CN105572351B - 基于电化学发光法真菌检测微流控芯片 - Google Patents

基于电化学发光法真菌检测微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明创造提供一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，包括承载检测单元的检测基片，所述检测单元包括顺序相连的样品入口区、存储区、检测区以及废液区，所述检测单元在所述检测基片上呈圆形阵列排列并于阵列中心共用所述样品入口区，所述检测区加载有微电极。本发明创造操作灵活便捷、灵敏度和灵活性高。

Description

基于电化学发光法真菌检测微流控芯片
技术领域
本发明创造属于微流控芯片设计技术领域，具体涉及一种用于真菌检测的免疫检测微流控芯片。
背景技术
近年来，随着抗生素的大量滥用和免疫抑制剂在临床的广泛使用，侵袭性深部真菌感染的发病率和病死率越来越高。其中，曲霉、隐球菌以及念珠菌已经逐渐成为临床上几种重要的致病真菌。目前侵袭性细菌感染检测具有以下弊端：实验周期较长、检测率较低、消耗样本与试剂量大、检测设备复杂、成本高、需要专业检测人员进行操作。侵袭性细菌感染病情进展很快，传统的检测技术往往会造成漏诊、误诊，致使贻误病情。微流控芯片，由于所操控的试剂与样本的体积很小(约10-9～10-18L)，在提高检测反应速率的同时，让人为因素对检测过程的影响减小到最低，可极好的规避传统检测的弊端。检测抗原是目前临床公认的快速早期诊断细菌感染的有效方法。曲霉菌、隐球菌以及念珠菌的分泌性抗原分别为半乳甘露聚糖抗原、荚膜多糖抗原以及甘露聚糖抗原，在感染早期可从患者血液中发现。
基于免疫反应检测抗原是一种目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法，其具有高的灵敏度与特异性。其主要分为酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、电化学法、化学发光检测法以及电化学发光检测法。其中电化学发光检测法，由于其高的灵敏度、宽的动态浓度响应、反应体系可控，能产生均一稳定的信号并能与检测电路集成等特点，愈加受到关注。但现有的微流控芯片反应体系操作不够灵活，反应信号灵敏度不高或均一性差，反复操作的便捷性差、成本难以预计，成为微流控芯片设计的主要问题。
发明内容
本发明创造为解决现有技术中的问题，提供了一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，操作灵活便捷、灵敏度和灵活性高。
本发明创造提供的基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，包括承载检测单元的检测基片，所述检测单元包括顺序相连的样品入口区、存储区、检测区以及废液区，所述检测单元在所述检测基片上呈圆形阵列排列并于阵列中心共用所述样品入口区，所述检测区加载有微电极，使得电化学发光反应能顺利进行。
进一步，所述检测基片能够可拆卸地固定于一独立的壳体内，实现检测基片的更换。
进一步，本发明创造的微流控芯片还包括可覆盖于所述检测基片上的检测盖体，所述检测盖体可单独设置，也可优选地与所述壳体通过一端进行轴连接。
其中，所述存储区存放有试剂或标记抗体，所述检测区存放有固相载体。
其中，所述存储区可设置为相互连通的多个存储区域，所述存储区域之间以及存储区与检测区之间可进一步通过迂回的曲线形通道连通。
其中，所述微电极包括工作电极(WE)、对电极(CE)以及参考电极(RE)，所述工作电极(WE)、对电极(CE)以及参考电极(RE)可各自独立地装载于：a.所述检测区所在的流道的底面(例如，当选用纸张作为检测基片材料时)、或b.单独的纸张之上并固定于所述检测区所在的流道内、或c.集成于所述检测盖体的内侧的对应位置之上，实现可重复利用。
其中，所述检测盖体上设有与所述样品入口区对应的通孔；在与所述检测区位置相对应的内侧，还设有检测窗口、工作电极、对电极、参考电极、微电极引脚中的一种或多种；所述检测盖体内部还设有布线导线，用于光、电等信号的传输。
进一步，所述检测盖体上还设有电信号读出与控制接口，经所述布线导线分别与各微电极或检测窗口相连，用于检测信号或检测结果的输出。
进一步，所述微电极中所述工作电极由分布于所述检测区中央的中心圆以及绕该中央两侧的两个半弧A构成，且所述中心圆与两个所述半弧A向一侧延伸汇合，在其汇合端部可进一步设置一工作电极引脚；所述工作电极的中心圆与其中一个半弧A之间设置有一个半弧B作为对电极，所述工作电极的中心圆与另一个半弧A之间设置有一个半弧C作为参考电极，所述对电极和参考电极均向与所述工作电极引脚相对的一端延伸，并在其延伸端部可进一步分别设置对电极引脚和参考电极引脚。进一步，所述工作电极引脚、对电极引脚和参考电极引脚分别与设置于所述检测盖体上的微电极引脚相匹配。
本发明创造的有益效果是：(1)检测基片可进行更换，用于检测的检测壳体可重复利用，有利于成本控制；(2)检测单元在所述检测基片上呈圆形阵列排列，通过设计相同的检测单元结构可实现同一样品的一次性重复检测，也可通过设计不同的检测单元结构实现同一样品在不同检测条件下的检测项目，灵活便捷，灵敏度和准确度高。
附图说明
图1是本发明创造一种实施方式的结构示意图；
图2是图1另一种状态的结构示意图；
图3是图1的分解图；
图4是图1中检测单元的结构示意图；
图5是图1中微电极的结构示意图；
图6是图1中检测单元的另一种结构示意图。
图中，1-检测基片；2-检测单元；21-样品入口区；22-存储区；221-存储区域；222-迂回的曲线形通道；23-检测区；24-废液区；3-微电极；31-工作电极；311-中心圆；312-半弧A；32-对电极；321-半弧B；33-参考电极；331-半弧C；4-壳体；5-检测盖体；51-通孔；52-检测窗口；53-微电极引脚；54-电信号读出与控制接口。
具体实施方式
下面通过结合附图对本发明创造进行进一步说明。下面的实施例中描述的具体方案仅是为了说明本发明创造的内容，并不用于对本发明创造的限定。
本发明创造一种优选的实施方式如图1-5所示，包括承载检测单元2的检测基片1，所述检测单元2(图4)包括顺序相连的样品入口区21、存储区22、检测区23以及废液区24，所述检测单元2在所述检测基片1上呈圆形阵列排列并于阵列中心共用所述样品入口区21，所述检测区23加载有微电极3，使得电化学发光反应能顺利进行。所述检测基片1能够可拆卸地固定于一独立的壳体4内，实现检测基片1的更换。微流控芯片还包括可覆盖于所述检测基片1上的检测盖体5，所述检测盖体5可单独设置，也可优选地与所述壳体4通过一端进行轴连接。
所述检测基片1为一次性使用区域，所选用的材料可以为纸张，如层析纸等，或者采用塑料等；所述壳体4及检测盖体5为可重复使用区域，可选择塑料、PMMA等材料，最好选用透光度高并具有一定的抗腐蚀能力的材料。
所述检测单元2中：
样品入口区21使经处理后的含有抗原的样品进入，由于毛细力作用，样品将从样品入口区21向废液区24流动，样品入口区2大小考虑到加样的便捷性以及试剂的节省，以及纸张流道加工精度，直径在1到5mm之间为优。
存储区22可根据不同的检测原理向其中加入不同的试剂或标记抗体，以夹心法为例，存储区可加入三联吡啶钌标记的抗体(粉末状)；当样品流经该区域，产生特异性免疫反应；还可以根据特定的情况，将存储区22可设置为相互连通的多个存储区域221(图6)，所述存储区域221之间以及存储区22与检测区23之间可进一步通过迂回的曲线形通道222连通，通道宽度100～200μm，达到充分混合的目的；存储区22考虑到试剂装载的难易程度与用量，直径在2mm左右为佳，深度可通过试剂的用量综合考虑为50～150μm。
检测区23存放有固相载体，如三丙胺(TPA)；同时该区域需要加载微电极3，使得电化学发光反应能顺利进行；所述微电极3包括工作电极31、对电极32以及参考电极33，所述工作电极31、对电极32以及参考电极33可各自独立地装载于：a.所述检测区23所在的流道的底面(例如，当选用纸张作为检测基片材料时)、或b.单独的纸张之上并固定于所述检测区23所在的流道内(如图1-3)、或c.集成于所述检测盖体5的内侧的对应位置之上，实现可重复利用。
所述微电极3(图5)中所述工作电极31由分布于所述检测区23中央的中心圆311以及绕该中央两侧的两个半弧A 312构成，且所述中心圆311与两个所述半弧A向一侧延伸汇合，在其汇合端部可进一步设置一工作电极引脚(图中未示出)；所述工作电极31的中心圆311与其中一个半弧A 312之间设置有一个半弧B 321作为对电极32，所述工作电极31的中心圆311与另一个半弧A 312之间设置有一个半弧C 331作为参考电极33，所述对电极32和参考电极33均向与所述工作电极引脚相对的一端延伸，并在其延伸端部可进一步分别设置对电极引脚(图中未示出)和参考电极引脚(图中未示出)。
所述微电极3中，参考电极33可选用Ag/AgCl以保证参考电势稳定；工作电极31以及对电极32由于需要电极化学性质稳定，可选用石墨电极(集成在纸张上时)，也可选用铂电极以及金电极(检测盖体5上时)。
另外，所述微电极3中，工作电极31需要进行修饰(当以磁珠为固相载体时无需进行电极修饰)，采用修饰微电极时，可以同时选择将对电极32与参考电极33如前所述集成于所述检测盖体5的内侧以降低成本。
废液区24主要用于收集废液并提供动力。如采用纸张作为检测基片1的材料时，废液区本身即可提供毛细动力；如采用塑料或PMMA作为检测基片1材料时，可选择在检测单元2填入层析纸，或制作微柱结构，用以提高其所提供的动力。
所述检测单元2在检测基片1内的整体厚度优选为100μm左右，废液区可适当加深。
所述检测盖体5上设有与所述样品入口区21对应的通孔51。
在与所述检测区23位置相对应的内侧，还设有检测窗口52，检测窗口52可以直接进行光信号的采样，也可通过电子集成封装光电转换器，用于电化学发光产生信号的捕捉。光电转换器的选择，综合考虑到工作环境、成本以及可靠性灵敏度的因素，可以选择光敏电阻以及光敏二极管。光敏电阻(宽光谱响应；无极性，使用方便，成本低，寿命长，结构简单；灵敏度高，但远低于光电倍增管，工作电流大～mA，易读取)；光敏二极管(灵敏度高于光敏电阻器；高频性能好；可靠性好；体积小，易于集成)。
工作电极31、对电极32、参考电极33、微电极引脚53中的一个或多个也可设置于所述检测盖体5内侧；其中，所述微电极引脚53分别与所述微电极3的工作电极引脚、对电极引脚和参考电极引脚相匹配。
所述检测盖体5内部还设有布线导线(图中未示出)，用于光、电等信号的传输。
所述检测盖体5上还设有电信号读出与控制接口54，经所述布线导线分别与各微电极3或检测窗口52相连，用于检测信号或检测结果的输出。
下面简要列举几种本发明创造的检测内容和流程。
方案1纸张微流控芯片，以电极作为固相载体检测多糖抗原：
1)采用如图1-5所示的微流控芯片结构，各区域装载样本
a)存储区22装载三联吡啶钌标记的抗体粉末；
b)检测区23装载三丙胺(TPA)；
c)检测区23表面通过平版印刷或者软光刻技术制备二抗修饰的微电极。
2)反应流程：
经片外处理后的含有抗原的样品，通过移液枪滴入样品入口区21；样品流经存储区22时，抗原与标记抗体结合，并在检测区23工作电极(二抗修饰)上富集，后续的样品将没有结合抗原的标记抗体冲入废液区24。经5min的富集后，在微电极3上加+1V电压，在电压激励下，化学物质在电极表面发生氧化还原反应，发射620nm光子。
3)检测流程：
反应发射的光子被检测窗口52中的光电转换器收集，电信号通过数据线连接到处理电路(可在PCB上或者在手机上实现)，经过滤波器、放大器滤除噪声并放大信号，利用模数转换器将模拟连续信号转换成离散数字信号，传入手机、电脑等处理模块，经数据处理后将最终结果以界面形式反映在电子屏幕上。
注：常用的光电转换器有：光电倍增管、光敏电阻以及光敏二极管等，其中，光电倍增管，需要几百到几千伏供电电压，需要专用设备检测，虽然精度高，但不利于集成与降低成本；光敏电阻的光谱响应宽、无极性、成本低、体积小、寿命长，灵敏度高(低于光电倍增管)，工作电流大，易读取；光敏二极管的灵敏度在光电倍增管与光敏电阻之间，高频性能好、可靠性好、易于集成。
方案2纸张微流控芯片，以磁珠作为固相载体检测多糖抗原：
1)采用如方案1的微流控芯片结构，仅将其中的检测单元2替换为图6的结构，各区域装载样本
a)第一个存储区域装载三联吡啶钌标记的抗体粉末以及生物素标记的二抗粉末；
b)第二个存储区域装载被链霉亲和素修饰的磁珠(磁化的PS珠)；
c)检测区23装载三丙胺(TPA)；
d)检测区23内表面制备微电极3；
e)检测区23下方集成永磁铁，对磁珠进行捕捉。
2)反应流程：
经片外处理后的含有抗原的样品，通过移液枪滴入样品入口区21；经过第一个存储区时，抗原、标记抗体与标记二抗相结合，形成夹心结构；接着进入第二个存储区，链霉亲和素与生物素结合，使夹心结构与磁珠相连，并通过磁力作用固定于电极之上。后续样本对检测区23未结合抗原的结构起到清洗作用，并流入废液区24。经5min的富集后，在微电极3上加+1V电压，在电压激励下，化学物质在电极表面发生氧化还原反应，发射620nm光子。
3)检测流程：
反应发射的光子被检测窗口52中的光电转换器收集，经过滤波器、放大器滤除噪声并放大信号，利用模数转换器将模拟连续信号转换成离散数字信号，通过有线或无线发射接收设备，传入手机、电脑等处理模块，经数据处理后将最终结果以界面形式反映在电子屏幕上。
方案3塑料微流控芯片，以磁珠作为固相载体检测多糖抗原：
基本原理与试剂的盛放同方案二，但在废液区24装载层析纸片或制备微柱，用以提高其毛细动力，确保液体具有足够的驱动力。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，其特征在于，包括承载检测单元的检测基片，所述检测单元包括顺序相连的样品入口区、存储区、检测区以及废液区，所述检测单元在所述检测基片上呈圆形阵列排列并于阵列中心共用所述样品入口区，所述检测区加载有微电极；
所述检测基片可拆卸地固定于一独立的壳体内，实现检测基片的更换；
所述微流控芯片还包括可覆盖于所述检测基片上的检测盖体；所述检测盖体上设有与所述样品入口区对应的通孔；在与所述检测区位置相对应的内侧，还设有检测窗口、工作电极、对电极、参考电极、微电极引脚中的一种或多种；所述检测盖体内部还设有布线导线，用于光、电信号的传输。
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，其特征在于，所述存储区设置为相互连通的多个存储区域，所述存储区域之间以及存储区与检测区之间通过迂回的曲线形通道连通。
3. 根据权利要求1所述的一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，其特征在于，所述微电极包括工作电极、对电极以及参考电极，所述工作电极、对电极以及参考电极各自独立地装载于：a. 所述检测区所在的流道的底面、或b. 单独的纸张之上并固定于所述检测区所在的流道内、或c. 集成于所述检测盖体的内侧的对应位置之上。
4.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，其特征在于，所述检测盖体上还设有电信号读出与控制接口，所述布线导线分别与各微电极或检测窗口相连。
5.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光法真菌检测微流控芯片，其特征在于，所述微电极中所述工作电极由分布于所述检测区中央的中心圆以及绕该中央两侧的两个半弧A构成，且所述中心圆与两个所述半弧A向一侧延伸汇合；所述工作电极的中心圆与其中一个半弧A之间设置有一个半弧B作为对电极，所述工作电极的中心圆与另一个半弧A之间设置有一个半弧C作为参考电极，所述对电极和参考电极均向与所述工作电极引脚相对的一端延伸。
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