CN104838267B - 用于lal反应物质测试的向心微流体平台 - Google Patents

用于lal反应物质测试的向心微流体平台 Download PDF

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Abstract

提供一种由用于测试流体样本中的LAL反应物质的微流体盘和读取器所组成的向心微流体平台。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。盘可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个通道的分配网络，其中各通道具有计量部分和至少一个分析室部分。分析室部分可包括用于混合样本和试剂的混合室以及与光学读取器兼容的光学室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供分析室部分中分析。至少一个分析室部分具有在其中隔离的至少一个试剂。向心微流体平台还包括用于测试微流体盘中的流体样本的读取器，包括外壳、光具座、向心盘驱动器和控制器。还提供一种用于测试至少一个流体样本的LAL反应物质的方法。

Description

用于LAL反应物质测试的向心微流体平台
技术领域
本发明针对确定流体样本中的LAL反应物质的浓度的领域，以及更具体来说，本发明涉及用于测量流体样本中的LAL反应物质的浓度的向心微流体平台和盘。
本申请享有临时专利申请序号61/710908(2012年10月8日提交，标题为“MICROFLUIDIC BACTERIA ENDOTOXIN TESTING METHOD AND APPARATUS”、临时专利申请序号61/710990(2012年10月8日提交，标题为“CENTRIPETAL MICROFLUIDIC PLATFORM FORBACTERIAL ENDOTOXIN TESTING”、临时专利申请序号61/710898(2012年10月8日提交，标题为“SENSITIVE AND RAPID METHOD FOR DETECTION OF LOW LEVELS OF ENDOTOXINS USINGLAL REAGENTS”以及临时专利申请序号61/710903(2012年10月8日提交，标题为“MICROPLATES PRELOADED WITH ENDOTOXIN DETECTION REAGENTS WITH CALIBRATIONMEANS”的权益。通过引用将上述申请全部结合到本文中。
背景技术
诸如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和真菌之类的微生物污染可引起人类的严重疾病甚至死亡。当人们受到革兰氏阴性细菌感染时，细菌可产生发热诱导细菌内毒素。内毒素对人类会是危险并且甚至是致命的。内毒素分子是革兰氏阴性细菌的细胞壁的脂多糖成分，其能够存在于药物剂型和医疗装置的表面，而与微生物污染无关。即使系统通过了无菌测试，内毒素污染也能够发生，这就是要求单独内毒素测试的原因。
当前，开发了多种测试，以便使用来自马蹄蟹的血细胞溶菌产物来检测样本中或样本上的内毒素的存在。当血细胞溶菌产物暴露于内毒素时，凝结将发生。血细胞溶菌产物是从各种马蹄蟹物种(包括Limulus（鲎）、Tachypleus（东方鲎）和Carcinoscorpius（圆尾鲎）物种)的血淋巴所产生的变形细胞溶菌产物。常用变形细胞的溶菌产物从Limulus或Tachypleus物种的血淋巴来产生，称作Limulus变形细胞溶菌产物(“LAL”)。使用LAL作为测试试剂的例行测试包括凝胶凝结检验、终点浊度检验、动力浊度检验、终点生色检验和动力生色检验。使用LAL试剂的测试也可用来对某些类型的葡聚糖测试真空污染的标记。
关于所使用的LAL检验和标准的更多信息可见于美国药典(“USP”)第85章“Bacterial Endotoxins Test”(“BET”)、日本药典4.01“Bacterial Endotoxin Test”、欧洲药典2.6.14“Bacterial Endotoxins”以及其他等效国家药典。附加国际协调药典信息能够见于ICH Q4B附录14“Bacterial Endotoxin Test General Chapter”。对于医疗装置中的内毒素测试，信息能够见于USP第161章“Transfusion and Infusion Assemblies andSimilar Medical Devices”和ANSI/AAMI ST72“Bacterial endotoxins - Test methods,routine monitoring, and alternatives to batch testing”。这些标准和过程可一般称作药典（compendia）。
制药、医疗装置和食品工业的制造商必须满足某些标准，以确保其产品没有包含微生物或内毒素污染。这些工业要求对内毒素的存在的频繁、准确和灵敏测试，以满足各种安全标准，例如由美国食品和药物管理局或者环境保护局所规定的标准。这些机构接受药典过程标准中的许多。因此，如果制造商想要得到对新产品上市的政府批准，则在产品符合上述药典中的方法和标准时可满足FDA要求中的许多。这能够充分降低制造商得到新产品的FDA批准的成本。
当测试结果表明不良结果或者超出预计范围的内毒素浓度时，这些机构还具有严格报告要求。这种不合规结果必须彻底调查以查找根本原因，并且向监管机构说明。这是费时并且费用高的。如果制造商能够表明不合规结构因测试本身的异常而不是因样本中或样本上的内毒素的实际存在而发生，则可满足向机构的报告要求中的许多。这可减少满足这类报告义务所导致的时间和成本。当今，不存在能够区分测试本身的异常或误差与样本中的异常的已知方法或设备。
各种药典中的这些检验要求包含已知浓度的内毒素的水溶液用作“标准物”。这些水溶液通常是不稳定的；因此，它们通常就在测试之前在测试位置从粉末毒素来制成。LAL试剂通常也采取粉末形式出现，并且必须在使用前在水溶液中重新构成。
内毒素和LAL粉末的配制因关键生物分子的缓慢溶解以及它们在混合以及此后在表面上的冷凝期间粘附表面的倾向而比较困难。LAL试剂在重新构成时还开始缓慢地起反应，并且具有极短的保存期。虽然最佳实践是就在使用之前混合这些，但是工作流程通常规定在过程开始时混合它们。另外，配制过程易于受到来自环境中普遍存在的内毒素的污染。
机构还要求一系列校准测试以确保所使用的设备和试剂正确起作用。校准测试和样本测量也必须一次以上来制成。符合BET和其他药典的当前实验室方法非常详细，并且要求用于没有污染地分配到微板等的多个入口中的流体体积的重复并且极准确测量。
执行LAL分析的最常见方法是采用微孔板和读取器。在顶部开放并且在底部具有透明窗口的反应孔的基体放置在用于多个同时检验的加热分光光度读取器中。存在许多缺点，包括配制板要花费的漫长时间、高成本、出错和污染的机会以及需要由为此任务专门培训和专用的技术人员进行工作。
连续监测高水平操作人员以确保测量和测试的适当技术和精度，以及根据需要再培训操作人员，以确保重复动作的精度。典型方法具有多达248个缓慢费时的移液步骤，因其复杂度而使它成为易出错方法并且因其操纵的长度和数量而易受污染。
开发了方法和装置来减少步骤的数量或者自动化内毒素测试中的步骤的部分或全部。一些方法包括自动化一个或多个移液或等分步骤、自动化样本的混合或者在仅允许极有限次数的测试的测试基片中预先加载试剂。但是，所开发的方法或装置全部遗漏如下方面的一个或多个，设计到基片中的低成本自动化、确保清洁度的一次性清洁基片、各基片上的药典测试合规、内建的单独测试测量验证以及测量操作的简单性。
部分自动化检验过程的其他微流体方法存在，但是这些因其受限大小以及它们对所存储校准而不是对在同一设备中使用相同试剂和标准物同时运行的校准的依靠与药典方法不是完全兼容。它还要求准确样本测量；没有等分试样（aliquot）由仪器或设备本身来生成。
其他自动化方法依靠机器人在微板中测量和分配样本和试剂。一旦经过配制，在读取器中手动或者使用另一个机器人来加载板。机器人通常是基于移液管的分发系统，其准确地将样本和试剂从瓶架传递到板，更换移液管吸头以防止交叉污染。这是高费用系统，其每次需要机器人操作的频繁验证和多个一次性用具(移液管吸头、多孔板、稀释管、移液管填充托盘、取样小瓶等)。它还依次配制孔，并且相似的手动配制不能同时开始所有反应。污染仍然是问题，并且由于该过程通常未监测，所以没有排斥因故污染样本的合法方式。
开发了基于流量注入或依次注入分析的自动化系统。其重要改进在于，它同时进行分析并且因而更快并且如药典所规定，以及使用一次性微流体，其不要求清洁并且不易受污染。
但是，当今不存在能够减少用户在配制和测量校准标准物和测量样本中执行的步骤的数量、同时符合药典的已知方法或设备。
相应地，存在对减少或消除潜在操作人员错误量并且还符合药典、用于测试和分析流体样本中的内毒素浓度的更为半自动化测试方法或过程的需要。
发明内容
本发明包括能够执行LAL分析(包括来自单个源的单个样本的多个分析、来自“加料”有附加内毒素或葡聚糖、内毒素或葡聚糖的标准浓度以及空白的水(“空白”或“LAL试剂水”)的相同源的分析)的微流体盘、系统和方法。这些分析能够在可以是一次性装置的同一微流体盘中同时执行。
本发明可用来检测任何LAL反应物质。如本文所使用的“LAL反应物质”表示与LAL试剂(检测试剂)发生反应的物质，包括内毒素或1,3-β-D-葡聚糖、例如海带多糖和凝结多糖。本发明还可与任何LAL试剂或检测试剂或者适合于检验LAL反应物质的任何其他试剂的商业源一起使用。
本发明可减少用户在配制和测量校准标准物和样本中必须执行的步骤的数量。它可降低对高级技能、经验和培训的需要，并且减少成本、时间和人为错误的机会。本发明还可用来区分测试本身的异常或误差和样本中的异常。另外，本发明可按照符合药典要求和FDA管制的方式来使用。
本发明还适合与将反应进度与内毒素水平相关的所有定量药典和光度方法一起使用，包括：1)动力生色，其中一直到所指定量的光吸收变化的时间与浓度相关；2)终点生色，其中对固定时间的光吸收变化与浓度相关；3)动力浊度，其中一直到所指定量的浊度(通常通过光吸收所测量)变化的时间与浓度相关；以及4)终点浊度，其中对固定时间的浊度变化与浓度相关。微流体盘使用户能够对各测量样本执行至少两个简单或者纯正分析和至少两个加料分析以及标准物和空白(校准样本)的至少两个分析。这可通过在微流体盘中具有用于各流体样本的储蓄器部分以及到至少四个区域(其中样本可准确地计量到准确体积中)的分配网络来实现。
如本说明书所使用的术语“流体样本”可不仅包括待分析的样本(“测量样本”)，而且还包括没有呈现与在检测极限所采用的内毒素检测试剂或溶菌产物进行反应的水。非反应水的样本又可称作“空白”、“LAL试剂水”、“BET的水”或者“注入用水”。术语“流体样本”还可包括一些溶液，其中包括配制的溶液，包含试剂、标准物、加料或配制的检测试剂。如本文所使用的“试剂”广义地使用并且包括任何物质、化学品或溶液，其在实验室用来检测、测量或检查物质、化学品或溶液，或者帮助这种检查。试剂包括标准物和检测试剂。LAL反应物质的适当检测试剂包括LAL试剂、重组因子C试剂、重组因子C和LAL试剂的混合物以及包括抗菌胜（sushi peptide）、抗菌胜片段、抗菌胜二聚物以及其他特定接合蛋白质(例如从抗菌素所得出的抗体和受体接合蛋白质)的配制品。术语“流体样本”还可包括内毒素或葡聚糖标准物(“LAL反应物质”或“标准物”)的配制溶液。上述各流体样本类型可具有其自己的储蓄器部分，或者流体样本类型的两个或更多可共享至少一个引入端口。
盘使用户能够组合和混合计量样本以及可存在的任何试剂或标准物。盘还可具有一个或多个光学室，并且可插入光学读取器中，以测量流体样本中的光学变化。
微流体盘还可包含用于空白和标准物的分析的相似结构，其没有包含样本的分配网络，使得标准物或空白和试剂是所混合和分析的流体。可分析在不同水平的至少三个标准物，其中各标准物和空白具有在来自单个样本的至少三个复本中被分析的手段。因此，盘支持对三个不同水平的校准标准物和空白的一式三份的分析。如上所述的盘允许所有药典所要求的测试在一个盘中使用同一样本来执行。
在一个实施例中，测量样本、试剂和标准物全部可作为准备使用的配制液体来引入。每种类型的单个流体样本可引入到一次性设备并且然后分配。
在另一个实施例中，空白的水（blank water）可用于空白分析，以及在最高水平分配和稀释单个标准物。因此，标准物根据需要通过分配、准确计量和混合来稀释，以产生其他标准物或加料。
在又一实施例中，盘可预先加载有标准物、试剂或者其混合物。标准物可作为液体或者可稀释或重新构成的干燥配制品在盘的部分中隔离。这消除对标准物引入端口的需要。隔离标准物可在设备的混合或分析部分中分配或者直接使用。对于标准物分析，标准物与空白的水相混合，并且然后分配或者直接使用。对于加料，标准物可采用样本、试剂或者两者的混合物来重新构成。
试剂也可作为液体或者干燥配制品在盘中隔离，使得它可采用空白的水来稀释或重新构成，并且然后分配和使用。这个空白的水可来源于与被分析空白相同的储蓄器。试剂可在各混合区域或者各分析唯一的另一区域中隔离，供与空白的水、样本或者它们两者重新构成。
备选地，试剂和标准物均可在盘中隔离。因此，只有样本和空白的水需要添加到设备供分析。还应当注意，当检测或LAL试剂固定在干燥形式时，它可与样本或标准物而不是空白的水重新构成，从而增加待分析材料的相对浓度，并且增加检验的速度和灵敏度。
在本发明的一个方面，公开一种供与向心微流体系统一起使用的微流体盘。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个测试通道的分配网络，其中各测试通道具有计量部分和至少一个分析室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供分析室部分中分析。至少一个测试通道部分具有在其中隔离的至少一个试剂。试剂可包括LAL反应物质。
在盘的另一个实施例中，至少一个分配网络是包括至少八(8)个测试通道的校准网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量。所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
在盘的又一实施例中，至少一个分配网络是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的带LAL反应物质的第四数量的加料。
在微流体盘的另一个实施例中，至少一个阀可定位在a)储蓄器部分与分配网络部分和/或b)计量部分与分析室部分之间。阀可配置成允许离心力激发等分试样流经阀从计量部分到分析室部分。
在又一实施例中，分析室部分全部可包括混合室和光学室。混合室可具有在其中隔离的至少一个附加试剂。附加试剂可包括检测试剂。混合室可具有对于将固定在侧壁上的检测试剂与等分试样相混合所优化的厚侧壁。厚侧壁可促进混合接近厚侧壁的试剂和等分试样的流路。在另一个实施例中，分析室可配置成实现使用科里奥利效应、惯性效应或者其中携带的气泡和/或空泡（bubble and/or bead）中的至少一个将等分试样与试剂相混合。
在又一实施例中，分配网络部分还可包括主要分配通道、废料入口通道和废料室，以用于限定任何过量流体样本并且将余量与等分试样分离。在另一个实施例中，盘可配置成允许离心力从光学室部分中的样本流体中消除气泡。
在另一个实施例中，公开一种配置成测试微流体盘中的流体样本的读取器。该读取器可包括外壳、光具座（optical bench）、向心盘驱动器和控制器。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个通道的分配网络，其中各通道具有计量部分和至少一个分析室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供分析室部分中分析。
在另一方面，外壳可包括用于将流体样本插入盘的储蓄器中的入口。入口和读取器可配置成防止用户将流体样本插入不正确储蓄器中。
在读取器的又一实施例中，至少一个分配网络可以是包括至少八(8)个测试通道的校准网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
在读取器的另一方面，至少一个分配网络可以是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的带LAL反应物质的第四数量的加料。
在本发明的又一实施例中，公开一种用于测试LAL反应物质的至少一个流体样本的方法。该方法可包括将微流体盘插入光学读取器中。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘还可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个通道的分配网络，其中各通道具有计量部分以及包括光学室的至少一个分析室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供光学室中分析。
读取器可包括外壳、光具座、向心盘驱动器、用于将所述流体样本引入所述盘中的入口以及控制器。流体样本插入读取器的入口中。读取器使盘旋转，直至达到反应速度。读取器使用光具座来分析光学室中的等分试样，以得到测量数据和/或反应数据。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个实施例中，包括检测试剂和/或LAL反应物质的至少一个试剂可引入读取器入口中。读取器可使盘旋转，直至达到反应速度。允许等分试样与检测试剂发生反应。等分试样可在光学室中使用光具座来分析，以得到测量数据和/或反应数据。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个方法实施例中，至少一个测试通道具有在其中隔离的至少一个试剂。试剂可包括LAL反应物质和/或检测试剂。在又一实施例中，该方法还可包括将流体样本从储蓄器传递到计量部分并且计量等分试样。等分试样可从计量部分传递到光学室。等分试样可在光学室中使用光具座来连续监测以得到测量数据和/或反应数据，直到等分试样完成了反应。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个方法实施例中，测量数据和/或反应数据可包括等分试样体积、反应动力学、流体运动、透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光、荧光和磁共振。该方法和/或所述测量数据和/或反应数据可使用历史测量数据和/或来自已知反应动力学的数据来验证。在又一实施例中，示踪剂可固定在分析室中，以帮助测量和验证等分试样体积。
通过以下作为说明所示和所述的本发明的实施例的描述，本发明的优点将是本领域的技术人员更显而易见的。如将会认识到，本发明能够具有其他和不同实施例，并且其细节能够在各个方面进行修改。
附图说明
作为举例、参照图解附图在现在描述的本发明的实施例中具体示出本发明的这些和其他特征及其优点。
图1a-d是用于测试微流体盘中的多个流体样本的一示范实施例；
图1e是示出读取器的一示范实施例的电路的框图；
图1f是由读取器的一示范实施例的CPU所运行的程序的流程图；
图2示出按照本发明的一示范实施例、由读取器对微流体盘的光学室中的样本的吸收的动态监测；
图3是微流体盘的一示范实施例；
图4是爆破阀的一示范实施例；
图5是微流体盘的一示范实施例；
图6是微流体盘的一示范实施例；
图7是微流体盘的一示范示意图；
图8是光学室的一示范实施例；以及
图9a-c是使用读取器和微流体盘的测试过程或方法的示范实施例。
应当注意，所有附图是概略的，而不是按比例绘制的。附图中，为了清楚和便利起见，这些附图的部分的相对尺寸和比例在大小上经过放大或减小来示出。相同参考标号一般用来表示不同实施例中的对应或相似特征。相应地，(一个或多个)附图和描述将被看作实际上是说明性的而不是限制性的。
具体实施方式
本发明通过创建具有预先加载到盘中的内毒素检测试剂和内毒素标准物的专用盘以及盘的读取器，来改进标准细菌内毒素测试(“BET”)。在另一个实施例中，公开一种具有预先加载到光学室或混合室中的内毒素检测试剂和内毒素标准物的微流体盘103。在另一实施例中，公开一种用于微流体盘103的读取器100。
盘和读取器设计成测量样本中的BET，并且还提供来自已知内毒素加料的校准数据。预先加载的测试盘可设计成满足所有当前BET制药管制要求。盘和读取器可与浊度、生色和凝胶凝结BET方法一起使用。LAL反应物质的适当检测试剂包括LAL试剂、重组因子C试剂、重组因子C和LAL试剂的混合物以及包括抗菌胜、抗菌胜片段、抗菌胜二聚物以及其他特定接合蛋白质(例如从抗菌素所得出的抗体和受体接合蛋白质)的配制品。内毒素标准物包括已经校准到相干管制主内毒素（regulatory master endotoxin）的内毒素。
相应地，所公开的盘和读取器显著减少测量样本中的BET所需的步骤的数量，由此使污染、定时延迟和失配为最小，并且因而改进精度。盘和读取器适合与FDA许可LAL一起使用。
所公开的盘和读取器显著减少样本配制时间。通过将测试试剂预先加载到盘中，消除了各样本的冗长试剂添加。测试试剂可以是帮助测试样本的任何试剂。适当测试试剂包括但不限于内毒素检测试剂和内毒素标准物。适当内毒素检测试剂可包括变形细胞溶菌产物。内毒素标准物可以是USP内毒素参考标准物，其已经校准到当前全球健康组织内毒素国际标准。测试的精度也可通过使定时和移液误差为最小得到改进。可通过读取器和盘上向用户识别样本或者通知用户关于是否要求附加试剂的多个可选识别机制，来进一步降低样本引入误差。适当识别机制可包括光学标记，例如颜色标记、字线数字标记或者发光二极管。
测试试剂可沉积到盘的各个表面上、例如沉积到光学室的内表面或者混合室中的流体流的点以允许样本、标准物或空白测量、沉积到可溶涂层上或者沉积到透明、半透光或反射可溶膜上。备选地，测试试剂可作为颗粒、干燥小珠或粗微粒来添加，或者沉积到载体介质(其添加到盘)中。
具有预先加载试剂的盘可封装成使得通过使用载体材料(其防止水分、细菌和LAL反应物质污染预先加载试剂)，来将它与环境密封。封装还可包括有效降低水分、氧和/或挥发性污染物的试剂。示范剂包括但不限于用于水分的硅胶、用于怕羞的氧化铁包以及用于挥发性污染物的活性碳。在一个实施例中，载体材料是清洁袋。
在一个实施例中，公开一种盘，其中盘预先加载有至少一个测试试剂。在另一个实施例中，测试试剂可包括内毒素标准物。在另一个实施例中，内毒素标准物可按照多个浓度存在，其中各浓度存在于盘的独立部分。浓度可以是浊度或生色技术的最低浓度的倍数。在又一实施例中，测试试剂可包括内毒素检测试剂。在另一个实施例中，内毒素检测试剂可以是Limulus变形细胞溶菌产物。
当加料由干燥标准物制成时，样本和试剂的体积与其他分析和校准测试相同。当加料是液体时，它能够作为“热加料”来添加，其是工业中认可的方法，由制造商推荐并且由监管机构接纳。在这种方法中，10倍于预期加料浓度的标准物溶液按照全体积的10%添加到全体积的样本。添加LAL试剂的标准量，并且所产生混合物在通路长度比标准非加料孔要长5%的单元中监测。这模仿微板中使用的热加料方法，其中组合样本和试剂的体积以及因而光柱和通路长度比热加料样本要大5%。
如本说明书所使用的术语“样本”可不仅包括待分析的样本，而且还包括没有呈现与在检测极限所采用的内毒素检测试剂或溶菌产物进行反应的水。非反应水的样本又可称作“LAL试剂水”或“LWR”。
参照图1a-b，示出供测试流体样本中使用的读取器100的一示范实施例。读取器100具有外壳101，其由将读取器100的内部101g与外部光和环境效应、例如温度隔离的不透明和绝缘材料来制成。如能够看到，由于转动控制和监测的简洁性，读取器100设计为紧凑的。
外壳101由前壁101a、后壁101b、底壁101c、右壁101d、左壁101e和顶壁101f组成，其限定读取器100的内部101g。外壳101的顶壁101f和前壁101aa、后壁101ba、右壁101da、左壁101ea的上段限定盖子102，其允许用户访问读取器100的内部以插入和移开包含流体样本的盘103。但是，预计在读取器100的其他实施例中，对读取器100的侧部的访问可通过其他结构、包括但不限于顶壁101f中的门来提供。此外，如能够看到，读取器100还由用户界面113和/或输入装置114、例如计算机组成。
来看图1c-d，图1c中，读取器100的内部内容通过外壳101示出，以示范外壳101中的读取器100的内容的示范配置。图1d示出没有外壳101的读取器100的内部内容。读取器100的内部组件由光具座107、盘103、控制器106和向心盘驱动器115组成。向心盘驱动器115由使轴104转动的电动机105组成。盘103活动地固定到轴104的上部104a，并且由电动机105来转动。光具座107由源110和检测器120组成。用户界面113、输入装置114、监测器105和光具座107由控制器来控制并且与控制器106进行交互。
盘103具有微流体，如以下所述，其包含固定试剂。盘103还具有插孔116，其活动地固定到轴104的上部104a。插孔116能够是孔或其他类型的接口，其能够活动地固定到轴104，由此允许盘103由电动机105来旋转。预计电动机105能够是能够使盘103转动的任何类型的机器致动器。
设置在盘103的外沿117的单独光学室202在光学上由光具座107来监测。光具座107测量当光在盘103转动的同时通过源110和检测器120时光学室中吸收的光。源110由光源108组成，其非限制性地可能是具有可控谱输出的发光二极管(LED)。光源108非限制性地还可以是单色仪，其通过使用根据谱来分割光的装置来提供窄谱范围，并且排除所需频带的之外的那些频率。光源108还能够使得为不同类型的多个光源、可变波长的单个光源或者使用多个光带来增加信号或降低干扰和噪声的其他方法。例如，在多个频率监测光学密度的变化可降低不稳定样本颜色的干扰。这也可使用不同读取器位置中的独立光源和检测器进行。源110还由源光学元件109组成，其能够对这个光进行整形、形成或滤波，以产生更理想的光学系统或者限制干扰。源光学元件109能够包括但不限于光圈、带通或其他光学滤波器、衍射光栅、扩散器、透镜、光纤或其他光导、反射镜或其他这类组件。
检测器120由光检测器112和检测器光学元件111组成。检测器光学元件111能够在光由光检测器112接收之前对光进行整形、形成或滤波，以产生更理想的光学系统或者限制干扰。检测器光学元件111能够包括但不限于光圈、带通或其他光学滤波器、衍射光栅、扩散器、透镜、光纤或其他光导、反射镜或其他这类组件。
此外，光检测器112非限制性地能够是光电二极管或光电倍增管。光检测器112测量经过盘103的光学室202的光的强度。这个强度能够用来对于源110、检测器120、源光学元件109和/或检测器光学元件111所指定的谱来计算每个光学室202中的流体的光吸收率。这通过控制源110和检测器120并且使用控制器106记录检测器120的输出进行。与检测器120在全强度或者以反应在室202中发生之前的室202中的初始条件所接收的光的比较能够用来生成目标吸收(又称作光学密度)，以便用于监测LAL反应。零光透射(盘上完全阻挡光的区域)或者零吸收(没有流体或者没有盘材料的开放通路)的参考值也能够用来客观地校准光具座和盘材料的响应。光检测器120所接收的光经过光学室202(其没有包含任何流体、包含未反应样本或者包含具有试剂的未反应样本)时，光由检测器120在全强度来接收。在另一个实施例中，当光具座107的复本存在于外壳101中并且盘103没有存在于光具座107的复本的源110与检测器120之间时，由源110提供给检测器120的光是也能够由检测器120所接收的光的全强度。
光然后经过盘103中的光学室202，其通常经过由108和109(若存在的话)所形成的光束移动。光学室202具有能够填充有样本和试剂的内部体积，盘103的正面的任一侧的两个光学窗口205在检测器120所感测的光频率是透明的。如能够看到，光学窗口205创建经过光学室202的通路，通过其，由源110所产生的光能够传播、由光学室202的内容来吸收并且由检测器120来接收。诸如窗口、暗场、光圈、透镜、反射器或扩散器之类的光学组件也能够结合到光学室本身中，以提供光路的部分或者增加系统的稳定性或灵敏度。由源110所产生的光束则能够由更多光学元件111进一步修改或聚焦，其包括109的列表，并且能够限制视场或谱，或者以其他方式用来改进或调节光学系统的响应。
在读取器和微流体盘的另一方面，感测方法具有多种光学测量，包括透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光和荧光。在读取器和微流体盘的另一方面，感测方法是能够在旋转盘中远程感测流体的变化的方法，包括更复杂的光学方法(例如拉曼光谱、核磁共振和表面质子共振)和非光学方法(例如电容、磁、音阻和音衍射)。
读取器能够采用读取器之上或附近的用户界面(通常为图形的)113或者任何远程控制器、PC或其他输入/输出装置114来控制。这允许数据输入、数据获取、数据记录、用户控制、用户界面和所有必要的安全性和可溯性，以满足药典要求(由监管机构经由制药药典所进行的规范)。
用于将样本放置在盘中的方法未示出。但是，预期样本可通过许多方法放置在读取器100所包含的盘103中，包括但不限于从移液管注入加标记端口，但是最好在读取器控制下采用防止进行出错的手段进行，例如通过在读取器100的顶壁101f中提供单个样本访问端口或门，并且使读取器100对齐盘103，使得当样本通过读取器100来添加时只能够访问盘103的正确储蓄器325。存在这样做的许多方式，但是全部要求读取器100了解盘103的位置。此外，还需要读取器100了解盘103的位置，以便将光学测量结果与盘103的室202中的样本准确匹配。预计盘103的位置能够通过许多方法来查明，包括但不限于插孔上能够被感测的编码器、标记、窗口或反射镜、能够被监测的磁体或电荷、插孔、轴或电动机的直接监测以及限制将盘安装到插孔上的一个位置的手段、监测电动机驱动器信号以查明它应当移动的量或者监测来自107的光学信号。确定盘103的位置的另一种方法在美国专利申请发表20090139578(2008年7月30日提交，于2009年6月4日发表，并且标题为“CENTRIFUGAL FORCEBASED PLATFORM, MICROFLUIDIC SYSTEM INCLUDING THE SAME, AND METHOD OFDETERMINING HOME POSITION OF THE PLATFORM”)中示出，通过引用将其结合到本文中。
此外，预期在读取器100和盘103的一些实施例中，确定和控制盘103的位置，以用于由读取器100通过使用光学方法来读取和加载样本。例如通过使用具有不透明光学窗口205的单个光学室202结合光具座107或者独立光路，这个光学方法能够结合到主要光路中。此外，预期在盘103和读取器100的其他实施例中，盘103的位置能够使用非光学手段、例如磁体和传感器来确定。
预期在读取器100的一些实施例中，盘103的位置能够使用上述方法的组合来确定。例如，存在于盘103上的单个标记或图案中断指示已经到达盘上的一个位置，其可与发送给电动机105的脉冲数量的跟踪结合使用，其在正常条件下会指示位置。通过监测盘103上的单个标记或图案中断和发送给电动机105的脉冲数量，能够补偿任何“丢失步骤”，从而给出任何时间在读取器100中的盘103的位置的准确近似。
在一实施例中，读取器100包括固定光学组件。固定光学组件可包括低成本LED和光电二极管。读取器100能够包括带通滤波器，以增加光学测量的精度。读取器也能够经过调制或电子斩波，以提供光学噪声的降低、排斥环境光以及排斥杂散光。如能够看到，预期读取器100包括少量光学组件，其产生低成本光具座107，同时使用较高质量部件。
此外，在读取器100的一些实施例中，光具座107能够使用光学斩波，其通过降低1/f噪声(基线漂移)的效应来增加信噪比。斩波能够来自调制源(例如重复导通和截止的LED)，或者它能够来自机械斩波(机械地阻挡和未阻挡的光)。当每个光学室202经过光具座107移动时，旋转盘103提供自然斩波信号。此外，信噪比也能够通过对光具座107的输出进行数字滤波来增加。
盘103中的待测试流体能够通过移液管或者任何能够准确地测量和输送所测量体积的样本流体的其他注入设备来注入储蓄器325。应当理解，待引入到各储蓄器325中的流体的准确测量不是必要的，只要比用于测试所需的要多的流体—而不是要少的流体—添加到储蓄器325。在一实施例中，预定体积的流体引入储蓄器325供测试。在另一个实施例中，储蓄器325完全充满待测试流体，而没有准确测量引入储蓄器325中的流体的体积。
图1e是与控制器106进行交互的组件的框图。如能够看到，控制器106由存储器119以及运行存储器119中存储的程序的CPU 118组成。控制器与用户界面113、向心盘驱动器115、盘103、光具座107和外壳环境增强器121连接。在一些实施例中，输入/输出装置114也与控制器106进行交互。
在一个实施例中，外壳环境增强器由加热器和温度计组成，以用于调节外壳101中的温度。盘103向控制器106提供位置信息。光具座107为控制器106提供与检测器120所接收的光的强度有关的信息。外壳环境增强器121向控制器106提供外壳101中的温度的测量，以及控制器106使用这个信息来确定在外壳101中是否应当激活加热器。用户界面113允许用户为控制器106提供测试参数，并且允许控制器106向用户显示测试结果。向心盘驱动器115向控制器116提供位置信息，并且还准许控制器106调节盘103的转动。
图1f是存储器119中存储并且由读取器100的CPU 118所运行的程序的流程图。在步骤700，CPU 118从存储器119初始化并且检索图1f的程序。在步骤705，经由用户界面113提示用户将盘103插入读取器100中。一旦用户将盘103插入读取器100中并且关闭读取器100，在步骤710经由用户界面113提示用户插入测试参数。一旦CPU 118接收测量参数，在步骤715转动盘，使得储蓄器部分620与读取器100的盖子102中的入口或端口排齐，其仅允许用户将样本插入盘103的正确储蓄器部分620中。经由用户界面113提示和指示用户关于要插入哪一个样本。一旦插入样本，CPU 118指示向心盘驱动器115将盘转动到下一个样本储蓄器位置，并且再次提示和指示用户关于要插入哪一个样本，并且重复该过程，直到所有样本已经插入盘103中。在使用液体试剂的一些实施例中，CPU还将盖子102中的入口或端口与储蓄器部分620排齐，并且经由用户界面113提示和指示用户关于要将哪一个试剂插入储蓄器部分620中。
在步骤720，将盘内容加热到读取器100的外壳101中的最佳反应温度。CPU 118使用加热器和温度计来实现和保持最佳反应温度。一旦所有样本和试剂都加载到盘103的储蓄器部分620中并且外壳101处于最佳反应温度，则在步骤725，CPU 118指示向心盘驱动器115使盘103旋转，直至达到反应速度。反应速度是所有必要流体移入分析或光学室中的转动速度。反应速度可以是特定速度或者一系列离散速度，这取决于流体运动的流体学和机械的细节。如果要求一系列离散速度，则速度的变化可通过增加旋转盘的速度以增加速度并且向外移动流体进行。速度也可通过对盘施加交替高和低力以利用虹吸阀来改变。一旦达到反应速度，样本流体从储蓄器部分620流入了光学室部分635中并且样本流体在与光学室部分635中的试剂发生反应之前在光学室部分635中分析。此外，在步骤725，样本流体在光学室部分635中进行反应的同时被分析。在这个步骤所收集的分析信息又称作反应数据，其存储在存储器119中。
一旦反应数据存储在存储器119中，则在步骤730，CPU检索反应数据，使用反应数据来创建校准曲线，并且然后使用反应数据和校准曲线来计算测试结果。在步骤735经由用户界面113向用户报告测试结果。在步骤735之后，该程序在步骤740结束。
图2示出由读取器100对盘103的光学室202中的样本的吸收的动态监测。如能够看到，旋转微流体盘103包括盘103的外沿117附近的光学室202。光学室202通过光具座107旋转。光学室202能够规则或不规则地间隔开。预期在盘103的一些实施例中，光学室202的间距间隔能够具有不同大小，其能够用来将盘103的位置信息编码到光具座107的输出中。例如，如图2所示，在室202或者室202的编组之间能够存在小间隙203和较大间隙204。小间隙203和较大间隙204将在光具座107的数据流中产生对应的大和小间隙。当源110所产生的光由检测器120接收并且变换为电信号时，创建数据流中的这些间隙。
示范数据流示为图表207上的强度与时间。穿过各光学室202的光的强度作为峰值来记录，其中光学室中的间隙没有这类峰值。这些间隙(或者单个间隙或参考室)的图案则能够由控制器来解释，以确定位置以及可能还有如上所述的其他信息。如在图表207中能够看到，显然能够基于检测器120所接收和变换的光的强度来区分盘103的小间隙203、大间隙204或光学室202经过光具座107时的时间周期。要理解，在其他实施例中，取决于光学室202之间存在的盘103的材料的光透射性质和光具座107的配置，间隙能够作为峰值来记录，以及穿过每个光学室202的光能够解释为谷值。这是可接受的，因为仍然显然能够基于检测器120所接收和变换的光的强度来区分盘103的小间隙203、大间隙204或光学室202经过光具座107时的时间周期。
图7示出具有插孔116、索引标记122以及围绕盘103的整体的多个径向测试区域303。索引标记122允许读取器100查明盘103的位置。此外，径向测试区域具有流体网络600，其由储蓄器部分620、分配网络部分625、计量部分630和光学室部分635组成。储蓄器部分620与分配网络部分625流体连通并且处于其上游，分配网络部分625与计量部分630流体连通并且处于其上游，以及计量部分630与光学室部分635流体连通并且处于其上游。储蓄器部分620保留样本，直到盘103的转动速度将样本流体发送给分配部分625，其将样本流体分配到计量部分630中的各种等分流体。将计量部分630中创建的等分试样发送给光学室部分635，其中将试剂与样本流体相混合，并且分析反应。
要理解，在一些实施例中，储蓄器部分620、分配网络部分625、计量部分630和光学室部分635可重叠。例如，预计在流体网络600的一些实施例中，网络部分625和光学室部分635中的流体能够形成等分试样。此外要理解，阀可存在于储蓄器部分620、分配网络部分625、计量部分630和光学室部分之间。阀的示范实施例包括爆破阀（burst valve）、虹吸阀、通过疏水表面利用等离子体蚀刻所生成的被动阀、疏水多孔隔膜和机械阀。
图3示出微流体盘103的一实施例的布局，在盘103的中心具有用于插孔116的孔，以用于活动地安装到读取器100的轴104。单独样本、样本的部分、参考可控制或者参考或控制的部分通过分隔到测试区域303中的光学室202的编组来分析。在圆形103的典型实施例中，径向测试区域303按照径向图案来布局。但是，预计本领域的技术人员能够选择另一种图案。样本或参考放置在储蓄器325中，更靠近盘103的插孔116。当使盘103旋转时，流体将经过开放分配通道305朝盘103的外沿117移动。在一些实施例中，分配通道305还包括在样本朝光学室202移动时量出或等分试样的室。在本说明书中提到各种类型的分配通道或者通道。类型包括主要分配通道、废料入口通道、等分入口通道、光学室入口通道等。各种类型的通道在本说明书的其他部分描述。
在盘103的大多数实施例中，插入储蓄器325的样本通常将分为等分试样，其中各等分试样被输送到独立光学室202。这归因于如下事实：当前药典要求是使各样本被分析四次，两次没有添加而两次添加了正控制。这对校准和负控制分析也是便利的，因为这些的“通用”实现可要求使用LAL试剂水作为样本的十二(12)个分析，其能够易于通过使用相同布局的3组4个分析来实现，其中三个储蓄器325提供有样本，以及各储蓄器325中的样本分为四个等分试样并且提供给单独光学室202，由此创建必要的十二(12)个分析。预期盘103的一些实施例可采用来自单个较大储蓄器325的12宽布局，其中单个储蓄器325提供有样本，以及样本分为十二个等分试样并且提供给单独光学室202，由此创建必要的十二(12)个分析。设想在对12个分析提供样本的实施例中的储蓄器325将比对四个分析提供样本的实施例中的储蓄器325要大。
在盘103的一些实施例中，阀控制流体网络600中的流体的流动。阀可实现成执行例如暂时或永久停止流体的流动以调节流体经过盘103的流动以及盘103中发生的反应过程的动作。一种类型的阀是爆破阀。爆破阀使用通道表面能量和毛细力来控制流体流。已知毛细作用通过沿小通道向上以毛细作用传送或者以其他方式吸取流体来传输流体。流体的表面张力提供激发力，因为流体想要湿润通道壁，由此流体沿通道向上自行吸取，直到通道中的压力等于表面张力激发力。通过从疏水材料来构成通道或者采用疏水材料而不是亲水材料来涂敷通道壁，相同表面张力也能够用来阻止流体流经通道。疏水材料排斥水，而亲水材料吸引水(湿润)。一种示范疏水材料是疏水多微孔隔膜，其因材料孔大小而允许空气而不是水通过。疏水微多孔隔膜孔的小尺寸要求采取毛细压力形式的大压力来迫使水经过孔。这个毛细压力与通道中的流体的表面能量、通道材料或内部通道涂层的表面能量以及通道的大小和几何结构相关。在另一个盘实施例中，可使用虹吸阀。
盘103可由多种材料制成，包括但不限于聚苯乙烯、环烯烃共聚物和乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯。在盘103的一些实施例中，可添加碳以使聚苯乙烯变黑，以帮助光吸收率方法。
图3中，储蓄器部分625由储蓄器325组成。此外，分配网络部分625由分配通道305组成。此外，计量部分630由分配通道305和光学室202组成。最后，光学室部分635由光学室202组成。
图4示出具有爆破阀404的通道401的一实施例。如能够看到，通道401由上游段402、爆破阀404和下游段406组成。通道401具有由采用不同材料所制成或涂敷的壁，其中沿其长度具有不同表面能量。上游段402和下游段406是亲水的、即易于湿润，而爆破阀404是疏水的、难以湿润。经过通道401从上游传播到下游(沿箭头方向)的水将通过毛细力、离心力、来自上游的压力或者来自下游的真空来吸取到上游界面403，其中上游段402和爆破阀404相接。液体移动到上游界面403之外所需的压力将是爆破阀404的毛细压力与上游段402的毛细压力之间的差。如果差大于流体的激发力，则流体将不会流经上游界面403，直到例如通过使盘103更快地旋转来战胜压力差为止。一旦流体流经下游界面405(其中爆破阀404和下游段406相接)，毛细压力返回到原始压力，并且爆破阀404不再具有对通道中的流体流或压力的任何作用。
备选地，爆破阀能够使用均匀表面能量的材料并且改变通道的直径或几何结构来构成。在这些情况下，通道通常向上通向大许多的室，其因尺寸而具有低或零毛细力。
其他值能够用于盘103中，包括但不限于被虹吸、通风孔、止回阀、室、安全阀、油绳或者在盘103沿一个方向旋转(由于科里奥利效应对盘中力和压力的影响)时才被激活的亲水多孔构件或者由机械或电致动所控制的主动阀。在一个实施例中，阀能够是虹吸阀，其中盘的转动速度的变化激活该阀。此外，其他阀能够用于盘103中，包括但不限于一次控制阀，其能够使用在通道中放置气泡来防止流动，和/或能够使用与水接触膨胀的聚合物来直接封锁通道、经过隔膜间接封锁通道以避免污染的可能性或者在样本已经离开区域之后通过为此目的分隔小体积样本来间接或直接封锁通道。此外，盘103的一些实施例将主动组件、例如通用阀或现场泵用于盘103中的流体控制。
图5示出将爆破阀用于控制流体网络600的盘103的一实施例的流体网络图。盘103在各径向测试区域303中具有围绕插孔116所设置的流体网络600。为了简洁起见，流体网络仅在一个径向测试区域303中示出。样本或试剂对各测试区域303添加到储蓄器325。储蓄器出口通道503可端接在第一阀490中的下游端。第一阀490位于储蓄器出口通道503和分配网络506的相交处。储蓄器出口通道503提供流体从储蓄器325流动到分配网络506的通路。第一阀490能够是有选择地允许储蓄器325的流体传递到分配网络506的任何阀。分配网络506是将储蓄器325的内容输送到径向测试区域303中的一系列光学室202的通道的网络。
在一个实施例中，第一阀490是爆破阀，其设计成使用储蓄器通道表面的材料的表面能量以及通道的直径和几何结构来阻止流体流动，直到盘103以充分速度旋转以战胜爆破阀。这防止流体在不可控和未知时间流入光学室202、由此在反应能够被监测和准确定时之前开始反应。在又一实施例中，阀可以是虹吸阀。
在另一个实施例中，第一阀490能够作为通过利用等离子体蚀刻的疏水表面处理(其采用适合于微流体系统的可湿性梯度来操纵表面，例如在“‘Smart’ PolymericMicrofluidics Fabricated by Plasma Processing: Controlled Wetting, CapillaryFilling and Hydrophobic Valving”(Katerina Tsougeni等人，2009年11月30日)中所述)所生成的被动阀来形成。本领域的技术人员应当理解，第一阀490能够通过表面处理储蓄器出口通道503与分配网络506之间的通道或者通过定位在通路中的物理势垒或隔膜来形成。在又一实施例中，第一阀490是机械阀，其能够有选择地手动、电或者其上的压差而起动，以允许流体在储蓄器出口通道503与分配网络506之间流动。在又一实施例中，第一阀490是定位在储蓄器出口通道503与分配网络506之间的通路中的隔膜。
盘103以充分转动速度旋转，以将流体通过射流移动。更具体来说，将流体从储蓄器325、经过储蓄器出口通道503、通过第一阀移入分配网络506，其将流体导向盘103的外沿117附近的四个光学室202，其中反应发生。具有较高压力第二阀491的通风管507允许空气从光学室202排出，同时防止样本流出光学室202，由此将样本保留在盘103中。在一些实施例中，第二阀491是爆破阀。预期在其他实施例中，第二阀491能够是疏水隔膜，并且还用来防止样本经过通风管507流出光学室202。此外，在其他实施例中，第二阀491能够是定位在通路中或者从通风管507的表面处理所形成的机械阀、隔膜、插入件或膜。每个第二阀491能够手动或电起动，或者能够因其上的压差而起动。
第二阀491的示范实施例可以是爆破阀、通过利用等离子体蚀刻的疏水表面处理所生成的被动阀、疏水多孔隔膜、机械阀或者在防止样本流出光学室202的同时充分允许空气逸出光学室202、由此将样本保留在盘103中的任何其他类型的阀。在这个实施例中，试剂和标准物通过在光学室202的表面进行干燥来固定在光学室202中。科里奥利效应能够用来主动盘旋和混合光学室202的内容，其使内容变成溶剂化物并且使其进入溶液以起反应。备选地，流体的惯性能够通过改变速度或者反转转动来帮助涡流。任何过量流体只存储在分配网络506中，并且由于受限扩散(所述的分子较大并且通过扩散极缓慢移动)而没有参与这些反应。这样，对准确结果是关键的样本体积通过光学室202的体积来控制和支配。如能够看到，光学室202还充当反应室。在光学上监测在光学室202中发生的反应。在一些实施例中，光学监测使用大约405 nm的蓝光来执行。但是，预期本领域的技术人员能够选择使用不同的光波长。
多个干燥过程适合于将标准物和试剂固定在光学室202中，包括但不限于在环境温度下的真空干燥过程或者冷冻干燥过程(冻干法)。在又一实施例中，标准物和试剂可在环境温度下干燥或者冷冻干燥。在一些实施例中，材料(标准物和试剂)不需要完全干燥，特别是在使用非水溶剂时，但是通过部分干燥或其他方法，保留在或者改变成它能够物理固定的状态。
图5中，储蓄器部分由储蓄器325组成。此外，分配网络部分625由第一阀490和分配网络506组成。计量部分由分配网络506和光学室部分635组成。此外，光学室部分635由光学室202组成。预期存在与图5有所不同的许多其他流体方案。
有时，不同试剂或者试剂的部分需要单独存储或混合以获得更好性能或保存期。例如，如果内毒素标准物在与试剂混合之前与样本相混合，则响应会更紧密匹配样本内毒素，从而增加精度。其他时间，液体试剂可需要用来代替干燥或者固定的材料。针对这种情形的一个实施例在图6中示出。
测试试剂和标准物沉积的许多方式可用来减少混合时间、气泡形成、再增溶时间、易于制造和检测灵敏度。方式可包含产生预期结果的化学和物理手段。化学手段可包括使用化学添加剂。化学添加剂的示例包括溶解度增强剂(例如糖类蔗糖、葡萄糖、乳糖和甘露醇)以及抗剥落剂(例如包含聚(乙撑氧)、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟基丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素的水聚合物溶液)。物理手段可包括沉积过程期间的各种涂层、溅射或者干燥技术。
在一些实施例中，内毒素检测试剂可沉积在每一个光学室202中。备选地，在光学室的任一个中不存在内毒素检测试剂，从而允许用户添加来自优选供应商的内毒素检测试剂，如与LAL试剂份额匹配的控制标准物内毒素(CSE)或者参考标准内毒素(RSE)，其是通用参考并且具有相同滴定度，而与所使用的LAL试剂无关。在一个实施例中，内毒素检测试剂可以是变形细胞溶菌产物。LAL的自然吸收的使用或者浊度或生色非LAL反应示踪剂、例如荧光染料对LAL和内毒素的添加也可用来降低测试误差。示踪剂是惰性化合物，其被添加到流体以帮助确定体积、流体位置和移动(流体运动)。示踪剂也可用来帮助验证测量数据。适当的示踪剂包括但不限于染料。
内毒素标准物可以仅沉积在光学室202的一部分中。另外，内毒素标准物可按照各种浓度逐个光学室202来沉积。光学室202可预先加载或者预先沉积有内毒素标准物，其中内毒素浓度逐个光学室202改变，使得用户只需要将待测量样本添加到储蓄器325。在一个实施例中，内毒素检测试剂和内毒素标准物可沉积在光学室202中，使得USP 85所要求的所有测试和复本可以只通过将样本添加到储蓄器325来执行。在这种实施例中，每个光学室202包括独立的给定测试或者给定测试的复本。
在一个实施例中，可在四个复本中确认最低浓度，其中九十六(96)个光学室202的四(4)个各包括一个复本。备选地，光学室202可预先加载有内毒素标准物，使得可执行包括复本的抑制/增强测试(或“加料”)。备选地，可预先加载光学室202，使得可执行定量测试，其中量化给定样本中的细菌内毒素的浓度。在又一实施例中，可预先加载光学室，使得根据USP 85所要求的所有测试和复本、包括溶菌产物灵敏度、抑制/增强和定量测试可在同一盘103上执行。
测试试剂和标准物可在沉积之前与化学添加剂、例如溶解度增强剂和抗剥离剂相混合。试剂和标准物沉积在盘103中而没有干扰光学窗口205或者光具座107，由此允许初始样本吸收测量。在一个实施例中，盘103可覆盖有密封部件，其防止水和氧的通过，由此盘103及其内容可保持干燥到小于大约5%的湿度水平。
盘103中的流体激发可通过向心力来提供，其通过盘103中的流体的位置和盘103的转动速度来确定。通过向心力的流体激发能够由读取器100准确和重复地控制，并且允许诸如反转转动方向或者盘103的转动速度之类的情况，以改变样本经过盘103的流动。
如能够看到，图6中的盘103与图5中的盘103相似，只不过径向测试区域303中的流体网络600是不同的。为了方便起见，只有一个流体网络600仅在一个径向测试区域303中示出，但是要理解，流体网络600存在于各径向测试区域303中。储蓄器325接收样本，以及第一阀490处于储蓄器出口通道503的下游端。第一阀490处于主要分配通道604的上游端，以及第二阀491处于主要分配通道604的下游端。四(4)个等分入口通道606的上游端与主要分配通道604相交并且从主要分配通道604接收样本流体。各等分入口通道606将样本流体输送到等分室607。此外，各等分室607在等分室通风管508的末端具有第四阀493或疏水隔膜。第三阀492位于等分室607的下游端。光学室入口通道611的上游端经过第三阀492接收样本流体，并且将流体输送到光学室202供测试。废料室入口通道609的上游端经过第二阀491接收废料流体，并且将废料流体向下游输送到废料流体室610。此外，废料流体室610在废料室通风管510的末端具有第六阀495或疏水隔膜。
在操作中，第一阀490防止样本经过分配网络506的过早流动。第一阀490、第二阀491和第三阀492设计成在随流体向下游移动而增加的不同压力下进行操作，使得当它越过它用阀调节的一个时，它仅移动到下一个阀但不超出。在这种情况下，经过第一阀490移动所需的压力比第二阀491所需的要小，它们两者均比穿过在通向光学室202的光学室入口通道611的头端的第三阀492所需要的要小。每个光学室202在其通风管507的末端还具有第五阀494或者疏水隔膜，以防止来自光学室202的流体经过通风管507损失。
一旦盘103开始以充分速率旋转，流体从储蓄器325沿储蓄器出口通道503向下移动，并且经过第一阀490沿主要分配通道604向下移动到等分入口通道606，其将流体分配到等分室607。这些室能够仅用于体积测量，或者它们也能够具有在其中隔离的试剂(例如内毒素标准物)，以便在等分室607中或者稍后在光学室202下游使用如前面详述的科里奥利效应进行混合。流体将不会传播通过第二阀491或第三阀492，直到盘103的转动速度足以生成足够压力以移动第二阀491或第三阀492。一旦盘103以允许流体流过第二阀491而不是第三阀492的速度旋转，过量流体将从等分室607排出并且进入废料流体室610，由此将空气吸入分配网络506。盘103然后以允许流体流过第三阀492的速度甚至更快地旋转，以及来自等分室607的样本流体的准确体积向下游流入光学室202，也许具有也在其中混合的、存在于等分室607中的试剂。反应然后将在光学室202中发生并且被监测。
样本流体在移入光学室202之前可需要经由等分来计量的一个原因在于，如果LAL试剂作为液体在实际分析而不是在盘103固定时输送到盘103。使用LAL液体试剂涉及移动和准确计量盘103中的样本流体和试剂。这可通过将第二层添加到盘103(图6所示)进行。在一个实施例中，这个第二层包含LAL试剂的平行流体通路，其与以上所述供与样本流体一起使用的流体通路相似或相同。独立层上的两个平行通路在由两个流体系统共享的光学室202相接。相应地，样本流体系统将样本流体输送到光学室202，以及试剂系统将LAL试剂输送到光学室202。两者均具有通向光学室202的通道，并且当第三阀492的压力被取得充分转动速度的盘103超过时部分填充光学室202。这两个流体然后在光学室202中混合在一起，并且所产生反应被监测。
在一些实施例中，第一阀490、第二阀491和第三阀492能够是定位在通道中或者从通道的表面处理所形成的机械阀、隔膜、插入件或膜。第一阀490、第二阀491和第三阀492能够手动或电起动，或者能够因其上的压差而起动。第一阀490、第二阀491和第三阀492的任一个的示范实施例可以是爆破阀、通过利用等离子体蚀刻的疏水表面处理所生成的被动阀、机械阀等。
在一些实施例中，第四阀493、第五阀494和第六阀495是爆破阀。预期在其他实施例中，第四阀493、第五阀494和第六阀495能够是疏水隔膜，并且还用来防止样本经过通风管流出其相应室。此外，在其他实施例中，第四阀493、第五阀494和第六阀495能够是定位在通风管中或者从应用于通风管的表面处理所形成的机械阀、隔膜、插入件或膜。第四阀493、第五阀494和第六阀495能够手动或电起动，或者能够因其上的压差而起动。第四阀493、第五阀494和第六阀495的示范实施例可以是爆破阀、通过利用等离子体蚀刻的疏水表面处理所生成的被动阀、疏水多孔隔膜、机械阀或者在防止样本流出通风管的同时充分允许空气逸出其相应室、由此将样本保留在盘103中的任何其他类型的阀。
即使结合图6仅论述最左等分入口通道606、等分室、光学室入口通道611、光学室202和第三阀494，也要理解，右边的三组对应结构具有同样功能。
图6中，储蓄器部分620由储蓄器325和储蓄器出口通道503组成。分配网络部分625由第一阀490和主要分配通道604组成。计量部分630由等分入口通道606、等分室607、第二阀491和第三阀492组成。光学室部分635由光学室入口通道611和光学室202组成。
来看图8，盘103示为具有光学室202的一实施例，其中具有盘103的顶侧和底侧的入口611、通风孔507、侧壁206和光学窗口。在一些实施例中，侧壁206具有围绕光学室202的整体的一般圆形形状。但是，在其他实施例中，入口与通风孔507之间的侧壁206的插孔侧是直的，以及侧壁206的其余部分是一般“U”形的。
使用读取器100和盘103的示范测试过程或方法在图9a中示出。在步骤800，用户提供盘、读取器和待测试样本。在步骤805，用户将盘103插入读取器100。来自盘103的信息、例如份额、范围或到期日期能够从标记或者盘中存储的信息手动或自动传递到读取器。读取器100在步骤815转动盘103，使得储蓄器部分620与读取器100的盖子102中的入口或端口排齐，其仅允许用户将样本插入盘103的正确储蓄器部分620中。经由用户界面113提示和指示用户关于要插入哪一个样本。在使用液体试剂的一些实施例中，CPU还将盖子102中的入口或端口与储蓄器部分620排齐，并且经由用户界面113提示和指示用户关于要将哪一个试剂插入储蓄器部分620中。
在步骤815，将盘内容加热到读取器100的外壳101中的最佳反应温度。CPU 118使用加热器和温度计来实现和保持最佳反应温度。一旦所有样本和试剂都加载到盘103的储蓄器部分620中并且外壳101处于最佳反应温度，则在步骤802，CPU 118指示向心盘驱动器115使盘103旋转，直至达到反应速度。样本流体在流体与光学室部分635中的试剂发生反应之前在光学室部分635中被分析，并且样本流体在光学室部分635中发生反应的同时被分析。在这个步骤所收集的分析信息又称作反应数据，其存储在存储器119中。
一旦反应数据存储在存储器119中，则在步骤825，CPU检索反应数据，使用反应数据来创建校准曲线，并且然后使用反应数据和校准曲线来计算测试结果。在步骤830经由用户界面113向用户报告测试结果。
图9b和图9c对图9a中的步骤820进行详细说明。图9b详述图9a的方法的实施例中在步骤820进行的动作。在步骤815a，样本流体从储蓄器部分传递到计量部分，并且创建等分试样。这能够通过使盘103以充分速度转动进行，使得样本流体从储蓄器部分620经阀流入计量部分630。在盘103的一些实施例中，废料流体室610存在，并且一旦旋转盘103达到充分速度，则来自储蓄器部分620和分配网络部分625的其余流体经阀流入废料流体室610。
在步骤815b，在创建样本流体的等分试样之后，等分试样从等分试样部分630传递到光学室部分635。这能够通过使盘103以充分速度旋转进行，使得样本流体的等分试样经阀从计量部分630流入光学室部分635。
在步骤815c，一旦样本流体的一部分处于光学室部分635中，样本流体在流体与光学室部分635中的任何试剂进行接触和/或反应之前使用分光光度计或者任何其他光测量过程来分析。在步骤815d，样本流体在光学室部分635中连续分析，直到样本流体的完整等分试样已经完成在每个光学室部分中的反应并且反应数据被存储。
图9c详述图9a的方法的实施例中在步骤820进行的动作。在步骤815e，样本流体经由分配网络部分625从储蓄器部分620传递到光学室部分635。这能够通过使盘103以充分速度转动进行，使得样本流体从储蓄器部分620流入光学室部分635。在一些实施例中，阀存在于储蓄器部分620与光学室部分635之间。
一旦样本流体的一部分处于光学室部分635中，则在步骤815f，样本在流体与光学室部分635中的任何试剂进行接触和/或反应之前使用分光光度计或者任何其他光测量过程来分析。样本流体然后在光学室部分635中连续分析，直到样本流体已经完成在每个光学室部分635中的反应并且反应数据被存储。
回到图3和图5-7所示的盘103，在盘103的一些实施例中，LAL试剂固定(例如干燥)在光学室202中，并且使用科里奥利效应对光学室202中的流体将具有的循环与样本流体相混合。还有可能通过使用光学室202中的流体的惯性并且通过改变转动速度或者反转盘103的转动方向以来回“摇动”光学室202中的流体，来增加光学室202中的这种混合。
在光学室202的一些实施例中，能够通过在光学室202中特意携带气泡或者将小珠添加到光学室202(其能够是磁性的并且随着旋转盘经过固定磁体而移动)中的其中之一或两者，来增强光学室202中的混合的积极性。在一些实施例中，光学室202中的小珠由附连到磁体的材料(例如铁磁或亚铁磁材料)来组成，由此小珠将在它们移过固定在读取器100中的磁体时被搅拌。能够采用进出光学室的流体运动、例如经过孔口或通道的室之间的往复流动来增强混合。不仅这混合通过任何通道中的扩散或者开放区域的湍流所传递的流体，而且传递混乱地干扰科里奥利涡流，从而增加其混合效率。
如能够看到，光学室202中的混合能够使用科里奥利效应进行，并且能够是非常主动和积极的，其帮助将缓慢扩散的大分子与聚合的分子以及粘附表面的分子相混合。
在盘103的一些实施例中，光学室202可以是较宽或较厚的，由此形成较长光路，由此引起更大灵敏度。预期在盘103的一些实施例中，光路长度与灵敏度要求匹配。
在盘103的附加实施例中，混合在位于光学室202上游的混合室中执行。预期光学室202和混合室(若存在的话)能够对较厚段(例如较长光路长度)来优化和/或对与固定在内部表面上的试剂的混合来优化。在一个实施例中，试剂可固定在窗口上或者侧壁206上。较厚光学室202和混合室允许交替固定化设计，例如允许使用粉末试剂。
在其他实施例中，光学室202中的流动模式也可通过改变光学室202的几何结构来修改成例如在试剂被固定的表面之上具有更大流动速度。在一个实施例中，光学室202的侧壁206可成角度，使得通过侧壁206所构成的流体流可成角度，使得侧壁206所构成流体流沿与光学室202中流体的正常循环方向不同的方向或者横向移动。在光学室202的附加实施例中，光学室202中的叶片、通道或空隙也可用来使流体与其正常循环相反地移动，并且增加光学室202中的混合的效能。在其他实施例中，侧壁206的几何结构促进流路，其有效地混合接近侧壁206的表面的材料。
光学室202配置成当流体的一部分定位在光学室202中时允许流体使用分光光度计在光学上分析和监测。光学室202配置成允许准确光学密度测量，并且还能够用来固定试剂固定化或者作为流体的混合室。光学室202提供在所有分析阶段监测流体的光学密度的能力，包括：(1)在添加(一个或多个)试剂或者与其混合之前，以便获得材料和读取器基准数据；(2)在添加和混合试剂之后但在试剂溶解之前，以获得流体基准数据；以及(3)在分析和测试过程期间连续监测流体。在添加或混合试剂之后但在试剂溶解之前，光学室202能够用来分析因从光学室202的表面的光学反射的变化而存在于其中的流体。这能够进行，以提供改进后续光学测量的定时的精度的起始点。光学室202能够用来通过使用在正常光学监测波长的自然吸收来检验或检查试剂的正确量，在正常光学监测波长使用示踪剂，在交替光学监测波长使用自然吸收，和/或在交替光学监测波长使用示踪剂。光学室202中的流体的连续监测能够比标准多用途板读取器要更为频繁地进行，以便提供改进的时间分辨率、更好的噪声抑制以及准确外推到数据的端点的更大能力。外推能够使用曲线拟合技术来执行，例如回归法、加权最小平方法、数据变换方法以及参数和非参数方法。光学室202中的流体的连续监测也能够采用读取器100中的固定光学器件进行。
在本发明的一个方面，公开一种供与向心微流体系统一起使用的微流体盘。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个测试通道的分配网络，其中各测试通道具有计量部分和至少一个分析室部分。分析室部分可包括用于混合样本和试剂的混合室以及与光学读取器兼容的光学室部分。混合室和光学室部分可以是独立的、互为整体或者是用于混合功能和光学室功能的相同室。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供分析室部分中分析。至少一个测试通道部分具有在其中隔离的至少一个试剂。试剂可包括LAL反应物质。
在盘的另一个实施例中，至少一个分配网络是包括至少八(8)个测试通道的校准网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量。所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
在盘的又一实施例中，至少一个分配网络是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的带LAL反应物质的第四数量的加料。在另一个实施例中，第一、第二、第三数量可以是相同或不同的。如果使用内毒素，则第一数量可选择成使得当内毒素处于溶液中时，浓度范围从0.005至0.5 EU/mL。类似地，第二数量的范围可从0.05至5.0 EU/mL，以及第三量的范围可从0.5至50 EU/mL。
在微流体盘的另一个实施例中，至少一个阀可定位在a)储蓄器部分与分配网络部分和/或b)计量部分与分析室部分之间。阀可配置成允许离心力激发等分试样流经阀从计量部分到分析室部分。
在又一实施例中，分析室部分全部可包括混合室和光学室。混合室可具有在其中隔离的至少一个附加试剂。附加试剂可包括检测试剂。混合室可具有对于将固定在侧壁上的检测试剂与等分试样相混合所优化的厚侧壁。厚侧壁可促进混合接近厚侧壁的试剂和等分试样的流路。在另一个实施例中，分析室可配置成实现使用科里奥利效应、惯性效应或者其中携带的气泡和/或空泡中的至少一个将等分试样与试剂相混合。
在又一实施例中，分配网络部分还可包括主要分配通道、废料入口通道和废料室，以用于限定任何过量流体样本并且将余量与等分试样分离。在另一个实施例中，盘可配置成允许离心力从光学室部分中的样本流体中消除气泡。
在另一个实施例中，公开一种配置成测试微流体盘中的流体样本的读取器。该读取器可包括外壳、光具座、向心盘驱动器和控制器。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个通道的分配网络，其中各通道具有计量部分和至少一个分析室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供分析室部分中分析。
在读取器和微流体盘的另一方面，感测方法具有多种光学测量，包括透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光和荧光。在读取器和微流体盘的另一方面，感测方法是能够在旋转盘中远程感测流体的变化的方法，包括更复杂的光学方法(例如拉曼光谱、核磁共振和表面质子共振)和非光学方法(例如电容、磁、音阻和音衍射)。
在另一方面，外壳可包括用于将流体样本插入盘的储蓄器中的入口。入口和读取器可配置成防止用户将流体样本插入不正确储蓄器中。
在读取器的又一实施例中，至少一个分配网络可以是包括至少八(8)个测试通道的校准网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量。通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
在读取器的另一方面，至少一个分配网络可以是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络。通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质，以及通道的至少两(2)个具有在其中隔离的带LAL反应物质的第四数量的加料。
在本发明的又一实施例中，公开一种用于测试LAL反应物质的至少一个流体样本的方法。该方法可包括将微流体盘插入光学读取器中。该微流体盘可包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括用于接纳至少一个流体样本的储蓄器部分。储蓄器部分可包括储蓄器和储蓄器出口。盘还可包括与储蓄器部分流体连通的分配网络部分。各分配网络部分可包括至少四(4)个测试通道的分配网络，其中各测试通道具有计量部分以及包括光学室的至少一个分析室部分。计量部分可确定大小成计量流体样本的等分试样，供光学室中分析。
读取器可包括外壳、光具座、向心盘驱动器、用于将所述流体样本引入所述盘中的入口以及控制器。流体样本插入读取器的入口中。读取器使盘旋转，直至达到反应速度。读取器使用光具座来分析光学室中的等分试样，以得到测量数据和/或反应数据。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个实施例中，包括检测试剂和/或LAL反应物质的至少一个试剂可引入读取器入口中。读取器可使盘旋转，直至达到反应速度。允许等分试样与检测试剂发生反应。等分试样可在光学室中使用光具座来分析，以得到测量数据和/或反应数据。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个方法实施例中，至少一个光学室具有在其中隔离的至少一个试剂。试剂可包括LAL反应物质和/或检测试剂。在又一实施例中，该方法还可包括将流体样本从储蓄器传递到计量部分并且计量所述等分试样。等分试样可从计量部分传递到光学室。等分试样可在光学室中使用光具座来连续监测以得到测量数据和/或反应数据，直到等分试样完成了反应。测量数据和/或反应数据和校准曲线可用来计算测试结果。读取器则可报告和/或存储测试结果。
在另一个方法实施例中，测量数据和/或反应数据可包括等分试样体积、反应动力学、流体运动、透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光、荧光和磁共振。该方法和/或所述测量数据和/或反应数据可使用历史测量数据和/或来自已知反应动力学的数据来验证。在又一实施例中，示踪剂可固定在分析室中，以帮助测量和验证等分试样体积。
示例
以下示例示范内毒素标准物预先加载到盘103中的一实施例。内毒素标准物在表1中示出。但是，内毒素标准物范围在其他实施例中可以是不同的。
表1
范围(EU/mL) 最低(EU/mL) 中间范围(EU/mL) 最高(EU/mL)
0.005 - 0.5 0.005 0.05 0.5
0.01 - 1 0.01 0.1 1
0.05 - 5 0.05 0.5 5
0.1 - 10 0.1 1 10
0.5 - 50 0.5 5 50
如上所述，盘的一示范实施例包括其中形成的二十四(24)个测试区域303，其中各测试区域303配置成测试独立流体。表2示出具有二十四(24)个测试区域303的盘103的每个光学室202中的试剂，其中各测试区域包括四(4)个光学室202。
图5示出具有二十四(24)个测试区域303的盘103的每个光学室202中的试剂的另一个实施例，其中各测试区域303包括四(4)个光学室202。表1示出最低、中间范围和最高内毒素水平取决于特定盘103的范围，其中盘103中的范围水平对各测试区域303是相同的。不同范围的单位按照EU/mL(每毫升内毒素单位)。对校准复本求平均，以生成校准曲线。负控制与最低校准水平相比必须在统计上是不同的。对各报告值来对样本分析复本求平均。对正控制加料求平均，以及加料分析与基本分析之间的差必须在有效分析的中间范围值的50%和200%之内。表2和表3所示的各盘103的校准曲线基于三重控制。表1针对盘103，其中各测试区域具有包含待测试样本流体或LAL试剂水(其被输送到测试区域303中的四(4)个光学室202)的储蓄器325。表2针对盘103，其中四(4)个测试区域303的四(4)个光学室202提供有来自一(1)个共享储蓄器325的LAL试剂水。
各盘103包含至少一个样本流体，其本身由标准分析的至少两个复本和两个正控制、即加料有内毒素组成；以及采用至少3个点和负控制(空白)所形成的校准曲线，各具有至少2(或3)个复本（Rep）。
表2
表3
在读取器100中的盘103的测试过程期间，当流体定位在光学室202中供光学分析时，读取器100配置成进行光学测试，例如光学光谱、记录所分析数据，并且编译所记录数据。
与用于测试细菌内毒素以及任何其他流体测试的标准微板方法相比，盘103和读取器100提供更快的分析时间。盘103要求比同板要少许多的配制时间，从而引起更少的污染机会、更易于集成到其他实验室任务中以及更低的成本。盘103和读取器100满足浊度或生色技术的USP <85> 细菌内毒素测试的所有有效测试要求，包括预备测试，其包括确保校准曲线的标准和干扰因素的测试。这包括检验测试过程、计算、解释，以及结果在LAL试剂水的情况下小于025 EU/ml，并且在产品的情况下，内毒素小于产品的极限。各流体样本、空白和校准内毒素测试在读取器100内部验证，其包括验证测试(包括但不限于样本关键光学质量空白读数、混合样本/试剂/可选内毒素、初始光学读数、关键光学质量的变化和变化率的平滑性、与理论预计变化的拟合的紧密度、对数据的噪声等级的预计等)的部件。如果测试结果看来不正确，则盘103的测试过程将停止，并且差错消息将发送给用户界面113和/或输入装置114，而没有产生内毒素测量结果。不存在试剂到窗口205上的附连，以允许在添加试剂或者试剂与流体相混合之前对流体样本的初始关键光学质量测量。
如本文所使用的“验证”表示证实、确认分析或分析的进度或者建立分析或分析的进度的确定性。当验证分析的适合性时，可使用药典方法，要求其中至少两个正控制(在校准范围的中间加料有LAL反应物质的样本)、三个负控制(空白)以及制造商或药典所指定的任何其他参数。正产品控制加料必须满足药典要求(50%与200%之间的加料产率)、负控制(最低水平与空白之间的差，其中空白具有较低响应水平)和制造商规范(例如0.005 EU/mL样本与空白之间的差或者某些标准物的开始时间极限)。如果这些分析成功，则它们验证系统和试剂按规范进行操作。验证数据流意味着，数据流的行为令人满意地对应于基于历史测量数据或者检测试剂与LAL反应物质之间的反应的已知反应动力学的预计行为。这表明，数据流通过基于LAL反应的分析室中的变化而不是基于某个异常、例如气泡的室或光路中的变化来生成。最终，这个区分本身通过对不同试剂和份额及引起的异常的多个测试来验证，以确认其操作，包括但不限于样本关键光学质量空白读数、混合样本/试剂/可选LAL反应物质、初始光学读数、关键光学质量的变化和变化率的平滑性、与理论预计变化的拟合的紧密度、对数据的噪声等级的预计等。如果测试结果看来不正确，则模块的测试过程将停止，并且将发送差错消息，而没有产生LAL反应物质测量结果。
读取器100和盘103配置成防止通过流体样本引入误差。在一实施例中，读取器100和/或盘103包括用于流体样本的放置的视觉反馈，其可包括着色或标记栏或其他主动光学反馈。读取器100和盘103还配置成使移液误差为最小。
对多个测试自动地等分各流体样本。将各流体样本注入一个储蓄器325中(优选地为大约100 μl的流体)，并且分为流体的4个相等等分试样，以满足USP <85>细菌内毒素测试标准的要求。用户仅将流体样本和LAL试剂水注入盘103。由于用于测试的减少量的流体样本，对测试过程要求类似较少量的试剂，以及减少量的必要试剂产生细菌内毒素的更廉价测试。
读取器100和盘103还配置成预测BET测量结果。读取器100和盘103包括通过监测作为时间的函数的关键光学质量(透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光或荧光)并且应用各种预测算法，来准确预测样本中的内毒素的浓度的部件。预测用来加速对最终结果的测量时间。读取器100和盘103还允许在光学分析期间从噪声的信号提取。读取器100和盘103学提供动力反应模型或其他反应模型的使用。盘103包括使用疏水隔膜以及经过隔膜的多个样本移动的可选主动流体样本除气或者在样本没有移动并且与隔膜静态接触的同时进行除气。
读取器100和盘103包括指示哪一个储蓄器325将要由用户来填充的方式其中具有关联进入读取器100的样本的所输入标签或标识符、结果的自动分析(包括用户和监管要求所需的所有结果的计算、自动报告)的选项。读取器100还允许包括关于盘103、试剂年限和保存期极限的报告的生成。
试剂—包括LAL、内毒素和可选生色试剂等—能够通过任何实用手段(包括将试剂固定到光学室202壁上、添加采取各种形式(小珠)、或者附连到可溶解和不可溶解膜或者插入盘103的形式的可溶解试剂)在盘103中以正确水平预先加载。盘103和读取器100配置成降低或消除污染。盘103包括密封部分，以阻挡水、氧、内毒素和细菌传输到盘103中并且经过盘103传输。
读取器100能够包括加热器或其他设备，以将盘103加热到可控温度，优选地在流体样本的引入之前。读取器100的加热器能够位于轴104(有时称作心轴)中。读取器100的一些实施例经由接近转动盘103的透明层、基于空气的热传递来加热盘103，其是快速和均匀的、较低成本并且易于控制或调节。预期读取器100的一些实施例通过加热外壳或心轴内部来预先加热盘103。读取器100能够配置成在反应之前、期间和结束时测量盘103中的样本的光学密度。
如上所述，盘103能够包括试剂，例如LAL、内毒素和/或生色试剂。通过使用缓慢或快速干燥方法的添加剂的添加，使试剂稳定长保存期。试剂/反应剂能够配置成控制与流体样本重新构成时的溶解速率。能够基于在没有内毒素测量的灵敏度的损失的情况下重新溶解的被证实能力来使用缓慢干燥和快速冻干。从细菌提取热解天然材料能够用来创建快速稳定、防止生物分子聚合并且具有良好稳定性的材料。这些提取物能够是来源于许可LAL制造商、匹配LAL试剂份额的控制标准物内毒素CSE或者通用并且无需与份额匹配的参考标准物内毒素RSE。RSE的使用允许装置的制造，其能够与任何LAL试剂一起使用，即制造和分配中的一个优点，因为具有特定试剂的变体是不必要的。试剂在盘103中沉积，以控制沉积精度、不同试剂成分的隔离以防止过早交互作用以及从最佳物理布置的优化混合。试剂设计用于快速溶解，以增加光学测量的精度。溶解速率应当控制成使得与流体样本的混合具有最大效率。试剂的溶解能够控制成使得光学分析能够在已知或预定时间开始，这增加光学测量的精度。
气泡能够干扰流体的运动和流体的光学性质，并且其控制对健壮分析系统是重要的。此外，气泡能够在盘103中、例如在随盘旋转的读数期间使用向心力来控制。通常，气泡因其小尺寸和粘附表面的能力而在正常重力下没有完全分离。但是，旋转盘的向心力随着盘的转动速度增加而能够超过正常重力，由此自然消除气泡。这允许可能生成气泡的多种方法或试剂或标准物固定。
读取器100和盘103通过改进测试精度，降低测量(定时、热变化、反应发起、试剂混合和光学测量)中的误差，降低样本污染，增加样本吞吐量，减少总测试时间，利用内置测试验证以增加可靠性，并且计量所有全球监控机构和药典要求，来改进流体样本中的细菌内毒素的测量。细菌内毒素的测试使用读取器100和盘103来半自动化，这允许高密度的测试以最少量的用户输入来完成。
在一个实施例中，标准物是从热解天然材料所提取的控制标准物内毒素，供用作分析物参考，以具有与盘103和读取器100一起使用的最佳物理特性，例如最佳溶解速率、微团形成(生物分子聚合)和稳定性。
预期在盘103的一些实施例中，多个试剂能够在光学室202中固定。在这些实施例中，试剂准确地放置于光学室202，使得试剂相互隔离并且在物理上设置用于可控混合，使得试剂不会过早交互。
如能够看到，由于读取器100和盘103减少配制时间量并且降低污染的可能性，所以这允许盘103和读取器100更易于集成到实验室中，降低读取器100和盘103的成本，提供更快的分析时间，减少技术人员培训时间，增加测试质量的健壮性，以及减少技术人员执行测试所需要的时间量。更快的分析时间归因于更短的配制时间和终点的外推。
此外，由于盘103包含在读取器100的外壳101内部，并且盘103的流体网络600在很大程度上密封，所以存在污染物进入盘103并且干扰测试的较小机会。这类污染物可包括内毒素、葡聚糖、生物化学品、酶抑制离子和光学污染物(例如表面(例如光学窗口205)上的指纹)。这归因于如下事实：存在对外壳101内部的测试环境的更好控制，并且盘103在测试期间要求较少操控。由于外壳101中的环境的控制以及盘103的形式和体积，外壳101和盘103例如通过组件表面降低的污染和毒性来给予更快和更好的热控制及材料控制。
此外，盘103的微流体性质在测试期间提供其中的流体的主动混合和被动混合其中之一或两者。主动混合可由使用惯性力进行搅拌、使样本旋转的科里奥利效应、在流体常驻或经过其中时沿一个方向或者往复地实行混合的各种通道、网络或室或者物理上搅拌样本的机械或声致动器中的一个或多个组成。被动混合可包括利用盘103的窄室中的扩散的方法。
盘103的流体网络600的设计使用较低体积的试剂，这引起用于运行测试的较低材料成本、对自然资源的较低输入和较少浪费。
如在盘103和读取器100中能够看到，按照药典方法，使用许可试剂，一式两份来检验各样本，并且在中间水平采用正控制加料一式两份来检验各样本。此外，校准以低、中间或高水平一式三份来执行，其中浓度的十倍(10x)变化给出宽范围，以及药典(例如USP 85)在首次使用新批量试剂时要求三重复制，因此通过始终进行三重复制，覆盖每一种情况。负控制也按照用于一式三份地执行校准的相同逻辑一式三份来执行。预期盘103的一些实施例仅具有双重校准和负控制复制，因为那就是根据药典的试剂的后续使用所需要的。在非药典方法是可接受的或者向监管机构已经验证为是等效和可接受的情况下，基于历史数据的所存储校准能够用来代替来自单独标准物的结果。
此外，如在盘103中能够看到，由于在等分和分配期间需要样本流体和试剂的准确体积，所以单个样本能够对具有和没有正控制加料的检验采用双重复制来分为四个或更多分析，以及用作用于校准和负控制的样本的LAL试剂水可分为四个检验，以使用相同液体测试区域。此外，正控制加料和校准标准物能够在等分或分配期间混合到样本中。另外，过量样本能够排出并且存储在盘103中，这使样本的传递更简易，因为它们不需要是准确体积。
此外，如能够看到，除了空白测试以及建立如BET中所提供的校准曲线之外，盘103配置成还接收待测量流体的二十一(21)个样本。本领域的技术人员应当理解，虽然本文所示和所述的示范盘103包括其中形成的二十四(24)个径向测试区域303，但是盘103的其他实施例能够采用更多或更少径向测试区域303来形成。本领域的技术人员还应当理解，虽然本文的论述参照盘103用于执行BET中提供的测试检验，但是盘103也能够配置成用于测试流体样本并且提供校准测试以及基准测试的任何其他测试方法中。
虽然结合上述具体实施例描述了本发明，但是很明显，本领域的技术人员将会清楚地知道许多备选、组合、修改和变更。相应地，如上所述的本发明的优选实施例预计只是说明性而不是限制性的。能够进行各种变更，而没有背离本发明的精神和范围。因此，本发明的范围由所附权利要求书来限定，以及字面上或者等价地落入权利要求的含意之内的所有装置、过程和方法预计包含在其中。

Claims (19)

1.一种供与向心微流体系统一起使用的微流体盘，所述微流体盘预先加载有至少一个试剂，该微流体盘包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括：
储蓄器部分，用于接纳至少一个流体样本，所述储蓄器部分包括储蓄器和储蓄器出口；
以及分配网络部分，与所述储蓄器部分流体连通；
其中各分配网络部分包括至少四(4)个通道的分配网络，其中各通道具有计量部分和至少一个分析室部分，所述计量部分确定大小成计量所述流体样本的等分试样供在所述分析室部分中分析；以及
至少一个测试通道部分具有在其中隔离的至少一个试剂，所述试剂包括LAL反应物质；
其中，所述分配网络部分还包括主要分配通道、废料入口通道和废料室，以用于限定所述流体样本的任何过量并且将过量流体样本与所述等分试样分离，其中第一阀定位在主要分配通道的上游端，第二阀定位在主要分配通道的下游端，第三阀定位在所述计量部分与所述分析室部分之间，当微流体盘开始旋转使得第一阀进行操作，流体经过第一阀向下游移动，当微流体盘的转速增大以允许流体流过第二阀而不是第三阀，则过量流体样本将从计量部分的等分室排出并进入所述废料室，由此将空气吸入分配网络，微流体盘然后以允许流体流过第三阀的速度旋转，进而将来自等分室的流体提供至分析室。
2.如权利要求1所述的微流体盘，其中，至少一个分配网络是包括至少八(8)个测试通道的校准网络，并且其中：
所述通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量；以及
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
3.如权利要求1所述的微流体盘，其中，至少一个分配网络是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络，并且其中：
所述通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的具有LAL反应物质的第四数量的加料。
4.如权利要求1所述的微流体盘，其中，至少一个第一阀定位在所述储蓄器部分与所述分配网络部分之间，至少一个第三阀定位在所述计量部分与所述分析室部分之间。
5.如权利要求4所述的微流体盘，其中，所述第三阀配置成允许离心力激发所述等分试样流经所述第三阀从所述计量部分到所述分析室部分。
6.如权利要求1所述的微流体盘，其中，所述分析室部分全部包括混合室和光学室，所述混合室具有在其中隔离的至少一个附加试剂，所述附加试剂包括检测试剂。
7.如权利要求6所述的微流体盘，其中，所述混合室具有对用于将固定在厚侧壁上的所述检测试剂与所述等分试样相混合所优化的所述厚侧壁，其中所述厚侧壁促进靠近所述厚侧壁来混合所述试剂和所述等分试样的流路。
8.如权利要求1所述的微流体盘，其中，所述分析室配置成实现使用科里奥利效应、惯性效应或者其中携带的气泡和/或空泡中的至少一个将所述等分试样与所述试剂相混合。
9.如权利要求1所述的微流体盘，其中，所述盘配置成允许离心力从所述分析室部分的所述样本液体中消除气泡。
10.一种配置成测试微流体盘中的流体样本的读取器，所述读取器包括外壳、光具座、向心盘驱动器和控制器；其中所述微流体盘预先加载有至少一个试剂，该微流体盘包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括：
储蓄器部分，用于接纳至少一个流体样本，所述储蓄器部分包括储蓄器和储蓄器出口；
以及分配网络部分，与所述储蓄器部分流体连通；
其中各分配网络部分包括至少四(4)个测试通道的分配网络，其中各测试通道具有计量部分和至少一个分析室部分，所述计量部分确定大小成计量所述流体样本的等分试样供在所述分析室部分中分析；
其中，所述分配网络部分还包括主要分配通道、废料入口通道和废料室，以用于限定所述流体样本的任何过量并且将过量流体样本与所述等分试样分离，其中第一阀定位在主要分配通道的上游端，第二阀定位在主要分配通道的下游端，第三阀定位在所述计量部分与所述分析室部分之间，当微流体盘开始旋转使得第一阀进行操作，流体经过第一阀向下游移动，当微流体盘的转速增大以允许流体流过第二阀而不是第三阀，则过量流体样本将从计量部分的等分室排出并进入所述废料室，由此将空气吸入分配网络，微流体盘然后以允许流体流过第三阀的速度旋转，进而将来自等分室的流体提供至分析室。
11.如权利要求10所述的读取器，其中，所述外壳包括用于将流体样本插入所述盘的储蓄器中的入口，其中所述入口和读取器配置成防止用户将所述流体样本插入不正确的储蓄器。
12.如权利要求10所述的读取器，其中，至少一个分配网络是包括至少八(8)个测试通道的校准网络，并且其中：
所述通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第一数量；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第二数量；以及
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的LAL反应物质的第三数量。
13.如权利要求10所述的读取器，其中，至少一个分配网络是包括至少四(4)个测试通道的样本测量网络，并且其中：
所述通道的至少两(2)个中没有LAL反应物质；
所述通道的至少两(2)个具有在其中隔离的具有LAL反应物质的第四数量的加料。
14.一种用于测试至少一个流体样本的LAL反应物质的方法，所述方法包括：
将微流体盘插入光学读取器中，其中：
所述微流体盘预先加载有至少一个试剂，该微流体盘包括至少两个测试区域，其中各测试区域包括：
储蓄器部分，用于接纳至少一个流体样本，所述储蓄器部分包括储蓄器和储蓄器出口；
以及分配网络部分，与所述储蓄器部分流体连通；
其中各分配网络部分包括至少四(4)个测试通道的分配网络，其中各通道具有计量部分和包括光学室的至少一个分析室部分，所述计量部分确定大小成计量所述流体样本的等分试样供在所述光学室中分析，其中，所述分配网络部分还包括主要分配通道、废料入口通道和废料室，以用于限定所述流体样本的任何过量并且将过量流体样本与所述等分试样分离，其中第一阀定位在主要分配通道的上游端，第二阀定位在主要分配通道的下游端，第三阀定位在所述计量部分与所述分析室部分之间；以及
所述读取器包括外壳、光具座、向心盘驱动器、用于将所述流体样本引入所述盘的入口以及控制器；
将所述流体样本插入所述读取器的所述入口中；
使所述盘旋转，以使得第一阀进行操作，流体经过第一阀向下游移动；
使所述盘的转速增大以允许流体流过第二阀而不是第三阀，则过量流体样本将从计量部分的等分室排出并进入所述废料室，由此将空气吸入分配网络；
使微流体盘然后以允许流体流过第三阀的速度旋转，进而将来自等分室的流体提供至分析室；
使用所述光具座来分析所述光学室中的所述等分试样，以得到测量数据和/或反应数据；
使用校准曲线和所述测量数据和/或反应数据来计算测试结果；以及
报告和/或存储所述测试结果。
15.权利要求14所述的方法，还包括：
将包括检测试剂和/或LAL反应物质的至少一个试剂插入所述读取器的所述入口中；
使所述盘旋转，直至达到反应速度；
允许所述等分试样与所述检测试剂发生反应；
使用所述光具座来分析所述光学室中的所述等分试样，以得到测量数据和/或反应数据；
使用校准曲线和所述测量数据和/或反应数据来计算测试结果；以及
报告和/或存储所述测试结果。
16.权利要求14所述的方法，其中，至少一个测试通道具有在其中隔离的至少一个试剂，所述试剂包括LAL反应物质和/或检测试剂，并且其中所述方法还包括：
将所述流体样本从所述储蓄器传递到所述计量部分，并且计量所述等分试样；
将所述等分试样从所述计量部分传递到所述光学室；
使用所述光具座连续监测所述光学室中的所述等分试样，直到所述等分试样已经完成反应，以得到测量数据和/或反应数据；
使用校准曲线和所述测量数据和/或反应数据来计算测试结果；以及
报告和/或存储所述测试结果。
17.权利要求14所述的方法，其中，所述测量数据和/或反应数据包括等分试样体积、反应动力学、流体运动、透射、吸收、光学密度、颜色、颜色值、色调、谱、浊度、散射光、化学发光、荧光和磁共振。
18.权利要求17所述的方法，其中，所述方法和/或所述测量数据和/或反应数据使用历史测量数据和/或来自已知反应动力学的数据来验证。
19.权利要求18所述的方法，其中，示踪剂固定在所述测试通道中，以帮助测量和验证所述等分试样的体积。
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