en este estudio de hepatitis A, los participantes del estudio no comenzaron la terapia con estatinas hasta el día de la vacunación (Packard Rs , Schlegel S, Senouf D, Burger F, Sigaud P, Perneger T, Seigrist CA, and Mach F. Atorvastin Treatment and Vaccination Efficacy. J Clin Pharmacology 2007, 47:1022-1027). En otro estudio, Brantly et al evaluaron la respuesta al toxoide tetánico en voluntarios sanos. De manera similar al estudio de la hepatitis A, los participantes sanos del estudio fueron asignados al azar para recibir atorvastina o placebo y comenzaron la medicación el día de la vacunación. Sorprendentemente, los participantes en este estudio asignados al grupo de estatinas tenían niveles de IgG anti-TT tres veces más altos (Lee PY, Sumpia PO, Byars JA, Kelly KM, Zhuang H, Shuster JS, Theriaque DW, Segal MS, Reeves WH, and Brantly ML. Short-term atorvastin treatment enhances specific antibody production following tetanus toxoid vaccination in healthy volunteers. Vaccine 2006, 24: 4035-4040). Las dos diferencias claras entre estos estudios y los resultados de los que informamos aquí son la edad mucho mayor de nuestro grupo de estudio y el hecho de que en los estudios de toxoide tetánico y hepatitis A, los participantes no habían estado expuestos crónicamente a las estatinas en el momento de la vacunación. Por supuesto, es posible que uno o ambos de estos factores contribuyan a los resultados contrastantes del estudio. Sin embargo, como la mayoría de los usuarios de estatinas toman la medicación a largo plazo, los resultados de estos dos estudios tienen una utilidad limitada para evaluar la influencia del tratamiento con estatinas rutinario.

Los estudios sobre la efectividad de la vacuna contra la gripe en los ancianos han revelado niveles de eficacia subóptimos. En un estudio realizado por Monto en pacientes ancianos de residencias de ancianos, la vacunación fue del 33% contra la enfermedad similar a la gripe y del 43% contra la neumonía (Monto, A. S., Hornbuckle, K., & Ohmit, S. E. (2001). Influenza vaccine effectiveness among elderly nursing home residents: a cohort study. American journal of epidemiology, 154(2), 155-160). En un estudio de metanálisis anterior que usaba datos de veinte estudios observacionales realizados en gran parte entre las décadas de 1970 y 1980, Gross encontró estimaciones agrupadas más altas de la eficacia de la vacuna del 56% (IC del 95%, del 39% al 68%) para la prevención de enfermedades respiratorias, del 53% (IC, del 35% al 66%) para la prevención de neumonía, del 50% (IC, del 28% al 65%) para la prevención de la hospitalización y del 68% (IC, del 56% al 76%) para la prevención de muerte (Gross, P. A., Hermogenes, A. W., Sacks, H. S., Lau, J., & Levandowski, R. A. (1995). The efficacy of influenza vaccine in elderly personsA meta-analysis and review of the literature. Annals of Internal medicine, 123(7), 518-527). Es de interés que las estimaciones de la eficacia contra las enfermedades respiratorias y la neumonía en los primeros años, cuando el uso de estatinas era menos común, son más altas que las del estudio más reciente. A la luz de los análisis divulgados en la presente, también es posible que estas diferencias se deban a diferentes cepas de gripe y otros factores de población.

Las estatinas se han considerado como agentes adyuvantes en la prevención de la neumonía porque su efecto inmunosupresor podría reducir el estado inflamatorio inicial y, por tanto, la gravedad de la neumonía. Los estudios observacionales del uso de estatinas en la EPOC han informado de reducciones en la mortalidad del 30%-50% después de neumonía o exacerbaciones infecciosas en usuarios de estatinas (Young R, Hopkins RJ. Statin Use in Pneumonia. The American Journal of Medicine, Volume 126 , Issue 7 , e11 - e12). Otros estudios no han encontrado un impacto de las estatinas sobre el riesgo de neumonía y sepsis (Yende S, Milbrandt EB, Kellum JA, Kong L, Delude Rl , Weissfeld LA and Angus DC. Understanding the potential role of statins in pneumonia and sepsis. Critical Care Medicine 2011, 39(8): 1871-1878). Fedson ha recomendado considerar las estatinas como agentes terapéuticos en el tratamiento de la neumonía en ancianos (Fedson, D. S. (2013). Treating influenza with statins and other immunomodulatory agents. Antiviral research, 99(3), 417-435). En un comentario, afirma que aunque los biólogos del sistema han sugerido el uso de agentes inmunomoduladores como las estatinas en el tratamiento de la gripe, deberían preceder a su uso rutinario ensayos clínicos aleatorios de este enfoque. Fedson señala de manera similar que, especialmente en pandemias en las que la enfermedad grave puede continuar con la disponibilidad de la vacuna durante muchos meses, debe considerarse la evaluación de las estatinas como agentes potenciales para reducir la inflamación y, por lo tanto, la gravedad de la enfermedad. (Fedson, D. S. (2013). How will physicians respond to the next influenza pandemic?. Clinical infectious diseases, cit695).

Claramente, el impacto de las estatinas sobre el sistema inmunitario y la consiguiente respuesta a la vacuna, así como el riesgo de enfermedad, son complejos. Aunque los efectos inmunosupresores de las estatinas pueden ser deseables en el estado agudo de la enfermedad, el mismo efecto puede ser perjudicial cuando afecta a la respuesta a la vacuna. Hemos demostrado un efecto dramático del uso de estatinas a largo plazo sobre la respuesta inmunitaria a la vacuna contra la gripe en la población analizada. Este efecto negativo debe tenerse en cuenta al evaluar la inmunogenicidad y la eficacia de la población afectada por las vacunas contra la gripe y, potencialmente, al considerar el uso preferencial de vacunas con adyuvante y/o vacunas de dosis alta en tales poblaciones de sujetos para contrarrestar la inmunosupresión inducida por fármacos.

Las varias características y realizaciones de la presente invención, a las que se hace referencia en las secciones individuales anteriores, se aplican, según sea apropiado, a otras secciones, mutatis mutandis. En consecuencia, las características especificadas en una sección pueden combinarse con las características especificadas en otras secciones, según sea apropiado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna contra la gripe para su uso en la inmunización de un sujeto contra la infección por el virus de la gripe, en donde la vacuna comprende:

(a) un adyuvante y una dosis estándar de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B; o

(b) una dosis alta de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B, que tiene entre 30 jg y 150 |jg de antígeno por cepa de gripe; o

(c) un adyuvante y una dosis alta de antígeno del virus de la gripe de una cepa H1N1, una cepa H3N2 y una cepa B, que tiene entre 30 jg y 150 jg de antígeno por cepa de gripe;

y en donde el sujeto tiene menos de 65 años, pero 18 años o más y está en terapia con estatinas.

2. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adyuvante es un adyuvante de sal de aluminio o un adyuvante de emulsión de aceite en agua.

3. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el adyuvante de emulsión de aceite en agua comprende escualeno; y opcionalmente, en donde el adyuvante de emulsión de aceite en agua comprende además un surfactante.

4. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el adyuvante de aceite en agua comprende escualeno, polisorbato 80 y trioleato de sorbitán, en donde el adyuvante de aceite en agua comprende opcionalmente un 4,3% de escualeno, un 0,5% de polisorbato 80 y un 0,48% de trioleato de sorbitán en peso.

5. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la vacuna comprende un adyuvante y comprende entre dos y diez veces la cantidad de un antígeno de dosis estándar.

6. La vacuna contra la gripe para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la vacuna contra la gripe comprende entre 30 jg y 150 jg de antígeno por cepa.

7. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la vacuna contra la gripe comprende 60 jg de antígeno por cepa.

8. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 5-7, en donde la vacuna no contiene un adyuvante de emulsión de aceite en agua.

9. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el sujeto ha estado en terapia con estatinas durante por lo menos 1 semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas, por lo menos 4 semanas o más.

10. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el sujeto tiene

a) entre 45 y 64 años de edad; o,

b) entre 60 y 64 años de edad.

11. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la terapia con estatinas comprende una estatina sintética, una estatina no sintética o una combinación de las mismas, opcionalmente en donde la terapia con estatinas comprende una estatina seleccionada del grupo que consiste de: pravastatina, simvastatina, lovastatina y mevastatina, fluvastatina, atorvastatina, cerivastatina, rosuvastatina y pitavastatina.

12. La vacuna contra la gripe para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la terapia con estatinas comprende una estatina sintética seleccionada del grupo que consiste de:

fluvastatina, atorvastatina, cerivastatina, rosuvastatina y pitavastatina.