PT2356983E - Circulação dos componentes durante a homogeneização da emulsão - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

CIRCULAÇÃO DOS COMPONENTES DURANTE A HOMOGENEIZAÇÃO DA

EMULSÃO

CAMPO TÉCNICO A presente invenção está no campo da fabricação de emulsões de óleo em água adjuvantes para vacinas em emulsão por homogeneização. ANTECEDENTES NA TÉCNICA 0 adjuvante de vacina conhecido como 'MF59' [1-3] é uma emulsão submicrónica de óleo em água de esqualeno, polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80), e trioleato de sorbitano (também conhecido como Span 85) . Também pode incluir iões de citrato por exemplo 10 mM de tampão de citrato de sódio. A composição da emulsão por volume pode ser de aproximadamente um 5% de esqualeno, aproximadamente um 0,5% de Tween 80 e aproximadamente um 0,5% de Span 85. O adjuvante e a sua produção são descritos com mais pormenor no capitulo 10 da referência 4, no capitulo 12 da referência 5 e no capitulo 19 da referência 6.

Como se descreve na referência 7, o MF59 fabrica-se a escala comercial mediante a dispersão de Span 85 na fase de esqualeno e Tween 80 na fase aquosa, seguida da mistura a alta velocidade para formar uma emulsão grossa. Esta emulsão grossa é passada repetidamente através de um microfluidizador para produzir uma emulsão com um tamanho uniforme de gotas de óleo. Como se descreve na referência 6, a emulsão microfluidizada é filtrada através de uma membrana de 0,22 mm para eliminar as gotas grandes de óleo, e o tamanho médio das gotas da emulsão resultante mantém-se inalterável durante pelo menos 3 anos a 4 °C. O conteúdo em esqualeno da emulsão final pode ser medido como se descreve na referência 8.

As emulsões de óleo em água contêm gotas de óleo. As gotas de óleo maiores incluidas nestas emulsões podem atuar como sitios de nucleação para a agregação, o que leva à degradação da emulsão durante o armazenamento. A referência 8a descreve um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água com esqualeno que inclui a passagem dos componentes da emulsão várias vezes através do um homogeneizador simples para reduzir o tamanho das gotas de óleo. É um propósito da invenção proporcionar métodos adicionais e melhorados para a produção de emulsões microfluidizadas de óleo em água (tais como MF59), especialmente métodos que são adequados para uso a escala comercial e que proporcionam uma homogeneização e microfluidização melhoradas para proporcionar emulsões com um menor número de partículas grandes.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água com esqualeno, incluindo o método a etapa de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo usando um homogeneizador, em que a primeira emulsão se forma mediante a circulação dos componentes da emulsão primeiro através de um homogeneizador tal como se descreve na reivindicação 1. A invenção também proporciona um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclui esqualeno, incluindo o método a etapa de: (b) microfluidização de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho medio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, em que a segunda emulsão se forma mediante a circulação dos componentes da segunda emulsão por transferência dos componentes da segunda emulsão desde um recipiente da primeira emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização para um recipiente da segunda emulsão, e depois através de um segundo dispositivo de microfluidização, em que os dispositivos de microfluidização primeiro e segundo são o mesmo.

Opcionalmente, o método da presente invenção inclui uma etapa anterior de (a) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo.

Opcionalmente, o método da presente invenção inclui a etapa de (c) filtração da segunda emulsão.

Como se descreve com mais pormenor a seguir, a primeira emulsão pode ter um tamanho médio de gota de óleo de 5000nm ou menos, por exemplo, um tamanho médio de entre 300 nm e 800 nm. O número de gotas de óleo na primeira emulsão com um tamanho> 1,2 mm pode ser de 5 x 1.011 / ml ou menos, tal como se descreve a seguir. Gotas de óleo com um tamanho> 1,2 mm não são recomendáveis, já que podem causar a instabilidade da emulsão devido à aglomeração e coalescência das gotas [14].

Depois da formação, a primeira emulsão pode submeter-se então a pelo menos um processo de microfluidização para formar a segunda emulsão que tem um tamanho médio reduzido de gota de óleo. Como se descreve a seguir, o tamanho médio de gota de óleo da segunda emulsão é de 500 nm ou menos. O número de gotas de óleo na segunda emulsão com um tamanho de > 1,2 mm pode ser de 5 x 1010 / ml ou menos, tal como se descreve a seguir. Para conseguir estas caracteristicas pode requerer-se o processo dos componentes da emulsão através do dispositivo de microfluidização várias vezes, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 vezes. A segunda emulsão pode então ser filtrada, por exemplo, através de uma membrana hidrofilica de polietersulfona, para dar uma emulsão de óleo em água que pode ser adequada para o seu uso como adjuvante de vacina. O tamanho médio de gota de óleo da emulsão de óleo em água produzida depois da filtração pode ser de 220 nm ou menos, por exemplo, entre 135-175 nm, entre 145-165 nm, ou aproximadamente 155 nm. O número de gotas de óleo que têm um tamanho de >1,2 mm presentes na emulsão de óleo em água produzida depois da filtração pode ser de 5 x 108 /mL ou menos, por exemplo 5 x 107/ml ou menos, 5 x 106/ml ou menos, 2 x 106 / ml ou menos, ou 5 x 105 / ml ou menos. A emulsão final de óleo em água formada depois da filtração pode ter pelo menos 102 vezes menos gotas de óleo com um tamanho de > 1,2 mm em comparação com a primeira emulsão, e de maneira ideal pelo menos 103 vezes menos (por exemplo, 104 vezes menos).

Em algumas formas de realização mais de um ciclo das etapas (i) e (ii) usa-se antes da passagem (111) . De maneira similar, podem ser utilizadas múltiplas repetições das etapas iindividuais (i) e (ii) .

Em geral, o método realiza-se entre 20-60 °C, e idealmente a 40 ± 5 °C. Embora os componentes da emulsão primeira e segunda possam ser relativamente estáveis até a temperaturas mais altas, pode dar-se a descomposição térmica de alguns componentes e são recomendáveis as temperaturas baixas.

Componentes da emulsão O tamanho médio de gota de óleo (isto é, o diâmetro médio em número de gotas de óleo da emulsão) pode ser medido usando uma técnica de dispersão de luz dinâmica, como se descreve na referência 13. Um exemplo de máquina de medição por dispersão de luz dinâmica é o Analisador do Tamanho de Partículas Submicron Nicomp 380 (de Particle Sizing Systems). O número de partículas que têm um tamanho> 1,2 mm pode ser medido usando um contador de partículas, como o Accusizer ™ 770 (de Particle Sizing Systems).

Os métodos da invenção são usados para a fabricação de emulsões de óleo em água. Estas emulsões incluem três ingredientes básicos: um óleo; um componente aquoso, e um tensioativo.

Como as emulsões estão destinadas ao uso farmacêutico então o óleo será habitualmente biodegradável (metabolizável) e biocompativel. 0 óleo utilizado pode incluir esqualeno, um óleo de figado de tubarão, que é um terpenóide ramificado e insaturado (C30H50; (CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19, 23-hexametil-2-,6,10,14,18,22 tetracosahexaeno, CAS RN 7683-64-9).0 esqualeno é recomendado de maneira especial para o uso na presente invenção. O óleo da presente invenção pode incluir uma mistura (ou combinação) de óleos, por exemplo, incluindo esqualeno e pelo menos um óleo adicional.

Em vez de (ou além de) o uso de esqualeno, uma emulsão de esqualeno pode incluir óleos, incluídos os proveniente, por exemplo, de uma fonte animal (como o peixe) ou vegetal. As fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. 0 óleo de amendoim, de soja, de coco, e azeite, os mais comummente disponíveis, exemplificam os óleos de frutos secos. 0 óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo, obtido da semente de jojoba. Os óleos de sementes incluem óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e similares. No grupo dos grãos, o óleo de milho é o mais acessível, mas o óleo de outros grãos de cereais tais como trigo, aveia, centeio, arroz, tef, triticale e similares também podem ser utilizados. 6-10 carbono ésteres de ácidos gordos de glicerol e 1,2-propanodiol, embora não se produzam de forma natural nos óleos de sementes, podem ser preparados mediante hidrólise, separação e esterificação dos materiais de partida apropriados a partir dos óleos de frutos secos e de sementes. As gorduras e óleos do leite de mamífero são metabolizáveis e portanto podem ser utilizados. Os procedimentos para a separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros de fontes animais são bem conhecidos na técnica. A maioria dos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, os óleos de fígado de tubarão, e o óleo de baleia (por exemplo, esperma de baleia) exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser usados na presente memória. Uma série de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são denominados geralmente como terpenóides. 0 esqualano, o análogo saturado do esqualeno, também pode ser utilizado. Os óleos de peixe, incluídos o esqualeno e o esqualano, estão facilmente disponíveis em fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica.

Os outros óleos úteis são os tocoferóis, particularmente em combinação com esqualeno. Quando a fase oleosa de uma emulsão inclua um tocoferol, qualquer dos tocoferóis a, p, y, 8, ou \ pode ser utilizado, mas são recomendados os tocoferóis a. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ser utilizados. Um a-tocoferol recomendável é o DL-a-tocoferol. 0 tocoferol pode tomar várias formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Os sais incluem sais orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se se utiliza um sal deste tocoferol, o sal recomendável é o succinato. Uma combinação de óleo que inclua esqualeno e um tocoferol (por exemplo, DL-a-tocoferol) pode ser utilizada. 0 componente aquoso pode ser água potável (por exemplo, w.f.i.) ou pode incluir outros componentes, por exemplo, solutos. Como exemplo, podem ser incluídos sais para formar um tampão, por exemplo, sais de citrato ou fosfato, tais como sais de sódio. Os tampões habituais incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampão succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Os tampões serão incluídos habitualmente na classe de 5-2 0mm. 0 tensioativo é preferivelmente biodegradável (metabolizável) e biocompatível. Os tensioativos podem ser classificados pelo seu "EHL" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo), onde um EHL no intervalo de 1-10 geralmente significa que o tensioativo é mais solúvel em óleo que em água, e um EHL no intervalo de 10-20 é mais solúvel em água que em óleo. As emulsões incluem preferivelmente pelo menos um tensioativo que tem um EHL de pelo menos 10 por exemplo, pelo menos 15, ou preferivelmente pelo menos 16. A invenção pode ser usada com tensioativos que incluam, mas não se limitem a: tensioativos de ésteres de polioxietilensorbitano (comummente conhecidos como), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO ), e/ou óxido de butileno (BO), que se vende com o nome comercial DOWFAX ™, tais como copolímeros de bloco linear EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de repetição de grupos etoxi(oxi-1,2-etanodiilo), com octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)poli-etoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tais como fosfatidilcolina (lecitina); polioxietileno éteres gordos derivados de álcoois laurílicos , cetílicos, estearílicos e oleílicos (conhecidos como tensioativos Brij), tais como trietilenglicol lunolauril éter (Brij 30) ; polioxietileno-9-lauril éter, e ésteres de sorbitano (comummente conhecido como SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensioativos recomendados para incluir na emulsão são polissorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

As misturas de tensioativos podem ser incluídas na emulsão por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85 ou misturas de Tween 80/Triton X100. Também é adequada a combinação de um éster de polioxietileno sorbitano tal como monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) e um octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Outra combinação útil inclui laureth 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol. As misturas úteis podem incluir um tensioativo com um valor EHL no intervalo de 10-20 (por exemplo, Tween 80, com um EHL de 15,0) e um tensioativo com um valor EHL no intervalo de Ι-ΙΟ (por exemplo, Span 85, com um EHL de 1,8) .

Formação da primeira emulsão

Antes da etapa de microfluidização, os componentes da emulsão são misturados para formar uma primeira emulsão de acordo com o método descrito na reivindicação 1.

As gotas de óleo da primeira emulsão podem ter um tamanho médio de 5000 nm ou menos, por exemplo, 4000 nm ou menos, 3000nm ou menos, 2000nm ou menos, 1200nm ou menos, lOOOnm ou menos, por exemplo, um tamanho médio entre 800 e 1200 nm ou entre 300 nm e 800 nm.

Na primeira emulsão, o número de gotas de óleo com um tamanho de > 1,2 mm pode ser de 5 x 1011/ml ou menos, por exemplo 5 x 1010/ml ou menos, ou 5 x 109/ml ou menos. A primeira emulsão pode então ser microfluidizada para formar uma segunda emulsão que tem um menor tamanho médio de gota óleo que a primeira emulsão e/ou menos gotas de óleo com tamanho> 1,2 mm. O tamanho medio de gota de óleo da primeira emulsão é conseguido mediante a mistura dos componentes da primeira emulsão num homogeneizador. Por exemplo, como se mostra na Figura 1, podem ser combinados num recipiente de mistura (12) e, a seguir os componentes combinados podem ser introduzidos (13) num homogeneizador mecânico, tal como um homogeneizador rotor-estator (1).

Os homogeneizadores podem operar de maneira vertical e/ou horizontal. Para maior comodidade num ambiente comercial, são recomendados os homogeneizadores em linha.

Os componentes são introduzidos num homogeneizador rotor-estator e encontram-se com um rotor de rotação rápida que contém ranhuras ou buracos. Os componentes são lançados para fora por centrifugação à maneira de uma bomba e passam através das ranhuras/buracos. Em algumas formas de realização, o homogeneizador inclui múltiplas combinações de rotores e estatores, por exemplo, uma organização concêntrica de anéis de dentes de pente, como se mostra pelas caracteristicas (3) e (4); (5) e (6);e (7) e (8) na Figura 1 e na Figura 2. Os rotores nos homogeneizadores úteis a grande escala podem ter anéis de dentes de pente no extremo de um impulsor multi-lâmina de orientação horizontal (por exemplo, caracteristica (9) na figura 1) alinhados em próxima resistência para emparelhar os dentes num revestimento estático. A primeira emulsão é formada através de uma combinação de turbulência, cavitação e cisalhamento mecânico que ocorre dentro da brecha entre o rotor e o estator. Os componentes são introduzidos de maneira útil numa direção paralela ao eixo do rotor.

Um parâmetro de rendimento importante nos homogeneizadores de rotor-estator é a velocidade da ponta do rotor (velocidade periférica). Este parâmetro é uma função tanto da velocidade de rotação como do diâmetro do rotor. É útil uma velocidade periférica de pelo menos 10 ms-1, e de maneira ideal, uma velocidade superior, por exemplo > 20 ms-l,> 30 ms-l,> 40 ms-1, etc. Uma velocidade periférica de 40 ms-1 pode ser alcançada facilmente a 10.000 rpm com um homogeneizador pequeno ou a velocidades de rotação inferiores (por exemplo, 2.000 rpm) com um homogeneizador mais grande. Os homogeneizadores adequados de alta cisalha estão comercialmente disponíveis.

Para a fabricação a escala comercial, o homogeneizador deveria ter uma velocidade de fluxo de pelo menos 300 1/hr por exemplo,> 400 l/h,> 500 l/h,> 600 l/h,> 7001/ h,> 800 l/h,> 900 l/h,> 1000 l/h,> 2000 l/h,> 5000 1/hr, ou até> 10000 1/hr. Os homogeneizadores adequados de alta capacidade estão comercialmente disponíveis.

Um homogeneizador recomendado proporciona uma velocidade de cisalhamento de entre 3x105 e 1x106 s-1, por exemplo, entre 3x105 e 7x105 s-1, entre 4x105 e 6x105 s-1, por exemplo, aproximadamente 5x105 s-1.

Embora os homogeneizadores de rotor-estator geram relativamente pouco calor durante o funcionamento, o homogeneizador pode arrefecer durante o uso. De forma ideal, a temperatura da primeira emulsão mantém-se abaixo dos 60 °C durante a homogeneização, por exemplo, abaixo dos 45 °C.

Em algumas formas de realização, os componentes da primeira emulsão podem ser homogeneizados várias vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes). Para evitar a necessidade de uma longa cadeia de recipientes e homogeneizadores, os componentes da emulsão podem circular (por exemplo, como se mostra pela caracteristica (11) na Figura 1). Em particular, a primeira emulsão pode ser formada mediante a circulação dos componentes da primeira emulsão várias vezes através de um homogeneizador (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 etc. vezes) Contudo, a realização de muitos ciclos pode não ser recomendável já que pode produzir recoalescência como se descreve na referência 14. Desse modo, o tamanho das gotas de óleo pode ser monitorizado se a circulação do homogeneizador for utilizada para verificar que se alcança um tamanho de gota desejado e/ou que não se está a produzir recoalescência. A circulação através do homogeneizador é vantajosa porque pode reduzir o tamanho médio das gotas de óleo na primeira emulsão. A circulação é também vantajosa porque pode reduzir o número de gotas de óleo que têm um tamanho> 1,2 mm na primeira emulsão. Estas reduções no tamanho médio de gota e no número de gotas de> 1,2 mm na primeira emulsão podem proporcionar vantagens no processo a jusante (es). Em particular, a circulação dos componentes da emulsão primeiro através do homogeneizador pode levar a um processo de microfluidização melhorado que então pode resultar num número reduzido das gotas de óleo que têm a> 1,2 mm na segunda emulsão, isto é, depois da microfluidização. Esta melhoria nos parâmetros de emulsão segundo pode proporcionar um rendimento de filtração melhorada. Rendimento de filtração melhorada pode levar a perdas de conteúdo menos durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão óleo em água é MF5 9.

Dois tipos particulares de circulação são denominados aqui como "tipo I" e "tipo II". A circulação Tipo I é ilustrada na Figura 5, enquanto a circulação tipo II é ilustrada na Figura 6.

Uma circulação tipo I consiste na transferência dos componentes da emulsão entre um recipiente de mistura prévia e um homogeneizador. O recipiente de mistura prévia pode ser de 50 a 500 L de tamanho, por exemplo, de 100 a 400 L, de 100 a 300 L, de 200 a 300 L, de 250 L ou de 280 L. O recipiente de mistura prévia pode ser fabricado em aço inoxidável. A circulação de tipo I pode continuar durante 10 a 60 minutos, por exemplo 10 a 40 minutos ou 20 minutos. A circulação dos componentes da primeira emulsão inclui uma circulação de tipo II da transferência dos componentes da primeira emulsão desde um recipiente de primeira mistura prévia, através de um primeiro homogeneizador para um recipiente de segunda mistura prévia (que opcionalmente tem as mesmas propriedades que o recipiente de primeira mistura prévia), e depois através de um segundo homogeneizador. O segundo homogeneizador será geralmente o mesmo que o primeiro homogeneizador, mas em algumas disposições, os homogeneizadores primeiro e segundo são diferentes. Após a passagem dos componentes da primeira emulsão através do segundo homogeneizador, os componentes da emulsão primeira podem ser transferidos de novo para o recipiente de primeira mistura prévia, por exemplo se vai repetir-se o processo de circulação de tipo II. Assim, os componentes da emulsão podem viajar numa caminho de figura de oito entre os recipientes de primeira e segunda mistura prévia através de um único homogeneizador (ver a Figura 6) . A circulação de tipo II pode levar-se a cabo uma só vez ou várias vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 vezes, etc. A circulação de tipo II é vantajosa, em comparação com a circulação de tipo I, já que pode ajudar a assegurar que todos os componentes da primeira emulsão passem através do homogeneizador. 0 esvaziamento do recipiente de primeira mistura prévia significa que o conteúdo completo da emulsão passou através do homogeneizador, para o recipiente de segunda mistura prévia. Do mesmo modo, o conteúdo do recipiente de segunda mistura prévia pode ser esvaziado, de novo assegurando-se que tudo passa através do homogeneizador. Assim, a disposição de tipo II pode assegurar de forma conveniente que todos os componentes da emulsão se homogeneizam pelo menos duas vezes, que pode reduzir tanto o tamanho médio das gotas de óleo como o número de gotas de óleo que têm um tamanho de >1,2 mm na primeira emulsão. Desse modo, um tipo ideal de circulação tipo II implica esvaziar o recipiente de primeira mistura prévia e passar substancialmente todo o seu conteúdo através do homogeneizador para o recipiente de segunda mistura prévia, seguido pelo esvaziamento do recipiente de segunda mistura prévia e voltar a passar substancialmente todo o seu conteúdo através do homogeneizador de novo para o recipiente (vazio) de primeira mistura prévia. Assim, todas as partículas passam através do homogeneizador pelo menos duas vezes, que é difícil de conseguir a circulação de tipo I.

Em algumas formas de realização, é utilizada uma combinação de circulações de tipo I e de tipo II, e esta combinação pode proporcionar uma primeira emulsão com boas características. Em particular, esta combinação pode reduzir o número de gotas de óleo que têm um tamanho de > I, 2 mm na primeira emulsão. Esta combinação pode incluir qualquer ordem de circulação de tipo I e II, por exemplo, de tipo I seguido de tipo II, tipo II seguido de tipo I, tipo I seguido de tipo II seguido de tipo I de novo, etc. Numa forma de realização, a combinação inclui 20 minutos de circulação de tipo I seguida por uma só circulação de tipo II, isto é, a transferência dos componentes circulados da primeira emulsão desde um recipiente de primeira mistura prévia, através de um primeiro homogeneizador para um recipiente de segunda mistura prévia, e depois uma vez através de um segundo homogeneizador.

Os recipientes de mistura prévia primeira e segunda podem manter-se sob um gás inerte, por exemplo, nitrogénio, de até 0,5 bares. Isto pode evitar que os componentes da emulsão se oxidem, que é particularmente vantajoso se um dos componentes da emulsão for esqualeno. Isto pode proporcionar um aumento na estabilidade da emulsão.

Como se mencionou anteriormente, a entrada inicial para o homogeneizador pode ser uma mistura não homogénea dos componentes da primeira emulsão. Esta mistura pode ser preparada misturando os componentes individuais da primeira emulsão individualmente mas, em algumas formas de realização, vários componentes podem ser combinados antes desta mistura. Por exemplo, se a emulsão inclui um tensioativo com um EHL inferior a 10, então este tensioativo pode combinar-se com um óleo antes da mistura. De maneira similar, se a emulsão inclui um tensioativo com um EHL superior a 10, então este tensioativo pode combinar-se com um componente aquoso antes da mistura. Os sais do tampão podem ser combinados com um componente aquoso antes da mistura, ou podem adicionar ser adicionados separadamente.

Os métodos da invenção podem ser utilizados a grande escala. Desse modo, um método pode implicar a preparação de uma primeira emulsão, cujo volume é maior de 1 litro por exemplo, > 5 litros,> 10 litros, >20 litros,> 50 litros, >100 litros,> 250 litros, etc.

Depois da sua formação, a primeira emulsão pode ser microfluidizada, ou pode ser armazenada à espera de microfluidização.

Em algumas formas de realização, em particular aquelas em que se utilizam múltiplos ciclos das etapas (i) e (ii), a entrada para o homogeneizador será a saida de um microfluidizador, de tal maneira que a primeira emulsão se microfluidiza e depois se submete de novo a homogeneização.

Microfluidização

Depois da sua formação, a primeira emulsão pode ser microfluidizada para reduzir o seu tamanho médio de gota de óleo e/ou para reduzir o número de gotas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 mm.

Os instrumentos de microfluidização reduzem o tamanho médio das gotas de óleo mediante a propulsão de correntes de componentes de entrada através de canais geometricamente fixos a alta pressão e alta velocidade. A pressão à entrada da câmara de interação (também chamada "primeira pressão") pode ser substancialmente constante (isto é, ± 15%; por exemplo, ± 10%, ± 5%, ± 2%) durante pelo menos um 85% do tempo durante o qual os componentes são alimentados no microf luidizador, por exemplo, pelo menos um 87%, pelo menos um 90%, pelo menos um 95%, pelo menos um 99% ou 100% do tempo durante o qual se alimenta a emulsão no microfluidizador.

Numa forma de realização, a primeira pressão é de 1300 bares ± 15% (18 kPSI ± 15%) , isto é, entre 1100 e 1500 bares entre 15 kPSI e 21 kPSI) para um 85% do tempo durante o qual a emulsão se alimenta no microfluidizador. Dois perfis de pressão adequados são mostrados na Figura 3. Na Figura 3A a pressão é substancialmente constante durante pelo menos um 85% do tempo, enquanto na Figura 3B a pressão permanece de maneira continua e substancialmente constante.

Um aparelho de microfluidização inclui habitualmente pelo menos uma bomba intensificadora (preferivelmente duas bombas, que podem ser simultâneas) e uma câmara de interação. A bomba intensificadora, que de maneira ideal se impulsa de forma electro-hidráulica, proporciona alta pressão (isto é, a primeira pressão) para forçar uma emulsão em e através da câmara de interação. A natureza simultânea das bombas intensificadoras pode ser utilizada para proporcionar a pressão substancialmente constante da emulsão mencionada anteriormente, o que significa que as gotas da emulsão estão todas expostas substancialmente ao mesmo nivel de forças de cisalhamento durante a microfluidização.

Uma vantagem da utilização de uma pressão substancialmente constante é que pode reduzir as falhas por fadiga no dispositivo de microfluidização, que podem levar a uma maior vida útil do dispositivo. Uma vantagem adicional da utilização de uma pressão substancialmente constante é que os parâmetros da segunda emulsão podem ser melhorados. Em particular, o número de gotas de óleo com um tamanho de > 1.2 mm presentes na segunda emulsão pode ser reduzido. Além disso, o tamanho médio de gota de óleo da segunda emulsão pode ser reduzido quando se utiliza uma pressão substancialmente constante. A redução no tamanho médio de gota de óleo e no número de gotas de óleo com um tamanho> 1.2 mm na segunda emulsão pode proporcionar um rendimento melhorado de filtração. 0 rendimento de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão é MF59. A câmara de interação pode conter vários, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc., dos canais de geometria fixa à que passa a emulsão. A emulsão entra na câmara de interação através de uma linha de entrada que pode ter um diâmetro de entre 200 e 250 mm. A emulsão divide-se em correntes de medida quando entra na câmara de interação e, a alta pressão, acelera a alta velocidade. À medida que passa através dos canais, as forças produzidas pela alta pressão podem atuar para reduzir o tamanho das gotas de óleo da emulsão e reduzir a quantidade de gotas de óleo com um tamanho de 1,2 mm. Estas forças podem incluir: forças de cisalhamento, através da deformação da corrente de emulsão que se produzem pelo contacto com as paredes do canal; as forças de impacto, por meio de colisões que ocorrem quando as correntes de emulsão de alta velocidade chocam umas com outras, e as forças de cavitação, através de formação e colapso das cavidades dentro da corrente. A câmara de interação geralmente não inclui partes móveis. Pode incluir superficies de canais de cerâmica (alumina, por exemplo) ou diamante (diamante policristalino, por exemplo). Outras superfícies podem ser feitas de aço inoxidável. A geometria fixa da pluralidade de canais na câmara de interação pode ser geometria tipo "Y" ou geometria de tipo "Z" .

Numa câmara de interação de geometria de tipo Y, um fluxo único de entrada de emulsão divide-se em correntes de emulsão primeira e segunda, que depois se recombinam num fluxo de saída de emulsão única. Antes da recombinação, cada uma das correntes de emulsão primeira e segunda pode ser dividida de forma independente numa primeira e segunda pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) de subcorrentes. Quando as correntes de emulsão se recombinam, as correntes de emulsão primeira e segunda (ou as suas subcorrentes) fluem perfeitamente em direções substancialmente opostas (por exemplo, as correntes de emulsão primeira e segunda, ou as suas subcorrentes, fluem substancialmente no mesmo plano (± 20°) e a direção de fluxo da corrente da primeira emulsão é 180 ± 20° diferente da direção de fluxo da corrente da segunda emulsão). As forças produzidas quando as correntes de emulsão se recombinam podem atuar para reduzir o tamanho das gotas de óleo da emulsão e reduzir o número de gotas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 mm.

Numa câmara de interação de geometria de tipo Z a corrente de emulsão passa à volta de uma várias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) esquinas em ângulo substancialmente recto (isto é, 90 ± 20 °). A Figura 4 ilustra uma câmara de interação com geometria de tipo Z e duas esquinas em ângulo recto na direção do fluxo. Durante a sua passagem à volta das esquinas, uma corrente de emulsão de entrada pode dividir-se numa várias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) subcorrentes e então recombinam-se numa só sarda de corrente de emulsão (por exemplo, como se mostra na Figura 4, com quatro subcorrentes (32)). A divisão e depois a recombinação (31) podem suceder em qualquer ponto entre a entrada e a saida. As forças que são produzidas quando a emulsão contacta com as paredes do canal à medida que passa à volta das esquinas podem atuar para reduzir o tamanho da emulsão de gotas de óleo e reduzir o número de gotas de óleo que com um tamanho> 1,2 mm. Um exemplo de uma câmara de interação de tipo Z é a câmara de interação E230Z de Microfluidics.

Numa forma de realização, a corrente de emulsão passa à volta de duas esquinas em ângulo substancialmente recto. No ponto quando a corrente de emulsão de entrada passa à volta da primeira esquina em ângulo substancialmente recto, divide-se em cinco subcorrentes. No ponto em que as correntes passam à volta da segunda esquina substancialmente em ângulo recto, recombinam-se numa única corrente de emulsão de saida.

Na técnica anterior foi habitual o uso de câmaras de tipo Y de interação para emulsões de óleo em água, como as da presente invenção. Contudo, descobrimos que é vantajoso usar uma câmara de interação de geometria de canal de tipo Z para emulsões de óleo em água, porque isto pode levar a uma maior redução no número de gotas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 mm presentes na segunda emulsão em comparação com uma câmara de interação de geometria de tipo Y. A redução no número de gotas de óleo com um tamanho> 1,2 mm na segunda emulsão pode proporcionar um rendimento de filtração melhorado. 0 rendimento de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão é MF59.

Um aparelho de microfluidização recomendável opera a uma pressão de entre 170 e 2750 bares (aproximadamente de 2500 psi a 40000 psi), por exemplo aproximadamente a 345 bares, a uns 690 bares, aproximadamente a 1380 bares, a uns 2070 bares, etc.

Um aparelho de microfluidização recomendável funciona a uma velocidade de fluxo de até 20 1/min por exemplo, até 14 1/min, até 7 1/min, até 3,5 1/min, etc.

Um aparelho de microfluidização recomendável tem uma câmara de interação que proporciona uma velocidade de cisalhamento de mais de 1x106 s-1 por exemplo, > 2.5x106 s-l,> 5x106 s-1,> 107 s-1, etc.

Um aparelho de microfluidização pode incluir múltiplas câmaras de interação que são utilizadas em paralelo, por exemplo 2, 3, 4, 5 ou mais, mas é mais útil incluir uma câmara de interação única. O dispositivo de microfluidização pode incluir um módulo de processamento auxiliar (APM), que inclua pelo menos um canal. O APM contribui para a redução no tamanho médio das gotas de óleo na emulsão que passa através do dispositivo de microfluidização, embora a maioria da redução se produza na câmara de interação. Como se mencionou anteriormente, os componentes da emulsão são introduzidos na câmara de interação pela bomba intensificadora sob uma primeira pressão. Os componentes da emulsão geralmente saem do APM a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão (pressão atmosférica, por exemplo). Em geral, entre um 80 e um 95% de diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressão através da câmara de interação (por exemplo, de PI a P4 na Figura 4) e de 5 a 20% de diferença de pressão entre a primeira e a segunda queda de pressão através do módulo de processamento auxiliar, por exemplo, a câmara de interação pode proporcionar aproximadamente 90% da queda de pressão enquanto o APM pode proporcionar aproximadamente 10% da queda de pressão. Se a pressão que cai através da câmara de interação e a a que cai através do módulo de processamento auxiliar não têm em conta a totalidade da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressão, isto pode ser devido a uma queda de pressão finita através dos conectores entre a câmara de interação e o módulo de processamento auxiliar. O APM geralmente não inclui partes móveis. Pode incluir superfícies dos canais de cerâmica (alumina, por exemplo) ou de diamante (diamante policristalino, por exemplo). Outras superfícies podem ser feitas de aço inoxidável. O APM é colocado geralmente a jusante em relação à câmara de interação e também pode ser colocado de forma sequencial à câmara de interação. Na técnica anterior, as medidas de proteção correspondentes são colocadas geralmente a jusante das câmaras de interação que inclui canais de tipo Y para suprimir a cavitação e portanto aumentar a velocidade de fluxo na câmara de tipo Y até num 30%. Além disso, na técnica prévia os APM geralmente situam-se a montante das câmaras de interação que incluem canais de tipo Z para reduzir o tamanho dos grandes aglomerados. Neste último caso, o APM só diminui a velocidade de fluxo nas câmaras de tipo Z até num 3%. Contudo, encontrou-se que a colocação dos APM jusantes de uma câmara de interação que inclui vários canais de tipo Z é vantajoso na presente invenção, já que pode levar a uma maior redução no tamanho médio das gotas de óleo e uma maior redução no número de gotas de óleo com um tamanho de > 1,2 mm presentes na segunda emulsão. Como se discutiu anteriormente, a redução no número de gotas de óleo com um tamanho> 1,2 mm na segunda emulsão pode proporcionar um rendimento melhorado de filtração. 0 rendimento de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão de óleo em água é MF59. Uma vantagem adicional deste posicionamento de uma câmara de interação de tipo Z e um APM a jusante é que pode levar a uma diminuição mais lenta da pressão depois da câmara de interação. A diminuição mais lenta da pressão pode levar a um aumento na estabilidade do produto, porque há menos gás encerrado na emulsão.

Um APM contém pelo menos um canal de geometria fixa a que passa a emulsão. O APM pode conter vários, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc, canais de geometria fixa a que passa a emulsão. O canal ou canais do APM pode ser linear ou não linear. Os canais não lineares adequados são de geometria tipo "Z" o "Y", que são os mesmos que os descritos anteriormente para a câmara de interação. Numa forma de realização, o canal, ou canais, do APM são de geometria tipo Z. Vários canais de tipo Z dividem a emulsão em correntes à medida que entram no APM.

Em contraste com as recomendações do fabricante, o uso de um APM que inclua vários canais de geometria fixa é recomendável em comparação com um único canal APM de geometria fixa, já que pode levar a uma maior redução no número de gotas de óleo com um tamanho de> 1,2 mm presentes na segunda emulsão. Como se discutiu anteriormente, a redução no número de gotas de óleo com um tamanho de> 1,2 mm na segunda emulsão pode proporcionar um rendimento melhorado de filtração. 0 rendimento de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão óleo em água é MF59.

Um aparelho de microfluidização gera calor durante o funcionamento, o que pode elevar a temperatura de uma emulsão em 15-20 °C em relação à primeira emulsão. De maneira vantajosa, portanto, a emulsão microfluidifiçada arrefece assim que for possível. A temperatura da segunda emulsão pode manter-se abaixo de 60 0 C, por exemplo, abaixo de 45 °C. Assim saída de uma câmara de interação e / ou uma saída de APM pode alimentar um mecanismo de arrefecimento, tal como um permutador de calor ou serpentina de refrigeração. A distância entre a saída e o mecanismo de arrefecimento deve manter-se o mais curta possível para encurtar o tempo global mediante a redução dos atrasos de refrigeração. Numa forma de realização, a distância entre a saída do microfluidizador e o mecanismo de arrefecimento é de entre 20-30cm. Um mecanismo de refrigeração é particularmente útil quando uma emulsão se submete a múltiplas etapas de microfluidização, para prevenir o sobreaquecimento da emulsão. O resultado da microfluidização é uma emulsão de óleo em água, a segunda emulsão, em que tamanho médio das gotas de óleo és 500 nm ou menos. Este tamanho médio é particularmente útil já que facilita a esterilização em filtro da emulsão. As emulsões em que pelo menos 80% em número das gotas de óleo têm um tamanho médio de 500 nm ou menos, por exemplo, 400 nm ou menos, 300 nm ou menos, 200 nm ou menos ou 165 nm ou menos, são particularmente úteis. Além disso, o número de gotas de óleo na segunda emulsão com um tamanho de > 1,2 mm é 5 x 1010/ml ou menos, por exemplo 5 x 109/ml ou menos, 5 x 108/ml ou menos, ou 2 x 108/ml ou menos. A entrada inicial para a microfluidização pode ser a primeira emulsão. Em algumas formas de realização, contudo, a emulsão microfluidizada submete-se de novo a microfluidização, de tal maneira que sucedem múltiplas voltas de microfluidização. De maneira particular, a segunda emulsão pode formar-se mediante a circulação dos componentes da segunda emulsão através de um dispositivo de microfluidização várias vezes, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes, etc. A segunda emulsão pode ser formada mediante a circulação dos componentes da emulsão através de um segundo dispositivo de microfluidização de 4 a 7 vezes. A circulação dos componentes da segunda emulsão pode incluir uma circulação tipo I de transferência dos componentes da segunda emulsão desde um recipiente da primeira emulsão (que opcionalmente tem as mesmas propriedades que o recipiente de primeira mistura prévia) e o dispositivo de microfluidização. A circulação dos componentes da segunda emulsão pode incluir uma circulação de tipo II de transferência dos componentes da segunda emulsão desde um recipiente da primeira emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização para um recipiente da segunda emulsão (que opcionalmente tem as mesmas propriedades que o recipiente de primeira mistura prévia), e depois através de um segundo dispositivo de microfluidização. 0 segundo dispositivo de microfluidização pode ser o mesmo que o primeiro dispositivo de microfluidização. Alternativamente, o segundo dispositivo de microfluidização pode ser diferente que o primeiro dispositivo de microfluidização. 0 recipiente da primeira emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da primeira mistura prévia. Alternativamente, o recipiente da primeira emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da segunda mistura prévia. 0 recipiente da segunda emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da primeira mistura prévia. Alternativamente, o recipiente da segunda emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da segunda mistura prévia. 0 recipiente da primeira emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da primeira mistura prévia e o recipiente da segunda emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da segunda mistura prévia. Alternativamente, o recipiente da primeira emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da segunda mistura prévia já que o recipiente da segunda emulsão pode ser o mesmo que o recipiente da primeira mistura prévia.

Como alternativa, os recipientes da emulsão primeira e segunda podem ser diferentes dos recipientes da primeira e segunda mistura prévia.

Após a passagem dos componentes da segunda emulsão através do segundo dispositivo de microfluidização, os componentes da segunda emulsão podem ser transferidos de novo para o recipiente da primeira emulsão, por exemplo se o processo de circulação de tipo II vier a repetir-se. A circulação de tipo II pode ser levada a cabo uma só vez ou várias vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 vezes, etc. A circulação de tipo II é vantajosa já que assegura que todos os componentes da segunda emulsão passaram pelo dispositivo de microfluidização pelo menos 2 vezes, o que reduz o tamanho médio das gotas de óleo e o número de gotas de óleo com um tamanho de> 1,2 mm na segunda emulsão.

Uma combinação de circulação de tipo I e circulação de tipo II pode ser usada durante a microfluidização. Esta combinação pode incluir qualquer ordem de circulação de tipo I e II, por exemplo, de tipo I seguido de tipo II, de tipo II seguido de tipo I, de tipo I seguido de tipo II seguido de tipo I de novo, etc

Os recipientes de emulsão primeira e segunda podem manter-se sob um gás inerte, por exemplo, nitrogénio, de até 0,5 bares. Isto pode evitar que os componentes da emulsão se oxidem, que é particularmente vantajoso se um dos componentes da emulsão for esqualeno. Isto pode proporcionar um aumento na estabilidade da emulsão.

Os métodos da invenção podem ser utilizados a grande escala. Assim, um método pode implicar a microfluidização a um volume superior a 1 litro por exemplo, > 5 litros,> 10 litros, >20 litros,> 50 litros, >100 litros,> 250 litros, etc.

Filtração

Depois da microfluidização, a segunda emulsão pode ser filtrada. Esta filtração elimina as gotas de óleo de grande tamanho que sobreviveram aos procedimentos de homogeneização e microfluidização. Embora pequenas em termos de número, estas gotas de óleo podem ser grandes em termos de volume e podem atuar como sítios de nucleação para a agregação, o que leva à degradação da emulsão durante o armazenamento. Além disso, esta etapa de filtração pode ser conseguida a esterilização de filtro. A membrana de filtração especialmente adequada para a esterilização de filtro depende das características do fluido da segunda emulsão e do grau de filtração requerido. As características de um filtro podem afectar a sua idoneidade para a filtração da emulsão microfluidifiçada. Por exemplo, as suas caracterí sticas de tamanho de poro e superfície podem ser importantes, especialmente quando se filtra uma emulsão baseada em esqualeno. 0 tamanho de poro das membranas utilizadas com a invenção deve permitir a passagem das gotas desejadas mantendo ao mesmo tempo as gotas não desejadas. Por exemplo, devem ser conservadas as gotas que têm um tamanho de> 1 mm, enquanto se permitir a passagem das gotas de <200 nm. Um filtro de 0,2 mm ou 0,22 mm é ideal, e também pode conseguir a esterilização de filtro. A emulsão pode ser pré-filtrada por exemplo através de um filtro de 0,45 mm. A pré-filtração e filtração podem ser conseguidas numa só etapa mediante o uso de filtros conhecidos de dupla camada que incluam uma primeira camada de membrana com poros maiores e uma segunda camada de membrana com poros mais pequenos. Os filtros de dupla camada são particularmente úteis com a invenção. A primeira camada tem, de maneira ideal, um tamanho de poro de > 0,3 mm, como por exemplo entre 0,3 e 2mm, entre 0.3 e 1 mm, ou entre 0,4 e 0.8mm, ou entre 0,5 e 0.7mm. Um tamanho de poro de <0,75 mm na primeira camada é recomendável. Assim, a primeira camada pode ter um tamanho de poro de 0,6 mm ou 0,45 mm, por exemplo. A segunda camada tem, de maneira ideal, um tamanho de poro que menor de um 75% (e, preferivelmente, menos da metade de) que o tamanho de poro da primeira camada, por exemplo, entre um 25 e um 70% ou entre um 25 e um 49% do tamanho de poro da primeira camada, por exemplo entre um 30 e um 45%, como por exemplo 1/3 ou 4/9, do tamanho de poro da primeira camada. Assim, a segunda camada pode ter um tamanho de poro de <0,3 mm, como por exemplo entre 0.15 e 0.28mm ou entre 0.18 e 0.24mm por exemplo, 0,2 mm ou 0,22 mm. Num exemplo, a primeira camada de membrana com poros de maior tamanho proporciona um filtro de 0,45 mm, enquanto a segunda camada de membrana com poros mais pequenos proporciona um filtro de 0,22 mm. A membrana de filtração e/ou a membrana de pré-filtração podem ser assimétricas. Uma membrana assimétrica aquela em que o tamanho de poro varia de um lado da membrana para o outro por exemplo em que o tamanho de poro é maior na face de entrada que na face de saída. Um lado da membrana assimétrica pode denominar-se como "superfície de poro grosso", enquanto o outro lado da membrana assimétrica pode denominar-se como "superfície de poro fino". Num filtro de dupla camada, uma ou (de maneira ideal) ambas camadas podem ser assimétricas. A membrana de filtração pode ser porosa ou homogénea. Uma membrana homogénea é geralmente uma película densa que vai desde 10 até 200 mm. Uma membrana porosa tem uma estrutura porosa. Numa forma de realização, a membrana de filtração é porosa. Num filtro de dupla camada, ambas camadas podem ser porosa, ambas camadas podem ser homogéneas, ou pode ter uma camada porosa e uma camada homogénea. Um filtro recomendável de dupla camada é aquele em que ambas camadas são porosas.

Numa forma de realização, a segunda emulsão filtra-se previamente através de uma membrana assimétrica, porosa e hidrófila e depois filtra-se através de outra membrana assimétrica porosa e hidrófila que tem poros mais pequenos que a membrana de pré-filtração. Isto pode utilizar um filtro de dupla camada. 0 filtro de membrana pode ser esterilizado em autoclave antes do seu uso para assegurar-se de que é estéril.

As membranas de filtração são feitas tipicamente de materiais de suporte poliméricos tais como PTFE (poli-tetrafluoretileno), PES (polietersulfona), PVP (polivinilpirrolidona), PVDF (fluoreto de polivinilideno), nylons (poliamidas), PP (polipropileno), celuloses (incluindo ésteres de celulose), PEEK (poliéter-éter), nitrocelulose, etc Estes têm diferentes caracteristicas, com alguns suportes intrinsecamente hidrófobos (por exemplo PTFE) e outros que são intrinsecamente hidrófilos (por exemplo, acetatos de celulose). Contudo, estas caracteristicas intrínsecas podem ser modificadas por tratamento da superfície da membrana. Por exemplo, é conhecida a preparação de membranas hidrofilizadas ou hidrofobizados tratados com outros materiais (tais como outros polímeros, grafite, silicone, etc) para revestir a superfície da membrana, por exemplo, ver a secção 2.1 da referência 15. Num filtro de dupla camada as duas membranas podem ser feitas de diferentes materiais ou (de maneira ideal) do mesmo material.

Um filtro ideal para uso com a invenção tem uma superfície hidrófila, em contraste com o ensino das referências 9-12 que sustém que se devem utilizar filtros hidrófobos (polissulfona). Os filtros com superfícies hidrófilas podem ser formados a partir de materiais hidrófilos, ou por hidrofilização de materiais hidrófobos, e um filtro preferido para uso com a invenção é uma membrana hidrofílica de polietersulfona. Vários métodos diferentes são conhecidos para transformar as membranas hidrofóbicas PES em membranas hidrófilas PES. Frequentemente consegue-se por revestimento da membrana com um polímero hidrófilo. Para proporcionar a fixação permanente do polimero hidrófilo à PES, uma camada de revestimento hidrófilo submete-se, geralmente, a uma reação de reticulação ou de enxerto. A referência 15 descreve um procedimento para a modificação das propriedades superficiais de um polímero hidrófobo que tem extremos de cadeia funcionalizáveis, incluindo o contacto do polímero com uma solução de um resto de ligação para formar uma ligação covalente, e logo o contacto do polímero hidrófobo levado a reação com uma solução de um agente de modificação. A referência 16 descreve um método de hidrofilização de membrana PES por revestimento directo de membrana, que implica a humectação prévia com álcool, seguida de imersão numa solução aquosa que contém um monómero hidrófilo, um monómero polifuncional (reticulante) e um iniciador de polimerização. 0 monómero e o reticulante e são polimerizados então utilizando a polimerização térmica ou iniciada por UV para formar um revestimento de polímero reticulado hidrófilo sobre a superfície da membrana. Do mesmo modo, as referências 17 e 18 descrevem um revestimento de membrana PES por imersão numa solução aquosa de polimero hidrofilico (óxido de polialquileno) e pelo menos um monómero polifuncional (reticulante) e, a sequir, a polimerização de um monómero para proporcionar um revestimento hidrófilo não extraivel. A referência 19 descreve a hidrofilização de membrana PES por uma reacção de enxerto em que uma membrana PES se submete tratamento de plasma de hélio a baixa temperatura seguido por enxerto de monómero hidrófilo N-vinil-2-pirrollidona (NVP) sobre a superfície da membrana. Tais processos adicionais são descritos nas referências 20 a 26.

Nos métodos que não dependem do revestimento, a PES pode dissolver-se num dissolvente, misturada com um aditivo hidrófilo solúvel, e depois a solução misturada é utilizada para moldar uma membrana hidrófila, por exemplo, por precipitação ou mediante o início da co-polimerização. Ditos métodos são descritos nas referências 27 a 33. Por exemplo, a referência 33 descreve um método de preparação de uma membrana hidrofílica de carga modificada que tem extraíveis de baixa membrana e permite a recuperação rápida de resistividade de água ultrapura, que tem uma estrutura de rede de polímero reticulado e interpenetrantes formada por realização de uma solução de polímero com uma mistura de PES, PVP, polietilenimina, e éter diglicidil alifático, formando uma película fina da solução, e precipitando-a a película como uma membrana. Um processo similar é descrito na referência 34.

As abordagens híbridas podem ser utilizadas, em que os aditivos hidrófilos estão presentes durante a formação da membrana e também se adicionam mais tarde como revestimento, por exemplo, ver a referência 35. A hidrofilização de membrana PES também pode ser conseguida por tratamento com plasmas de baixa temperatura. A referência 36 descreve a modificação hidrófila de membrana PES pelo tratamento de plasma C02 com baixas temperaturas. A hidrofilização de membrana PES também pode ser conseguida por oxidação, como se descreve na referência 37. Este método implica a humectação prévia de uma membrana PES hidrófoba num liquido que tem uma tensão superficial baixa, expondo a membrana PES húmida a uma solução aquosa de oxidante e, aquecendo-a a seguir. A inversão de fases também pode ser utilizada, tal como se descreve na referência 38.

Uma membrana PES hidrófila ideal pode ser conseguida por tratamento de PES (hidrófobo) com PVP (hidrófilo). 0 tratamento com PEG (hidrófilo) em vez de PVP foi descoberto para dar uma membrana hidrofilizada PES que se contamina facilmente (especialmente quando se utiliza uma emulsão de esqualeno) e também liberta formaldeido de maneira pouco recomendável, durante o tratamento em autoclave.

Um filtro de dupla camada preferido tem uma primeira membrana hidrófila PES e uma segunda membrana hidrófila PES.

As membranas hidrófilas conhecidas incluem Bioassure (de Cuno); EverLUX ™ polietersulfona; Stelux ™ polietersulfona (ambos de Meissner); membranas Millex GV, Millex HP, Millipak 60, Millipak 200 e Durapore CVGL01TP3 (de Millipore); Membrana Fluorodene EX™ EDF, Supor ™ EAV; Supor ™ EBV, Supor ™ EKV (todas de Pall); Sartopore ™ (de

Sartorius); membrana PES hidrofílica de Sterlitech e membrana PES WFPES de Wolftechnik.

Durante a filtração, a emulsão pode manter-se a uma temperatura de 40 °C ou menos, por exemplo 30 °C ou menos, para facilitar o êxito da filtração estéril. Algumas emulsões não podem passar através de um filtro estéril quando estão a uma temperatura superior a 40 °C. É vantajoso levar a cabo a etapa de filtração dentro de um período de 24 horas, por exemplo dentro de um período de 18 horas, de 12 horas, de 6 horas, de 2 horas, de 30 minutos, para produzir a segunda emulsão porque depois deste tempo pode que não seja possível fazer passar a emulsão através do segundo filtro estéril sem que o filtro se obstrua, como se menciona na referência 39.

Os métodos da invenção podem ser utilizados a grande escala. Assim, um método pode implicar a filtração de um volume superior a 1 litro por exemplo, > 5 litros,> 10 litros, 20 litros>,> 50 litros, 100 litros>,> 250 litros, etc. A emulsão final O resultado da microfluidização e da filtração é uma emulsão de óleo em água em que o tamanho médio das gotas de óleo pode ser menor que 220 nm, por exemplo, 155 ± 20 nm, 155 ± 10 nm ou 155 ± 5 nm, e em que o número de gotas de óleo que têm um tamanho > 1,2 mm pode ser de 5 x 108/ml ou menos, por exemplo 5 x 107/ml ou menos, 5 x 106/ml ou menos, 2 x 106/ml ou menos, ou 5 x 105 / ml ou menos. 0 tamanho médio de gota de óleo das emulsões descritas neste documento (incluindo as emulsões primeira e segunda) é geralmente de não menos de 50 nm.

Os métodos da invenção podem ser utilizados a grande escala. Assim, um método pode implicar a preparação de uma emulsão final com um volume superior a 1 litro por exemplo, > 5 litros,> 10 litros, >20 litros,> 50 litros, >100 litros,> 250 litros, etc

Uma vez que a emulsão de óleo em água foi formada, pode transferir-se para garrafas de vidro estéreis. As garrafas de vidro podem ser de 5 1, 8 1, ou 10 1. Alternativamente, o óleo em água pode transferir-se para uma bolsa estéril flexivel (bolsa flexivel). A bolsa flexivel pode ser de 50 1, 100 1 ou 250 1. Além disso, a bolsa flexivel pode estar provida de um ou mais conectores estéreis para conectar a bolsa flexivel ao sistema. O uso de uma bolsa flexivel com conectores estéreis é vantajoso em comparação com as garrafas de vidro já que a bolsa flexivel é maior que as garrafas de vidro o que significa que pode que não seja necessário alterar a bolsa flexivel para armazenar toda a emulsão fabricada num só lote. Isto pode proporcionar um sistema estéril fechado para a fabricação da emulsão que pode reduzir a possibilidade de impurezas que presentes na emulsão final. Isto pode ser particularmente importante se a emulsão final é utilizada para fins farmacêuticos, por exemplo, se a emulsão final é o adjuvante MF59.

As quantidades preferidas de óleo (% em volume) na emulsão final são de entre 2 e 20%, por exemplo aproximadamente 10%. Um conteúdo em esqualeno de aproximadamente 5% ou aproximadamente 10% é particularmente útil. Um conteúdo em esqualeno (w/v) de entre 30-50mg/ml é útil, por exemplo, entre 35-45mg/ml, 36-42mg/ml, 38-40mg/ml, etc.

As quantidades preferidas de tensioativos (% em peso) na emulsão final são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como Tween 80) 0,02 a 2%, em particular, aproximadamente 0,5% ou aproximadamente 1%; ésteres de sorbitano (tais como Span 85) 0,02 a 2%, em particular aproximadamente 0,5% ou aproximadamente 1%; polioxietanóis octil- ou nonilfenoxi (tais como Triton X-100) 0,001 a 0,1%, em particular, 0.005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (tais como laureth 9) 0,1 a 20%, preferivelmente de 0,1% a 10 e em particular de 0,1 a 1% ou aproximadamente 0,5%. Um conteúdo de polissorbato 80 (w / v) de entre 4-6mg/ml é útil por exemplo, entre 4.1- 5.3mg/ml. Um conteúdo de trioleato de sorbitano (w/v) de entre 4-6mg/ml é útil por exemplo, entre 4.1-5.3mg/ml. O processo é particularmente útil para preparar qualquer das seguintes emulsões de óleo em água: • Uma emulsão que inclui esqualeno, polissorbato 80 (Tween 80), e trioleato de sorbitano (Span 85). A composição da emulsão por volume pode ser de aproximadamente 5% de esqualeno, aproximadamente 0,5% de polissorbato 80 e aproximadamente 0,5% de trioleato de sorbitano. Em termos de peso, estas quantidades convertem-se em 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% trioleato de sorbitano. Este adjuvante é conhecido como 'MF59'. A emulsão MF59 inclui vantajosamente por exemplo, iões de citrato, por exemplo 10 mM de tampão de citrato de sódio. • Emulsões que contêm esqualeno, um a-tocoferol (idealmente DL-a-tocoferol) e polissorbato 80. Estas emulsões podem ter (em peso) 2-10% de esqualeno, 2-10% de a-tocoferol e 0,3 a 3% de polissorbato 80 por exemplo, 4,3% de esqualeno, 4,7% dea-tocoferol, e 1,9% de polissorbato 80. A relação em peso de esqualeno: tocoferol é preferivelmente <1 (por exemplo, 0,90) já que isto proporciona uma emulsão mais estável. O esqualeno e polissorbato 80 podem estar presentes numa relação de volume de à volta de 5:2, ou numa relação em peso de aproximadamente 11:5. Uma emulsão tal pode ser feita por dissolução de polissorbato 80 em PBS para dar uma solução a 2%, misturando depois 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-a-tocoferol e 5 ml de esqualeno), e microfluidizando a mistura a seguir. A emulsão resultante pode ter gotas submicrónicas de óleo, por exemplo, com um tamanho entre 100 e 250 nm, preferivelmente de aproximadamente 180 nm. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo Triton X-100). A emulsão também pode incluir um monofosforil lipido A 3-0-desacilado ('3 D-MPL '). A emulsão pode conter um tampão fosfato.

• Uma emulsão que inclua esqualeno, um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de a-tocoferol). A emulsão pode incluir estes três componentes numa relação de massa de aproximadamente 75:11:10 (por exemplo 750mg/ml de polissorbato 80, HOmg/ml de Triton X-100 e lOOmd/ml de succinato de a-tocoferol) e estas concentrações deverão incluir qualquer contribuição destes componentes de antigénios. A emulsão pode também incluir um 3d-MPL. A emulsão pode também incluir uma saponina, tal como QS21. A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão que inclui esqualeno, um dissolvente aquoso, um polioxietileno alquil éter agente tensioativo hidrófilo não iónico (por exemplo, polioxietileno (12) cetoestearil éter) e um tensioativo não iónico hidrófobo (por exemplo, um éster de sorbitano ou éster de manida, tal como monooleato de sorbitano ou "Span 80"). A emulsão é preferivelmente termo-reversivel e/ou tem pelo menos 90% das gotas de óleo (em volume) com um tamanho inferior a 200 nm [40]. A emulsão também pode incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotector (por exemplo, um açúcar, tal como dodecil maltosideo e/ou sacarose), e/ou um alquilpoliglicosideo. Também pode incluir um agonista de TLR4, como um cuja estrutura quimica não inclua um anel de açúcar [41]. Ditas emulsões podem ser liofilizadas.

As composições destas emulsões, expressas anteriormente em termos de percentagem, podem ser modificadas por diluição ou concentração (por exemplo por um número inteiro, como 2 ou 3 ou por uma fracção, tal como 2/3 ou 3/4), em que os seus coeficientes não mudam. Por exemplo, um MF59 concentrado 2 vezes teria aproximadamente um 10% de esqualeno, aproximadamente um 1% de polissorbato 80 e aproximadamente um 1% de trioleato de sorbitano. As formas concentradas podem diluir-se (por exemplo, com uma solução de antigénio) para dar uma concentração final desejada da emulsão. As emulsões da invenção são armazenadas de maneira ideal a entre 2 °C e 8 °C. Não deve congelar-se. O ideal é mantê-las afastadas de uma fonte de luz direta. Em particular, as emulsões e vacinas da invenção que contêm esqualeno devem ser protegidas para evitar a descomposição fotoquímica do esqualeno. Se as emulsões da invenção são armazenadas, então se fará preferivelmente numa atmosfera inerte, por exemplo, N2 ou árgon.

Vacinas

Embora seja possível administrar adjuvantes em emulsão de óleo em água aos pacientes (por exemplo, para proporcionar um efeito adjuvante para um antigénio que se administrou separadamente ao paciente), É mais habitual misturar o adjuvante com um antigénio antes da administração para formar uma composição imunogénica, por exemplo, uma vacina. A mistura de emulsão e um antigénio pode ter lugar extemporaneamente, no momento de uso, ou pode ter lugar durante a fabricação da vacina, antes do enchimento. Os métodos da invenção podem ser aplicados em ambas situações.

Assim pois, um método da invenção pode incluir ainda uma etapa de processo da mistura da emulsão com um componente antigénico. Como alternativa, pode incluir ainda uma etapa de embalamento do adjuvante num kit como componente do kit junto com um componente antigénico.

Em geral, portanto, a invenção pode ser utilizada na preparação de vacinas mistas ou quando se preparam kits que incluem antigénio e adjuvante preparados para misturar-se. Quando a mistura tem lugar durante a fabricação, os volumes de antigénio a granel e a emulsão que se misturam será habitualmente maior que 1 litro por exemplo, > 5 litros,> 10 litros, >20 litros,> 50 litros, >100 litros, > 250 litros, etc. onde a mistura tem lugar no ponto de uso a seguir, os volumes que se misturam normalmente serão menores que 1 mililitro por exemplo, <0,6 ml, <0,5 ml, <0,4 ml, <0,3 ml, <0,2 ml, etc. Em ambos casos, é habitual que os volumes substancialmente iguais da emulsão e a solução de antigénio para se misturarem, isto é, substancialmente 1:1 (por exemplo, entre 1,1: 1 e 1:1,1, preferivelmente entre 1,05:1 e 1:1,05, e mais preferivelmente entre 1,025:1 e 1:1,025). Em algumas formas de realização, contudo, pode ser usado um excesso de emulsão ou um excesso de antigénio [42]. Quando se utiliza um volume em excesso de um componente, o excesso será geralmente de pelo menos 1,5:1 por exemplo, >2:1,> 2,5:1,> 3:1,> 4:1,> 5:1, etc.

Quando antigénio e adjuvante são apresentados como componentes separados dentro de um kit, estão fisicamente separados entre si dentro do kit e esta separação pode ser conseguida de várias maneiras. Por exemplo, os componentes podem estar em recipientes separados, tais como frascos. Os conteúdos de dois frascos podem ser misturados quando for necessário, por exemplo, mediante a eliminação dos conteúdos de um frasco e a adição deles a outro frasco, ou separadamente eliminando os conteúdos de ambos frascos e misturando-os num terceiro recipiente.

Em outra disposição, um dos componentes do kit está numa seringa e o outro está num recipiente tal como um frasco. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir o seu conteúdo no frasco a misturar, e a mistura pode ser retirada com a seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem ser administrados a um paciente, normalmente através de uma nova agulha estéril. O embalamento de um componente numa seringa elimina a necessidade de usar uma seringa separada para a administração ao paciente.

Em outra disposição preferida, os dois componentes do kit mantêm-se juntos mas separadamente na mesma seringa, por tais como as exemplo, uma seringa de dupla câmara, descritas nas referências 43-50 etc. Quando a seringa se aciona (por exemplo, durante a administração a um paciente), então o conteúdo das duas câmaras mistura-se. Esta disposição evita a necessidade de uma etapa separada de mistura no momento de uso. O conteúdo dos diversos componentes do geralmente estará em forma liquida. Em algumas disposições, um componente (normalmente o componente antigénio em vez do componente de emulsão) está em forma seca (por exemplo, numa forma liofilizada), estando o outro componente em forma liquida. Os dois componentes podem ser misturados para reactivar o componente seco e proporcionar uma composição liquida para a administração a um paciente. Um componente liofilizado encontra-se habitualmente dentro de um frasco em vez de uma seringa. Os componentes secos podem incluir estabilizantes tais como lactose, sacarose ou manitol, assim como misturas dos mesmos, por exemplo misturas dactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Uma possivel disposição usa uma emulsão de componente líquido numa seringa pré-carregada e um componente antigénio liofilizado num frasco.

Se as vacinas contêm componentes adicionais à emulsão e ao antigénio, então estes componentes adicionais podem incluir-se num destes dois componentes do kit, ou podem ser parte de um terceiro componente do kit.

Os recipientes adequados para vacinas mistas da invenção, ou para os componentes individuais do kit, incluem frascos e seringas descartáveis. Estes recipientes devem ser estéreis.

Quando uma composição/componente se encontra num frasco, o frasco é feito preferivelmente de um vidro ou de um material plástico. 0 frasco esteriliza-se preferivelmente antes de a composição ser adicionada ao mesmo. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são selados preferivelmente com uma tampa sem látex, e recomenda-se a ausência de látex em todo material de embalamento. Numa forma de realização, um frasco tem uma tampa de borracha de butilo. 0 frasco pode incluir uma dose única de vacina/componente, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco "multidose") , por exemplo de 10 dose. Numa forma de realização, um frasco inclui 10 x 0,25 ml doses de emulsão. Os frascos recomendáveis são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um fecho Lor) adaptado de tal maneira que uma seringa pré-carregada possa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa possa ser expulso no frasco (por exemplo, para reconstituir o material liofilizado no mesmo), e o conteúdo do frasco possa ser retirado de novo na seringa. Depois de retirar a seringa do frasco, uma agulha pode então ligar-se e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa está situada preferivelmente no interior de um selo ou cobertura, de tal maneira que o selo ou cobertura tem que eliminar-se antes que se possa aceder à tampa.

Quando uma composição/componente é embalada numa seringa, a seringa não terá normalmente uma agulha unida a ela, embora se possa administrar uma agulha separada com a seringa para a montagem e o uso. São recomendadas as agulhas de segurança. As agulhas típicas são as de 1 polegada de calibre 23, as de 1 polegada de calibre 25 e as de 5/8 polegadas de calibre 25. As seringas podem estar providas de etiquetas descoláveis em que se pode imprimir o número de lote, a estação de gripe e a data de validade dos conteúdos impressos, para facilitar a manutenção de registos. 0 êmbolo da seringa tem preferivelmente uma tampa para evitar que ele seja retirado acidentalmente durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ou êmbolo de látex de borracha. As seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa terá geralmente uma tampa na ponta para selar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa da ponta é feita preferivelmente de uma borracha de butilo. Se a seringa e a agulha são embaladas separadamente, então a agulha estará preferentemente provida de um escudo de borracha de butilo. A emulsão pode ser diluida com um tampão antes do seu embalamento num frasco ou numa seringa. Os tampões típicos incluem um tampão fosfato, um tampão Tris, um tampão borato, um tampão succinato; um tampão de histidina, ou um tampão de citrato. A diluição pode reduzir a concentração de componentes do adjuvante, conservando o seu exemplo proporções relativas para proporcionar um adjuvante "meio-forte" .

Os recipientes podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a administração às crianças. Por exemplo, uma seringa que contém uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostre um volume de 0,25 ml.

Quando um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é utilizado, a seguir, prefere-se usar um recipiente feito de um vidro de boro-silicato em vez de um vidro de cal sodada.

Podem ser utilizados antigénios com emulsões de óleo em água, incluindo mas sem limitar-se a: antigénios virais, tais como proteínas da superfície virai; antigénios bacterianos, tais como proteínas e/ou antigénios sacáridos; antigénios fúngicos; antigénios de parasitas; e antigénios tumorais. A invenção é particularmente útil para vacinas contra o virus da gripe, el VIH, a ancilostomíase virus da hepatite B, virus do herpes simples, a raiva, o virus sincitial respiratório, o citomegalovírus, Staphelococcus aureus, clamidia, coronavirus SARS, virus de varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mecobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr, virus do papiloma humano, etc. Por exemplo: • Antigénios do vírus influenza. Estes podem tomar a forma de um vírus vivo ou de um vírus inactivado. Quando se utiliza um vírus inactivado, a vacina pode incluir virião inteiro, virião dividido ou antigénios de superfície purificados (incluída a hemaglutinina e, normalmente, incluindo também a neuraminidase). Os antigénios da gripe também podem apresentar-se em forma de virossomas. Os antigénios podem ter qualquer subtipo de hemaglutinina, seleccionado entre Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 e/ou H16. A vacina pode incluir antigénios de uma ou mais (por exemplo 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do vírus influenza, incluindo o vírus da gripe A e/ou B, por exemplo, uma vacina monovalente A/H5N1 ou A/H1N1, ou uma vacina trivalente A/H1N1+A/H3N2+B. 0 vírus da gripe pode ser uma estirpe recombinante, e pode ter sido obtido por técnicas de genética reversa [por exemplo, 51-55]. Assim, o vírus pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/PR/8/34 (normalmente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N de uma estirpe de vacina, um reordenamento 6:2). Os vírus utilizados como fonte dos antigénios podem ser cultivados quer em ovos (por exemplo, ovos de galinha embrionados) ou numa cultura celular. Quando se usa a cultura celular, o substrato celular será habitualmente uma linha celular de mamífero, tais como MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Preferido linhas celulares de mamífero para os vírus de influenza crescimento incluem células MDCK [56-59], derivado de Madin Darbe de rim canino, as células Vero [60-62], derivada de rim de macaco verde africano, ou células PER.C6 [63], que se derivem de retinoblastos embrionários humanos. Quando o vírus foi cultivado numa linha celular de mamífero, então a composição, de maneira vantajosa, estará livre de proteínas de ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) e de ADN de frango, o que reduz a alergenicidade. As doses unitárias de vacina são normalizadas habitualmente por referência ao conteúdo de hemaglutinina (HA), que normalmente se mede mediante SRID. As vacinas existentes contêm habitualmente de aproximadamente 15 mg de HA por estirpe, embora se possam utilizar doses mais baixas, particularmente quando se usa um adjuvante. As doses fraccionárias tais como © (isto é, 7,5 mg de HA por estirpe), V e V foram utilizados [64,65], ao ter doses mais altas (por exemplo, doses 3x ou 9x [66,67]). Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 mg de HA por estirpe de influenza, preferivelmente entre 0,1 e 50 mg por exemplo, 0,l-20mg, 0,l-15mg, 0,l-10mg, 0.1-7.5mg, 0,5- 5mg, etc. As doses particulares incluem, por exemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,75, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc. por estirpe. 0 vírus da imunodeficiência humana, incluídos o HIV-1 e HIV-2. 0 antigénio será habitualmente um antigénio de cobertura. • Antigénios de superfície do vírus da hepatite B. Este antigénio obtém-se preferivelmente mediante métodos de ADN recombinante, por exemplo, depois da expressão numa levedura Saccharomeces cerevisiae. Ao contrário do HBsAg virai nativo, o antigénio recombinante expresso em levedura não é glicosilado. Pode estar em forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de aproximadamente 20 nm), incluindo uma matriz lipídica que inclui fosfolípidos. Ao contrário das partículas de HBsAg nativas, as partículas expressas de levedura podem incluir fosfatidilinositol. O HBsAg pode ser de qualquer dos subtipos aewl, aew2, aew3, aew4, aer, adw2, adw4, adrq-e adrq +. • Ancilostoma particularmente como se vê em caninos (Ancylostoma caninum). Este antigénio pode ser Ac-MTP-1 recombinante (metaloprotease de tipo astacina) e/ou uma hemoglobinase aspártica (Ac-APR-1), que pode expressar-se num sistema de baculovírus/células insecto como uma proteína segregada [68, 69]. • Antigénios do vírus herpes simplex (HSV). Um antigénio do HSV preferido para usar com a invenção é a glicoproteína de fgD. Prefere-se o uso de gD de uma estirpe de HSV-2 ('gD2' antigénio). A composição pode usar uma forma de gD em que a região da membrana C-terminal de ancoragem foi eliminada [70] por exemplo, um gD truncado que inclui os aminoácidos 1-306 da proteína natural com a adição de aparagina e glutamina no extremo C-terminal. Esta forma da proteína inclui o péptido de sinal que se separa para produzir uma proteína madura de 283 aminoácidos. A deleção da âncora permite que a proteína se prepare em forma solúvel. • Antigénios do vírus do papiloma humano (VPH). Os antigénios de VPH preferidos para usar com a invenção são as proteínas da cápside Ll, que se podem encaixar para formar estruturas conhecidas como partículas similares a vírus (VLPs). As VLPs podem produzir-se por expressão recombinante de Ll em células de levedura (por exemplo, em S. cerevisiae) ou em células de insecto (por exemplo, em células de Spodoptera, tais como S. frugiperda, ou em células de Drosophila). Para as células de levedura, os vectores plasmídicos podem levar o gene Ll , para células de insectos, os vectores de baculovírus podem levar o gene Ll. Mais preferivelmente, a composição inclui VLPs de Ll tanto das estirpes HPV-16 como de HPV-18. Esta combinação bivalente foi demostrada como altamente efectiva [71]. Além disso das estirpes HPV-16 e HPV-18, também é possível incluir VLPs de Ll das estirpes HPV-6 e HPV-11. 0 uso de estirpes de VPH oncogénicas também é possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60mg/ml (por exemplo, aproximadamente 40mg/ml) de Ll por estirpe de VPH. • Antigénios de antrax. 0 antrax é causado pelo Bacillus anthracis. Os antigénios B.anthracis adequados incluem componentes A (factor letal (FL) e factor de edema (FE)), ambos dos cuais podem partilhar um componente B comum conhecido como antigénio protetor (AP) . Os antigénios podem ser desintoxicados de maneira opcional. Mais pormenores podem ser encontrados nas referências [72 a 74] . • Antigénios S. aureus. São conhecidos vários antigénios S. aureus. Os antigénios adequados incluem sacáridos capsulares (por exemplo, de estirpe de tipo 5 e/ou 8) e proteínas (por exemplo, IsdB, Hla, etc.) Os antigénios capsulares de sacárido estão idealmente conjugados numa proteina portadora. • Antigénios S. pneumoniae. São conhecidos vários antigénios S. pneumoniae. Os antigénios adequados incluem sacáridos capsulares (por exemplo, de um ou mais dois serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e/ou 23F) e proteínas (por exemplo pneumolisina, a pneumolisina destoxifiçada, proteína D tríade da poli-histidina (PhtD), etc.) Os antigénios capsulares de sacárido estão idealmente conjugados numa proteína portadora. • Antigénios do cancro. São conhecidos vários antigénios específicos de tumores. A invenção pode ser usada com antigénios que provocam uma resposta imunoterapêutica contra o cancro de pulmão, melanoma, cancro de mama, cancro de próstata, etc.

Uma solução do antigénio normalmente mistura-se com a emulsão, por exemplo, numa relação em volume de 1:1. Esta mistura pode ser realizada por um fabricante da vacina, antes do seu enchimento, ou pode ser realizada no momento do uso, por um profissional de saúde.

As composições farmacêuticas

As composições realizadas usando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem ser incluídos componentes adicionais à emulsão e ao antigénio opcional. A composição pode incluir um conservante tal como tiomersal ou 2-fenoxietanol. Recomenda-se, contudo, que a vacina deva estar substancialmente livre de (isto é, com menos de 5mg/ml) de material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal [75,76]. As vacinas e componentes que não contêm mercúrio são mais recomendáveis. 0 pH de uma composição estará geralmente entre 5,0 e 8,1, e mais habitualmente entre 6,0 e 8,0 por ex. entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode por tanto incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina antes do seu embalamento. A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não pirogénica, por exemplo, com um conteúdo de <1 O (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e, preferentemente, <0,1 UE por dose. A composição está de maneira preferente livre de glúten. A composição pode incluir material para uma única imunização ou pode incluir material para múltiplas imunidades (isto é, uma "multidose" kit). A inclusão de um conservante prefere-se nas disposições multidose.

As vacinas são administradas habitualmente num volume de dose de aproximadamente 0,5 ml, embora uma dose média (isto é, aproximadamente 0,25 ml) pode ser administrada a crianças. O uso médico da vacina A invenção proporciona kits e composições preparadas usando os métodos da invenção. As composições preparadas de acordo com os métodos da invenção são adequadas para a administração a pacientes humanos, e para uso no aumento de uma resposta imune num paciente, que inclui a etapa de administração de dita composição ao paciente. A invenção também proporciona estes kits e composições para uso como medicamentos. A invenção também proporciona o uso de: (i) uma preparação aquosa de um antigénio, e (ii) uma emulsão de óleo em água preparada de acordo com a invenção, na fabricação de um medicamento para elevar uma resposta imune num paciente. A resposta imune colocada por estes métodos e usos incluirá geralmente uma resposta de anticorpo, preferentemente uma resposta de anticorpos protetores.

As composições podem ser administradas de diversas maneiras. A via de imunização mais preferida é mediante injecção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna), mas outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea, intranasal [77-79], oral [80], intradérmica [81,82], transcutânea, transdérmica [83], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças como adultos. O paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55 anos, ou pelo menos 55 anos. O paciente pode ser adultos (por exemplo,> 50 anos de idade, preferivelmente> 65 anos), jovens (por exemplo, <5 anos), pacientes hospitalizados, trabalhadores de saúde, serviços armados e pessoal militar, mulheres grávidas, doentes crónicos, pacientes imunodeficientes, e pessoas que viajam para o estrangeiro. As vacinas não são adequadas unicamente para estes grupos, contudo, e pode ser utilizada de maneira mais geral na população.

As vacinas da invenção podem ser administradas aos pacientes de maneira substancial ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde) outras vacinas.

Processos intermédios A invenção também proporciona um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui a microfluidição de uma primeira emulsão para formar uma segunda emulsão e depois a filtração da segunda emulsão. A primeira emulsão tem as caracteristicas descritas anteriormente. A invenção também proporciona um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui a filtração de uma segunda emulsão, isto é, uma emulsão microfluidifiçada. A emulsão que se microfluidiza tem as caracteristicas descritas anteriormente.

[149] A invenção também proporciona um método para a fabricação de uma vacina, que inclui a combinação de uma emulsão com um antigénio, em que a emulsão tem as caracteristicas descritas anteriormente.

Formas de realização especificas

As formas de realização específicas da presente invenção incluem: • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclui esqualeno, compreendendo as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gotas de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, e (iii) a filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana hidrofílica. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo de 5000 nm ou menos, (ii) microf luidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, e (iii) filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana hidrofílica. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo, (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, e (iii) a filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana hidrofílica de polietersulfona. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclua esqualeno, compreendendo o método a etapa de (i) formação de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo usando um homogeneizador, em que a primeira emulsão se forma mediante a circulação várias vezes dos componentes da primeira emulsão através de um homogeneizador. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que contenha esqualeno, incluindo o método a etapa de (b) microfluidização de uma primeira emulsão de óleo que tem um primeiro tamanho médio de gota para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, em que a segunda emulsão se forma mediante a circulação dos componentes da segunda emulsão por transferência dos componentes da segunda emulsão desde um recipiente da primeira emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização para um segundo recipiente de emulsão, e depois através de um segundo dispositivo de microfluidização, em que os dispositivos de microfluidização primeiro e segundo são o mesmo. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclui: a passagem de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo; em que o dispositivo de microfluidização inclui uma câmara de interação que contém vários canais de tipo Z e um módulo de processamento auxiliar que inclui pelo menos um canal; em que o módulo de processamento auxiliar está situado a jusante abaixo da câmara de interação. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclui a etapa de passagem de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo; em que o dispositivo de microfluidização inclui uma câmara de interação e um módulo de processamento auxiliar que contém vários canais. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água que inclui a etapa de passagem de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, em que o dispositivo de microfluidização inclui uma câmara de interação e em que a pressão dos componentes da emulsão à entrada da câmara de interação é substancialmente constante durante pelo menos 85% do tempo durante o qual se alimenta a emulsão no microfluidizador. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui a etapa de formação de uma emulsão que tem um primeiro tamanho médio de gota de óleo, em que a formação da primeira emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo, nitrogénio, por exemplo, a uma pressão de até 0,5 bares. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que compreenda etapa de passagem de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, em que a formação da segunda emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo, nitrogénio, por exemplo, a uma pressão de até 0,5 bares. • Um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, que inclui as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo, (iii) a filtração da segunda emulsão; (iv) a transferência da emulsão de óleo em água a uma bolsa estéril flexível.

Geral O termo "que compreende" engloba "que inclui", assim como "consistente em", por exemplo uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional por exemplo, X + E. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que está "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Quando for necessário, a palavra "substancialmente" pode omitir-se da definição da invenção. 0 termo "aproximadamente" em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x ± 10%. A menos que se indique especificamente, um procedimento que inclui uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não requer nenhuma ordem especifica de mistura. Assim, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Quando há três componentes, dois componentes podem ser combinados entre si, e então a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc.

Quando os materiais animais (sobretudo bovinos) são utilizados na cultura de células, obter-se de fontes que são livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), e, em particular, livre de encefalopatia bovina espongiforme (EEB). Em geral, prefere-se cultivar células em ausência total de materiais derivados de animais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra um exemplo especifico de um homogeneizador que pode ser utilizado para formar uma primeira emulsão. A figura 2 mostra o pormenor de um rotor e um estator que podem ser utilizados em dito homogeneizador. A figura 3 mostra dois perfis de pressão para um modo de bomba intensificador simultâneo. A figura 4 mostra uma câmara de interação de canal de tipo Z. A figura 5 mostra uma circulação de tipo I, enquanto a figura 6 mostra uma circulação de tipo II. Os recipientes estão etiquetados como "C", enquanto um homogeneizador se etiqueta como "H". São mostradas a direcção e a ordem dos movimentos de fluido. Na figura 6 o homogeneizador tem duas setas de entrada e duas setas de sarda, mas em realidade o homogeneizador tem um único canal de entrada e um único canal de saida. MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO.

Exemplo 1:

Os componentes da emulsão: esqualeno, polissorbato 80, trioleato de sorbitano e tampão de citrato de sódio foram introduzidos num homogeneizador em linha, de alta velocidade, rotor/estator (IKA de Super Dispax Reactor DRS 2000/5) . Os volumes de partida da emulsão de 2801 e 2501 foram utilizados e a velocidade do homogeneizador fixou-se em 5000 ± 1000 rpm. A temperatura da emulsão durante a homogeneização manteve-se abaixo de 60 °C.

Foram levadas a cabo três execuções de prova. Na primeira prova de funcionamento, 2801 dos componentes da emulsão submeteram-se a circulação de tipo I, entre o homogeneizador e um recipiente da primeira mistura prévia, durante 20 minutos, seguido por uma única circulação de tipo II, a transferência dos componentes da primeira emulsão desde um recipiente de aço inoxidável da primeira mistura prévia, através do homogeneizador para um recipiente de aço inoxidável da segunda mistura prévia, e depois de novo através do homogeneizador. Na segunda prova, 2801 dois componentes da emulsão submeteram-se à circulação de tipo I, entre o homogeneizador e um recipiente da primeira mistura prévia de aço inoxidável, durante 5 minutos, seguido de 5 circulações de tipo II, transferindo os componentes da primeira emulsão de um recipiente de aço inoxidável da primeira mistura prévia, através do homogeneizador a um recipiente de aço inoxidável da segunda mistura prévia, e depois de novo através do homogeneizador para o recipiente de aço inoxidável da primeira mistura prévia. Na terceira realização da prova, 2501 dois componentes da emulsão submeteram-se à circulação de tipo I, entre o homogeneizador e um recipiente da primeira mistura prévia de aço inoxidável, durante 20 minutos, seguido por uma única circulação de tipo II, transferindo os componentes da primeira emulsão para um recipiente de aço inoxidável da primeira mistura prévia, através do homogeneizador para um recipiente de aço inoxidável da segunda mistura prévia, e depois de novo através do homogeneizador para o recipiente de aço inoxidável da primeira mistura prévia. A primeira emulsão foi homogeneizada até que teve um tamanho médio de gota de óleo de 12 0 0 nm ou menos e um número de gotas de óleo com um tamanho> 1,2 mm de 5 x 109/ml ou menos. A primeira emulsão foi então submetida a microfluidização para formar uma segunda emulsão. A emulsão foi passada através do dispositivo de microfluidização cinco vezes. O dispositivo de microfluidização foi accionado a entre aproximadamente 600 e 800 bares (isto é, entre aproximadamente 9000 e 12000 psi) e a emulsão manteve-se a uma temperatura de 40 ± 5 °C durante a microf luidização mediante o uso de um mecanismo de refrigeração. A segunda emulsão foi filtrada estéril. tamanho médio das gotas de óleo nas emulsões filtradas em cada execução de prova cumpriu com a especificação para um adjuvante MF59.

Outros parâmetros das emulsões durante as execuções de prova primeira, segunda e terceira podem ser encontradas na Tabela 1.

Tabela 1

Parâmetro Unidade Primeira execução Segunda execução Terceira execução Número de gotas de óleo com um 1,2 μιη na segunda emulsão /ml 43.7 x 106 56.4 x 106 45.1 x 106 Número de gotas de óleo com um> 1,2 μιη depois da filtração /ml 0.2 x 106 0.6 x 106 0.5 x 106

Os resultados das três provas de funcionamento são excelentes. Contudo, os resultados da Tabela 1 mostram que a prova de execução 1 produziu a maior redução de percentagem (99,5%) no número de partículas com um 1,2 mm na emulsão depois da filtração em comparação com o número presente na segunda emulsão. Portanto, o melhor modelo de circulação de homogeneização é à volta de 20 minutos de circulação de tipo I seguidos por uma circulação de tipo II.

Exemplo 2:

Em experiências posteriores, uma primeira emulsão foi formada por circulação de tipo I (Figura 5) ou tipo II (Figura 6). Em cinco execuções separadas o número médio de partículas grandes por ml foi o seguinte:

Tabela 2 Médio Coeficiente de variação Tipo I 1.70 x 109 0.23 Tipo II 1.04 x 109 0.13

Portanto a circulação de tipo II resulta num menor número de gotas grandes e menos variação de lote a lote.

Referências [1] WO90/14837.

[2] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[3] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[4] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[5] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. 0'Hagan.

[6] New Generation Vaccines (eds. Levine et al.). 3rd edition, 2004. ISBN 0-8247-4071-8.

[7] 0'Hagan (2007) Expert Rev Vaccines 6(5):699-710.

[8] EP-B-2 02 917 0 [8a] EP 1 574 210 A2 [9] Baudner et al. (2009) Pharm Res. 26(6):1477-85.

[10] Dupuis et al. (1999) Vaccine 18:434-9.

[11] Dupuis et al. (2001) Eur J Immunol 31:2910-8.

[12] Burke et al. (1994) J Infect Dis 170:1110-9.

[13] Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions (W. Schartl), 2007. ISBN: 978-3-540-71950-2.

[14] Jafari et al (2008) Food Hydrocolloids 22:1191-1202 [15] W090/04609.

[16] US-4,618,533 [17] US-6, 193, 077 [18] US-6, 495, 050 [19] Chen et al. (1999) Journal of Applied Polymer Science, 72:1699-1711.

[20] US-4,413,074 [21] US-4,432,875 [22] US-4,340,482 [23] US-4,473, 474 [24] US-4,473, 475 [25] US-4, 673, 504 [26] EP-A-0221046.

[27] US-4,943,374 [28] US-6,071,406 [29] US-4,705,753 [30] US-5,178,765 [31] US-6,495,043 [32] US-6,039,872 [33] US-5,277,812 [34] US-5,531,893.

[35] US-4,964,990 [36] Wavhal & Fisher (2002) Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics 40:2473-88.

[37] W02006/044463.

[38] Espinoza-Gómez et al. (2003) Revista de la Sociedad

Química de México 47:53-57.

[39] Lidgate et al (1992) Pharmaceutical Research 9(7):860-863.

[40] US-2007/0014805.

[41] W02007/080308.

[42] W02007/052155.

[43] W02005/089837.

[44] US 6,692,468.

[45] WO00/07647.

[46] WO99/17820.

[47] US 5,971,953.

[48] US 4,060,082.

[49] ΕΡ-Α-0520618.

[50] W098/01174.

[51] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170.

[52] Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200.

[53] Liu et al. (2003) Virology 314:580-590.

[54] Ozaki et al. (2004) J. Virol. 78:1851-1857.

[55] Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103.

[56] W097/37000.

[57] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[58] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[59] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50.

[60] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[61] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[62] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[63] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[64] WOOl/22992 .

[65] Hehme et al. (2004) Virus Res. 103(1-2):163-71.

[66] Treanor et al. (1996) J lnfect Dis 173:1467-70.

[67] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[68] Williamson et al. (2006) Infection and Immunity 74 961-7.

[69] Loukas et al. (2005) PLoS Med 2(10): e295.

[70] EP-A-0139417.

[71] Harper et al. (2004) Lancet 364(9447):1757-65.

[72] J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100.

[73] Demicheli et al. (1998) Vaccine 16:880-884.

[74] Stepanov et al. (1996) J Biotechnol 44:155-160.

[75] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[76] W002/097072.

[77] Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77.

[78] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295 304.

[79] Piascik (2003) J Am Pharm Assoe (Wash DC). 43:728-30.

[80] Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.

[81] Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[82] Herbert et al. (1979) J lnfect Dis 140:234-8.

[83] Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água adjuvante de vacina com esqualeno, incluindo o método a etapa de: (i) formação de uma primeira emulsão com um primeiro tamanho médio de gota de óleo usando um homogeneizador, em que a primeira emulsão se forma mediante a transferência dos seus componentes a partir de um primeiro recipiente para um segundo recipiente através de um homogeneizador, e devolvendo-os então desde o segundo recipiente ao primeiro recipiente através do mesmo homogeneizador, em que substancialmente todos os componentes da emulsão desde o primeiro recipiente são passados através do homogeneizador ao segundo recipiente, e depois substancialmente todos os componentes da emulsão do segundo recipiente são passados através do homogeneizador de novo ao primeiro recipiente.
2. 2. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a etapa (i) inclui dois ou mais ciclos de transferência de componentes da primeira emulsão desde o primeiro recipiente para o segundo recipiente, e vice-versa.
3. 3. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o homogeneizador é um homogeneizador mecânico e os componentes da primeira emulsão são combinados num recipiente de mistura antes de introduzir-se no homogeneizador.
4. 4. Método da reivindicação 3, em que o homogeneizador é um homogeneizador rotor-estator.
5. 5. Método de qualquer reivindicação anterior, em que os recipientes primeiro e sequndo se mantêm sob um gás inerte.
6. 6. Método de qualquer reivindicação anterior, que inclui: (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de gota de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio de gota de óleo.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que o homogeneizador é um homogeneizador rotor-estator e em que a microfluidização se produz numa câmara de interação que não tem partes móveis.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que o homogeneizador proporciona uma velocidade de cisalhamento de até 1x101 s-1, e em que a microf luidização se produz numa câmara de interação que proporciona uma velocidade de cisalhamento> 2.5x106 s-1.
9. 9. Método de qualquer reivindicação anterior, que inclua: (iii) a filtração da segunda emulsão.
10. 10. Método de uma qualquer das reivindicações 6 a 9, em que durante a etapa (ii), a segunda emulsão se forma mediante a circulação dos componentes da segunda emulsão várias vezes através de um dispositivo de microfluidização.
11. 11. Método da reivindicação 10, em que a segunda emulsão se forma mediante a circulação dos componentes da segunda emulsão através de um dispositivo de microfluidização três vezes.
12. 12. Método da reivindicação 10 ou a reivindicação 11, em que a circulação dos componentes da emulsão segunda inclui a transferência dos componentes da segunda emulsão entre um recipiente da primeira emulsão e um dispositivo de microfluidização.
13. 13. Método de uma qualquer das reivindicações 10 a 12, em que a circulação dos componentes da segunda emulsão inclui a transferência dos componentes da segunda emulsão desde um recipiente da primeira emulsão, através de um dispositivo de microfluidização a um recipiente da segunda emulsão, e depois de novo através do dispositivo de microfluidização.
14. 14. Método de uma qualquer das reivindicações 6 a 13, em que os recipientes de emulsão primeira e segunda se mantêm sob um gás inerte.
15. 15. Método de uma qualquer das reivindicações precedentes, em que o primeiro tamanho médio de gota de óleo é de 5000 nm ou menor.
16. 16. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o número de gotas de óleo que têm um tamanho de> 1,2 mm na primeira emulsão é 5 x 1011/ml ou menos.
17. 17. Método de uma qualquer das reivindicações 6 a 16, em que o segundo tamanho médio de gota de óleo é de 500 nm ou menos.
18. 18. Método de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 17, em que o número de gotas de óleo que têm um tamanho de> 1,2 mm na segunda emulsão é 5 x 1010/ml ou menos.
19. 19. Método para preparar uma composição de vacina, que inclui a preparação de uma emulsão de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 18 e a combinação da emulsão com um antigénio.
20. 20. Método para preparar um kit de vacina que inclua a preparação de uma emulsão de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 18 e embalar a emulsão num kit como componente do kit junto com um componente antigénico.
21. 21. Método da reivindicação 20, em que os componentes do kit estão em frascos separados, por exemplo, em que os frascos são de vidro de boro-silicato.
22. 22. Método de qualquer das reivindicações 19 a 21, em que o adjuvante é um adjuvante a granel e o método compreende extrair doses unitárias do adjuvante a granel para o embalamento como os componentes do kit.
23. 23. Método de uma qualquer das reivindicações 19 a 22, onde o antigénio é um antigénio do virus da gripe, por exemplo, em que a combinação da emulsão e o antigénio forma uma composição de vacina que inclui aproximadamente 15 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 7,5 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 3.8mg, aproximadamente 1.9mg, ou aproximadamente 1,5 mg de hemaglutinina por estirpe de virus da gripe.